T3SS Sécrétion de type III

Petite introduction …

¤ qu’est-ce que la sécrétion :

c’est quand une protéine est synthétisée dans le cytoplasme et va traverser la membrane pour être libérée dans le milieu extérieur

c’est un transport actif

c’est un cas particulier d’export

¤ les différents types de sécrétion :

+ type VI identifiée en 2006(+ type VII chez les Gram+)

La sécrétion de type III

appelée INJECTISOME (machinerie de sécrétion complexe)

mise en évidence chez Yersinia (Cornelis, 1997)

pathogène d’animaux et phytopathogène

complexe macromoléculaire

permet l’injection directe de protéines effectrices au travers de la membrane des cellules cibles eucaryotes

rôle important dans la virulence permet l’invasion intracellulaire dans les cellules non phagocytaires, inhibe la réponse proinflammatoire, module le trafic intracellulaire…

Les différentes familles d’injectisomes :

Injectisome Family Species Description

Chlamydiales *Chlamydia trachomastis Obligate intracellular human pathogen

Hrp1 *Pseudomonas syringae Plant pathogen

Hrp2 *Burkholderia pseudomalles*Xanthomonas campestris

Human pathogen

Plant pathogen

SPI-1 *Salmonella enterica

*Shigella flexneri

Human pathogen

Human pathogen

SPI-2 *Escherichia coli EPEC

*Yersinia pestis

Human pathogen

Rodent and human pathogen

Rhizobium *Rhizobium sp Plant symbiont

Ysc *Yersinia enterocolitica Human pathogen

Les différentes familles d’injectisomes :

Injectisome Family Species Description

Chlamydiales *Chlamydia trachomastis Obligate intracellular human pathogen

Hrp1 *Pseudomonas syringae Plant pathogen

Hpr2 *Burkholderia pseudomalles*Xanthomonas campestris

Human pathogen

Plant pathogen

SPI-1 *Salmonella enterica*Shigella flexneri

Human pathogen

Human pathogen

SPI-2 *Escherichia coli EPEC*Yersinia pestis

Human pathogen

Rodent and human pathogen

Rhizobium *Rhizobium sp Plant symbiont

Ysc *Yersinia enterocolitica Human pathogen

différentes familles toutes basées sur le même modèle structural très conservé

Structure du système de sécrétion de type III (Calvin et al., 2006)

Partie basale

NEEDLE

COMPLEX

MI

ME

tige

STRUCTURE

BASALE

différentes familles toutes basées sur le même modèle structural très conservé

quand contact : formation d’un pore=translocateur (Yop B, Yop D et Lcrv) + injection des Yop (=effecteurs)

mécanisme contact-dépendant

transport unidirectionnel

en 1 étape dans un état déplié

intervention de chaperonnes

translocon

Partie basale : ATP-ase

grande similarité avec le flagelle suggérant une origine commune

Figure 2. Structure du flagelle et du SST3. (a) représentation schématique du flagelle (b)représentation schématique du SST3 de la famille Ysc chez Yersinia spp. (Cornelis, 2006)

ab

Flagelle = organelle mobile. Il s’agit d’un prolongement cytoplasmique comportant 3 parties : corps basal, crochet, filament. Son assemblage est séquentiel, de la partie la + interne à la partie la + externe : insertion du

disque M dans la mbne, puis du disque S, addition de la tige et de son capuchon, addition des disques Pet L, addition du crochet et finition, autoassemblage du

filament flagellaire par polymérisation de la flagelline et enfin addition des protéines de

motilité.

grande similarité avec le flagelle suggérant une origine commune

Injectisome Ysc

The Needle Length of Bacterial

Injectisomes Is Determined by a

Molecular Ruler

Laure Journet, Céline Agrain, Petr Broz, Guy R. Cornelis*

14 August 2003; accepted 16 October 2003

SCIENCE VOL 302 5 DECEMBER 2003

(La longueur des aiguilles des injectisomes bactériens est déterminée par une règle moléculaire)

¤ Ce que les chercheurs savaient :

Les protéines de la famille Ysc présentent beaucoup de similarités avec les protéines du corps basal du flagelle (origine commune)

La longueur du crochet du flagelle (55nm) est génétiquement contrôlée

Mutations dans fliK (gène du flagelle de Salmonella) crochets de taille indéfinie

Mutation dans invJ (Salmonella) et dans spa32 (Shigella) aiguilles de longueurs variables

InvJ et Spa32 se comportent comme FliK (pas de séquences homologues)FlagellumSalmonella

