Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II

8/7/2019 Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II

1/43

TEHNICI DE BIOLOGIEMOLECULAR II


2/43

RECOMBINAREA ADN-ului

Recombinare lat. re nou, combina - formare

Informaia genetic a lumii vii estelocalizat la nivelul dublului lan de ADN Materialul genetic poate fi izolat, iar cele 2

lanuri se separ i apoi se pot recombina

cu un alt lan strin complementar Aceste fenomene dau posibilitatea crerii

de noi organisme n condiii naturale sau delaborator


3/43

CROSSING-OVERTheimage cannotbe displayed.Your computer may nothaveenough memory toopen theimage,or theimagemay havebeen corrupted.Restartyour computer,and then open thefile again.If thered x stillappears,you may haveto deletetheimage and then insertit again.


4/43


PRICIPIUL METODEI Recombinarea natural (recombinarea

genetic) CROSSING-OVER schimbul

reciproc de fragmente de cromatide (gene)ntre cromozomii omologi alturai npachytenul meiozei 1

Recombinarea artificial (tehnologia ADN-ului recombinat) Genetic Engeneering Ingineria genetic


5/43


1953 J.D. Watson i Fr. Crick - Structuraspaial a ADN-ului

1970 SUA prima recombinare reuit

Pe cale artificial combinarea informaieigenetice de la 2 specii diferite: organism nourecombinat = modificat genetic = transgenic

Baza ingineriei genetice i a biotehnologiilor Implicaii majore n biologie molecular,

biochimie, genetic, farmacologie, medicin,agricultur


6/43


Unelte de lucru n tehnologia ADN-ului recombinat:

Enzimele de restricie ADN-ligazele

Vectorii


7/43

ENZIMELE DE RESTRICIE

Endonucleaze de origine bacterian care cliveazADN-ul strin (viral)

Metilarea reprezint un mecanism de aprare al

bacteriei (de protecie) fa de propriileendonucleaze Exonucleaze se fixeaz la captul lanului de

ADN Endonucleaze n interiorul moleculei de ADN

(endonucleaze de restricie) Enzime de restricie I, II, III Eco K si B

(Escherichia coli )


8/43

ADN-LIGAZELE

1967 descrierea primelor ADN-ligaze Nu pot lega 2 molecule ADN monocatenare Leag doar 2 lauri ADN din aceeai molecul

ADN dublu helix Formeaz o legtur fosfodiesteric ntre 3-OH

al unei extremiti i 5-P a celeilalte extremiti Consum de energie NAD+ sau ATP

Procesul de legare (linker) esenial n: sintezanormal a ADN-ului, repararea ADN-ului irecombinare genetic


9/43

VECTORII I. Vectorii de expresie:

1. Pentru sinteza unor cantiti maride proteine: plasmide, bacteriofagi,

cosmide, fagemide, secvene de inserie 2. De transcriere pentru sinteza

ARN-ului

Vectorii speciali 1. Retrovirusurile - ARN virusuri

conin reverstranscriptaz: HIV

2. Retrovirusurile i plasmid Ti


10/43

PLASMIDELE

Clasa major de elemente genice mobile Prezente la procariote (bacterii) i eucariote (plante

i animale) La procariote molecule de ADN dublu catenar

helix circular Dimensiuni: de la 2kpb cteva sute kpb ADN extarcromozomial (cromozomi accesorii),

neobligatoriu pentru supravieuire Componenete:

Una sau mai multe gene pentru o anumitproprietate (rezistena la antibiotice)

Un segment de replicare (factor de replicare) Un segment de transfer (factor de transfer)


11/43

BACTERIOFAGII

Virusuri care infecteaz bacteriile

Sunt obligatoriu parazii

mprumut aparatul metaboliccelular al gazdei pentru propriareplicare

Material genetic ADN sau ARN

(retrovirusuri), n form linear saucircular

Fagul , 80,


12/43


Etape Tierea lanurilor ADn dublu catenare cuenzimele de restricie

Rezult ADN monocatenar

Tierea ADN-ului vectorului Cele 2 fragmente se leag covalent cu ajutorul

ADN-ligazelor Introducerea n celula gazd a ADN-ului de

cercetat legat de vector Multiplicarea sincron, odat cu celula gazd a

ADN-ului de cercetat i al vectorului Obinerea unui nr. f mare de copii identice de

ADN recombinat = CLONARE DE ADN


13/43

RECOMBINAREA ADN-uluii INGINERIA GENETIC

Termenul de Genetic Engineering (Inginerie genetic) -adesea folosit ca similar cu recombinarea ADN-ului

n realitate Ingeneria genetic este doar ultima etap arecombinrii

Rezult un genom nou, celula avnd caractere aparte Ingineria genetic st la baza proceselor de biotehnologie Terapia genic (Gene Targeting): boli ereditare, infecia cu

