GENEVIEVE NADEAU

LA SIGNIFICATION PRONOSTIQUE DES POLYMORPHISMES DE GÈNES DE LA

GLUCURONIDATION DANS LE CANCER DE LA PROSTATE TRAITÉ PAR PROSTATECTOMIE

RADICALE

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en epidemiologic (recherche clinique) pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se.)

DEPARTEMENT D'EPIDEMIOLOGIE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2010

© Geneviève Nadeau, 2010

Résumé Le cancer de la prostate (CaP) représente le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez

les hommes de plus de 50 ans au Canada. Considérant l'hétérogénéité clinique du CaP, sa

dépendance hormonale et une forte suspicion d'une contribution génétique à son étiologie,

il apparaît crucial d'examiner si des polymorphismes au niveau des gènes reliés au

métabolisme des androgènes et des œstrogènes seraient associés à une évolution clinique

plus ou moins agressive du CaP.

La glucuronidation est un processus majeur d'inactivation des hormones stéroïdiennes

sexuelles. Cinq polymorphismes fonctionnels des enzymes UDP-glucuronosyltransférases

(UGT) ont donc été étudiés.

Une déficience en UGT2B17 et UGT2B28 a été associée à un risque accru de récidive

biochimique post-prostatectomie chez les patients atteints d'un CaP cliniquement localisé.

Ces résultats supportent l'hypothèse que des polymorphismes des UGT associés à une

activité moindre conduisent potentiellement à des concentrations intracellulaires en

androgènes actifs plus élevées, le tout se traduisant par une prolifération cellulaire accélérée

et un pronostic moins favorable.

Avant-Propos Ce travail est le fruit d'une collaboration entre le Laboratoire d'Uro-Oncologie

Expérimentale de l'Hôtel-Dieu de Québec et le Laboratoire de Pharmacogénomique du

CHUQ, pavillon CHUL. Le succès de ce travail d'équipe se traduit par la rédaction d'un

manuscrit, présenté dans la troisième section de ce mémoire, intitulé « Copy Number

Variation of Sex-Steroid Metabolizing Genes as Biomarkers of Prostate Cancer Recurrence

after Prostatectomy: Looking at the End of the Androgenic Signal ».

Ce mémoire est divisé en quatre grandes parties. Le chapitre I présente une revue des

connaissances générales publiées dans la littérature sur le sujet de recherche. Le chapitre II

décrit la méthodologie utilisée et les objectifs poursuivis. Le manuscrit est présenté dans le

chapitre III. Il a été rédigé en anglais et selon les critères exigés par le périodique auquel

nous l'avons soumis pour publication. Dans la dernière section, une discussion résume les

résultats obtenus et propose de futures avenues de recherche pour la poursuite du projet.

La contribution de plusieurs expertises fut requise pour la réalisation de ce projet. Je tiens à

remercier tout d'abord mon directeur de maîtrise, Dr Louis Lacombe, pour son support, ses

précieux conseils et sa grande disponibilité. J'exprime également mes remerciements aux

Drs Éric Lévesque, Chantai Guillemette et Yves Fradet, qui m'ont généreusement

accueillie dans leurs laboratoires. Je suis fière d'avoir pu bénéficier d'un tel encadrement

scientifique.

Je ne saurais passer sous silence la contribution de Judith Bellemare, étudiante au doctorat

en pharmacie. Merci Judith pour ton aide à toutes les étapes du projet et pour avoir

gentiment répondu à mes innombrables questions. Merci aux Drs Pierre Douville et

François Meyer pour leurs collaboration et commentaires constructifs. Merci aux

professionnel(le)s de recherche, Hélène Hovington, Céline Veilleux et Mario Harvey, pour

leur patience et leur précieuse aide à la réalisation du projet.

Merci à mes parents qui m'ont toujours encouragée à persévérer et à continuer. Enfin,

merci à Alain, sur qui je peux toujours compter, pour sa compréhension et sa générosité.

/ may not be there yet, but I'm closer than I was yesterday.

- Author Unknown

Table des matières Résumé i Avant-Propos ii Table des matières iv Liste des tableaux vi Liste des figures vii Liste des abréviations viii CHAPITRE 1 ÉTAT DES CONNAISSANCES 1 1.1 Le cancer de la prostate 2

1.1.1 Epidemiologic 2 1.1.2 Facteurs de risque 5 1.1.3 Facteurs pronostiques 10 1.1.4 Influences des androgènes et œstrogènes sur le tissu prostatique 11

1.2 Les enzymes UDP-glucuronosyltransférases 14 1.2.1 Structure des enzymes UGT 16 1.2.2 Fonction biologique 17 1.2.3 Classification 19

1.2.3.1 UGT1 20 1.2.3.2 UGT2 20

1.2.4 Polymorphismes génétiques étudiés 21 1.2.4.1 UGT2B7 21 1.2.4.2 UGT2B15 21 1.2.4.3 UGT2B17 21 1.2.4.4 UGT2B28 22 1.2.4.5 UGT1A1 22

1.2.5 Rôle étiologique de la voie de glucuronidation dans le cancer de la prostate 23 1.2.5.1 Études in vitro 23 1.2.5.2 Études cliniques 24

Objectifs et Hypothèse 25 CHAPITRE 2 METHODOLOGIE 26 2.1 Aspect clinique 27

2.1.1 Devis de l'étude 27 2.1.2 Confidentialité et considérations éthiques 29

2.2 Génotypage 29 2.3 Analyses statistiques 30

2.3.1 Équilibre de Hardy-Weinberg 32 2.3.2 SNP, haplotypes et CNV 33

CHAPITRE 3 RÉSULTATS 36 CHAPITRE 4 DISCUSSION 69 4.1 Synthèse et interprétation des résultats 70 4.2 Comparaison avec la littérature 71 4.3 Forces de l'étude 72 4.4 Limites de l'étude 73 4.5 Perspectives 76 Conclusion 78

Bibliographie 79 Annexe A 92 Annexe B 94 Annexe C 96

Liste des tableaux Tableau 1.1 Gènes de susceptibilité 7 Tableau 1.2 Marqueurs pronostiques du cancer de la prostate 10 Tableau 1.3 Spécificité stéroïdienne des UGT étudiées 20

Liste des figures Figure 1.1 Relation entre la prévalence des cancers de la prostate diagnostiqués lors

d'autopsie, diagnostiqués cliniquement et les décès par cancer de la prostate 3

Figure 1.2 Paradigmes du traitement du cancer de la prostate 5

Figure 1.3 Production et élimination des androgènes dans les cellules épithéliales basales et luminales de la prostate 12

Figure 1.4 Schéma de la stéroïdogénèse incluant les UGT. 15

Figure 1.5 Représentation schématique de la structure primaire des UGT 16

Figure 1.6 Les trois phases du processus de détoxication chez l'humain 17

Figure 1.7 Réaction de glucuronidation 18

Figure 1.8 Élimination de la DHT dans les cellules prostatiques 19

Figure 1.9 Représentation schématique de l'impact d'un déficit en UGT2B15I2B17 dans les cellules LNCaP androgéno-dépendantes 23

Figure 2.1 Exemple de fenêtre de présentation d'un chromatogramme de bonne qualité, obtenu à partir d'un séquenceur automatique 30

Figure 2.2 Représentation schématique du concept des polymorphismes et des haplotypes 33

Figure 2.3 Haplotypes des polymorphismes d,UGT2BJ7, 2B15 et 2B28 sur le chromosome 4 et leur fréquence allélique 34

Figure 2.4 Représentation schématique du concept des variations dans le nombre de copies des gènes 35

Liste des abréviations 3a-Diol Androstane-3a,17P-Diol 3a-HSD Enzyme 3a-hydroxystéroïde déshydrogénase 3P-HSD Enzyme 3p-hydroxystéroïde déshydrogénase 17P-HSD Enzyme 17p-hydroxystéroïde déshydrogénase ABC ATP-binding cassettes ACS American Cancer Society ADN Acide désoxyribonucléique ADT Androstérone ADT-G Androstérone glucuronide APS Antigène prostatique spécifique AR Récepteur des androgènes ARN Acide ribonucléique ASAP Foyer de prolifération micro-glandulaire atypique ASCO American Society of Clinical Oncology AUA American Urological Association CaP Cancer de la prostate CHUL Centre Hospitalier de l'Université Laval CHUQ Centre Hospitalier Universitaire de Québec CNV Variation dans le nombre de copies de gènes CYP Cytochrome P450 D Aspartate DHT Dihydrotestostérone DHT-G Dihydrotestostérone glucuronide EAU European Association of Urology ESR1 Gène codant pour le récepteur a des œstrogènes GST Glutathione S-Transférase HDQ L'Hôtel-Dieu de Québec HGPIN Néoplasie intraépithéliale de haut grade HIFU Ultrasons focalisés de haute intensité HR Hazard ratio (rapport des risques instantanés) HSD3B1 Gène codant pour l'isoenzyme 3p-hydroxystéroïde déshydrogénase type I HSD3B2 Gène codant pour l'isoenzyme 3P-hydroxystéroïde déshydrogénase type II I5AR Inhibiteurs de la 5a-réductase IMC Indice de masse corporelle Kb Kilobase ( 1000 paires de bases) LNCaP Lignée cellulaire constituant un modèle in vitro d'adénocarcinome

prostatique humain LUOE Laboratoire d'uro-oncologie expérimentale NAT N-acétyltransférase P450c 17 Enzyme du cytochrome P450 17-hydroxylase-17,20-lyase P450scc Enzyme du cytochrome P450 side chain clivage (coupure de chaîne latérale) PCPT Étude intitulée: Prostate Cancer Prevention Trial PCR Réaction en chaîne par polymerase RE Reticulum endoplasmique

IX

REDUCE Étude intitulée: REduction by DUtasteride of prostate Cancer Events REMARK REporting recommendations for tumor MARKer prognostic studies SELECT Étude intitulée: SELenium and vitamin E Cancer prevention Trial SHBG Globuline se liant aux hormones sexuelles SNP Polymorphisme nucléotidique simple SRD5A2 Gène codant pour la 5<x-réductase de type II SULT Sulfotransférase TNM Système international de classification des cancers

(T : Tumeur; N adenopathies régionales; M :Métastases à distance) UDPGA Acide Uridine Diphospho-glucuronique UGT Uridine Diphospho-Glucuronosyltransférase Y Tyrosine

CHAPITRE 1 ETAT DES CONNAISSANCES

1.1 Le cancer de la prostate

1.1.1 Epidemiologic

Avec 25 500 nouveaux cas estimés en 2009 au Canada (1), le cancer de la prostate (CaP)

représente le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes de plus de 50 ans,

en excluant les cancers cutanés superficiels. Il s'agit de la 3e cause de décès par cancer,

après le cancer du poumon et le cancer colorectal. Un homme sur six sera diagnostiqué

avec un CaP au cours de sa vie et un homme sur 27 en mourra. L'âge médian au diagnostic

est de 68 ans (2). Son incidence est en augmentation, avec un taux annuel estimé à 129 pour

100 000 en 2009(1).

Malgré une augmentation significative de l'espérance de vie (3), un déclin de 24,3% des

taux de mortalité fut noté au cours des 17 dernières années au Canada, aux États-Unis et en

Grande-Bretagne, probablement en grande partie dû à une détection précoce (4;5).

D'ailleurs, depuis l'utilisation répandue de l'APS en 1988 (6), l'incidence par stade a

changé au profit des formes localisées qui représentent maintenant 84% des nouveaux cas

(2;7).

Le taux de survie à 5 ans est de 100% pour ces CaP cliniquement localisés, alors qu'il n'est

que de 31% lorsque le cancer est d'emblée métastatique au moment du diagnostic (2). Ceci

met en évidence l'importance, comme toute autre pathologie, de le détecter à un stade

précoce et asymptomatique.

Pourtant, le dépistage du CaP demeure un sujet de controverse. En effet, d'un effort de

dépistage précoce origine un risque de surdiagnostic et de surtraitement dont les fardeaux

sanitaire et économique sont non négligeables. Deux larges essais cliniques randomisés ont

été publiés au cours de la dernière année sur le sujet. La première étude, réalisée aux États-

Unis chez plus de 76 000 hommes, a conclu qu'après dix ans de suivi, les hommes incités

au dépistage sont 10% plus nombreux à mourir d'un CaP (8). Cette étude fut toutefois

vivement critiquée en raison de plusieurs lacunes méthodologiques, notamment un biais de

contamination significatif puisque 50% des hommes du groupe témoin ont eu au moins un

dosage d'APS en cinq ans. La seconde étude, qui portait sur 162 000 hommes d'origine

européenne, a conclu que le dépistage permettait de réduire la mortalité par CaP de 20%

après un suivi moyen de neuf ans, ce qui était significatif (p=0.04) (9).

Le U.S. Preventive Services Task Force (en 2008) et l'Association Européenne d'Urologie

(EAU) (en 2009) ont conclu qu'il n'existait pas suffisamment de données pour

recommander ou décourager à l'heure actuelle le dépistage systématique du cancer de la

prostate par dosage de l'APS et/ou par toucher rectal (10; 11). Tout récemment, la Société

Américaine du Cancer (ACS) révisait ses recommandations sur le dépistage précoce du

CaP, estimant que tout homme devrait être informé des avantages et inconvénients du

dépistage de façon à permettre une prise de décision libre et éclairée (12). La conclusion

semble donc être que les chances de bénéficier réellement d'un dépistage précoce sont

minimes compte tenu qu'une faible proportion de CaP de bas risque progresseront vers une

forme avancée et métastatique dont le pronostic est nettement plus sombre (13). La majorité

des sujets atteints décéderont donc non pas de mais avec leur CaP.

I""l Tous les hommes

■ H Cal'diagnostiques lors d'autopsie

^ B CaP diagnostiqués cl iniquement

^ 1 Décès par CaP

Figure 1.1 Relation entre la prévalence des cancers de la prostate diagnostiqués lors d'autopsie, diagnostiqués cliniquement et les décès par cancer de la prostate

Adapté de Prostate Cancer, Lancet 2008 (13).

Conséquemment, la prévention du CaP suscite énormément d'intérêt et plusieurs études

récentes ont abordé le sujet de la chimioprévention avec les inhibiteurs de la 5a-réductase

(I5AR). L'étude PCPT, publiée en 2003, a mis en évidence une réduction statistiquement

significative (p<0,001) de 24,8 % de l'incidence du CaP chez des hommes en bonne santé

de 55 ans ou plus qui avaient reçu du finasteride (15AR de type 2) pendant sept ans, par

comparaison à ceux qui avaient reçu un placebo (14). Basées sur cette étude, la Société

américaine d'oncologie clinique (ASCO) et l'Association américaine d'urologie (AUA) ont

émis des directives en mars 2009 recommandant qu'il y ait une discussion approfondie

avec les hommes faisant régulièrement mesurer leur taux d'APS sur le fait que leur risque

de CaP peut être réduit en prenant un 15AR (15). En avril 2009, des résultats préliminaires

de l'étude REDUCE ont été dévoilés. Cette étude regroupait 8000 hommes de 50 à 75 ans

qui ont été randomisés de façon à recevoir du dutastéride (I5AR de type 1 et 2) ou un

placebo. Le risque de survenue d'un CaP avait diminué de 23,5 % après quatre ans (16).

D'un point de vue clinique, un diagnostic de CaP sera posé à partir de biopsies prostatiques

transrectales effectuées à la suite d'un toucher rectal suspect ou d'une valeur sérique d'APS

augmentée.

Compte tenu de l'hétérogénéité clinique du CaP, le choix du traitement optimal repose sur

plusieurs facteurs cliniques et biologiques, notamment les caractéristiques de la tumeur et

l'espérance de vie du patient (17). De nombreuses modalités thérapeutiques sont

actuellement disponibles: surveillance active, prostatectomie radicale, radiothérapie,

brachythérapie, cryothérapie, HIFU, hormonothérapie et, ultimement, chimiothérapie.

