Thème - bu.univ-ouargla.dz · Figure 07 observation microscopique de la souche S24 ... 3.3.1 Criblage et sélection des souches productrice des ... La microflore microbienne du lait

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Biologique

Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie

Filière: Biologie

Spécialité : Microbiologie fondamentale et appliquée

Présenté par : HADJ ABDERRAHMAN Hayet

Thème

Soutenu publiquement

Le : 09/06/2015

Devant le jury :

UKM Ouargla Présidente M.C.A Mme

. BOUDJENAH. S

UKM Ouargla Encadreur M.A. B Mme

. CHETHOUNA. F

UKM Ouargla Examinatrice M.A. B Mlle

. BALLA. A

Année universitaire : 2014/201

Recherche des substances à activité antimicrobiennes

produites par des souches bactériennes isolées à partir du

lait bovin

Liste des abréviations

ADH arginine dihydrolase

ATTC American Type Culture Collection.

FAO Food And Agriculture Organisation

Etc Et cetera

Sp Espèce

CO2 Dioxyde de carbone

LDH le lactate déshydrogénase

PH potentiel d'hydrogène

MRS Milieu de Man, Rogosa and Sharpe(1960)

MRS-BCP Milieu MRS additionné de Pourpre de Bromocrésol.

°C degré Celsius.

trs Tourres

h Heure

Mn Minute

Ml Millilitres

l Litre

g Gramme

Liste des figures

N° Titre Page Figure 1 Séquence et structure de lantibiotiques de type A (nisin) et B (mersacidin) et

de

« two-peptides lantibiotic » (lacticin 3147 A1 et A2

12

Figure02 Procédure expérimentale. 19 Figure 03 Conservation de longue durée des bactéries lactiques purifiées. 22 Figure04 montre la réalisation du test de réductase à déférents moments de

réductase 26

Figure 05 Isolement des Bactéries lactiques dans le milieu MRS à partir de

dilution 10-3

. 27

Figure 06 Purification des souches à gauche souche S18 et a droit souche S13 27 Figure 07 observation microscopique de la souche S24 Gx40 28 Figure 08 la coissance des souche lactiques déférents températures. 30 Figure 09 montre la croissance des souches lactiques a Ph=4 ;ph=9.6 Na cl 4 et à

6%. 31

Figure 10 Résultat de type de métabolisme 32 Figure 11 Résultat des tests des sucres sur plaque d‘Elisa 33 Figure 12 Résultat du test de lait de Sherman a gauche a 3% et a droit à 1% 34 Figure 13 Résultat de test de l‘hydrolyse de l‘arginine. 35 Figure 14 Résultats de test citrate sur milieu KMK (Kempler et Mc Kay

(1980). 35

Figure 15 Résultat de test de production dextrane isolats ensemencé sur le

milieu MSE 36

Figure 16 résultat du méthode des spots 37 Figure 17 activité antibactérienne de Lactococcus diacetilactis vis-à-vis

Staphylococcus areus ATCC 25923. 39

Liste des tableaux

N° Titre Page Tableau 01 Composition générale du lait de vache 03 Tableau 02 Les caractéristiques physico-chimiques 04 Tableau 03 Examen microscopique des souches isolées 28 Tableau 04 Résultat du test physiologique 29 Tableau 05 Résultat de profil fermentaire 33 Tableau 06 Identification des souches isolées 36 Tableau 07 Résultat des isolats producteurs de substance antibactérienne 37 Tableau 08 Résultat de l‗activité antibactérienne de Lactococcus diacelilactis

vis-à-vis Staphylococcus aureus 38

Tables des matières

Liste des abréviations

Liste des figures

Liste des tableaux

Tables des matières

Introduction 1

Chapitre : Recherche bibliographique

1-1) Définition 3

1-2) Composition et variabilité de la composition 3

1-3) Caractéristiques organoleptiques 4

1-4) Caractéristiques physico-chimiques 4

1-5) Caractéristiques microbiologiques du lait 5

1-5-1) Microflore lactique du lait 5

1-5-1-1) Sources de contamination 5

1-5-1-2) Microflore contaminante 6

1-5-1-2-1) Flore pathogène 6

1-5-1-2-2) Flore d'altération 6

1-5-2) Principales activités des microorganismes dans le lait 6

1-6) Les bactéries lactiques et leurs propriétés antimicrobiennes 7

1-6-1) Définition des bactéries lactiques 7

1-6-2) Propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques 7

1-6-2-1) pH et les acides organiques 7

1-6-2-2) Peroxyde d’hydrogène 8

1-6-2-3) Dioxyde de carbone 9

1-6-2-4) Diacétyl 9

1-6-2-5) Reutérine 9

1-6-2-6) Bactériocines 9

1-6-2-6-1) Classification 11

Chapitre II : Matériel et méthodes

2.1Matériel 17

2.1.1 Echantillon du lait de vache 17

2.1.2 Appareillage 17

2.1.2.1 Appareillage utilisée pour le test physico-chimique 17

2.1.2.2 Appareils utilisés pour les manipulations microbiologiques 17

2.1.3 Petits matériel et verreries 17

2.1.4 Réactifs 18

2.1.5 Milieux de culture 18

2.2 Méthodes 19

2.2.1 Tests physico-chimiques 20

2.2.1.1 PH 20

2.2.2 Analyse microbiologiques 20

2.2.2.1 Test de la réductase 20

2.2.2.2 Provenances de la souche cible 20

2.2.2.3 Isolement des bactéries lactiques 20

2.2.2.4 Purification des isolats 21

2.2.2.5 Conservation des isolats 21

2.2.2.5.1 Conservation des isolats a courte terme 21

2.2.2.5.2 Conservation des isolats a longue terme : 21

2.2.2.6 Identification des souches de bactéries lactiques 22

2.2.2.6.1 Étude macroscopique : 22

2.2.2.6.2 Étude microscopique 22

2.2.2.6.2.1 Coloration de Gram 22

2.2.2.6.3 Identification physiologiques et biochimique 23

2.2.2.6.3.1 Test de catalase 23

2.2.2.6.3.2 Test du Na Cl et du PH 23

2.2.2.6.3.3 Test de croissance à différentes température et de thermorésistante 23

2.2.2.6.3.4 Étude type de métabolisme 23

2.2.2.6.3.5 Recherche de l’arginine déhydrolase (ADH) 24

2.2.2.6.3.6 Etude du profil fermentaires 24

2.2.2.6.3.7 Production de dextrane 25

2.2.2.6.3.8 Utilisation du citrate 25

2.2.2.6.3.9 Test de bleu de Sherman (1937) 25

2.2.2.7 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées 26

2.2.2.7.1 recherche de la ou substance antimicrobienne 26

1. Méthode des spots

2.2.2.7.2 Mise en évidence de nature de la substance antimicrobienne 26

Chapitre III : Résultats et discussion

III. Résultats et Discussion 26

3.1 Tests physico-chimiques 26

3.1.1 Mesure de PH 26

3.2 Analyse microbiologique 26

3.2.1 Test de réductase 26

3.2.2 Résultats d’identification des isolats 26

3.2.2.1 Caractères macroscopique 27

3.2.2.2 Caractères microscopique 27

3.2.2.2.1 Coloration de Gram 27

3.2.2.3 Tests physiologiques et biochimique 29

3.2.2.3.1 Test de catalase 29

3.2.2.3.2 Test du tolérance au Na Cl et du PH et la croissance a déférents températures 29

3.2.2.3..3 Type de métabolisme 32

3.2.2.3..4 Test de fermentation des sucres 32

3.2.2.3.5 Test de bleu de Sherman 34

3.2.2.3..6 Hydrolyse de l’arginine(ADH) 34

3.2.2.3.7 Utilisation du citrate 35

3.2.2.3..8 Production de dextrane 36

3.3 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées 37

3.3.1 Criblage et sélection des souches productrice des substances antibactérienne 37

3.3.2 Mise en évidence de nature de la substance antimicrobienne 37

Conclusion 41

Références bibliographiques

Annexes

Introduction

1

Introduction

Le lait de vache a toujours été un aliment essentiel dans l‘alimentation. La

consommation de lait et de produits laitiers fait partie des préoccupations des gens grâce à sa

teneur bien connue en calcium et en protéines (PARAINGAUX , 1954).

En raison du sa composition physicochimique, le lait est considéré comme un

écosystème idéal pour la croissance de différents types de microorganismes (BELARBI,

2011). La microflore microbienne du lait cru, composée surtout des bactéries lactiques,

participe de façon importante à l‗élaboration des caractéristiques organoleptiques des produits

laitiers (CHAMMAS et al., 2006). Cette flore a la capacité de produire des substances

antibactérienne contre divers germes non souhaitables contaminant le lait. Parmi ces

substances on site ; les acides organiques (acide lactique), le peroxyde d‘hydrogène, les

produits aromatisants tels que le diacétyl et acétylaldéhide ; et des substances de nature

protéique nommées bactériocines. Ces derniers, ont la chance d‘être préoccupé par les

chercheurs en raison de leur grand pouvoir antagonisme.

