VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2014 - Thèse n°99

LES FENTES LABIO-PALATINES CONGENITALES CHEZ LE

CHIEN : MISE AU POINT D’UN TEST ENZYMATIQUE POUR

LE DOSAGE DE L’HOMOCYSTEINE, MARQUEUR

ANTENATAL POTENTIEL DES FENTES LABIO-PALATINES,

DANS LE SANG DE LA MERE ET DANS LE LIQUIDE

AMNIOTIQUE DES CHIOTS

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 10 Décembre 2014

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

COURCHAY Marion

Née le 02/08/1987

à Châtenay-Malabry

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2014 - Thèse n°99

LES FENTES LABIO-PALATINES CONGENITALES CHEZ LE

CHIEN : MISE AU POINT D’UN TEST ENZYMATIQUE POUR

LE DOSAGE DE L’HOMOCYSTEINE, MARQUEUR

ANTENATAL POTENTIEL DES FENTES LABIO-PALATINES,

DANS LE SANG DE LA MERE ET DANS LE LIQUIDE

AMNIOTIQUE DES CHIOTS

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 10 Décembre 2014

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

COURCHAY Marion

Née le 02/08/1987

à Châtenay-Malabry

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3

Mise à jour :

Liste des Enseignants du Campus Vétérinaire de Lyon

Civilité Nom Prénom Unités pédagogiques Grade

M. ALOGNINOUWA Théodore Pathologie du bétail Professeur

M. ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent Gestion des élevages Maître de conférences

Mme ARCANGIOLI Marie-Anne Pathologie du bétail Maître de conférences

M. ARTOIS Marc Santé Publique et Vétérinaire Professeur

M. BARTHELEMY Anthony Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Contractuel Mme BECKER Claire Pathologie du bétail Maître de conférences

M. BELLI Patrick Pathologie morphologique et clinique des animaux de

compagnie

Maître de conférences

Contractuel

Mme BENAMOU-SMITH Agnès Equine Maître de conférences

M. BENOIT Etienne Biologie fonctionnelle Professeur

M. BERNY Philippe Biologie fonctionnelle Professeur

Mme BERTHELET Marie-Anne Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Mme BONNET-GARIN Jeanne-Marie Biologie fonctionnelle Professeur

Mme BOULOCHER Caroline Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

M. BOURDOISEAU Gilles Santé Publique et Vétérinaire Professeur

M. BOURGOIN Gilles Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

M. BRUYERE Pierre Biotechnologies et pathologie de la reproduction Maître de conférences

Stagiaire M. BUFF Samuel Biotechnologies et pathologie de la reproduction Maître de conférences

M. BURONFOSSE Thierry Biologie fonctionnelle Maître de conférences

M. CACHON Thibaut Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Stagiaire M. CADORE Jean-Luc Pathologie médicale des animaux de compagnie Professeur

Mme CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

M. CAROZZO Claude Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

M. CHABANNE Luc Pathologie médicale des animaux de compagnie Professeur

Mme CHALVET-MONFRAY Karine Biologie fonctionnelle Professeur

M. COMMUN Loic Gestion des élevages Maître de conférences

Mme DE BOYER DES ROCHES

Alice Gestion des élevages Maître de conférences

Mme DELIGNETTE-MULLER Marie-Laure Biologie fonctionnelle Professeur

M. DEMONT Pierre Santé Publique et Vétérinaire Professeur

Mme DESJARDINS PESSON Isabelle Equine Maître de conférences

Contractuel Mme DJELOUADJI Zorée Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

Mme ESCRIOU Catherine Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences

M. FAU Didier Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur

Mme FOURNEL Corinne Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie

Professeur

M. FRANCK Michel Gestion des élevages Professeur

M. FREYBURGER Ludovic Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

M. FRIKHA Mohamed-Ridha

Pathologie du bétail Maître de conférences

Mme GILOT-FROMONT Emmanuelle Santé Publique et Vétérinaire Professeur

M. GONTHIER Alain Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

Mme GRAIN Françoise Gestion des élevages Professeur

M. GRANCHER Denis Gestion des élevages Maître de conférences

Mme GREZEL Delphine Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

M. GUERIN Pierre Biotechnologies et pathologie de la reproduction Professeur

Mme HUGONNARD Marine Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences

M. JUNOT Stéphane Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

M. KECK Gérard Biologie fonctionnelle Professeur

M. KODJO Angeli Santé Publique et Vétérinaire Professeur

Mme LAABERKI Maria-Halima Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

M. LACHERETZ Antoine Santé Publique et Vétérinaire Professeur

Mme LAMBERT Véronique Gestion des élevages Maître de conférences

Mme LATTARD Virginie Biologie fonctionnelle Maître de conférences

Mme LE GRAND Dominique Pathologie du bétail Professeur

Mme LEBLOND Agnès Santé Publique et Vétérinaire Professeur

M. LEPAGE Olivier Equine Professeur

Mme LOUZIER Vanessa Biologie fonctionnelle Maître de conférences

M. MARCHAL Thierry Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie

Professeur

Mme

MIALET

Sylvie

Santé Publique et Vétérinaire

Inspecteur en santé publique

vétérinaire (ISPV)

Mme MICHAUD Audrey Gestion des élevages Maître de conférences

M. MOUNIER Luc Gestion des élevages Maître de conférences

M. PEPIN Michel Santé Publique et Vétérinaire Professeur

M. PIN Didier Pathologie morphologique et clinique des animaux de

compagnie Maître de conférences

Mme PONCE Frédérique Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences

Mme PORTIER Karine Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Mme POUZOT-NEVORET Céline Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Mme PROUILLAC Caroline Biologie fonctionnelle Maître de conférences

Mme REMY Denise Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur

M. ROGER Thierry Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur

M. SABATIER Philippe Biologie fonctionnelle Professeur

M. SAWAYA Serge Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Mme SEGARD Emilie Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Contractuel Mme SERGENTET Delphine Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences

Mme SONET Juliette Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences

Contractuel M. THIEBAULT Jean-Jacques Biologie fonctionnelle Maître de conférences

M. VIGUIER Eric Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur

Mme VIRIEUX-WATRELOT Dorothée Pathologie morphologique et clinique des animaux de

compagnie

Maître de conférences

Contractuel M. ZENNER Lionel Santé Publique et Vétérinaire Professeur

12 mars

Mise à jour :

4

5

REMERCIEMENTS

A Monsieur le Professeur Olivier CLARIS

De la faculté de Médecine de Lyon,

Qui nous a fait l’honneur d’accepter la Présidence de ce jury de thèse,

Pour l’intérêt porté à notre travail,

Mes hommages respectueux.

A Monsieur le Docteur Samuel BUFF,

De VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon,

Qui nous a fait l’honneur d’encadrer ce travail,

Pour sa gentillesse, ses conseils et sa compréhension dans les moments difficiles,

Qu’il trouve ici l’expression de mes plus sincères remerciements.

A Monsieur le Docteur Thierry BURONFOSSE,

De VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon,

Qui nous a fait l’honneur de juger ce travail et de participer à notre jury de thèse,

Pour son investissement, sa disponibilité et sa grande gentillesse,

Qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude.

A Madame le Docteur Emilie ROSSET,

De VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon,

Pour être membre invité de ce jury de thèse,

Pour son investissement dans la réalisation de ce travail,

Pour sa grande gentillesse, sa disponibilité à tout instant et son aide précieuse,

Qu’elle trouve ici l’expression de mes sincères remerciements et de mon amitié.

A Monsieur le Docteur Andréa DEL CARRO,

De VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon,

Pour son implication dans la mise en place de ce travail,

Pour sa gentillesse et sa bonne-humeur,

Mes sincères remerciements et amitié.

6

A ma Mère,

Sans qui tout cela n’aurait pas pu se réaliser,

Pour être une maman parfaite et pour avoir toujours cru en moi.

A mon Père,

Le plus formidable de tous les papas,

Pour avoir toujours été près de moi quand j’en avais besoin.

A mon frère,

Pour avoir été le grand frère protecteur et aimant, malgré nos disputes.

A Pépé,

Parti bien trop tôt,

Pour avoir été un grand père si doux et si attentionné,

Tu me manques tellement.

A Mémé,

Pour sa gentillesse extrême et notre complicité.

A mes grands-parents maternels,

Pour leur générosité, leur attention et leur gentillesse.

A mon oncle, ma tante et mes cousins,

Pour tous ces bons moments passés en famille.

A ma marraine,

Pour son immense gentillesse et sa grande présence pendant mon enfance.

A tous mes amis,

Pour leur soutien et notre complicité,

Pour ces merveilleux moments passés à leur côté,

Et pour tous ceux à venir, malgré l’éloignement.