Aux stades localisés (T1-T2-T3, N0, MO), les patients reçoivent habituellement un

traitement à visée curative (prostatectomie, radiothérapie). Il est estimé qu'environ le tiers

des CaP cliniquement localisés traités par prostatectomie radicale récidiveront au cours des

10 années suivant la chirurgie (18). Chez certains patients rigoureusement sélectionnés, une

attitude de surveillance active sera plutôt privilégiée.

En cas d'élévation du taux d'APS et donc de récidive ou de progression de la maladie, un

traitement de radiothérapie de rattrapage ou une hormonothérapie (blocage androgénique)

sera offert. La réponse à l'hormonothérapie est d'une durée très variable et imprévisible. Le

CaP peut par la suite devenir hormono-indépendant, ce qui se traduira par une nouvelle

élévation de l'APS et une progression clinique avec apparition de symptômes et/ou de

métastases. À ces stades plus avancés (T4 ou Ml), où la tumeur est habituellement devenue

hormono-résistante, la prise en charge par une équipe multidisciplinaire vise une

préservation maximale de la qualité de vie associée à différentes stratégies thérapeutiques

de manipulation hormonale ou de chimiothérapie (17).

I Non métastastique (MO) i

Hormono-dépendant Hormono-indépendant

Hormono-résistant Métastatique (M+)

Récidive APS

Récidive APS

Récidive APS

Récidive APS

Progression clinique Localisé Récidive

APS Récidive

APS Progression

clinique Localisé / i Récidive

APS Récidive

APS Progression

clinique i Récidive

APS Récidive

APS Progression

clinique i Récidive

APS Récidive

APS

Radiot néraoie t 1 _J t _ ' - ^ - ^ Prostatectomie Radiothérapie de sauvetage

Hormonothérapie Chimiothérapie

Figure 1.2 Paradigmes du traitement du cancer de la prostate Adapté de Campbell-Walsh's Urology, 9th edition (19).

À l'ère de la médecine individualisée, le but ultime serait de pouvoir moduler l'offre et

l'intensité du traitement offert aux patients nouvellement diagnostiqués en fonction du

bénéfice potentiel qu'ils pourraient en tirer, et ainsi minimiser le risque d'induire des effets

néfastes découlant du traitement à des patients chez qui le cancer demeurera

potentiellement latent et à l'état subclinique toute leur vie.

1.1.2 Facteurs de risque

Les études épidémiologiques ont identifié un nombre important de facteurs de risque pour

le cancer de la prostate.

1. Facteurs héréditaires

Age

Il s'agit du facteur de risque le plus significatif (6). Le CaP est rarement

diagnostiqué avant 50 ans, mais après cet âge, son incidence augmente de façon

exponentielle (20). L'analyse histologique des prostates d'hommes décédés

d'autres causes montre la présence de cellules prostatiques néoplasiques chez

plus de 50% des octogénaires (6;21).

Histoire familiale

Dans une méta-analyse publiée en 2003, les hommes avec des antécédents

familiaux de CaP présentaient un risque significativement accru de développer

un CaP (22). Leur risque relatif varie de 1,5 à 5 selon le nombre et l'âge au

diagnostic des parents atteints, et le degré de parenté (4).

Ethnie

Il existe une grande variation de l'incidence du CaP selon les races. Les Afro-

Américains sont parmi les plus touchés au monde avec une incidence de 249

pour 100 000 habitants. En comparaison, l'incidence chez les Caucasiens est de

157. Pour les Hispaniques, l'incidence diminue à 135 et elle atteint son

minimum chez les Asiatiques avec 94 (21;23). Ces disparités demeurent

significatives même lorsqu'on tient compte du statut socio-économique, de

l'accès aux soins de santé et des habitudes de vie (24;25).

Facteurs génétiques

Plusieurs études ont identifié des marqueurs génétiques de prédisposition au

CaP. Sans en faire une liste exhaustive, les principaux gènes de susceptibilité

actuellement reconnus sont impliqués dans différents mécanismes de la

carcinogénèse tels que l'inflammation, l'angiogénèse et le contrôle du cycle

cellulaire (26) (Tableau 1.1). Certains loci de prédisposition ont également été

identifiés sans qu'aucun gène causal ne réside dans ces régions. Les plus

fortement associés au CaP à ce jour semblent être 8q24, 17ql2 et 17q24 (27;28).

Des polymorphismes de gènes impliqués dans la biosynthèse et la dégradation

des androgènes et œstrogènes ont aussi été associés à un risque accru de CaP, les

plus étudiés étant AR, SRD5A2, CYP17A1, CYP3A, SHBG, ESR1, HSD3B1 et

HSD3B2 (26;27;29;30).

Tableau 1.1 Gènes de susceptibilité Gène Chromosome Année

d'identification Fonction de la protéine

EL AC/HP C2 17pll 2001 Inconnue RNASEL/HPC1 lq24-25 2002 Apoptose et susceptibilité aux

infections MSR1 8p22-23 2002 Inflammation et susceptibilité aux

infections 0GG1 3p26.2 2002 Réparation des dommages

oxydatifs de l'ADN CHEK2 22ql2.1 2003 Régulation du cycle cellulaire BRCA2 13ql2.3 2003 Réparation de l'ADN PON1 7q21.3 2003 Antioxydant et anti-radicaux libres GDF15 19pl3 2004 Inflammation

TMPRSS2-ERG TMPRSS2-ETV1

21q22.3;21q22.2 21q22.3;7p21.2

2005 Oncogenes de fusion

Adapté de Risk Factors for prostate cancer, Nat Clin Pract Urol 2009 (27).

La recherche en biologie moléculaire est en pleine effervescence, et malgré

l'accroissement exponentiel du nombre de marqueurs moléculaires potentiels

identifiés, ceux-ci ne semblent représenter qu'une petite fraction de la

prédisposition génétique observée dans le CaP (26).

2. Facteurs liés à la diète et aux habitudes de vie

Les études épidémiologiques ont généré plusieurs conclusions contradictoires

quant au rôle des facteurs diététiques sur le risque de développer un CaP. Il est

toutefois postulé que l'exposition à certains carcinogènes alimentaires puisse

causer des dommages directs à l'épithélium prostatique (31).

Obésité

La relation entre l'obésité et le CaP est complexe. Certaines évidences suggèrent

qu'un indice de masse corporelle (IMC) > 35 est associé à des tumeurs de plus

haut grade de Gleason, et à un risque accru de récidive biochimique et de

marges positives post-prostatectomie, en comparaison aux hommes non-obèses

(32;33). D'autres évidences suggèrent un effet paradoxal de l'obésité. En effet,

un surplus de poids serait associé à un risque accru de CaP de haut grade, mais à

un risque moindre de CaP de bas grade (34).

Par ailleurs, les taux d'APS sérique sont d'autant plus faibles que 1TMC est

élevé (35;36), possiblement en raison d'une hémodilution puisque le volume

plasmatique de distribution est plus grand (37). Il en résulte un dépistage du CaP

plus difficile chez les obèses, en raison l'APS abaissé et d'un toucher rectal

adéquat plus difficile à exécuter. De plus, la taille souvent plus importante de la

prostate chez les hommes obèses (38;39) limite la capacité non seulement de

sentir la tumeur mais aussi de détecter le cancer lors de la biopsie (40).

Il reste à déterminer si l'augmentation du risque de CaP chez les hommes obèses

résulte d'une détection tardive ou d'une forme plus agressive de cancer. Ceci

présente d'autant plus d'intérêt que l'indice de masse corporelle constitue un

facteur de risque modifiable de CaP.

Tabac

Bien que le tabagisme soit un facteur de risque établi pour de nombreux cancers,

les évidences pour le CaP ne sont pas aussi convaincantes (20). Aucune relation

dose-réponse n'a été clairement démontrée dans la littérature entre le tabagisme

et le risque de CaP (41). Par contre, plusieurs études ont établi que les hommes

fumeurs avaient des taux sanguins en testosterone, androsténédione et

dihydrotestostérone supérieurs à ceux des non-fumeurs (42-44).

Autres facteurs nutritionnels

D'autres facteurs nutritionnels ont été suggérés pour leur effet protecteur dans le

CaP, soit le lycopène, les isoflavonoïdes, les phytocestrogènes, les polyphenols

du thé vert et la vitamine D (6;13;27). L'étude SELECT, un essai randomisé

d'envergure impliquant plus de 35 000 hommes, a conclu que le sélénium et la

vitamine E n'exerçaient pas d'effet bénéfique pour la prévention du CaP (45).

3. Lésions précurseurs

Deux états précurseurs possibles du CaP ont été identifiés, soit les foyers de

prolifération micro-glandulaire atypique (ASAP) et la néoplasie intraépithéliale

de haut grade (HGPIN). Ces lésions auraient un rôle potentiellement prémalin

puisque les patients chez qui elles sont identifiées ont un risque

significativement accru d'avoir un CaP (5).

4. Niveaux d'hormones stéroïdiennes endogènes

Plusieurs études ont quantifié les taux circulants en androgènes chez des sujets

atteints d'un CaP en comparaison à des témoins appariés en fonction de l'âge.

Une méta-analyse de 18 études prospectives publiée en 2008 rapportait une

absence d'association entre les taux sanguins de testosterone totale et le risque

de CaP (46). Bien qu'à priori cette absence d'association « dose-réponse »

puisse suggérer à certains d'abandonner l'hypothèse du rôle étiologique des

androgènes dans le CaP, selon plusieurs auteurs, elle ne fait que souligner une

compréhension limitée du lien entre les taux sanguins d'androgènes, de leur

conversion métabolique dans la prostate et de leur action réelle sur le tissu

prostatique (47). Quant aux niveaux sériques en œstrogènes, certains auteurs ont

mis en évidence des niveaux significativement plus élevés chez les patients avec

CaP en comparaison aux témoins sains appariés (48). Ils considèrent ainsi que

des niveaux circulants faibles en œstrogènes représentent un facteur de risque

additionnel du CaP (49-53).

5. Facteurs environnementaux

Aucune cause étiologique d'origine environnementale n'a pu à ce jour être

formellement identifiée (26). Parmi les facteurs de risque avancés, on note le

statut socio-économique, l'occupation, l'exposition aux métaux lourds

(cadmium, zinc), l'exposition aux rayons ultraviolets, la fréquence des activités

sexuelles, les infections transmises sexuellement, la vasectomie et les radiations

ionisantes (6;20;27).

Les évidences quant au rôle de l'inflammation sur la carcinogénèse prostatique

sont nettement plus éloquentes. On estime que 20% de tous les cancers humains

seraient causés par un état inflammatoire chronique (31). L'inflammation

créerait un microenvironnement où des dommages cellulaires répétés

10

entraveraient les processus de réparation et de replication de l'ADN usuels (54).

Ce lien fut corroboré par l'identification de gènes de susceptibilité au CaP

impliqués dans les mécanismes de l'inflammation (Tableau 1.1) et par

l'association entre la prise d'anti-inflammatoires et une diminution du risque de

CaP (55). L'origine de l'inflammation intraprostatique et les mécanismes

moléculaires complexes qui la sous-tendent n'ont pas encore été élucidés (31).

1.1.3 Facteurs pronostiques

Les principaux marqueurs pronostiques actuellement utilisés en pré-traitement sont l'APS

initial, le score de Gleason à la biopsie et le stade clinique TNM. À partir des

caractéristiques pathologiques, s'ajoutent le score de Gleason du spécimen, le stade

pathologique TNM et le statut des marges chirurgicales. Il s'agit des marqueurs

pronostiques « classiques » du CaP.

Il serait utopique de vouloir faire une liste exhaustive de tous les facteurs pronostiques

suggérés dans le CaP. Une excellente revue systématique de la littérature publiée en 2009

adresse cette question et nous nous en inspirerons pour résumer les marqueurs les plus

prometteurs (56) (Tableau 1.2).

Tableau 1.2 Marqueurs pronostiques du cancer de la prostate Prometteurs Non prometteurs Non concluants

Nombre de carottes biopsiques atteintes

Dimension maximale de la tumeur dans le spécimen

% de tumeur dans le spécimen chirurgical

Cinétique de l'APS (vélocité, temps de doublement)

Volume tumoral Répétitions CAG du récepteur des androgènes

% de cancer de haut grade Polymorphismes du récepteur de la vitamine D

Index de prolifération Ki-67

Taux de phosphastase acide Creatinine ADN-ploïdie Gleason 7 : 4+3 vs 3+4 Expression de P-caténine Bcl-2

CD10 Génotypes CYP3A4

p53 Syndécan-1

Score de Gleason modifié Adapté de Use of classical and novel biomarkers as prognostic risk factors for localized

prostate cancer: a systematic review, Health Technol. Assess. 2009 (56).

11

Les évidences pour juger de l'utilité clinique de ces marqueurs sont peu robustes, à

l'exception de la vélocité de l'APS pour laquelle il existe deux larges essais de validation

de bonne qualité (56).

De nombreux outils pronostiques (tables de Partin, nomogramme de Kattan, etc.) ont été

élaborés pour guider la prise de décision thérapeutique et tenter de prédire le risque de

progression. Puisqu'ils ont été développés à partir de données provenant d'études de

cohortes longitudinales plutôt que d'essais randomisés, ils sont davantage susceptibles

d'être affectés par des biais. Il importe donc d'être prudent lors de leur utilisation pour

l'évaluation du risque individuel.

À la lumière de cette revue systématique, il est recommandé que les études s'intéressant

aux marqueurs pronostiques du CaP portent sur de larges cohortes dont la durée de suivi

moyenne ou médiane soit d'au minimum cinq ans. Une validation externe des marqueurs

potentiels identifiés s'avère également nécessaire (56). Ces recommandations vont dans le

même sens que les recommandations REMARK émises par le groupe de collaboration

NCI-EORTC en 2005 (57).

1.1.4 Influences des androgènes et œstrogènes sur le tissu prostatique

Les androgènes influencent le développement, la maturation, la prolifération et la

différenciation des cellules prostatiques (27). Depuis les travaux de Huggins et Hodges en

1941 (58), le rôle des androgènes dans la carcinogénèse prostatique est largement établi

(26). Ceux-ci ont montré qu'une castration chirurgicale ou médicale résultait en une

régression du CaP métastatique, ce qui a conduit à l'introduction de l'hormonothérapie par

blocage androgénique dans le traitement du CaP (47).

La testosterone et la dihydrotestostérone (DHT) sont les deux principaux androgènes chez

l'homme. La 5a-réductase de type II, l'isoforme prédominante dans la prostate (encodée

par le gène SRD5A2), convertit la testosterone de façon irréversible en DHT, le metabolite

androgénique actif principal dans les tissus (59). Une exposition insuffisante à la DHT

12

semble protéger contre le développement du CaP, à la fois in vitro et in vivo (59). En effet,

l'administration de suppléments de DHT à des modèles animaux induit une transformation

néoplasique prostatique (60). Cette hypothèse est également supportée par la constatation

que les eunuques et les hommes avec des anomalies congénitales du métabolisme des

androgènes ne développent pas de néoplasie prostatique (20).

Dans la prostate, la DHT se lie au récepteur des androgènes (AR) pour former un complexe

DHT-AR qui, après translocation dans le noyau, activera la transcription de gènes modulant

la synthèse d'ADN et la prolifération cellulaire (27).

L'action androgénique intraprostatique est donc déterminée par une multitude de facteurs,

incluant la concentration en AR, la concentration en DHT et sa biotransformation

enzymatique en une multitude de metabolites. L'exposition au DHT est en effet d'abord

influencée par l'activité de la 5a-réductase de type II pour sa synthèse et par l'activité des

enzymes régulant son inactivation (47).

