Structure cristallographique d’une jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaisonStructure cristallographique d’une jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaison

Jérémie Pitona, Odile Lecompteb, Olivier Mauffretc, Olivier Pochb, Claudine Mayera aCRC Pôle 4 Equipe 12 - Site Pitié-Salpêtrière, UMRS 872 INSERM, 91 bd de l'Hôpital, 75013 Paris.

bIGBMC, Département de Biologie et Génomique Structurales, IGBMC, 1 rue Laurent Fries, 67404 Illkirch.cLBPA, UMR 8113 CNRS, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex.

E-mail: piton@chups.jussieu.fr

Remerciements : Nous remercions l’équipe de cristallographie du laboratoire UMRS 872 INSERM et en particulier Vanessa Delfosse et Stephanie Petrella, ainsi que Michel Pirrochi de la ligne FIP-BM30A pour son aide lors des collectes de données.

Forme B, Forme HJ ?Forme Modèle

B

HJ

1ZFC

1ZF3 OK Forme Jonction de Holliday

Remplacement Moléculaire

La recombinaison homologue est impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Décrite à l’origine comme responsable de la diversité génétique en créant de nouvelles combinaisons de gènes, la recombinaison possède des rôles très importants dans la ségrégation des chromosomes, l’intégration virale, la stabilité et le maintien du génome… L’étape principale de la recombinaison homologue est la formation d’un complexe formé de quatre brins d’ADN appelé jonction de Holliday qui conduit à deux doubles hélices d’ADN recombinées. Il est donc nécessaire de caractériser cette structure quaternaire d’ADN pour comprendre les causes de leurs formations ainsi que le mode de reconnaissance avec les protéines impliquées dans la recombinaison, telles que les recombinases ou les résolvases. Dans le cadre d’études de relations structure-fonction d'une famille d'ATPases atypiques d'archaea [1] (dénommées A5+) possédant un domaine résolvase et jouant ainsi un rôle potentiel dans la recombinaison, nous avons résolu la structure d’un oligonucléotide amphimorphique, c'est-à-dire qui cristallise sous plusieurs formes (forme A, forme B ou jonction de Holliday).

Des travaux antérieurs montrent que le passage d’une forme à une autre est dépendant de la séquence et de la concentration en ions. L’oligonucléotide CCGATATCGG cristallise en forme B dans le groupe d’espace P212121 en présence de 5 mM CaCl2, et en forme jonction de Holliday dans le groupe d’espace C2 avec 100 mM CaCl2 [2]. Des cristaux de cet oligonucléotide ont ici été obtenus en présence de 30 mM MgCl2, conditions jamais décrites dans la littérature. L’oligonucléotide cristallise dans le groupe d’espace C2 avec les paramètres de maille a = 64,26 Å, b  = 24,37 Å, c = 37,97 Å, β = 111,39°. Nous présentons ici la structure résolue à 2.3 Å en forme jonction de Holliday ainsi qu'un modèle d'interaction avec les protéines A5+.

Résumé

Domaine Domaine d’hydrolyse d’hydrolyse

de l’ATPde l’ATP

Domaine Domaine de liaison de liaison à l’ADNà l’ADN

Domaine résolvase de Domaine résolvase de jonction de Hollidayjonction de Holliday

Jonction de Jonction de HollidayHolliday

ADN ADN

forme Bforme B

Proposition d’un modèle d’interaction

AXE 2

En cours d’affinement…

Affinement : CNSAffinement : CNS

Unité biologiqueUnité biologique

R = 0,22 Rfree = 0,32

Unité asymétriqueUnité asymétrique Symétrique généré par Symétrique généré par l’axe 2 cristallographiquel’axe 2 cristallographique

Unité biologique

=

Influence des conditions de Influence des conditions de cristallisationcristallisation

Modifications structurales par rapport à 1ZF3

Effets des ions Mg2+ ?

Affinement et structure de HJ_Mg

1ZF3HJ_Mg

Oligonucléotide amphimorphique : cristallise sous plusieurs formes

forme A, forme B, jonction de Holiday

Influence de la séquence... … et de la nature des ions

CCGATATCGG

?Forme Forme

HJHJ

1ZF31ZF3

Forme HJ

1ZF4

Forme Forme BB

1ZFC1ZFC

50 mM cacodylate de sodium, 1 mM spermine, 30 mM MgCl2 et 30 % MPD

Conditions de cristallisation

+ Mg2+

+ Ca2+

(100mM)+ Ca2+

(5mM)

Problématique

+ Na+

La recombinaison homologueIntermédiaire de la recombinaison : Jonction de Holliday, structure quaternaire d’ADN

Protéines moteurs : permet à la jonction de glisserProtéines résolvases : hydrolyse la jonction de Holliday libérant les 2 hélices recombinées

Intermédiaire de la recombinaison, jonction de Holliday

Forme « open X »

2 Formes en solution

Jonction de Holliday

Interactions protéines - ADN :- Protéines tetramériques reconnaissent la forme « open X »Ex : RuvAB, intégrase, etc…

- Protéines dimériques reconnaissent la forme « stacked X »Ex : Résolvase, endonucléase, etc…

Domaine Domaine d’hydrolyse de d’hydrolyse de l’ATP l’ATP (280 aa)

Domaine AAA+Domaine AAA+

Domaine de liaison à l’ADN Domaine de liaison à l’ADN Winged Helix Winged Helix (100 aa)

Domaine WHDomaine WH C

Domaine Domaine Résolvase de Résolvase de jonction de jonction de HollidayHolliday (120 aa)

Domaine Domaine RésolvaseRésolvaseN

Organisation en domaines des protéines de la famille A5+

Interaction avec jonction de Holliday en forme « stacked X », rôle dans la recombinaison

Études structurales d’une jonction de HollidayDans le cadre d’études des relations structure – fonction des protéines de la famille A5+, nous avons résolu la structure d’un oligonucléotide en forme Jonction de Holliday.

Forme Open X ou Stacked X ?

Seule forme cristallisable sans protéine

Références bibliographiques :[1] Lecompte O., Ripp R., Puzos-Barbe V., Duprat S., Heilig R., Dietrich J., Thierry J.-C., Poch O., Genome Res., 2001, 11, 981-993.[2] Hays F.A., Vargason J.M., Ho, P.S. Biochemistry, 2003, 42, 9546-9597.

Statistiques de la collecte

27,4 (29,8)

2845 (428)

50-2.2 (2.3-2.2)Résolution (Å)0.974Longueur d’onde (Å)

a = 64.36, b =24.37, c = 37.97 = 111.39

Paramètres de maille (Å,°)

C2Groupe d’espaceBM30A (ESRF)Source des rayons X

No. Mol. dans U.A.

Rsym† (%)

I/(I)Redondance

Complétude (%)

No. reflexions unique

No. d’observations

11,91 (7,4) 4.1 (4.1)96,9 (93,4)

11723 (1760)

Forme « stacked X »

1 monomère

CCGATATCGGCCGCTAGCGGCCGGTACCGGTCGGTACCGACCGGCGCCGGCCAGTACUGGCCGGGCCCGGCCGGGACCGG

23 structures de type jonction de Holliday dans la NDB

8 séquences non redondantes

Pu : Base purine Py : base pyrimidine