Injectisome Salmonella

Injectisome Shigella

Structure/function

FliK InvJ Spa32 *Control the hook/needle lenght*Substrate specificity switch

«  qu’est-ce qui contrôle la longueur

des aiguilles chez Yersinia ?? »

¤ Microscopie électronique :

Y. enterocolitica E40 incubée dans un milieu où la sécrétion de Yop a été induite artificiellement

Structures détachées de type aiguille de 60 nm

¤ Mesure des aiguilles :

¤ Microscopie électronique :

Y. enterocolitica yscP Δ97-465

¤ taille des aiguilles de Y. enterolica yscP Δ97-465

Tailles comprises en 45 et 1532 nm

YscP joue un rôle dans le contrôle de la longueur des aiguilles de l’injectisome

Test de complémentation :

yscPΔ97-465 + yscP+

Le contrôle de la taille est restauré

YscP joue une rôle essentiel dans le contrôle de la longueur des aiguilles

¤ on dispose de 3 protéines YscP de tailles différentes :

90% d’identité de séquence avec YscP entero E40

¤ les 3 protéines conduisent-elles à des aiguilles de même taille ???????

Test de complémentation : yscP Δ97-465 + yscP pestis KIM

Résultat : restauration du contrôle de la longueur des aiguilles mais aiguilles de taille + petite

YscP E40

Test de complémentation : yscP Δ97-465 + yscP Δ222-306

Résultat : -contrôle restauré de la longueur des aiguilles

- aiguilles + petites que pour YscP E40

YscP E40

YscP joue un rôle essentiel dans le contrôle de la longueur des aiguilles

Corrélation entre la taille de YscP et la longueur des aiguilles

¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ97-465 :

¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ97-465 :

1,2,3,4 : corrélation taille de la protéine/longueur des aiguilles

¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ97-465 :

6,7,8 : corrélation taille YscP/longueur des aiguilles

¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ97-465 :

16-25

26-35

9

10

N-ter important pour le contrôle de la taille

¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ97-465 :

385-424

467-515

11

12

C-ter important pour le contrôle de la longueur

¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ97-465 :

Relation linéaire entre la longueur des aiguilles et la taille de YscP

Hypothèse :YscP est un molecular ruler

¤ Hypothèse : si YscP est un molecular ruler, on pourrait s’attendre à ce que la protéine soit associée à l’aiguille, au moins pendant l’étape d’élongation.

¤ Tester cette hypothèse : purification des aiguilles Y.enterocolitica-condition non-permissive-condition permissive

Condition non-permissive :Présence de YscP dans la fraction d’aiguilles et dans le surnageant

¤ Hypothèse : si YscP est un molecular ruler, on pourrait s’attendre à ce que la protéine soit associée à l’aiguille, au moins pendant l’étape d’élongation.

¤ Tester cette hypothèse : purification des aiguilles Y.enterolica-condition non-permissive-condition permissive

Condition permissive : Ysc P seulement retrouvée dans le surnageant

YscP est associée au aiguilles nouvellement synthétisées ne sécrétant pas de Yop mais pas avec les aiguilles sécrétant les Yop

¤ YscP joue 1 rôle essentiel dans le contrôle de la longueur des aiguilles

¤ corrélation entre taille de YscP et longueur des aiguilles (relation linéaire)

¤ N-ter et C-ter de YscP importants pour le contrôle de la longueur des aiguilles

¤ YscP = molecular ruler

Hypothèse :

¤ les 2 extrémités N et C-ter sont des ancres protéiques : 1 attachée au corps basal, l’autre attachée à l’extrémité grandissante de l’aiguille.

¤ quand l’aiguille atteint sa taille mature (60nm), YscP complètement tendue signalant via 1 domaine l’arrêt de sécrétion de YscF et le changement de sécrétion pour les Yop

¤ cette hypothèse va dans le même sens que des études précédentes sur la fonction de switch de YscP, qui une fois l’assemblage de l’aiguille terminé switch la sécrétion de YscF pour la sécrétion des Yop.

¤ d’après cette hypothèse YscP a une double fonction

Modèle du molecular ruler :

Modèle du molecular ruler :

Modèle du molecular ruler :

N-ter

C-ter

Modèle du molecular ruler :

Modèle du molecular ruler :

Characterization of a Type III secretion substrate

specificity switch (T3S4) domain in YscP from

Yersinia enterocolitica

Céline Agrain,Isabelle Callebaut,Laure Journet,Isabel Sorg,Cécile Paroz,Luís Jaime Mota and Guy R. Cornelis

Molecular Microbiology (2005) 56(1), 54–67

(Identification du domaine T3S4 de YscP de Yersinia enterolica)

Longueur des aiguilles déterminée par YscP

YscP = molecular ruler (importance région N et C-ter)

YscP responsable du switch de sécrétion ???