TESTICULES SURRENALE

testosterone DHEA

Cellule basai*

17f>-HSD

I7P-HS0

-*■ S-Diol

3p-HSD

PROSTATE

éP

*■ Testosterone ■' 5a-réductase | 5u-reductase I So-

1 7P

H S D » Birr ­A­Dione ♦■

Ja­HSD 17P­HSD

AOT ♦——►îa­diol |uGT2B17

AOT­G

Ja-HSry

x-à

i UGT2B17

3a-diol-G , , DHT-G

UGT2B17

Cellule luminale

­** Testosterone I 5a-reductase

— ► DHT » OHT-G ■ V UCT2B1S

M o y a u ^

Figure 1.3 Production et élimination des androgènes dans les cellules épithéliales basales et luminales de la prostate

Tiré de L'inactivation des androgènes par les UDP-glucuronosyltransférases, Med Sci (Paris) 2003 (61).

13

La DHT est d'abord convertie en 3a et 3p-androstanédiol via les 3a et 3p-HSD, un

processus réversible. Ces metabolites sont ensuite conjugués en 3a et 3P-androstanédiol

glucuronide, un processus généralement irréversible (voir section suivante) (47). Puisque la

mesure directe des taux androgéniques intraprostatiques s'avère techniquement difficile et

puisque peu de la DHT formée dans la prostate est relarguée dans la circulation sous cette

forme, certaines études épidémiologiques considèrent que les taux sériques des metabolites

glucuronides sont le reflet des taux hormonaux tissulaires (47).

L'importance de l'activité de la 5a-réductase de type II a été démontrée notamment par les

études PCPT et REDUCE qui proposent des molécules inhibitrices de cette enzyme comme

agents de chimioprévention (14; 16). De plus, des polymorphismes fonctionnels (49T, 89V)

de SRD5A2, résultant en une activité augmentée de l'enzyme, ont été associés à un risque

accru de CaP par une plus grande biodisponibilité intracellulaire de dihydrotestostérone

(29;62;63).

Des récepteurs œstrogéniques sont également présents dans la prostate. Plusieurs études

épidémiologiques suggèrent d'ailleurs un rôle des œstrogènes dans la carcinogénèse

prostatique (20). Ce rôle n'est toutefois pas bien établi et les données sont contradictoires.

D'une part, l'incidence du CaP est plus faible chez les hommes atteints de cirrhose

hépatique, une condition associée à des taux élevés en œstrogènes et faibles en androgènes

circulants (20). Ceci semble supporter l'idée que les œstrogènes auraient un effet protecteur

contre le CaP via l'inhibition de la croissance des cellules épithéliales prostatiques (48).

D'autre part, l'hypothèse inverse est supportée par le fait que l'obésité, un facteur de risque

de CaP, est associée à des taux sériques en testosterone abaissés et en œstradiol augmentés

(64;65). De plus, des polymorphismes du gène de l'aromatase (CYP19), qui transforme la

testosterone en œstradiol, et du gène CYP1B1, capable de produire des metabolites 4-

hydroxylés carcinogéniques des œstrogènes, ont été associés à un risque accru de CaP (26).

Ainsi, des effets directs et indirects des œstrogènes sur la prostate sont fortement plausibles,

mais les mécanismes complexes de ces interactions n'ont pas été élucidés à ce jour (66).

14

Les cellules prostatiques contiennent donc de nombreuses enzymes de biotransformation

des hormones stéroïdiennes, requises pour la production locale de metabolites actifs à partir

de précurseurs, la formation de metabolites biologiquement actifs et enfin, pour

l'inactivation de certaines formes actives. En raison de l'hormono-dépendance reconnue du

CaP, la présence de variations au niveau des gènes codant pour ces enzymes pourrait altérer

de façon significative les niveaux circulants et intracellulaires des hormones actives et ainsi

modifier subséquemment le risque de récidive du CaP suite au traitement initial, une idée

d'abord développée par Ross en 1998 (29;63). Une meilleure compréhension du point de

vue épidémiologique, biochimique et moléculaire des facteurs affectant l'exposition aux

hormones semble donc essentielle.

1.2 Les enzymes UDP-glucuronosyltransférases

La production et l'inactivation des hormones stéroïdiennes sexuelles découlent de plusieurs

étapes enzymatiques. Plusieurs cellules périphériques cibles, dont les cellules prostatiques,

possèdent toute la machinerie requise à un tel processus. Il s'agit du concept

d'intracrinologie, introduit en 1988. Les hormones formées localement exercent leur action

à l'intérieur même des cellules où elles ont été formées, sans libération significative dans le

compartiment extracellulaire et la circulation générale. Par ailleurs, ces stéroïdes actifs,

inactivés dans les mêmes cellules, diffusent facilement dans la circulation pour être ensuite

éliminés (67-69).

Chez l'humain, les enzymes impliquées dans la formation des stéroïdes sexuels à partir du

cholestérol, le précurseur commun, sont la P450scc, la 3P-HSD, la P450cl7, la 17P-HSD,

la 5a-réductase, la 3a-HSD, la P450 aromatase et la sulfatase (70). Le processus de

glucuronidation, catalysé par les UDP-glucuronosyltrasférases (UGT), est associé au

catabolisme et à l'inactivation des hormones stéroïdiennes sexuelles (71). Les UGT

contribuent ainsi, de concert avec les enzymes de la stéroïdogénèse, à la régulation de la

concentration tissulaire en hormones biologiquement actives (71; 72).

\,i-l ! - - • % -

I ~ \ l \ \ \ h *"%

I T

%HHM-HV

1.2.1 Structure des enzymes UGT

Les UGT sont des enzymes transmembranaires du reticulum endoplasmique lisse et

rugueux des cellules (71). Deux principaux domaines de leur structure primaire sont

importants pour leur activité enzymatique (71). La région amino-terminale est très variable

et responsable de la spécificité pour le substrat (71). La région carboxy-terminale, dont la

séquence consensus est conservée d'une isoenzyme à l'autre, se liera au cofacteur UDPGA

pour la réaction de glucuronidation (61).

Séquence Domaine de liaison du signal substrat

Domaine de liaison du Signal de rétention au cofacteur reticulum endoplasmique

I ' 'HjN coo

Région amino» lenuiiiale conservée

! Insertion dans le

reticulum endoplasmique

Domaine transmembranaire

Lys-Lys

CYTOPLASME ^ C O O

MEMBRANE DU RETICULUM ENDOPLASMIQUE

LUMIERE 'H ,N —

Figure 1.5 Représentation schématique de la structure primaire des UGT Tiré de Human UDP-Glucuronosyltransferases: chemical defence, jaundice

and gene therapy, Bioessays, 1993 (73).

D'abord identifiés dans les cellules hépatiques, l'expression des UGT est maintenant

reconnue dans la plupart des tissus de l'organisme (74). Il est d'intérêt pour la présente

étude de mentionner que seul l'ARN messager d,UGT2B15 et UGT2B17 a été détecté dans

la prostate (75;76). L'ARN messager à,UGT2B7, UGT1A1 et UGT2B28 est quant à lui

présent dans la glande mammaire (77-79).

17

1.2.2 Fonction biologique

Le processus métabolique qui s'applique aux hormones, aux médicaments et à de

nombreux composés endogènes et exogènes se présente en quatre phases, lesquelles ne sont

pas toujours séquentielles. La phase I, la fonctionnalisation, est principalement effectuée

par les cytochromes P450. Il s'agit essentiellement de réactions réversibles d'hydroxylation

ou de déméthylation, ce qui transforme le substrat à éliminer en une molécule intermédiaire

partiellement hydrophobe. Ces molécules deviennent alors accessibles, si elles ne l'étaient

pas déjà, aux enzymes de phase II qui poursuivent le processus par la conjugaison à un

groupement polaire. Ces conjugués plus hydrosolubles peuvent diffuser facilement hors des

cellules. Ils seront alors excrétés dans les urines ou la bile au cours de la phase III,

terminant ainsi le signal hormonal (71). La phase O, également catalysée par des

transporteurs, est responsable de l'absorption de composés ne pouvant diffuser librement à

l'intérieur de la cellule.

UGT SULT GST NAT

Liidobiotiqucs Xenobiotiques

Transporteurs ABC

Nucleophile Electrophile

Conjugues Bile Urine

Figure 1.6 Les trois phases du processus de détoxication chez l'humain Tiré de LXRa et UGT 1 A3: deux protéines essentielles à la detoxification hépatique des

acides biliaires, Verreault M., Mémoire de Maîtrise, U.Laval 2005 (80).

18

Plus spécifiquement, la réaction de glucuronidation consiste en l'ajout irréversible d'un

groupement glucuronide de l'acide UDP-glucuronique (UDPGA) à un substrat lipophile

par une UGT périphérique spécifique présente dans la cellule cible (61;71). Les dérivés

glucuronoconjugués sont généralement inactifs (81;82) en raison d'une forte polarité et

d'un encombrement stérique qui compromettent la liaison de la molécule à son récepteur

(71).

Substrats lipophiles

Cytoplasme

Médicaments Carcinogènes Polluants environnementaux Constituants alimentaires Bilirubine

Acides biliaires Stéroïdes Acides rétinoiques Acides gras

Lys-Lys COO

UGPGIcA (co-substrat)

p-D-glucuronide hydrophile

HO R (OH, -NHj, -SH, -COOH)

Excrétion (bile, urine)

Figure 1.7 Réaction de glucuronidation Adapté de Pharmacogenomics of human UDP-glucuronosyltransferase enzymes,

Pharmacogenomics J. 2003 (83).

19

La voie de glucuronidation joue donc un rôle important dans l'inactivation locale des

hormones stéroïdiennes et une diminution d'activité des enzymes UGT pourrait provoquer

une accumulation excessive du substrat susceptible d'affecter la réponse biologique finale

(61;71). Ultimement, ceci pourrait avoir des conséquences délétères sur le tissu prostatique

(61) (Figure 1.8).

Testosterone

DHT -^zl DHT AR

ADT j — * 3<x-diol

UGT

•l V V ADT-G 3a-diol-G DHT-G

-> Proliferation cellulaire

Carcinogénèse

Figure 1.8 Élimination de la DHT dans les cellules prostatiques Adapté de Deletion Polymorphism ofUGT2B17and Risk of Prostate Cancer in African

American and Caucasian Men, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006 (84).

1.2.3 Classification

Chez l'humain, il existe 22 UGT qui sont divisés en quatre grandes familles basées sur

l'homologie de séquence : UGT1, UGT2, UGT3 et UGT8 (81). La famille UGT3, formée

des gènes UGT3A1 et UGT3A2 localisés sur le chromosome 5, et la famille UGT8, qui ne

comprend qu'une seule enzyme, sont impliquées dans la biosynthèse et le métabolisme des

lipides (85).

20

Les deux principales familles, UGT1 et UGT2, sont subdivisées en trois sous-familles,

UGT1A, UGT2A et UGT2B, et sont très importantes pour la conjugaison et l'inactivation

des hormones stéroïdiennes sexuelles.

1.2.3.1 UGT1

UGT1 est localisé dans la région 2q37 (86). Neuf protéines UGT1A ont été caractérisées

jusqu'à maintenant chez l'humain : UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A5, 1A6, 1A7, 1A8, 1A9 et 1A10

(87). L'activité enzymatique des UGT1A pour les stéroïdes est principalement la

conjugaison des œstrogènes (61).

1.2.3.2 UGT2

Dix gènes de cette famille ont été caractérisés chez l'homme : UGT2A1, 2A2, 2A3, 2B4,

2B7, 2B10, 2B11, 2B15, 2B17et 2B28 (87;88). Ils sont localisés dans la région 4ql3 (88).

Quatre isoformes de la sous-famille UGT2B, soit 2B7, 2B15, 2B17 et 2B28, sont

principalement impliquées dans la glucuronidation des androgènes (61). UGT2B7 et

UGT2B28 ont également un effet sur la conjugaison des œstrogènes (61).

La spécificité stéroïdienne des cinq enzymes étudiées dans le projet de ce mémoire est

indiquée au tableau 1.3.

Tableau 1.3 Spécificité stéroïdienne des UGT étudiées UGT Principaux substrats stéroïdiens

UGT2B7 Androstane-3a, androstérone, 4-hydroxyœstrone, œstriol, aldosterone, 5a-tétrahydrocortisone, 5 P-tétrahydrocortisone

UGT2B15 DHT, testosterone, androstane-3a UGT2B17 DHT, testosterone, androstane-3a, androstérone UGT2B28 Androstane-3a, œstradiol UGT 1 Al Œstradiol, œstriol, 2-hydroxyœstrone, 2-hydroxyœstradiol, 2-hydroxyœstriol

Tiré de L'inactivation des androgènes par les UGT, Med Sci (Paris) 2003 et de Rôle des UGT dans le métabolisme des hormones stéroïdiennes, Med Sci (Paris) 2001 (61;71).

21

1.2.4 Polymorphismes génétiques étudiés

1.2.4.1 UGT2B7

Deux variantes polymorphiques ont été décrites pour le gène UGT2B7, soit UGT2B7(H268)

et UGT2B7ÇY ) (transversion de C à T) (89;90). Bien que l'expression de cette enzyme

n'ait pas été détectée dans la prostate, cette isoforme est capable de glucuronider les

œstrogènes, les 4-hydroxycatécholœstrogènes, l'androstane-3a, l'androstérone et la DHT

(79;91;92). Il a été démontré qu' UGT2B7(H268) a une capacité réduite à conjuguer les

metabolites œstrogéniques, ce qui pourrait provoquer une accumulation de substrat pouvant

être génotoxique pour un individu (61;93;94).

1.2.4.2 UGT2B15

Un polymorphisme fonctionnel d,UGT2B15 a été identifié en 1997 (75). Il s'agit de la

substitution du nucleotide guanine en position 274 vers une thymine, ce qui résulte en la

modification du codon 85 d'une aspartate (D) en une tyrosine (Y) (UGT2B15(D85Y))

(75;95). 20% de la population caucasienne est homozygote pour l'allèle UGT2B15(Y85)

(61). Ces deux variantes semblent avoir une spécificité et une affinité pour les substrats

similaires, mais diffèrent significativement dans leur capacité à conjuguer la DHT et

l'androstane-3a, UGT2B15ÇY85) étant deux fois plus efficace que 2B15(D85) (79). Il a été

postulé que cette différence dans l'activité enzymatique pourrait exposer les individus

homozygotes pour UGT2B15(D85) à des niveaux supérieurs en androgènes (83), mais des

discordances existent dans les conclusions des études épidémiologiques s'étant intéressées

à l'association entre ce SNP et le risque de CaP (30;96-100).

1.2.4.3 UGT2B17

UGT2B17 est exprimée dans les cellules basales de la prostate, contrairement à UGT2B15

qui est exprimée dans les cellules luminales (101; 102). Ces deux enzymes, homologues à

95% et adjacentes sur le bras long du chromosome 4 (61), ont des rôles complémentaires

dans le métabolisme des substrats androgéniques. Par ailleurs, une étude a révélé

qu,UGT2B17, 2B15 et 2B7 ont une efficacité de conjugaison équivalente pour

22

l'androstane-3a, mais qu,UGT2B17 possède une efficacité de glucuronidation de

l'androstérone et de la DHT supérieure (79).

Une deletion polymorphique complète de ce gène a été identifiée chez 27% de la

population caucasienne (103). Cette deletion est en fait l'une des plus fréquentes de tout le

génome humain (104). Une corrélation a été établie entre cette deletion et une diminution

de la glucuronidation des androgènes (101;105;106). De plus, tel que démontré à l'annexe

A, six études se sont intéressées à l'association entre la deletion d,UGT2B17 et le risque de

développer un CaP (84; 107-111). Seules trois de ces études ont conclu à un risque

significativement accru de CaP chez les porteurs de cette deletion (84; 108; 109).

1.2.4.4 UGT2B28

UGT2B28, l'isoforme la plus récemment caractérisée de cette famille, conjugue l'œstradiol

et l'androstane-3a, mais à une capacité moindre en comparaison à UGT2B7, 2B15 et 2B17

selon les données in vitro originales (77). Une deletion allélique de ce gène a été identifiée

chez 13,5% d'une population caucasienne (103). La fonction biologique et l'impact

clinique de ce polymorphisme demeurent à être élucidés. Il est à noter que les deletions

d,UGT2B17 et 2B28 co-existent dans le génome de 15% des Caucasiens et qu'au moins

une de ces deux deletions est retrouvée chez 57% d'entre eux (103).