Par cette capacité, l‘utilisation des bactéries lactiques permet de satisfaire les besoins

de point de vue sanitaire en industrie alimentaire, et permet d‘inhiber la prolifération des

microorganismes pathogènes et ainsi d‘assurer une bonne conservation des aliments (PAUL

ROSS et al., 2002).

De ce fait, nous nous sommes proposé de réaliser ce travail qui vise essentiellement de

recherche des substances antibactériennes notamment les bactériocines produite par des

bactéries lactique ;

La présente étude s‘articule autour de trois volets d‘investigations complémentaires :

Isolement et identification des souches lactiques à partir de lait de vache collectés dans

la région d‘Ouargla.

Sélection des souches lactiques productrices des substances antibactériennes.

Recherche de la nature des substances inhibitrice.

Chapitre

Chapitre I Recherche bibliographique

3

1. Lait cru

1.1 Définition

Le lait est une sécrétion mammaire normale d'animaux de traite obtenue à partir d'une ou de

plusieurs traites sans modification ou, il est destiné à la consommation sous forme liquide ou

subit un traitement ultérieur (FAO, 2000).

Le lait est un liquide sécrété par les glandes mammaires des femelles mammifères après la

naissance du jeune. C‘est un liquide de composition complexe, blanc et opaque, d‘une saveur

douce, d'une réaction ionique (PH) voisin de la neutralité. La fonction naturelle du lait est d‘être

un aliment exclusif des jeunes mammifères pendant la période critique de leur existence, après la

naissance, alors que la croissance est rapide et qu'il ne peut lui être substitué d'autres aliments. La

grande complexité de la composition du lait répond à cette fonction (ALAIS, 1984).

1.2 Composition et variabilité de la composition

Tableau 1 : Composition générale du lait de vache (VIGNOLA, 2002)

Constituants majeurs Variations limites (%) Valeurs moyennes (%)

Eau 85,5 – 89,5 87,6

Matières grasses 2,4 – 5,5 3,7

Protides 2,9 – 5,0 3,2

Glucides 3,6 – 5,5 4,6

Minéraux 0,7 – 0,9 0,8

Constituants mineurs Vitamines, enzymes,

pigments

Cellules diverses, gaz

De manière générale, le lait vue sa composition est un aliment naturellement complète comprend

quatre types de constituants importants, que sont : les lipides, constitués essentiellement de

graisses ordinaires (triglycérides), les protides (caséine, albumine et globuline), les glucides,

essentiellement le lactose, les sels. Mais de nombreux autres constituants sont présents en

quantité minime comme les vitamines, enzymes, nucléotides, gaz dissous; dont certains ont une

grande importance du fait de leur activité biologique.

Cette composition varie selon différents facteurs liés généralement aux animaux. Les principaux

sont : l'individualité, la race, les périodes de lactation, l'alimentation, la saison, l‘âge et l'espèce

(VIGNOLA, 2002).


4

1.3 Caractéristiques organoleptiques

La qualité organoleptique d‘un produit se dégrade au fil du temps, la durée de stockage, la

température et leur action lié affectent considérablement les attributs sensoriels totaux. Un lait

de bonne qualité organoleptique présente des caractéristiques typiques qui concernent la couleur,

l‘odeur, la saveur, la viscosité etc.

1.4 Caractéristiques physico-chimiques

Tableau 2 : Les caractéristiques physico-chimiques (BOURGEOIS et al., 1990)

Caractéristiques chimiques Valeurs

pH (20) 6,6 – 6,8

Densité 1,030 – 1,033

Température de congélation (°C) - 0,53

Caractéristiques physiques (g / 100g)

Teneur en eau 87,3

Extrait sec total 12,7

Taux de matière grasse 3,9

Extrait sec dégraissé 9,2

Teneur en matière azotée totale 3,4

Teneur en caséine 2,8

Teneur en albumine et globuline 0,5

Teneur en lactose 4,9

Teneur en cendre 0,90

Vitamines, enzymes et gaz dissous Traces


5

1.5 Caractéristiques microbiologiques du lait

Le lait contient peu de microorganismes lorsqu'il est prélevé dans de bonnes conditions

hygiéniques à partir d'un animal sain (moins de 103 germes/ml). Il s‘agit essentiellement de

germes saprophytes du pis et des canaux galactophores : microcoques mais aussi streptocoques

lactiques (Lactococcus et Lactobacillus).

Le lait cru est protégé contre les bactéries par des substances inhibitrices appelées "Lacténines"

mais leur action est de très courte durée (1 heure environ) (GUIRAUD, 1998).

D‘autres microorganismes peuvent se trouver dans le lait lorsqu'il est issu d'un animal malade.

Ils sont généralement pathogènes et dangereux au point de vue sanitaire.

1.5.1 Microflore lactique du lait

Elle fait partie de la flore normale du lait et se caractérise par son aptitude à fermenter le

lactose avec production d‘acide lactique et donc, abaissement du pH. Les ferments lactiques

laitiers constituent un groupe diversifié de bactéries qui ont néanmoins un certain nombre de

caractéristiques communes : elles sont à Gram positifs, catalase négatifs, anaérobies facultatifs

ou micro-aérophiles et hétérotrophes (ALAIS, 1984 ; CLAUDE et CHAMPAGNE, 1998).

L‘ensemble de ces caractères précieux permet aux bactéries lactiques un développement plus

rapide que les espèces considérées comme nuisibles (SAIED KOUDA et BOUDABOUS,

1994).

Très peu d‘espèces résistent à la pasteurisation basse (63°C pendant 30mn). Elles produisent

des substances inhibitrices et antibiotiques telles que la nisine, la « diplococcine », et «

l‘acidophine » qui sélectionnent les bactéries non lactiques au profil des bactéries lactiques.

Parmi les bactéries lactiques ayant comme habitat le lait, nous avons le genre Streptococcus,

Lactobacillus, Enterococcus, Leuconostoc et Aerococcus (LUQUET et CORRIEU, 2005).

1.5.1.1 Sources de contamination

Le lait est généralement contaminé par une grande variété de microorganismes d‘origines

diverses. Cette contamination peut provenir de l'animal (intérieur ou extérieur de la mamelle), de

l'environnement où se fait la traite (sol, atmosphère, eau, mains salles ...) et du matériel servant à

la collecte du lait (machines à traire, filtre, récipients,divers) mais aussi de l‘homme. Certains

microorganismes peuvent provoquer un danger pour le consommateur du lait cru ou de produits

fabriqués avec du lait cru. D'autres sont seulement des agents d'altération de ces produits ; ils

dégradent les composants du lait en donnant des produits de métabolisme indésirables

(RICHARD, 1990 et GUIRAUD, 1998).


6

1.5.1.2Microflore contaminant

Elle est composée de la flore pathogène et de la flore d‘altération.

1.5.1.2.1 Flore pathogène

Elle fait partie de la flore contaminant du lait. Les bactéries pathogènes pour l‘homme

peuvent être présentes dans le lait cru, ou dans les produits laitiers qui en dérivent. Elles sont

capables de provoquer des malaises chez les personnes qui consomment ces produits.

Les bactéries les plus importantes de cette flore pathogène sont le plus souvent mésophiles et les

principaux microorganismes pathogènes associés aux produits laitiers sont : Salmonella,

Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus cereus,

Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Campylobacter jejuni,

Shigella sonei et certaines moisissures (VIGNOLA, 2002).

1.5.1.2.2. Flore d'altération

Incluse dans la flore contaminant, la flore d‘altération causera des défauts sensoriels de goût,

d'arômes, d'apparence ou de texture et réduira durée de vie du produit laitier. Parfois, certains

microorganismes nuisibles peuvent aussi être pathogènes. L‘un n'exclut pas l‘autre. Les

principaux genres identifiés comme flore d'altération sont : Pseudomonas sp, Proteus sp, les

coliformes soit principalement les genres : Escherichia et Enterobacter, les sporulées telles que

Bacillus sp, Clostridium sp et certaines levures et moisissures (VIGNOLA, 2002 et RICHARD,

1990).

1.5.2 Principales activités des microorganismes dans le lait

Les activités métaboliques des microorganismes présents dans le lait peuvent avoir des effets

positifs ou négatifs sur l‘apparence, l‘odeur, la consistance ou la texture et le goût des produits

laitiers. Parmi ces activités on peut citer l‘acidification, la protéolyse, la lipolyse, la production

de gaz.

L‘acidification : c‘est une production d‘acide lactique à partir du lactose par les ferments

lactiques lors de leur croissance.

La protéolyse : c‘est la dégradation des protéines du lait avec formation de peptides, dont

certains donnent des mauvais goûts aux produits laitiers.

La lipolyse : c‘est la libération d‘acides gras à partir des triglycérides du lait, entraînant

un goût de rance.


7

La production de gaz : certaines bactéries (hétérofermentaires, bactéries telluriques) au

cours de leur croissance produisent des gaz. dans le cas de certains fromages on peut

assister à l‘apparition d‘un défaut d‘aspect, dû à la production de gaz, associé ou non à un

défaut de goût.

Enfin, certains microorganismes ne semblent pas présenter les inconvénients cités plus

haut. Leur présence en grand nombre dans le lait est toutefois est indispensable comme

les bactéris lactique.

