BIOCHIdVIIE, 1983, 65, 673-678. Br~ves Communications

Stimulation par l'(Estradiol de la synth6se des ribosomes dans les cellules ad6nohypophysaires.

Rend LE GUELLECV et Jacques DUVAL.

(Refu le 2-6-i933, accepld apr~s rdvision le 26-xo-x983. )

Laboratoire de B ioch imie Gdndrale, E R A C . N . R . S . n ° 070567, C a m p u s de Beaul ieu , 35042 Rennes Cedex.

R6sum6. Slimmary.

L'injection d'une dose unique de I0 ~g d'vestradiol un rat provoque dans l'addnohypophyse une stimu-

lation de la synthise des R N A ribosomiques et de celle des protdines assocides. Cette stimulation peut dire raise en dvidence par double marquage in vitro des R N A d~ l'aide d'addnine ou de guanine et des proldines ~ l' aide de valine. L' analyse des polysomes par sddimentation en gradient de saccharose rdv~le l'incorporation des macro- moldcules ndo-synthdlisdes dans les sous-unitds 40 S et 60 S. La stimulation de synth~se par l'ceslradiol des R N A ribosomiques et des protdines assocides est done coordonnde. A ucune modification de la proportion des polysomes hypophysaires totaux n'est ddcelde dans ces conditions bien qu'une telle modification puisse gtre envisagde dans une catdgorie de cellules spdcifiques sans pouvoir dire ddtectde par sddimentation en gradient de saccharose.

Mats clds : eestradiol / ribosomes / adenobypophyse.

A single dose of 70 ~g oestradiol injected to a male rat stimulates in the anterior pituitary the synthesis of ribosomal R N A and of the associated proteins. This stimulation is shown using in vitro double-labeling of R N A with adenine or guanine and of proteins with valine. The analysis of polysomes reveals the incorpora- tion of the neo-synthesized molecules into the dO S and 60 S subunits. Therefore, the stimulation of ribosomal R N A and protein biosynthesis by oestradiol is a co- ordinated process. No change in the whole polysome distribution is observed in these conditions lhough such a modification may occur in a specific cell population without being detected by using sucrose gradient anal- ysis.

Key words : oestradiol / ribosomes / anterior pituitary.

Introduction.

Dans les organes cibles, les hormones st6- roides - - et l'oestradiol en particulier - - peuvent contrSler l'expression g6n6tique apr6s s'&tre lides ~ leurs r6cepteurs. Ainsi, dans l'ad6no- hypophyse, les cestrog~nes induisent une hyper- trophie et une hyperplasie, donc une aug- mentation de la synth6se des RNA, DNA et prot4ines. Un accroissement des activit6s thymi- dine kinase [1], des DNA polym6rases [2, 3], de l'indice mitotique [4, 5] de m~me qu'une dldva- tion des RNA polym6rases [6, 7] ant 6t6 rap- port4es apr6s action des ~estrog6nes in viva. Dans d'autres organes, tels le Ioie de coq [8] ou l'ut6rus de rate [9], l'cestradiol augmente la proportion des polysomes lourds, donc des unit4s fonctionnelles de la synth6se protfique.

Outre ces effets globaux, une stimulation de

la synth6se d'une hormone peptidique, la pro- lactine, a 6t4 mise ell 6vidence 5~ partir de cel- lules hypophysaires en culture [10]. Cependant, en ce qui concerne les RNA polym6rases, nous n'avons pu observer, comme r@onse primaire, qu'une stimulation de la RNA polym6rase I e t une incorporation accrue des nucl6otides dans les pr6curseurs des RNA 28 S e t 18 S, aucun effet n '6tant not4 pour la RNA polym6rase II ni sur la synth6se des RNA-poly A(+) et du RNA 5 S [6]. Cette observation suggdrait une action primaire de l'~estradiol au niveau des nucl6oles des cellules hypophysaires.

Le prdsent travail avait donc pour but :

- - de d6terminer si une injection de l'hormone stdroide induisait une modification de la

V To whom all correspondence should be addressed.

48

674 R. Le Guellec et J . Duval

d i s t r i b u t i o n de l ' e n s e m b l e r i bosomes -po ly - somes.