1.2.4.5 UGT1A1

UGT1A1 est l'isoforme principalement responsable de la glucuronidation des œstrogènes

(88). Le promoteur du gène UGT1A1 est caractérisé par une boîte TATA de la forme

(TA)ÔTAA (UGT1A1*1) (71). La variante UGT1A1*28 est caractérisée par une répétition

supplémentaire du dinucléotide TA, soit (TA^TAA (71). Deux autres variantes moins

fréquentes, (TA)5TAA (UGT1A1*36) et (TA)8TAA (UGT1A1*37), ont également été

identifiées (112). Les variantes avec cinq ou six répétitions TA ont une activité glucuronide

plus élevée en comparaison aux variantes avec sept ou huit répétitions (88). D'ailleurs, une

méta-analyse récente a conclu à une association entre la variante UGT1A1*28 et un risque

accru de cancer du sein chez les femmes caucasiennes (113).

23

1.2.5 Rôle étiologique de la voie de glucuronidation dans le cancer de la

prostate

1.2.5.1 Études in vitro

Les cellules humaines LNCaP sont dérivées d'un ganglion métastatique d'un

adénocarcinome prostatique (114). Elles sont un excellent modèle pour l'étude in vitro du

CaP puisqu'elles sécrètent l'APS et expriment le récepteur aux androgènes de même que

plusieurs enzymes du métabolisme stéroïdien, dont UGT2B15 et UGT2B17 (115-117). De

plus, leur prolifération est hormono-sensible puisqu'elles répondent à des doses exogènes

physiologiques d'androgènes (114).

La prolifération des cellules LNCaP a été préférentiellement stimulée dans les cellules

déficientes en UGT2B15 et UGT2B17 (118). Il a été démontré qu'une baisse de l'activité de

glucuronidation favorise l'accumulation intracellulaire et dans le milieu de culture de DHT,

ce qui active le récepteur aux androgènes et la transcription de gènes androgéno-dépendants

dont l'APS (71 ;118) (Figure 1.9).

Cellules contrôles Cellules déficientes en UGT2B15ctUGT2BÎ7

/ \ Figure 1.9 Représentation schématique de l'impact d'un déficit en UGT2B15/2B17 dans les

cellules LNCaP androgéno-dépendantes Tiré de UGT2B15 and UGT2B17 Enzymes Are Major Determinants of the Androgen

Response in Prostate Cancer LNCaP Cells, J Biol Chem 2007 (118).

24

Il semble donc plausible que des polymorphismes des gènes UGT qui diminuent l'activité

de glucuronidation, puissent modifier la réponse androgénique chez l'humain (101) et par

conséquent modifier le risque qu'un CaP se développe ou progresse.

1.2.5.2 Études cliniques

Douze études épidémiologiques se sont intéressées jusqu'à maintenant à l'association entre

des polymorphismes des UGT et le risque de développer un CaP (Annexe A). Toutes ces

études sont rétrospectives et de type cas-témoins. Parmi les six études ayant examiné

UGT2B15(D85Y), quatre rapportent une association significative entre la variante glutamine

(D85), ayant une activité de glucuronidation moindre, et le risque de CaP (96;98-100). Par

contre, deux études n'ont obtenu aucune corrélation significative (30;97).

Trois études ont démontré que la deletion allélique d,UGT2B17 est significativement plus

fréquente chez les sujets avec CaP par rapport aux témoins (84;108;109), tandis que trois

autres groupes n'ont pu mettre en évidence une telle association (107;110;111). Enfin, une

seule étude très récente ayant investigué la distribution de la deletion allélique d' UGT2B28

entre les cas et les témoins n'a pu conclure à une association significative (111).

Ces observations non concluantes peuvent s'expliquer en partie par des différences

ethniques et par des facteurs biologiques, statistiques et techniques. De plus, aucune étude

ne s'est intéressée à l'effet de la co-occurrence de plusieurs de ces variations génétiques des

gènes UGT2B qui sont pourtant en relation étroite sur le chromosome 4 (29).

Bien que ces résultats semblent à prime abord contradictoires, il importe de souligner que

toutes les corrélations significatives qui ont été mises en évidence associaient l'allèle qui

conjugue le plus faiblement la DHT à un risque accru de CaP.

Pour supporter cette hypothèse et établir de façon indiscutable le rôle des polymorphismes

des UGT dans le CaP, des études supplémentaires avec de plus larges cohortes et

idéalement prospectives sont requises.

Objectifs et Hypothèse Considérant l'hétérogénéité clinique du CaP, sa dépendance hormonale et une forte

suspicion d'une contribution génétique à son étiologie, il apparaît crucial d'examiner si des

polymorphismes au niveau des gènes reliés au métabolisme des androgènes et des

œstrogènes seraient associés à une évolution clinique plus ou moins agressive du CaP. La

majorité des études portant sur ces facteurs génétiques ont tenté d'établir une association

avec le risque de développer un CaP. Il y a donc un manque d'études pour tenter

d'identifier des facteurs génétiques du métabolisme des stéroïdes sexuels associés à un

risque de progression ou de récidive du CaP. De plus, aucune étude jusqu'à maintenant ne

s'est intéressée au rôle pronostique des UGT dans le CaP.

Objectif principal : Déterminer si une association existe entre certaines variantes

génomiques des UGT et la survie sans récidive biochimique post-prostatectomie.

Objectifs secondaires : Déterminer si une association existe entre ces mêmes variantes et

l'apparition de métastases, la transition vers l'hormono-résistance, la survie globale et la

survie spécifique.

Hypothèse Des polymorphismes de gènes impliqués dans l'inactivation par

glucuronidation des hormones stéroïdiennes peuvent influencer l'évolution clinique et

modifier le risque de récidive suite au traitement initial chez des patients atteints d'un CaP

non-métastatique. Il est attendu que cette association soit en faveur des polymorphismes qui

diminuent cette inactivation, ce qui résulterait en des taux d'hormones actives supérieurs.

CHAPITRE 2 METHODOLOGIE

2.1 Aspect clinique

2.1.1 Devis de l'étude

L'étude porte sur une cohorte rétrospective de patients diagnostiqués avec un cancer de la

prostate cliniquement localisé et traités par prostatectomie radicale par deux uro-

oncologues de l'Hôtel-Dieu de Québec entre 1999 et 2002. Ce centre hospitalier est le

centre de référence tertiaire en oncologic pour l'Est du Québec et dessert une population

majoritairement caucasienne et francophone. Les patients ont été recrutés de façon

consécutive par une infirmière de recherche lors de leur visite pré-opératoire à l'unité des

soins ambulatoires ou, s'ils venaient de l'extérieur de la région de Québec, le matin avant

leur chirurgie.

Il n'y avait aucun critère d'exclusion pré-établi. Les seuls patients qui ont été exclus de

l'étude étaient ceux qui avaient refusé d'y participer ou ceux qui n'avaient pu être sollicités

en raison d'un manque d'effectif médical. Les nombres exacts pour chaque catégorie n'ont

malheureusement pas été consignés. Des 652 prostatectomies radicales effectuées du 10

février 1999 au 31 décembre 2002, 527 patients avaient fourni un consentement écrit

éclairé. Un patient a été exclu en raison d'un échantillon sanguin manquant.

Depuis 1990, une base de données est compilée au LUOE contenant des renseignements

cliniques colligés à partir des dossiers médicaux pour tous les patients ayant subi une

prostatectomie radicale à l'HDQ. Le gestionnaire de cette base de données (HH) effectue à

intervalles réguliers une validation pour s'assurer de l'exactitude et de l'intégrité des

informations qui y sont saisies. Les données médicales des 526 patients ont été révisées et

mises à jour par une infirmière de recherche et une résidente en urologie. De façon à être le

plus exhaustif et rigoureux possible, les dossiers des archives médicales de l'HDQ et de la

Clinique d'urologie Berger ont été consultés, de même que le système informatique

CristalNet du CHUQ, lequel compile tous les résultats de laboratoire incluant les APS.

28

Les visites de suivi ont été effectuées par les uro-oncologues à l'HDQ ou à la Clinique

d'urologie Berger pour la majorité des patients (n=480). Pour tous les autres patients, le

département des archives médicales de l'hôpital de la région de leur résidence principale a

été contacté de façon à connaître leur évolution clinique et leurs valeurs d'APS récentes,

ceci afin de minimiser le nombre de perdus de vue.

Le suivi post-prostatectomie habituel consiste en des visites médicales et des dosages

sériques d'APS à trois mois, six mois et un an, puis annuellement lorsque l'APS demeure

non-détectable. Selon l'évolution clinique, des visites plus rapprochées, des examens

d'imagerie ou des thérapies adjuvantes (radiothérapie, hormonothérapie) peuvent être

demandés.

La variable principale à l'étude était la survie sans récidive biochimique. Il s'agit d'une

variable substitut pour la variable qui serait cliniquement la plus pertinente, soit la survie

spécifique. Puisque le cancer de la prostate est un cancer à évolution lente, les décès

attribuables au CaP demeurent relativement peu fréquents (taux de mortalité : 23/100 000)

(1). Chez les patients atteints d'un CaP localisé, l'utilisation de l'APS comme marqueur

sérique d'une récidive biochimique est largement acceptée (119;120). En effet, six

semaines après une prostatectomie radicale, l'APS devrait être non détectable puisque sa

source de production a été enlevée. Lorsqu'il devient détectable, ceci implique la présence

de tissu prostatique résiduel et plus probablement de cellules néoplasiques résiduelles

(121). À l'heure actuelle, il n'y a pas de consensus sur la valeur d'APS à partir de laquelle

il faut considérer qu'il y a récidive du cancer (122). Un panel d'experts a récemment statué

qu'une valeur entre 0,2 et 0,4 ug/L apparaissait la plus adéquate pour définir une récidive

biochimique, laquelle se traduira ultimement par une récidive clinique post-prostatectomie

(123). Comme tout biomarqueur, si on augmente la valeur du seuil de positivité, ce

marqueur gagne en spécificité, mais perd en sensibilité. Notre groupe a donc choisi

d'établir la valeur seuil à 0.3 ug/L pour définir la récidive biochimique.

Les autres issues cliniques d'intérêt étaient l'apparition de métastases, la transition vers

l'hormono-résistance, la survie globale et la survie spécifique. Malgré le nombre de sujets

29

inclus dans l'étude et la durée du suivi effectué, ces événements sont demeurés peu

fréquents parmi notre cohorte, ce qui limitait notre puissance pour détecter une association

significative.

2.1.2 Confidentialité et considérations éthiques

Le protocole de la présente étude a été approuvé par les comités d'éthique de la recherche

clinique de l'Hôtel-Dieu de Québec (HDQ) et du Centre Hospitalier de l'Université Laval

(CHUL). Le formulaire de consentement des participants est présenté en annexe (Annexe

B). Afin de garantir le respect de la vie privée et la confidentialité des données, les sujets

ont été identifiés par un numéro identificateur unique. Le code permettant de connaître

l'identité du sujet était conservé dans un lieu séparé des lieux d'entreposage des

échantillons, de génotypage et d'analyses statistiques. Seuls deux coordonnateurs de l'étude

(HH et GN) y avaient accès. Aucune information nominale n'a été dévoilée à d'autres

parties.

2.2 Génotypage

Les détails des manipulations de laboratoire pour les analyses génotypiques sont présentés

dans l'article au chapitre suivant.

Les échantillons sanguins ont été centrifugés au moment de leur collecte de façon à

congeler séparément le plasma et le culot cellulaire. Tous ces échantillons sont demeurés

entreposés au département de biochimie médicale de l'HDQ jusqu'au moment de leur

première utilisation. Seuls les culots cellulaires ont été utilisés pour l'isolement de l'ADN

génomique.

Une fois extrait, l'ADN a été purifié, dosé, dilué à une concentration de 25 ng/uL, puis

conservé à -20°C.

30

Toutes les réactions de PCR effectuées pour la présente étude avaient déjà été mises au

point dans le Laboratoire de Pharmacogénomique du CHUL. Les séquences d'amorce

étaient ainsi déjà connues et disponibles. Les températures optimales pour la dénaturation

de l'ADN, l'hybridation et l'extension des amorces étaient établies. Quelques échantillons

ont été effectués en duplicata et des puits contenant de l'eau stérile plutôt que de l'ADN

servaient de contrôles de qualité sur chaque plaque.

À la suite d'une amplification, certains produits de PCR étaient séparés en fonction de leur

taille sur gel d'agarose, éclairés sous ultraviolets avec révélation au bromure d'éthidium, et

identifiés selon la hauteur de leur bande en comparaison avec l'échelle de marqueur de

taille moléculaire utilisée simultanément.

Les autres produits PCR étaient envoyés pour séquençage automatique par électrophorèse

capillaire. Le chromatogramme obtenu était interprété à l'aide d'un logiciel téléchargeable

permettant d'identifier spécifiquement les nucleotides de chaque séquence.

TWtr "rrar "raror T ^ T TT5^ ^ * r c r ',520i , -—reot J — i

T T G G C G T R f l T C R T G G T C f l T R G C T G T T T C C T G T G T G R R R T T G T T f l T C C 93 189 116 126 138

Figure 2.1 Exemple de fenêtre de présentation d'un chromatogramme de bonne qualité, obtenu à partir d'un séquenceur automatique Tiré de http://staden.sourceforge.net/ (124).

2.3 Analyses statistiques

Les détails des analyses statistiques sont présentés dans l'article au chapitre suivant.

31

Une analyse descriptive des caractéristiques des sujets a d'abord été effectuée. Des courbes

de survie de Kaplan-Meier et un modèle d'analyse multivariée par méthode de régression de

Cox ont été utilisés pour évaluer l'association entre chaque polymorphisme et la récidive

biochimique. Les censures ont été effectuées au moment de la récidive biochimique, du

décès ou de la dernière valeur d'APS disponible.

Diverses caractéristiques de base associées au pronostic ont été incluses dans le modèle

multivarié pour leur effet potentiellement confondant. Ces facteurs sont l'âge, le statut

tabagique, l'APS initial, le score de Gleason à la biopsie, le stade T clinique et la prise

d'une hormonothérapie néo-adjuvante. L'ethnie n'a pas été retenue comme facteur

confondant puisque notre population était très homogène à ce point de vue. Les

caractéristiques pathologiques (score de Gleason et stade T pathologiques) ont été

délibérément exclues du modèle multivarié puisque ce modèle se voulait davantage

prédictif qu'explicatif. Pour cette même raison, une analyse multivariée sans sélection (« en

bloc ») plutôt que pas à pas avec sélection (« stepwise ») a été privilégiée. De surcroît, cette

approche nous apparaissait la plus conservatrice dans un contexte d'étude exploratoire. Le

but de notre modélisation statistique n'était pas de comprendre la contribution du facteur

génétique au pronostic du CaP mais plutôt d'évaluer l'effet de la présence ou de l'absence

de ce facteur en vue ultimement d'individualiser la prise de décision sur le bénéfice d'un

traitement local définitif non exempt de risques, en l'intégrant par exemple dans un

nomogramme.

La catégorie de référence pour les polymorphismes étudiés correspondait à la variante

homozygote commune. Les gènes UGT2B17 et UGT2B28 ont été traités selon un modèle

dominant, où les variantes hétérozygote et homozygote rare ont été combinées lors de

l'analyse. Les gènes UGT2B7, UGT2B15 et UGT1A1 ont plutôt été traités selon un modèle

de codominance, où les variantes hétérozygote et homozygote rare étaient considérées

séparément. Enfin, un modèle additif a permis de vérifier s'il y avait un effet « dose-

réponse » selon le nombre de deletions alléliques pour l'un ou l'autre des gènes UGT2B17

et UGT2B28 chez un même individu.

32

Compte tenu de la proximité des gènes UGT2B17 et UGT2B28 sur le bras long du

chromosome 4, une variable supplémentaire (la co-occurrence des copies de ces deux

gènes) a été ajoutée au modèle multivarié afin de vérifier s'il y avait interaction entre ces

gènes.

