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STIMULATION DE LA SYNTHÈSE DES COMPOSÉS
NUTRACEUTIQUES ET AROMATIQUES DANS LES FINES
HERBES ET LES LÉGUMES PAR LES CHAMPIGNONS
MYCORHIZIENS À ARBUSCULES
Mémoire
Frédéric Simard
Maîtrise en biologie végétale Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
©Frédéric Simard, 2014
ii
iii
Résumé
Le principal objectif de ce projet de recherche était de déterminer si les
champignons mycorhiziens à arbuscules pouvaient stimuler la synthèse des
composés du métabolisme secondaire d’intérêt nutraceutique dans les végétaux.
Deux plantes ont été utilisées au cours de ce projet de recherche, le basilic
(Ocimum basilicum L.) et la carotte (Daucus carota L.). La mycorhize a favorisé la
croissance des plants de basilic ayant reçu un ajout de superphosphate triple au
cours de la deuxième expérience menée sur cette espèce. Elle a aussi favorisé à
plusieurs reprises l’assimilation minérale de certains minéraux comme le
potassium et le phosphore. Des teneurs plus élevées en caroténoïdes ont été
observées dans les feuilles des plants de basilic ayant reçu une double dose
d’inoculant. De plus, la capacité antioxydante liposoluble des extraits de plants de
basilic inoculés avec la simple dose a été abaissée. Chez la carotte, la mycorhize
a favorisé la croissance et l’assimilation minérale des plants dans les conditions
sans ajout de superphosphate triple. La teneur en α-carotène a diminué chez les
carottes mycorhizés au cours de la première expérience. L’association
mycorhizienne a induit des effets à la fois indirects et directs sur la synthèse des
composés nutraceutiques.
iv
v
Résumé long
Le principal objectif de ce projet de recherche était de déterminer si les
champignons mycorhiziens à arbuscules pouvaient stimuler la synthèse des
composés du métabolisme secondaire d’intérêt nutraceutique dans les végétaux.
Les aliments sains, riches en composés nutritifs et antioxydants et produits de
manière respectueuse envers l’environnement sont de plus en plus recherchés.
L’usage critiqué des pesticides et des engrais chimiques mène les producteurs à
revoir leurs méthodes culturales. C’est dans cette optique que les champignons
mycorhiziens à arbuscules attirent de plus en plus l’attention des producteurs
horticoles. Jusqu’à maintenant, plusieurs auteurs ont rapporté les effets favorables
des champignons mycorhiziens à arbuscules sur la synthèse de certaines familles
de molécules d’intérêt nutraceutique comme les composés phénoliques et les
terpénoïdes. Plusieurs questions persistent concernant l’étendu de l’effet de la
mycorhize, est-elle localisée au site de colonisation des racines ou peut-elle se
manifester à distance jusque dans les feuilles de la plante? En revanche, d’autres
auteurs n’ont pas observé d’effet direct des champignons endomycorhiziens et les
effets observables semblent davantage être attribuables à la fertilisation ou à l’effet
indirect d’une meilleure assimilation minérale conférée par la mycorhize.
C’est devant ces nombreuses questions fondamentales que les hypothèses de ce
projet de recherche ont pris forme. Il a été émis que les champignons mycorhiziens
à arbuscules auraient un effet inducteur sur le métabolisme secondaire des plantes
et que cet effet mènerait à la synthèse d’une plus grande quantité de composés
d’intérêt nutraceutique. Les fruits et les légumes produits selon cette régie de
culture seraient ainsi biofortifiés. Les molécules produites lors de l’enclenchement
des mécanismes de défense des plantes sont sensiblement les mêmes que celles
qui confèrent les propriétés nutraceutiques, cosmétiques ou aromatiques. Donc,
l’effet de l’association mycorhizienne serait direct et non pas indirect causé par une
meilleure assimilation des nutriments de la solution nutritive du sol ou du substrat.
vi
Deux plantes ont été utilisées au cours de ce projet de maîtrise de deux ans, la
carotte et le basilic. Deux expériences ont été réalisées pour chaque espèce. La
carotte permettait de déterminer si les effets étaient localisés au niveau des
racines de la plante et le basilic permettait de déterminer si les effets pouvaient
être systémiques et activer des mécanismes moléculaires jusque dans les feuilles
de la plante. Les deux plantes ont été inoculées à l’aide d’un inoculant commercial
du Glomus irregulare. Pour atteindre nos différents objectifs, les plants ont été
fertilisés à l’aide de deux types de solution fertilisante, une faiblement concentrée
en azote au cours d’une première expérience et une autre plus concentrée au
cours de la deuxième expérience. De plus, du superphosphate a été ajouté au
substrat de culture dans certains traitements afin d’isoler l’impact direct de la
mycorhize de l’impact indirect d’une meilleure assimilation minérale causée par
cette dernière.
Les principales conclusions sont que l’association mycohizienne est
indéniablement plus efficace lorsque les teneurs en minéraux dans la solution du
sol sont faibles. Toutefois, la mycorhize a favorisé la croissance des plants de
basilic lors d’un ajout de superphosphate triple au cours de la deuxième
expérience menée sur cette espèce. Elle a aussi favorisé à plusieurs reprises
l’assimilation de certains minéraux comme le potassium et le phosphore.
L’association mycorhizienne n’a pas modifié de façon importante la biochimie du
basilic. Outre une stimulation de la synthèse des caroténoïdes dans les feuilles des
plants de basilic ayant reçu une double dose d’inoculant au départ, peu d’effets ont
été observés au niveau des teneurs totales en composés phénoliques, en
caroténoïdes et de la capacité antioxydante. Une diminution de la capacité
antioxydante a aussi été observée dans les extraits liposolubles des feuilles des
plants de basilic inoculés à partir de la simple dose. Chez la carotte, la mycorhize a
favorisé la croissance et l’assimilation minérale des plants dans les conditions sans
ajout de superphosphate triple. La mycorhize semble avoir perturbé la synthèse de
l’α-carotène chez les carottes mycorhizées au cours de la première expérience. Il
n’y a pas eu d’autre impact important de l’association mycorhizienne sur les
vii
molécules du métabolisme secondaire étudiées au cours des expériences sur la
carotte.
viii
ix
Table des matières
Résumé ............................................................................................................................................... iii
Résumé long ........................................................................................................................................ v
Liste des tableaux ............................................................................................................................. xiii
Remerciements ................................................................................................................................ xvii
Introduction général............................................................................................................................. 1
Chapitre 1 : Revue bibliographique sur les champignons mycorhiziens arbusculaires, hypothèses et
objectifs de recherche ......................................................................................................................... 4
1.1 La découverte des champignons mycorhiziens arbusculaires ........................................... 4 1.2 Effets sur la croissance des plantes et mécanisme de transfert carbone/éléments
minéraux entre les symbiotes ......................................................................................................... 6 1.3 Protection accrue contre les stress hydriques et salins et relation hydrique entre les
mycorhizes à arbuscules et l’hôte végétal ...................................................................................... 8 1.4 Amélioration de la structure des sols ................................................................................ 10 1.5 Protection accrue contre les différents stress biotiques .................................................... 11 1.6 Impact sur la synthèse des métabolites primaires et secondaires de la plante hôte ........ 12
1.6.1 Métabolisme primaire des acides aminés ................................................................. 12 1.6.2 Métabolisme des terpénoïdes ................................................................................... 12 1.6.3 Métabolisme des phénylpropanoïdes ....................................................................... 13 1.6.4 Autres modifications du métabolisme secondaire ..................................................... 14
1.7 Hypothèses et objectifs de recherche ............................................................................... 14
Chapitre 2 : Influence du champignon mycorhizien arbusculaire Glomus irregulare sur la
croissance, la nutrition minérale et la production de composés nutraceutiques chez le basilic
(Ocimum basilicum L.)....................................................................................................................... 18
Résumé ......................................................................................................................................... 18 2.1 Introduction .............................................................................................................................. 18 2.2 Matériel et méthodes ............................................................................................................... 20
2.2.1 Biologie du basilic et champignon mycorhizien utilisé ..................................................... 20 2.2.2 Localisation, conditions de culture et dispositifs expérimentaux ..................................... 21 2.2.3 Échantillonnage et paramètres mesurés ......................................................................... 23 2.2.4 Coloration des racines et détermination du pourcentage de colonisation mycorhizienne 24 2.2.5 Détermination du contenu en éléments minéraux du substrat ........................................ 25 2.2.6 Détermination de la teneur en éléments minéraux dans les feuilles de basilic ............... 26 2.2.7 Détermination de la teneur en composés phénoliques totaux dans les poudres sèches
des feuilles de basilic ................................................................................................................ 26 2.2.8 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes................................................ 27
2.2.8.1 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes totaux .............................. 27 2.2.8.2 Séparation et détermination de la teneur des différents caroténoïdes ..................... 29
2.2.9 Détermination de la capacité antioxydante des extraits de poudre de basilic ................. 30 2.2.9.1 Extraction des composés liposolubles (L-ORAC) ..................................................... 30 2.2.9.2 Extraction des composés hydrosolubles (H-ORAC) ................................................. 30 2.2.9.3 Mesure de la capacité antioxydante.......................................................................... 31
2.2.10 Analyse statistique ......................................................................................................... 32 2.3 Résultats ................................................................................................................................. 32
x
2.3.1 Taux de colonisation des racines des plants de basilic par le champignon Glomus
irregulare .................................................................................................................................... 32 2.3.2 Croissance des plants de basilic ...................................................................................... 33 2.3.3 Teneur en éléments minéraux des feuilles des plants de basilic ..................................... 35
2.3.3.1 Première expérience ................................................................................................. 35 2.3.3.2 Deuxième expérience ................................................................................................ 38
2.3.4 Teneur en composés phénoliques totaux dans les feuilles de basilic ............................. 41 2.3.5 Teneur en caroténoïdes totaux dans les feuilles de basilic .............................................. 42 2.3.6 Capacité antioxydante des extraits de feuilles des plants de basilic ............................... 45
2.4 Discussion et conclusion ......................................................................................................... 47 2.4.1 Première expérience sur le basilic ................................................................................... 47
2.4.1.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ............................................. 47 2.4.1.2 Effet sur les métabolites secondaires ........................................................................ 48
2.4.2 Deuxième expérience sur le basilic .................................................................................. 49 2.4.2.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ............................................. 49 2.4.2.2 Effet sur le métabolisme secondaire ......................................................................... 50
2.4.3 Comparaison de l’étude avec la littérature ....................................................................... 51 2.4.4 Conclusion ........................................................................................................................ 52
Chapitre 3 : Effet du champignon mycorhizien à arbuscules Glomus irregulare sur la croissance, la
nutrition minérale et la stimulation de la synthèse de composés nutraceutiques chez la carotte
(Daucus carota L.) ............................................................................................................................. 56
Résumé ......................................................................................................................................... 56 3.1 Introduction .............................................................................................................................. 57 3.2 Matériels et méthodes ............................................................................................................. 58
3.2.1 Biologie de la carotte et conditions de culture .................................................................. 58 3.2.2 Échantillonnage et paramètres mesurés .......................................................................... 60 3.2.3 Détermination du taux de colonisation par le champignon mycorhizien à arbuscules
Glomus irregulare des racines de carotte ................................................................................. 61 3.2.4 Analyse minérale du substrat de culture des bioessais de carotte .................................. 62 3.2.5 Analyse minérale des tissus végétaux des racines de carotte ......................................... 63 3.2.6 Contenu en composés phénoliques totaux dans les poudres sèches de carotte ............ 64 3.2.7 Quantification du contenu en caroténoïdes totaux dans les poudres sèches de carotte . 65 3.2.8 Détermination de la capacité antioxydante des extraits de carotte .................................. 67
3.2.8.1 Extraction des composés liposolubles des poudres de carotte (L-ORAC) ............... 67 3.2.8.2 Extraction des composés hydrosolubles des poudres de carotte (H-ORAC) ........... 68 3.2.8.3 Mesure de la capacité antioxydante .......................................................................... 68
3.2.9 Analyses statistiques ........................................................................................................ 69 3.3 Résultats .................................................................................................................................. 69
3.3.1 Taux de colonisation des racines de carotte par le champignon endomycorhizien Glomus
irregulare .................................................................................................................................... 69 3.3.2 Rendements en matière fraîche des racines tubérisées de carotte ................................. 70 3.3.3 Teneur en minéraux dans les tissus des racines tubérisées de carotte .......................... 71
3.3.3.1 Première expérience ................................................................................................. 71 3.3.3.2 Deuxième expérience ................................................................................................ 74
3.3.4 Contenu en composés phénoliques totaux dans les racines tubérisées de carotte ........ 76 3.3.5 Contenu en caroténoïdes dans les racines tubérisées de carotte ................................... 77 3.3.6 Capacité antioxydante des extraits de carotte ................................................................. 80
3.4 Discussion et conclusion ......................................................................................................... 82
xi
3.4.1 Première expérience sur la carotte .................................................................................. 82 3.4.1.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ............................................. 82 3.4.1.2 Effet sur le métabolisme secondaire ......................................................................... 82
3.4.2 Deuxième expérience sur la carotte................................................................................. 83 3.4.2.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale ............................................. 83 3.4.2.2 Effet sur le métabolisme secondaire ......................................................................... 84
3.4.3 Comparaison avec les études antérieures ....................................................................... 85 3.4.4 Conclusion ........................................................................................................................ 86
Conclusion générale.......................................................................................................................... 89
Références bibliographiques ............................................................................................................. 93
Annexe 1 ......................................................................................................................................... 103
Annexe 2 ......................................................................................................................................... 104
xii
xiii
Liste des tableaux
Chapitre 2
Tableau 2.1 Propriétés chimiques du terreau Agro Mix® avec ou sans ajout de superphosphate triple au moment de l’empotage des essais sur le basilic……….25 Tableau 2.2 Taux de colonisation des racines des plants de basilic par le champignon endomycorhizien à arbuscules Glomus irregulare en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple…………………….......33 Tableau 2.3 Masses fraîches aériennes des plants de basilic en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple………………35 Tableau 2.4 Teneur en éléments minéraux (base sèche) dans les feuilles des plants de basilic de la première expérience en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple……………………………..……37 Tableau 2.5 Teneur en éléments minéraux (base sèche) dans les feuilles des plants de basilic de la deuxième expérience en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple……………………………..……40 Tableau 2.6 Teneur en composés phénoliques totaux dans les feuilles de basilic en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple…………………………………………………………………………….....………42 Tableau 2.7 Teneur en caroténoïdes totaux, en lutéine et en β-carotène dans les feuilles des plants de basilic des deux expériences en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple……………………..44 Tableau 2.8 Capacité antioxydante des extraits hydrosolubles (Orac-H), liposolubles (Orac-L) et totaux (Orac-T) des feuilles de basilic des deux expériences en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple…………………………………………………………………...46
Chapitre 3
Tableau 3.1 Propriétés chimiques de la terre à jardin Premier horticulture utilisée pour les bioessais chez la carotte en fonction de l’ajout ou non de superphosphate triple……………………………………………………………………………………….63 Tableau 3.2 Taux de colonisation des racines de carotte par le champignon endomycorhizien Glomus irregulare en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple……………………………………………………………..70
xiv
Tableau 3.3 Rendement en matière fraîche des racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………...…71 Tableau 3.4 Teneurs en éléments minéraux (base sèche) des racines tubérisés de carotte de la première expérience en fonction de l’ajout ou d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………………………………………………………….....73 Tableau 3.5 Teneurs en éléments minéraux (base sèche) des racines tubérisés de carotte de la deuxième expérience en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple……………………………………………………….............75 Tableau 3.6 Teneur en composés phénoliques totaux dans les racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’un inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………………………………………………………………………………...……..77 Tableau 3.7 Teneur en caroténoïdes totaux, en β-carotène et en α-carotène dans les racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple…………………………………………………………..……79 Tableau 3.8 Capacités antioxydantes hydrophiles (Orac-H), lipophiles (Orac-L) et totaux (Orac-T) des extraits de racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple………………….……………81
xv
« La joie de contempler et de comprendre, voilà le langage que me porte la
nature. »
-Albert Einstein
xvi
xvii
Remerciements
Tout d’abord, je voudrais remercier mes directeurs de recherche, M. Jacques-
André Rioux et M. Martin Trépanier, pour la confiance qu’ils m’ont témoignée en
acceptant ma participation à ce projet de recherche. Je tiens à les remercier
sincèrement pour l’ensemble des connaissances scientifiques qu’ils m’ont
transmises et pour leurs dévoués enseignements.
Je ne peux oublier de remercier Éric Dugal, Marie-Pierre Lamy et Antoine St-
Pierre, vous m’avez beaucoup aidé et supporté durant ces années d’études. Je
considère avoir fait partie d’une équipe très solidaire envers ses membres.
Merci à Pascal Dubé et à Jean Martin, vous m’avez rendu de grands services pour
les différentes analyses nécessaires à l’accomplissement de ce travail de
recherche.
À vous, mes parents, vous êtes sans doute les auteurs les plus importants de cette
réussite. Sans votre infaillible amour et votre éducation impeccable, je n’en serais
certainement pas où j’en suis présentement. Vous êtes et avez été la clé de mes
succès. Philippe, mon frère, tu seras toujours mon modèle sur qui je peux compter
et me fier par tes conseils réfléchis. Ma chère Cathia, nous avons passé ensemble
cette étape de notre vie commune. Certains moments ont été ardus lors de cette
merveilleuse aventure, mais ta compassion et ton amour m’ont permis de traverser
toutes ces épreuves la tête haute.
Merci Sylvie d’avoir mis ta délicate touche pour la correction de ce mémoire.
Gilles et Lucie, merci de m’avoir hébergé au « petit chalet » du lac Trois-Saumons.
C’est un endroit paradisiaque pour la rédaction.
Merci grand-père et grand-mère, Josephat et Lorraine, de m’avoir apprit à jardiner.
xviii
Finalement, merci à tous mes amis. Les relations et les aventures que nous avons
vécues ensemble ont forgé ma personne et mon caractère. Vous avez toujours été
là pour moi lors des moments difficiles, mais aussi lors des plus heureux.
1
Introduction général
Les champignons mycorhiziens à arbuscules représentent un groupe particulier de
microorganismes présents dans les sols. Les premières espèces de champignons
mycorhiziens à arbuscules seraient apparues il y a entre 460 à 350 millions
d’années et auraient jouées un rôle crucial lors de l’établissement des premières
populations de plantes terrestres vasculaires. Les 300 espèces de champignons
mycorhiziens à arbuscules répertoriées à ce jour participent à l’association
symbiotique obligatoire la plus commune formée avec environ 300 000 espèces
végétales, ce qui représente près de 80 à 90 % des plantes terrestres connues à
ce jour. Après près de 100 années d’études sur cette symbiose végétale, plusieurs
rôles écologiques leurs ont été attribués. Parmi ceux-ci, les plus déterminants sont
leurs effets bénéfiques sur l’écologie des écosystèmes et des agrosystèmes. Les
études démontrent qu’un bon nombre de plantes mycorhizées présentent une
stimulation de la croissance. La symbiose mycorhizienne permet une assimilation
plus efficace de l’eau et des éléments nutritifs, particulièrement le phosphore. Elle
diminue les effets néfastes d’un bon nombre d’agents pathogènes affectant les
racines. Elle favorise une meilleure absorption de l’eau par temps sec et modifie le
métabolisme primaire et secondaire des plantes.
Les études sur la modification du métabolisme des plantes sont encore à l’état de
prélude. Bien qu’il y ait de nombreuses observations documentées à ce sujet, il
reste encore beaucoup à faire afin de mieux comprendre certains phénomènes :
par exemple, l’effet direct de la colonisation des racines opposé à l’effet indirect de
la nutrition minérale octroyé par le champignon. De plus, les effets d’une espèce
de champignon peuvent être très différents de ceux d’une autre sur une plante
mycorhizée. Dans une optique d’agriculture en pleine transformation à la suite
d’une demande par le consommateur d’aliments sains et produits de manière
durable, l’utilisation des champignons mycorhiziens à arbuscules semble prendre
tout son sens.
2
Ce document présente une étude des effets du champignon mycorhizien à
arbuscules Glomus irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la
stimulation de la synthèse de composés à valeur nutraceutique d’une fine herbe, le
basilic, et d’un légume racine, la carotte.
3
Chapitre 1
4
Chapitre 1 : Revue bibliographique sur les champignons mycorhiziens
arbusculaires, hypothèses et objectifs de recherche
1.1 La découverte des champignons mycorhiziens arbusculaires
Les recherches sur les associations mycorhiziennes retiennent l’attention depuis
plus de 120 ans. C’est en 1885 que A.B. Frank donna le nom « mycorhize » à
l’association entre les racines d’un arbre et d’un champignon ectomycorhizien
(Frank, 1885). Il émit comme hypothèse que les champignons ectomycorhiziens et
les plantes ligneuses étaient intimement liés par une relation mutualiste d’échange
de nutriments. À l’origine, Frank postula que le champignon assimilait les éléments
minéraux et les nutriments de l’humus du sol et que l’arbre en échange de
minéraux nourrissait le champignon. Quelques années plus tard, il fit la distinction
entre les champignons ectotrophiques et endotrophiques qu’il n’avait observés à
l’époque que chez les éricacées et les orchidées. C’est en 1897 que Janse nomma
la vésicule, l’une des structures caractéristiques de certains champignons à
arbuscules, et c’est ensuite Gallaud (1905) qui nomma la structure de l’arbuscule,
d’où l’appellation de champignon à arbuscules et à vésicules qui demeura
longtemps. C’est à ce moment que plusieurs chercheurs se mirent à décrire et à
tenter de classifier les différentes espèces de champignons mycorhiziens à
arbuscules.