Dans ce papier : par des approches bioinformatiques et des approches génétiques identification de la région de YscP responsable de la fonction

de switch

¤ Délétions dans yscP – Tests des mutants obtenus pour leur capacité à sécréter les Yop

A. Schematic representations of the yscP in frame deletions mutants together with their ability to secrete Yops.

¤ Délétions dans yscP – Tests des mutants obtenus pour leur capacité à sécréter les Yop

1 381 385 425 500 515

Pas d’effet sur la sécrétion

phénotype intermédiaire (rsd importants)

pas de sécrétion (domaine important)

La région de YscP comprise entre 385 et 500 est requise pour la

sécrétion des Yop.

¤ Expérience de Western-blot pour tester la capacité des mutants de délétion à synthétiser YscP

YscP mutantes sont produites et de taille attendue

¤ Impact des délétions sur la sécrétions des Yop (SDS-PAGE coloration au Coomassie)

Délétions avant rsd 381 et après rsd 500 : pas d’effet sur la sécrétion des Yop

délétions entre 385 et 500 affectent la sécrétion des Yop

NB: le temoin négétif n’est pas complètement négatif pour la sécrétion des YOP

Petit Bilan:

la région en C-ter comprise entre les rsd 385 et 500 est requise pour la sécrétion des Yop

Ce domaine serait donc responsable de la fonction de switch de spécificité de substrat

YscP et FliK ont des fonctions similaires avec seulement 10% d’identité

la fonction de switch de FliK est localisé dans la région C-ter

¤ Ce que ce papier a apporté :

la fonction de switch de YscP est en C-ter

?????:- C-ter de YscP et FliK partagent des similarités ??- région équivalente dans les protéines des autres

injectisomes ou dans les systèmes de type III ??

Comment ? comparaison de C-ter de YscP avec les protéines de la famille

Ysc : AscP, PscP, LscP et SctP

Alignements multiples déduits d’une analyse PSI-BLAST et ajustés manuellement

Résultat : domaine C-ter conservé (34% d’identité)

Domaine C-ter (409-492) : Type III Secretion Substrate Specificity Switch = T3S4

¤ Analyses bioinformatiques :

T3S4 : - structure globulaire - repliement α/β original - signature P-x-L-G

Basé sur sa séquence dans YscP, les limites du T3S4 ont été déterminé : 403-492

¤ Expérience de swapping (échange) du T3S4 :

d’après les analyses bioinfo, le domaine T3S4 de la famille Ysc est très conservé entre les différents membres : repliement et taille du domaine identiques.

Les T3S4 des différentes protéines de la

de la famille Ysc peuvent être

échangés

¤ Expérience de swapping (échange) du T3S4 :

Remplacement du T3S4 de YscP par :

- T3S4 de AscP (Aeromonas salmonicida)- T3S4 de PscP (Pseudomonas aeruginosa)- T3S4 de FliK (S.enterica Thyphi)- T3S4 de FliK (Y.pestis)

Comment ?

- introduction de 2 sites de restriction au niveau de la région codant le T3S4 de yscP

- clonage de la région codant le T3S4 des différentes protéines

- introduction des plasmides recombinants dans une souche yscP-

¤ Effets du swapping sur la sécrétion des Yop :

Coomassie stained SDS-PAGE

Sécrétion des Yop

¤ Effets du swapping sur la sécrétion des Yop :

Sécrétion des Yop

Coomassie stained SDS-PAGE

La sécrétion des Yop est restaurée

les T3S4 de AscP et PscP sont capables de jouer le rôle de YscP

l’intéraction entre le T3S4 et l’appareil de sécrétion est spécifique

¤ Contrôle de la longueur des aiguilles :

Analyse au M.E et mesures de la longueur :

Hybride famille Ysc : switch de spécificité de substrat mais altération de la fonction molecular ruler

¤ Effet des mutations dans le T3S4: ¤ Effet des mutations dans le T3S4:

Bioinfo : -la majorité des résidus conservés du T3S4 ont une

grande importance dans la structure du domaine

- d’autres ne sont pas aussi importants pour la structure

Substitution de ces rsd par une alanine pour voir s’ils ont un effet sur la fonction ??