Des analyses bivariées ont été effectuées pour évaluer les associations entre chaque

polymorphisme et les facteurs pronostiques confondants.

Avec 526 patients, il avait été estimé qu'un HR > 1.30 pouvait être détecté avec une

puissance statistique de 80 % malgré un déséquilibre de 80 % entre les groupes.

2.3.1 Équilibre de Hardy-Weinberg

Cette loi, mise en évidence au début du XXeme siècle, veut que, de génération en génération,

les fréquences alléliques restent constantes dans le patrimoine génétique d'une population.

Ainsi, à moins qu'elle ne subisse les effets de facteurs autres que la recombinaison

aléatoire, comme une sélection ou des mutations, la composition génétique globale d'une

population demeurera stable et en équilibre (125).

Il s'agit d'un modèle théorique central à la génétique des populations. Cette loi peut

s'exprimer de la façon suivante : p2 + q2 + 2 pq = 1, où p et q représentent les fréquences

alléliques (126). La méthode la plus simple pour vérifier si l'équilibre est respecté est de

calculer une statistique du khi-carré.

La proximité entre deux alleles étant une cause de déséquilibre de liaison, un déséquilibre

peut donc survenir s'il y a eu sélection avantagée au profit d'haplotypes spécifiques (cf.

section suivante). Également, une mutation allélique peut être associée à un risque accru de

développer une maladie particulière. En choisissant d'étudier un sous-groupe de la

population générale atteint de cette pathologie, ceci peut avoir comme conséquence

d'observer un déséquilibre pour l'allèle en question au sein de ce sous-groupe.

33

2.3.2 SNP, haplotypes et CNV

Les polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs) constituent la plus importante source

de variation génétique dans le génome humain. Ils correspondent à des séquences d'ADN

ne différant que par une seule paire de bases (127). On estime qu'il en existe environ 10

millions, affectant 0.1% de tout le génome humain (128).

L'association de SNPs dans une région du génome située sur un même chromosome

s'appelle un haplotype. Certains SNPs proches physiquement sur le génome ont tendance à

être transmis en bloc (ensemble) (127). Il importe donc d'en tenir compte lors d'études

d'associations puisque cette diversité haplotypique peut être beaucoup plus informative et

surtout représentative de la réalité que si chaque SNP n'est considéré qu'individuellement

(129).

SNP SNP SNP

a u a Personne 1 A A C A C G C C A....T T C G G G G T C....A G T C G A C C G.... Personne 2 A A C A C G C C A....T T C G A G G T C....A G T C A A C C G.... Personne 3 A A C A T G C C A....T T C G G G G T C....A G T C A A C C G.... Personne 4 A A C A C G C C A....T T C G G G G T C....A G T C G A C C G....

Haplotype 1

Haplotype 2

Haplotype 3

Haplotype 4

CTCAAAGTACGG TTGATTGCGCAA CCCGATCTG TCGATTCCG

TTCAGGCA CAGTAATA

\TACTGGTG TTCAGACA

Figure 2.2 Représentation schématique du concept des polymorphismes et des haplotypes Tiré de The International HapMap Project, Nature 2003 (128).

Ce concept d'analyse par haplotypes est particulièrement pertinent en ce qui concerne les

UGT2B. En effet, Ménard et al. (2009) ont étudié la fréquence de co-occurrence de trois

34

gènes impliqués dans la glucuronidation des androgènes dans une population caucasienne.

Ils ont ainsi pu identifier sept haplotypes différents. Les haplotypes avec coexistences des

deletions d,UGT2B17 et d'UGT2B28 pourraient ainsi avoir un impact sur le métabolisme

hormonal supérieur à l'impact que chaque polymorphisme aurait individuellement

(74; 103).

UGT2B17

I l I ■

I l I ■

■ ■ I ■

f

UGT2B15

!■■■'■■

puni

puni pllllw

I l I IE3-

UGT2B28

■ ■ I ■

■ I I ■

^ f + + +

I l I ■

4

Allelic Frequency

0.345

0.295

0.155

0 085

0.070

0.030

0.020

Figure 2.3 Haplotypes des polymorphismes d,UGT2B17, 2B15 et 2B28 sur le chromosome 4 et leur fréquence allélique

Tiré de UGT genomic diversiy : beyond gene duplication, Drug Metab Rev 2009 (74).

Les variations dans le nombre de copies de gènes (CNV) représentent une nouvelle

dimension de la variabilité génétique interindividuelle qui suscite à l'heure actuelle

énormément d'intérêt. Les CNV sont des gains ou des pertes d'ADN génomique de plus de

mille paires de bases (1 kb). Elles sont microscopiques ou submicroscopiques et ne sont pas

identifiables par les méthodes de caryotype standards. Depuis l'identification des premières

CNV en 2004 par microarray (130), plus de 21 000 CNV ont été reconnues (131) affectant

35

de 5 à 10% de tout le génome humain (132; 133). Les mécanismes à l'origine de ces

changements structuraux sont assez complexes. Ils impliquent une instabilité du génome en

raison de séquences d'ADN homologues à des positions génomiques différentes qui se

recombineront pour donner lieu à des deletions ou des duplications principalement (134).

D'autres mécanismes ont été proposés, notamment la recombinaison non-homologue, la

rétrotransposition et la «fork stalling and template switching» (132). Conséquemment,

ceci peut influencer la quantité d'ARN messager produite et donc le niveau d'expression

final de la protéine dans les cellules cibles (135).

2 copies 1 copie 0 copie

ft

f A ­ ­ C A ­

G ­

A ­

A ­

c ­

­ ­ C A—I ­ C

£

A T A ­

A G A ­

A C

■C ■c ■c ■T •c ■c A C

T A

A C

El 1

­ C ­ C ­ T — C

C ^ A ­ C W<

Figure 2.4 Représentation schématique du concept des variations dans le nombre de copies des gènes

Adapté de Common deletion polymorphisms in the human genome, Nat Genet 2006 (104).

L'étude de la signification clinique des CNV comme facteurs de risque ou pronostiques

dans le cancer n'en est qu'à ses débuts (131). Jusqu'à maintenant, 49 CNV communes et 28

CNV rares (Annexe C) ont été associées à divers cancers (133). Dans le cas du cancer de la

prostate, une seule CNV y a été associée de façon significative. Il s'agit de la deletion de

2p24.3, dont l'effet biologique demeure inconnu puisqu'aucun gène n'est compris dans la

séquence délétée (136).

CHAPITRE 3 RESULTATS

Copy Number Variation of Sex-Steroid Metabolizing Genes as Biomarkers of Prostate Cancer Recurrence after Prostatectomy: Looking at the End of the Androgenic Signal

Geneviève Nadeau,*1,2 Judith Bellemare,*2 Pierre Douville,1 François Meyer,1 Yves

Fradet,1 Chantai Guillemette,2 Louis Lacombe,1 and Eric Levesque1,2

These authors contributed equally.

1L'Hôtel-Dieu de Québec, Centre Hospitalier de l'Université Laval (CHUQ)

Research Center, Laval University, Quebec, Canada. 2Pharmacogenomics

Laboratory, Centre Hospitalier de l'Université Laval (CHUQ) Research Center, and

Faculty of Pharmacy, Laval University, Quebec, Canada.

Correspondence: Éric Lévesque, MD, PhD, FRCPC; Hematologist-Oncologist at

CHUQ Research Center, T3-48, 2705 Boul. Laurier, Québec, Canada, G1V 4G2.

Tel. (418) 654-2296 Fax. (418) 654-2761 E-mail: eric.levesque.1@ulaval.ca.

This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)

(C.G. and E.L.), Canadian Urological Association-Canadian Uro-Oncology Group-

Abbott Oncology research grant (L.L.) and the Canada Research Chair Program

(C.G.). J.B. is recipient of a Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate

Scholarship award from CIHR. E.L is recipient of a clinician-scientist award from

CIHR.

Running head: CNV of UGT2B17 and UGT2B28 and Prostate Cancer

Recurrence.

Authors' disclosures of potential conflicts of interest: The author(s) declare no

potential conflict of interest.

38

RÉSUMÉ

Introduction: La présence de polymorphismes génétiques des voies du

métabolisme des androgènes et œstrogènes a été associée à un risque accru de

développer un cancer de la prostate. Par contre, la valeur pronostique de ces

polymorphismes (SNPs) a très peu été étudiée chez les patients atteints d'un

cancer de la prostate. La glucuronidation, catalysée par les enzymes UDP-

glucurosyltransférases (UGT), constitue une étape clé dans l'inactivation des

hormones stéroïdiennes, contrôlant ainsi leurs concentrations intracellulaires.

L'objectif était d'établir le lien entre la présence de variations génétiques (SNPs ou

deletions/insertions) de cinq gènes appartenant à la famille des UGT et la récidive

biochimique après une prostatectomie radicale chez les patients atteints d'un

cancer cliniquement localisé. Méthodes: Nous avons effectué une étude

rétrospective incluant 526 hommes d'origine canadienne française. À partir de

prélèvement sanguins pré-opératoires, cinq isoformes UGT ont été génotypées

chez ces patients: UGT2B7, 2B15, 2B17, 2B28 et 1A1. Des courbes de Kaplan-

Meier et un modèle de régression multivariée ont servi à évaluer l'association avec

la survie sans récidive biochimique. Résultats: L'âge moyen à la chirurgie est de

63,3 ans, l'APS initial moyen de 12,21 ± 2,75 ug/L et la durée de suivi médiane de

7,37 ans. Des 526 patients étudiés, 130 (24,7%) ont eu un échec de l'APS. Deux

gènes impliqués dans l'inactivation des androgènes ont démontré une association

significative en analyse multivariée avec la survie sans récidive biochimique. Une

deletion allélique 6'UGT2B17 et UGT2B28 sont toutes deux associées à un risque

accru d'échec de l'APS (HR 1,43; IC95 [1,01-2,01] et HR 1,57; IC95 [1,10-2,25],

39

respectivement). La deletion de deux copies ou plus de ces gènes générait un HR

de 2,12 (IC95 [1,34-3,37]) pour la récidive biochimique. Aucune association

significative n'a été observée pour les autres variantes des UGT étudiées.

Conclusion: La présence d'une deletion allélique des gènes UGT2B17 et

UGT2B28 est associée à la récidive biochimique précoce après une

prostatectomie radicale dans le cancer de la prostate cliniquement localisé.

40

Abstract

Purpose: Inherited variations in hormone-related genes have been investigated for

a possible association with prostate cancer risk, but their prognostic value has not

been well studied. The glucuronidation pathway catalyzed by UDP-

glucuronosyltransferases (UGT) leads to inactivation of sex-steroids, thus

influencing the intracellular levels of these hormones in target cells. Our aim was to

determine if genomic variations in five candidate UGT genes are associated with

an elevated risk of biochemical recurrence of prostate cancer after prostatectomy.

Methods: The study included 526 French-Canadian men who underwent radical

prostatectomy for clinically localized (cT2/T3) prostate cancer between 1999 and

2002. The genotypes for common variations in UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17,

UGT2B28, and UGT1A1 and their relationship with biochemical recurrence-free

survival (bRFS) were assessed using Cox proportional hazard models. Results: At

a median follow-up of 7.4 years, 130 patients (24.7%) experienced prostate-

specific antigen (PSA) failure. Polymorphic deletions of UGT2B17 and UGT2B28

were both associated with an increased likelihood of PSA failure (hazard ratio (HR)

1.43, 95% CI [1.01; 2.01] and HR 1.57, 95% CI [1.10; 2.25], respectively). The

deletion of two or more copies of these genes resulted in an HR of 2.12 (95% CI

[1.34; 3.37]) for biochemical recurrence. No significant association was observed

for other UGT variants. Conclusion: Copy number variations of UGT2B17 and

UGT2B28 are prognostic molecular biomarkers of early biochemical recurrence

after prostatectomy. This study is the first to recognize copy number variation in

41

genes at the end of the androgenic signal as independent predictors of prostate

cancer recurrence.

42

INTRODUCTION

Prostate cancer (PCa), an androgen- and estrogen-related cancer, is the sixth

most common cancer in the world and the second leading cause of cancer death in

North American men.1 The specific mortality of PCa is directly related to both the

stage at time of diagnosis and age at onset.2 Of the several known risk factors, the

most significant are age, ethnicity, genetic, genomic, and dietary factors.3,4 In the

early stages of carcinogenesis, androgens are centrally implicated in the

development and progression of this hormone-dependent cancer.5,6 However, an

association between plasma androgen levels and PCa susceptibility has not been

consistently observed across studies.7,8

Currently, prostate cancer recurrence risk is assessed based on clinical stage,

biochemical prostate-specific antigen (PSA) level, and Gleason scores. However,

in two recently published large-scale population trials, PSA screening was shown

to have little impact on decreasing cancer-related mortality, and was accompanied

by a risk of overdiagnosis, overtreatment, and increased complications.9,10 Hence,

the heterogeneity observed in clinical behavior emphasizes the need to identify

additional tools suitable for use in clinical practice, such as molecular biomarkers.

Over the last several decades, a number of studies have addressed the role of

inherited variations in hormone-related genes and the associated risk of developing

prostate cancer.11"14 However, to our knowledge, only two studies have looked at

the prognostic value of hormone-related gene polymorphisms in PCa progression

43

and mortality.15,16 In the first study, Lindstrom and colleagues studied the role of

germline variations in androgen receptor (AR) genes and the biosynthetic genes

CYP17 and SRD5A2, and suggested that polymorphisms in the AR genes affect

hormonal treatment and ultimately PCa death.15 More recently, overexpression of

the androgen/estrogen inactivating enzyme HSD17B4 was associated with a poor

clinical outcome.16 Despite the fundamental role of androgens in prostate cancer

development, very scarce data are available regarding the consequence of

genomic variations in the steroidogenic pathway and the associated risk of prostate

cancer progression following treatment, particularly for early stage disease.

UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are metabolizing enzymes that, in concert

with other steroidogenesis enzymes, contribute to the maintenance of intracellular

levels of sex-steroid hormones in target cells.17 This enzymatic process generates

glucuronide derivatives that are biologically inactive androgens and estrogens and

are subsequently excreted in bile or urine.18 UGTs are expressed in almost all

tissues, including hormone target organs such as the prostate.18,19 Five UGT

isoforms are mainly responsible for inactivating androgens and estrogens. The

UGT1A1 isoform is primarily responsible for glucuronidation of estradiol,20,21

whereas the UGT2B class of enzymes (namely UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17,

and UGT2B28) is mainly involved in androgen catabolism in hormone-dependent

cells.18 Common polymorphisms in two of these genes (UGT2B15 and UGT2B17)

have been associated with prostate cancer risk in some but not all studies.22"30

Interestingly, copy number variations (CNV) of the major UGT2B17 and UGT2B28

androgen metabolizing genes have been reported, and more than 50% of

44

Caucasians have a reduced copy number in at least one of these genes.31

However, the impact of common germline polymorphic variations or deletions in

UGTs has not yet been addressed in PCa progression and mortality.

In this study, we assessed whether genomic variations in the sex-steroid

metabolizing genes UGT1A1, UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17, and UGT2B28 are

potential molecular biomarkers that are associated with an increased risk of

biochemical PSA recurrence after prostatectomy. A population of 526 Caucasian

patients with clinically localized prostate cancer and a median follow-up of more

than 7.4 years was studied. The rationale for selecting these UGT genes was

based on the following concepts: (1) the early phase of prostate carcinogenesis is

hormone-dependent, and any genes modifying the level of active molecules

available for hormone receptor binding can have an impact on cancer recurrence

and progression; (2) UGT genes are expressed in target cells where hormone

action occurs; (3) UGT genes are known genomic factors associated with prostate

cancer risk; and (4) UGT genes are hormone-regulated genes that are differentially

expressed in cancers.