Préalablement, Link (1809) regroupa les champignons phycomycètes
endomycorhiziens sous le genre Endogone. Par la suite, les frères Tulasne
(Tulasne et Tulasne, 1844) ont été les premiers à décrire le genre Glomus,
représentant l’ensemble des espèces à sporulation se produisant dans les sols,
mais sans établir de relation avec les symbioses mycorhiziennes. Ils
reconnaissaient cependant la proximité du genre Glomus avec le genre Endogone.
Fries (1849) introduisait le terme Endogonacées et plaçait cette famille dans l’ordre
des Tuberales. Les Endogonacées seront par la suite déplacées dans les
5
Mucorales par Bucholtz (1912). Dangeard (1896) fut le premier à décrire un
champignon mycorhizien à arbuscules isolé des racines d’un peuplier (Dangeard,
1900). Il croyait alors que ce type de champignon était pathogène et lui donna le
nom Rhizophagus populinus. En 1922, Thaxler révisa les Endogonacées et
replaça le genre Glomus des frères Tulasne dans les Endogone (Thaxter, 1922).
Butler (1939) revérifia l’identité des champignons mycorhiziens à arbuscules et les
classifia comme des membres imparfaits des Endogonacées.
Face à ces nombreux événements contradictoires, les phytopathologistes
Nicholson et Gerdemann (1968) décidèrent de dresser un système de
classification classique à nom latin. Parallèlement, Mosse et Bowen (1968), pour
leur part, décidèrent de dresser un système plus descriptif basé principalement sur
la structure des parois cellulaires des spores, la couleur des spores et leurs
contenus cytoplasmiques. Les deux systèmes de classification présentaient en
partie des correspondances, notamment parce que les spores des champignons
possèdent peu d’éléments permettant leur différenciation. C’est au début des
années 1970 qu’il devint évident pour Gerdemann et Trappe (1974) que les
Endogone, contenant à ce moment plusieurs espèces variées, devaient être
révisés plus en profondeur. Il divisa l’ancien genre Endogone en sept nouveaux
incluant trois genres non mycorhiziens, Endogone, Modicella, Glaziella, et quatre
genres mycorhiziens, Glomus, Sclerocystis, Gigaspora et Acaulospora.
L’ensemble de ces genres fut placé dans les Endogonacées, les Endogonales et
les Zygomycètes.
En 2001, une réelle révolution dans le monde de la classification des champignons
mycorhiziens arbusculaires se produisit. Schüβler et collaborateurs (2001)
utilisèrent des données moléculaires pour établir les relations phylogénétiques
entre les différents genres et espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules.
Le groupe des champignons mycorhiziens à arbuscules quitta le phylum des
Zygomycètes pour constituer un nouveau phylum propre à ce type de
champignon : les Glomeromycètes. Les études phylogénétiques permirent de
6
regrouper les différentes espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules
selon quatre ordres : Paraglomerales, Archeosporales, Diversisporales et
Glomerales. Pendant longtemps, une des espèces modèles, le Glomus
intraradices souche DAOM197198 et BEG 195, a porté à tort ce nom d’espèce.
Les analyses génétiques ont permis de relier ses données moléculaires à une
espèce nouvellement décrite, le Glomus irregulare (Stockinger et coll., 2009).
1.2 Effets sur la croissance des plantes et mécanisme de transfert
carbone/éléments minéraux entre les symbiotes
Durant plusieurs années, les chercheurs ne s’entendaient pas sur l’impact des
champignons mycorhiziens à arbuscule sur la croissance des plantes. Plusieurs
croyaient que la colonisation du tissu racinaire végétal par les champignons
mycorhiziens arbusculaires était d’origine pathogène ou parasitique. Rayner (1927)
postula que les champignons ectomycorhiziens devaient être possiblement
bénéfiques pour leurs hôtes et que les champignons mycorhiziens arbusculaires
l’étaient probablement aussi. L’idée de Rayner fit échos à travers la communauté
scientifique et plusieurs travaux de recherches furent effectués pour déterminer le
type de relation entre la plante et le champignon. On souleva ainsi l’importance de
déterminer le terme le plus approprié pour définir cette relation, soit infection,
colonisation ou mycorhization. Le terme colonisation semblerait être jusqu’à
aujourd’hui le plus approprié.
Asai (1944) publia un article relatant l’effet de champignons mycorhiziens à
arbuscules sur l’amélioration de la croissance des plants poussant dans un sol
pasteurisé. Il observa ainsi l’impact de la microflore, en particulier l’impact des
champignons mycorhiziens arbusculaires ainsi que celui des rhizobiums sur la
croissance des légumineuses. Viennent par la suite de nombreux articles
démontrant l’impact positif des mycorhizes à arbuscules sur la croissance de
plusieurs plantes : notons le pommier (Mosse, 1957), le tabac (Peuss, 1958), le
7
peuplier (Clark, 1963), le maïs et l’avoine (Meloh, 1963). Cet effet bénéfique sur la
croissance serait majoritairement dû à un rapport coût en carbone contre un
bénéfice en éléments minéraux favorables pour la plante. Entre 4 et 20 % des
photosynthétats sont transférés au champignon, majoritairement sous forme
d’hexoses (Koch et Jonhson, 1984; Eissenstat et coll., 1993). Ces sucres,
absorbés par les structures intraracinaires du champignon, sont rapidement
transformés en tréhalose, en lipide et en glycogène afin d’être exportés vers les
hyphes extraracinaires qui eux ne peuvent pas (ou très peu) prélever de carbone
organique des sols par les processus saprotrophiques (Shachar-Hill et coll., 1995;
Bago et coll., 2002a, 2002b). Ce carbone concédé pour maintenir son symbiote en
place est vu comme un investissement plutôt qu’une dépense pour la plante, car la
symbiose prédispose celle-ci à une plus grande efficacité dans l’acquisition des
nutriments du sol quand les teneurs en sont faibles. Le champignon possède une
meilleure capacité à prélever ces minéraux du sol et à les transférer à la plante par
les racines. L’hôte végétal peut même parfois en accumuler pour une utilisation
subséquente. Cependant, plusieurs chercheurs ont proposé d’éviter une
généralisation excessive sur l’effet bénéfique des champignons mycorhiziens à
arbuscules sur la croissance des plantes, rappelant qu’il peut y avoir une grande
variation sur la nature de l’effet causé par les différentes espèces de champignons
(Lohman, 1927; Janos, 1980; Johnson et coll., 1997).
Avant 1959, on ne connaissait pas la cause exacte des effets positifs engendrés
par les champignons mycorhiziens à arbuscules sur la croissance des plantes.
Baylis (1959) suggérait que l’effet positif sur la croissance est le résultat d’une
meilleure assimilation du phosphore par la plante en relation avec les
champignons mycorhiziens arbusculaires. Par la suite, plusieurs chercheurs
confirmèrent les conclusions de Baylis entre autres Gerdemann (1964) et Holevas
(1966). Après une deuxième série d’expériences, Baylis (1970, 1972a, 1972b)
formula une nouvelle hypothèse à l’effet que les champignons mycorhiziens ou les
poils racinaires devaient être responsables du prélèvement du phosphore dans les
sols. Il observa aussi que l’effet sur la croissance était plus marqué dans les sols
8
pauvres que dans les sols riches en phosphore. Outre le phosphore, plusieurs
autres éléments comme le cuivre, le fer et le zinc sont prélevés du sol par le
réseau extraracinaire fongique et transférés sensiblement de la même manière
vers la plante (Kilham et Firestone, 1983).
L’ensemble de ces informations permet de conclure que les racines mycorhizées
possèdent une plus grande capacité à explorer le sol à la recherche de minéraux
et ainsi à les absorber. Le phosphore, souvent peu mobile dans les sols, serait
l’élément le plus abondamment transféré vers les racines de la plante. Cette
capacité est majoritairement attribuable au réseau fongique extraracinaire et à sa
capacité supérieure à sécréter des phosphatases permettant de solubiliser et
d’absorber les phosphates par des canaux transporteurs de phosphates propres
aux champignons mycorhiziens (Joner et coll., 2000; Koide et Kabir, 2000). De
récentes études ont démontré que des bactéries solubilisatrices de phosphore se
développant en périphérie des hyphes sont à l’origine de la solubilisation des
phosphates. Ces phosphates sont par la suite absorbés par les hyphes et
transférés ultimement à l’hôte végétal démontrant ainsi de nouvelles preuves d’une
symbiose tripartite (Villegas et Fortin, 2001, 2002).
1.3 Protection accrue contre les stress hydriques et salins et relation
hydrique entre les mycorhizes à arbuscules et l’hôte végétal
Plusieurs études ont démontré la diminution du flétrissement des plantes en
symbiose avec les champignons mycorhiziens à arbuscules comparativement à
des plantes non mycorhizées démontrant ainsi l’impact bénéfique de la mycorhize
dans l’approvisionnement en eau de la plante. Les effets du champignon
mycorhizien sur le bilan hydrique de la plante seraient à la fois directs et indirects.
L’influence des mycorhizes arbusculaires se traduit tout d’abord par une diminution
de la résistance du transport de l’eau au niveau des racines. Ce phénomène a été
observé chez le soya et serait notablement attribuable à une augmentation de la
9
surface de contact des hyphes extraracinaires et des racines avec les particules du
sol (Safir et coll., 1972). Les différentes observations démontrant un effet direct
des mycorhizes à arbuscules ont permis de noter un taux de transpiration plus
élevé et une résistance stomatale réduite chez les plants mycorhizés en
comparaison avec des plants non mycorhizés, et ce, autant durant les états de
stress hydrique que durant les périodes de rétablissement. Ceci serait dû en partie
à des variations hormonales affectant l’activité stomatale (Allen et coll., 1981). La
diminution de la résistance au transport de l’eau au niveau des racines est perdue
lorsqu’il y a ajout de nutriments au sol, démontrant ainsi un effet indirect de la
mycorhize sur le bilan hydrique de la plante. Ce fait amènerait à la conclusion que
dans les sols pauvres en nutriments, l’eau serait mieux absorbée par la plante, car
le champignon permet à celle-ci de puiser une plus grande quantité de minéraux
(en particulier le phosphore) engendrant ainsi un appel d’eau du sol plus important
au niveau des racines (Augé, 2001, 2004). La relation hydrique serait donc
attribuable à la relation minérale entre la plante et le champignon, mais aussi à des
variations hormonales affectant la physiologie stomatale de la plante.
Dernièrement, une aquaporine (GintAQ1) des hyphes extraracinaires du Glomus
irregulare a été caractérisée. Les travaux d’Arocado et collaborateurs (2009) ont
démontré qu’il y avait une expression concertée des gènes responsables de la
synthèse des aquaporines au niveau des hyphes et des racines en réponse à un
stress salin ou hydrique.
D’autres recherches ont démontré l’impact positif de la symbiose en réponse au
stress salin. La majorité des plantes voient leur croissance et leur biomasse
diminuer lorsqu’elles sont exposées à de hautes teneurs en sels minéraux comme
le chlorure de sodium dans les sols. La raison de cette diminution est
l’indisponibilité des minéraux séquestrés en raison de concentrations trop élevées
en sels et de l’énergie dépensée pour contrebalancer les effets toxiques des sels
en haute concentration. Dans plusieurs cas, la relation symbiotique mycorhizienne
s’est avérée bénéfique aux plantes se développant dans ces conditions. Par
exemple, Al-Karaki (2000) a observé une augmentation de la masse sèche
10
aérienne et racinaire, du nombre et de la grosseur des fruits des plants de tomate
inoculés comparativement à ceux qui ne l’étaient pas. Cette protection engendrée
par le partenaire fongique est causée par une meilleure assimilation minérale,
l’accumulation d’un régulateur osmotique (proline) en plus grande quantité (Jindal
et coll., 1993), d’une augmentation du taux de photosynthèse ainsi que d’une
utilisation plus efficace de l’eau disponible. La protection contre les stress salins
des plantes en association avec les mycorhizes arbusculaires est donc une
combinaison d’effets nutritionnels, biochimiques et physiologiques (Evelin et coll.,
2009; Porcel et coll., 2012).
1.4 Amélioration de la structure des sols
La structure des sols est un élément fondamental dans le fonctionnement et la
fertilité des écosystèmes et particulièrement pour les agroécosystèmes.
L’agrégation des particules du sol facilite les différents mouvements de l’eau, des
gaz et des nutriments qui sont essentiels pour le bon développement des plantes
et des microorganismes dans les sols. Les microorganismes participent activement
au processus d’agrégation des particules du sol, favorisant ainsi leur structure. Les
travaux de Degens (1997) suggèrent que les hyphes fongiques des champignons,
incluant ceux des champignons mycorhiziens à arbuscules, sont le facteur biotique
le plus important dans la stabilisation des sols, tout en reconnaissant les impacts
positifs des racines des plantes, des bactéries et de la faune du sol. Les
champignons mycorhiziens à arbuscules seraient le facteur le plus important pour
trois raisons : 1) les hyphes extraracinaires des champignons mycorhiziens à
arbuscules sont souvent une composante dominante de la biomasse microbienne
des sols; 2) de par leur symbiose avec les plantes, ils ne sont pas limités dans leur
approvisionnement en carbone comparativement aux champignons saprophytes
qui eux n’ont que le carbone disponible dans les sols pour se développer; 3) et
finalement, les champignons mycorhiziens possèdent un temps de résidence plus
long dans les sols que les autres types de microorganismes (Jastrow et coll.,
1998). Depuis 1996, on sait que la glomaline, une glycoprotéine produite par les
11
mycorhizes à arbuscules, favorise l’agrégation des particules et la rétention en eau
dans les sols. Des études démontrent que plus la concentration en glomaline est
grande, plus le pourcentage en eau disponible dans les agrégats du sol est élevé
(Rillig et coll., 2001).
1.5 Protection accrue contre les différents stress biotiques
Chez la plupart des plantes, la relation plante-pathogène induit une résistance
systémique acquise qui se traduit par une expression plus rapide des mécanismes
de résistance lors d’une subséquente rencontre avec un grand nombre de
pathogènes. Les mécanismes de résistance s’accompagnent par la présence dans
la plante de l’acide salicylique et d’un grand nombre de protéines spécifiques qui
contribuent à la résistance de la plante (Durrant et Dong, 2004). Lors de
l’établissement de la colonisation racinaire, les champignons endomycorhiziens
sont perçus par la plante sensiblement de la même manière qu’un pathogène. Les
mêmes voies métaboliques caractéristiques de l’induction de la résistance
systémique sont déclenchées dans les deux cas. Les enzymes de la phénylalanine
ammonia-lyase et de la chalcone isomérase, caractéristiques des mécanismes de
résistance des plantes, ont été mesurés à près de 200 % par rapport au traitement
témoin lors de la colonisation des racines de la luzerne (Volpin et coll., 1994). De
plus, des superoxydes dismutases (Podzo et coll., 2002), des protéines de
résistance de type 1 (Cordier et coll., 1998) et de hautes concentrations en
composés phénoliques (Ceccarelli et coll., 2010) ont été retrouvés dans les plantes
colonisées par les champignons endomycorhiziens.
Les mycorhizes, en plus de déclencher la mise en place des mécanismes de
résistance, protègent indirectement les racines de la plante en favorisant le
développement de microorganismes antagonistes des pathogènes dans la
rhizosphère. Plusieurs cas de réduction du développement d’organismes
pathogènes près ou dans la rhizosphère ont été décrits lorsque les plantes sont en
association avec les mycorhizes ou en présence de champignons mycorhiziens
12
sans même être colonisées. Par exemple, le Glomus irregulare a réduit les
dommages causés par le Fusarium oxysporum dianthi selon les études de St-
Arnaud et collaborateurs (1997) et le Glomus mosseae a réduit le nombre de
foyers d’infection causés par le Phytophtora nicotinae au niveau des racines de
tomate (Lioussanne et coll., 2009).
1.6 Impact sur la synthèse des métabolites primaires et secondaires de la
plante hôte
1.6.1 Métabolisme primaire des acides aminés
Le métabolisme des acides aminés est affecté suite à l’établissement de la
colonisation par les champignons endomycorhiziens. Une étude sur la tomate
menée par Salvioli et collaborateurs (2012) a démontré des modifications des
teneurs en acides aminés lors de la maturation des fruits de plants de tomate
mycorhizés. La glutamine était présente en plus grande quantité lorsque le fruit
était vert et la glutamine, la thréonine et la sérine étaient plus abondantes en cours
de la maturation (rougissement) du fruit. Ces résultats démontrent ainsi un effet
systémique de la mycorhize. Une étude in vitro récente a démontré la capacité des
hyphes du champignon mycorhizien à arbuscules à absorber directement les
acides aminés du milieu de culture et à les transférer à la racine de la plante
(Whiteside et coll., 2012).
1.6.2 Métabolisme des terpénoïdes
Depuis longtemps, les mycorhiziologistes observent que les racines mycorhizées
des plantes présentent des colorations jaunes à orangées visibles à l’œil nu. Il a
été démontré que le métabolisme des terpénoïdes pouvait être stimulé en réponse
à la mycorhization. Deux molécules, la mycoradicine et la bluménine, sont
retrouvées dans les racines mycorhizées seulement et sont responsables de cette
coloration particulière. Or, ces deux molécules dérivent directement de la voie
13
métabolique des terpènoïdes et sont produites uniquement à la suite de
l’établissement de la symbiose mycorhizienne (Strack et Fester, 2006). Ces
molécules proviennent du clivage oxydatif des caroténoïdes. Le rôle de ces
molécules pour la symbiose demeure incertain, mais elles joueraient probablement
divers rôles dans la signalisation entre les partenaires, le contrôle de la
colonisation des racines, la protection contre les agents pathogènes du sol et
assureraient aussi une protection contre les stress oxydatifs dans les cellules
racinaires colonisées (Strack et Fester, 2006; Akiyama, 2007). Les teneurs en
caroténoïdes sont aussi susceptibles d’être modifiées suite à l’établissement
mycorhizien comme le démontre une expérience sur la tomate où les teneurs en
lycopène et en β-carotène dans les fruits ont été augmentées (Ulrichs et coll.,
2008). Quelques études récentes ont été effectuées sur des fines herbes. La
teneur en huiles essentielles, molécules provenant aussi de la voie des
terpénoïdes, a augmenté chez l’aneth, chez le carvi, ainsi que chez la coriande et
l’origan (Kapoor et coll., 2002a, 2002b, 2004; Khaosaad et coll., 2006; Morone-
Fortunato et Avato, 2008; Chaudhary et coll., 2008) en réponse aux mycorhizes
arbusculaires.
1.6.3 Métabolisme des phénylpropanoïdes
La voie métabolique des phénylpropanoïdes est elle aussi affectée par la présence
de champignons mycorhiziens dans les racines. La composition en flavonoïdes est
fortement affectée lors des différentes étapes de la colonisation mycorhizienne.
Les flavonoïdes, composés phénoliques à deux noyaux aromatiques, semblent
jouer plusieurs rôles dans l’établissement de la mycorhize. Certains flavonoïdes
racinaires comme le coumestrole, l’ononine et le daidzéine ont été caractérisés
comme molécules signals servant à favoriser le développement des hyphes et les
branchements entre le réseau racinaire et mycélien (Salzer et Boler, 2000;
Vierheilig et Piché, 2002). La teneur plus abondante de médicarpine dans les
racines a aussi été notée lors du positionnement des appressoriums des
mycorhizes à arbuscules sur la racine du Medicago sativa. La médicarpine est
14
souvent retrouvée comme phytoalexine dans les racines des plantes parasitées
par des pathogènes, démontrant une certaine homologie du signal avec les
champignons mycorhiziens à arbuscules (Dixon et coll., 1992). Les flavonoïdes
joueraient donc plusieurs rôles durant la colonisation mycorhizienne et la
composition en flavonoïdes serait elle aussi dépendante des différentes
combinaisons plantes-champignons mycorhiziens (Larose et coll., 2002). De ce
fait, une augmentation d’environ 30 % de la concentration des phénols totaux et de
la capacité antioxydante des extraits a été observée chez l’artichaut (Ceccarelli et
coll., 2010) et une synthèse plus élevée d’anthocyanes a été obtenue chez la
fraise (Castellanos-Morales et coll., 2010).
1.6.4 Autres modifications du métabolisme secondaire
On a également observé une augmentation de la concentration de molécules
conférant les saveurs piquantes (sulfoxides) chez la ciboule (Allium fistulosum L.)
