TD 4b: PCR

Le principe de la PCR (rappel)

pcrwin.zip

Choix des séquences d’amorces

• Amplification de 5’ vers 3’

Exercice n°6

Détermination de la tailleoptimale des amorces

• Spécificité de l’hybridation assurée par– T° hybridation– longueur de l’amorce

• Longueur optimale de l’amorce fonction de la complexité du génome

Exercice n°7

Hybridation amorce-matriceChoix de la température

– Tm: t° où 50% de l’ADN est double brin– Zone d’accrochage: de 13 à 25 nucléotides– formule empirique Tm = 4(G+C) + 2(A+T)– Température d’hybridation: Tm - 4°C– Un mésappariement est possible, mais pas n’importe où– Tm baisse de 1 à 1,5°C par % de non homologie

Exercices n°8, 21

Exercice n°9

Amplifier l’ARN: la RT-PCR

A

BA

A

Reverse transcriptase

ADN polymerase

Amplification cyclique

Quantifier l’ADN:la PCR quantitative

96 Replicates

-1.00E-01

4.00E-01

9.00E-01

1.40E+001 6

11 16 21 26 31 36

Cycle Number

Analyse temps réel

Analyse point Final

Detection de fluorescence au cours d’une PCR

Les chimies fluorescentes

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Molecular_Biology/PCR/Product_Lines/Quantitative_PCR.html

La chimie Taqman

5’3’

5’5’3’

5’

Amorce sens

Amorce anti-sens

Sonde TaqMan®

R Qp

FRET

Quenching

L’activité exonucléasique de la polymérase décrochele reporter qui émettra de la fluorescence après

excitation par un laser à 500 nm

R

p3'

p3'

p3'

p3'

QR

QR

Q

QR ProbeForward Primer

3' 5'

5' 3'

Reverse Primer

5'

5'

R = ReporterQ = Quencher

Polymerisation

3' 5'

5' 3'

5'

5'

Déplacement de la sonde

3' 5'

5' 3'

5'

5'

Clivage

3' 5'

5' 3'

5'

5'

Polymerisation terminée

Système de détection

Intégré dans un seul instrument

Détection en temps réel des produits de PCR

Detection de lafluorescence

PCRde L'échantillon

Preparation Analyse spécifique à l'application

ABI Prism 7700

Plusieurs types de fluorophorespossibles

Ct: cycle au cours duquel démarre la phase exponentielle de la PCR

-2.00E-02

0.00E+00

2.00E-02

4.00E-02

6.00E-02

8.00E-02

1.00E-01

20 22 24 26 28 30

96 replicats

CYCLE SEUIL(Ct)

Seuil de Détection(Threshold)

Cycles

Phase exponentielle

Equation de l’amplification de la PCR

Xn = Xo x (1 + Ex)n

Xn = nombre de cibles au cycle nXo = nombre initial de molécules ciblesEx = efficacité de la PCRn = nombre de cycles de PCR

• Ct est proportionnel au nombre de cibles àamplifier

• Ct est reproductible d’une amplification àl’autre

Dilutions au 1/5è

Conditions pour une PCR quantitative multiplex sur ABI Prism 7700 (Maïs)

• Tampon d’enzyme• Nucléotides: dATP, dCTP, dGTP, dUTP• Uracile N-Glycosylase (UNG)• Chlorure de magnésium• Oligonucléotides: LTP1 et LTP2• Sonde TaqMan LTP: VIC 5’-----------------3’ TAMRA• Oligonucléotides: 35S1 et 35S2• Sonde TaqMan 35S: FAM 5’-----------------3’ TAMRA• ADN polymérase• ADN génomique (100 ng)• Eau distillée stérile (qsp 25 μl)

Conditions d’amplification

•2 Températures : Chimie TaqMan®

•Tm des amorces : 60°C

•Tm de la sonde : + 7 à 12 °C

Collection des données Activation del'AmpliTaq Gold

Activation del'UNG

UNG: uracyle N-glycosylase:évite unecontamination par le produit pré-amplifié

Détermination d’une courbe standard

Pente efficacité de la PCR (p=3,32 -> E=100%)

Ct = a x log (Qté ADN cible) + b

Ex = [10(1/a) - 1] x 100

Efficacité identique pour deuxéchantillons: dosage comparatif possible

Réference

Gène 1

Gène 2

Pente : -3,44

E = 95%

Ech 2

Ct gène 1

Ct gène ref

Qté gène 1 Qté gène ref

Application: dosage de transgènes• Préparation d’une gamme étalon

– détermination de la quantité d’ADN total– détermination de la quantité d’ADN transgénique

quantité ADN total (ng) 200 100 50 25 5 2,5quantité ADN transgénique (ng) 4 2 1 0,5 0,1 0,05

Ct

log (Qté ADN total (ng))

Ct

log (Qté ADN transgénique (ng))

Ct = a x log (Qté ADN total) + b

Ct = a’ x log (Qté ADN transgénique) + b’

% d’OGM contenu dans l’échantillon = Qté d’ADN transgénique/Qté totale d’ADN x 100

Amplification d’un gène de référence Amplification d’une séquence du transgène

Exercice n°35

Utilisation: détection de SNP(single nucleotide polymorphism)

VICVIC FAMFAM

2 sondes allèle spécifiques

FAMFAM TAMRAVICVIC TAMRAAllele 2Allele 2

Allele 1Allele 1FAMFAM TAMRAVICVIC TAMRA

Clivage inefficace en cas de mismatch