- - de d d t e r m i n e r si les R N A 28 S e t 18 S d o n t l a syn th6se 6 ta i t s t imul6e pa r l ' h o r m o n e s ' i l i co rpo ra i en t darts de nouve l l e s sous-urdt6s r i b o s o m i q u e s et si l a syn th6se des p ro td ines c o n s t i t u t i v e s de ces pa r t i cu l e s 6 ta i t 4gale- mer i t s t imul6e .

Mat6rlel et M6thodes.

A nirnaux.

Les rats inMes de souche Wistar sont gg4s de 42 jours lors de l'exp4rience. Ils nous sont fournis par l'61evage Janvier (C.E.R.J., 53940 Le Genest). Ils sont 41ev6s avec eau et nourriture ~ volont6 (U.A.R. n ° 103) darts une salle maintenue ~ 25 ° et 6clair6e de 7 h ~ 19 heures.

Un groupe d 'animaux re~oit par voie sous-cutan6e une injection de 10 vg de 17 ~-eestradiol dissous dans 0,1 ml de m61ange huile de s4same-alcool benzylique (9 : 1 v/v) tandis que le groupe de t6moins regoit le m4me volume de solvant.

Prdparation des polysomes.

Nous avons adopt4 pour l 'hypophyse une m6thode d6crite par Merryweather et Knowler [9]. Les animaux sont d6capit4s (guillotine Harvard Apparatus) et les hypophyses rapidement pr61ev6es. Elles sont broy6es soit imm6diatement, soit apr6s incubation, ~ l'aide d 'un broyeur de Potter-Elvehjem darts 10 volumes de tampon A (Tris HC1 200 mM pH 8,5, KC1 50 raM, MgCI~ 15 mM, 2-mercaptoethanol 7 mM, Cyclohexi- mide 5 ~xg/ml, H6parine 50 [xg/ml, Triton X100 1 p. cent). Apr6s centrifugation ~ 12 000 g, le snrnageant est d4pos4 sur 1 ml de tampon B (Tris HC1 50 mM pH 7,6, KC1 50 mM, MgCI~ 15 raM, 2-mercaptoethanol 7 mM, Cycloheximide 5 txg/ml, H4parine 50 ~g/ml) et centrifug4 ~ 200 000 g durant 90 rain. Le culot est remis en suspension 5~ l'aide d 'un homog6n4iseur darts le tampon C (Tris HC1 50 mM pH 7,6, KC1 250 mM, MgC12 5 raM, Cycloheximide 5 [xg/ml, H4parine 50 [xg/ml) et centrifug6 ~ 12 000 g pendant 10 minutes. Le surnageant obtenu est alors d6pos6 sur 5.2 ml d 'un gradient de concentration de saccharose 15- 45 p. cent darts le tampon C et centrifug6 X 230 000 g durant 40 min. Le contenu des tubes est r4cup6r6 et le profil des polysomes obtenu par mesure directe de l 'absorption ~ 254 nm (ISCO). La centrifugation

12 000 g qui pr6c6de le gradient, non pr6vue darts la technique initiale, a pour objet d'61iminer certains aggr6gats qui perturbent le profil des polysomes les plus lourds.

Incubation des hypophyses.

Les hypophyses pr61ev6es sont incub4es pendant des temps variables (de 2 h X 4 h), ~ raison de 6 glandes pour 2 ml de milieu KRBG (Krebs-Ringer-bicarbo-

hate-glucose pH 7,4). Les pr6curseurs, marqu6s soit avec 3H pour les animaux stimul4s par l'eestradiol, soit avec 1'C pour les animaux t4moins, sont introduits aux concentrations suivantes : ad6nine 50 ixM, guanine 100 ~zM, valine 17,5 ~M. Ces pr6curseurs fournis par Amersham France out les activit4s sp4ci- fiques suivantes :

Ad6nine [2-3H] : 15,5 Ci/mmote ; Ad6nine [8-1'C] : 225 mei/mmole.

Guanine [8-3H] : 10,4 Ci/mmole ; Guanine ~8-~C] : 51 mCi/mmole.

Valine ~3,4-3H] : 2 Ci/mmole ; Valine [U-l'C] : 283 mCi/mmole.

A la fin de l ' incubation, les hypophyses sont rinc4es par du KRBG ~ 0 oC renfermant une forte concentra- tion de pr6curseur non radioactif et les glandes prove- nant d 'animaux t6moins ou stimul4s sont regroup4es dans le m~me homog6n6iseur de Potter pour la pr6pa- ration des polysomes.

Analyse de la radioactivitd.