HIV, boli neoplazice, boli cardio-vasculare, boli metabolice,vaccinuri recombinate

Aplicaii n agricultur i zootehnie (industria alimentar) Conservani alimnetari Ecologie poluare cu hidrocaburi


14/43

INGINERIA GENETICEtape

Se pornete de la matricea ADN-ului monocatenar Copie a ADN-ului monocatenar n prezena

reverstranscriptazei Se obine un lan de ADN dublu catenar

Clonarea acestuia Fragmentul clonat este nglobat ntrt-un vector de exprimare Vectorul este introdus n celula gazd receptoare n celula receptoare se produce transcrierea i translaia

fragmentului de ADN strin n final se obine protine dorit exemplu insulina sau

anumite enzime


15/43



16/43



17/43

SONDELE GENETICE Probe de acid nucleic (ADN sau ARN) marcate

radioactiv sau non-radioactiv pe o singur baznucleotidic

Conin o secven cunoscut de baze

Reprzint pricipalele unelte pentru metodelede hibridizare pentru analiza secvenei ADN-ului int

Se formeaz prin aceleai metode dehibridizare Blot (S i W) sau in situ

Se obin cu ajutorul enzimelor de restricie Etichetarea, reperarea, cartografierea tutror

genelor i a ntreg genomului


18/43

SONDELE GENETICE


19/43

SONDELE GENETICEMARCAREA

A. Marcarea radioactiv: Cu izotopi radioactivi: H3 (HIS) , S35, I125 i

P32 (Blotting)

B. Marcarea non-radioactiv: Marker: BIOTINA se va lega de uracil

Evidenierea biotinei prin legarea de AVIDINsau STREPTOVIDIN, care se leag la rndullor de un fluorocrom pentru o reacie de culoare


20/43

CLONAREA Clonarea bacterian- un grup de celule

bacteriene identice dpv genetic, care provindintr-o singur celul bacterian de origine

Clonarea ADN-ului se realizeaz printr-otehnic de recombinare a ADN-ului, urmat de

ncorporarea acestuia ntr-un vector ntroducerea ntr-o celul gazd i multiplicarea

sincron n biologia molecular, clonarea semnific

obinerea unei culturi de celule identice, de la ocelul unic, care conine un fragmentmultiplicat de acid nucleic de cercetat


21/43

CLONAREA ADN-ului

ETAPE Extragerea unui fragment de ADN, prin

tierea ADN-ului genomic cu enzime derestricie

Introducerea ADN-ului ntr-un vector

Introducerea vectorului recombinant ncelula gazd (plasmid cu ADN-ul destudiat) E. coli de obicei

Selectarea celulelor bacteriene care coninvectorul recombinant


22/43

CLONAREA ADN-ului


23/43

CLONAREA ADN-ului


24/43

CLONAREA ADN-ului


25/43

PCR POLYMERASE CHAIN REACTIONREACIA N LAN A POLIMERAZEI

PCR este folosit pentru cercetarea unorcantiti foarte mici de ADN dintr-un produsbiologic

Ofer posibilitatea ca dintr-o mixtur de ADN sse extrag o singur molecul de ADN, care sfie ulterior amplificat enzimatic

Spectru de aplicabilitate al PCR foarte larg:

medicin, oncologie, genetic, medicin legal,identificarea i crearea de noi virusuri saubacterii, arheologie, ecologie


26/43

PCR PRINCIPIUL REACIEI

ADN monocatenar se folosete dreptmatri

In vitro de la acest lan se formeaz princomplementaritate un nou lan, cuajutorul ADN-polimerazei i n prezenaunui oligonucleotid (15-20 nucleotide)

denumit primer sau amors Oligonucleotidul are un capt 3 OH

liber


27/43

PCR POLYMERASE CHAIN REACTIONREACIA N LAN A POLIMERAZEI

Avantajele PCR :

Foarte sensibil: poate evidenia chiarprezena unei singure molecule de ADN

Permite multiplicarea (clonarea) uneisingure secvene de ADN, chiar i n afaracelulei vii

Maini automate Thermal Cycler sauTermocycler

25-30 de cicluri de amplificare n 4 ore

Relativ uor de efectuat


28/43

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION

REACIA N LAN A POLIMERAZEI


29/43

PCR ETAPELE REACIEI

PCR pornete fie de la un ADN dublucatenar careva fi secionat i transformat n monocatenar, fiedirect de la un lan monocatenar

Denaturarea ADN-ului de cercetat (95C) conine secvena int

Scderea temperaturii i adugarea primeruluisau amorsei hibridizare la temperatur redus(36-65C)

Primerul trebuie s fie n exces pentru a

mpiedica renaturarea Sinteza unui nou lan cu ajutorul ADN-

polimerazei n prezena celor 4 tipuri denucleotide ADN (A, C, G, T)