7

TABLE DES MATIERES

LISTE DES ENSEIGNANTS DU CAMPUS VETERINAIRE DE LYON ............................ 3

REMERCIEMENTS .............................................................................................................................. 5

TABLE DES MATIERES ..................................................................................................................... 7

TABLE DES ILLUSTRATIONS ...................................................................................................... 11

TABLE DES ABREVIATIONS ........................................................................................................ 15

INTRODUCTION .............................................................................................................................. 17

PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................... 19

I. Etude des fentes labio-palatines congénitales ........................................................................................ 20 A. Définition, symptômes et diagnostic ........................................................................................................ 20

1) Définition ............................................................................................................................................... 20 2) Symptômes............................................................................................................................................ 20 3) Diagnostic .............................................................................................................................................. 21

B. Epidémiologie des fentes labio-palatines ................................................................................................. 21 1) Prédisposition liée à l’âge de la mère ................................................................................................... 21 2) Prédisposition liée au sexe .................................................................................................................... 22 3) Prédisposition raciale ............................................................................................................................ 22

C. Anatomie du palais sain et du palais malformé chez le chien .................................................................. 23 1) Anatomie et histologie de la région buccale saine................................................................................ 23

a) Les lèvres ........................................................................................................................................... 23 b) Le palais dur, palatum durum ........................................................................................................... 24 c) Le palais mou ou « voile du palais », palatum molle......................................................................... 26

2) Anatomie des défauts palatins congénitaux ......................................................................................... 26 a) Présentation générale ....................................................................................................................... 26 b) Classification ..................................................................................................................................... 27

D. Organogénèse de la région du palais et formation des fentes palatines .................................................. 30 1) Rappels de fondamentaux d’embryologie ............................................................................................ 30 2) Formation de la tête .............................................................................................................................. 30

a) Formation de la face (fig. 9 et 10) ..................................................................................................... 30 b) Formation des cavités nasales, buccale et du palais (fig. 12 et 13) .................................................. 35

i. Formation du palais primaire ........................................................................................................ 35 ii. Formation du palais secondaire : aspect général .......................................................................... 35 iii. Formation du palais secondaire : aspect histologique (fig. 15) ................................................. 38

3) Bilan sur l’étiopathogénie des fentes labio-palatines ........................................................................... 40 E. Etiologie des fentes labio-palatines congénitales ..................................................................................... 41

1) Facteurs génétiques .............................................................................................................................. 41 a) Chez l’homme ................................................................................................................................... 41

i. TGFA, Transforming Growth Factor Alpha .................................................................................... 42 ii. TGFB3, Transforming Growth Factor Beta 3 ................................................................................. 42 iii. MSX1, Msh homéobox 1 ........................................................................................................... 42 iv. MTHFR, 5,10-méthylène tétrahydrofolate réductase ............................................................... 42 v. Derniers gènes mis en évidence .................................................................................................... 43

b) Chez le chien ..................................................................................................................................... 43 2) Facteurs environnementaux ................................................................................................................. 43

a) Facteur iatrogène .............................................................................................................................. 43

8

b) Cause virale/bactérienne/parasitaire ............................................................................................... 44 c) Facteurs nutritionnels ....................................................................................................................... 44

i. Excès en vitamines A et D ............................................................................................................. 44 ii. Carences en magnésium, Zinc et vitamine E ................................................................................. 45 iii. Carences en vitamines B6, B12 et folates ................................................................................. 45 iv. L’alcool ...................................................................................................................................... 45

d) Physiques .......................................................................................................................................... 45 3) Trouble métabolique maternel ............................................................................................................. 45 4) Mécanique ............................................................................................................................................ 45

F. Prise en charge des fentes palatine chez le chien ..................................................................................... 46 1) Prise en charge immédiate : cathétérisme œsophagien ....................................................................... 46 2) Prise en charge chirurgicale : palatoplastie .......................................................................................... 49

II. Du fœtus dans ses enveloppes fœtales à la mise-bas ............................................................................. 52 A. La gestation chez les canidés .................................................................................................................... 52 B. Le liquide amniotique et ses structures environnantes ............................................................................ 53

1) Présentation et rôles des enveloppes fœtales (fig. 19, 20 et 21) ......................................................... 53 a) L’amnios et le liquide amniotique ..................................................................................................... 53

i. Description .................................................................................................................................... 53 ii. Fonctions ....................................................................................................................................... 54

b) L’allantoïde ........................................................................................................................................ 55 c) Le sac vitellin, le lécithocoele ............................................................................................................ 56 d) Le chorion .......................................................................................................................................... 57

2) Le cordon ombilical ............................................................................................................................... 57 3) Le placenta, un organe à part entière ................................................................................................... 58

C. Développement embryonnaire des enveloppes fœtales .......................................................................... 61 D. Développement anomal des enveloppes fœtales : l’hydramnios, une conséquence pour la mise-bas chez la femme ........................................................................................................................................................... 64

1) Définition ............................................................................................................................................... 64 2) Etiologie ................................................................................................................................................ 64

a) Diabète maternel .............................................................................................................................. 64 b) Anomalies congénitales .................................................................................................................... 65

i. Anomalies obstructives du fœtus.................................................................................................. 65 ii. Anomalies des parois digestives.................................................................................................... 65 iii. Autres malformations ............................................................................................................... 65

c) Anémie fœtale................................................................................................................................... 65 d) Autres étiologies possibles ................................................................................................................ 65

3) Diagnostic .............................................................................................................................................. 66 4) Conséquences pour la gestation et la mise-bas .................................................................................... 66

E. La mise-bas chez les Canidés ..................................................................................................................... 67 1) La mise-bas normale ou eutocique ....................................................................................................... 67

a) Une cascade d’activations endocriniennes ....................................................................................... 67 b) Déroulement de la mise-bas ............................................................................................................. 68

i. Etape I ........................................................................................................................................... 68 ii. Etape II .......................................................................................................................................... 69 iii. Etape III ..................................................................................................................................... 69

2) La mise-bas dystocique ......................................................................................................................... 69 a) Etiologies possibles et facteurs favorisants....................................................................................... 69

i. Causes d’origine maternelle .......................................................................................................... 69 ii. Causes d’origine fœtale ................................................................................................................. 70

b) Critères d’alerte ................................................................................................................................ 71 c) Traitement médical d’une dystocie ................................................................................................... 72

i. Stimulation manuelle .................................................................................................................... 72 ii. Stimulation médicamenteuse ....................................................................................................... 72

3) La césarienne......................................................................................................................................... 73 a) Motifs de réalisation d’une césarienne ............................................................................................. 73

i. Césarienne d’urgence .................................................................................................................... 73 ii. Césarienne programmée ............................................................................................................... 73

b) Programmation d’une césarienne ..................................................................................................... 73

9

i. Intérêt de la programmation d’une césarienne ............................................................................ 73 ii. Quand et comment programmer la césarienne ? ......................................................................... 74

III. L’homocystéine, un marqueur potentiel des fentes palatines ............................................................. 77 A. Métabolisme de l’homocystéine ............................................................................................................... 77

1) Synthèse de l’homocystéine ................................................................................................................. 77 2) L’homocystéine dans le métabolisme de la méthionine et de la cystéine ............................................ 79

a) « Cycle des méthyls activés » ............................................................................................................ 79 b) Synthèse de la cystéine à partir de l’homocystéine .......................................................................... 79

3) Homocystéine et cofacteurs vitaminiques : folates, vitamine B6 et B12 .............................................. 79 a) Métabolisme des folates et vitamine B12 ......................................................................................... 79

i. Les folates ou vitamines B9 ........................................................................................................... 79 ii. La vitamine B12 ou cobalamine .................................................................................................... 81 iii. Cycles des folates ...................................................................................................................... 81

b) Vitamine B6 ou pyridoxine, et homocystéinémie ............................................................................. 81 c) Conclusion (fig. 27) ............................................................................................................................ 81

B. L’hyperhomocystéinémie .......................................................................................................................... 83 1) L’homocystéine dans le sang................................................................................................................. 83 2) L’homocystéinémie en médecine humaine .......................................................................................... 83

a) Méthode de dosage sanguin de l’homocystéine .............................................................................. 83 i. Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) ................................................ 84 ii. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM) ................... 84 iii. Méthode immunologique ......................................................................................................... 85 iv. Méthode enzymatique .............................................................................................................. 85

b) Valeurs de référence ......................................................................................................................... 86 3) Les causes d’hyperhomocystéinémie .................................................................................................... 87

a) Déficit nutritionnel : l’hyperhomocystéinémie comme marqueur d’une carence en folates, vitamines B6 et/ou B12 ............................................................................................................................. 87 b) Anomalie génétique à l’origine d’un déficit enzymatique ................................................................ 87

i. Déficit en cystathionine β-cynthétase (CBS) ................................................................................. 87 ii. Déficit en 5,10-méthylène tétrahydrofolate réductase (MTHFR) ................................................. 88 iii. Déficit en méthionine synthase (MS) ........................................................................................ 88

C. L’homocystéine en médecine humaine .................................................................................................... 89 1) Homocystinurie ..................................................................................................................................... 89 2) Risques cardio-vasculaires .................................................................................................................... 90 3) Troubles neurologiques......................................................................................................................... 91

D. Folates, vitamine B12, homocystéine et maladies congénitales .............................................................. 91 1) Folates, vitamine B12 et défauts du tube neural .................................................................................. 91 2) Folates et fentes palatines .................................................................................................................... 92

a) Résultats en médecine humaine ....................................................................................................... 92 b) Résultats en médecine vétérinaire.................................................................................................... 93

3) L’homocystéine, marqueur potentiel des fentes palatines ? ................................................................ 93 a) L’homocystéinémie de la mère ......................................................................................................... 93 b) L’homocystéine dans le liquide amniotique...................................................................................... 94

PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE ....................................................................................... 97

I. Objectifs ................................................................................................................................................. 98

II. Protocole expérimental : matériels et méthodes .................................................................................... 98 A. Sélection des animaux............................................................................................................................... 98 B. Prélèvement du sang de la mère .............................................................................................................. 99 C. Prélèvement du liquide amniotique ......................................................................................................... 99

1) Réalisation de la césarienne au CHEVAC: Hystérotomie ....................................................................... 99 a) Protocole anesthésique................................................................................................................... 100 b) Technique chirurgicale (fig. 29) ....................................................................................................... 100 c) Médication ...................................................................................................................................... 103 d) Traitement proposé ........................................................................................................................ 103

10

2) Prélèvement stérile du liquide amniotique au cours de la césarienne ............................................... 103 D. Dosage de l’homocystéine par la méthode enzymatique ....................................................................... 106

1) Présentation du test enzymatique à trois réactifs .............................................................................. 106 a) Principe du test ............................................................................................................................... 106 b) Les réactions chimiques mises en jeu (fig. 34) ................................................................................ 106 c) Composition des réactifs ................................................................................................................. 107 d) Réalisation du test ........................................................................................................................... 108

2) Validation du test enzymatique à trois réactifs .................................................................................. 109 a) Programmation du test ................................................................................................................... 109 b) Calibration et courbe d’étalonnage ................................................................................................ 111 c) Répétabilité du test ......................................................................................................................... 113

i. Répétabilité sur le plasma ........................................................................................................... 114 ii. Répétabilité sur le liquide amniotique ........................................................................................ 114

E. Dosage des autres paramètres biochimiques ......................................................................................... 114 F. Analyse des résultats............................................................................................................................... 115

III. Résultats ........................................................................................................................................... 115 A. Description des effectifs .......................................................................................................................... 115

1) Age moyen des chiennes le jour de la césarienne et nombre moyen de chiots par portée ............... 116 2) Statut rénal et nutritionnel chez la mère ............................................................................................ 117

B. Résultats relatifs à l’homocystéinémie (tHcy) chez la mère en fin de gestation .................................... 119 1) Valeurs moyennes ............................................................................................................................... 119 2) Résultats en fonction du statut rénal ou nutritionnel de la chienne .................................................. 121 3) Résultats en fonction de l’âge de la chienne....................................................................................... 122 4) Résultats en fonction de la présence de fentes labio-palatines au sein de la portée ......................... 122

C. Résultats relatifs à la concentration en homocystéine dans le liquide amniotique (aHcy) .................... 123 1) Valeurs moyennes ............................................................................................................................... 123 2) Résultats en fonction de la race .......................................................................................................... 125 3) Résultats en fonction du sexe du chiot ............................................................................................... 125 4) Résultats par rapport à la mère .......................................................................................................... 126

a) En fonction de l’âge de la mère ....................................................................................................... 126 b) En fonction de tHcy de la mère ....................................................................................................... 127

5) Résultats en fonction du nombre de chiots au sein de la portée ....................................................... 127 6) Résultats en fonction de la présence de fente labio-palatine ............................................................. 128

IV. Discussion ......................................................................................................................................... 129 A. Sélection des animaux et prélèvements des échantillons ...................................................................... 129 B. Mise au point du test enzymatique à trois réactifs ................................................................................. 129 C. Résultats de l’étude ................................................................................................................................ 130

1) L’homocystéinémie des chiennes en fin de gestation ........................................................................ 130 2) La concentration en Homocystéine dans le liquide amniotique ......................................................... 132

D. Perspectives ............................................................................................................................................ 134

CONCLUSION .................................................................................................................................. 137

BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................... 139

ANNEXES ......................................................................................................................................... 149 1) Annexe 1: Tableau Excel des résultats maternels ............................................................................... 149 2) Annexe 2: Tableau Excel des résultats concernant les nouveau-nés .................................................. 150

11

TABLE DES ILLUSTRATIONS

- Figures

Figure 1: Fente palatine congénitale chez un Bouledogue Français nouveau-né .................... 20

Figure 2: Coupe frontale en vue ventrale de la région buccale dorsale et du pharynx d’un

chien ......................................................................................................................................... 23

Figure 3: Coupe histologique transversale du palais dur ......................................................... 24

Figure 4: Crâne d'un chien en vue ventrale .............................................................................. 25

Figure 5: Fente palatine primaire, cheiloschisis ....................................................................... 27

Figure 6: Fente palatine secondaire étendue jusqu'au palais mou, palatoschisis ..................... 27

Figure 7: Vues ventrales de la région palatine d'un enfant ...................................................... 28

Figure 8: Fente du palais secondaire TOTALE chez un Bouledogue Français (Groupe II 1

selon la classification de KERNAHAN et STRAK) ................................................................ 29

Figure 9: Développement séquentiel embryonnaire de la face chez le porc ............................ 33

Figure 10: Développement de la lèvre supérieure et de la fosse nasale primitive en vue

antérieure et en vue ventrale chez un embryon humain ........................................................... 34

Figure 11: Développement comparé de la lèvre supérieure chez le chien et l'homme ............ 34

Figure 12: Développement embryonnaire séquentiel des cavités nasales, orale et du palais en

coupe longitudinale .................................................................................................................. 37

Figure 13: Développement embryonnaire séquentiel des cavités nasales, orale et du palais en

coupe transversale .................................................................................................................... 37

Figure 14: Développement embryonnaire du palais en vue ventrale ....................................... 38

Figure 15: Représentation séquentielle schématique de la fusion palatine secondaire à l'échelle

histologique .............................................................................................................................. 39

Figure 16: Principe de l'intubation gastrique d'un nouveau-né (1/2) ....................................... 47

Figure 17: Principe de l'intubation gastrique d’un nouveau-né (2/2) ....................................... 48

Figure 18: Prise en charge chirurgicale par la technique d'overlapping flap d'une fente palatine

secondaire médiale chez un Mastiff de 4 mois ........................................................................ 50

Figure 19: Le fœtus de chien et ses annexes embryonnaires ................................................... 54

Figure 20: Les annexes fœtales du fœtus de chien ................................................................... 59

Figure 21: Le fœtus de chien découvert et ses annexes ........................................................... 60

Figure 22: Développement embryonnaire séquentiel des enveloppes embryonnaires, présenté

en coupe longitudinale ............................................................................................................. 63

Figure 23: Malformations congénitales à l'origine de dystocies fœtales ................................. 71

12

Figure 24: Molécule de L-Homocystéine ................................................................................. 77

Figure 25: Métabolisme de l'homocystéine .............................................................................. 78

Figure 26: Molécule d'acide folique ......................................................................................... 80

Figure 27: Bilan du métabolisme de l'homocystéine et cofacteurs vitaminiques .................... 82

Figure 28: Méthode immunologique de dosage de l'homocystéine ......................................... 85

Figure 29: Présentation de différentes étapes de la césarienne .............................................. 102

Figure 30: Préparation de la table stérile pour le prélèvement du liquide amniotique ........... 104

Figure 31: Nouveau-né encore enveloppé de ses annexes fœtales ......................................... 104

Figure 32: Prélèvement stérile du liquide amniotique ........................................................... 105

Figure 33: Prélèvements de liquide amniotique effectués lors d'une césarienne programmée

sur une portée de 8 chiots ....................................................................................................... 105

Figure 34: Schéma des réactions enzymatiques mises en jeu lors du dosage par la méthode

enzymatique de l'homocystéine .............................................................................................. 107

Figure 35: Procédure du test enzymatique recommandée par les laboratoires Diazyme ....... 108

Figure 36: Analyseur Konelab20, laboratoire de biologie médicale, VetAgro Sup ............... 109

Figure 37: Présentation schématique du fonctionnement interne de l'analyseur Konelab20 .. 110

Figure 38: Programmation du test enzymatique à trois réactifs pour le dosage de

l'homocystéine sur l'appareil Konelab20 du laboratoire de biologie médicale de VetAgro Sup

................................................................................................................................................ 110

Figure 39: Absorbance en fonction du temps permettant d'obtenir la réponse R pour chaque

calibrant .................................................................................................................................. 112

Figure 40: Courbe d'étalonnage obtenue après paramétrage du test enzymatique à trois réactifs

sur l'appareil Konelab20 .......................................................................................................... 113

Figure 41: Représentation graphique par un diagramme en bâtons du nombre moyen de chiots

par portée en fonction de la race (*p<0.05) ........................................................................... 116

Figure 42: Représentation graphique en nuage de points du statut rénal des mères en fin de

gestation (moyennes et sem indiqués en rouge, valeurs de référence indiquées en vert) ...... 118

Figure 43: Représentation graphique en nuage de points du statut nutritionnel en vitamine B

des mères en fin de gestation (moyennes et sem indiqués en rouge, valeurs de référence

indiquées en vert) ................................................................................................................... 118

Figure 44: Représentation graphique par un diagramme en bâtons du statut rénal et

nutritionnel en vitamines B selon la race ............................................................................... 119

Figure 45: Représentation graphique par un diagramme en bâtons de tHcy moyenne obtenue,

en fonction de la race (*p<0.05)............................................................................................. 120

13

Figure 46: Représentation graphique par un nuage de points de tHcy obtenue, en fonction de

la race ..................................................................................................................................... 120