We found two common germline polymorphic CNV events in UGT2B17 and

UGT2B28 that were significantly associated with biochemical recurrence in

clinically localized prostate cancer. In our cohort, CNV of UGT2B17 and UGT2B28

was the third most important predictor for PSA recurrence after the well-

established Gleason score and PSA values at the time of diagnosis.

45

PATIENTS AND METHODS

Study Cohort. This study included 526 unrelated French-Canadian men who

underwent open radical prostatectomy for clinically localized adenocarcinoma of

the prostate at L'Hôtel-Dieu de Québec hospital, Québec, Canada between

February 1999 and December 2002. Each participant gave written informed

consent before surgery for subsequent genomic and genetic analyses. The

research ethical committee at the Centre Hospitalier Universitaire de Québec

approved the research protocol. Detailed clinical information was obtained

retrospectively from medical records. All patients were followed postoperatively

with serial PSA measurements.

Definitions. The primary outcome variable was biochemical recurrence-free

survival (bRFS) and was defined as (1 ) two consecutive PSA values > 0.3 ug/L, (2)

one PSA value > 0.3 ug/L followed by hormonotherapy (androgen deprivation

therapy or ADT) or radiation therapy, (3) a single last-recorded PSA value £ 0.3

ug/L, or (4) the initiation of ADT or radiation therapy by the patient's treating

physician. bRFS was defined as the period of time elapsed between the surgical

procedure and either the date of PSA failure or the date of the last recorded PSA

measurement.

Genotyping. Peripheral blood was collected on the morning of a preoperative

ambulatory clinic visit. All samples were kept frozen at -80°C until the time of

study. Genomic DNA was extracted using a QIAamp DNA Blood mini kit (Qiagen

46

Inc, Mississauga, Ontario, Canada) and stored at -80°C. PCR amplifications were

carried out in a total volume of 50 uL with 25 ng of DNA. Negative and internal

controls were run on every PCR plate. A genotyping quality control (random

replicates and controls of known genotypes) was successfully performed in 5% of

the cohort.

For UGT2B17 and UGT2B28 CNV determination, genotyping was performed using

two consecutive amplifications, one for exon 1 (absence/presence of the gene) and

one for the deletion breakpoint (absence/presence of the deleted allele).31 To

confirm the absence of both genes (del/del genotype), amplification of exon 6 was

systematically performed. PCR products were analyzed using agarose gel

electrophoresis. For UGT2B28, amplification and sequencing of a known tagged

SNP (rs11249532) was done with 16% randomly chosen samples to further

confirm genotypes.31 For UGT1A1 (rs34815109), UGT2B15 (rs1902023), and

UGT2B7 (rs7439366), after PCR amplification (for primers and amplification

strategies, see 31,32), products were purified and sequenced with an ABI 3730x1

genetic analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The sequences were

analyzed using Staden preGap and Gap4 programs (Open Source Technology

Group, http://staden.sourceforge.net/) to identify the variant sequence. PCR

amplicons were sequenced, and amplicons resulting in ambiguous sequencing

chromatograms were systematically re-amplified and re-sequenced.

47

Statistical Analysis

All genes were tested for consistency with Hardy-Weinberg equilibrium using chi-

square analysis. Each gene was treated as a categorical variable, with a common

(reference) homozygote, a hétérozygote, and a rare homozygote. A rare

homozygote was combined with a hétérozygote if the frequency of the rare

homozygote was below 0.10. For UGT2B17, it was previously established that

deletion of one allele is associated with significantly lower intraprostatic mRNA

levels compared to individuals homozygous for the insertion allele (ins/ins).25

Therefore, individuals with one or two deletion alleles for UGT2B17 were

combined. Initial PSA level, Gleason score at biopsy, and tumor clinical stage were

treated as categorical variables using the well-recognized D'Amico risk

classification.33,34

Kaplan-Meier bRFS analysis was performed to compare genotypes using the log-

rank test followed by a pairwise multiple comparison using the Sidâk multiple-

comparison method. Results that were significantly associated with bRFS in

univariate analysis were then evaluated in a multivariate Cox regression analysis.

We included the following covariates in the models: age, smoking, preoperative

PSA, Gleason score, clinical stage, neoadjuvant androgen deprivation therapy,

UGT2B17 and UGT2B28 genetic status. The proportional hazard assumption of

Cox models was verified graphically by log-minus-log vs. log (time) plots for each

variable. Kaplan-Meier curves and univariate analysis for bRFS were also

performed for CNVs of UGT2B17 and UGT2B28 as well as haplotypes. Clinical

variables were compared across genotypes using the chi-square test, Fisher's

48

exact test evaluated exactly, or the Monte Cario approximation, as appropriate. A p

value of less than 0.05 was considered statistically significant, and all tests were

two-sided. All statistical analyses were performed using SAS® Statistical Software

version 9.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

49

RESULTS

The median age at diagnosis was 63.3 years, and the median follow-up time was

7.37 years (range, 0.5 to 10.15 years). Table 1 shows the clinical and disease

characteristics of the patients in our study population as well as clinical tumor

stages, PSA levels at time of diagnosis, and Gleason scores. Overall, 130 patients

(24.7%) experienced PSA failure. The median time to biochemical recurrence was

2.1 years. The distributions of genotype frequencies are shown in Table 2, and are

consistent with previous reports.25,31,35,36

Figure 1 displays the Kaplan-Meier curves of bRFS for each UGT gene and its

associated genotypes. Univariate and multivariate Cox proportional hazards

models for bRFS are presented in Table 3. Preoperative PSA values and

pathological biopsy Gleason scores were both associated with bRFS. Indeed, PSA

values >20 impart an HR of 2.46 (95% CI [1.54; 3.93], p = 0.0002) in multivariate

analysis, whereas a Gleason score >8 is associated with an HR of 3.49 (95% CI

[2.19; 5.54], p < 0.0001), which is similar to previous reports.37,38 CNVs of

UGT2B17 and UGT2B28 were significantly associated with bRFS. Individuals with

one or two deleted alleles (genotypes ins/del or del/del) of UGT2B17 and

UGT2B28 had an increased likelihood of PSA failure with HR values of 1.43 (95%

CI [1.01; 2.01], p = 0.044) and 1.57 (95% CI [1.10; 2.25], p = 0.014), respectively.

A multivariate Cox proportional hazards model, adjusting for potential confounders,

confirmed that UGT2B17 and UGT2B28 were independent predictors of bRFS

(Table 3). Stepwise analysis also showed that the most important predictors of

50

bRFS were biopsy Gleason score followed by preoperative PSA and then UGT

genotype for both genes. When combined in the same Cox model, both genes

remained significant predictors of bRFS, and no significant interaction was noted

between gene markers (p = 0.2003, data not shown). When the association of

each UGT genotype was evaluated with the known clinical and pathological risk

factors, no noteworthy association was observed (data not shown).

Using univariate analysis, the risk of recurrence was also associated with the

number of deletions of either gene. In fact, the presence of one deletion was

associated with an HR of 1.35 (95% CI, [0.90; 2.01], p = 0.147) for bRFS, and two

or more deletions was associated with an HR of 2.12; (95% CI [1.34; 3.37], p =

0.001). A Kaplan-Meier curve for CNV of UGT2B17 and UGT2B28 versus bRFS is

shown in Figure 2. Interestingly, only the polymorphism in exon 1 of UGT2B7 was

associated with metastatic potential using the chi-square and Fisher's exact tests

(p = 0.018, data not shown). Further haplotype analyses of the UGT2B locus

revealed that haplotypes 3 and 5 were associated with bRFS using univariate

analysis. Indeed, haplotype 3 (polymorphic deletions of UGT2B17) had an HR of

1.79 (95% CI [1.21; 2.67], p = 0.004), and haplotype 5 (polymorphic deletions of

UGT2B28) had an HR of 1.78 (95% CI [1.15; 2.76], p = 0.010) for bRFS (Table 4).

51

DISCUSSION

The objective of this study was to assess the prognostic value of common genetic

variants of five major sex-steroid metabolizing UGT isoforms in clinically localized

prostate cancer patients following prostatectomy. This study was conducted with a

large and ethnically and geographically homogeneous population. To our

knowledge, there are no previous reports studying this association. We observed a

positive correlation between individuals with one or two deletion alleles for

UGT2B17 and UGT2B28 and bRFS. Our results show that the most important

predictors of bRFS in localized prostate cancer patients were (in order of

importance) biopsy Gleason score, preoperative PSA, and common polymorphic

deletions of these two sex-steroid metabolizing genes. Studying genes involved in

the end of the androgenic signal is highly relevant in the initial phase of disease

development because prostate cancer cells are hormone responsive at this stage,

and hormonal manipulation is a cornerstone of disease management.

Over the last several decades, a number of studies have addressed the

association between inherited variations in hormone-related genes and the risk of

developing prostate cancer.11"13 However, to our knowledge, only two studies have

looked at the prognostic value of hormone-related gene polymorphisms in PCa

progression and mortality,15,16 and none with inactivating UGTs. No other predictive

or prognostic markers have been identified in the steroidogenic pathway, although

several prognostic biomarkers have been identified in other cellular pathways,

52

including cell cycle genes,39 tumor suppressor genes,40 cytokines,41 and

transcription factors40

Recently, a CNV in UGT2B17, one of the best characterized and most frequent

CNVs in humans,31,36 was shown to be associated with osteoporosis in Asians,42

linking CNV for the first time with a complex metabolic disease. Indeed, this

genomic rearrangement event is associated with a complete deletion of a sex-

steroid metabolizing gene, which is a more striking change than a modulating SNP

or an epigenetic mechanism. Of all genetic and genomic processes involved in

prostate cancer progression, CNV is one of the most drastic molecular events.

However, to date, very limited data are available concerning CNV and cancer risk,

and no data are available regarding progression. Recently, CNV in UGT2B17 was

shown to be associated with prostate cancer risk in some studies but not in

others.25,26'28,30 However, none of these studies looked simultaneously at the

chromosomal neighbors UGT2B15 and/or UGT2B28, which may contribute to the

discrepancies observed. Indeed, these genes are expressed in the human prostate

and encode proteins that convert steroids into inactive glucuronide derivatives in

prostate cells.19 Because the products of these genes function at the end of the

androgen and estrogen signaling pathways in target cells, it seems reasonable that

a reduced copy number of these metabolizing genes might significantly affect the

inactivation of sex-steroids in residual prostate cancer cells following the surgical

procedure. The level of active hormone is expected to be elevated in these UGT-

deficient cells, potentially driving more hormone-dependent cells into cell

replication and leading to a higher risk of prostate cancer recurrence in these

53

individuals. Because PSA is a well-established androgen-responsive gene,43 losing

an allele of a sex-steroid metabolizing gene that affect the intracellular levels of

active hormones may lead to PSA secretion and disease recurrence. At the time of

biochemical relapse, the disease is particularly androgen-dependent for growth

and progression, and UGT haploinsufficiency may lead to higher levels of

intracellular androgen available for AR activation.

UGT2B15 is also expressed in the prostate;35 however, no significant association

with bRFS was observed in our study. It has been reported that there is a

significant age-independent correlation between the number of copies of the G

allele of UGT2B15 and a Gleason score of 7 or more.24 Because 40% of our cohort

was in this subgroup, this correlation might explain the unbalanced genotypic

combinations observed for UGT2B15. Although not studied as extensively, the

same hypothesis could apply to UGT2B28. Studies looking at the association

between the UGT2B15Asp85Tyr polymorphism and PCa risk reported conflicting

results.24,27,29 Therefore, the UGT2B15Asp85Tyr polymorphism, which alters protein

catalytic activity,35 is potentially associated with prostate cancer risk, but no link

was established with recurrence or progression. However, compared to a deletion

of UGT2B17, this variation has a much more modest functional impact on

androgen glucuronidation, affecting enzyme activity by a factor of two.

Furthermore, differences in the cellular prostatic compartmentalization of the

UGT2B15 and UGT2B17 proteins may underlie the variable influence of changes

in these two pathways in relation to disease risk and progression.44

54

Although there is accumulating evidence suggesting that estrogens are prostate

carcinogenesis factors,14 UGT2B7 and UGT1A1 do not seem to affect prostate

cancer recurrence in our cohort. The lack of association observed for UGT2B7 and

UGT1A1 with prostate cancer recurrence could be explained for instance by the

tissue distribution of these enzymes (absent or low abundance in the prostate), or

the modest functional impact on estrogens metabolism of the genetic variations

studied.19,45,46

Prostate cancer is well-known for its latency, and the median length of follow-up in

this study allowed us to observe a substantial number of PSA failure events (24.7%

of the cohort). However, the number of clinically relevant events in our cohort that

were related to the localized features of the tumors prevented us from looking at

the association between the molecular signature and the risk of metastasis,

hormonoresistance, or death. Because PCa risk has been associated with other

polymorphisms in gene products involved in androgen and estrogen metabolism

and action, a global picture of hormone-related genetic variations could help

elucidate how alterations in intracellular active hormone levels impact cancer

progression. Although these findings require validation in other cohorts, these data

help refine our understanding of the molecular basis of prostate cancer recurrence

and progression. Incorporation of CNV in UGT genes and other relevant genetic

variants in a nomogram 33,34 will ultimately provide a relevant clinical translation

that could help guide treatment decisions.

55

In conclusion, our findings suggest that the presence of at least one deletion allele

for UGT2B17 and UGT2B28 may be predictive of early PSA failure after

prostatectomy. This study provides the first evidence implicating CNV in sex-

steroid metabolizing genes as a possible biomarker for prostate cancer recurrence,

and highlights the importance of sex-steroids in the pathogenesis and recurrence

of this prevalent cancer. Further studies are needed to validate our findings and to

better understand the mechanisms involved in this effect on PCa disease

progression.

56

Acknowledgements

The authors wish to thank Celine Veilleux and Helene Hovington for their help with

data collection, Mario Harvey for helpful discussion and the Biostatistics Services

of the CHUQ research center.

Author Contributions

Conception and Design: Chantai Guillemette and Eric Lévesque

Financial Support: Chantai Guillemette, Eric Lévesque, and Louis Lacombe

Provision of study patients: Louis Lacombe, Pierre Douville, and Yves Fradet

Collection and assembly of data: Genevieve Nadeau and Judith Bellemare

Data analysis and interpretation: Genevieve Nadeau, Judith Bellemare, Eric

Lévesque, Chantai Guillemette, Louis Lacombe, and François Meyer

Manuscript writing: Genevieve Nadeau, Eric Lévesque, and Chantai Guillemette

Final approval of manuscript: Genevieve Nadeau, Judith Bellemare, Eric

Lévesque, Chantai Guillemette, Louis Lacombe, Yves Fradet, Pierre Douville, and

François Meyer

57

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Metab 89:5222-32., 2004

63

Tables

Table 1. Clinical and Pathological Characteristics of Study Population

Characteristic Number % Age at diagnosis, years (n = 526) Mean 63.3 SD 6.8 Range 43.5- 30.7 Smoking status (n = 523) No 438 84 Yes 85 16 PSA at diagnosis (ug/L) (n = 521 ) <10 362 69 > 10-20 103 20 >20 56 11 Biopsy Gleason score (n = 525) 2-6 318 61 7 140 27 8-10 67 13 Clinical T stage at diagnosis (n = 521 ) <T2a 391 75 T2b 101 19 >T2c 29 6 Neoadjuvant hormonotherapy (n = 526) No 495 94 Yes 31 6

PSA: prostate-specific antigen; T: tumor.