1.6 Les bactéries lactiques et leurs propriétés antimicrobiennes

1.6.1 Définition des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène de microorganismes produisant de l‘acide

lactique comme produit principal du métabolisme. Elles sont non pigmentées, aérobie anaérobie

facultatives, Gram-positif, catalase négatives à l‘exception de certains genres à pseudocatalase et

tolérantes à des pH acides. Leur forme peut être coccoïde, coccobacillaire, ou bacillaire. Elles

sont généralement mésophiles. Sur la base des caractéristiques de fermentation, les bactéries

lactiques sont homofermentaires ou hétérofermentaires. Dans le premier cas, seul l‘acide lactique

est produit. Dans le second, en plus de l‘acide lactique sont produits de l‘acide acétique, de

l‘éthanol, du dioxyde de carbone et de l‘acide formique. Actuellement, les bactéries lactiques

regroupent douze genres bactériens différents : Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus,

Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Oenococcus, Weissella,

Aerococcus, Tetragenococcus et Vagococcus.

1.6.2 Propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques

Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques peuvent être associées à de nombreux

éléments. Elles résultent de l‘effet combiné de différents facteurs biologiques provenant de leurs

activités métaboliques.

1.6.2.1 PH et les acides organiques

Les produits principaux du métabolisme des bactéries lactiques sont les acides organiques. Les

acides organiques sont produits soit par la voie homofermentaire, soit par la voie

hétérofermentaire. Le métabolisme du pyruvate conduit à la formation uniquement d‘acide

lactique chez les homofermentaires tandis qu‘il conduit à la formation d‘acide lactique, acétique

et formique, d‘éthanol et de dioxyde de carbone chez les hétérofermentaires (LIU, 2003).

Grâce à cette production d‘acides organiques, les bactéries lactiques diminuent le Ph du milieu

dans lequel elles se multiplient en inhibant une partie de la flore qui s‘y développe.


8

Leur compétitivité est améliorée étant donné leur grande tolérance aux pH bas extra et intra

cellulaires. Outre la diminution du pH du milieu, l‘effet antagoniste des acides organiques résulte

de l‘action de leur forme non dissociée. En effet, la forme non dissociée de l‘acide peut traverser

passivement la membrane et acidifier le cytoplasme par libération du proton, ce qui affecte le

métabolisme cellulaire en inhibant certaines fonctions (KLAENHAMMER, 1993; BRUL et al.,

1999; CAPLICE et al., 1999; HSIAO et al., 1999; COTTER et al., 2003; JANSSEN et al.,

2007).

Selon Bru et al., (1999) Les acides organiques sont l‘un des agents classiques de préservation

des aliments et sont reconnus comme des additifs alimentaires.

Les acides couramment utilisés sont les acides benzoïque, sorbique, acétique, fumarique,

propionique et lactique. Ils sont utilisés pour prévenir ou retarder la croissance des bactéries

dégradant la nourriture (HSIAO etal., 1999). Le principal problème consécutif à leur utilisation

est la haute concentration nécessaire pour inhiber les bactéries pathogènes ou indésirables et qui

est parfois inacceptable pour le consommateur (KOBILINSKY et al., 2007).

La concentration inhibitrice minimale, qui est la plus petite quantité d‘acide qui peut empêcher la

croissance d‘un microorganisme, de chacun de ces acides doit être déterminée dans des

conditions précises de pH mais aussi d‘activité d‘eau, de température… (HSIAO et al., 1999).

1.6.2.2 Peroxyde d’hydrogène

Les bactéries lactiques ne possèdent pas de catalase typique contenant un noyau hème pour

dégrader le peroxyde d‘hydrogène en oxygène et en eau. Il peut s‘accumuler et être inhibiteur de

différents micro-organismes par l‘oxydation des lipides membranaires et la destruction des

structures des protéines cellulaires (ZALAN et al., 2005). Certaines bactéries lactiques peuvent

néanmoins se protéger contre le peroxyde d‘hydrogène qu‘elles produisent par la synthèse de

catalase hexamérique ou tétramérique contenant du manganèse et qui sont parfois décrites

comme étant des pseudocatalases (STRUS et al., 2006). La concentration de peroxyde

d‘hydrogène produite par des Lactobacilli varie entre 0,001 et 8 mM, en fonction de l‘espèce, de

la souche et des conditions de cultures (SAKAMOTO et al., 1998; KULLISAAR et al., 2002;

ZALAN et al., 2005; STRUS et al., 2006). Son action se manifestera aussi bien sur les germes

indésirables que sur ceux qui sont indispensables au bon déroulement de la fermentation. Il est

donc rarement utilisé pour son activité inhibitrice. D‘autre part, son action oxydante peut avoir

un effet néfaste sur la santé humaine (ZALAN et al., 2005).


9

Celui-ci est formé pendant la fermentation hétérolactique et crée un environnement anaérobie qui

inhibe les microorganismes aérobies. L‘accumulation de dioxyde de carbone dans la bicouche

lipidique peut causer un dysfonctionnement de la perméabilité (AMMOR et al., 2006).

1.6.2.4 Diacétyl

Il est synthétisé par différents genres de bactéries lactiques comme Lactococcus sp., Leuconostoc

sp., Lactobacillus sp. et Pediococcus sp. Le diacétyl (C4H6O2) est un des composants

aromatiques essentiels du beurre. Il a des propriétés antimicrobiennes qui sont dirigées contre les

levures, les bactéries Gram-négatif et les bactéries Gram-positif non lactiques, ces dernières y

sont néanmoins moins sensibles (El ZINEY et al., 1998). Les concentrations nécessaires à

l‘obtention d‘une inhibition sont de l‘ordre de 100 ppm, et sont supérieures à celles présentes

dans le beurre et susceptibles de provoquer son arôme (2 à 7 ppm) (CAPLICE et al., 1999).

1.6.2.5 Reutérine

La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est produite

comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobique du glycérol par certaines

espèces de Lactobacillus ainsi que par d‘autres genres bactériens non lactiques tels que Bacillus,

Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter et Clostridium (El-Ziney et al., 1998). La fermentation du

glycérol se déroule en deux étapes. Le glycérol sera tout d‘abord déshydraté par une « glycerol

deshydratase » pour former de la reutérine qui sera ensuite réduite en 1,3- propanediol par une

oxydoréductase. Cette deuxième étape est inhibée en l‘absence de glucose. La reutérine

s‘accumule alors dans le microorganisme producteur. A haute concentration, elle est excrétée

dans le milieu. Sa toxicité contre la cellule productrice limite sa production, certaines espèces

comme Lactobacillus reuteri y sont plus résistantes (VOLLENWEIDER, 2004).

La reutérine a un large spectre d‘activité. Elle a une action contre les procaryotes (Gram-positif

ou Gram-négatif), les eucaryotes, les virus, les champignons et les protozoaires.

Elle interfère avec la réplication de l‘ADN. Elle a des applications aussi bien dans le domaine

médical que dans le domaine alimentaire (VOLLENWEIDER, 2004).

1.6.2.6 Bactériocine

Le terme bactériocine à été réservé à des substances d‘origine bactérienne répondant à des

critères énumérés par Tagg et al, (1976), essentiellement selon la présence d'un élément

protéique biologiquement actif, un mode d'action qui est bactéricide, et un spectre

d'inhibition étroit. Cette description est la première a être proposée (BENABBOU, 2009),

toutefois elle s‘est avérée être limitante (STILES, 1994), c‘est pourquoi elle à subi des

modifications au cours du temps pour arriver a les qualifiées comme « des protéines ou

des complexes de protéines avec une activité bactéricide contre les espèces généralement


10

étroitement liées à la bactérie productrice » (KLAENHAMMER, 1988) « ou confinées dans la

même niche écologique » (KLAENHAMMER, 1993), cette définition reste la plus

largement acceptée (DORTU et al., 2009), sinon d‘autres plus récentes existent, définissent

les bactériocines, comme « des produits extracellulaires de la synthèse des ribosomes

bactériens, primaires ou modifiés, ayant un spectre d'activité bactéricide relativement étroit »

(BROMBERG , 2004), ou bien les décrivait comme étant « toute molécule de nature

protéique, synthétisée par voie ribosomique et douée d'une activité bactéricide ou

bactériostatique contre certaines bactéries Gram + proches de la souche productrice sur

le plan phylogénétique » (BENABBOU, 2009). Cette activité dirigée envers les

bactéries Gram +, peut être expliqué par la couche supplémentaire des bactéries à

Gram - composé de phospholipides, protéines et principalement par les lipopolysaccharides

« LPS », cette couche est ainsi la barrière de protection des Gram négatif (ABEE et al.,

1995 ; BROMBERG et al., 2004 ; DORTU et al., 2009). Dans la plus part des cas les

bactéries productrices exhibent une immunité spécifique contre leurs propre bactériocines

(JEEVARATNAM et al., 2005).