Apr6s centrifugation dans le gradient de saccharose, des fractions sont recueillies, transf6r6es dans des fioles renfermant du scintillateur <c Ready-solv << (Beck- m~n) et compt6es sur un compteur Intertechniqne pr6r6gl6 pour le double marquage 3H/14C. Les calculs en dpm ont 6t6 effectu6s apr6s corrections pour retomb4es non sp6cifiques darts les canaux corres- pondants.

Afin de d6tecter une modification 6ventuelle darts les profils de radioactivit6 inh6rente ~ l'effet de l'cestradiol, nous avons calcnl6 pour chaque fraction le rapport dpm 3H/dpm 1~C et le AsH d6fini par Beckingham-Smith [11] qui permet de mininfiser les fluctuations de comptage dans les fractions faiblement marqu6es.

R6sultats.

La m d t h o d e de p r 6 p a r a t i o n uti l isde n o u s a pe rmis d ' o b t e n i r des po lysomes h y p o p h y s a i r e s d o n t le prof i l (fig. 1 A) est vo i s in de ceux de la l i t t 6 ra tu re . Compar6 ~ ceux d u foie (fig. 1 B) qu i n o u s a se rv i de t 6 m o i n p o u r va l ide r no t r e m6thode , n o u s c o n s t a t o n s c e p e n d a n t que la p r o p o r t i o n de r ibosomes et des sous-uni tds est p lus i m p o r t a n t e dans l ' h y p o p h y s e et que les diff6rentes catdgories de po lysomes sont mo i ns b i e n ind iv idua l i sdes . L ' i n c u b a t i o n des g landes p e n d a n t 2 heures d i m i n u e la p r o p o r t i o n des po lysomes ma i s sans a l tdrer l eur tai l le pu i sque les pics se s i t u e n t t o u j o u r s au m6me l i iveau (fig. 1 C). Nos r6su l t a t s son t doric k r app roche r de ceux de C a r t o u z o u et coll. [12]. U n e i n c u b a - t i o n prolong6e j u s q u ' k 4 h 30 lie modif ie pas de fa~on n o t a b l e ce profil.

BIOCHIMIE, 1983, 65, n ° 11-12.

(Estradiol et synthbse des ribosomes dans l'hypophyse. 675

DO 80S

I O

0,5

O

0,5 ~ C

O 2~0 40

fractions

FIG. I. - - Profils des polysomes prdpards ~ partir :

(A) d ' h y p o p h y s e s n o n i n c u b 6 e s (B) de foie de r a t (C) d ' h y p o p h y s e s de r a t s i n c u b 6 e s 2 h d a n s le K R B G .

En analysant les polysomes de l'addnohypo- physe extraits apr~s 2, 4, 16 et 24 heures d'ac- tion de l'cestradiol, nous avons observ6 que ni la faille ni la proportion des polysomes n'6taient modifides de fagon significative par rapport ceux des animaux t~moins. Les courbes obte- hues dtaient pratiquement superposables ~ celle repr6sent4e dans la figure 1 A et ne sont donc pas rapport6es dans ce m6moire.

La validit6 de notre analyse par double mar- quage est attestde par les courbes obtenues partir des hypophyses provenant d'animaux t6moins incub6es soit avec un pr6curseur triti6 ou marqu4 au carbone 14 (fig. 2 A, 3 A e t 4 A).

Lorsque les polysomes sont analysds apr&s 17 heures d'action de l'cestradiol in vivo et 3 heures d'incubation en pr6sence d'ad6nine tritide, on observe que la radioactivit~ est lar- gement associde aux polysomes, ce qui traduit le caract~re fonctionnel de ceux-ci au cours de l'incubation (fig. 2 A e t B). Nous constatons que les rapports aH/~C ou A~H sont cependant plus ~lev6s au niveau des ribosomes et des sous- unitds qu'au niveau des polysomes, ce qui confirme l'incorporation du RNA dont Fees- tradiol a stimuld la synth~se dans les particules ribonucldoprot~iques cytoplasmiques suscep- tibles d'etre engag6es dans la biosynth~se protdique.

50

ZX3H 0 2,5

3H/14C 1,5

4

X E 2 o. ..1=

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10 fractions 3 0 ~"

~p o

X E

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5G

~3H 0

4

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"'""" , ," ~: J.~] ~O

20 fractions 40 FIG. 2. - - A1 : Profils de la radioactivitd lide aux polysomes pr@ards apr~s 3 h d'incubation des hypophyses

en prdsence de : e--t Ad6nine-~4C ( r a t s t 6 m o i n s ) A - - A A d 6 n i n e - 3 H ( r a t s t 6 m o i n s ) .

