T Berdous

INSERM U716 Pr F Calvo

Direction : S Mourah

Polymorphismes génétiques des anti-cancéreux

PHARMACOGENETIQUE

Variabilité interindividuelle de la réponse à un médicament

Objectifs => Améliorer la maîtrise de la variabilité interindividuelle

Individualiser le traitement médicamenteux : choix de

la molécule mais aussi posologie et rythme

d’administration

Le bon traitement, à la bonne personne et, au bon moment

Polymorphismes génétiques

Définition: Modification de séquence, stable, observée chez plus d’1% de la population

-Répétitions en tandem : microsatellites/minisatellite-La plus simple se situe au niveau d'un nucléotide : Single Nucleotide Polymorphism ou SNP

Le génome humain : 107 de SNP / 3 milliards pb contribuant à la diversité de l'espèce humaine

Variations nucléotidiques & conséquences :– séquence acide aminé – l'expression – in fine l'activité

Certains polymorphismes sont non fonctionnels ou silencieux, conservationstructure et/ou fonction.

Conséquences cliniques des différents phénotypesmétaboliques pour un médicament à index

thérapeutique étroit : anticancéreux

La classification des agents anticancéreux se fait suivant leur mécanisme d'action sur le cycle cellulaire et leur appartenance à des familles chimiques.

Médicaments altérant l'ADN : - agents intercalants = daunorubicine , anthracyclines (la pluplart sont des antibiotiques)- inhibiteurs de la topoisomérase I et II = irinotécan, étoposide

Anticancéreux

Inhibiteurs enzymatiques : - de la dihydrofolate réductase = méthotréxate

Antimétabolites :- 5-fluoro-uracile

Cytokines :- interféron alpha

Altération du fuseau mitotique :

Métabolisme et transport des Xénobiotiques

Objectif

Mise au point et validation d’une méthode de détection des polymorphismes des

gènes MDR1 et UGT1A1, basée sur la technologie de PCR à sonde d’hybridation :

► Polymorphismes des exons 26 et 21du gène MDR1 : transport des Anthracyclines et de l’Aracytine

► Polymorphismes de la TATA Box du gène UGT1A1 : toxicité à l’Irinotécan

► Association des SNP avec l’expression génique

transporteur le mieux caractérisé de la famille des ATP Binding Casette protéines

responsable de l’efflux cellulaire d’anticancéreux (Anthracyclines…)

surexprimé (ARN et protéine) dans les cellules cancéreuses

P-gp Function

MDR1 - P-gp - gp170

► 28 polymorphismes décrits (1236, 2677, 3435)

► Le SNP 3435C>T sur l’exon 26 définit 3 génotypes : CC, CT et TT

► Fonctionnalité de la Pgp dans les cellules hématopoïétiques moins élevée avec le génotype TT par rapport au CC (Hoffmeyer 2000) mais l’inverse est trouvé par d’autres (Kim 2002)

►La fréquence de la mutation C>T varie selon les races : génotype CC plus fréquent chez les africains et les afro-américains (83 et 61%) par rapport aux caucasiens (26%) et aux japonais ou chinois (34%) (Schaeffeler 2001); 83-84% versus 48% et 53% (Ameway 2001)

Polymorphisme du gène UGT1A1 en réponse à l’irinotécanUridine diphosphate Glucuronyl Transférase : enzyme membranaire

Enzyme de phase II, catalyse la glucuronoconjugaison.

► polymorphisme de répétition dans la TATA box du promoteur ( délétion ou insertion de séquence TA) plusieurs allèles (TA)5, (TA)7, (TA)8 (phénotype sauvage (TA)6).

►TA7 est associée à l’état homozygote, à la maladie de Gilbert (Kadakol 2000).