Les bactériocines forment un groupe hétérogène de protéines antibactériennes distinctes selon :

le spectre d'activité, le mode d'action, le poids moléculaire, l‘origine génétique ainsi que leurs

propriétés biochimiques (KLAENHAMMER, 1988 ; ABEE et al., 1995 ; DORTU et al.,

2009), dont la plupart sont cationiques, hydrophobes ou amphiphiles composées de 20 à

60 résidus d'acides aminés (Naidu, 2006). Ainsi grâce aux caractérisations biochimiques et

génétiques, quatre majeur classes existent répertoriées pour la première fois par

KLAENHAMMER (1993) : (I) les lantibiotiques, (II) des peptides, thermostables, (III)

d‘autre thermolabile, (IV) en quatrième rang des protéines complexes dont l'activité nécessite

l'association de fragments de glucides ou des lipides. La majorité des bactériocines

produites par les bactéries lactiques associées avec de denrées alimentaires appartiennent

aux classes I et II (JEEVARATNAM et al., 2005).

Par ailleurs, les bactériocines qui éveillent plus d'intérêt demeurent les bactériocines de

la classe I et ceux de la classe II. Les premières exercent généralement un large spectre

d'action antimicrobienne si comparées aux secondes dont la spécificité est étroite.

1.6.2.6.1.Classification

La classification des bactériocines produites par les bactéries lactiques est proposée

premièrement par Klaenhammer (1993) et modifiée par Nes et al, (1996) ; elles peuvent

être classées selon leurs caractères biochimiques et génétiques en quatre classes :


11

a) Classe I : Les lantibiotiques

Lantibiotiques, une abréviation désigne toute « lanthionine contenant des peptides

antibiotiques » (ASADUZZAMAN et al., 2009). Issue de synthèses ribosomale et rendu

bioactif par modification poste traductionnelle, ils constituent un groupe hétérogène de

poids moléculaire inferieure à 5 kDa, ce sont thermostables agissant sur la structure de la

membrane, ils sont largement modifiées après translation.

Résultats de la formation des acides aminés soufrés inhabituels, lanthionine et β methyl-

lanthionine. En effet, deux étapes cruciales sont nécessaires pour leur synthèse :

Premièrement, la sérine et la thréonine sont soumises à une déshydratation enzymatique pour

donner lieu à la déshydroalanine, respectivement (PARADA et al., 2007). L‘exemple le plus

connu de ce groupe c‘est la nisine (BRAODBENT et al., 1989).

Les lantibiotiques sont primitivement divisés en deux sous-classes basées sur les similarités

structurelles : Sous-classe « Ia » relativement allongées, flexibles et chargées positivement.

Généralement, elles agissent par la formation des pores dans la membrane cytoplasmique des

espèces cibles sensibles. La nisine c‘est le prototype de ce groupe. Et la Sous-classe « Ib » elles

sont globulaires, plus rigide dans leur structure, chargées négativement. Elles intervenir

par l‘interférence avec des réactions enzymatiques de la bactérie sensible (DEEGAN et al.,

2006).

Figure 1 : Séquence et structure de lantibiotiques de type A (nisin) et B (mersacidin) et de

« two-peptides lantibiotic » (lacticin 3147 A1 et A2) ( DORTU et al .,2008)


12

b) Classe II : peptides hydrophobiques thermostables

Des peptides de synthèse ribosomale bioactif après une modification poste traductionnelle

par clivage de la séquence peptidique N terminale (JEEVARATNAM et al., 2005 ; NAIDU,

2006). Ils sont de poids moléculaire inferieure à 10 kDa (faible taille), thermostable

jusqu‘au 121 °C, ayant une structure β-feuille, non-lanthionine. Elles ne contiennent pas

d‘acides aminés modifiés, leur point isoélectrique varie entre 8 et 10. Suivant leur action

anti-listeria et la diversité en structure, une classification plus exhaustive dont plusieurs

sous-classes a été suggérée, les uns typique (a, b, c, d), et un autre atypique (f). Toutefois il est

pertinent de noter qu‘uniquement deux sous classes sont communément utilisées : IIa et IIb

(NAIDU, 2006 ; TAHIRI, 2007).

Sous-classe IIa :

Ce sont des « cystibiotique » contenant quatre résidus cystéine (NAIDU, 2006). ils contiennent

de 27 à 48 acides aminés et ont tous une partie N-terminal hydrophobe contenant la séquence

consensus -Tyr-Gly-Asn-Gly-Val- ainsi qu‘un pont disulfure et une partie C-terminal moins

conservée, hydrophobe ou amphiphile qui détermine la spécificité d‘action (RICHARD et

al., 2006). Elles ont toutes une activité contre Listeria monocytogenes. Certaines bactériocines

des cette sous-classe contiennent également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-

terminal qui semble être important dans la stabilisation de la structure tertiaire. Il paraître par

ailleurs qu‘il leur conférerait une meilleure activité antimicrobienne (DORTU & THONART.,

2009). Cette sous-classe contient les bactériocines leucocin A, mesenterocin Y105, pediocin

PA-1 et curvacin A (Tableau 1.5) (KLAENHAMMER, 1993 ; ENNAHAR et al., 1999 ;

NAIDU, 2006).

Sous-classe IIb :

Forme la plus grande sous classe. Ce sont des cystibiotiques contenant un pont S-S dans la

moitié N-terminale. Elles comprennent les bactériocines ayant besoin de deux peptides pour

être actives, il y a deux types de bactériocines qui peuvent être distingués : le type E

(Enhancing) ou la fonction d‘un des deux peptides est d‘augmenter l‘activité de

l‘autre et le type S (Synergy) ou les deux peptides sont complémentaires (DORTU et al.,

2009). Dans ce groupe il ya lactococcin G et plantaricins EF et JK (PARADA et al., 2007).

Sous-classe IIc :

Ce sont cystibiotiques dépourvues de la séquence consensus -Tyr-Gly-Asn-Gly- Val- (celle


13

de classe IIa et IIb), et ayant un pont S-S qui s‘entent sur la section N et C- terminale

(NAIDU, 2006 ). Elles sont de petits peptides thermostables qui sont transportés par

des peptides-leader. On trouve les bactériocines divergicin A et acidocin B (PARADA et

al., 2007).

c) Classe III : Protéines thermolabiles

Elles amassent les protéines de taille supérieure à 30 kDa thermolabiles, la structure et le

mode d‘action est complètement différent des autres bactériocines produites par les LAB.

Cette classe ne contient que quatres bactériocines : helveticin J produite par Lactobacillus

helveticus A, helveticin V, enterolysin A produite par Enterococcus faesium, zoocin

produite par Spreptococcus zooepidemicus et la millericin B produites par Streptococcus

milleri, on peut ajoute acidofilicin A, lactacin A et B (PAPAGIANNI, 2003 ; DORTU et

al., 2007 ; PARADA et al., 2007).

d) Classe IV : Protéines complexes

Des peptides nécessitant un groupement carbohydraté (glycoprotéines) ou lipidique

(lipoprotéines) afin d‘être active. Elle regroupe la plantaricin S, leuconocin S, lactocin 27,

pediocin SJ-1 (NAIDU, 2006 ; KLAENHAMMER, 1993). Néanmoins, aucune

bactériocine n‘a été purifié pour cette classe ; ceci est due probablement aux

propriétés cationiques et hydrophobes leurs permettant la formation de complexes avec

d‘autres molécules présentent dans l‘extrait brut, un phénomène déjà observé avec la

plantaricin S (CLEVELAND et al., 2001 ; DORTU et al., 2009 ).

Chapitre II

Chapitre II Matériel et méthodes

15

Chapitre II : Matériel et méthodes

2.1Matériel

2.1.1 Echantillon du lait de vache

Les échantillons du lait proviennent des vaches sainent de la région d‘Ouargla, ils ont

reçu le 15-02-2015, auprès des éleveurs. Dont les mamelles sont lavés avec l‘eau

savonneuse ; les échantillons sont recueillis dans des flacons de 250 ml stériles et conservés à

4°C, il transporté au laboratoire ou ils sont analysés.

2.1.2 Appareillage

2.1.2.1 Appareillage utilisée pour le test physico-chimique

-PH-mètre (Inolab MLM)

2.1.2.2 Appareils utilisés pour les manipulations microbiologiques

- Autoclave (Systec 5075 MLV)

-Etuve bactériologique (Memmert)

- Vortex (Heidolph)

- Balance de précision (Sartorius)

- Bain marie

- Loupe binoculaire (Carl Zeiss)

- Plaque chauffante agitant (Fisher)

- Microscope optique (Laboscope 200);

-Micropipette (1000μl (Capp)

- Four Pasteur

- Centrifugeuse

-Incubateur (HERAEAUS);

-Centrifugeuse max 10000 tours /min (Universal 16 R).

2.1.3 Petits matériels et verreries

Pipettes Pasteur, flacons en verre (de 250 ml), tubes a essais en verre, pipettes graduées (1ml,

5ml, 10ml), boites de pétri en plastique de 90 mm, béchers de 250,500 et 1000 ml, des Erlen

myers, burette, anse de platine, cloches de Durham …..


16

2.1.4 Réactifs

-Eau physiologique,

- Bleu de Méthylène,

- Réactifs pour coloration du GRAM,

- L'eau oxygénée,

2.1.5 Milieux de culture ( Voir l’annexe …..)

- MRS (De Man, Rogosa et Sharpe) bouillon et gélose (Fluka)

-MSE , KMK

- MRS BCP

-L‘eau physiologique

-Milieu Muller – Hilton

-Bouillon Nutritif (BN)


17

2.2 Méthodes

Figure02 : Procédure expérimentale.