(Guo et coll., 2007). La symbiose mycorhizienne est un phénomène fondamental,
mais la plante semble réagir à certains niveaux de la même façon que lorsqu’elle
est en présence d’agents pathogènes. Cette réponse aux champignons
endomycorhiziens pourrait se manifester par l’activation généralisée des voies du
métabolisme secondaire menant à la production d’une panoplie de molécules de
défense engendrant ainsi la résistance systémique acquise (Durrant et Dong,
2004). Bien qu’il y ait eu quelques recherches sur le sujet, il reste encore plusieurs
questions ouvertes sur la modification du métabolisme des plantes en réponse à la
mycorhization ainsi que l’élucidation des différents mécanismes en cause.
1.7 Hypothèses et objectifs de recherche
Au cours des dix dernières années, de plus en plus de gens se sont conscientisés
à ce qui se trouve dans leur assiette. L’arrivée des aliments biologiques, ainsi que
l’usage critiqué des pesticides et des engrais de synthèse ont poussé les
producteurs à revoir leurs pratiques culturales. Plusieurs observations démontrent
15
que l’inoculation par les champignons endomycorhiziens peut à la fois faire
augmenter les rendements des cultures et modifier considérablement les
métabolismes primaire et secondaire des plantes tout en diminuant
raisonnablement l’utilisation des engrais chimiques et des produits phytosanitaires
nécessaires à leur production. La possibilité de produire des fruits, des légumes et
des fines herbes biofortifiés préalablement inoculés par les champignons
endomycorhiziens est aujourd’hui de plus en plus envisageable et souhaitable.
Ces évidences ont mené à la naissance de ce projet de recherche et à la
formulation des hypothèses et objectifs de recherche qui suivent.
Les hypothèses de travail étaient :
1) La plante mycorhizée présentera une modification de son métabolisme
secondaire en réponse à la colonisation de ses racines par le
champignon endomycorhizien Glomus irregulare;
2) Une concentration accrue en métabolites secondaires en réponse à la
symbiose conférera à la plante un potentiel nutraceutique plus
intéressant qu’une plante non mycorhizée;
3) Les effets sur les modifications du métabolisme secondaire ne sont pas
l’effet indirect d’une meilleure assimilation minérale, mais l’effet direct de
la colonisation mycorhizienne des racines.
Les plantes choisies ont été une fine herbe, le basilic doux (Ocimum basilicum L.)
et un légume racinaire, la carotte (Daucus carota L.). Ces plantes sont
couramment utilisées dans l’alimentation humaine et produites en grande quantité
par les producteurs horticoles et maraîchers québécois. L’inoculum utilisé a été le
Myke® Pro PS3 (Glomus irregulare) produit par la compagnie Premier Tech
Biotechnologies (Rivière-du-Loup, Québec).
L’inoculation des plants a permis de vérifier les objectifs spécifiques de la présente
recherche. Ces objectifs étaient de :
16
1) Déterminer si une plante colonisée par les champignons
endomycorhiziens présente une synthèse accrue de métabolites
secondaires;
2) Déterminer si les modifications biochimiques de la plante mycorhizée
confèrent à celle-ci un potentiel nutraceutique plus intéressant qu’une
plante non mycorhizée;
3) Déterminer les voies du métabolisme secondaire qui peuvent être
stimulées par les champignons endomycorhiziens;
4) Déterminer si les modifications du métabolisme secondaire de la plante
sont systémiques ou localisées;
5) Déterminer de quelle nature sont les effets du champignon sur les
teneurs en composés du métabolisme secondaire des plantes à l’étude.
Est-ce l’effet indirect de la fertilisation minérale, l’effet du champignon sur
l’assimilation minérale ou l’effet direct de la colonisation des racines par
le champignon?
17
Chapitre 2
18
Chapitre 2 : Influence du champignon mycorhizien arbusculaire Glomus
irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la production de
composés nutraceutiques chez le basilic (Ocimum basilicum L.)
Résumé
Deux expériences ont été menées sur le basilic visant à déterminer si les
mycorhizes à arbuscules pouvaient favoriser la croissance, la nutrition minérale et
augmenter les teneurs des composés nutraceutiques dans les feuilles de cette
espèce. La première expérience a permis de mettre en évidence l’importance de
l’association mycorhizienne lorsque la fertilisation azotée est faible (fertigation
bihebdomadaire de 50 à 150 mg/l en azote). Une augmentation de la teneur en
caroténoïdes dans les feuilles de basilic a été observée chez les plants
mycorhizés. La mycorhize a aussi permis l’augmentation de la teneur de certains
éléments minéraux dans les feuilles comme le phosphore, le potassium et le zinc,
mais en a fait diminuer d’autres comme le calcium et le magnésium. L’ajout de
superphosphate triple dans le substrat a généré une stimulation de la croissance
des plants et une augmentation des teneurs en phosphore, en magnésium et en
manganèse dans les feuilles. La présence de superphosphate triple a entraîné la
diminution du taux de colonisation des racines par le champignon et de la teneur
en zinc dans les feuilles du basilic. L’amendement en phosphore a fait
significativement augmenter la teneur en composés phénoliques et la capacité
antioxydante de l’extrait liposoluble des feuilles du basilic.
2.1 Introduction
La symbiose entre les plantes supérieures et les champignons mycorhiziens est
dans la plupart des cas favorable à la croissance des plantes, surtout lorsque ces
dernières sont exposées à des conditions difficiles comme un stress hydrique, une
teneur en éléments minéraux plus faible dans la solution du sol ou en présence de
19
certains pathogènes. Une série d’expériences menées récemment par plusieurs
chercheurs démontrent que cette symbiose peut également avoir un effet favorable
sur la synthèse de plusieurs métabolites secondaires. Certains de ces métabolites
présentent des propriétés alimentaires, nutraceutiques, aromatiques, cosmétiques
et même pharmaceutiques. Le basilic possède plusieurs propriétés
phytochimiques intéressantes pour l’alimentation humaine. Elles lui sont
attribuables à un large éventail de composés phénoliques prédominants
comprenant l’acide rosmarinique, l’acide caféique et l’eugénol, ainsi que des
flavonoïdes comme le kaempférol, la lutéoline et la catéchine (Grayer et coll. 1996,
2002; Simon et coll., 1999; Lewinsohn et coll., 2000; Gang et coll., 2001;
Jayasinghe et coll., 2003; Kivilompolo et Hyötyläinen, 2007). Sa saveur et ses
arômes proviennent aussi de la qualité de son huile essentielle présente dans les
glandes foliaires. Cette huile est composée majoritairement de linalool, d’eugénol,
d’α-bergamotène et de 1,8-cinéol (Tada et coll., 1996; Ismail, 2006; Copetta et
coll., 2006, 2007; Chalchat et Özcan, 2008; Carovic-Stanko et coll., 2009). Sa
valeur en vitamine A est majoritairement attribuable à sa composition en
caroténoïdes dont les plus importants sont la lutéine et le β-carotène (Kopsell et
coll., 2005; Daly et coll., 2010). L’ensemble de ces composés lui confère donc de
bonnes propriétés antioxydantes (Kim et coll., 2005; Gülçin et coll., 2007; Hakkim
et coll. 2007; Politeo et coll., 2007).
Jusqu’à maintenant, les résultats rapportés sur le basilic dans la littérature
concernent la combinaison du Glomus mossae et du Glomus caledonium ainsi que
celle du Glomus irregulare sur le basilic. Les résultats restent contradictoires en
certains points. Plusieurs études ont été réalisées sur la modification des teneurs
en huiles essentielles des plants, mais peu de données ont été répertoriées par
rapport à la teneur en composés phénoliques totaux, la capacité antioxydante des
composés hydrosolubles et liposolubles, ainsi que la teneur en caroténoïdes dans
les feuilles des plants colonisés par le Glomus irregulare. Les objectifs de la
présente étude étaient de vérifier les effets du Glomus irregulare sur la croissance,
la nutrition minérale et la synthèse de composés nutraceutiques du basilic cultivé
20
en serre dans un terreau organique. Ces effets ont été déterminés par les mesures
du taux de colonisation des racines, des rendements en matière fraîche de la
partie aérienne du plant, de ses teneurs en éléments minéraux, en composés
phénoliques totaux, en caroténoïdes, ainsi que sa capacité antioxydante.
2.2 Matériel et méthodes
2.2.1 Biologie du basilic et champignon mycorhizien utilisé
Le basilic doux (Ocimum) appartient à la famille des Lamiacées, anciennement
appelées Labiées. Cette plante peut atteindre près de 75 cm de hauteur et est
caractérisée par ses arômes et par sa floraison estivale (fleurs blanches ou
violettes). On cultive différentes espèces un peu partout dans le monde, mais le
basilic doux est le plus important commercialement. Les conditions de culture
appropriées en température sont un minimum de 12 à 15 °C, la plage optimale
étant entre 20 à 25 °C. Cette plante préférant être exposée en plein soleil
demande un arrosage régulier et résiste mal aux périodes de sécheresse et de
froid. Un sol bien aéré facilitera sa croissance. En plus, il faut que les apports
d’azote soient fréquents. Originaire de la région de Gènes, la variété ‘Genovese’ a
conquis le monde entier et est à l’origine d’une impressionnante lignée de variétés
nouvelles. Sa popularité vient de sa haute teneur en huiles essentielles qui est
convoitée par les domaines cosmétiques, pharmaceutiques et alimentaires
(Bauwens, 2008).
Les graines de basilic (Ocimum basilicum L.) du cultivar ‘Sweet, Large Genovese
Green’ vendues par la compagnie Norseco inc. (Laval, Qc) ont été utilisées. Ce
cultivar a été sélectionné pour ses qualités gustatives. L’inoculant Mike® PRO PS3
(800 propagules du Glomus irregulare par gramme d’inoculant) produit par la
compagnie Premier Tech Biotechnologies a été utilisé.
21
2.2.2 Localisation, conditions de culture et dispositifs expérimentaux
Deux expériences ont été menées dans les serres à haute performance de
l’Université Laval (Québec). Les graines de basilic ont été semées dans le substrat
à semis Pro-Mix PGX® (Premier Tech Horticulture, Rivière-du-Loup, Qc) dans des
plateaux multicellulaires (P-200).
Un dispositif factoriel en blocs complets aléatoires a été adopté. Le premier facteur
était composé de trois niveaux d’inoculant mycorhizien : soit sans inoculant (NM),
avec une dose d’inoculant (M1X) et avec la double dose (M2X). Le deuxième
facteur était composé de deux niveaux de phosphore, soit avec ajout de
superphosphate triple (P+) ou sans ajout de superphosphate triple (P-). Le
dispositif était donc composé de 6 traitements :
1) P-NM : Sans ajout d’inoculant mycorhizien et sans ajout de
superphosphate triple;
2) P+NM : Sans ajout d’inoculant mycorhizien mais avec ajout de
superphosphate triple;
3) P-M1X : Avec ajout de la simple dose d’inoculant mycorhizien et sans
ajout de superphosphate triple;
4) P+M1X : Avec ajout de la simple dose d’inoculant mycorhizien et avec
ajout de superphosphate triple;
5) P-M2X : Avec ajout de la double dose d’inoculant mycorhizien et sans
ajout de superphosphate triple;
6) P+M2X : Avec ajout de la double dose d’inoculant mycorhizien et avec
ajout de superphosphate triple.
Les traitements ont été préparés selon la méthodologie suivante. Lors du semis,
0,2 g/cellule (environ 160 propagules) d’inoculant mycorhizien ont été ajouté au
substrat pour les traitements P-M1X et P+M1X et 0,4 g/cellule (environ 320
propagules) d’inoculant mycorhizien pour les traitements P-M2X et P+M2X. Les
22
traitements P-NM et P+NM ont reçu une dose de 0,4 g/cellule d’inoculant stérilisé
afin de rendre la composition du substrat semblable à celui des autres traitements.
Les plateaux de semis ont été placés selon un dispositif expérimental composé de
6 répétitions comprenant chacune 6 graines par traitement afin d’obtenir le nombre
de plants nécessaires pour l’empotage et la mise en place définitive du dispositif.
Trois semaines après le semis, les plants de basilic ont été repiqués dans des pots
azalés Kord® de 15 cm de diamètre (V = 1,5 L) remplis du substrat tourbeux
commercial Agro Mix® (Fafard et Frères ltée, Saint-Bonaventure, Qc). Ce substrat
a été préalablement pasteurisé à la vapeur pendant 2 heures afin d’éliminer tout
agent contaminant. Les traitements P+NM, P+M1X et P+M2X ont reçu un
supplément de 0,2 g/pot de superphosphate triple (0-46-0) mélangé au substrat.
Afin d’assurer une bonne homogénéité, le superphosphate triple granulaire avait
été réduit auparavant en poudre à l’aide d’un moulin à café. Au moment de
l’empotage, les plants des traitements P+NM et P-NM ont reçu une nouvelle dose
de 0,2 g d’inoculant mycorhizien stérilisé et ceux des traitements P-M1X, P-M2X,
P+M1X et P+M2X, une nouvelle dose de 0,2 g d’inoculant viable. L’expérience a
été répétée deux fois. Les dispositifs comportaient six répétitions et chacun des six
traitements était constitué de deux plants pour un total de 72 plants pour chacune
des deux expériences.
La serre a été maintenue à une température de 22 °C le jour et de 17 °C la nuit
sous une photopériode de 14 heures. La première expérience s’est déroulée du 2
mai au 3 août 2010 pour une période de 85 jours de croissance. Une fertilisation
bihebdomadaire a été appliquée à l’ensemble du dispositif. La solution fertilisante a
été produite à partir d’un engrais hydrosoluble (20-2-20) de la compagnie
PlantProducts®. Les plants ont reçu une dose croissante de fertilisant allant de
50 à 150 mg/l en azote selon le stade de développement des plants, soit 50 mg/l
d’azote à raison de 100 ml par pot du 17 mai au 16 juin, 100 mg/l d’azote à raison
de 100 ml par pot du 16 juin au 19 juillet et 150 mg/l d’azote à raison de 100 ml par
pot du 19 juillet au 3 août. La deuxième expérience s’est déroulée du 23 juillet
23
2010 au 27 octobre 2010 pour un total de 92 jours de croissance (12 semaines), et
ce, dans des conditions similaires de croissance. Pour cette expérience, les plants
ont reçu une fertilisation bihebdomadaire apportant 150 mg/l en azote à raison de
100 ml par pot pendant toute la période de croissance.
2.2.3 Échantillonnage et paramètres mesurés
Un échantillon de substrat a été recueilli au moment de l’empotage des plants de
chacune des expériences afin d’en connaître le contenu en éléments minéraux. À
la fin de chacune des expériences, les 72 plants de basilic ont été récoltés
séparément. La masse fraîche des parties aériennes des plants a été mesurée afin
d’établir les rendements. Un échantillon des racines a été prélevé pour déterminer
le taux de colonisation mycorhizienne. La teneur des divers composés du
métabolisme secondaire a été déterminée sur l’un des deux plants que comprenait
chacun des traitements. Les feuilles de la partie supérieure, possédant
sensiblement les mêmes dimensions et ne présentant pas de symptômes de
maladie ou de carence, ont été prélevées, mises dans une enveloppe de papier et
immédiatement congelées. Une fois la congélation réalisée, elles ont été séchées
à froid au lyophilisateur minimisant ainsi au maximum la dégradation des
molécules d’intérêt nutraceutique. Les feuilles séchées ont ensuite été broyées au
mortier. La poudre obtenue a été utilisée afin de déterminer la teneur en minéraux,
le contenu en composés phénoliques totaux, le contenu en caroténoïdes totaux, la
capacité antioxydante des fractions d’extractions polaires et apolaires et la
composition moléculaire en caroténoïdes dans les feuilles. Les détails de ces
analyses sont présentés ci-après.
24
2.2.4 Coloration des racines et détermination du pourcentage de colonisation
mycorhizienne
Les racines ont été lavées à l’eau courante et placées dans des tubes Sarstedt®
de 15 ml percés de multiples trous. Les tubes sont introduits dans des supports à
tube pour faciliter les manipulations.
Les échantillons de racines sont soumis à une hydrolyse alcaline au KOH 10 %
dans un autoclave à une température de 121 °C durant 45 minutes. Les tubes et
leurs contenus sont ensuite rincés abondamment à l’eau froide et plongés dans un
bain d’HCl 1 % à température de la pièce pendant 15 minutes. Les tubes sont
rincés rapidement à l’eau chaude et immergés dans la solution colorante à base de
bleu de trypan (0,05 %) à 50 °C pour une durée de 10 à 12 minutes. Enfin, les
racines sont rincées à l’eau froide et le contenu des tubes est transféré dans des
plats de Petri. L’ajout de glycérol 20 % aide à la conservation des racines.
Le taux de colonisation est déterminé selon une adaptation de la méthode
d’intersection de Giovannetti et Mosse (1980). Cette méthode consiste à étaler les
racines colorées dans un plat de Petri et à les observer sous loupe binoculaire afin
d’en déterminer le taux de colonisation. Des lignes parallèles distancées d’environ
1 cm sont préalablement tracées sur le couvercle du Petri. Le couvercle est
emboîté sous le plat de Petri afin que les racines croisent les lignes du couvercle.
À chaque intersection rencontrée, l’observateur détermine la présence ou non
d’hyphes, de vésicules ou d’arbuscules. Une fois le décompte fait sur l’ensemble
des lignes, le taux de colonisation est déterminé en divisant les comptes
« positifs » sur l’ensemble des comptes « positifs + négatifs » afin de déterminer le
pourcentage. Un minimum de 100 observations doit être effectué afin que la valeur
soit considérée comme représentative.
25
2.2.5 Détermination du contenu en éléments minéraux du substrat
La détermination du contenu en minéraux des substrats a été réalisée selon la
méthode d’extraction des substrats saturés (SSE). Des échantillons de substrat de
tous les traitements ont été prélevés avant et après l’expérimentation dans 3 des 6
répétitions du dispositif. Ils ont été mis dans des plats de plastique et saturés en
eau distillée permettant la libération en solution des éléments minéraux présents
dans le terreau. Après deux heures d’attente, l’eau des terreaux est prélevée par
filtration sous vide. Une quantité de 14 ml d’eau a été recueillie, filtrée, centrifugée
et transférée dans un tube de plastique de 15 ml. Ces tubes munis d’un bouchon
peuvent être entreposés au réfrigérateur jusqu’à l’analyse des solutions.
La teneur en azote des échantillons de substrat a été déterminée par colorimétrie
au spectrophotomètre (Nkonge et Ballance, 1982), de même que celle du
phosphore (Murphy et Riley, 1962). Les teneurs en potassium, en calcium, en
magnésium et en oligominéraux (Fe, Mn, Cu) ont été déterminées par absorption
atomique. Celle du zinc a été déterminée par émission atomique. Ces teneurs
apparaissent au tableau 2.1.
Tableau 2.1 Propriétés chimiques du terreau Agro Mix® avec ou sans ajout de superphosphate triple au moment de l’empotage des essais sur le basilic.
Conduct. électrique pH NH4
+ NO3- PO4
- K Ca Mg Fe Cu Mn Zn
(CE) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)
P- 0,97 5,52 2 2 4 75 125 18 2 0,1 0,6 0,7
P+ 1,06 5,44 1 2 37 78 140 20 2 0,1 0,7 0,8
*P- représente le terreau utilisé pour les traitements sans ajout de superphosphate triple et P+ pour les traitements avec ajout de superphosphate triple
26
2.2.6 Détermination de la teneur en éléments minéraux dans les feuilles de
basilic
La teneur en azote dans les échantillons de basilic a été obtenue par colorimétrie à
la suite de leur digestion (Isaac et Johson, 1976; Nkonge et balance, 1982). Les
analyses du phosphore, du potassium et des autres éléments (Ca, Mg, Fe, Mn,
Cu, Zn) ont été faites après la calcination des tissus végétaux. La teneur en
phosphore a été quantifiée par colorimétrie au spectrophotomètre (Murphy et
Riley, 1962), celle du potassium et des autres éléments (Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn)
par absorption atomique et émission atomique.
2.2.7 Détermination de la teneur en composés phénoliques totaux dans les
poudres sèches des feuilles de basilic
L’analyse du contenu en composés phénoliques totaux a été réalisée selon une
adaptation de la méthode de Singleton et Rossi (1965). Une quantité de 0,25 ±
0,05 g de poudre lyophilisée est placée dans un tube à centrifuger (Sarstedt®) de
15 ml et 10 ml d’une solution de méthanol aqueux 80 % a été ajoutée. Le tube est
par la suite placé au bain ultrasonique (Model 75D VWR) pour une durée de 15
minutes à 25 °C. Durant ces 15 minutes, le tube est brassé au vortex à deux
reprises pendant 30 secondes. Après la sonification, le tube est centrifugé et le
surnageant est transféré dans un tube à centrifuger (Sarstedt®) de 50 ml.
L’extraction est réalisée à nouveau à deux reprises avec la même quantité de
solvant sur le culot. Les 30 ml de surnageant combiné sont par la suite transférés
dans un ballon et le solvant est évaporé à l’évaporateur rotatif à une température
de 35 °C (Rotovapor R-200, Heating bath B-490, Büchi). Lorsque le volume dans
le ballon atteint environ 3 ml, l’extrait est récupéré dans un cylindre gradué et
complété à l’aide d’eau bidistillée à un volume total de 50 ml.