Figure 47: Régression linéaire entre tHcy et le statut rénal ................................................... 121

Figure 48: Régression linéaire entre tHcy et le statut nutritionnel ......................................... 121

Figure 49: Régression linéaire entre tHcy et l'âge de la mère ................................................ 122

Figure 50: Représentations graphiques par un diagramme en bâtons de tHcy ou de la

concentration plasmatique en folates en fonction de la présence de fentes palatines ou non 123

Figure 51: Répartition du nombre d'échantillon en fonction de aHcy ................................... 124

Figure 52: Représentation graphique par un diagramme en bâtons des valeurs moyennes de

aHcy en fonction de la race (*p<0.05) ................................................................................... 125

Figure 53: Représentation graphique par un diagramme en bâtons de aHcy moyenne en

fonction du sexe des chiots (*p<0.05) .................................................................................... 126

Figure 54: Régression linéaire entre aHcy et l'âge de la mère ............................................... 126

Figure 55: Corrélation nulle entre aHcy et tHcy .................................................................... 127

Figure 56: Régression linéaire entre aHcy et le nombre de chiots dans la portée .................. 127

Figure 57: Représentation graphique par un diagramme en bâtons de la valeur moyenne aHcy

en fonction de la présence ou non de fentes labio-palatines .................................................. 128

- Tableaux

Tableau I: Bilan du devenir des différentes proéminences embryonnaires ............................. 40

Tableau II: Critères d'alerte pour le propriétaire lors de mise-bas dystocique ......................... 71

Tableau III: Intérêts de la césarienne programmée .................................................................. 74

Tableau IV: Les différentes formes d'homocystéine dans le sang humain .............................. 83

Tableau V: Valeurs moyennes de la tHcy chez l'espèce Humaine (en µmol/L) ...................... 87

Tableau VI: Composition des réactifs du test enzymatique ................................................... 108

Tableau VII: Réponse du test et concentrations des calibrants .............................................. 111

Tableau VIII: Age des chiennes le jour de la césarienne, nombre de chiots par portée et

nombre de fentes labio-palatines ............................................................................................ 116

Tableau IX: Moyennes des statuts nutritionnels (en violet) et rénaux (en vert) des chiennes 117

Tableau X: Valeurs moyennes de l'homocystéinémie des mères ........................................... 120

Tableau XI: Valeurs moyennes de aHcy ................................................................................ 124

14

15

TABLE DES ABREVIATIONS

- AAFCO = Association of American Feed Control Officials

- ACTH = AdrenoCorticoTropic Hormone

- ADA = Adénosine Désaminase

- Ado = Adénosine

- AFI = Amniotic Fluid Index, Index de Fluide Amniotique

- aHcy = Concentration totale en homocystéine dans le liquide amniotique

- AINS = Anti-Inflammatoire Non Stéroïdien

- Albm = Albumine

- ATP = Adénosine Triphosphate

- BB = Bouvier Bernois

- BF = Bouledogue Français

- Bull Ter = Bull Terrier miniature

- CBS = Cystathionine β-synthétase

- CERREC = Centre d’Etude et Recherche en Reproduction et Elevage Canin

- CG-SM = Chromatographie en phase gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse

- CHEVAC = Centre Hospitalier d’Enseignement Vétérinaire Animaux de Compagnie

- Créat = Créatinémie

- CVr = Coefficient de Variation de Répétabilité

- Cys = Cystéine

- DNMT = ADN Méthyltransférase

- DTT = Dithiothréitol

- ECG = ElectroCardioGramme

- EDTA = Ethylène Diamine Tétra Acétique

- FiO2 = Fraction Inspirée en Oxygène

- GLDH = Glutamate Déshydrogénase

- Hcy = Homocystéine

- HcyS-Albumine = Homocystéine-protéine disulfure

- HcyS-SCys = Homocystéine-cystéine disulfure

- HcyS-SHcy = Homocystine

- HcyS-SR = Homocystéine disulfure

- HPLC = Chromatographie en phase liquide à Haute Performance (High Perfomance

Liquid Chromatography)

- IM = Intra-Musculaire

16

- IRF6 = Interferon Regulatory Factor 6

- IV = intra-veineuse

- LDL = Low-Density lipoprotein

- LH = Hormone Lutéinisante (Luteinizing Hormone)

- LOD = Limite de Détection

- LOQ = Limite de Quantification

- PABA = Acide p-aminobenzoïque

- PGF2α = Prostaglandine F2α

- MEE = Medial Edge Epithelium pour épithélium de recouvrement des bourgeons

palatins

- MES = Medial Epithelial Seam pour épithélium médian de jonction

- Met = Méthionine

- Méthyl-THF = Méthyltétrahydrofolate

- MS = Méthionine synthase (également appelée Hcy méthyltransférase)

- MTHFR = 5,10-méthylène tétrahydrofolate réductase

- NAD+ = Nicotinamide Adénine Dinucléotide, forme oxydée

- NADH = Nicotinamide Adénine Dinucléotide, forme réduite

- NDH = Nom Déposé Humaine

- NDV = Nom déposé Vétérinaire

- PDS = Plus Antibacterial (polydioxanone) Suture

- Prot = Protéine totale

- PVRL1 = Poliovirus-receptor like-1

- SAH = S-adénosylhomocystéine

- SAM = S-adenosylmethionine

- SC = Sous Cutané

- SEM = Standard Error of the Mean

- SpO2 = Saturation pulsée en oxygène

- St B = Saint Bernard

- TBX22 = T-box transcription factor 22

- TCEP = tris(2-carboxyethyl)phosphine

- TGFA = Transforming Growth Factor Alpha

- TGFB3 = Transforming Growth Factor Beta 3

- tHcy = Concentration plasmatique totale en homocystéine

- THF = Tétrahydrofolate

- TN = Terre Neuve

17

INTRODUCTION

Les maladies congénitales, structurelles ou fonctionnelles, sont peu fréquentes dans

l’espèce canine puisque 1 à 2% seulement des chiots naissent avec une telle pathologie

(30)(12). Cependant elles ont souvent de lourdes conséquences et sont à l’origine de 14% de

la mortalité néonatale (12). En effet, lorsque celles-ci sont décelées, dès la naissance en ce qui

concerne les fentes palatines ou des semaines après comme par exemple la persistance du 4ème

arc aortique, l’euthanasie est la solution la plus utilisée car les traitements médicaux et/ou

chirurgicaux sont bien souvent contraignants et onéreux pour les propriétaires. Lorsqu’elles

sont présentes, les maladies congénitales peuvent donc entrainer des pertes importantes pour

les éleveurs canins. De plus, de nombreuses études ont établi que la présence de maladies

congénitales prédispose aux complications lors de la mise-bas.

Compte tenu de tous ces éléments, il apparait utile et nécessaire d’avoir à disposition

un marqueur anténatal de la présence de maladies congénitales. C’est le cas en particulier de

la fente labio-palatine qui fait l’objet de cette étude.

La fente labio-palatine apparait chez le fœtus par un défaut de développement lors de

l’organogénèse. Les conséquences peuvent apparaitre pendant la gestation par l’apparition

d’hydramnios et provoque ensuite, chez le nouveau-né, de graves symptômes conduisant à la

mort ou à une prise en charge chirurgicale lourde. A ce jour, cette affection n’est pas

diagnostiquée avant la mise-bas dans l’espèce canine.

De récentes études chez l’humain ont permis de mettre en évidence la présence d’un

fort taux d’homocystéine, un acide aminé soufré, dans le sang de la mère dont le fœtus est

atteint de « bec de lièvre ». L’homocystéine est donc un possible candidat comme marqueur

anté-natal mais aucune étude ni analyse n’a encore été réalisée en médecine vétérinaire.

L’objectif de cette étude est donc de documenter la pathophysiologie des fentes labio-

palatines et du liquide amniotique d’une part et les connaissances actuelles sur l’homocystéine

d’autre part comme candidat marqueur potentiel ; puis de mettre en place un test enzymatique

permettant le dosage de l‘homocystéine dans le sang et le liquide amniotique, afin de pouvoir

corréler le taux d’homocystéine dans le liquide amniotique avec la présence de la maladie

chez les nouveau-nés. L’hypothèse est que si ces dosages sont significatifs, ils pourraient être

utilisés en médecine vétérinaire, le prélèvement de liquide amniotique étant réalisable en fin

de gestation.

18

19

PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Dans cette étude bibliographique, les fentes labio-palatines congénitales, qui font

l’objet de ce travail, vont tout d’abord être développées.

Puis, une documentation du conceptus, fœtus enveloppé de ses annexes fœtales, et de

la mise-bas sera réalisée. En effet, l’objectif de cette étude clinique est de doser

l’homocystéine dans le sang de la lice, mais également, dans le liquide amniotique des chiots

lors de césariennes programmées. Une synthèse bibliographique concernant ces notions parait

donc être justifiée.

Enfin, l’homocystéine, quant à elle, sera détaillée dans son contexte biochimique

clinique, avant de s’interroger sur sa place dans les malformations congénitales.

20

I. Etude des fentes labio-palatines congénitales

L’étude de la fente labio-palatine congénitale, également appelée fente oro-faciale, va

être développée dans cette partie, de sa définition à sa prise en charge, en passant par son

étiologie, point essentiel de cette étude clinique.