► déficit en UGT1A1 est à l’origine d’une toxicité sévère (diarrhée, leucopénie) dans le traitement de certains cancers par l’irinotécan

structure du gène UGT1A1

- 9 patients atteints de Leucémie aigue myéloblastique et 20 donneurs sains ont été inclus

- les PBMC ont été isolées (Ficoll)

- les ADN et ARN des PBMC ont été extraits sur colonnes Qiagen

- détection des SNP 3435 C>T (exon 26) et 2677 C>A (exon 21) du gène MDR1 et de UGT1A1 en utilisant la technologie des sondes à hybridation (Roche)

- quantification des transcrits MDR1 par RT-PCR quantitative en utilisant la technologie des sondes à hydrolyse (TaqMan™)

Patients & Méthodes

Méthodes• Technologie SybrGreen

• Sondes à Hybridation

Fluorescéine LCRed 640

Résultats - MDR1

mut

3435 neg

150 pb

Mut Mut

2677 - 3435 -

150 pb

PCR point final

PCR en SybrGreen

2677 3435

Polymorphisme – MDR1 / 3435 C>T

Tm nt 3435 :

Wt = 56°C

Mut = 64°C

PCR en Sonde à hybridation

Répartition des génotypages MDR1 (n=9)

CC CT TT

(2/9) (5/9) (2/9)

Polymorphisme –MDR1 / C3435T

Polymorphisme – MDR1 / C2677A

Homozygote sauvage 2677

Pas de mutation

Tm 59°C

Quantification des transcrits MDR1 et SNP

► 2 donneurs sains homozygotes sauvages

► Moyenne d’expression des transcrits MDR1 : 21.3 et 566 copies de MDR1/106 copies 2m respectivement dans les 2 groupes (20 donneurs sains et 9 LAM).

► Association C3435T : Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5)

Identification échantillon Génotype Tanscrits MDR1 (copies/106 copies 2m)

C42

3435CT / Hétérozygote

2115

C77 250

C112 200

C114 300

C100 11

C73 3435CC / Homozygote sauvage

1536

C16 4

C71 3435TT / Homozygote muté

643

C121 39

Tm 40°C 46°C 40°C

Répartition des génotypages UGT1A1 (n=6)

TA6/TA7 TA6/TA6

(4/6) (2/6)

Résultats – UGT1A1 sonde TA7

Selon la méthodologie décrite par Von Ahsen en 2000

DiscussionIdentification fiable et reproductible des différents polymorphismes MDR1

et UGT1A1 étudiés

MDR1

C3435T :

Détection de différents profils dans les LAM (hétérozygotes, homozygote muté/sauvage),

Donneurs sains homozygotes sauvages 3435CC

C2677A : un seul génotype : homozygote sauvage

Ces fréquences sont en accord avec celles rapportées par d’autres équipes.

La mutation C2677A est décrite comme rare (Hoffmeyer et al 2003)

Association SNP et expression de MDR1 :

- Illmer et al 2002,

association phénotype-génotype des polymorphismes MDR1 (n = 405 patients) : C3435T, C2677A & C1236T

- Association C3435T :

Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5)

Discussion

UGT1A1

Sonde TA7, caractérisation de 2 profils génotypiques :

- homozygote sauvage TA6/TA6- hétérozygote muté TA6/TA7

- les autres génotypes non mis en évidence groupe restreint

Le génotypage de ces polymorphismes est réalisable avec les sondes TA6, TA8 (validation des résultats).

Optimisation de la méthode décrite par Von Ahsen et al

Détection des différents génotypes en utilisant une seule sonde

TA7

Conclusion & Perspectives

► Mise au point et validation de la détection des SNP C3435T, C2677A(MDR1) et polymorphismes UGT1A1 par sonde à hybridation

► Méthode reproductible et fiable, spécifique et sensible (picogrammes d’ADN)

► Evaluer les conséquences cliniques et thérapeutiques de ces SNP

► Association phénotype-génotype

Mise à disposition du médecin de tests de dépistage de polymorphismes génétiques, réalisables en routine, permettant de prédire l’efficacité ou la

toxicité d’un traitement pour un individu donné.

Sonde Génotype Tm par Tm PCR Thermodynamie

UGT1A1 TA5 35,4°C 36,3°C

TA6 39,9°C 39°C TA7 46,2°C 46,4°C TA8 42,2°C 41,3°C

Nos résultats sont en accord avec ceux décrits par Von Ahsen en 2000

Mécanismes moléculaires à l’origine d’une

anomalie du métabolisme