27
Par la suite, une aliquote de 100 µl d’échantillon est placée dans une cuvette en
plastique servant à la spectrophotométrie. À cette même cuvette, on ajoute 2 ml
d’eau bidistillée et 200 µl de la solution réactive Folin-Ciocalteu’s. La cuvette est
agitée durant 2 minutes avant d’ajouter 900 µl d’une solution de carbonate de
sodium (Na2CO3 – 200 g/L). Un temps d’incubation de deux heures est nécessaire
avant la prise de l’absorbance au spectrophotomètre (modèle 8453 HP) à une
longueur d’onde de 765 nm. Préalablement, des standards de 50, 100, 250 et
500 mg/l d’acide gallique ont été préparés et ont servi de valeurs de référence pour
tracer une courbe standard. Les valeurs du contenu en composés phénoliques
totaux sont ainsi quantifiées en mg/100 g de matière fraîche d’équivalent acide
gallique.
2.2.8 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes
2.2.8.1 Extraction et détermination des teneurs en caroténoïdes totaux
La méthode utilisée est une adaptation de trois méthodes similaires (Biehler et
coll., 2010). L’ensemble des manipulations doit se faire le plus possible à l’abri de
la lumière et les échantillons doivent être conservés sur la glace. Une quantité de
0,080 ± 0,005 g de poudre lyophilisée de feuilles de basilic a été placée dans un
tube (Sarstedt®) de 15 ml. À ce même tube, 4 ml de méthanol et 1 ml de
KOH:méthanol (30 % w/v) sont ajoutés afin d’éliminer la chlorophylle par
saponification. Le tube est brassé au vortex pendant 30 secondes et incubé 15
minutes sur la glace.
Après la saponisation, le tube est centrifugé à 3500 rpm pendant 7 minutes et le
surnageant est transféré dans un tube à centrifuger (Sarsted®) de 50 ml. Au tube
28
contenant le culot sont ajoutés 5 ml d’une solution d’hexane:éthanol:acétone
(2:1:1) (HEA). Le tube est brassé à deux reprises au vortex pendant 30 secondes
et placé au bain ultrasonique pendant 10 minutes à 10 °C. L’échantillon est à
nouveau centrifugé à 3500 rpm pendant 7 minutes. Ces étapes d’extraction
utilisant la solution d’HEA sont répétées deux fois. Les surnageants qui résultent
de ces trois extractions successives sont combinés dans un même tube, 5 ml
d’eau distillée saturée en chlorure de sodium sont ajoutés à celui-ci. Le tube
contenant les surnageants est brassé au vortex pendant 30 secondes et centrifugé
à 3500 rpm pendant 2 minutes. Suite à ces opérations, la solution se sépare en
deux phases : une phase apolaire jaune foncé en surface et une autre phase
polaire jaune pâle en dessous. À l’aide d’une pipette pasteur, la phase apolaire
supérieure est récupérée et transférée dans un tube de 15 ml. La phase polaire est
lavée par l’ajout de 2,5 ml d’hexane. Le tube est brassé au vortex et centrifugé
selon la même méthode. La phase apolaire est à nouveau récupérée et transférée
au tube contenant le premier surnageant apolaire. La phase polaire est lavée une
dernière fois à l’hexane suivant la même méthode. Lorsque l’ensemble des phases
apolaires a été récupéré, le volume total est ajusté à 10 ml d’hexane. Ensuite, 3 ml
de la solution sont placés dans une cuvette en quartz servant à la
spectrophotométrie et l’absorbance de la solution est mesurée à une longueur
d’onde de 450 nm au spectrophotomètre (modèle 8453 HP).
La quantification se fait selon la formule mathématique suivante :
C(mg/g) =
(Abs450nm / A1cm1%) x (Volume d’hexane (dL) / Poids de l’échantillon (g)) x
(1000 mg/g) x Dilution
*A1cm1% du β-carotène dans l’hexane = 2592 dL g-1 à 450 nm
29
La quantité obtenue représente le contenu en caroténoïdes totaux en équivalent β-
carotène dans 1 g de poudre lyophilisée de basilic. La valeur est convertie en
mg/100 g de matière fraîche d’équivalent β-carotène.
2.2.8.2 Séparation et détermination de la teneur des différents caroténoïdes
Cette méthode est une adaptation de celle de Gilmore et Yamato (1991). Un
volume de 5 ml de la solution d’extraction contenant les caroténoïdes est transféré
dans un tube de verre et le contenu est séché sous azote. Lorsque le contenu du
tube est sec, les caroténoïdes sont resolubilisés dans 700 µl d’une solution de
MTBE (Methyl tert-butyl ether):méthanol (91:9). Le tube est brassé au vortex
durant 30 secondes afin d’assurer la pleine solubilisation des caroténoïdes. La
solution résultante est placée dans une fiole de 1 ml pour l’analyse par
chromotographie en phase liquide à haute performance (CLHP).
L’analyse des caroténoïdes par CLHP se fait selon l’adaptation de la méthode de
Gilmore (Gilmore et Yamamoto, 1991). Les caroténoïdes sont séparés à l’aide
d’une colonne YMC C30 250 mm X 4,6 mm (particules 5 µm) maintenue à une
température de 30 °C. La séparation des caroténoïdes se fait à l’aide d’un système
Waters (Waters 600). Les phases mobiles permettant la séparation se composent
d’une phase A : méthanol:MTBE:eau (81:15:4) et d’une phase B : méthanol:MTBE
(9:91). Les gradients suivent les proportions suivantes : 100 % A et 0 % B jusqu’à
50 % A et 50 % B durant les 45 premières minutes d’analyse suivie de 50 % A et
50 % B pendant les 25 minutes suivantes. La colonne est rééquilibrée pendant 25
minutes entre chaque échantillon. Le volume de l’échantillon injecté dans le
système (Waters 717plus) est de 10 µl. Les caroténoïdes sont détectés à une
longueur d’onde de 450 nm par le détecteur UV à photodiode (Waters PDA 996).
30
2.2.9 Détermination de la capacité antioxydante des extraits de poudre de
basilic
2.2.9.1 Extraction des composés liposolubles (L-ORAC)
L’extraction des composés liposolubles (L-ORAC) a été effectuée selon une
adaptation de la méthode de Wu et collaborateurs (2004). L’ensemble des
manipulations s’est déroulé le plus possible à l’abri de la lumière. Une quantité de
0,25 ± 0,05 g de poudre lyophilisée de feuilles de basilic est placée dans un tube
Sarsted® de 15 ml. Un volume de 10 ml d’hexane:dichlorométhane (1:1) est ajouté
au tube. L’échantillon est brassé au vortex pendant 30 secondes et placé ensuite
au bain ultrasonique pendant 10 minutes à une température de 37 °C. Le tube est
par la suite centrifugé à 3500 rpm durant 10 minutes. Le surnageant est recueilli
dans un autre tube et une deuxième extraction est effectuée sur le culot. Les deux
surnageants sont mélangés et transférés dans un ballon pour être évaporés à
l’évaporateur rotatif à une température de 45 °C. Une fois le résidu séché, il est
resolubilisé dans 4,5 ml de RMCD (randomly methylated β-cyclodextrin) 7 % et
1,5 ml d’acétone. Cette solution est utilisée pour l’analyse des composés
liposolubles.
2.2.9.2 Extraction des composés hydrosolubles (H-ORAC)
Le tube contenant le culot de l’extraction des composés liposolubles est réutilisé
pour l’extraction des composés hydrosolubles. Un volume de 10 ml
d’acétone:eau:acide acétique (70:29,5:0,5) est ajouté au culot. Les deux
extractions sont réalisées selon la même méthodologie que celle de l’extraction
des composés liposolubles. Seul le solvant diffère pour les extractions et celui-ci
n’est pas évaporé.
31
2.2.9.3 Mesure de la capacité antioxydante
La mesure de la capacité antioxydante des extraits de basilic est réalisée selon la
méthode ORAC (capacité d’absorption des radicaux oxygénés / oxygen radical
absorbance capacity) (Wu, 2004). Les deux surnageants des extractions sont
utilisés pour la mesure de la capacité antioxydante. La solution de l’extraction
liposoluble est diluée d’un facteur de 50 dans une solution de RMCD 7 %. Quant à
elle, la solution de l’extraction hydrosoluble est diluée d’un facteur de 400 dans une
solution de tampon phosphate (NaH2PO4-Na2HPO4) de 0,075 M (pH 7,0).
L’ensemble des mesures de capacité antioxydante se réalise à l’aide de plaques à
96 puits (Corning 3615) analysées au Fluorimètre (Galaxy, BMG) à une longueur
d’onde de 520 nm et à une température de 37 °C. Les puits extérieurs de la plaque
restent vides pour des raisons d’isolation thermique. Dans chaque puits restant,
200 µl d’une solution de fluorescéine (fluorescéine sodium, 9,6 x 10-8 M) et 20 µl
des solutions standards de trolox (0, 6,25, 12,5, 25 ou 50 µM) ou 20 µl d’extrait des
échantillons sont ajoutés. Les différentes solutions standards sont réalisées selon
les mêmes solutions que les dilutions des échantillons et sont utilisées comme
valeur de référence pour tracer la courbe standard. Une plaque différente a été
préparée pour chaque série d’analyses d’échantillons hydrosolubles ou
liposolubles. Un triplicata des standards et des échantillons est réalisé dans
chacun des cas.
L’analyse s’effectue en 35 cycles de 210 secondes pour un temps d’analyse total
de 2 heures, 2 minutes, 30 secondes. Au cycle #4, un volume de 75 µl de 2,2’-
Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 0,0317 M est ajouté dans les
puits pour les analyses L-ORAC alors qu’un volume de 75 µl à 0,0634 M a été
ajouté pour les analyses H-ORAC. L’ajout de l’AAPH démarre la réaction
d’oxydation. Les résultats sont exprimés en µM de capacité antioxydante en
équivalent trolox / 100 g de matière fraîche à un taux de 85 % d’humidité des
échantillons lors de la récolte.
32
2.2.10 Analyse statistique
L’ensemble des analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel d’analyse
statistique SAS® et du test LSMEANS de la procédure MIXED. Rappelons que le
dispositif expérimental est un plan factoriel à deux facteurs en blocs complets
aléatoires répété six fois.
2.3 Résultats
2.3.1 Taux de colonisation des racines des plants de basilic par le
champignon Glomus irregulare
À la fin de la première expérience sur le basilic, les taux de colonisation des
racines inoculées par le champignon endomycorhizien Glomus irregulare variait de
37 à 56,6 % (Tableau 2.2). Les racines des plants de basilic des traitements sans
ajout d’inoculant ne présentaient aucune contamination. L’application de la double
dose d’inoculant (M2X) évalué à environ 480 (320 au semis et 160 à l’empotage)
propagules du champignon Glomus irregulare a engendré une augmentation
significative des taux de colonisation des racines des plants de basilic
comparativement à l’application de la simple dose (M1X) évaluée à 320 (160 au
semis et 160 à l’empotage) propagules. Ce résultat cohérent est dû à la présence
d’un plus grand nombre de propagules dans le terreau au départ.
Les taux de colonisation des racines de basilic à la fin de la deuxième expérience
se sont élevés entre 44 et 86 % en fonction des traitements appliqués (Tableau
2.2). La double dose d’inoculant (M2X) a eu comme effet une augmentation
significative de la colonisation des racines de basilic par le champignon
mycorhizien. L’application de superphosphate triple dans le substrat a entraîné une
diminution du taux de colonisation. Cette observation en accord avec d’autres
études est abondamment rapportée dans la littérature.
33
Tableau 2.2 Taux de colonisation des racines des plants de basilic par le
champignon endomycorhizien à arbuscules Glomus irregulare en fonction
de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple.
Traitements
Taux de colonisation
(%)
Expérience 1 Expérience 2
NM 0 0
P- M1X 38 ± 19 77 ± 9
M2X 57 ± 18 86 ± 9
NM 0 0
P+ M1X 46 ± 14 44 ± 19
M2X 48 ± 18 56 ± 18
Facteur mycorhize F * F *
1X 42 b 61 b 2X 53 a 71 a
Facteur phosphore F n.s. F ***
P- - 82 a P+ - 50 b
Int. myc x phos F n.s. F n.s. P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant.
Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s : non significatif; significatif à * P≤ 0,05; *** P≤ 0,001).
2.3.2 Croissance des plants de basilic
Au cours de la première expérience sur le basilic, les plants ayant reçu une double
dose d’inoculant (M2X) ont présenté une croissance significativement inférieure
aux plants non inoculés (NM) et aux plants ayant reçu une simple dose d’inoculant
(M1X) (Tableau 2.3). De plus, les traitements ayant reçu un ajout de
superphosphate triple (P+) ont présenté une masse fraîche de la partie aérienne à
34
la récolte significativement supérieure aux traitements n’ayant reçu aucun ajout de
superphosphate triple (P-).
Pour ce qui est de la deuxième expérience sur le basilic, il n’y a pas eu d’effet
significatif du facteur mycorhize (Tableau 2.3). Comme pour l’expérience 1, l’ajout
de superphosphate triple a permis à l’ensemble des plants des traitements P+
d’avoir une croissance significativement supérieure aux plants des traitements
sans ajout de superphosphate P-. Le champignon semble avoir réagi
favorablement à la présence de phosphore supplémentaire, contrairement à ce qui
s’est produit au cours de la première expérience. Il y a eu une augmentation
significative de la croissance des plants mycorhizés des traitements P+M1X et
P+M2X comparativement aux plants du traitement P+NM. Des photos des récoltes
sont disponibles à l’annexe 1.
35
Tableau 2.3 Masses fraîches aériennes des plants de basilic en fonction de la
dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple.
Traitements
Masse fraîche
(g)
Expérience 1 Expérience 2
NM 26,5 ± 3,8 68,7 ± 2,3 c
P- M1X 26,1 ± 5,8 66,3 ± 6,0 c
M2X 23,4 ± 3,7 66,4 ± 3,0 c
NM 37,4 ± 5,0 75,4 ± 6,2 b
P+ M1X 37,2 ± 3,6 82,9 ± 3,5 a
M2X 32,8 ± 4,6 81,8 ± 3,4 a
Facteur mycorhize F ** F n.s.
NM 31,95 a -
1X 31,64 a -
2X 28,06 b -
Facteur phosphore F *** F n.s.
P- 25,35 b -
P+ 35,79 a -
Int. myc x phos F n.s. F **
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant. Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à ** P≤ 0,01; *** P≤ 0,001).
2.3.3 Teneur en éléments minéraux des feuilles des plants de basilic
2.3.3.1 Première expérience
Les analyses minérales (Tableau 2.4) des feuilles de basilic lyophilisées après la
récolte ont permis de d’observer les effets de la mycorhize sur les teneurs en
potassium, en calcium, en magnésium et en zinc. La teneur en potassium a été
significativement plus élevée pour le traitement M2X comparativement aux
traitements M1X et NM. Pour le calcium, le magnésium et le zinc, les plants des
36
traitements M2X ont présenté une différence significative à la baisse par rapport
aux plants des traitements NM et M1X. Pour ce qui est de l’effet du phosphore, les
traitements ayant reçu un ajout de superphosphate triple ont présenté une
diminution significative du contenu en azote dans leurs feuilles. Les plants avec
ajout de superphosphate (P+) ont aussi montré une teneur significativement plus
élevée en manganèse.
37
Tableau 2.4 Teneur en éléments minéraux (base sèche) dans les feuilles des plants de basilic de la première
expérience en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple.
N P K Ca Mg
Fe Cu Mn Zn
Traitements (%) (mg/kg)
NM 0,91 ± 0,05 0,22 ± 0,02 1,48 ± 0,46 0,28 ± 0,06 0,36 ± 0,06
58 ± 29 5 54 ± 13 51 ± 1
P- M1X 0,87 ± 0,06 0,23 ± 0,06 1,39 ± 0,29 0,27 ± 0,04 0,38 ± 0,07
58 ± 40 6 58 ± 21 57 ± 1
M2X 0,98 ± 0,01 0,26 ± 0,03 1,91 ± 0,25 0,22 ± 0,02 0,32 ± 0,04 64 ± 53 5 48 ± 21 45 ± 1
NM 0,84 ± 0,08 0,21 ± 0,02 1,41 ± 0,33 0,29 ± 0,04 0,40 ± 0,08
66 ± 36 4 77 ± 14 57 ± 1
P+ M1X 0,82 ± 0,08 0,22 ± 0,04 1,27 ± 0,10 0,29 ± 0,03 0,41 ± 0,03
44 ± 7 5 74 ± 11 59 ± 1
M2X 0,86 ± 0,09 0,23 ± 0,03 1,73 ± 0,14 0,23 ± 0,03 0,32 ± 0,04 48 ± 13 5 78 ± 24 45 ± 1
Effets fixes
Mycorhize F n.s. F n.s. F ** F ** F * F n.s. F n.s. F n.s. F *
NM - - 1,45 b 0,28 a 0,38 a
- - - 54 ab
M1X - - 1,33 b 0,28 a 0,4 a
- - - 58 a
M2X - - 1,82 a 0,22 b 0,32 b
- - - 45 b
Phosphore F ** F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F *** F n.s.
P- 0,92 a - - - -
- - 54 b -
P+ 0,84 b - - - -
- - 77 a -
Int. M x P F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant. Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05; ** P≤ 0,01; *** P≤ 0,001).
38
2.3.3.2 Deuxième expérience
Les plants de basilic de l’expérience ayant été mycorhizés et avec ajout de
superphosphate triple (P+M1X et P+M2X) ont présenté une augmentation
significative de la teneur en phosphore dans les feuilles (Tableau 2.5). Ce résultat
est sans contredit le plus documenté dans la littérature sur les champignons
mychoriziens à arbuscules. On peut ici comparer les traitements entre eux du fait
qu’il y a eu une interaction entre les deux facteurs étudiés. On remarque pour les
traitements sans ajout de superphosphate triple que la différence de la teneur en
phosphore n’est pas significative. La solution fertilisante contenait peu de
phosphore et les substrats tourbeux offrent peu de phosphore assimilable aux
racines une fois que la charge nutritive de départ présente dans le terreau est
épuisée. Lorsqu’une dose de superphosphate est ajoutée au traitement P+M1X et
P+M2X, on peut remarquer un effet important de la mycorhize en comparant ces
valeurs au traitement non inoculé (P+NM). Le contenu en phosphore des plants
mycorhizés était 34 % plus élevé dans le traitement P+M1X et 39 % plus élevé
dans le traitement P+M2X. Dans la deuxième expérience, la mycorhize n’a pas eu
d’autres effets sur l’absorption minérale des plants de basilic.
Pour ce qui est de l’effet du phosphore, l’interaction observée pour la teneur en
phosphore entre les deux facteurs nous mène à comparer les traitements entre
eux. Il y a eu une augmentation de la teneur en phosphore dans les traitements
avec ajout de superphosphate triple (P+). Ce résultat est cohérent puisqu’il y a eu
ajout de phosphore au départ dans le substrat. Le phosphore a aussi entraîné une
augmentation significative de l’absorption du magnésium et du manganèse.
Toutefois, le zinc a été retrouvé en plus faible quantité (significativement) dans les
feuilles des plants de basilic ayant reçu un ajout de superphosphate triple (P+), le
phosphore étant un antagoniste de l’absorption du zinc.
Une seconde interaction a été détectée entre le facteur mycorhize et le facteur
phosphore concernant le potassium. Cet élément a été significativement plus
abondant dans le traitement P-M1X tandis que les autres traitements inoculés
39
n’ont pas été différents de ceux non inoculés. Les plants du traitement P-M1X
étaient toutefois les plus petits.
40
Tableau 2.5 Teneur en éléments minéraux (base sèche) dans les feuilles des plants de basilic de la deuxième
expérience en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple.
N P K Ca Mg
Fe Cu Mn Zn
Traitements (%) (mg/kg)
NM 1,27 ± 0,16 0,86 ± 0,07 c 0,71 ± 0,17 b 0,21 ± 0,04 0,44 ± 0,07
51 ± 8 5 127 ± 30 41 ± 6
P- M1X 1,15 ± 0,14 0,83 ± 0,14 c 0,87 ± 0,15 a 0,18 ± 0,01 0,39 ± 0,09
65 ± 30 6 137 ± 25 49 ± 10
M2X 1,22 ± 0,13 0,91 ± 0,15 c 0,71 ± 0,06 b 0,18 ± 0,02 0,43 ± 0,09 54 ± 18 5 128 ± 29 49 ± 11
NM 1,20 ± 0,12 1,48 ± 0,21 b 0,71 ± 0,10 b 0,21 ± 0,04 0,55 ± 0,12
63 ± 10 5 148 ± 52 34 ± 8
P+ M1X 1,17 ± 0,13 2,25 ± 0,25 a 0,67 ± 0,07 b 0,21 ± 0,02 0,62 ± 0,10
80 ± 38 5 167 ± 57 39 ± 10
M2X 1,19 ± 0,15 2,44 ± 0,36 a 0,72 ± 0,06 b 0,19 ± 0,03 0,56 ± 0,15 70 ± 29 5 150 ± 38 38 ± 9
Effets fixes
Mycorhize F n.s. - - F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
NM - - - - -
- - - -
M1X - - - - -
- - - -
M2X - - - - -
- - - -
Phosphore F n.s. - - F n.s. F *** F n.s. F n.s. F * F **
P- - - - - 0,42 b
- - 131 b 46 a
P+ - - - - 0,58 a
- - 157 a 37 b
Int. m x p F n.s. F *** F * F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant. Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05; ** P≤ 0,01; *** P≤ 0,001).