A. Définition, symptômes et diagnostic

1) Définition

Une fente labio-palatine congénitale est une communication entre les cavités nasale

et orale au niveau du palais primaire (« bec de lièvre ») et/ou du palais secondaire, due à un

défaut de fermeture de ce palais lors de l’organogénèse (fig. 1).

Ces anomalies de développement sont souvent accompagnées de malformations

congénitales sur d’autres organes : chez 8% des chiens présentant une fente palatine primaire

ou secondaire (80)(56).

Figure 1: Fente palatine congénitale chez un Bouledogue Français nouveau-né

(VetAgro Sup, CERREC)

2) Symptômes

Dans la majorité des cas, la fente palatine est observée directement après la naissance

si le propriétaire prend soin de vérifier la cavité buccale. Dans le cas échéant, les symptômes

suivants peuvent être observés :

- toux et éternuements, causés par de fausses déglutitions,

21

- écoulements de lait par les narines,

- infections respiratoires chroniques consécutives (pneumonie par fausse déglutition, rhinite

ou laryngotrachéite).

3) Diagnostic

En médecine humaine, le diagnostic anténatal par examen échographique est

réalisable. Dans l’étude de BENIFLA J-L. et al., le diagnostic est réalisé à la 24ème

semaine (±

4 semaines) et permet de donner un type anatomique exacte dans deux tiers des cas (46).

Ainsi, les parents peuvent se préparer et recevoir les conseils nécessaires pour bien accueillir

l’enfant à la naissance. Cependant, cela reste un examen difficile, avec une détection dans

50% des cas, les fentes du palais primaire étant plus facilement détectables que les fentes du

palais secondaire (27).

Les anomalies possibles associées aux fentes ne sont pas toujours décelables à l’examen

prénatal mais doivent être systématiquement recherchées.

En médecine vétérinaire, le diagnostic anténatal par ultrason est très difficile et aucun

cas n’est décrit. La malformation est donc une découverte à la mise-bas.

B. Epidémiologie des fentes labio-palatines

En médecine humaine, la prévalence des fentes labio-palatines varie selon les auteurs :

elle est de 2.1‰ au total (27), avec une répartition de 1‰ pour les becs-de-lièvre et de 0.4‰

à 0.7‰ pour les fentes du palais secondaires (114)(67).

La prévalence de la maladie dans l’espèce canine est plus difficilement évaluée, les

chiots étant souvent euthanasiés avant d’être déclarés. Cependant, une étude récente met en

évidence une prévalence de 7.9% des fentes palatines chez le Bouledogue Français et le Boxer

(11).

1) Prédisposition liée à l’âge de la mère

La prévalence des becs-de-lièvre augmente avec l’âge de la mère dans l’espèce

humaine, contrairement aux fentes du palais secondaire (68).

22

2) Prédisposition liée au sexe

Chez l’homme, les garçons semblent plus affectés par les becs-de-lièvre que les

filles (85). L’étude de BENDER P.L. met en évidence que les garçons sont deux fois plus

concernés par cette pathologie congénitale (8). Ils seraient quatre fois plus concernés selon

LANGMAN J. et SADLER T.W. (68). A l’inverse, les filles seraient plus concernées par

les fentes du palais secondaire isolées (68)(85).

Cependant, aucune prédisposition liée au sexe n’a été rapportée dans l’espèce canine

(62).

3) Prédisposition raciale

Dans l’espèce humaine, une variation selon les groupes ethniques est observée : les

japonais et les indiens d’Amérique semblent être les plus touchés avec respectivement une

incidence de 3.6‰ et 2.1‰ (8).

Le développement de cette pathologie chez l’espèce canine présente une

prédisposition pour les races brachycéphales (Bouledogue Français, Bulldog Anglais,

Boxer). En effet, ces races présentent un risque augmenté de 30% (56). Des cas de fentes

palatines sont également fréquemment observés chez : les Beagles, les Cocker Anglais, les

Labradors Retrievers, les Teckels, les Schnauzers, les Bergers Shetland et les Bergers

Allemands (89).

Une fente labio-palatine congénitale est une communication entre les cavités

nasale et orale au niveau du palais primaire et/ou du palais secondaire, due à un défaut de

fermeture de ce palais lors de l’organogénèse entrainant des infections respiratoires par

fausse déglutition lorsqu’elle n’est pas pris en charge immédiatement. Elle peut être

diagnostiquée en médecine humaine par ultrasonographie.

Dans l’espèce canine, les races brachycéphales sont prédisposées et présentent

un risque augmenté de 30%.

23

C. Anatomie du palais sain et du palais malformé chez le chien

1) Anatomie et histologie de la région buccale saine

La cavité buccale, également appelée cavité orale, communiquant caudalement avec le

pharynx, est délimitée par les lèvres, les joues, le palais dur, le palais mou et le plancher

sublingual (fig. 2).

Figure 2: Coupe frontale en vue ventrale de la région buccale dorsale et du pharynx d’un

chien

D’après (65)(32)

a) Les lèvres

Distinguées en lèvres supérieures et lèvres inférieures, les lèvres se rejoignent au

niveau de la commissure délimitant l’angle de la gueule. La lèvre supérieure intervenant dans

le « bec de lièvre » présente un sillon médian appelé « philtrum ».

De l’extérieur vers l’intérieur, elles se composent :

- de la peau (versant épidermique externe) portant les vibrisses,

24

- de glandes sébacées de très grandes tailles : les glandes circumorales,

- du muscle orbiculaire de la bouche,

- de glandes salivaires de nature muqueuse,

- et d’une muqueuse orale, de type épithélium pavimenteux non kératinisé chez les carnivores,

parfois pigmentée (versant muqueux interne) (33).

Elles recouvrent l’os incisif (pair) médialement et les os maxillaires latéralement.

b) Le palais dur, palatum durum

Le palais dur ou palais osseux correspond au plafond de la gueule et permet de

délimiter la cavité orale de la cavité nasale. Son intégralité permet les fonctions de succion

et d’aspiration, impossibles dans le cas de fente palatine. Il est caractérisé par une voûte

allongée délimitée caudalement par le palais mou et qui se mélange aux gencives en

périphérie (33).

Le raphé sépare médialement le palais dur sur toute sa longueur et peut se prolonger

jusqu’au palais mou. Il correspond à la suture palatine médiane (5). La papille incisive est un

relief proéminent, de forme arrondie en région médiale située juste en arrière des incisives et

présentant l’orifice du conduit incisif se prolongeant aux cavités nasales (33)(36) (fig. 2).

La muqueuse orale du palais mou est épaisse, parfois pigmentée, et présente des

reliefs transversaux réguliers : les crêtes palatines, au nombre de 6 à 10 chez le chien,

empêchant les aliments de circuler en amont (33). Elle est constituée d’un épithélium

stratifié très kératinisé reposant sur un chorion épais (fig. 3). Le tissus conjonctif de la

sous-muqueuse est dense et en continuité avec le périoste (33).

Figure 3: Coupe histologique transversale du palais dur

(VetAgro Sup, campus vétérinaire de Lyon, service d’anatomie pathologique)

Crête

Kératinisation

très marquée

Epithélium très épais

Chorion épais

Sous muqueuse

25

La face supérieure du palais dur est constituée d’une muqueuse respiratoire

(épithélium cilié pseudostratifié) (36).

La base osseuse du palais dur est constituée :

- des processus palatin de l’os incisif rostralement (os pair),

- des processus palatins des os maxillaires en région moyenne (os pair),

- et des os palatins caudalement (33)(5)(93) (fig. 4).

Figure 4: Crâne d'un chien en vue ventrale

(93)

La suture palatine médiane correspond à la suture des deux os palatins et des deux

processus palatins des os maxillaires ; elle est continuée rostralement par la suture

interincisive au sein de laquelle se trouve le canal incisif (5). La courbe correspondant à

l’union d’une lame horizontale de l’os palatin avec le processus palatin de l’os maxillaire, de

chaque côté, correspond à la suture palatine transverse (5). L’orifice palatin antérieur

majeur s’ouvrant sur le conduit palatin majeur se situe au niveau de cette suture. Il est

accompagné d’orifices palatins mineurs. Les fissures palatines, étroites et peu allongées,

27. Lame horizontale de l’os

palatin (pair)

30. Orifice antérieur du conduit

palatin

31. Gouttière palatine au niveau

du processus palatin de l’os

maxillaire (pair)

32. Fente incisive ou fissure

palatine

33. Corps de l’os incisif (pair)

34. Canal incisif

26

prennent place entre l’extrémité rostrale des os maxillaires, le corps de l’os incisif et la

branche palatine de l’os incisif.

c) Le palais mou ou « voile du palais », palatum molle

Le palais mou prolonge caudalement le palais dur et est attaché à l’arcade palatine

sur son bord rostral avec un bord caudal libre (fig. 2). Mobile, cartilagineux, et sans

structure osseuse, il correspond à une cloison contractile permettant de séparer la cavité

buccale du pharynx. Son extrémité caudale permet de séparer le rhinopharynx de

l’oropharynx. Il est particulièrement long chez le chien chez qui sa taille moyenne est de 6 cm

de long, 3cm de large et 5 mm d’épaisseur (36). Il est souvent trop long chez les races

brachycéphales, gênant le passage de l’air dans le pharynx et pouvant entrainer des détresses

respiratoires (36)(80).