30/43




31/43

PCR ETAPELE REACIEI

Fiecare ciclu se ncheie cu sinteza unui lan dublucatenar i ncepe cu denaturarea acestui lan n al doilea ciclu se folosete drept matri att

ADN-ul de origine, ct i ADN-ul nou sintetizat(datorit ADN-polimerazei)

Cu fiecare ciclu de denaturare-sintez se dubleazcantitatea de ADN rezultat din ciclul anterior(cretere exponenial)

Se repet 30-50 de cicluri, pn se obine

cantitatea necesar de ADN pentru celelaltereacii dorite (hibridizri, sonde, etc) Pentru evitarea erorilor se recomand repetarea

de mai multe ori a aceleai reacii pentru probadat i folosirea de controale negative


32/43

POLIMERAZELE FOLOISTE N PCR

n anii 1980 polimeraza Klenow (fragment de

ADN-polimeraz I de la E. coli) Dezavantaje termolabil Apoi Taq-polimeraza, termostabil, izolat de la o

bacterie termofil Thermus aquaticus

n acest fel s-a ajuns n prezent la automatizareacomplet a reaciei n mainile numite ThermalCycler

Dup 4 ore i aproximativ 25-30 de cicluri deamplificare se poate ajunge la o amplificare de 106109 ori

Produsele ADn obinute prin PCR se separ prinelectorforez n gel, benzile sunt citite cu UV

Apoi se realizeaz hibridizri prin metodele blotting

(Southern sau Dot)


33/43




34/43




35/43

APLICAIILE PRACTICE ALE PCR

Medicin:

Boli ereditare: fibroz chistic, distrofia muscularDuchenne, fenilcetonuria Boli infecioase: HIV (din stadiile precoce ale infeciei,

prin identificarea ARN-ului viral), hepatite virale,herpes virus, papiloma virus, EBV, bacterii Mycobacterium tuberculosis, Clostridium difficile,Neisseria meningitidis, parazii malaria,toxoplasmoz

Boale Whipple, malakoplakia, boala Crohn Medicin legal (fire de pr, celule, snge sau sperm) Biologie strudii de evoluie a speciilor, migraie uman,

fosile Ecologie evidenierea unor microorganisme din pmnt sau

ap care nu au putut fi cultivate n laborator pn n prezent Arheologie mumii egiptene


36/43

SECVENIEREA ADN-ului

Analiza structruii ADN-ului a nceput n anii 70 cumetodele de secveniere i de analiz a secvenelor denucleotide din aceste structuri

Se folosesc enzimele de restricie (endonucleaze) carepot tia fragmentele de ADn pn la cteva sute sau

mii de perechi de baze Aceste fragmente sunt apoi separate electroforetic i

analizate n Germania i SUA exist bnci de date n cre sunt

stnse toate secvenele de ADN cunoscute pn nprezent

1995 secvenierea complet a primului genombacterian Haemophilus influenzae, urmat la foartescut timp de cel al Mycoplasma genitalium

n prezent - genomul uman complet


37/43


Pricipiu: tierea lanului de ADN n segmente i analizaulterioar a secvenelor de baze nucleotidice

Prin descifrarea acestor secvene se pot delimita genele iimplicit, secvena de aminoacizi codificat de acea gen, nproteina final

Nu se pot obine, ns, informaii despre proceseleposttranslaionale pe care le sufer o protein, respectivstructura teriar i cuaternar a acesteia

Este o variant a tehnicii de recombinare a ADN-ului

Condiia necesar este existena unui nr. suficient de marede copii de ADN, obinut prin clonare sau PCR


38/43

SECVENIEREA ADN-ului i FINGERPRINTINGGENOMIC

Se folosesc 2 metode n prezent:

metoda enzimatic Sanger (chain TerminationTechnique) Metoda chimic Maxam-Gilbert )de obicei combinat cu

metoda Sanger) Amprente de ADN sau FINGERPRINTING genomic: pe baza

analozelor secvenelor de ADN, s-a demonstrat c fiecareindivid este unic i c este caracterizat printr-unfingerprinting genomic (o amprent unic de ADN)

Patternul individual unic este dat de regiunile hipervaraibiledin ADN-ul genomic, i anume de zona ADN-urilormicrosatelite

Genomul uman cuprinde 70% de secvene unice identice latoi indiviii i 30% secvene repetitive, specifice fiecruiindivid

Figerprintigul genomic (amprenta genetic) este caracteristicfiecrui individ, se suprapune parial la rude i poate fi identic

la gemenii univitelini


39/43


40/43



41/43



42/43


43/43

TEHNICI DE BIOLOGIE

MOLECULAR II

Documents

Tehnici de biologie moleculara oct 2009 II