41
2.3.4 Teneur en composés phénoliques totaux dans les feuilles de basilic
Au cours de la première expérience, l’inoculation par les champignons
mycorhiziens n’a pas eu d’impact significatif sur le contenu en composés
phénoliques dans les plants des traitements inoculés (Tableau 2.6). Ces composés
ont été en quantité légèrement plus élevée dans les feuilles des plants du
traitement P-NM comparativement à ceux des traitements inoculés P-M1X et P-
M2X. L’ajout de phosphore dans le substrat a eu pour effet une augmentation
significative de la teneur en composés phénoliques comparativement aux plants
n’en ayant pas reçu. Cependant, une faible corrélation a été obtenue entre la
concentration en phosphore dans les feuilles et la teneur en composés
phénoliques.
Il est intéressant de retrouver les mêmes résultats suite à l’analyse des plants de la
deuxième expérience. Similairement, il n’y pas eu d’effet engendré par la
mycorhization, mais l’ajout de superphosphate a entraîné une hausse de la
quantité des phénols totaux dans la plante. Comme pour la première expérience, il
n’y a eu qu’une faible corrélation entre la concentration en phosphore et la teneur
en composés phénoliques dans les feuilles de basilic. Il n’y a pas eu d’interaction
significative entre le facteur mycorhize et le facteur phosphore, et ce, pour les deux
expériences.
42
Tableau 2.6 Teneur en composés phénoliques totaux dans les feuilles de
basilic en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de
superphosphate triple.
Traitements
Teneur en composés phénoliques totaux
(mg/100 g frais EAG1)
expérience 1 expérience 2
NM 1005 ± 156 979 ± 119
P- M1X 966 ± 59 827 ± 79
M2X 991 ± 81 878 ± 46
NM 1047 + 53 994 ± 67
P+ M1X 1028 ± 72 1018 ± 68
M2X 1070 ± 60 995 ± 112
Facteur mycorhize F n.s. F n.s.
NM - -
1X - -
2X - -
Facteur phosphore F * F **
P- 987 b 895 b
P+ 1048 a 1002 a
Int. myc x phos F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant. Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas
significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05; ** P≤ 0,01) 1EAG=Équivalent acide gallique.
2.3.5 Teneur en caroténoïdes totaux dans les feuilles de basilic
L’analyse de la teneur en caroténoïdes dans les feuilles de basilic de la première
expérience a démontré un effet significatif du facteur mycorhize (Tableau 2.7).
Bien que les plants de basilic inoculés avec une seule dose d’inoculum (M1X) n’ont
pas présenté de différence significative par rapport aux plants non inoculés (NM),
les plants inoculés avec une double dose d’inoculant ont montré des teneurs en
caroténoïdes totaux, en lutéine (principale xanthophylle) et en β-carotène (principal
carotène) significativement supérieures. Aucune interaction n’a été observée entre
les deux facteurs. Néanmoins, les plants du traitement P-M2X ont présenté une
43
synthèse accrue en caroténoïdes totaux de l’ordre de 13 et 20 % comparativement
aux plants des traitements P-NM et P-M1X respectivement. Cette augmentation de
la synthèse est aussi valable pour la lutéine et le β-carotène. Il est intéressant de
noter que les plants du traitement P-M2X étaient les plus petits et ceux qui
présentaient la plus forte teneur en macroéléments N-P-K. Ces mêmes effets ont
aussi été remarqués dans les traitements avec ajout de superphosphate triple. De
ce côté, les deux traitements avec ajout d’inoculant ont donné des résultats
légèrement plus élevés que ceux sans ajout d’inoculant même si les différences
n’ont pas été significatives. Il est intéressant de remarquer que les profils des
contenus en lutéine et en β-carotène suivent celui de la concentration des
caroténoïdes totaux. De bonnes corrélations ont été obtenues entre la teneur en
caroténoïdes et la teneur en azote (r2=0,64; F<0,0001; n=34) ainsi que pour la
teneur en caroténoïdes et la teneur en phosphore (r2=0,72; F<0,0001; n=34) dans
les feuilles des plants.
L’effet du phosphore est aussi ressorti, les plants des traitements avec ajout de
superphosphate triple (P+) possédaient des teneurs en caroténoïdes totaux, en
lutéine et en β-carotène significativement plus faibles que les plants sans ajout de
superphosphate triple (P-).
Au cours de la deuxième expérience sur le basilic, aucune différence significative
n’a été observée concernant les teneurs en caroténoïdes. Les effets fixes
mycorhize et phosphore n’ont donc eu aucun impact sur les plants de cette
deuxième expérience.
44
Tableau 2.7 Teneur en caroténoïdes totaux, en lutéine et en β-carotène dans les feuilles des plants de basilic des
deux expériences en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de superphosphate triple.
Traitements
Caroténoïde totaux Lutéine β-Carotène
(mg/100g frais d'équivalent β-carotène)
expérience 1 expérience 2 expérience 1 expérience 2 expérience 1 expérience 2
NM 3,85 ± 0,40 7,55 ± 0,99 1,72 ± 0,31 3,60 ± 0,54 1,03 ± 0,19 2,41 ± 0,42
P- M1X 3,55 ± 0,55 7,00 ± 0,79 1,49 ± 0,25 3,31 ± 0,51 0,90 ± 0,05 2,16 ± 0,20
M2X 4,41 ± 0,53 7,16 ± 0,65 2,04 ± 0,32 3,38 ± 0,41 1,19 ± 0,17 2,19 ± 0,28
NM 3,43 ± 0,49 6,92 ± 1,08 1,25 ± 0,13 3,39 ± 0,68 0,70 ± 0,12 2,25 ± 0,32
P+ M1X 3,53 ± 0,49 6,64 ± 0,65 1,42 ± 0,24 3,18 ± 0,49 0,83 ± 0,17 2,00 ± 0,27
M2X 3,57 ± 0,48 6,72 ± 0,87 1,62 ± 0,32 3,28 ± 0,42 0,92 ± 0,16 2,09 ± 0,30
Facteur mycorhize F * F n.s. F *** F n.s. F ** F n.s.
NM 3,64 b - 1,49 b - 0,87 b -
1X 3,54 b - 1,46 b - 0,86 b -
2X 3,99 a - 1,83 a - 1,06 a -
Facteur phosphore F ** F n.s. F *** F n.s. F *** F n.s.
P- 3,94 a - 1,75 a - 1,04 a -
P+ 3,51 b - 1,43 b - 0,82 b -
Int. myc x phos F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant. Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05; ** P≤ 0,01; *** P≤ 0,001).
45
2.3.6 Capacité antioxydante des extraits de feuilles des plants de basilic
L’analyse des données relatives à la capacité antioxydante des extraits
hydrosolubles et totaux des plants de basilic de l’expérience 1 n’a pas révélé de
différence significative entre les traitements (Tableau 2.8). En revanche, le facteur
mycorhize a présenté des différences significatives pour la capacité antioxydante
des extraits liposolubles. Les plants inoculés avec seulement une dose d’inoculant
(M1X) avaient une capacité antioxydante de leur extrait liposoluble
significativement inférieure à celle des plants témoins non inoculés (NM), alors que
les plants inoculés avec la double dose d’inoculant (M2X) possédaient une
capacité antioxydante intermédiaire. Le phosphore n’a causé pour sa part aucun
effet au cours de la première expérience. On remarque que la capacité
antioxydante de l’extrait hyrodrosoluble contribue à près de 90 % de la capacité
antioxydante des plants de basilic et que les résultats de la capacité antioxydante
totale ressemblent considérablement à ceux de la teneur en composés
phénoliques.
Au cours de la deuxième expérience, l’ajout de superphosphate triple a été le seul
paramètre à générer une augmentation significative de la capacité antioxydante
des extraits liposolubles (Orac-L) (Tableau 2.8). Le facteur mycorhize n’a pas eu
d’effet au cours de la deuxième expérience et il n’y a pas eu d’interaction entre les
deux facteurs.
46
Tableau 2.8 Capacité antioxydante des extraits hydrosolubles (Orac-H), liposolubles (Orac-L) et totaux (Orac-T)
des feuilles de basilic des deux expériences en fonction de la dose d’inoculant mycorhizien et de l’ajout de
superphosphate triple.
Traitements
Expérience 1
Expérience 2
Orac-T Orac-H Orac-L
Orac-T Orac-H Orac-L
(µM/100g frais TEAC)
(µM/100g frais TEAC)
NM 35449 ± 4477 32534 ± 4470 2954 ± 403
36377 ± 3408 33303 ± 3160 3074 ± 753 P- M1X 32780 ± 2273 30041 ± 1863 2739 ± 692
30945 ± 3072 27838 ± 2815 3107 ± 393
M2X 33756 ± 4785 30923 ± 5036 2833 ± 587 53348 ± 3925 32415 ± 3877 3037 ± 406
NM 35721 ± 3242 32557 ± 3519 3165 ± 715
36682 ± 5421 33128 ± 4949 3555 ± 684
P+ M1X 35661 ± 5323 33391 ± 5279 2270 ± 313
34425 ± 3932 31348 ± 3868 3077 ± 555
M2X 36918 ± 3765 34094 ± 3613 2825 ± 458
33706 ± 3888 30075 ± 3921 3631 ± 603
Facteur mycorhize F n.s. F n.s. F * F n.s. F n.s. F n.s.
NM - - 3060 a
- - - 1X - - 2504 b
- - -
2X - - 2829 ab
- - -
Facteur phosphore F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F *
P- - - -
- - 3073 b P+ - - -
- - 3438 a
Int. myc x phos F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements non inoculés, M1X représente les traitements ayant reçu une dose d’inoculant, M2X représente les traitements ayant reçu une double dose d’inoculant. Les résultats d’une même colonne suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05).
47
2.4 Discussion et conclusion
2.4.1 Première expérience sur le basilic
2.4.1.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale
La croissance des plants de basilic de la première expérience semble avoir été
affectée par le taux de colonisation mycorhizienne des racines. L’application de la
double dose d’inoculant (M2X) dans le substrat a généré des taux de colonisation
plus élevés que la simple dose (M1X). Le taux de colonisation qui en a résulté
semble avoir eu un impact négatif sur la croissance des plants probablement dû à
un manque de ressources nutritives pour les deux partenaires et un partage de
celles-ci à l’intérieur du pot. L’inoculation mycorhizienne par cette double dose
(M2X) a entraîné des teneurs plus faibles en calcium, en magnésium ainsi qu’en
zinc. Il est possible que les teneurs plus faibles de ces éléments aient créé un effet
limitant sur la croissance des basilics du traitement M2X. En contrepartie, on a
observé une accumulation significative de potassium ainsi que la présence plus
élevée, mais non significative, d’éléments comme l’azote et le phosphore.
L’ajout de superphosphate triple (traitement P+) a favorisé significativement la
croissance du basilic. Cela s’est traduit par une augmentation du rendement en
masse fraîche de la partie aérienne de 41 % comparativement aux plants des
traitements qui n’en ont pas reçu. Le phosphore n’a pas eu d’impact sur la
colonisation des racines par le champignon lors de cette première expérience. Cet
ajout de superphosphate triple a diminué la teneur en azote dans les feuilles du
basilic. Comme les plants étaient significativement plus gros, la teneur en azote
dans les feuilles a conséquemment diminué et ceci a possiblement eu une
répercussion sur la synthèse des constituants photosynthétiques tels les
caroténoïdes. Les plants de basilic de la première expérience ont reçu une solution
fertilisante faible en azote allant de 50 à 150 mg/l selon le stade de croissance des
48
plants afin d’observer les effets de l’association mycorhizienne dans des conditions
de culture plus limitatives. L’ajout de superphosphate triple a favorisé l’assimilation
du manganèse, dû à la synergie existante entre ces deux éléments.
2.4.1.2 Effet sur les métabolites secondaires
L’accumulation d’éléments minéraux comme l’azote et le phosphore, ainsi que la
plus faible dimension des plants, ont probablement favorisé la synthèse d’une plus
grande quantité de caroténoïdes totaux dans les feuilles des traitements M2X. La
lutéine est la principale xanthophylle et le β-carotène le principal carotène chez le
basilic. La teneur de ces deux composés a été significativement augmentée en
présence de la double dose d’inoculant (M2X). Ces observations semblent
démontrer que les caroténoïdes ont été synthétisés et se sont accumulés en plus
grande quantité dû aux teneurs plus élevées de certains minéraux dans les plants
ayant reçu cette double dose d’inoculant. De bonnes corrélations ont été obtenues
entre la teneur en azote et en phosphore et la teneur en caroténoïdes dans les
feuilles des plants de basilic démontrant ainsi une relation importante entre ces
paramètres.
L’ajout de superphosphate triple a engendré une augmentation significative des
teneurs en composés phénoliques totaux dans les plants. Cependant, la
corrélation entre la teneur en phosphore et la teneur en composés phénoliques est
faible. Il semble que la présence de phosphore ait stimulé les mécanismes de
défense de la plante. La capacité antioxydante des extraits des plants de basilic de
la première expérience n’a présenté aucune différence significative entre les
traitements. On peut cependant observer une tendance similaire entre les résultats
de la teneur en composés phénoliques et les résultats de la capacité antioxydante
des plants de basilic. Les plants ayant reçu un ajout de superphosphate triple ont
présenté des capacités antioxydantes totales supérieures aux plants qui n’en n’ont
pas reçu.
49
2.4.2 Deuxième expérience sur le basilic
2.4.2.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale
Au cours de la deuxième expérience, la double dose d’inoculant (M2X) a permis
une colonisation racinaire par le champignon significativement supérieure à la
simple dose démontrant l’importance de la dose d’inoculant initiale sur le taux de
colonisation des racines à la récolte. Il est intéressant de constater, même si la
différence n’est pas significative, que la masse moyenne aérienne des plants des
traitements P-M1X et P-M2X a été inférieure à celle du traitement P-NM comme ce
fut le cas lors de la première expérience. La nature organique du substrat en est
probablement la cause. Les plants des traitements avec ajout d’inoculum et ajout
de superphosphate triple (P+M1X) et (P+M2X) ont présenté une croissance
significativement supérieure aux plants du traitement sans inoculum et avec ajout
de superphosphate triple (P+NM) dû à une meilleure assimilation du phosphore
conférée par l’association mycorhizienne. Cette stimulation de la croissance, due à
la capacité supérieure du champignon à absorber le phosphore, représente
environ 8,5 % d’augmentation de la masse fraîche de la partie aérienne des
basilics comparativement aux plants non inoculés. L’ajout de superphosphate triple
au substrat a aussi favorisé l’augmentation des rendements chez le basilic.
L’interaction entre les facteurs observés pour la teneur en phosphore dans les
feuilles propose que l’association mycorhizienne ait favorisé une meilleure
assimilation du phosphore chez les plants de basilic mycorhizés lorsque celui-ci
était présent dans le substrat. Les champignons mycorhiziens à arbuscules sont
réputés pour leur plus grande capacité à favoriser l’absorption des éléments
minéraux, comme le phosphore, dans les terreaux minéraux plutôt que dans les
terreaux organiques. Les sources minérales disponibles dans un terreau tourbeux
sont minimes outre la charge nutritive de départ et l’ajout de fertilisant au cours de
la période de croissance. La capacité du champignon à puiser les minéraux a été
limitée dans les traitements sans ajout de superphosphate. Ceci pourrait expliquer
les résultats entre les traitements avec et sans ajout de superphosphate triple.
50
L’ajout de superphosphate triple dans le substrat a entraîné une hausse
significative des teneurs en phosphore, en magnésium et en manganèse dans les
feuilles de basilic, mais aussi une baisse significative de la teneur en zinc dans les
feuilles des plants des traitements ayant reçu un amendement en phosphore. Les
baisses des teneurs en magnésium et en manganèse peuvent s’expliquer soit par
les processus synergiques d’assimilation entre les éléments dans le substrat ou
par l’effet de la mycorhize sur l’absorption des minéraux. Le résultat de la teneur
plus faible en zinc est probablement causé par l’effet antagoniste du phosphore sur
l’absorption du zinc.
2.4.2.2 Effet sur le métabolisme secondaire
Dans cette deuxième expérience, l’ajout de superphosphate triple a encore une
fois généré une augmentation significative de la teneur en composés phénoliques
dans les feuilles bien que la corrélation entre la teneur en phosphore et en
composés phénoliques dans les feuilles ait été faible. L’ajout de superphosphate
triple semble donc permettre à la plante de produire une plus grande quantité de
composés phénoliques possiblement grâce à un statut nutritionnel favorable et à
son possible effet éliciteur.
La teneur en caroténoïdes chez les plants n’a été aucunement influencée par le
facteur mycorhize ou par le facteur phosphore au cours de cette deuxième
expérience. Cela mène à en déduire que les mycorhizes ne semblent pas changer
les ratios des teneurs des différents caroténoïdes dans les feuilles de basilic. Le
statut nutritionnel des plants de basilic semble être à l’origine des variations des
teneurs en caroténoïdes dans les plants. Il est important de noter que la
fertilisation a été plus importante que lors de la deuxième expérience. Cette plus
grande disponibilité des minéraux a possiblement diminué les effets observables
des mycorhizes. L’observation d’une plus grande teneur en caroténoïdes dans les
51
feuilles lors de la deuxième expérience comparativement à la première peut
s’expliquer par une fertilisation apportant une plus forte teneur en éléments
minéraux.
L’ajout de superphosphate triple (P+) a finalement eu comme effet une
augmentation significative de la teneur en composés liposolubles antioxydants
dans les feuilles de basilic. Le statut nutritionnel de la plante en est probablement
encore une fois la cause.
2.4.3 Comparaison de l’étude avec la littérature
Des études antérieures sur le basilic ont démontré l’impact que peuvent provoquer
des fertilisations plus ou moins importantes en macroéléments sur les constituants
phytochimiques du basilic. Nguyen et Niemeyer (2008) ont observé une diminution
de la teneur en composées phénoliques, notamment l’acide rosmarinique, en
fonction de l’augmentation de l’apport en azote (0,1 à 5,0 mM) pendant la
croissance des plants de basilic. En plus de l’azote, d’autres teneurs en composés
phytochimiques ont pu être modifiées selon la fertilisation administrée en
phosphore, en potassium et en calcium (Suh et coll., 1999; Sing et coll., 2004;
Nguyen et coll., 2010). D’autres auteurs, comme Toussaint (2008), ont en
revanche présenté des résultats en faveur de l’impact direct de la mycorhize sur la
stimulation de la synthèse de l’acide rosmarinique, de l’acide caféique et de la
composition de l’huile essentielle des plants de basilic mycorhizés par le Glomus
mossea et le Glomus caledonium indépendamment de la dose en phosphore
contenue dans les plants. Dans cette même étude, le Glomus irregulare n’avait
pas produit les effets observés avec les deux autres champignons. Toussaint et
collaborateurs (2008) ont aussi démontré qu’un apport en phosphore chez les
plants non mycorhizés entraînait une hausse de la teneur de ces composés
phénoliques ce qui est en accord avec nos résultats. Les plants de basilic
mycorhizés avec le Glomus intraradices, désormais nommé Glomus irregulare,
52
n’ont pas démontré de variation significative de la teneur en composés
phénoliques totaux et de la teneur de certains composés phénoliques individuels.
2.4.4 Conclusion
Ces deux expériences ont démontré des résultats comparables, mais aussi
contradictoires qui peuvent cependant bien se compléter et s’expliquer. La
première expérience a démontré l’importance de l’association mycorhizienne sur
l’assimilation minérale lorsque les concentrations en minéraux dans le terreau sont
faibles. Dans cette expérience, ceci s’est traduit par une augmentation de la teneur
en caroténoïdes, mais aussi sur d’autres paramètres mesurés dans les plants
ayant reçu la double dose d’inoculant (M2X). La fertilisation plus prononcée en
azote de la deuxième expérience a fait diminuer l’effet observé de la mycorhize au
cours de la première expérience. Le taux de colonisation des racines par le
champignon mycorhizien semble avoir eu un impact sur la croissance des plants
lors de cette étude. L’augmentation de l’assimilation du phosphore par les
mycorhizes est souvent rapportée dans la littérature. Or, ce phénomène a été
observé lors de la deuxième expérience et a eu un effet favorable sur la croissance
du basilic.
Au cours des deux expériences, l’ajout de superphosphate triple a entraîné une
augmentation significative de la teneur de plusieurs composés phytochimiques
dont les composés phénoliques et les molécules de la capacité antioxydante de
l’extrait liposoluble. Comme le phosphore favorise ces hausses, il est fort probable
que la mycorhize provoque indirectement l’augmentation des composés
nutraceutiques chez le basilic par une assimilation supérieure du phosphore et/ou
d’autres minéraux. L’effet direct de la mycorhize n’a pas été observé sur les
analyses chimiques des plants en post-récolte lors de cette étude.