64

Table 2. Genotype Frequencies and their Association with Biochemical

Recurrence-free Survival

Gene Variation Genotype Overall N (%)

PSA failure N (%)

Log-rank test (P)

UGT2B7 P.H268Y rs7439366

O T

CC CT TT

116(22) 275 (52) 135(26)

24(21) 72 (26) 34 (25)

0.5370

UGT2B15 p.D85Y rs1902023

G>T

GG TG TT

128 (24) 327 (62) 71 (14)

29 (23) 79 (24) 22(31)

0.3881

UGT2B17 (ins/ins) (ins/del)/(del/del)*

279 (53) 247 (47)

60 (22) 70 (28)

0.0433

UGT2B28 (ins/ins) (ins/del)/(del/del)*

390 (74) 136(26)

84 (22) 46 (34)

0.0131

UGT1A1 rs34815109 c-54 -53insTA

5, 6, 7 or 8

6/6§

6/7 7/7

244 (46) 221 (42)

61 (12)

59 (24) 56 (25) 15(25)

0.8862

Trequencies for L/G72B77(del/del) and L/GT2B28(del/del) are n = 30 (5.7%) and n = 1 (0.2%), respectively. §-53insTA = 5/6 (n = 2) were combined with 6/6.

Hardy-Weinberg equilibrium was not maintained for UGT2B15 and UGT2B28.

PSA: prostate-specific antigen; ins=insertion; del=deletion.

Table 3. Univariate and Multivariate Cox Proportional Hazards Models for

Biochemical Recurrence-free Survival*

65

Univariate Multivariate HR 95% CI P HR 95% CI P

Age <65 S 65

1.000 0.951 [0.672; 1.345] 0.7746 0.809 [0.566; 1.158] 0.2474

Smoking No Yes

1.000 1.125 [0.711; 1.781] 0.6151 1.177 [0.732; 1.894] 0.5010

Preoperative PSA

<10 > 10-20

>20

1.000 1.769 3.406

[1.164; 2.688] [2.196; 5.283]

0.0075 <0.0001

1.504 2.462

[0.972; 2.327] [1.543;3.929]

0.0671 0.0002

Biopsy Gleason

<6 7

8-10

1.000 1.896 3.803

[1.266; 2.839] [2.470; 5.855]

0.0019 <0.0001

1.605 3.488

[1.056; 2.441] [2.194; 5.544]

0.0269 <0.0001

Clinical stage T

<T2a T2b

>T2c

1.000 1.843 2.148

[1.245; 2.728] [1.144; 4.031]

0.0022 0.0173

1.527 1.366

[1.013; 2.303] [0.705; 2.646]

0.0434 0.3552

Neoadjuvant ADT

No Yes

1.0 1.549 [0.835; 2.874] 0.1650 0.947 [0.485; 1.847] 0.8726

UGT2B17 (ins/ins) (ins/del)/(del/del)

1.0 1.425 [1.009; 2.011] 0.0444 1.588 [1.109; 2.273] 0.0115

UGT2B28 (ins/ins) (ins/del)/(del/del)

1.000 1.571 [1.097; 2.251] 0.0138 1.441 [0.990; 2.096] 0.0562

*ADT: androgen deprivation therapy; 95% CI: 95% confidence interval; Hazard Ratio: HR; PSA: prostate-specific antigen.

Table 4. Univariate Cox Proportional Hazards Model for Biochemical

Recurrence-free Survival: Haplotype Analyses.

66

Haplotype UGT genes Frequency (%)

Univariate HR

95% CI P

2B7 2B15 2B17 2B28

Ht 1 T G Ins Ins 24.1 1.0 Ht 2 C T Ins Ins 19.6 0.970 [0.641; 1.468] 0.8869 Ht 3 T G Del Ins 13.7 1.798 [1.209;2.673] 0.0037 Ht 4 T T Ins Ins 10.8 1.397 [0.894; 2.183] 0.1424 Ht 5 C T Ins Del 9.1 1.783 [1.151;2.764] 0.0096 Ht 6 C G Ins Ins 7.5 1.189 [0.695; 2.035] 0.5284 Ht 7 C G Del Ins 7.4 0.875 [0.484; 1.580] 0.6570 *Haplotypes (Ht) with a frequency of less than 5% were excluded from the analysis.

95% CI: 95% confidence interval; HR: Hazard Ratio.

Figures

Figure 1. Kaplan-Meier Biochemical Recurrence-Free Survival Analysis for

UGT genes. BCR: Biochemical recurrence.

67

A) UGT2B7 B) UGT2B15

CC 118 97 CT 275 232 TT 135 106

Time (months)

23 39

08

■S oe

a. o m

Time (months)

^ * * ^ T 7 ^ * * ^ T 7 ^ * * ^ T 7 L ­ ­ ­

^ * * ^ T 7

CC — C T ­ ­TT­ •• p­0.3881

126 107 92 78 18 0 327 270 238 190 51 0

71 60 45 34 10 0

C) UGT2B17 D) UGT2B28

5 06-

o

ins/del ins/ins —

♦ del/del ­ • p=0 0433

0 25 50 75

Time (months) 100 125

•is/del ms/ael • del/del

279 24

238 199

208 167 167 135

44 0 35 0

OS­

S' £ 06-

a. o

ins/ins ­ins/del + del/del ­

ins/del 390 0 ins/del + del/del 136

325 112

50 75 Time (months)

278 97

226 76

p=0.0131

54 25

E) UGT1A1

0 25 50 75 100 125

Time (months)

M 244 205 177 •46 42 0 6.7 221 178 154 •22 25 0 7.7 61 54 44 34 12 0

Figure 2. Kaplan-Meier Biochemical Recurrence-Free Survival Analysis for

Copy-number variations of UGT2B17 and UGT2B28.

BCR: Biochemical recurrence.

68

1.0

OS­

'S 0.6--Q o

o 0.4 -

0 .2 - Deletions 0 — 1 - -

r>2 »

0 I

25

•r . . . "i .-

> - - -

— I r— 50 75

Time (months)

p=0.0052

100 125

DelO 213 182 157 128 28 0 1 226 187 162 129 40 0

>2 87 68 56 45 11 0

CHAPITRE 4 DISCUSSION

4.1 Synthèse et interprétation des résultats

L'objectif principal de cette étude était d'examiner si des polymorphismes de gènes

impliqués dans l'inactivation androgénique ou œstrogénique pouvaient être associés au

pronostic du cancer de la prostate cliniquement localisé.

Il a ainsi pu être démontré pour la toute première fois que la présence d'une deletion

allélique des gènes UGT2B17 et UGT2B28 est associée à une récidive biochimique précoce

post-prostatectomie radicale. Les intervalles de confiance nous permettent de conclure que

ces résultats sont statistiquement significatifs pour UGT2B17 et qu'il y a une tendance à la

limite de la significativité pour UGT2B28. De plus, les deux deletions identifiées semblent

avoir une importance cliniquement significative, venant au troisième rang comme facteurs

prédictifs de la récidive biochimique, après le score de Gleason et l'APS. La validité de

l'association observée semble d'autant plus appuyée par l'effet cumulatif du nombre de

deletions pour l'un ou l'autre de ces gènes sur le risque accru d'échec de l'APS, et par la

mise en évidence d'une association similaire pour les haplotypes qui incluent ces deletions.

Il est intéressant de souligner que la coexistence de deletions homozygotes pour UGT2B17

et UGT2B28 n'a été observée chez aucun individu de notre cohorte. Il y a lieu de se

questionner sur l'impact qu'une telle combinaison, si rare voire inexistante, pourrait avoir

au niveau biologique chez un individu porteur de ce génotype.

La non-significativité des trois SNP étudiés s'explique possiblement par l'effet biologique

beaucoup plus modeste de ce type de variation génétique en comparaison à la deletion

complète d'un gène fonctionnel. Également, deux de ces SNP sont davantage impliqués

dans le métabolisme des œstrogènes, dont le rôle dans la carcinogénèse prostatique

demeure somme toute moins bien établi que celui des androgènes (26).

Compte tenu que l'APS est un paramètre androgéno-dépendant et qu'il s'agit d'un élément

important dans le dépistage du CaP, ceci pourrait affecter l'association observée entre le

71

pronostic du CaP et les variations de gènes impliqués dans le métabolisme des androgènes

(139). Nous avons ainsi vérifié et confirmé qu'aucune association significative n'existait

entre les variantes d'UGT2B17 et d,UGT2B28 et l'APS au diagnostic, de même qu'avec le

score de Gleason et le stade clinique T.

Finalement, il a été démontré in vitro qu'une diminution de la glucuronidation des

androgènes dans les cellules LNCaP déficientes en UGT2B15 et UGT2B17 stimule la

prolifération cellulaire (101). Les résultats de l'étude présentée reflètent ainsi de façon

indirecte le même fait, soit que des polymorphismes génétiques associés à une répression

de la glucuronidation conduisent potentiellement à des concentrations intraprostatiques en

androgènes actifs plus élevées, d'où leur impact négatif sur le pronostic du CaP.

4.2 Comparaison avec la littérature

Il est difficile de comparer directement nos résultats avec la littérature existante compte

tenu que l'hypothèse testée n'avait jamais été explorée auparavant. En effet, aucune étude

n'avait porté sur le lien entre les SNP et deletions des UGT et le pronostic du CaP. Par

contre, plusieurs études avaient porté sur le SNP d,UGT2B15 et la deletion d,UGT2B17 et

le risque de CaP (Annexe A). Malheureusement, la conclusion à tirer lors d'une analyse

combinée de toutes ces études demeure équivoque puisque les résultats sont

contradictoires. Ces divergences peuvent être dues en partie à des biais d'échantillonnage

(petits nombres de cas, ethnies différentes) ou au choix des sujets témoins (sujets avec

hyperplasie bénigne de la prostate dans l'étude de Gsur et al. (97), possibilité de témoins

avec CaP latent non identifié) (139). Il est toutefois intéressant de souligner que toutes les

corrélations significatives mises en évidence pour UGT2B15 et UGT2B17 associaient

l'allèle qui conjugue le plus faiblement la DHT à un risque accru de CaP.

Pour ce qui est d,UGT2B28, il s'agit d'une enzyme nouvellement caractérisée (77) et

encore très peu étudiée à ce jour quant à son rôle. Une seule étude portant sur 221 cas et

72

205 témoins s'est intéressée à l'association entre la deletion dHUGT2B28 et le risque de

CaP (111). L'association observée était toutefois non statistiquement significative.

Quoique les résultats obtenus par notre étude soient de nature exploratoire, ceux-ci pavent

la voie à des investigations moléculaires plus poussées sur la valeur pronostique des

deletions d'UGT2B17 et UGT2B28 dans la carcinogénèse prostatique.

4.3 Forces de l'étude

Il s'agit d'une étude translationnelle portant sur une large cohorte de patients dont la durée

de suivi est suffisamment longue pour permettre d'observer un nombre significatif

d'événements (récidives biochimiques). La puissance conférée permet donc la mise en

évidence de nouveaux marqueurs moléculaires. De plus, il s'agit de la première étude à

s'intéresser aux deletions polymorphiques d,UGT2B17 et d,UGT2B28 en association avec

la récidive biochimique. Jusqu'à maintenant, plusieurs études s'étaient penchées sur les

associations entre les polymorphismes de mutations ponctuelles (SNP) des gènes codant

pour les enzymes de la stéroïdogénèse et le risque de développer un CaP. Par contre, très

peu (seulement deux selon la revue de littérature effectuée (140; 141)) se sont intéressées à

la valeur pronostique de ces variations dans le CaP et aucune ne s'est intéressée aux

variations dans le nombre de copies de ces gènes (142).

Les études d'associations entre variantes génétiques abondent de nos jours et compte tenu

du nombre considérable d'hypothèses pouvant être testées simultanément, il peut être

tentant d'observer des associations significatives surtout lorsque les gènes testés ont été

sélectionnés de façon « aléatoire ». Or, ceci n'est pas le cas de la présente étude puisqu'une

hypothèse sur le mécanisme biologique sous-tendait le choix des variables génétiques

sélectionnées.

Sans vouloir prétendre à une relation de nature causale de l'association observée par la

présente étude, la plausibilité du mécanisme biologique, la force de l'association (valeur

73

non-négligeable des hazard ratios obtenus) et la relation dose-effet (HR croissant selon le

nombre de deletions portées par un individu) permettent d'appuyer l'importance clinique de

nos conclusions. Il demeure que la reproductibilité de ces résultats devra être vérifiée pour

confirmer la vraisemblance de notre hypothèse.

4.4 Limites de l'étude

Malgré les points forts de cette étude, dont la puissance statistique et l'originalité, celle-ci

est vraisemblablement affectée par certains biais, en partie inhérents à son devis

longitudinal rétrospectif.

Deux biais de sélection doivent être mentionnés. D'abord, bien que tout ait été fait pour

minimiser un biais lié à la participation et recruter les sujets de façon consécutive,

seulement 527 des 652 patients ayant subi une prostatectomie radicale au cours de la

période de l'étude avaient fourni un consentement écrit éclairé. Il nous est impossible de

savoir pourquoi certains sujets n'ont pas été inclus. Aucune raison n'a pu être identifiée qui

aurait conduit à l'exclusion systématique de certaines catégories de sujets. Il nous semble

également permis de croire que, bien que l'équilibre de Hardy-Weinberg n'était pas

parfaitement respecté pour UGT2B15, ceci puisse s'expliquer par une corrélation existant

entre le nombre de copies de l'allèle G d,UGT2B15 et un score de Gleason > 7 (observé

chez 40% de la cohorte), tel que rapporté par Hajdinjak et al. (98). Quoique moins étudié,

une hypothèse similaire pourrait s'appliquer pour UGT2B28.

Le second biais de sélection porte sur les perdus de vue. Il est quasi-impossible dans une

étude clinique longitudinale de large envergure de n'avoir aucun perdu de vue. Beaucoup

d'efforts ont été déployés pour tenter de réduire ce biais au minimum, notamment grâce à

un suivi méticuleux et rigoureux. De plus, pour tous les patients n'étant pas suivis à l'HDQ,

le département des archives médicales de l'hôpital de la région de leur résidence principale

a été contacté de façon à connaître leur évolution clinique et leurs valeurs d'APS récentes.

74

Parmi les biais d'information de cette étude, il faut noter les possibles inexactitudes des

renseignements cliniques (compilés diligemment dans une base de données régulièrement

validée), l'imprécision des PCR et du séquençage (18 contrôles négatifs effectués, 5%

d'échantillons faits en duplicata, coefficient de variation de l'ABI 3730x1 estimé à 1%,

(143)) et l'interprétation des génotypes après séquençage (quoique peu subjective, elle fut

faite à l'aveugle et de façon indépendante par deux personnes différentes). Nous croyons

que ces imprécisions se répercutent de façon non différentielle sur les deux groupes de

patients (ceux avec et sans récidive biochimique) et que leurs effets sont négligeables sur

les résultats obtenus.

Parmi les facteurs de confusion inclus dans le modèle d'analyse multivariée, le tabagisme

fut l'objet de quelques discussions au sein de notre groupe. En raison d'une association

controversée entre le statut tabagique et les concentrations sériques en androgènes (41-44),

il fut décidé de considérer cette variable comme source potentielle de confondance, ceci

dans l'optique de présenter le scénario le plus conservateur. Il est à noter que les analyses

ont également été testées en excluant cette variable du modèle, et les conclusions de l'étude

n'en étaient pas affectées.

Comme autre facteur potentiellement confondant, il aurait été pertinent de tenir compte de

l'IMC, puisque l'obésité est associée à un risque accru de récidive biochimique (32; 144).

Par contre, puisqu'il s'agit d'une étude rétrospective, ces données étaient non disponibles

pour une proportion significative de la cohorte et il ne nous était donc pas possible de

contrôler adéquatement pour cette variable.

Seulement cinq polymorphismes génétiques ont été étudiés et déterminés chez les sujets. Il

est fort probable qu'un individu possède à la fois des gènes de bon et de mauvais pronostic

pour le CaP. Ces gènes peuvent avoir des interactions additives, synergiques ou

antagonistes, ce qui modulerait dans une direction difficilement prévisible l'association à

l'étude. Il ne nous était bien entendu pas possible de présenter les résultats en tenant

compte du nombre certes imposant de tels facteurs pour la plupart inconnus.