Le lait de vache

Isolement des bactéries

lactiques sur : Milieux

MRS

Purification Par: repiquage

successif

Centrifugation 4000 trs/ min

Identification

Surnageant (substance

anti –microbienne)

Test de l’activité antimicrobienne (spots) avec la

souche cible

Culture des souches

en bouillon MRS

Culot

Interprétation des résultats


18

2.2.1 Tests physico-chimiques

Les échantillons de lait subit de test physico-chimiques consistant la détermination du PH.

2.2.1.1 PH

La mesure du PH est réalisée par PH-mètre (Inolab MLM). L‘électrode de référence pour la

mesure de la concentration en ions H+ (donc du pH) est l‘électrode à l‘hydrogène.

Celle-ci en platine, spécialement traitée, est immergée dans la solution dont le PH doit être

mesuré (LEHNINGER, 1981).

2.2.2 Analyse microbiologiques

2.2.2.1 Test de la réductase

Le test de la réductase permet d‘estimer la charge microbienne des échantillons de lait

collectés. Son principe est basé sur la décoloration du bleu de méthylène. La rapidité de cette

décoloration est directement proportionnelle au nombre de germes présents (LARPENT et

al., 1997). Plus l‘activité microbienne est forte, plus courte sera la durée de décoloration des

Echantillons (RYFFEL, 2006).

2.2.2.2 Provenances de la souche cible

La souche cible utilisé dans ce travail c‘est Staphylococcus aureus ATTC 25923

provienne de l‘laboratoire d‘analyse médicale d‘hôpital de wilaya d‘Ouargla.

Nous avons choisi cette souche pour plusieurs raisons :

elle est sensible aux bactériocines (CHOI, 2000 ; ALLOUCHE et al.,2010) Cette

espèce appartient à la flore de contamination pathogène des produits alimentaires

(TRIAS, 2008).

C‘est une espèce que l‘on peut retrouver dans le lait, mammiteux (LARPENT et al.

,1997) ;

elle est résistante aux antibiotiques (RAHAL, 1984) ;

c‘est une espèce pathogène, responsable de nombreuses affections chez l‘homme et

chez l‘animal ((SIBOUKEUR, 2011).

2.2.2.3 Isolement des bactéries lactiques

Les milieux de culture utilisés étaient des milieux liquide ou solide de MRS, la stérilisation

des milieux est réalisée par autoclave à 120°C pendant 20min

Les échantillons de lait dilué par la méthode de dilution décimale (10-1

à 10-6

) dans l‘eau

physiologique (9%° Na Cl) (voire l‘annexe), pour besoin de comptage trois dilution sont

choisies10-3

,10-4

et 10-5

, dont nous avons ensemencés 1 ml par étalement en surface.

Les boites incubées à 30°C pendant 24H à 48 H.


19

2.2.2.4 Purification des isolats

Après croissance des colonies de couleur blanchâtre ou laiteuse ont été appliqués sur

lesquelles des tests préliminaires comprenant la coloration de Gram et le test de catalase.

Seules les souches à Gram positif et catalase négative ont été retenues et repiquée sur bouillon

MRS. L‘opération est renouvelée jusqu‘à l‘obtention d‘une culture pure, dont la pureté est

estimée par observation microscopique après coloration de Gram. (BADIS et al.,2006) .

2.2.2.5 Conservation des isolats

2.2.2.5.1 Conservation des isolats a court terme

La conservation des isolats se fait sur milieu MRS solide dans des tubes inclinée après

incubations à 30°C pendant 18 H, Les tubes sont conservé a +4 °C, le renouvellement des

cultures se fait tous les 2 semaines (SAIDI et al .,2002).

2.2.2.5.2 Conservation des isolats a longue terme

A partir des cultures jeunes (18-48 h) sur milieu liquide, les cellules sont récupérées par

centrifugation à 8000 t/min pendant 5 min. Une fois le surnageant éliminé, on ajoute le

milieu de culture de conservation (MRS à p H 6.8 et 30% glycérol) sur le culot.

Les cultures sont conservées en suspension dense et en tubes Eppendorfs à -15°C. Indiquent

que des suspensions très concentrées résistent mieux à la congélation. En cas de besoin,

les cultures sont décongelés lentement (entre 25°Cet 30°C) et agiter dans le vortex. (SAIDI

et al., 2002).


20

Figure 03 : Conservation de longue durée des bactéries lactiques purifiées.

2.2.2.6 Identification des souches de bactéries lactiques

Suite à la purification des isolats, dix sept souches ont été retenues, dont nous avons

étudié les genres conformément au protocole de (CARR et al., 2002).

2.2.2.6.1 Étude macroscopique :

Une observation macroscopique permet de décrire l‘aspect des colonies, obtenues sur

milieu solide (taille, couleur, forme, aspect,).

2.2.2.6.2 Étude microscopique

L‘observation microscopique au grossissement (G x100) permet de classer les bactéries selon

leur Gram, leur morphologie cellulaire, leur mode d‘association (JOFFIN et LEYRAL,

1996).

2.2.2.6.2.1 Coloration de Gram

La coloration de GRAM est la coloration de base de la bactériologie. C‘est une coloration

double qui permet de différencier les bactéries, non seulement d‘après leur forme mais aussi

d‘après leur affinité pour les colorants, liée à la structure générale de la paroi.

(SIBOUKEUR, 2011). (Voir l‘annexe°1).

Culture jeune de 18H sur

bouillon MRS

Centrifugation a 8000 tr/10 mn

Culot est additionné de 2 ml de

MRS et 30% de glycérole

Répartition dans des tubes

eppendorfs

Conservation a -20°C


21

2.2.2.6.3 Identification physiologiques et biochimique

2.2.2.6.3.1 Test de catalase

Ce test à pour but de différencier les bactéries lactiques (catalase-) et des autres souches non

lactiques (catalase +).

Le catalase est un enzyme qui est capable de décomposer l‘eau oxygénée selon la réaction :

2H2O2 2H2O + O2

Une colonie est mise en suspension avec une ou deux gouttes de solution de peroxyde

d'hydrogène diluée au dixième (sur une lame). La réaction positive se traduit par un

dégagement immédiat de bulles de gaz et le contraire est négatif (MARCHAL et al., 1991).

2.2.2.6.3.2 Test du Na Cl et du pH

Ce test nécessite l‘emploi de trois milieux MRS liquides ; l‘un contenant 4% de NaCl (4g de

NaCl par 100ml de milieu), et le deuxième 6 % et le derniers 9 %. Ces milieux ont été en

incubée à 30°C pendant 24 a 48H.

Et l‘autre test consiste a préparée trois milieux de culture de différentes PH à PH=4, PH=6.8

et PH=9.6.

Les souches sont ensemencées et incubées à 30 °C de 24 à 48 H.

2.2.2.6.3.3 Test de croissance à différentes température et de thermorésistance

On à ensemencé les isolats dans du MRS liquide et qu‘on à incuber à 4°C, 15°C et à 45°C

(CARR et al, (2002), (BADIS et al., 2005).

autre série de tube à subit un chauffage à 63°C au bain Marie pendant 30 min puis on à

incubé à 30°C pendant 24h a 48h (BADIS et al., 2004). Ces tests vont nous aider à

distinguer les souches mésophiles et des thermophiles, ainsi que les thermorésistantes.

2.2.2.6.3.4 Étude type de métabolisme

Pour l‘étude de métabolisme on verse le milieu MRS liquide sur des tubes à essai contenant

des cloches de Durham et on autoclave les tubes pour 15 minutes à 120°C. L‘ensemencement

est suivi d‘une incubation 24 h à 30 ° C.

Le métabolisme oxydatif se traduit par l‘absence de gaz et les cloches restent au fond des

tubes. Le flottement des cloches signifie la présence des gaz et un métabolisme fermentaire.

(GUIRAUD, 2003).

Catalase


22

2.2.2.6.3.5 Recherche de l’arginine déhydrolase (ADH)

Le test arginine déshydrolase sert à déterminer si la bactérie transforme l‘arginine par

l‘arginine déshydrolase, la réalisation de test se fait comme de la manière suivante :

A l‘aide d‘une pipette de Pasteur, on ensemence le milieu M16 BCP (milieu M16 solide

avec un indicateur de PH : le pourpre de bromocrésol), avec l‘inoculum de la bactérie à

identifier (préparé à partir d‘une culture de 18 à 24 h avec de l‘eau physiologique), on ajoute

quelques gouttes d‘huile minérale stérile, on incube à 30°C pendant 24 à 48 h. A la suite de

l‘incubation, on lit la réaction obtenue :

-réaction positive : si le milieu demeure rose

-réaction négative : si le milieu devient jaune orangé (JOFFIN et LEYRAL, 2006).

2.2.2.6.3.6 Etude du profil fermentaires

Ce test a été réalisé sur le bouillon MRS BCP dépourvu de l‘extrait de viande et sans

glucose (BADIS et al 2005), répartit dans les trous de la plaque d‘Elisa.