Sa muqueuse est de type digestive ventralement (épithélium plus mince, stratifié et

non kératinisé, dont le chorion contient de très nombreux nodules lymphoides) et respiratoire

dorsalement (épithélium cilié pseudostratifié). Il présente de nombreux muscles : élévateur

du voile du palais, tenseur du voile du palais, palato-glosse, palato-pharyngien et palatin (33).

2) Anatomie des défauts palatins congénitaux

a) Présentation générale

La malformation palatine peut atteindre soit le palais primaire, l’os incisif, et forme

un « bec de lièvre » (nom vulgaire) (fig. 5); soit le palais secondaire, palais dur et/ou mou

(fig. 6). Les malformations du palais primaire sont encore appelées cheiloschisis lorsque seule

la lèvre supérieure est impliquée ou cheilognathoschisis lorsque la fente concerne la lèvre et

le maxillaire, et celles du palais secondaire palatoschisis. Chez le chien, les malformations

du palais secondaire sont plus fréquentes que les malformations du palais primaire

(54)(80).

Les conséquences d’une malformation du palais primaire sont souvent moins graves

que celles touchant le palais secondaire. Sa reconstruction est donc principalement esthétique

(49)(37).

27

(54) (54)

Les fentes palatines congénitales du palais secondaire sont presque toujours en

région médiale, sauf lorsqu’elles sont accompagnées d’une malformation du palais primaire

où elles peuvent être latéralisée sur la partie antérieure (49). Elles s’accompagnent

fréquemment d’un défaut du voile du palais et les défauts du voile du palais seuls peuvent être

médians ou latéralisés (49). Enfin, elles sont souvent très larges chez les chiens (15).

b) Classification

L’enjeu de réaliser une classification en humaine date du début du 20ème

siècle dans un

intérêt thérapeutique chirurgical (64)(15). Bien qu’il existe de nombreuses différences

concernant les fentes palatines chez l’homme et chez le chien, la classification réalisée par

KERNAHAN et STRAK en 1958 pour la médecine humaine est la plus adaptée à la médecine

vétérinaire (15)(64):

- Groupe I : Fentes labiales et gingivales (primaires), rostrales aux fentes incisives

1. Unilatérale (droite ou gauche)

2. Médiale Totale ou partielle

3. Bilatérale

- Groupe II : Fentes palatines (secondaires), caudales aux fentes incisives

1. Totale

2. Partielle

3. Sous-muqueuse

Figure 5: Fente palatine primaire, cheiloschisis Figure 6: Fente palatine secondaire

étendue jusqu'au palais mou,

palatoschisis

28

- Groupe III : Fentes labiales, gingivales et palatines

1. Unilatérale (droite ou gauche)

2. Médiale Totale ou partielle

3. Bilatérale

Une fente labiale est caractérisée de simple ou partielle lorsque seule la lèvre est

concernée ; elle est qualifiée de totale lorsqu’il y fente du rebord alvéolaire et de la lèvre

(120) (fig. 7).

La fente palatine sous muqueuse correspond à une fusion palatine presque complète

avec un défaut de soudure des os et des muscles seulement. La fente palatine totale s’étend

de la fente incisive au voile du palais (fig. 8) tandis que la fente palatine partielle ne

concerne qu’une partie du palais secondaire.

Figure 7: Vues ventrales de la région palatine d'un enfant

(67)

A. Individu normal

B. Bec-de-lièvre unilatéral partiel (atteignant la narine et la lèvre)

C. Bec-de-lièvre unilatéral total (atteignant la narine, la lèvre et la mâchoire)

D. Bec-de-lièvre total bilatéral

E. Fente palatine secondaire totale

F. Fente palatine secondaire associée à un bec-de-lièvre unilatéral total

29

Figure 8: Fente du palais secondaire TOTALE chez un Bouledogue Français (Groupe II 1

selon la classification de KERNAHAN et STRAK)

[Crédit photos M. Courchay]

STRAK R. B. a également classé les fentes palatines en fente palatine antérieure et

fentes palatine postérieure, dont la limite est marquée par le canal palatin (67).

Trois régions anatomiques peuvent intervenir dans la topographie des fentes labio-

palatines :

-les lèvres, délimitées médialement par le philtrum et recouvrant l’os incisif pair,

-le palais dur, longue voute portant les crêtes palatines, mettant en jeu trois structures

osseuses paires (rostralement à caudalement : les processus palatins de l’os incisif, les

processus palatins de l’os maxillaires et les lames horizontales de l’os palatin),

-le voile du palais, mobile, cartilagineux et sans structure osseuse.

Les fentes labio-palatines concernent :

-soit les lèvres « bec-de-lièvre » (cheiloschisis ou cheilognathoschisis), unilatérales ou

bilatérales, partielles ou totales fentes du palais primaire,

-soit le palais dur (palatoschisis) et/ou le voile du palais, médiales fentes du palais

secondaire,

-soit les deux régions anatomiques.

Les défauts du palais primaire sont moins graves que les défauts du palais

secondaire. L’espèce canine est plus touchée par les fentes du palais secondaire

contrairement à l’homme.

30

D. Organogénèse de la région du palais et formation des fentes palatines

1) Rappels de fondamentaux d’embryologie

La gastrulation, deuxième phase du développement embryonnaire suivant la

blastulation et précédent la neurulation, est à l’origine des trois feuillets à partir desquels se

forment tous les tissus d’un être vivant triblastique:

- l’ectoderme, feuillet externe, qui sera à l’origine de l’épiderme et du tissu neural ;

- le mésoderme, feuillet intermédiaire, à l’origine de l’appareil urogénital, circulatoire, du

tissu musculaire et osseux ;

- et l’endoderme, feuillet interne, qui formera le tractus respiratoire et gastro-intestinal

(56)(80)(4).

2) Formation de la tête

La forme de la tête est initialement marquée par le développement des six arcs

pharyngiens au cours de la 4ème

semaine de gestation, replis du mésenchyme issus de la crête

neurale (80)(56). C’est l’appareil pharyngé qui est à l’origine de la formation de la face,

de la bouche, des cavités nasales, du pharynx, du larynx, des structures cervicales, de l’oreille

externe et moyenne et d’une partie du système endocrinien (80).

a) Formation de la face (fig. 9 et 10)

La formation de la face comprend les régions orale, nasale et orbitaire. Son

développement est lent et complexe (4). Il fait intervenir cinq régions embryonnaires,

initialement séparées par de profonds sillons, qui sont :

- la proéminence (ou le bourgeon) fronto-nasale,

- les proéminences (ou les bourgeons) maxillaires (paires),

- et les proéminences (ou les bourgeons) mandibulaires (paires) (80)(114).

Ces proéminences sont des massifs mésoblastiques soulevant l’épiblaste de l’extrémité

crâniale (114).

La proéminence fronto-nasale se développe à partir du mésoderme dorsalement au

cerveau (33). C’est un bourgeon impair, le plus volumineux et médian.

La première paire d’arches pharyngées, aussi appelée arches mandibulaires, est à

l’origine des proéminences maxillaires dorsales et mandibulaires ventrales (80)(56). Ces

31

proéminences vont se développer grâce à de nombreuses mitoses et fusionner latéralement.

Elles enclavent alors la bouche primitive, le stomodeum, en une invagination ectodermique

rostrale qui formera la cavité orale (80)(4)(67). La membrane pharyngienne ferme

caudalement le stomodeum (114). La démarcation entre l’épithélium de la région buccale

d’origine ectodermique et d’origine endodermique n’est pas évaluable.

La paire de proéminences maxillaires ainsi que la proéminence fronto-

nasale convergent dorsalement au stomodeum et forme son plafond; tandis que la paire de

proéminences mandibulaires converge ventralement pour former le plancher du stomodeum

(fig. 9).

Parallèlement, la proéminence fronto-nasale forme deux épaississements

bilatéralement : les placodes nasales et optiques, dérivées de l’ectoderme (80)(56)(33). Ces

placodes sensorielles associées à des formations du tube neural seront à l’origine des organes

des sens de l’olfaction et de la vision (80)(4).

Les placodes nasales sont remplacées par un processus d’invagination par les fosses nasales

(fovea nasale, nasal pit en anglais) entourées des proéminences nasales. On distingue alors

les proéminences nasales médiales et les proéminences nasales latérales, aussi appelés

bourgeons naseaux internes et bourgeons naseaux externe, qui formeront les ailes du nez (67).

La proéminence fronto-nasale devient alors la proéminence frontale. La partie caudale de la

fausse nasale se différencie en placode olfactive (4).

Les placodes optiques se développent en récessus optiques puis se dilatent en vésicules

optiques.

Les proéminences maxillaires augmentent de taille rapidement et fusionnent

médialement avec les proéminences nasales médiales, fermant ainsi les fosses nasales et les

séparant du stomodeum (80)(4). La fusion de ces proéminences sera à l’origine des os

maxillaires et incisifs ainsi que des tissus des lèvres supérieures (fig. 9 et 10) (80)(56).