53
Pour conclure, l’effet direct du Glomus irregulare sur la stimulation de composés
nutraceutiques dans le basilic ne s’est pas manifesté dans cette étude, ce qui ne
signifie pas qu’il ne puisse y avoir d’effets directs des mycorhizes dans d’autres
conditions de culture ou avec l’utilisation d’autres espèces de champignon
mycorhizien. La première expérience réalisée nous a démontré l’impact de la
mycorhize lorsque la teneur en azote de la solution fertilisante est faible. Au cours
de cette étude, les plants de basilic n’ont été soumis à aucun stress, ce qui peut
avoir limité les effets de la mycorhize. Or, les effets les plus marqués des
mycorhizes sont souvent observés lorsque les plants sont en déficience nutritive
ou soumis à d’autres stress biotiques ou abiotiques (Smith et Read, 1997). Les
résultats de cette étude proposent de nouveaux résultats allant plutôt dans le sens
d’un effet indirect du Glomus irregulare via la nutrition minérale du basilic et de
l’impact de la fertilisation en macroéléments sur les teneurs en composés
nutraceutiques.
54
55
Chapitre 3
56
Chapitre 3 : Effet du champignon mycorhizien à arbuscules Glomus
irregulare sur la croissance, la nutrition minérale et la stimulation de la
synthèse de composés nutraceutiques chez la carotte (Daucus carota L.)
Résumé
Ce projet avait pour but de déterminer si la mycorhize pouvait influencer le
rendement en racines tubérisées, l’assimilation des minéraux et le métabolisme
secondaire de la carotte dans un terreau simulant un sol pauvre ou riche en
phosphore. Les rendements en racines tubérisées ont été significativement
augmentés dû à la mycorhization dans le terreau simulant un sol pauvre en
phosphore au cours de la deuxième expérience. La mycorhize a permis une
accumulation supérieure en cuivre dans les racines lors des deux expériences. Les
teneurs des autres éléments minéraux n’ont pas varié à la suite de l’établissement
mycorhizien. La mycorhize semble avoir modifié la synthèse de carotène par une
diminution de l’accumulation de l’α-carotène dans les carottes lors de la première
expérience. Cependant, cette observation n’a pas été notée lors du deuxième
essai. Il n’y a pas eu d’autres effets de la mycorhize sur les autres paramètres
phytochimiques mesurés du métabolisme secondaire. L’ajout de superphosphate
triple a permis une augmentation des rendements des racines tubérisées lors de la
deuxième expérience. De plus, l’amendement en phosphore a permis une
assimilation supérieure du phosphore et du magnésium, mais a été antagoniste à
l’absorption du potassium, du calcium et du cuivre. L’ajout de phosphore dans le
substrat a engendré un contenu supérieur en composés phénoliques totaux et en
caroténoïdes totaux. Des tendances démontrent que l’ajout de phosphore
engendre une augmentation de la capacité antioxydante des composés
hydrosolubles probablement liés à l’augmentation de la teneur en composés
phénoliques (deuxième expérience).
57
3.1 Introduction
Près de 80 % des plantes terrestres participent aux symbioses mycorhiziennes.
L’association mycorhizienne représente la symbiose végétale la plus importante et
elle est vitale pour le maintien et la productivité des écosystèmes terrestres.
Lorsqu’ils sont en relation avec les racines des plantes, ces champignons
favorisent dans la majorité des cas leur croissance, leur assimilation en eau et en
minéraux et les protègent contre plusieurs stress biotiques et abiotiques. De plus,
on sait qu’il est possible de favoriser la synthèse des métabolites secondaires
nutraceutiques en ajoutant ces organismes à la régie de culture. Cette stimulation
semble être l’effet direct de la colonisation racinaire par le champignon favorisant
ainsi la stimulation des mécanismes de défense de la plante, mais aussi l’effet
indirect d’une meilleure assimilation minérale conférée par le champignon. Depuis
peu, les producteurs peuvent se procurer diverses formulations d’inoculant
mycorhizien pouvant être utilisées autant en agriculture qu’en horticulture afin de
tirer profit des bienfaits de la symbiose tout en diminuant du même coup la quantité
de fertilisant à utiliser. La carotte se prête particulière bien à cette méthode
culturale, car elle se mycorhize facilement. Cette culture se fait partout dans le
monde et ses rendements moyens sont évalués à près de 30 à 40 t/ha selon les
données de la FAO. La racine tubérisée de la carotte est consommée en grande
quantité en Amérique du Nord dû à sa valeur gustative et nutraceutique
intéressante par rapport à son prix au marché. La carotte est une source
importante de carotène pour l’alimentation humaine. L’α-carotène et le β-carotène
sont les pigments majoritairement retrouvés (entre 45 à 80 %) dans les carottes
jaunes et oranges (Simon et Wolff, 1987; Alasalvar et coll., 2001). D’autres
pigments, comme les xanthophylles et les anthocyanines, peuvent être synthétisés
et s’accumuler en fonction du cultivar (Buishand et Gabelman, 1980). Les
carotènes sont reconnus pour se transformer en vitamine A dans l’organisme et la
carotte est l’une des sources les plus importantes de ces composés dans la diète
des Nord-Américains (Olsen, 1989). La capacité antioxydante des caroténoïdes à
séquestrer les radicaux libres oxygénés leur procure une place importante dans la
58
prévention des maladies comme les cancers, les maladies cardiovasculaires et la
dégénérescence maculaire (Fraser et Bramley, 2004). De plus, les produits de
clivage des caroténoïdes peuvent aussi agir dans les processus de défense de la
plante (Bouvier et coll., 2005). Le contenu en composés phénoliques est
relativement pauvre dans la carotte, mais elle contient une quantité non
négligeable de certains flavonoïdes comme le quercetine et la lutéoline (Bahorun
et coll., 2004). Elle procure aussi un apport intéressant en fibres et en glucides.
Les principaux objectifs de cette expérience étaient de : 1) déterminer si les
champignons endomycorhiziens peuvent favoriser la croissance et la nutrition
minérale de la carotte et 2) déterminer s’ils ont un impact direct ou indirect sur la
stimulation de la synthèse des métabolites secondaires nutraceutiques de la
carotte.
3.2 Matériels et méthodes
3.2.1 Biologie de la carotte et conditions de culture
La carotte (Daucus carota L.) est une plante herbacée bisannuelle appartenant à la
famille des Apiacées. Généralement, la culture de ce légume débute par un semis
direct germant entre 8 et 15 jours. Plusieurs cultivars existent et peuvent être
utilisés selon la durée de culture et le calibre désiré du légume à la récolte. La
récolte peut s’échelonner sur toute une saison de production. Les variétés les plus
précoces sont récoltables 75 jours après le semis, 3 à 4 mois pour les variétés
demi-longues d’été et 5 à 6 mois pour les variétés longues d’hiver. Un sol sablo-
limoneux meuble et bien drainé est conseillé pour cette culture. Un sol caillouteux
et trop dense nuit considérablement au développement de la plante et à l’aspect
du produit à la récolte. De plus, un sol trop lourd augmentera les risques de
maladie de cette espèce (pourriture). La carotte n’a pas de grands besoins en
azote, un excès lui est même désavantageux, mais un apport en potassium et un
léger apport en matière organique lui sont favorables (Perret, 2011).
59
Les expériences sur la carotte se sont déroulées dans les serres haute
performance du pavillon des services à l’Université Laval (boul. Hochelaga,
Québec). Les serres étaient maintenues à une température de 22 °C le jour et de
17 °C la nuit. La photopériode était de 14 heures par jour sous lampe HPS. Les
graines de carottes ont été achetées chez un marchand local (Bourbeau et fils
ltée). Le cultivar utilisé était le ‘Tenderlong imperator’ produit par la compagnie
McKenzie. Les graines, 15 par pot pour la première expérience et 12 par pot pour
la deuxième expérience, ont été semées directement en disposition circulaire à
5 mm de profondeur dans des pots de 36,4 L remplis d’un mélange de terre noire
et de sable (terre à jardin Premier Tech Horticulture – sac de 30 L). Pour la
première expérience, le semis a été réalisé le 7 mai 2010 et la récolte a été faite
les 13, 14 et 15 octobre 2010 pour une durée totale de croissance de 153 jours. La
fertilisation bihebdomadaire effectuée à partir de l’engrais hydrosoluble 20-2-20
produit par la compagnie PlantProduct® s’est déroulée comme suit : 50 mg/l
d’azote à raison de 1 L par pot du 24 mai au 7 juin; 100 mg/l d’azote à raison de
1 L par pot du 7 juin au 23 juillet; 150 mg/l d’azote à raison de 1 L par pot du 28
juillet au 20 août et 150 mg/l d’azote à raison de 2 L par pot du 25 août au 13
octobre. Le deuxième dispositif a été réalisé du 9 juin au 12 septembre 2011 pour
une durée de 96 jours de croissance. La fertilisation bihebdomadaire a été
effectuée de manière semblable à la première expérience, soit : 75 mg/l d’azote à
raison de 1 L par pot du 23 juin au 14 juillet; 100 mg/l d’azote à raison de 1 L par
pot du 17 juillet au 4 août; 150 mg/l d’azote à raison de 1,5 L par pot du 8 au 22
août et 200 mg/l d’azote à raison de 1,5 L par pot du 22 août au 12 septembre.
Une irrigation avec l’eau du robinet a été réalisée au besoin entre les fertilisations
tout au long des expériences.
Le dispositif expérimental factoriel à deux niveaux utilisé était un plan en blocs
complets aléatoires. Il était composé de quatre traitements :
- P-NM : substrat avec ajout d’inoculant mycorhizien stérilisé et sans ajout
de superphosphate triple (0-46-0);
60
- P-M : substrat avec ajout d’inoculant mycorhizien viable et sans ajout de
superphosphate triple (0-46-0);
- P+NM : substrat avec ajout d’inoculant mycorhizien stérilisé et avec ajout
de superphosphate triple (0-46-0);
- P+M : substrat avec ajout d’inoculant mycorhizien viable et avec ajout de
superphosphate triple (0-46-0).
La terre à jardin a d’abord été désinfectée à la vapeur dans un pasteurisateur
prévu à cet effet pendant deux heures. Par la suite, l’inoculant mycorhizien et le
superphosphate triple ont été incorporés au substrat pour jardin en fonction du
traitement et ont été mélangés manuellement sur une table de travail avant de
remplir les pots Custom C4000 (36,4 L). Les traitements P-M et P+M ont reçu une
dose de 25 g d’inoculant viable du Glomus irregulare (Mike
PS3 800 propagules/gramme – Premier Tech Biotechnologie, Rivière-du-Loup,
Qc). Les traitements P-NM et P+NM ont reçu la même quantité d’inoculant
préalablement stérilisé à l’autoclave à 121 °C durant 40 minutes. L’ajout
d’inoculant stérilisé permettait de maintenir les mêmes conditions à l’intérieur de
chaque unité expérimentale. Les traitements P+NM et P+M ont reçu 5 g
(équivalent à 100 kg/ha de P2O5) de superphosphate triple (0-46-0). Le
superphosphate triple granulaire a été préalablement broyé en une fine poudre à
l’aide d’un moulin à café avant d’être incorporé au mélange. Les traitements P-NM
et P-M n’ont reçu aucun ajout préalable de superphosphate triple (0-46-0).
3.2.2 Échantillonnage et paramètres mesurés
Des analyses de sol ont été réalisées au début des expériences afin de déterminer
les propriétés chimiques du terreau utilisé avec et sans ajout de superphosphate
triple. Les résultats de ces analyses chimiques apparaissent plus loin dans le
tableau 3.1. Un échantillon des racines de carotte a été prélevé dans chaque pot à
61
la fin des expériences afin de déterminer le taux de colonisation moyen des
racines par le champignon mycorhizien dans chacune des unités expérimentales.
Lors de la récolte, toutes les carottes de chaque pot ont été retirées du sol, lavées
à l’eau et pesées individuellement pour déterminer les rendements en matière
fraîche. Trois carottes de chacune des unités expérimentales ont été dépourvues
du premier quart de leur longueur près du collet et du dernier quart vers l’extrémité
de la racine. La partie centrale résultante a été par la suite coupée en quatre
morceaux égaux et ces morceaux ont été placés dans une enveloppe de papier
étiquetée et entreposée au congélateur à -80 °C pour une durée minimale de 24
heures. Cette procédure avait pour but de faciliter la lyophilisation des tissus, mais
aussi de rendre les échantillons homogènes en n’utilisant que la partie du centre
pour les analyses. Les autres carottes ont été conservées au congélateur à -20 °C
pour de subséquentes analyses et comme réserve de matériel expérimental. Les
carottes coupées et congelées à -80 °C ont été placées au lyophilisateur pour y
subir un séchage à froid limitant ainsi la dégradation des molécules d’intérêt
nutraceutique. Une fois la lyophilisation opérée, ces mêmes morceaux de carotte
ont été broyés en une fine poudre à l’aide d’un creuset et d’un mortier. Cette
poudre a été placée dans un tube Sarstedt® 50 ml étiqueté avec le code de
l’échantillon et placé au congélateur à - 80 °C jusqu’à la réalisation des différentes
analyses. Ces poudres ont servi à la réalisation des analyses des éléments
minéraux, des composés phénoliques totaux, des caroténoïdes totaux et de la
capacité antioxydante.
3.2.3 Détermination du taux de colonisation par le champignon mycorhizien à
arbuscules Glomus irregulare des racines de carotte
Les différents échantillons de sol contenant les racines secondaires ont été
nettoyés à l’eau afin d’obtenir des racines dépourvues de terre. Ces racines ont été
placées dans des tubes Sarstedt® 15 ml préalablement troués à l’aide d’un pic à
dissection chauffé et mis dans des supports prévus à cet effet. Les tubes ont été
trempés dans une solution de KOH 10 % (w/v) à l’autoclave durant 45 minutes à
62
121 °C. Une fois l’hydrolyse alcaline effectuée, les tubes ont été rincés à l’eau du
robinet à deux reprises et placés dans une solution de HCL 1 % (v/v) à la
température de la pièce pendant 15 minutes. Les tubes contenant les racines ont
été à nouveau rincés à l’eau chaude à deux reprises et trempés dans la solution
colorante de Trypan Blue chauffée à 50 °C durant 10 à 12 minutes et rincés à l’eau
froide afin d’enlever le surplus de colorant pour finalement être placés dans des
plats de Petri. L’ajout d’une solution de glycérol 20 % a permis la conservation des
racines.
Le taux de colonisation des racines par le champignon Glomus irregulare a été
déterminé à l’aide d’une adaptation de la méthode d’intersection de Giovanneti et
Mosse (Giovannetti et Mosse, 1980). Des lignes distancées d’environ 1 cm ont été
tracées sur l’ensemble de la surface d’un couvercle de Petri. Par la suite, ce
couvercle a été placé sous le plat de Petri et a servi de gabarit pour le décompte
du taux de colonisation. Une fois les racines étalées dans le plat de Petri, le
décompte du taux de colonisation est réalisé par l’observation de chacune des
intersections «ligne-racine». Lorsqu’il y a présence de colonisation
endomycorhizienne, c’est-à-dire présence d’hyphes, de vésicules ou d’arbuscules
au niveau d’une intersection «ligne-racine», l’observateur marque à l’aide d’un
compteur une observation positive. Dans le cas où la racine n’est pas colonisée à
un point d’intersection, l’observateur marque au compteur une observation
négative. Une fois le décompte fait sur l’ensemble des lignes, le taux de
colonisation est déterminé en pourcentage. Un minimum de 100 observations doit
être effectué afin que la valeur soit considérée comme représentative.
3.2.4 Analyse minérale du substrat de culture des bioessais de carotte
La détermination du contenu en minéraux des substrats a été réalisée selon la
méthode d’extraction des substrats saturés (SSE). Des échantillons de substrats
de tous les traitements ont été prélevés avant l’expérimentation dans 3 des 6
63
répétitions du dispositif. Ils ont été mis dans des plats de plastique et saturés en
eau distillée permettant de libérer en solution les éléments minéraux présents dans
le terreau. Après deux heures d’attente, l’eau des terreaux est prélevée par
filtration sous vide. Une quantité de 14 ml d’eau recueillie est par la suite filtrée,
centrifugée et transférée dans un tube de plastique de 15 ml. Ces tubes munis
d’un bouchon peuvent être entreposés au réfrigérateur jusqu’à l’analyse des
solutions.
Les teneurs en azote (Nkonge et Ballance, 1982) et en phosphore (Murphy et
Riley, 1962) dans les échantillons de substrat ont été déterminées par colorimétrie
au spectrophotomètre. Celles du potassium, du calcium, du magnésium et des
oligoéléments Fe, Mn et Cu ont été déterminées par absorption atomique. La
teneur du zinc a été déterminée par émission atomique. Les résultats apparaissent
dans le Tableau 3.1.
Tableau 3.1 Propriétés chimiques de la terre à jardin Premier horticulture
utilisée pour les bioessais chez la carotte en fonction de l’ajout ou non de
superphosphate triple.
Conduct. électrique pH NH4
+ NO3- PO4
- K Ca Mg Fe Cu Mn Zn
(CE) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)
P- 1,29 4,67 1 106 3 51 114 29 2 0,0 0,9 0,1
P+ 1,55 4,64 1 131 7 49 143 37 2 0,0 1,1 0,2
*P- représente le terreau utilisé pour les traitements sans ajout de superphosphate triple et P+ les traitements avec ajout de superphosphate triple.
3.2.5 Analyse minérale des tissus végétaux des racines de carotte
La teneur en azote dans les échantillons de carotte a été obtenue par digestion et
par colorimétrie (Isaac et Jonhson, 1976; Nkonge et Ballance, 1982). Après la
calcination des tissus végétaux, la teneur en phosphore a été déterminée par
colorimétrie au spectrophotomètre (Murphy et Riley, 1962) et celles du potassium,
64
du calcium, du magnésium et des oligoéléments Fe, Mn, Cu, et Zn par absorption
atomique.
3.2.6 Contenu en composés phénoliques totaux dans les poudres sèches de
carotte
Le contenu en composés phénoliques totaux a été déterminé selon une adaptation
de la méthode de Singleton et Rossi (1965). Une quantité de 0,25 ± 0,05 g de
poudre de carotte est placé dans un tube Sarstedt® 15 ml. À ce tube est ajouté
10 ml d’une solution de méthanol aqueux 80 %. Le tube est par la suite brassé
durant 30 secondes au vortex et placé dans un bain ultrasonique (VWR Model
75D) à la température de la pièce pendant 15 minutes. Après la sonification, le
tube est brassé à nouveau durant 30 secondes au vortex et placé à la
centrifugeuse durant 10 minutes à 3500 rpm. Suite à la centrifugation, le
surnageant est transféré dans un tube Sarstedt® de 50 ml. La procédure
d’extraction est répétée 2 fois. Les 30 ml d’extrait résultants sont par la suite
transférés dans un ballon afin d’être évaporés sous vide (Welch Gem Vacuum
Pump 1.0) à l’évaporateur rotatif (Büchi Rotavapor R-200) à une température de
35 °C (Büchi Heatingbath B-490). Les trois derniers millilitres résultant de
l’évaporation sont récupérés et transférés dans un cylindre gradué. Le volume est
complété à 4 ml et le tout est transféré dans un tube Sarstedt® 15 ml.
Une aliquote de 100 µl de l’échantillon ou de standard est placée dans une cuvette
à spectrophotométrie en plastique. À cette même cuvette sont ajoutés 2 ml d’eau
et 200 µl de la solution réactive Folin-Ciocalteu’s. Ensuite, la cuvette est brassée
durant 2 minutes à la main. La réaction se termine par l’ajout de 900 µl d’une
solution de sodium carbonate (200 g/L). Un temps d’attende de 2 heures est
nécessaire avant de mesurer l’absorbance au spectrophotomètre à une longueur
d’onde de 765 nm. Des standards d’acide gallique de 50, 100, 250 et 500 mg/l sont
préalablement préparés pour l’obtention d’une courbe standard de référence. Les
65
valeurs résultantes sont quantifiées en mg d’équivalent acide gallique/100 g de
matière fraîche.
3.2.7 Quantification du contenu en caroténoïdes totaux dans les poudres
sèches de carotte
La méthode utilisée est une adaptation de trois méthodes similaires (Biehler et
coll., 2010). L’ensemble des manipulations pour l’extraction doit se faire le plus
possible à l’abri de la lumière et sur la glace concassée. Une quantité de 0,080 ±
0,05 g de poudre sèche de carotte est placé dans un tube Sarstedt® de 15 ml. À
ce tube, 10 ml d’une solution d’hexane:éthanol:acétone (HEA) (2:1:1) sont ajoutés.