Les solutions du sucres sont préparée a raison de 1g par 100 ml stérilisé 10mn à 100 °C au

bain marine, la source carbonée est représenté par l‘un des onze sucres suivants :Arabinose,

Glucose, Lactose, Maltose, Melibiose, Mannitol, Saccharose, Sucrose, Tréhalose,

Rhamnose, Sorbitol et Xylose.

Dans des eppindorfs stérile on mets 1 ml de culture jeune après en les centrifuge 8000 trs

/5mn, après élimination du milieu de culture on ajoute 1 ml de l‘eau physiologique stérile

au culot , en suite cet eppindorfs subit double centrifugation, après le rinçage on ajoute 1 ml

de milieu MRS BCP, la solutions résulte subit une agitation par le vortex pendant 60

secondes.

Dans les plaques Elisa remplis par le milieu liquide MRS BCP on ajoute par ordre les

solutions des sucres et autre fois la suspension bactérienne.

Le résultat après incubation à 30°C/24h à 48h, nous distinguons le virage de milieu de

violet au jaune et cela indique que la souche lactique a put fermenter cette source de

carbones lors de sa croissance.

Rappelons que la techniques se faite a proximité de buc bunsen et en condition stérile.


23

2.2.2.6.3.7 Production de dextrane

La production du dextrane à partir du saccharose est mise en évidence sur milieu solide MSE

(MAYEUX et al., 1962). Les souches productrices de dextrane sont caractérisées par la

formation de colonies larges, visqueuses et de couleur bleu, et les colonies blanchâtre ne

produit pas le dextrane.

2.2.2.6.3.8 Utilisation du citrate

L‘utilisation du citrate est étudiée par l‘ensemencement sur milieu Kempler et Mc Kay

(1980).Les colonies qui fermentent le citrate et les utilisent comme source de carbone et

d‘énergie résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu foncé (après 18 h-72

h d‘incubation a 30°C). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches.

2.2.2.6.3.9 Test de bleu de Sherman (1937)

Ce test se fait a évaluer l‘aptitude des souches lactiques a décolorer le bleu de méthylène a

différentes concentrations dans le lait écrémé (1 et 3%), ce test sert a se différencier entre

les lactocoques et les enterocoques.

Donc nous avons préparé le lait écrémé mélangé avec l‘indicateur coloré le bleu de méthylène

à différentes concentration ( 1% et 3%) ont été mis dans un tube à essai qui est autoclavés

pendant 15 min à 110 °C. Après refroidissement, les tubes a été inoculé par 0,5 ml d‘une

culture jeune de l‘isolat, incubé à 24h/30°C.

La réaction positive est remarquée par la réduction de bleu de méthylène vers le transparent et

coagulation du lait (BENDIMERAD, 2013 ; MAGHNIA, 2011).

Sucre

So

uch

e lactiq

ues


24

2.2.2.7 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées

2.2.2.7.1 Recherche de la substance antimicrobienne

La recherche d‘éventuelle production de substances inhibitrices par les bactéries isolées est

réalisée selon la méthode des spots :

Après avoir coulé les boites de pétri de 80mm avec de milieu de culture MRS solide

(solidifiées et séchées) on dépose 5μl de surnageant en spots .Les boites sont séchées à l‘air

ambiant près du bec bunsen pendant environ 30 minutes. La gélose est recouverte d‘une

gélose semi molle du milieu MRS ensemencée avec la souche cible (Staphylococcus

aureus).Les boites sont incubées 24 heures à 30 °C (SCHILLINGER et LUCKE.,1989)

La présence des zones claires autour d‘un trouble qui vont apparaitre signifie que cette

bactérie lactique productrice peut inhiber cette souche pathogène.

2.2.2.7.2 Mise en évidence de nature de la substance antimicrobienne

Le but de ce test est de prouver que la substance antimicrobienne élaborée par les isolats est

de nature protique, de ce fait nous avons éliminé la possibilité d‘être un peroxyde

d‘hydrogène par l‘ajoute de quelques gouttes de catalase ou bien d‘une suspension de

Staphylococcus aureus, et la possibilité d‘être un acide organique par neutralisation de

milieu (à PH 6.8).

A partir des cultures jeunes (suspension bactérienne incubée dans MRS liquide pendant

18H à 30 °C), un volume de 15ml a été prélevé et centrifuge à 4000 tours/ 30min. au

préalable, des boites de pétri contenant un milieu MRS, Miller-Hilton qui sont

ensemencées par souche cible (Staphylococcus aureus). Avec l‘ambon 5 puits sont fait

dans le milieu solide dont nous avons les rempli avec le surnagent comme suit :

Le premier puits : contenant surnagent non traité (témoin).

Le deuxième puits : contenant surnagent qui a été traité par l‘enzyme protéolytique,

la pepsine.

Les trois autre puits : contenant surnagent qui a été subit un traitement de déférentes

températures à 70°C, 90°C et à 110°C pendant 30min respectivement.

Le tous est incubé à 37°C pendant 24H.

Chapitre III

Chapitre III Résultats et discussion

26

III. Résultats et Discussion

3.1 Tests physico-chimiques

3.1.1 Mesure de PH

On a obtenue un PH =6.5 c‘est un PH plus au moins acide, l‘acidification du lait jusqu‘à sa

coagulation se faite par l‘activité des bactéries lactiques autochtones, l‘acidification due a la

fermentation des sucres par les BL (El BARADEI et al., 2008).

3.2 Analyse microbiologique

3.2.1 Test de réductase

La décoloration du bleu de méthylène par le lait vache analysé a eu lieu après une durée

supérieure à 4 heures. Ce lait est par conséquent de bonne qualité bactériologique. Il renferme

moins de 2 .106 germes /ml (LARPENT, 1970 ; GUIRAUD ,1998). La décoloration du bleu de

méthylène est due au métabolisme bactérien et sa rapidité est directement proportionnelle au

nombre de germes.

On constate que le lait de vache est de bonne qualité microbiologique et riche en flore lactique.

à l‘instant

Après plus de 4 heures

Figure04 : Réalisation du test de réductase

3.2.2 Résultats d’identification des isolats

L‘identification des souches isolées à partir de lait bovin cultivée sur milieu MRS en

surface, est basée sur des observations macroscopiques, microscopiques, et sur des tests

physiologiques et biochimiques


27

3.2.2.1 Caractères macroscopique

La caractérisation macroscopique permet d‘isolement vingt souches susceptibles d‘être lactique

par sa forme régulier de 1 à 2 mm, couleur laiteuse et blanchâtre (fig05) qui été ensemencé sur

milieu MRS solide et liquide.

Les colonies qui possèdent des critères loin des critères des bactéries lactiques sont éliminées

(Forme irrégulier couleur non blanchâtre ou laiteuse).

Figure 05: Isolement des Bactéries lactiques dans le milieu MRS à partir de dilution 10-3

.

Figure06: Purification des souches à gauche souche S18 et a droit souche S13.

3.2.2.2 Caractères microscopique

3.2.2.2.1 Coloration de Gram

L‘examen microscopique après la techniques de coloration de Gram à montré que la plus part

des souches lactiques pures isolée à partir du lait de vache cru sont des bactéries à Gram

positifs (+) et en forme : coques, coccobacille. Le mode d‘association varie d‘une souche à

l‘autre, il est expliqué dans le tableau (N°2), Ces observations permettent de classer


28

initialement les isolats selon le Gram, leurs morphologies cellulaires et leur mode d'association

(JOFFIN et LEYRAL, 1996).

Tableau 03 : Examen microscopique des souches isolées.

Code de la souche Coloration de Gram Forme Mode d‘association

S1 + coccus Grappe

S7 + coccus Diplocoques/chainette

S11 + coccus Diplocoques/chainette

S12 + coccus isolée/chainette

S13 + coccus Diplocoques /chainette




S19 + coccus Isolée/chainette


S25 + coccus Isolée/chainette

S1’ + coccus Isolée/chainette


S18’ + coccus Diplocoques /chainette



S23’ + Coccobacille Diplocoques/chainette

S25’ + Coccus Isolée /chainette

Figure 07: Observation microscopique de la souche S24 Gx40


29

3.2.2.3 Tests physiologiques et biochimique

3.2.2.3.1 Test de catalase

Pour l‘identification des bactéries lactiques il est nécessaire d‘appliqué le test de recherche

d‘enzyme catalase, généralement les BL sont dépourvue de cette enzyme mais certain souches

peut donner des résultats aléatoires puisque certaines bactéries lactiques possèdent des pseudo-

catalases, qui rendent la réaction positive (DESMAZEAUD et DE ROISSART ., 1994).

3.2.2.3.2 Test de la tolérance au Na Cl et du PH et la croissance a déférents températures

On a constaté qu‘il y des souches ne peuvent se croitre sur le milieu MRS à PH=4 et la plus

part peuvent se croitre sur le milieu MRS a PH= 9.6.

Nous avons été observe que la plus part des bactéries lactiques tolèrent la déférente

concentration de Na cl, d‘autre souche ne peux pas se croitre sur les milieux à 6% de Na cl tel

que : S7, S13, S14, S15.