As e t A3 : Rapports 3H/~C e t ASH calculds pour chaque fraction des gradients de polysomes (A3H = 3 H / X 3 H - - 1 4 C / Z - C ) . B~, B2 Ba : Equivalents de A ~, A ~, A 8 mais apr~s incubation des hypophyses en prdsence de ."

e - - , Ad~n ine - l~C ( r a t s t 6 m o i n s ) A - - A A d 6 n i n e - 3 H ( r a t s a y a n t r e c u 10 ~xg d ' o e s t r a d i o l 17 h a v a n t le d 6 b u t de l ' i n c u -

b a t i o n ) .

B I O C H I M I E , 1983, 65 , n ° 11-12.

676 R. Le Guellec et J. Dural

/,3 H 50 0

3H/14C 2

1

10 %

X E 5 o. lo

.I-

A 3 ...:. ........ , , . . . . /@- ' , . , \ ,'~ ~ ..-~-'":,

. . . . ~ . / , - , , o ,

Az • . . . % , . , . . . . . . . . . . , • . . . . . .

J :,.~\

20 fractions 40

1 0

10(2

A3H 0

4

% X X

~ lC • 1o '1o (J "I"

/ .

/'!A B3 / " " ,

[ ',...-., .,. B 2

10.

5

20 fractions 40

O l

'O

x E e~

lo

FIG. 3. - - At : Pro:ills de la radioactivitd lide aux polysomes prdpards apr~s d h d'incubation des hypo- physes en prdsence de ."

e - - e G u a n i n e - " C (rats t 6moins ) ZX--zX Guan ine -~H (ra ts t6moins ) .

A2 e t As : Rapports 3H/t~C et AsH calculds pour chaque fraction des gradients de polysomes. Bt, B~, Bs : Equivalents de A t, A ~, A~ mais apr~s incubalion des hypophyses en prdsence de ."

e - - e G u a n i n e - " C (rats t 6moins ) Zx--Zx Guan ine -SH (ra ts a y a n t regu 10 ~xg d 'oes t r ad io l 17 h a v a n t le d 6 b u t de

l ' i n c u b a t i o n ) .

5O ZX3H 0

2 3H/14C 1

10,

X E 5 o. 1o -r

0 3

A 3

• • " I " - -

A 2

j .... i:i),,, . o , , ,

IO

2 0 fractions 4C)

+50 A3H 0

-50

3/% 4 3

2O

X X E E 10 Q. e~

"I"

\.,d ",;-,,,." \ . , . /" ".",./

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i B 1 IO.

• '~ , . . [ . . . . . . . , . . , .,,X,~\

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20 fractions 40

% a

X E cL

FIG. 4. - - A1 : Profils de la radioactivitd lide aux polysomes pr@ards apr~s 3 h d'incubation des hypo- physes en prdsence de ."

e - - e Valine-14C ( ra ts t6moins ) ZX--Zx Val ine-~H ( ra t s t6moins ) .

A~ e t A 3 : Rapports 3H/ 'C et AsH calculds pour chaque fraction des gradients de polysomes. Bt, B2, Bs : Equivalents de At, A~, As mais apr~s incubation des hypophyses en prdsence de ."

e - - e V a l i n e - " C ( ra ts t 6moins ) ZX--ZX Val ine-SH (ra ts a y a n t regu 10 txg d ' c e s t r a d i o l 17 h a v a n t le d ~ b u t de l ' i n c u b a -

t ion) .

B I O C H I M I E , 1983, 65, n ° 11-12.

(Estradiol et synth~se des ribosomes dans l 'hyp@hyse. 677

Afin d'dviter le marquage dlev~ des poly- somes par l'addnine incorporde dans le fragment poly A des mRNA et dans le CCA k renouvel- lement rapide des tRNA, nous avons rfialis6 le m~me type de manipulation en presence de guanine. Lk 6galement, apr~s 17 heures d'action de l'cestradiol, la stimulation est plus forte au niveau des fractions 40, 60 et 80 S que dans les polysomes, ce qui confirme les exp&iences prdc6dentes (fig. 3 A et B).