Le tube est brassé au vortex durant 30 secondes et placé durant 15 minutes au
bain ultrasonique (VW model 75D) à une température maintenue sous 10 °C à
l’aide de glace concassée. Une fois la sonification terminée, le tube est brassé
durant 30 secondes au vortex et centrifugé à 3500 rpm durant 10 minutes. Le
surnageant est récupéré dans un tube Sarstedt® de 50 ml. La procédure
d’extraction est répétée sur le culot une deuxième fois à l’aide de 10 ml de la
solution d’HEA et une troisième fois à l’aide de 5 ml d’HEA. Un volume de 10 ml
d’eau saturé en chlorure de sodium est ajouté au tube de 50 ml contenant les
surnageants combinés. Le tube est brassé au vortex et placé à la centrifugeuse
durant 2 minutes à une vitesse de 3500 rpm. La solution d’extraction se sépare
alors en 2 phases distinctes : soit une phase apolaire de couleur jaune foncé en
surface et une seconde phase polaire de couleur jaune pâle en dessous. À l’aide
d’une pipette pasteur, la phase supérieure apolaire est récupérée et transférée
dans un tube de 15 ml. Un premier lavage de la phase polaire est fait par l’ajout de
5 ml d’hexane au tube. Le tube est à nouveau brassé au vortex et centrifugé. La
phase apolaire est à nouveau récupérée et transférée dans le même tube
contenant le premier surnageant apolaire. Des lavages subséquents sont
nécessaires si la coloration de la phase polaire est encore jaunâtre. Lorsque
l’ensemble des phases apolaires ont été récupérées, le volume total est ajusté à
10 ml. Ensuite, 1 ml de la solution de caroténoïdes est placé dans une cuvette en
66
quartz pour la spectrophotométrie. À cette cuvette est ajouté un 2 ml d’hexane
supplémentaire pour un volume total de 3 ml (facteur de dilution 3). Le contenu de
la cuvette est homogénéisé à l’aide d’une pipette et est mesuré au
spectrophotomètre (HP 8453) à une longueur d’onde de 450 nm.
La quantification se fait selon la formule mathématique suivante :
C(mg/g) =
(Abs450nm / A1cm1%) x (Volume d’hexane (dL) / Poids de l’échantillon (g)) x
(1000 mg/g) x Dilution
*A1cm1% du β-carotène dans l’hexane = 2592 dL g-1 à 450 nm
La quantité obtenue représente le contenu en caroténoïdes totaux en équivalent β-
carotène dans 1 g de poudre lyophilisée de carotte. La valeur est convertie en
mg/100 g de matière fraîche d’équivalent β-carotène.
Le reste du volume contenant les caroténoïdes est placé sous jet d’azote afin
d’évaporer la totalité de l’hexane. Une fois le tube séché le culot est resolubilisé
dans 2 ml d’une solution de méthanol:MTBE (9:91). Cette solution résultante sert
aux analyses des caroténoïdes par chromatographie en phase liquide à haute
performance (CLHP).
Pour les analyses et la séparation des caroténoïdes en CLHP (Gilmore et Yamato,
1991), 800 µl de la solution de méthanol:MTBE:caroténoïdes est placé dans un vial
de 1 ml. Le système chromatographique se compose d’une colonne YMC
C30 250 mm X 4,6 mm, avec particules de 5 µm maintenue à une température de
30 °C. Le système Waters (Waters 600) contrôle les proportions de solvants des
phases mobiles suivantes : la phase A : méthanol/MTBE/eau (81:15:4) et la phase
B : méthanol:MTBE (9:91). Les gradients suivent les proportions suivantes : 100 %
67
de A et 0 % de B jusqu’à 50 % de A et 50 % de B durant les 45 premières minutes
d’analyse puis se maintiennent (50 % de A et 50 % de B) durant les 25 minutes
suivantes à un débit de 1 ml / minute. La colonne est rééquilibrée durant 25
minutes entre chaque échantillon. Un volume de 10 µl d’échantillon est injecté
(Water 717plus Autosampler) dans le système. Les caroténoïdes sont détectés à
une longueur d’onde de 450 nm à l’aide du détecteur UV à photodiode (Waters
PDA 996).
3.2.8 Détermination de la capacité antioxydante des extraits de carotte
3.2.8.1 Extraction des composés liposolubles des poudres de carotte (L-
ORAC)
L’extraction des composés liposolubles a été réalisée selon l’adaptation de la
méthode de Wu et collaborateurs (2004). Pour les extractions nécessaires à la
mesure de la capacité antioxydante des extraits de carotte, une quantité de 0,25 ±
0,05 g de poudre séchée de carotte est placé dans un tube Sarstedt® 15 ml
auquel 10 ml d’hexane:dichlorométhane (1:1) (DH) est ajouté au tube. L’échantillon
est brassé au vortex durant 30 secondes et ensuite placée au bain ultrasonique à
une température de 37 °C pendant 10 minutes. Ce tube est centrifugé à 3500 rpm
durant 10 minutes. Le surnageant est recueilli dans un tube Sarstedt® de 50 ml et
une deuxième extraction est effectuée sur le culot. Les deux surnageants sont
mélangés. Le surnageant est évaporé dans un ballon à l’évaporateur rotatif à une
température de 45 °C. Une fois le résidu séché, il est resolubilisé dans 4,5 ml de
Randomly methylated B-Cyclodextrin 7 % (RMCD) et 1,5 ml d’acétone. Cette
solution a été utilisée pour l’analyse des composés liposolubles. L’ensemble des
manipulations doit se dérouler le plus possible à l’abri de la lumière.
68
3.2.8.2 Extraction des composés hydrosolubles des poudres de carotte (H-
ORAC)
Le tube contenant le culot de l’extraction des composés liposolubles est réutilisé
pour l’extraction des composés hydrosolubles. À ce culot, 10 ml
d’acétone:eau:acide acétique (70:29,5:0,5) (AEA) sont ajoutés. Les deux
extractions sont réalisées selon la même méthodologie que l’extraction des
composés liposolubles. Seul le solvant diffère pour les extractions.
3.2.8.3 Mesure de la capacité antioxydante
La mesure de la capacité antioxydante des extraits de carotte est réalisée selon la
méthode ORAC (capacité d’absorption des radicaux oxygénés / oxygen radical
absorbance capacity) (Wu et coll., 2004). L’ensemble des mesures de la capacité
antioxydante est réalisé à l’intérieur de plaques 96 puits (Corning 3615) et analysé
au Fluorimètre Galaxy de BMG à une longueur d’onde de 520 nm et une
température de 37 °C. L’analyse est effectuée en 35 cycles de 210 secondes pour
un temps d’analyse total de 2 heures, 2 minutes, 30 secondes. Au cycle 4, 75 µl de
2,2’-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 0,0317 M sont injectés
pour les analyses L-ORAC ou 75 µl d’AAPH 0,0634 M pour les analyses H-ORAC.
L’ajout d’AAPH démarre la réaction d’oxydation.
Les deux surnageants des extractions sont utilisés pour la mesure de la capacité
antioxydante. La solution de l’extraction liposoluble a été diluée d’un facteur de 5
dans une solution RMCD 7 %, alors que la solution de l’extraction hydrosoluble a
été diluée d’un facteur de 10 dans une solution de tampon phosphate de 0,075 M
(pH 7,0). L’ensemble des puits extérieurs de la plaque restent vides pour des
raisons d’isolation thermique. Dans chaque puits restant, 200 µl d’une solution de
fluorescéine (fluorescéine sodium, 9,6 x 10-8 M) et 20 µl des solutions standards de
trolox (0, 6,25, 12,5, 25 ou 50 µM) ou un extrait de l’un des échantillons sont
69
ajoutés. Les différentes solutions standards sont réalisées dans les mêmes
solutions que celles des dilutions des échantillons. Une plaque différente est
utilisée pour chaque série d’analyses d’échantillons hydrosolubles ou liposolubles.
Un triplicat des standards et des échantillons a été réalisé. Les résultats sont
exprimés en µM de capacité antioxydante en équivalent trolox / 100 g de matière
fraîche à un taux de 85 % d’humidité des échantillons lors de la récolte.
.
3.2.9 Analyses statistiques
L’ensemble des analyses statistiques a été effectué à l’aide du logiciel d’analyse
statistique SAS® et du test LSMEANS de la procédure MIXED. Rappelons que le
dispositif expérimental était un plan à deux facteurs en blocs complets aléatoires.
3.3 Résultats
3.3.1 Taux de colonisation des racines de carotte par le champignon
endomycorhizien Glomus irregulare
Au cours de la première expérience menée sur la carotte, de bons taux de
colonisation ont été obtenus pour les traitements avec ajout d’inoculant
mycorhizien (Tableau 3.2) autant pour le traitement sans ajout de superphosphate
triple (54 %) que pour le traitement avec ajout (66 %). L’ajout de superphosphate
triple n’a pas nui à la mycorhization au cours de cette expérience. La répétition 6
du dispositif a présenté des contaminations mycorhiziennes au niveau des racines
des carottes dans les pots P-NM et P+NM. C'est pourquoi cette répétition a été
complètement éliminée des résultats. Il n’y a pas eu de contamination dans les
pots sans ajout d’inoculant dans les 5 autres répétitions.
70
Pour la deuxième expérience, les taux de colonisation ont été encore relativement
élevés soit de l’ordre de 53 % pour le traitement avec ajout de superphosphate
triple comparativement à 88 % pour le traitement sans ajout de superphosphate
triple (Tableau 3.2). L’ajout de superphosphate triple a eu pour effet une diminution
significative du taux de colonisation des racines de carotte au cours de cette
expérience. Aucune contamination n’a été observée dans les traitements sans
ajout d’inoculant de l’expérience.
Tableau 3.2 Taux de colonisation des racines de carotte par le champignon
endomycorhizien Glomus irregulare en fonction de l’ajout d’inoculant
mycorhizien et de superphosphate triple.
Traitements
Taux de colonisation
(%)
Expérience 1 Expérience 2
P- M 54 ± 20 88 ± 3 a
P+ M 66 ± 8 53 ± 7 b
Effet phosphore F n.s. F *** P- représente les traitements sans ajout de superphosphate triple et P+ avec ajout de superphosphate triple. M représente les traitements avec ajout d’inoculant mycorhizien. Les résultats d’une même colonne suivis d’une même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à ***P≤ 0,001).
3.3.2 Rendements en matière fraîche des racines tubérisées de carotte
La croissance des carottes de la première expérience n’a été affectée par aucun
des deux facteurs du dispositif (Tableau 3.3). Les moyennes des traitements
étaient similaires.
En revanche, au cours de la deuxième expérience, les effets des différents
facteurs ont ressorti. Les plants mycorhizés sans ajout de superphosphate triple
(P-M) ont présenté une croissance et un rendement supérieur aux plants non
71
mycorhizés sans ajout de superphosphate triple (P-NM). Les plants des
traitements ayant reçu un ajout de superphosphate triple (P+NM et P+M) ont
présenté une croissance supérieure à celle des plants des traitements n’en ayant
pas reçu (P-NM et P-M). Des photos des récoltes sont disponibles à l’annexe 2.
Tableau 3.3 Rendement en matière fraîche des racines tubérisées de carotte
en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple
Traitements
Masse fraîche
(g)
Expérience 1 Expérience 2
P- NM 99,9 ± 7,1 29,8 ± 9,9 c
M 100,0 ± 9,8 40,4 ± 6,0 b
P+ NM 101,6 ± 11,8 82,3 ± 5,5 a
M 105,6 ± 12,4 78,8 ± 4,2 a
Facteur mycorhize F n.s -
NM - -
M - -
Facteur phosphore F n.s. -
P+ - -
P- - -
Int. myc x phos F n.s F ** P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple. NM représente les traitements sans ajout et M avec ajout d’inoculant mycorhizien.
Les résultats d’une même colonne suivis d’une même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à ** P≤ 0,01).
3.3.3 Teneur en minéraux dans les tissus des racines tubérisées de carotte
3.3.3.1 Première expérience
Les résultats des analyses minérales de la première expérience n’ont pas révélé
de différences majeures au niveau des teneurs en macroéléments (N, P et K) dans
72
les tissus végétaux des racines de carotte (Tableau 3.4). Ce résultat confirme en
quelque sorte les résultats des rendements de la première expérience. En
revanche, la colonisation mycorhizienne des racines a eu pour effet une plus
grande accumulation du cuivre dans les tissus des carottes mycorhizées. La
teneur en cuivre dans les racines des carottes mycorhizées était près du double
comparativement à elle des racines des carottes sans colonisation mycorhiziene. Il
n’y a pas eu d’autres différences majeures pour les autres oligoéléments.
73
Tableau 3.4 Teneurs en éléments minéraux (base sèche) des racines tubérisés de carotte de la première
expérience en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple.
N P K Ca Mg
Fe Cu Mn Zn
Traitements (%)
(mg/kg)
P- NM 1,36 ± 0,30 0,39 ± 0,05 2,67 ± 0,41 0,31 ± 0,02 0,18 ± 0,04
74 ± 11 5,2 ± 0,8 50 ± 25 38 ± 6
M 1,39 ± 0,49 0,42 ± 0,05 2,66 ± 0,21 0,29 ± 0,03 0,20 ± 0,04
86 ± 21 8,8 ± 2,5 45 ± 23 39 ± 8
P+ NM 1,14 ± 0,21 0,43 ± 0,06 2,77 ± 0,34 0,28 ± 0,03 0,21 ± 0,06
79 ± 26 6,2 ± 1,3 70 ± 28 40 ± 5
M 1,30 ± 0,18 0,43 ± 0,06 2,67 ± 0,24 0,30 ± 0,03 0,17 ± 0,02
70 ± 13 9,6 ± 1,9 54 ± 17 40 ± 6
Effets fixes
Mycorhize F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
F n.s. F *** F n.s. F n.s.
NM - - - - -
- 5,7 b - -
M - - - - -
- 9,2 a - -
Phosphore F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
P- - - - - -
- - - -
P+ - - - - -
- - - -
Int. M x P F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple.
NM représente les traitements sans ajout et M avec ajout d’inoculant mycorhizien. Les résultats d’une même colonne suivis d’une même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à ***P≤ 0,001).
74
3.3.3.2 Deuxième expérience
Les résultats des analyses minérales des carottes de la deuxième expérience ont
démontré un effet significatif de l’ajout de superphosphate triple (P+) sur
l’augmentation de la teneur en phosphore dans les racines tubérisées des plants
(Tableau 3.5). De plus, on remarque une diminution de la teneur en potassium, en
calcium et en cuivre dans les traitements P+. Pour ce qui est des effets directs de
la mycorhize sur l’absorption des éléments minéraux, le champignon semble avoir
conservé une partie du calcium disponible pour la plante. Les plants mycorhizés
avaient des teneurs en calcium significativement inférieures à celles des plants
non mycorhizés. À l’instar de la première expérience, la teneur en cuivre a été
significativement plus élevée dans les racines mycorhizées comparativement aux
racines qui ne l’étaient pas.
75
Tableau 3.5 Teneurs en éléments minéraux (base sèche) des racines tubérisés de carotte de la deuxième
expérience en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple.
N P K Ca Mg
Fe Cu Mn Zn
Traitements (%) (mg/kg)
P- NM 1,22 ± 0,07 0,16 ± 0,02 2,95 ± 0,47 0,29 ± 0,02 0,12 ± 0,01 63 ± 23 a 4,4 ± 2,4 b 36 ± 8 27 ± 5
M 1,07 ± 0,07 0,13 ± 0,01 2,50 ± 0,21 0,28 ± 0,01 0,10 ± 0,01 34 ± 10 b 9,4 ± 1,9 a 26 ± 4 25 ± 2
P+ NM 1,09 ± 0,15 0,34 ± 0,03 1,54 ± 0,29 0,25 ± 0,01 0,15 ± 0,01
55 ± 17 a 2,4 ± 0,7 b 33 ± 9 23 ± 3
M 1,04 ± 0,18 0,34 ± 0,05 1,55 ± 0,28 0,24 ± 0,01 0,15 ± 0,03 61 ± 12 a 3,4 ± 1,7 b 33 ± 3 25 ± 3
Effets fixes
Mycorhize F n.s. F n.s. F n.s. F * F n.s. - - F n.s. F n.s.
NM - - - 0,27 a -
- - - -
M - - - 0,26 b -
- - - -
Phosphore F n.s. F *** F *** F *** F *** - - F n.s. F n.s.
P- - 0,14 b 2,72 a 0,28 a 0,11 b
- - - -
P+ - 0,34 a 1,54 b 0,25 b 0,15 a
- - - -
Int. M x P F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F * F * F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple.
NM représente les traitements sans ajout et M avec ajout d’inoculant mycorhizien. Les résultats d’une même colonne suivis d’une même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05; ***P≤ 0,001).
76
3.3.4 Contenu en composés phénoliques totaux dans les racines tubérisées
de carotte
Il n’y a pas eu de variation significative observée entre les traitements pour la
teneur en composés phénoliques totaux dans les racines de carotte de la première
expérience (Tableau 3.6). Ni la mycorhize, ni l’ajout de superphosphate triple n’ont
eu de répercussions sur les résultats des concentrations en composés
phénoliques dans les racines des carottes.
La deuxième expérience a permis l’observation des variations des teneurs en
composés phénoliques totaux entre les traitements avec ajout (P+) et sans ajout
de superphosphate triple (P-) (Tableau 3.6). L’ajout de superphosphate triple a
entraîné l’augmentation de la teneur en composés phénoliques dans les racines
des plantes de carotte des traitements P+NM et P+M. Cette augmentation de la
teneur en phénols totaux s’élève à près de 10 % comparativement aux traitements
sans ajout de phosphore. Il est intéressant de remarquer la similarité des résultats
des traitements P+NM et P+M ainsi que les résultats des traitements P-NM et P-M
entre eux.
77
Tableau 3.6 Teneur en composés phénoliques totaux dans les racines
tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de
superphosphate triple.
Traitements
Teneur en phénols totaux (mg/100g frais équivalent acide gallique) Expérience 1 Expérience 2
P- NM 37,6 ± 12,1 30,6 ± 3,8
M 35,9 ± 7,7 30,6 ± 4,9
P+ NM 32,3 ± 4,4 34,3 ± 3,4
M 33,4 ± 6,8 33,6 ± 4,6 Facteur mycorhize F n.s. F n.s.
NM - -
M - - Facteur phosphore F n.s. F **
P- - 30,6 b
P+ - 33,9 a Int. myc x phos F n.s. F n.s. P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate
triple. NM représente les traitements sans ajout et M avec ajout d’inoculant mycorhizien.
Les résultats d’une même colonne suivis d’une même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s. : non significatif; significatif à ** P≤ 0,01).
3.3.5 Contenu en caroténoïdes dans les racines tubérisées de carotte
Les teneurs en caroténoïdes totaux et des deux principaux carotènes de la carotte
ont été mesurées après chaque expérience. Au cours de la première expérience, il
n’y a pas eu de différence significative conférée par la mycorhize pour la teneur en
caroténoïdes totaux et en β-carotène (Tableau 3.7). Curieusement, la mycorhize
semble avoir eu comme effet une diminution significative de la teneur en α-
carotène dans les plants mycorhizés comparativement aux plants qui ne l’étaient
pas. L’ajout de superphosphate triple au cours de la première expérience sur la
carotte n’a pas engendré de variation pour ces paramètres.
78
Les analyses phytochimiques des caroténoïdes de la deuxième expérience sur la
carotte n’ont montré aucun effet de la mycorhize sur les teneurs en caroténoïdes
totaux, en β-carotène et en α-carotène (Tableau 3.7). Cependant, l’ajout de
superphosphate triple a contribué à une synthèse significativement plus importante
en caroténoïdes totaux et en β-carotène. La teneur en α-carotène, bien qu’en plus
grande quantité dans les racines des plants des traitements avec ajout de
superphosphate triple, n’a pas été significativement différente de celle des plants
des traitements sans ajout de superphosphate triple. Il existe une faible corrélation
(r2 = 0,32; F = 0,0067; N = 67) entre la teneur en phosphore et la teneur en
caroténoïdes dans les racines de carotte.
79
Tableau 3.7 Teneur en caroténoïdes totaux, en β-carotène et en α-carotène dans les racines tubérisées de carotte
en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple.
Traitements
Caroténoïdes totaux β-carotène α-carotène
(mg/100g frais d'équivalent β-carotène)
Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2 Expérience 1 Expérience 2
P- NM 15,4 ± 2,3 11,9 ± 3,0 6,64 ± 1,73 5,05 ± 2,09 6,27 ± 1,37 5,79 ± 1,87
M 15,7 ± 2,5 12,7 ± 2,7 7,08 ± 1,46 5,25 ± 1,34 5,13 ± 1,28 5,94 ± 1,85
P+ NM 18,3 ± 7,7 13,8 ± 2,9 7,55 ± 3,42 6,14 ± 1,63 7,48 ± 3,64 6,37 ± 1,79
M 15,6 ± 5,6 14,3 ± 3,4 6,94 ± 3,10 6,45 ± 1,96 5,69 ± 1,94 6,25 ± 1,81
Facteur mycorhize F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F * F n.s.
NM - - - - 6,87 a -
M - - - - 5,41 b -
Facteur phosphore F n.s. F * F n.s. F * F n.s. F n.s.
P- - 12,3 b - 5,15 b - -
P+ - 13,9 a - 6,25 a - -
Int. myc x phos F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple.