L’aspect morphologique final des lèvres supérieures dépend de cette fusion (80). Les

proéminences nasales médiales se développent simultanément, également rapidement, et

dessinent une dépression ventrale à la proéminence frontale : le sillon internasal, au fond

duquel se soulève un relief médian, le septum primitif du nez (4). La fusion incomplète des

proéminences nasales médiales est à l’origine du philtrum chez les carnivores (56). Chez le

chien, les proéminences maxillaires fusionnent médialement pour former la majorité de la

lèvre supérieure, tandis que chez l’homme la lèvre supérieure est composée des processus

maxillaires supérieurs ainsi que des bourgeons nasaux internes (104) (fig. 11).

Par conséquent, les fentes du palais primaire, les « becs de lièvre », résultent d’un

défaut d’union entre les proéminences nasale médiales et les proéminences maxillaires,

32

c’est pourquoi elles peuvent être unilatérales ou bilatérales (80)(56). Les fentes labiales

médiales, très rares, sont la conséquence d’un défaut d’union médiale entre les deux

bourgeons naseaux médiaux.

33

Figure 9: Développement séquentiel embryonnaire de la face chez le porc

(80)

Apparition des proéminences

faciales formant la face primitive

et formation des proéminences

nasale entourant les placodes

nasales

Apparition des fosses nasales

Développement des proéminences

mandibulaires et maxillaires

Fusion des proéminences

mandibulaires

Fusion :

- des proéminences nasales

médiales,

- des proéminences nasales

latérales avec les proéminences

maxillaires,

- des proéminences mandibulaires

avec les proéminences

maxillaires.

34

Figure 10: Développement de la lèvre supérieure et de la fosse nasale primitive en vue

antérieure et en vue ventrale chez un embryon humain

(la flèche permet de repérer le plan de la cavité nasale)

D’après (114)

Figure 11: Développement comparé de la lèvre supérieure chez le chien et l'homme

D’après (104) et (51)

Proéminence

maxillaire

droite

Proéminence

nasale

médiale

Proéminence

nasale

latérale

35

b) Formation des cavités nasales, buccale et du palais (fig. 12 et 13)

i. Formation du palais primaire

Les fosses nasales continuent de s’invaginer progressivement caudalement sous le

mésoderme de la proéminence frontale. Elles deviennent des sacs naseaux, séparés

médialement par un septum, et séparés ventralement de la cavité buccale (stomodeum) par

une fine membrane oro-nasale qui forme le palais primaire, portée par la région

prémaxillaire (80)(56)(4). La partie rostrale de ce palais primaire formera les processus

maxillaires. Le septum s’atrophie progressivement caudalement permettant la formation d’une

unique cavité orale (80). Le palais primaire s’atrophie également caudalement, seule la partie

la plus rostrale du palais primaire persiste, de forme triangulaire (33). Par conséquent la cavité

nasale primitive communique avec la cavité orale, cela correspond aux choanes primitifs qui

seront repoussés très caudalement (80)(114). Ils sont situés de chaque côté de la ligne

médiane immédiatement caudalement au palais primaire (67).

A ce stade, la langue occupe à la fois la cavité buccale et nasale (80)(114).

ii. Formation du palais secondaire : aspect général

Les processus palatins latéraux, issus de la croissance des parties profondes des

proéminences maxillaires, progressent ensuite vers la ligne médiale jusqu’à fusionner

pour former le palais secondaire (fig. 12) (4)(67). Les processus palatins, d’abord verticaux

de part et d’autre de la langue, se développent, s’élèvent et deviennent horizontaux pour se

rejoindre au niveau de la ligne médiale (fig. 13) (39). La partie rostrale du palais secondaire

fusionne avec les processus maxillaires. Il fusionne tardivement avec le palais primaire

formant un Y et laissant passer le conduit incisif (fig. 14) (4). En même temps que la fusion

des processus palatins, le septum nasal se développe et progresse ventralement jusqu’à

fusionner avec le palais secondaire, divisant la cavité nasale en deux cavités gauche et droite

distinctes (80). Il fusionne également rostralement avec la région maxillaire et le palais

primaire (4). A ce stade, les cavités nasales sont isolées de la cavité buccale et les choanes

définitives s’ouvrent au niveau du pharynx. La soudure du palais se réalise vers le 33eme

jour de gestation (56)(4)(51).

Le palais secondaire est tout d’abord une membrane qui s’ossifiera ensuite sur les deux

tiers rostraux pour former le palais dur et restera une membrane caudalement pour

former le palais mou (80).

36

Ainsi, la synchronisation et la précision lors de la fusion des différents tissus

intervenant dans la formation tardive du palais secondaire chez les carnivores pourrait

expliquer pourquoi la prévalence des fentes palatines est plus élevée chez ses espèces (56). De

plus, la fusion des deux hémi-palais est rapidement suivie d’une phase d’élargissement

important de la tête. C’est pourquoi si la formation du palais secondaire est retardée, les deux

hémi-palais seront trop courts pour fusionner ensemble ainsi qu’avec le septum nasal (33).

37

Figure 12: Développement embryonnaire

séquentiel des cavités nasales, orale et du

palais en coupe longitudinale

(80)

Figure 13: Développement embryonnaire

séquentiel des cavités nasales, orale et du

palais en coupe transversale

(80)

38

Figure 14: Développement embryonnaire du palais en vue ventrale

(33)

iii. Formation du palais secondaire : aspect histologique (fig.

15)

La formation du palais secondaire fait intervenir l’épithélium des deux processus

palatins, le MEE (Medial Edge Epithelium), qui fusionnent pour former l’épithélium

médian de jonction, le MES (Medial Epithelium Seam) (19) (fig. 15).

Le MEE est constitué d’une couche de cellules basales cylindriques, apposées sur

une lame basale, et couverte d’une couche de cellules épidermiques (19). Avant la fusion,

la face orale du MEE n’est histologiquement pas distinguable de sa face nasale.

La fusion commence au premier tiers du palais secondaire puis progresse rostralement

et caudalement (39).

Après adhésion des MEE, la dispersion de l’épithélium médian est une étape

cruciale du développement du palais. Quatre mécanismes pourraient être mis en jeu :

- la rétraction/contraction du feuillet épithélial,

- la migration des cellules épithéliales en direction nasale ou orale,

- l’apoptose,

- la transition épithélio-mésenchymateuse (39)(19).

Après la fusion, les différenciations tissulaires, cellules mésenchymateuses et

épithéliales, permettent la formation de l’organe final avec respectivement la formation des

os, muscles, nerfs et vaisseaux sanguins d’une part et l’épithélium nasal et oral d’autre part.

1. Palais primaire

2. Processus palatins du

palais secondaire

3. Septum nasal

39

Figure 15: Représentation séquentielle schématique de la fusion palatine secondaire à

l'échelle histologique

D’après (19)

A. Rapprochement des processus palatins : à ce stade, les cellules épidermiques recouvrent

encore les cellules basales du MEE

B. Premier contact et adhésion des cellules épidermiques

C. Convergence des cellules basales du MEE de chaque processus palatins formant une

seule couche cellulaire épithéliale, le MES, faisant intervenir des glycoprotéines de

surface

D. Rupture du MES et formation de « gouttelettes » de monocouche de cellules

épithéliales

E. Mort cellulaire du MES entrainant la dégradation de la lame basale : dispersion du

MES

F. Fin de la fusion avec mouvements cellulaires importants des cellules

mésenchymateuses

Lame

basale

Cellule

mésenchymateuse

Cellules

épidermiques

Cellules

basales du

MEE

40

3) Bilan sur l’étiopathogénie des fentes labio-palatines

La formation des fentes palatines résulte d’un défaut de coalescence des bourgeons

embryonnaires (dont le devenir est résumé dans le tableau I) se traduisant par la formation

d’une fissure. Ces anomalies de fusion peuvent être :

- entre bourgeon nasal interne et massif externe (bourgeon nasal externe et bourgeon

maxillaire) : bec-de-lièvre latéraux,

- entre les bourgeons nasaux internes : bec-de-lièvre médian,

- entre les processus palatins : fente palatine secondaire (114)(67).

Tableau I: Bilan du devenir des différentes proéminences embryonnaires

Proéminences embryonnaires Structures en dérivant

Proéminences frontale Front, proéminences nasales médiales et latérales, septum

nasal

Proéminences maxillaires

Parties latérales de la lèvre supérieure chez l’homme,

toute la lèvre supérieure chez le chien, joues, processus

palatins latéraux

Proéminences nasales médiales Philtrum

Proéminences nasales latérales Ailes du nez

Proéminences mandibulaires Lèvre inférieure

41

E. Etiologie des fentes labio-palatines congénitales

De nombreux facteurs de risques responsables des fentes labio-palatines ont été mis en

évidence, les principaux étant les facteurs génétiques et environnementaux (8).

1) Facteurs génétiques

a) Chez l’homme

Depuis de nombreuses années, les facteurs génétiques responsables de fentes labio-

palatines sont recherchés chez l’homme en utilisant des méthodes de traçage génétique

directement sur le génome d’une famille concernée et des méthodes d’association sur des

modèles animaux, permettant d’utiliser des lignées transgéniques, ou non (8). Les

L’organogénèse des fentes labio-palatines fait intervenir la formation de la face

d’une part et la formation des palais primaire et secondaire d’autre part.