Dans le but de d6terminer si la synth~se des prot6ines ribosomiques dtait coupl6e A celle des RNA correspondants, le m~me type d'exp6- rience a dt6 r6alisd en pr6sence de valine. Apr~s 3 heures d'incubation, la valine est fortement incorporde dans les sous-unitds alors qu'elle l'est encore tr~s peu dans les polysomes (fig. 4 A et B). I1 apparait, k l 'examen des rapports 3H/~4C et ASH, que l'cestradiol stimule la syn- th~se des prot6ines ribosomiques et que celles-ci sont incorpordes dans les particules ribosomiques ndo-synthdtisdes.

Discuss ion ct conclus ions .

Nous avons montr6 rdcemment [6] que l'ces- tradiol activait rapidement la RNA polym&ase I et que la synth~se et la maturation des RNA 28 S et 18 S 6taient amplifi6es. Nous montrons ici que ces RNA sont incorpords darts les ribosomes. Au cours de l'ineubation des glandes, la pro- portion des polysomes diminue par rapport celle observde dans des hypophyses fraichement pr61evdes. La synthgse des protdines doit donc ~tre moins active i s vitro, bien qu'elle se pour- suive de fa~on lindaire en fonction de la dur6e d'incubation au-delk de 4 heures (r6sultats non publi6s).

Pendant l'incubation, l'add~ine ou la gua- nine s'incorporent dans les RNA qui s'associent & des protNnes pour former des particules ribonucldoprotdiqnes dormant naissance aux sous-unit6s 60 S e t 40 S des ribosomes. I1 appa- rait qu'en 3 ou 4 heures, ces sous-unit6s n6o- synth6tisdes ne s'incorporent qu'en faible pro- portion dans les polysomes, r6sultat particuli~- rement mis en dvidence avec la guanine, puisque l'ad6nine peut s'incorporer fortement dans les RNA poly A(+) et les tRNA. I1 en rdsulte qu'une stimulation de la synth~se des RNA ribosomiques par l'oestradiol se fair sentir essentiellement au niveau des sous-unit6s 60 S et 40 S e t des ribosomes 80 S.

Ces particules dont la synth~se est stimulde par l'hormone stdroide renferment non seule-

ment des RNA ndo-synth~tisds, mais dgalement de nouvelles protdines, ainsi que le montre l'incorporation de valine. En effet, les protdines marqudes r6vdldes par le gradient sont de deux types, celles qui constituent les ribosomes et celles en cours de synth~se sur les polysomes. Or, les rapports aH/14C sont augment~s par traitement cestrog~nique essentiellement aux niveaux 60 Se t 40 S. Nos exp6riences sugg~rent donc une synth~se eoncert6e des RNA et des protdines ribosomiques.

Cependant, alors que l'cestradiol agit au niveau des opdrons ribosomiques, il semble que la stimulation de synth~se des prot6ines s'effectue au niveau de la traduction des RNA messagers correspondants puisqu'aucune stimu- lation de la RNA polym&ase II n 'a pu 6tre d6cel6e dans le m~me temps E6].

Nous n'avons pas, au cours de ces exp6riences, r6alis6 une cin6tique d'action de l'cestradiol aussi d6taillde que celle que nous avions effec- tude pour la synth~se des RNA [6] et pour laquelle nous avions observ6 une stimulation maximum entre 10 et 15 heures apr~s l'injection de l'hormone. Ce d~lai de r~action peut appa- raitre long, mais il est ~ rapprocher de ce qui est observ6 dans un organe fortement et rapi- dement stimul~ par les oestrog~nes, l'nt~rus [13].

Signalons enfin qu'une injection umque d'cestradiol ne provoque pas d'accroissement dans la proportion des polysomes, d~tectable par simple mesure de l'absorption k 280 nm. Deux interpretations demeurent possibles : soit le temps d'action du st6ro~'de est trop court, et il faut signaler ~ ce sujet que, in vivo, la synth~se d'une hormone hypophysaire, la prolactine, n'est stimulde qu'apr~s plusieurs jours d'injec- tions [141 ; soit l'oestradiol ne modifie la dis- tribution des polysomes que dans une seule cat6gorie cellulaire. Or les gonadotropes repr~- sentent moins de 10 p. cent des cellules totales, et leur stimulation ne peut fitre ddceIde par la technique utilisde. Pour pr6ciser ce point, de nouveaux travaux devront ~tre entrepris partir de populations cellulaires spdcifiqnes.

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