NM représente les traitements sans ajout et M avec ajout d’inoculant mycorhizien. Les résultats d’une même colonne suivis d’une même lettre ne sont pas significativement différents à P≤ 0,05 (n.s.. : non significatif; significatif à * P≤ 0,05).
80
3.3.6 Capacité antioxydante des extraits de carotte
Les résultats des analyses de capacité antioxydante des extraits des poudres
lyophilisées de carotte n’ont pas présenté de différence significative à la suite des
deux expériences menées chez la carotte (Tableau 3.8). Cependant, on peut
remarquer la forte proportion de la capacité antioxydante hydrosoluble sur la
capacité antioxydante totale des extraits de carotte. De plus, il est intéressant
d’observer que les résultats de cette analyse (H-Orac) ressemblent fortement à ce
qui a été observé pour le contenu en composés phénoliques totaux. La grande
variabilité entre les résultats semble être à l’origine des effets non significatifs entre
les traitements.
81
Tableau 3.8 Capacité antioxydante hydrophile (Orac-H), lipophile (Orac-L) et totaux (Orac-T) des extraits de
racines tubérisées de carotte en fonction de l’ajout d’inoculant mycorhizien et de superphosphate triple.
Traitements
Orac-T Orac-H Orac-L
Orac-T Orac-H Orac-L
(µM/100g frais TEAC)
(µM/100g frais TEAC)
Expérience 1
Expérience 2
P- NM 1122 ± 303 1058 ± 485 64 ± 27
950 ± 158 885 ± 159 65 ± 14
M 1136 ± 309 1071 ± 304 65 ± 14 1035 ± 339 974 ± 338 61 ± 6
P+ NM 971 ± 222 908 ± 219 63 ± 19
1112 ± 164 1057 ± 161 55 ± 7
M 948 ± 184 874 ± 187 74 ± 29
1139 ± 368 1078 ± 372 60 ± 5
Facteur mycorhize F n.s. F n.s. F n.s.
F n.s. F n.s. F n.s.
NM - - -
- - -
M - - -
- - -
Facteur phosphore F n.s. F n.s. F n.s.
F n.s. F n.s. F n.s.
P- - - -
- - -
P+ - - -
- - -
Int. myc x phos F n.s. F n.s. F n.s.
F n.s. F n.s. F n.s.
P- représente les traitements sans ajout et P+ avec ajout de superphosphate triple.
NM représente les traitements sans ajout et M avec ajout d’inoculant mycorhizien. n.s. : non significatif TEAC = Trolox equivalent antioxydant capacity (Capacité antioxydante en équivalent Trolox).
82
3.4 Discussion et conclusion
3.4.1 Première expérience sur la carotte
3.4.1.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale
Les différents résultats de la première expérience nous indiquent que la longue
période de croissance ainsi qu’une fertilisation modérément élevée en azote ont
limité les effets de la mycorhize et les effets de l’ajout de superphosphate triple sur
les rendements et sur les teneurs des différents éléments minéraux des racines
tubérisées de carotte. Ces résultats peuvent sembler curieux, mais ils peuvent
s’expliquer par la longueur de la période de croissance et par la fertilisation
effectuée au cours de cette expérience. Afin d’atteindre les taux de colonisation
souhaités, la période de croissance de la première expérience a été plus longue
(153 jours) que celle de la deuxième expérience (96 jours). Les carottes ont reçu
une plus grande quantité d’éléments au cours de la première expérience ce qui a
fort probablement limité l’effet de l’ajout de superphosphate triple pour les
traitements P+. Bien que les racines des carottes furent suffisamment colonisées
par le champignon, il n’y a eu que peu d’effets de la mycorhize sur l’absorption des
nutriments outre la présence significativement plus élevée du cuivre dans les
tissus de la racine.
3.4.1.2 Effet sur le métabolisme secondaire
Les teneurs en composés nutraceutiques ont été peu influencées par la mycorhize
ou par l’ajout de superphosphate triple. L’association entre la carotte et le Glomus
irregulare ne semble donc pas affecter les teneurs en composés phénoliques, en
caroténoïdes ainsi que la capacité antioxydante. Étonnamment, une diminution
significative de l’α-carotène dans les racines tubérisées mycorhizées a été
observée comparativement aux carottes qui ne l’étaient pas. Ce phénomène n’a
83
pas été rapporté dans la littérature portant sur les champignons mycorhiziens à
arbuscules. Ce résultat reste alors difficile à expliquer, car les teneurs en
minéraux, en caroténoïdes totaux et en β-carotène ont été pour leur part
comparables au traitement témoin (NM). Toutefois, les champignons
endomycorhiziens arbusculaires sont réputés pour leur capacité à modifier la voie
des terpènes, principalement au niveau des terpènes volatiles comme les
monoterpènes, les sesquiterpènes et les diterpènes. Plusieurs auteurs ont
rapporté l’impact que pouvaient avoir les mycorhizes sur la modification des huiles
essentielles comme chez le basilic, l’aneth et le carvi (Kapoor et coll., 2002;
Toussaint et coll., 2007 et 2008; Chaudhary et coll., 2008). Il est possible que
l’apport en minéraux octroyé par la mycorhize ou que l’effet direct de la mycorhize
ait modifié les ratios de synthèse des tétraterpènes (carotènes) dans les racines de
carotte. Il est possible aussi que la voie de synthèse de l’α-carotène ait été
perturbée suite à la production des apocaroténoïdes caractéristiques des
mycorhizes dans les racines, la mycoradicine et le cyclohexénone. Ces molécules
sont un produit du clivage oxydatif des précurseurs de la synthèse des
caroténoïdes (Strack et Fester, 2006). Il est aussi possible que ce résultat ne soit
dû qu’aux variations des teneurs en minéraux dans les tissus. Ce résultat n’a pas
été observé lors de la deuxième expérience, ce qui aurait été très intéressant, d’un
point de vue fondamental pour les recherches sur les champignons mycorhiziens à
arbuscules. D’autres recherches à ce sujet sont souhaitables suite à ce résultat
inattendu.
3.4.2 Deuxième expérience sur la carotte
3.4.2.1 Taux de colonisation, croissance et nutrition minérale
La deuxième expérience sur la carotte a donné des résultats marqués par
l’expression de plusieurs différences entre les traitements et entre les facteurs
expérimentaux. Comparativement à la première expérience, ces différences sont
dues à une durée de croissance plus court, mais plus conventionnel (96 jours). Les
84
taux de colonisation ont eux aussi été représentatifs des résultats souvent
rapportés dans la littérature. Les racines des plants mycorhizés sans ajout de
phosphore (P-M) ont présenté une colonisation plus importante que les racines
des plants avec ajout du superphosphate triple. La croissance et les rendements à
la récolte ont aussi démontré l’impact de la mycorhize dans le substrat simulant un
sol pauvre en phosphore. Les racines tubérisées des plants mycorhizés (P-M) ont
été significativement plus grosses que celles des plants non mycorhizés (P-NM),
probablement dû à une meilleure nutrition minérale. Bien que la mycorhize ait
diminué significativement les teneurs en calcium dans les plants mycorhizés, elle a
augmenté les teneurs en cuivre dans les tissus racinaires pour une deuxième
expérience consécutive sur la carotte.
L’ajout de superphosphate triple dans le substrat, permettant de simuler des sols
plus riches en phosphore, a eu plusieurs conséquences sur le développement et la
biochimie de la carotte. Tout d’abord, l’amendement en phosphore a permis une
augmentation significative du rendement en matière fraîche des carottes et s’est
traduit par des concentrations deux fois plus élevées en phosphore dans les
racines. L’ajout de phosphore a permis une meilleure assimilation du magnésium,
l’absorption de ces deux éléments étant synergique. En revanche, l’ajout de
phosphore a possiblement été un antagoniste à l’assimilation du potassium, du
calcium et du cuivre.
3.4.2.2 Effet sur le métabolisme secondaire
Suite à la deuxième expérience, la mycorhize n’a pas influencé les teneurs en
composés nutraceutiques chez la carotte. Les teneurs en composés phénoliques
totaux, en caroténoïdes totaux incluant le β-carotène et l’α-carotène ainsi que les
capacités antioxydantes des extraits de carotte n’ont pas démontré de différence
significative comparativement à celles des traitements témoins (P-NM et P+NM).
85
En ce qui a trait à la biochimie de la synthèse des composés d’intérêt
nutraceutique, l’ajout de superphosphate triple a permis un stockage accru des
composés phénoliques totaux, des caroténoïdes totaux et du β-carotène. De plus,
les tendances à la hausse de la capacité antioxydante supérieure des extraits
hydrosolubles des carottes des traitements avec ajout de phosphore sont
complémentaires aux résultats des composés phénoliques. L’ajout de phosphore a
donc permis d’augmenter grandement les propriétés nutraceutiques de la carotte
en plus de lui procurer une croissance et un rendement supérieur. L’effet direct de
la mycorhize sur le métabolisme secondaire de la carotte reste donc mitigé.
3.4.3 Comparaison avec les études antérieures
Plusieurs études ont démontré d’importantes modifications biochimiques dans les
racines des plantes colonisées par les champignons mycorhiziens à arbuscules.
Une des modifications les plus documentées implique la voie de synthèse des
caroténoïdes menant à la production de deux cyclohexones, la mycoradicine et la
bluménine. Ces molécules sont responsables de la pigmentation jaunâtre des
racines colonisées. Ces deux pigments ont été retrouvés au niveau des racines de
carotte ainsi que chez de nombreuses espèces comme l’orge, le blé et le maïs
(Vierheilig et Piché, 2004). La production de composés réactifs oxygénés souvent
attribuable à une stimulation des mécanismes de défense des plantes a aussi été
rapportée par Strack et Fester (2006). De plus, une étude réalisée sur l’échinacée,
Echinaceae purpurea (L.) Moench, a présenté de nombreux résultats démontrant
la stimulation de la synthèse de métabolites secondaires d’intérêt phytomédical
dans les racines de la plante par la mycorhize. En somme, les acides phénoliques
cichorique, caftarique et chlorogénique ont été produits en plus grande quantité
suite à la mycorhization (Araim et coll., 2009). Il semblait donc intéressant de
suivre ce champ de recherche et d’étudier ce phénomène de la modification
biochimique dans les racines des plantes par les mycorhizes à arbuscules. À notre
connaissance, il s’agit de la première observation de la perturbation de la synthèse
en α-carotène dans les racines de la carotte. Au cours de la première expérience,
86
les racines tubérisées des carottes mycorhizées ont présenté une concentration en
α-carotène plus faible comparativement aux carottes qui ne l’étaient pas. Cette
observation n’a cependant pas été observée dans la deuxième expérience sur la
carotte. Les différentes conditions de culture peuvent être à l’origine des résultats
différents. Les teneurs en composés phénoliques totaux n’ont pas été modifiées
suite à l’établissement de la mycorhize. Cependant, aucune analyse sur certains
composés phénoliques spécifiques n’a été réalisée dans la présente étude. Bien
que Araim et collaborateurs (2009) aient déterminé des modifications de la teneur
de différents composés phénoliques dans les racines de l’échinacée, d’autres
études ont démontré comme la nôtre l’absence d’effet de la mycorhize sur ce
paramètre. Les conditions de culture et les combinaisons « plante hôte -
champignons mycorhiziens à arbuscules » semblent être des facteurs très
importants de la réponse de la plante à l’établissement mycorhizien.
Les effets du champignon endomycorhizien à arbuscules ont une fois de plus été
favorables pour la croissance et l’assimilation minérale des carottes. Cependant,
l’effet direct de la mycorhize ne semble pas être un facteur déterminant pour
l’augmentation des teneurs des métabolites secondaires que nous avons étudiés.
La modification du métabolisme semble être localisée au site de colonisation des
racines secondaires et ne semble pas modifier le métabolisme de la racine
tubérisée de la carotte. L’ajout de superphosphate triple a favorisé davantage la
croissance et a stimulé la production de composés nutraceutiques. La stimulation
des composés du métabolisme secondaire d’intérêt nutraceutique semble être
davantage l’effet indirect de l’assimilation minérale que l’effet direct du champignon
Glomus irregulare.
3.4.4 Conclusion
Au cours de ces deux expériences sur l’association entre le champignon
mycorhizien Glomus irregulare et la carotte, plusieurs effets intéressants ont été
87
observés. Tout d’abord, la croissance de la carotte a été stimulée suite à
l’établissement de la symbiose dans les traitements simulant un sol pauvre en
phosphore. De plus, les teneurs de certains éléments minéraux dans la racine
tubérisée comme le cuivre et le calcium ont été affectées par la présence du
champignon mycorhizien. Peu de différences au niveau du métabolisme
secondaire ont été attribuables à l’effet direct du champignon, outre la perturbation
de la synthèse de l’α-carotène au cours de la première expérience.
En plus de stimuler la croissance et de modifier les teneurs en phosphore, en
potassium, en calcium, en magnésium, en fer et en cuivre dans la racine tubérisée
de la carotte, l’ajout de phosphore dans le substrat a favorisé la synthèse des
composés phénoliques ainsi que la synthèse des caroténoïdes dans la racine
tubérisée de la carotte.
L’ensemble de ces résultats nous permet de conclure que le champignon
endomycorhizien n’a pas modifié de façon significative les teneurs en molécules
du métabolisme secondaire d’intérêt nutraceutique. L’effet du champignon semble
être limité au site de colonisation des racines. Il est probable que l’activation des
mécanismes de défense se soit réalisée au début de la colonisation, mais ces
effets n’ont pas été maintenus jusqu'à la récolte. Une perturbation de la synthèse
de l’α-carotène au cours de la première expérience a été observée, ce qui permet
d’ouvrir une nouvelle avenue de recherche sur l’effet des champignons à
arbuscules sur le métabolisme secondaire de la carotte. L’ajout de superphosphate
triple a pour sa part modifié considérablement les différentes concentrations en
molécules nutraceutiques ce qui nous porte à croire que l’effet du champignon
peut être de deux natures différentes, soit directe par la modification du
métabolisme à la suite de l’établissement mycorhizien et à la fois indirecte par une
modification de l’assimilation minérale. Ceci génère une synthèse accrue ou
inférieure de molécules du métabolisme secondaire. D’autres études mettant en
relation différentes combinaisons d’espèces végétales en association avec
différentes espèces de champignons endomycorhiziens soumises à différentes
88
doses de fertilisant permettraient de mieux comprendre ce phénomène complexe
de l’effet direct des champignons endomycorhizien sur la modification du
métabolisme secondaire de l’hôte végétal.
89
Conclusion générale
Ce projet de recherche portait sur les effets d’un champignon mycorhizien à
arbuscules, le Glomus irregulare, sur la croissance, l’assimilation des éléments
minéraux et le métabolisme secondaire du basilic et de la carotte. Deux
expériences ont été réalisées pour chacune des plantes. Les principaux objectifs
de la recherche étaient de déterminer si les mycorhizes à arbuscules pouvaient
stimuler la synthèse de molécules du métabolisme secondaire d’intérêt
nutraceutique, de déterminer si cette stimulation était localisée ou systémique et
de déterminer si la stimulation de la synthèse des molécules d’intérêt
nutraceutique était l’effet direct de la mycorhize ou l’effet indirect d’une meilleure
assimilation minérale conférée par celle-ci.
La croissance des plants de basilic mycorhizés à partir de la dose élevée (M2X) a
été inférieure à celle des plants du traitement non inoculé (NM) lors de la première
expérience. Des teneurs significativement plus faibles en calcium, en magnésium
et en zinc ont été observées dans les feuilles de ses mêmes basilics, ce qui
pourrait expliquer en partie l’effet observé sur la croissance. La teneur en
potassium dans les feuilles des basilics de ce même traitement (M2X) a quant à
elle été significativement plus élevée. Lorsque du superphosphate triple a été
ajouté dans le substrat, la mycorhize a permis une stimulation significative de la
croissance des plants de basilic comparativement aux plants non mycorhizés
(expérience 2) avec ajout de superphosphate triple. La teneur significativement
supérieure en phosphore dans les feuilles des plants mycorhizés (P+M1X et
P+M2X) démontre l’effet positif de la mycorhize sur l’assimilation en phosphore du
basilic. L’ajout de superphosphate triple dans le substrat a sans surprise favorisé la
croissance du basilic.
Au cours de la première expérience, la dose M2X d’inoculant mycorhizien a permis
une teneur plus élevée en caroténoïdes totaux, dont la lutéine et le β-carotène.
90
Cette augmentation des teneurs en caroténoïdes dans les feuilles du basilic
semble être davantage reliée au statut nutritionnel particulier des plants plus petits
qu’à l’effet direct de la mycorhize à arbuscules. L’inoculation par la dose M1X a
significativement fait diminuer la capacité antioxydante des extraits lipophiles des
feuilles de basilic de la première expérience. La mycorhize n’a pas eu d’effet sur la
teneur en composés phénoliques totaux du basilic. L’ajout de superphosphate
triple a significativement augmenté la teneur en composés phénoliques totaux au
cours des deux expériences et la capacité antioxydante de l’extrait liposoluble des
feuilles de basilic de la deuxième expérience. L’ensemble de ces résultats suggère
une fertilisation adaptée à la présence de la mycorhize chez les plantes cultivées
en contenants afin de favoriser les rendements du basilic et la synthèse de
certains composés du métabolisme secondaire.
Pour sa part, la croissance de la carotte a été significativement favorisée par la
mycorhize dans le substrat pauvre en phosphore au cours de la deuxième
expérience. La mycorhize a favorisé l’assimilation du cuivre au cours des deux
expériences, mais a diminué la teneur en calcium dans la racine tubérisée de la
carotte au cours de la seconde expérience.
La mycorhize a fait diminuer significativement la teneur en α-carotène dans les
racines tubérisées de carotte de la première expérience. Comme ce résultat ne
peut pas être expliqué par les contenus en éléments minéraux dans les racines, il
semble avoir été causé par la mycorhize. Ce phénomène n’a pas été observé au
cours de la deuxième expérience sur la carotte. La mycorhize n’a pas eu d’effet sur
le contenu en composés phénoliques et sur les capacités antioxydantes de la
carotte. En revanche, l’ajout de superphosphate triple a significativement permis
d’augmenter la teneur en composés phénoliques totaux, en caroténoïdes totaux et
en β-carotène dans les carottes au cours de la deuxième expérience.
91
Le champignon Glomus irregulare a permis de modifier la croissance, la nutrition
minérale et le métabolisme secondaire des plantes à l’étude. Son influence sur la
croissance et la nutrition des plantes est plus importante lorsque les teneurs en
éléments minéraux sont faibles dans le substrat. Au cours de cette étude, les
modifications des teneurs en composés du métabolisme secondaire semblent
davantage être l’effet indirect des modifications de l’assimilation minérale causées
par la symbiose. Cependant, le résultat concernant la diminution de l’α-carotène
dans la carotte suppose un effet direct de la mycorhize.
L’ensemble des résultats propose que l’effet de la mycorhize sur le métabolisme
secondaire des plantes peut-être à la fois localisé, mais aussi systémique. Au
cours de ce projet, la voie métabolique des terpénoïdes a été la plus perturbée
suite à la colonisation mycorhizienne des racines. D’autres expériences devraient
être envisagées afin de vérifier les effets des mycorhizes à arbuscules sur la
synthèse de l’α-carotène dans la carotte, mais aussi chez d’autres légumes
racines. Des expériences mettant en relation différentes espèces de mycorhizes à
arbuscules en relation avec plusieurs plantes hôtes devraient être réalisées afin de
déterminer les combinaisons les plus susceptibles de favoriser la stimulation de la
synthèse de composés nutraceutiques. De plus, la fertilisation et les teneurs
initiales en éléments minéraux dans le substrat devraient être des facteurs
essentiels à considérer lors des études sur les symbioses mycorhiziennes.
92
93
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Annexe 1
Photos des expériences sur le basilic
Photo 1 : Aspect des plants de la répétion 2 du dispositif lors de la récolte de la première expérience sur le basilic. T = P-NM, P = P+NM, M100 = P-M1X, M200 = P-M2X, MP100 = P+M1X et MP200 = P+M2X.
Photo 2 : Aspect des plants de la répétion 3 du dispositif lors de la récolte de la deuxième expérience sur le basilic. T = P-NM, P = P+NM, M100 = P-M1X, M200 = P-M2X, MP100 = P+M1X et MP200 = P+M2X.
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Annexe 2
Photos des expériences sur la carotte
Photo 3. Effet de l’ajout d’inoculant mycorhizien sur la croissance de la carotte. Photo prise lors de la récolte de la deuxième expérience. L’étiquette T (pot de gauche) représente le traitement témoin P-NM et l’étiquette M200 (pot de droite) représente le traitement P-M (avec mycorhize).
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Photo 4. Différence entre la croissance des plants du traitement P-NM (gauche) et celle des plants du traitement P-M (droite) au cours de la 3ième semaine de croissance de la deuxième expérience sur les carottes.
Photo 5. Différence entre les rendements de carottes non mycorhizées (T=P-NM gauche) et mycorhizées (M200=P-M droite) cultivés en substrat simulant un sol pauvre en phosphore au cours de la récolte de la deuxième expérience.