On note que les souches qui tolèrent le PH acide et la concentration élevé de Nacl sont des

probiotiques (PINEIRO, STANTON.,2007) .

Le test de croissance a déférents température a montré que la plus part des bactéries peuvent

pousser entre 4 °C, 15 °C et 37°C sont des mésophile ,et d‘autre pousser a des température élevé

62°C sont des thermophiles .

Tableau 04: Résultat du test physiologique.

PH T° Na cl

souches 4 9.6 4° 15° 37° 45° 62° 6% 4% 2%

S1 - + - + + + + + + -

S7 + + - + + + + - + +

S11 + + - + + + + + + +

S13 + + - + + + + - + +

S14 + - - - + - + - + +

S15 + + - + + + + - + -

S17 + + - + + + + - + +

S19 + - - + + + + + + +

S22 + - - + + - + + + +

S25 + - - + + - - - + +

S1‘ + - - + + - + - + +

S17‘ + + + + + + + + +

S18‘ + - - + + - - + + +

S19‘ - - - - + - + - + +

S21‘ + + - + + + + + + +

S23‘ + - + + + - - - +

S25‘ + + - + + - - + + +

+ :croissance, - pas de croissance


30

Figure 08: Résultat de la croissance des souches lactiques à déférents températures.

Croissance à 15°C.

Croissance a 15 °C


31

Figure 09: Montre la croissance des souches lactiques a PH=4 ; PH=9.6 Na cl 4% et à 6%.


32

3.2.2.3..3 Type de métabolisme

Dans la présente étude nous avons constaté que 77% des souches isolée a partir du lait bovin sont

homofermentaire et 23 % sont hétérofermentaire distingué par la présence d‘un gaz du CO2

dans la cloche du durham inversé dans le tube a essai (figure12)

Figure10: Résultat de type de métabolisme

3.2.2.3..4 Test de fermentation des sucres

La détermination des genres et des espèces bactériennes, réside essentiellement dans leur

capacité à fermenter les sucres en acide lactique et autre acide organique l‘analyse des profils

fermentaires (tab) révèle une grande diversité métabolique des carbohydrates chez les isolats

retenus

Production du gaz

dans la cloche de

durham


33

Tableau 05 : Résultat de profil fermentaire

Tré

hal

ose

Su

cro

se

rham

no

se

Xy

lose

Mal

tose

Glu

cose

Lacto

se

Saccharo

se

arab

ino

se

sorb

itol

Ty

pe

ferm

enta

ire

1 - - - - - + + + + + Homo

7 - - - - + + + + + + Homo

11 + + + + + + + + + + Hétéro

13 + + + + + + + + + + Homo

14 + + + + + + + + + + Homo

15 + + + + + + + + + + Hetero

17 + + + + + + + + + + Homo

18 - + - - - - - - - - Homo

19 + + + + + + + + + + Homo

22 + - - + - + + - - + Homo

25 + + - - + - + - - + Homo

1‘ - + - - - + - - + + Homo

17‘ + + - - + + - - + + Homo

19‘ - + - - + + - - + + Hétéro

20‘ + + + - + + + + + + Homo

21‘ - - - - - + + - - + Homo

23‘ + - - - - - - - - - Hetero

25‘

- + - - - - + + - - Homo

+ :fermentaion du sucre,- pas de fermentation .,homo :homofermentaire,

hétéro :hétérofermentaire

Figure 11: Résultat des tests des sucres sur plaque d‘Elisa

Jaune : fermentation du sucre résultat (+)

Violet : pas fermentations du sucre résultat (-)


34

3.2.2.3.5 Test de bleu de Sherman

Les résultats positive de ce teste (c‘est après l‘incubation 24h a 30°c) sont expliqué par la

capacité de réduction de bleu de méthylène et l‘aptitude de la coagulation du lait, nous avons

montré que sauf trios souche qui ne peut pas réduire le colorant à 3 % de 1% et les autres ont

cet aptitude et pour le pourcentage de 3% nous avons retenu 11 souches.

Les souches qui peuvent réduit le bleu de méthylène sont de type respiratoire aérobies tiré leur

oxygène a partir de bleu de méthylène qui vas virer vers le transparent, et si sont anaérobie

peuvent réduire sauf la solution de 1% de ce colorant (bleu de méthylène) (RABAH.2010).

Figure 12 : Résultat du test de lait de Sherman

3.2.2.3..6 Hydrolyse de l’arginine(ADH)

Une culture de 18H a été ensemencer sur milieu M16 BCP (annexe) qui contient L-

arginine (4g par litre), 6 souches de notre isolats sont dégradé l‘arginine après utilisation le

lactose présent dans le milieu, ses souches possèdent l‘enzyme (l‘arginine décarboxylase).

Les autres souches ne subit aucun changement de couleur ne possèdent pas l‘enzyme pour

dégradé l‘arginine (fig13).

Cet enzyme est mis en évidence par le changement de couleur de violet vers le jaune qui est

expliquée par l‘acidification du milieu par les souches lactiques en utilisant le glucose comme

source de carbone et d‘énergie puis un virage vers le violet qui est due a la formation

d‘ammoniaques (NH3). (MAGHNIA ,2011).


35

(A) Absence d’ADH (B) Présence d’ADH

Figure 13 : Résultat de test de l‘hydrolyse de l‘arginine.

3.2.2.3.7 Utilisation du citrate

Le milieu KMK contient une solution de ferricyanide de potassium et une solution de

citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l‘ion ferrique et le

ferricyanide de potassium. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la réaction entre ces

ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu foncé (après 18 h-72 h

d‘incubation). Nous avons montré que nos souches (fig 14) incapables de fermenter le citrate

restent blanches (KIHEL ,2006).

Figure 14:Résultats de test citrate sur milieu KMK (KEMPLER et Mc KAY (1980).

B A


36

3.2.2.3..8 Production de dextrane

La production de dextrane a été fait sur milieu MSE qui est un milieu hypersaccharosé

(MAYEUX et al., 1962 ; BADIS et al., 2005). Dont nous avons montré que nos souche ne

produit pas le dextrane.

Figure 15 : Résultat de test de production dextrane isolats ensemencé sur le milieu MSE

D‘après l‘observation macroscopique, microscopique et les testes physiologique et biochimique

d‘identification, nous avons pu identifier 17 souches lactiques comme montre le tableau ci-

dessus :

Tableau 06 : Identification des souches isolées

Genre Espèce Code de la souche

Enterococcus

Enterococcus durans

S1

S7

S13

S17

S17‘

Enterococcus faecalis

S15

S17

S21

Enterococcus faecuim S19

S19‘

Lactococcus lactoccocus Lactis subsp lactis

S22

S1‘

Lactoccocus diacelilactis S25‘

Streptococcus

Streptoccocus agalactiae S25

S18

Streptococcus mitis S21

S23

Tétesté


37

3.3 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées

3.3.1 Criblage et sélection des souches productrice des substances antibactérienne

Les résultats d‘interaction des souches lactique isolé avec la souche cible staphylococcus

aureus ATCC 25923 ont permis de retenir 08 isolats dont les zone d‘inhibition qui ont été

produites sur milieu MRS sont illustré dans le tableau ci-dessous

Figure 16 : Résultat de la méthode des spots

Tableau 07: Résultat des isolats producteurs de substance antibactérienne

Souche lactiques (productrice) Diametre

Lactococcus lactis sub lactis (11) 8 mm

Enterococcus faecalis (15) 6 mm

Enterococcus durans (17) 9mm

Enteroccocus faecalis(21) 7mm

Streptococcus mitis (21) 6 mm

Lactococcus diacelilactis (25‘) 8mm

3.3.2 Mise en évidence de nature de la substance antimicrobienne

Sur 17 isolats du lait cru, seulement 08 souches peuvent être considérée comme productrices

de substances antibactérienne. Pour la confirmation que la nature de l‘agent inhibiteur a été

bactériocinogène en éliminant les facteurs suivants :

L‘inhibition par la production d‘acide organique par la neutralisation.

L‘inhibition par la production du peroxyde d‘hydrogène par l‘enzyme de la catalase.


38

Rappelons que les bactériocine sont de nature protéique et sensible au traitement thermique, de

ce fait nous avons traité les surnagent de 08 isolat productrice par enzyme pepsine et traitement

thermique à différente température.

Nous avons constaté que la souche Lactococcus diacetilactis présente une activité bactéricide

forte sur Staphylococcus aureus avec une zone d‘inhibition de 27 mm.

Les résultats qu‘on obtenue affirme que la substance inhibitrice est :

Bactéricide.

Thermosensible.

Déférent de H2O2 et CO2

De nature protéique

Tableau 08 : Résultat de l‘activité antibactérienne de Lactococcus diacelilactis vis-à-vis

Staphylococcus aureus

(Zi = mm) = diamètre de la zone d‘inhibition obtenue (mm) – diamètre de puits (8 mm).

.

>> Zi de la zone d’inhibition

Neutre 35-8= 27mm

70°C à 30 mn 0mm

90°C à 30 mn 0mm

110°C à 30 mn 0mm

Traité par l’enzyme (la Pepsine) 0mm


39

Figure 17 : activité antibactérienne de Lactococcus diacetilactis vis-à-vis Staphylococcus areus

ATCC 25923.