75

Sur le plan de la validité externe, l'homogénéité ethnique de notre population est à la fois

une force et une limite. Il s'agit d'une force puisqu'elle nous confère la puissance

statistique requise pour observer des associations qui auraient pu passer inaperçues dans

une population plus hétérogène de même taille. Par contre, ceci implique que les résultats

ne peuvent être généralisés d'emblée à la population canadienne ou nord-américaine,

celles-ci faisant preuve d'une diversité génétique supérieure. Il en résulte la nécessité de

valider ces résultats dans une cohorte différente pour s'assurer qu'il ne s'agisse pas de faux

positifs, tel que recommandé par REMARK (57).

Quoique nous disposions d'une large cohorte, compte tenu de l'indolence de la majorité des

CaP diagnostiqués précocement, les événements cliniquement pertinents de l'ordre de

décès, développement de métastases et d'hormono-résistance étaient relativement peu

fréquents. La puissance statistique était donc probablement insuffisante pour nous

permettre de conclure quant à l'existence ou non d'une association significative entre les

polymorphismes génétiques étudiés et ces variables dépendantes secondaires.

Comme beaucoup d'études portant sur le CaP, la variable dépendante principale était une

issue de remplacement, soit la récidive biochimique. Cette issue est grandement utilisée

dans la littérature urologique, mais il demeure que la validation de nos résultats dans une

cohorte de patients ayant un CaP avancé serait certes intéressante. De plus, on ne peut

passer sous silence une absence de consensus sur la définition de la récidive biochimique

(123).

À notre humble avis, malgré les quelques imperfections au point de vue méthodologique

énoncées précédemment et difficiles à contrôler, cette étude à caractère exploratoire ne

nous semble aucunement entachée de biais rédhibitoires.

76

4.5 Perspectives

Tel que mentionné précédemment, ces résultats doivent d'abord et avant tout être validés

dans une cohorte différente et idéalement, dans une cohorte avec une plus grande

hétérogénéité ethnique. Une telle validation est actuellement en cours au sein de trois

différents groupes de recherche. Si nos résultats sont reproduits avec succès, il pourrait par

la suite être envisagé d'intégrer ces nouveaux marqueurs moléculaires pronostiques dans un

nomogramme afin d'aider les cliniciens à la prise de décision thérapeutique.

Vu l'intérêt des CNV mis en évidence par cette étude, nous croyons que ce sujet mérite

d'être approfondi. Une autre famille d'enzymes métaboliques de phase II impliquées dans

la détoxication, les glutathion S-transférases (GST), sert à la protection des cellules contre

le stress oxydatif et divers carcinogènes (145; 146). Les GST ont fait l'objet de nombreuses

études épidémiologiques associant une perte d'activité de ces enzymes à un risque accru et

un pronostic plus sombre de CaP (147;148). Cette famille d'enzymes se subdivise en huit

classes (148) et des variations dans le nombre de copies génétiques ont été identifiées chez

trois d'entre elles (GSTT1, GSTT2, GSTM1) (149-151). Il serait intéressant d'établir si les

CNV de cette famille sont individuellement associées à un risque accru de récidive

biochimique et si, tel qu'observé dans notre étude, le nombre de copies a un effet cumulatif

avec un pronostic plus sombre. Cette étude semble facilement réalisable puisque ces CNV

ont déjà été identifiées et que l'ADN de notre cohorte demeure disponible.

Également, puisqu'il a déjà été démontré que dans les lignées cellulaires LNCaP, la

deletion d,UGT2B17 conduisait à une expression cellulaire accrue en androgènes (118), il

devient pertinent de répéter l'expérience pour des cellules délétées en UGT2B28 compte

tenu des résultats de la présente étude. Ceci se veut intéressant de chercher à confirmer par

une expérimentation fondamentale des résultats obtenus par une recherche clinique.

Il serait également pertinent de valider l'explication avancée de l'intracrinologie pour

expliquer l'association observée entre les deux deletions et la récidive biochimique par une

étude au niveau tissulaire. Nous ne disposons évidemment pas de tissus frais pour cette

77

même cohorte mais seulement de tissus fixés en paraffine. Malheureusement, les deletions

ne peuvent être identifiées par immunohistochimie et ce type d'étude n'apparaît pas

possible pour le moment parmi cette même cohorte.

Enfin, il serait intéressant d'établir un profil complet du rôle et de l'influence des niveaux

circulants en hormones stéroïdiennes sexuelles, leurs précurseurs et leurs metabolites, en

relation avec les variations génétiques fonctionnelles des enzymes impliquées dans la

stéroïdogénèse, en mettant le tout en perspective avec le pronostic du CaP cliniquement

localisé.

Conclusion La glucuronidation est un processus majeur d'inactivation des hormones stéroïdiennes

sexuelles. Une déficience en UGT2B17 et UGT2B28 a été associée à un risque accru de

récidive biochimique post-prostatectomie chez les patients atteints d'un CaP cliniquement

localisé. Ces résultats supportent l'hypothèse que des polymorphismes des UGT associés à

une activité moindre conduisent potentiellement à des concentrations intracellulaires en

androgènes actifs plus élevées, le tout se traduisant par une prolifération cellulaire accélérée

et un pronostic moins favorable.

Bien entendu, compte tenu de la variété génétique interraciale, l'étude d'autres populations

est envisagée pour confirmer les résultats obtenus. Également, l'analyse simultanée de tous

les gènes impliqués dans la synthèse et l'inactivation des hormones stéroïdiennes sexuelles

est une avenue qui sera prochainement explorée afin de tenir compte de l'effet global de

tous les polymorphismes fonctionnels d'intérêt.

Malgré les limitations et le caractère exploratoire de cette large étude translationnelle, les

résultats obtenus sont plausibles biologiquement et ont un potentiel de répercussions

concrètes au point de vue médical. En effet, compte tenu du risque de surtraitement et des

complications associées à un surdépistage du CaP, il est permis d'entrevoir l'utilisation

éventuelle de ces nouveaux marqueurs moléculaires pour mieux identifier les hommes à

risque d'échec de l'APS et ainsi individualiser la prise en charge clinique.

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Annexe A : UGT et le risque de cancer de la prostate

Gène Génotype Cas (%) Témoins (%) RC IC P Références

UGT2B15* DD DY YY

41 58 2

19 77 5

3.0

1.0

1.3-6.5 0.007 MacLeod et al., 2000 (96)

Nbre sujets 64 64 UGT2B15 DD 21 25 1.0 Gsur et al., 2002

DY 52 49 1.25 0.73-2.15 0.39 (97) YY 27 26 1.20 0.65-2.22 0.54

Nbre sujets 190 190 UGT2B15 DD 28 16 2.50 1.18-5.24 n.d. Hajdinjak et al.,

DY 49 52 1.36 0.73-2.53 n.d. 2004 (98) YY 23 33 1.0

Nbre sujets 87§ 178 UGT2B15 DD 34 14 2.7 1.1-6.6 0.003 Park J. et al.,

DY 46 62 1.0 0.5-2.1 n.d. 2004 (99) YY 20 24 1.0

Nbre sujets 155 154 UGT2B15 DD 49 28 1.0 Okugi et al., 2006

DY 38 61 0.36 0.20-0.65 0.0006 (100) YY 13 11 0.66 0.27-1.60 0.36

Nbre sujets 102 117 UGT2B17 Ins/Ins+Ins/Dél 82 88 1.0 Park J. et al.,

Del/Dél 18 12 1.7 1.2-2.6 0.004 2006 (84) Nbre sujets 406 482 UGT2B15 DD

DY YY

n.d. n.d. n.d.

n.d. n.d. n.d.

n.d. n.d. 1.00 Cunningham et al., 2007 (30)

Nbre sujets 937 493 UGT2B17 Ins/Ins+Ins/Dél 82 88 1.0 Park J.Y. et al.,

Del/Dél 18 12 1.7 1.03-2.9 n.d. 2007(108) Nbre sujets 247 273 UGT2B17 Ins/Ins 49 48 1.0 Gallagher et al.,

Ins/Dél 41 40 0.99 0.73-1.35 n.d. 2007 (107) Dél/Dél 10 12 0.89 0.55-1.45 n.d.

Nbre sujets 411 397 UGT2B17 Ins/Ins 47 64 1.0 Karypidis et al.,

Ins/Dél 48 32 2.15 1.29-3.58 n.d. 2008 (109) Dél/Dél 4 3 1.63 0.37-7.15 n.d.

Nbre sujets 174 161 UGT2B17 Ins/Ins+Ins/Dél 89 89 1.0 Olsson et al.,

Dél/Dél 11 11 1.01 0.83-1.23 0.91 2008(110) Nbre sujets 2682 1672

93

UGT2B17 Ins/Ins 50 45 1.0 Setluretal.,2010 Ins/Dél 39 45 0.77 0.51-1.16 0.21 (111) Dél/Dél 10 10 0.88 0.45-1.73 0.71

UGT2B28 Ins/Ins 74 75 1.0 Ins/Dél 24 22 1.14 0.72-1.81 0.58 Dél/Dél 2 3 0.50 0.14-1.79 0.29

Nbre sujets 221 205

Ins : Insertion, Dél : Deletion, RC : Rapport de cotes, IC : Intervalle de confiance, n.d. : non disponible.

Il est possible que la somme des fréquences en pourcentage soit supérieure à 100 en raison d'arrondissement à l'unité.

*Le polymorphisme d'UGT2B15 étudié est D85Y (rs 1902023).

§Seuls les patients avec un score de Gleason >7 ont été inclus dans l'analyse comparative.

Inspiré de Inactivation by UDP-glucuronosyltransferase enzymes: The end of androgen signaling, J Steroid Biochem Mol Biol 2008 (152).

Annexe B : Formulaire de consentement

UMa ^ « . t * * * » " * Révision: Avril 1997 o>*« Cv*~ c i a

FEUILLET D'HTOORMATION POUR UTILISATION DE TISSUS OU DE LIQUIDE BIOLOGIQUE À DES FINS DE RECHERCHE

PROVENANT DE SUJETS SAINS OU MALADES.

INTRODUCTION: Nous vous demandons la permission de faire une prise de sang, d'urine ou encore d'utiliser une partie des tissus enlevés lors d'une opération pour des fins de recherche sur le cancer. La loi exige que nous obtenions cette permission pour effectuer ces recherches.

CHERCHEURS PRINCIPAUX: Les docteurs Pierre Douville et Real Lagacé.

OBJECTIFS: L'Hôtel-Dieu de Quebec est activement impliqué dans la recherche sur le cancer. Les laboratoires de l'hôpital analysent régulièrement les tissus, le sang ou l'urine pour identifier et suivre l'évolution des cancers. Cependant, nous sommes toujours à la recherche de meilleurs façons d'améliorer les tests que nous faisons ou d'en rechercher de nouveaux. Nous devons souvent comparer les nouveaux tests chez des personnes atteintes d'un cancer mais aussi chez des sujets normaux (donc sans cancer).

Nous vous demandons la permission de prélever 2 tubes de sang (20 mL) supplémentaires ou encore de garder une partie de voue urine pour effectuer des analyses reliées au cancer (mar­queurs tumoraux) sur le plasma, l'urine ou les cellules sanguines. Ces prises de sang seront effectuées en même temps que les tests requis par votre médecin ou, si vous êtes opéré, lorsque vous serez endormi. En outre, nous demandons la permission de pouvoir utiliser pour les mimes fins de recherche le reste du sang et àcs tissus prélevés normalement pour vos soins. En particulier, les blocs de tissus analysés par un pathologiste pourront être gardés pour des analyses subséquentes reliées a la recherche sur le cancer.

AVANTAGES: Il n'y a aucun avantage prévu pour vous puisque les résultats de tests effectués sur vos échantillons ne seront pas consignés à votre dossier médical.

RISQUES ET INCONFORTS: Il n'y a aucun risque pour vous à l'exception des effets possibles de la prise de sang comme la formation d'un 'bleu*.

Initiales du patient:

95

CONFLDEaNTIALITÉ: Aucun résultat ne sera transmis à votre dossier et toute l'information demeurera strictement confidentielle. Afin de pouvoir corréler les résultats avec votre état clini­que, les docteurs Pierre Douville, Real Lagacé ou un de leurs collaborateurs pourront consulter votre dossier médical pour les fins de la recherche. Aucune donnée nominale ne servira dans les rapports de recherche ou les publications qui pourront en résulter. Par ailleurs, les spéci­mens seront conservés à un endroit spécial accessible seulement aux chercheurs.

PARTICIPATION: Votre participation est volontaire et ne modifie en rien les examens médi­caux et les traitenents qui sont déjà prévus.

APPROBATION: Ce formulaire de consentement a été approuvé par le Comité d'éthique de la recherche de l'Hôtel-Dieu de Québec.

QUESTIONS: Pour des informations supplémentaires, vous pouvez rejoindre le docteur Pierre Douville au numéro de téléphone suivant: 691-5135.

CONSENTEMENT POUR L'OBTENTION DE MATÉRIEL BIOLOGIQUE POUR FINS DE RECHERCHE PROVENANT DE

SUJETS SAINS OU MALADES

Je, soussigné^) . , accepte que des échantillons de sang (2 tubes de 10 mL) ou d'urine soient prélevés pour des fins de recherche sur les marqueurs tumoraux. J'accepte également que les restants de tissus ou de d'autres tubes de sang puissent également servir aux mêmes fins.

SIGNATURE' DATE

SIGNATUtig (TÉMOIN) DATE

NOTE: Retourner la feuille signée avec les échantillons au laboratoire.

Annexe C : CNV rares associés au cancer

Gene Cancer syndrome References on genomic deletions or duplications

APC

2 BMPR1A 3 BRCA1 4 BRCA2 5 CDKN2A p14ARF 6 CDKN2A -p16(INK4a) 7 CHEK2 8 FANCA 9 MADH4 10 MEN1 11 MLH1

12 MSH2 13 MSH6 14 NF1 15 NF2 16 PRKAR1A 17 FTCH 18 RB1 19 SDHB 20 SDHC 21 SDHD 22 SMARCB1 23 STK11 24 TP53 25 TSC1 26 TSC2 27 VHL 28 WT1

Adenomatous polyposis coli; Turcot syndrome

Juvenile polyposis Hereditary breast/ovarian cancer Hereditary breast/ovarian cancer Familial malignant melanoma Familial malignant melanoma Familial breast cancer Fanconi anemia A Juvenile polyposis Multiple endocrine neoplasia type 1 Hereditary nonpolyposis colorectal cancer,

Turcot syndrome Hereditary nonpolyposis colorectal cancer Hereditary nonpolyposis colorectal cancer Neurofibromatosis type 1 Neurofibromatosis type 2 Carney complex Nevoid basal cell carcinoma syndrome Familial retinoblastoma Familial paraganglioma Familial paraganglioma Familial paraganglioma Rhabdoid predisposition syndrome Peutz-Jeghers syndrome Li-Fraumeni syndrome Tuberous sclerosis 1 Tuberous sclerosis 2 von Hippel-Lindau syndrome Denys-Drash syndrome, Frasier syndrome, f

amilial Wilms tumor

Hodgson ef al. [38], Su et al. [39], Aretz et al. [40] and Charames étal. [41]

Delnatte et al. [42] Petrij-Bosch et al. [43] and Montagna ef al. [44] Casilh ef al. [45] Lesueur et al. [46] Lesueur ef al. [46] Cybulski ef al. [47,48] Levran ef al. [49] Van Hattem ef al. [50] Kishi et al. [51] Nystrom-Lahti ef al. [52] and Chan ef al. [53]

Stella et al. [54] Plaschke ef al. [55] Riva ef al. [56] and Bausch ef al. [57] Tsilchorozidou ef al. [58] Horvath ef al. [59] Shimketsefa/. [60] Bremner ef al. [61] Cascon ef al. [62] Baysal ef al. [63] McWhinney ef al. [64] Swensen ef al. [65] Le Meur ef al. [66] Bougeard ef al. [67,68] Kozlowski ef al. [69] Kozlowski ef al. [69] Richards ef al. [70] Huffefa/. [71]

CNV, copy number variation.

Tiré de Copy number variations and cancer susceptibility, Curr Opin Oncol 2010 (133).