¤ Effet des mutations dans le T3S4:

Ces positions du T3S4 ne sont pas affectées par une substitution par une alanine

Ces rsd ne sont pas impliqués dans la sécrétion

¤ Effet des mutations dans la signature P-x-L-G du T3S4:

Substitutions des rsd P440 et L442 par une Alanine

L442A : phénotype wt pour les 2 fonctions

P440A: sécrétion des Yop affectée+ contrôle de la longueur des aiguilles moins efficace

seul le rsd P440 de la signature a un effet sur la sécretion et le contrôle de la taille des aiguilles

BILAN :

T3S4 en C-ter de YscP dans la région 403-492

T3S4 conservé dans les protéines responsables du contrôle de la longueur dans les différents types d’injectisomes et aussi chez les membres de la famille FliK (flagelle)

T3S4 de YscP peut être remplacé par le T3S4 d’un autre membre de la famille Ysc mais pas par le T3S4 d’une autre famille, ni par le T3S4 d’une protéine du flagelle

T3S4 a une structure globulaire

Ce domaine a une signature P-x-L-G impliquée dans la fonction

Conclusions :

YscP agit comme un « molecular ruler » (N et C-ter)

C-ter est requis pour le contrôle de la taille des aiguilles et pour la sécrétion des Yop

YscP exerce la fonction de switch de spécificité de substrat (T3S4) : sécrétion de YscF arrêt de sécrétion de YscF et sécrétion des Yop

T3S4 est un domaine globulaire dont la structure est conservée dans les orthologues des systèmes injectisomes et flagelles

l’interaction entre le T3S4 et l’appareil de sécrétion est spécifique

les phénotypes perte de contrôle de la longueur et pas de sécrétion de Yop peuvent être dissociés

YscP and YscU switch the substrate specificity of the Yersinia type III secretion system by regulating export of the inner rod protein YscI.

Wood SE, Jin J, Lloyd SA.Department of Pediatrics, Center for Vaccine Development, University of Maryland at Baltimore, 685 W. Baltimore St., Baltimore, MD 21201, USA.

Pathogenic yersiniae utilize a type III secretion system to inject antihost factors, called Yops, directly into the cytosol of eukaryotic cells. The Yops are injected via a needle-like structure, comprising the YscF protein, on the bacterial surface. While the needle is being assembled, Yops cannot be secreted. YscP and YscU switch the substrate specificity of the secretion system to enable Yop export once the needle attains its proper length. Here, we demonstrate that the inner rod protein YscI plays a critical role in substrate specificity switching. We show that YscI is secreted by the type III secretion system and that YscI secretion by a yscP mutant is abnormally elevated. Furthermore, we show that mutations in the cytoplasmic domain of YscU reduce YscI secretion by the yscP null strain. We also demonstrate that mutants expressing one of three forms of YscI (those with mutations Q84A, L87A, and L96A) secrete substantial amounts of Yops yet exhibit severe defects in needle formation. In the absence of YscP, mutants with the same changes in YscI assemble needles but are unable to secrete Yops. Together, these results suggest that the formation of the inner rod, not the needle, is critical for substrate specificity switching and that YscP and YscU exert their effects on substrate export by controlling the secretion of YscI.

J Bacteriol. 2008 Jun;190(12):4252-62. Epub 2008 Apr 18

Impassable YscP substrates and their impact on the Yersinia enterocolitica type III secretion pathway.Riordan KE, Sorg JA, Berube BJ, Schneewind O.Department of Microbiology, University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA.Yersinia type III machines secrete protein substrates across the bacterial envelope and, following assembly of their secretion needles, transport effector Yops into host cells. According to their destination during type III secretion, early, middle, and late secretion substrates can be distinguished; however, the signals and mechanisms whereby these proteins are recognized and transported by the secretion machine are not understood. Here, we examine several hybrids between secretion substrates and the impassable reporter protein glutathione S-transferase (GST). YscP-GST and YopR-GST blocked type III secretion; however, YscF-, YopD-, YopN-, and LcrV-GST did not. Unlike YopR-GST, which can block type III machines only during their assembly, expression of YscP-GST led to an immediate and complete block of all secretion. The secretion signal of YscP was mapped to its first 10 codons or amino acids; however, YscP(Delta 2-15)-GST, lacking this secretion signal, imposed a partial blockade. YscP-GST copurified with the type III ATPase complex (YscN, YscL, and YscQ) and with YscO, suggesting that the association of specific machine components with the impassable substrate may cause the block in type III secretion.

J Bacteriol. 2008 Sep;190(18):6204-16. Epub 2008 Jul 18