Conclusion

41

Conclusion

A travers cette étude les analyses microbiologiques ont montré que les échantillons de lait

bovin analysés sont de bonne qualité hygiénique. Et les observations macroscopiques,

microscopiques, ainsi que les différents tests physiologiques et biochimiques ont permis

d‘identifier 17 souches lactiques, 29% de Enterococcus durans ,17% Enterococcus faecalis ,12%

Enterococcus faecuim,12% lactoccocus Lactis subsp lactis,12% Streptoccocus agalactiae12%,

Streptococcus mitis et 6% de Lactoccocus diacelilactis.

La détermination de leur capacité à produire des substances antibactérienne contre la souche

cible Staphylococcus aureus ATTC 25923 à été montrée par contact direct cellule-cellule entre

les souches productrices et la souche cible. Le test d‘antagonisme a montré l‘effet inhibiteur de

7 souches Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecuim, lactoccocus

Lactis subsp lactis, Lactoccocus diacelilactis, Streptoccocus agalactiae, Streptococcus mitis.

Dont la souche Lactococcus diacetilactis suscptible d‘étre productrice de bactériocine.

Enfin au terme de cette modeste étude, nous pensons, qu‘il serait intéressant de :

D‘approfondir l‘étude sur l‘optimisation de la production des bactériocine en jouant sur

la nature du milieu de culture, la concentration de l‘inoculum, la température et la durée

d‘incubation, la souche cible utilisée … ;

déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) ;

concentrer les bactériocine par lyophilisation ou par purification en vue d‘une large

utilisation dans le secteur agro-alimentaire et cosmétique.


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Annexes

51

Annexe 1:

Technique de Coloration de Gram :

Déposer une goutte d‗eau physiologique stérile sur une lame bien propre ;

Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d‘eau, strier et sécher par

passage rapide sur la flamme d‘un bec benzène ;

Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes ;

Laver l‘excès du colorant avec de l‘eau distillée ;

Couvrir de lugol pendant 30 secondes ;

Laver à l‘eau distillée pendant 5 secondes ;

Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la lame

et par goutte à goutte jusqu‘à disparition complète de la coloration violette;

Laver à l‘eau distillée pendant 5 secondes ;

Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes

Laver à l‘eau distillée pendant 10 secondes

Déposer une goutte d‘huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un

fort grossissement.

Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes

en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rosâtres

Annexe 2:

Milieux de culture :

Milieu MRS (Man Rogosa et Sharpe, 1960)

Extrait de levure

5 g

Extrait de viande

10 g

Polypeptone

10 g

Citrate de sodium

2 g

Acétate de sodium

5 g

Glucose

20 g

KH2PO4

2 g

MgSO4

0,25g

MnSO4

0,05 g

Agar-Agar

15 g

Annexes

52

Eau distillée

1000 ml

pH =6.2

Autoclavage 120°C/ 20 minutes

Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)

Tryptone

20 g

Gélatine

2.5 g

Extrait de levure

5 g

Saccharose

100 g

Glucose

5 g

Citrate de sodium

1 g

Azide de sodium

0.075 g

Agar-Agar

15 g

Eau distillée

1000 ml

pH =6,8


Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)

Extrait de levure

3 g

Biopolytone

2,5g

Glucose

5 g

Agar

15 g

Eau distillée

1000 ml

pH= 6.6

Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.

Au moment de l‘emploi on ajoute :

Annexes

53

1 ml d‘une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)

1 ml d‘une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)

Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 μm et sont

conservées à l‘obscurité à 4°C.

Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)

Extrait de levure

2,5 g

Extrait de viande

5 g

Peptone

10 g

Acide ascorbique

0,5 g

Lactose

2 g

L-arginine

4 g

Pourpre de Bromocrésol

0,05 g

Agar-Agar

15 g

Eau distillée

1000 ml

pH = 6,8

Autoclavage 120°C pendant 20 minutes

Milieu MRS BCP

MRS (milieu liquide) moins l‘extrait de viande et sans sucre

1000 ml

Bromocrésol pourpre

0,025 mg

pH = 7.0


Annexes

54

Milieu Mueller-Hinton (Mueller et Hinton, 1941)

Infusion de viande de bœuf

3000 cm3

Peptone de caséine

17,5 g

Amidon de mais

1,5 g

Agar-agar

17 g

pH=7.4


Gélose nutritive

Extrait de viande

1 g

Extrait de levure

2 g

Peptone

5 g

Chlorure de sodium

5 g

Agar-agar

15 g

Eau distillée

1000 ml

pH

7,4

Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes

Bouillon nutritif

Annexes

55

Extrait de viande

1 g

Extrait de levure

2 g

Peptone

5 g

Chlorure de sodium

5 g

Eau distillée

1000 ml

pH

7,4

Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes

Lait écrémé

Lait en poudre

110 g

Eau distillée

1000 ml

Extrait de levure

3g

Autoclavage 110°C pendant 10 minutes

Eau Physiologique

Chlorure de sodium

8,5 g

Peptone

0,5 g

Eau distillée

1000 ml

pH =7,0

Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.

Résumé

La recherche des souches bactériennes lactiques productrices des substances antimicrobiennes à été entreprise à partir

du lait cru de vache.

L‘isolement des bactéries lactiques à partir de lait cru de vache nous a permis d‘obtenir 17 souches (Gram positif,

catalase négatif) qui ont purifiés et conservées.

L‘étude des caractéristiques phénotypiques ; biochimiques et physiologiques a permis les identifier comme suit:

29% de Enterococcus durans ,17% Enterococcus faecalis ,12% de chaque de Enterococcus faecuim,12% lactoccocus

Lactis subsp lactis, 12%Streptoccocus agalactiae, 12%Streptococcus mitis et 6%Lactoccocus diacelilactis.

Les 17 souches ont été testées pour leur effet antibactérien à l‘encontre de Staphylococcus aureus ATCC 25923.

L‘interaction de nos souches lactiques et la bactérie pathogène a donné des résultats positifs pour 7 souches.

Dont la souche Lactococcus diacetilactis susceptible d‘étre productrice de bactériocine

Mots-clés: Bactéries ; souche ; Bactériocines ; activité antibactérienne ; lait ; caractéristiques phénotypiques .

Abstract

Search for producing lactic acid bacterial strains to antimicrobial substances was undertaken from raw cow's milk.

Isolation of lactic acid bacteria from raw cow's milk has allowed us to obtain 17 strains (Grame positive, catalase

negative) that have purified and stored.

The study of phenotypic characteristics; biochemical and physiological helped identify the following:

29% of Enterococcus durans, 17% Enterococcus faecalis, 12% of Enterococcus faecuim, 12% lactis subsp lactis

Lactoccocus, 12% Streptococcus agalactiae ,12%Streptococcus mitis, and 6% Lactoccocus diacelilactis.

The 17 strains were tested for their antibacterial effect against Staphylococcus aureus ATCC 25923. The interaction of

our lactic strains and the pathogenic bacterium has shown positive results for 7 strains.

Including Lactococcus diacetilactis suscptible to be producing bacteriocin

Keywords: Bacteria; strain; Bacteriocins; antibacterial activity; milk; phenotypic characteristics

ملخص

.ٍن زييب اىبقر اىخاً تٌ ىَىاد اىَعادة ىيَينروباث ٍنتدت سالالث بنتيريت زَط اىالمتيلاىبسث عن

تنقيتها تٌاىتي (إيدابيت اىدراً، اىناتالز اىسيبيت) سالالث 17 عيى ٍنننا ٍن اىسصىه وقذ أتاذ عسه بنتيريا زَط اىالمتيل ٍن زييب اىبقر اىخاً في

.وتخسينها .

:و تسذيذ ٍا ييياىبيىميَيائيت واىفسيىىىخيت ساعذ عيى اىتعرف . دراست اىصفاث اىَظهريت

29% de Enterococcus durans ,17% Enterococcus faecalis ,12% de chaque de Enterococcus faecuim,12% lactoccocus

Lactis subsp lactis, 12%Streptoccocus agalactiae, 12%Streptococcus mitis et 6%Lactoccocus diacelilactis.

.Staphylococcus aureus ATCC 25923. ٍعاد ىيدراثيٌ ظذ رها ىتأثي17 تٌ اختبار سالالث

. اىسالالث7 ٍع قذ أظهرث نتائح إيدابيت اىَسببت ىألٍراضزَط اىينتيل واىبنتيريا (اىيبنيت)اىتفاعو بين سالالث بنتيريت

ك ره في بَاLactococcus diacetilactis .اىَرخر اىى انتاج ٍىاد ٍثبطت ىيبنتيريا اىَسببت ىالٍراض

زييب؛ اىصفاث اىَظهريت. اىنشاغ اىَعاد ىيبنتيريا. Bacteriocins. سالىت. بنتيريا’ ة :الكلمات المفتاحية

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Thème - bu.univ-ouargla.dz · Figure 07 observation microscopique de la souche S24 ... 3.3.1 Criblage et sélection des souches productrice des ... La microflore microbienne du lait