La formation de la face implique cinq régions embryonnaires (d’origine

mésoblastique) :

- la proéminence (ou le bourgeon) fronto-nasale, à l’origine des proéminences frontales

et nasales (médiales et latérales),

- les proéminences (ou les bourgeons) maxillaires (paires),

- et les proéminences (ou les bourgeons) mandibulaires (paires).

Chez le chien, la formation de la lèvre dépend de la fusion des proéminences maxillaires

principalement.

La formation du palais primaire correspond à la formation d’une fine membrane

oro-nasale qui s’atrophie rostralement pour former une masse triangulaire portée par les

processus maxillaires.

La formation du palais secondaire est issue de la croissance des parties profondes

des proéminences maxillaires qui se soulèvent et progressent médialement pour fusionner

ensemble, et rostralement pour fusionner avec le palais primaire plus tardivement. La

soudure du palais se réalise vers le 33eme

jour de gestation.

Les différentes formes anatomo-cliniques des fentes labio-palatines ont donc bien

des origines embryonnaires différentes.

42

mécanismes génétiques mis en cause sont monogéniques ou polygéniques. De très nombreux

gènes intervenant dans la formation des fentes labio-palatines ont été mis en évidence (26).

Parmi ceux-ci, l’importance des gènes suivants dans le développement des fentes labio-

palatines est notée.

i. TGFA, Transforming Growth Factor Alpha

Le TGFA est un facteur de croissance dont le gène a été un des premier à être corrélé

avec la formation de fentes labio-palatines (26)(128). La famille des TGF et leurs récepteurs

jouent un rôle essentiel dans le développement de la face et du crâne. Le TGFA est fortement

exprimé lors de la fusion palatine et permet la synthèse de la matrice extracellulaire (26). Il est

présent en grande quantité dans le MEE (96).

ii. TGFB3, Transforming Growth Factor Beta 3

Les TGFB jouent un rôle majeur dans la croissance cellulaire et la différenciation

cellulaire. Le TGFB3 est principalement impliqué dans la palatogénèse et le développement

pulmonaire (26).

iii. MSX1, Msh homéobox 1

La protéine MSX1 joue également un rôle important lors de l’embryogénèse et

intervient, entre autres, dans le développement cranio-facial. Une mutation de son gène est à

l’origine de fentes labio-palatines (70). 2% des fentes labio-palatines observées en médecine

humaine sont corrélées avec des mutations du gène MSX1 (128).

L’association MSX1 et TGFB3 semble augmenter le risque de fentes labio-palatines

(96).

iv. MTHFR, 5,10-méthylène tétrahydrofolate réductase

L’enzyme MTHFR est une enzyme-clé dans le métabolisme des folates.

Une mutation C T (C677T) sur le gène codant pour la 5,10-méthylène

tétrahydrofolate réductase (MTHFR) remplaçant une valine par une alanine entraine des

anomalies du tube neural. Il a été démontré qu’une telle mutation est un facteur de risque pour

les fentes labio-palatines (77). L’enzyme mutée est thermolabile et la mère porteuse d’un tel

43

génotype présenterait un risque d’avoir un enfant atteint de fente labio-palatine augmenté de

4.6% (95).

v. Derniers gènes mis en évidence

TBX22 (T-box transcription factor 22), PVRL1 (Poliovirus-receptor like-1) et IRF6

(Interferon Regulatory Factor 6) sont des gènes dont les mutations découvertes récemment

jouent un rôle non négligeable comme facteur de risque de fentes labio-palatines (128).

Les altérations génétiques sont donc nombreuses et toujours en voie d’investigation, et

les données actuelles ne permettent pas encore de corriger les processus défectueux avant la

naissance. De nos jours, la base génétique des fentes labio-palatines est toujours controversée

de par la grande complexité génétique de leur formation (96).

Les facteurs fœto-maternels sont également nombreux.

b) Chez le chien

La fréquence plus élevée de fentes palatines dans certaines races comme le

Bouledogue Français et sa rareté voir absence dans d’autres races, laisse supposer la présence

de tares héréditaires. Un mode de transmission de type autosomal récessif du caractère

fente palatine est fortement suspecté chez le Bouledogue Français et le Boxer, suite à une

étude combinant la présence de fentes palatines et l’analyse des pédigrees (11).

2) Facteurs environnementaux

a) Facteur iatrogène

La période la plus embryotoxique correspond à la période précédant l’implantation

embryonnaire à la muqueuse utérine, soit les 20 premiers jours de gestation chez la chienne

(30). En effet chez la chienne, le stade embryonnaire est défini jusqu’au 35ème

jour de

gestation et le stade fœtal à partir du 35ème

jour. L’administration de médicaments pendant

cette période peut donc être à l’origine de malformations congénitales mais aussi

d’avortement. Les médicaments tératogènes sont nombreux ; parmi les plus fréquents sont

notés : les progestatifs, les corticoïdes, les antifongiques (dont la griséofulvine), de

44

nombreux antibiotiques (tétracycline, gentamicine, dihydrostreptomycine, terramycine), la

primidone (barbiturique) (30)(89).

De nombreuses études ont été réalisées pour connaitre les doses toxiques de ces

molécules et le stade de gestation critique. Chez le rat par exemple, la dose de

glucocorticoïdes entrainant des fissures palatines est de 3.48 mg/kg (59).

b) Cause virale/bactérienne/parasitaire

Il n’a pas été démontré chez le chien qu’une affection générale durant la gestation était

à l’origine de fentes palatines. Cependant certaines maladies peuvent entrainer d’autres

malformations congénitales. C’est le cas du virus CPV-1 responsable de la parvovirose qui

serait un des facteurs de l’anasarque congénital (30).

Cependant chez l’homme, le virus de la grippe est à l’origine de malformations

congénitales (fentes labio-palatines, anomalies du tube neural et malformations cardio-

vasculaires), bien qu’il semble que ce soit plus la fièvre associée qui en soit responsable (1).

c) Facteurs nutritionnels

i. Excès en vitamines A et D

La dose recommandée en vitamine A et D pour les chiennes gestantes est de 1000

UI/kg (30). Des fentes palatines congénitales sont observées pour des taux supérieurs à 12500

UI/kg entre le 17ème

et 22ème

jour de gestation (30).

De nombreuses études chez différentes espèces ont permis de mettre en évidence

qu’une hypervitaminose A serait à l’origine de fentes palatines. Les travaux de SWENSON

M.J. et WIERSIG D.O. en 1967 ont établi qu’une administration de vitamine A à 125000

UI/kg à des chiennes entre le 7ème

et le 22ème

jour de gestation entrainait la présence de fentes

palatines dans la portée (109). L’étude de LORENTE C.A. et MILLER S.A. en 1978 portant

sur des rats a montré que la vitamine A sous sa forme acide rétinoïque est plus tératogène que

sous sa forme acétate de rétinyle et que l’hypervitaminose du point de vue histologique

empêche la réorientation des deux hémipalais lors de l’organogénèse chez le rat (75).

Enfin, selon DAVIES M., un régime contenant de fortes concentrations en vitamine A

serait un facteur contribuant aux fentes labio-palatines dans 50% des cas (23).

45

ii. Carences en magnésium, Zinc et vitamine E

Une carence en Zinc, élément chimique important lors du développement, peut être à

l’origine de fentes labio-palatines et d’autres malformations congénitales (85).

iii. Carences en vitamines B6, B12 et folates

Ce sujet sera développé dans la partie III.

iv. L’alcool

Une forte consommation d’alcool chez la femme peut entrainer des fentes labio-

palatines (128)(45).

d) Physiques

L’irradiation et la fumée de cigarette peuvent être à l’origine de fentes palatines

(8)(45)(72). Le mécanisme exacte selon lequel la fumée de cigarette interfère avec le

développement de la face n’est pas encore connu mais l’hypothèse que l’hypoxie affecte le

développement de la face est soulevée (8).

L’interaction gène/facteurs environnementaux est également importante à prendre en

compte (85). Par exemple plusieurs études mettent en évidence que l’effet combiné d’une

mutation de TGFA et d’une consommation maternelle de cigarettes pouvait augmenter le

risque de fentes labio-palatines (96).

3) Trouble métabolique maternel

Le diabète maternel est considéré depuis longtemps comme tératogène (51)(112).

4) Mécanique

Une mauvaise position du fœtus lors de l’organogénèse ainsi qu‘un traumatisme

peuvent entrainer des fentes labio-palatines (51).

46

F. Prise en charge des fentes palatine chez le chien

La prise en charge des fentes palatines est médicale dans un premier temps puis

obligatoirement chirurgicale. Cependant, elle est lourde et onéreuse et les propriétaires

choisissent la plupart du temps l’euthanasie chez le chien. De plus, pour les éleveurs, la

naissance d’un chiot présentant cette malformation entrainera d’autres complications : le chiot

sera plus difficile à vendre, sera probablement plus chétif, ne pourra être confirmé et devra

être éliminé de la reproduction afin de ne pas risquer de transmettre des tares génétiques.

1) Prise en charge immédiate : cathétérisme œsophagien

Le chiot nouveau-né ne peut pas subir d’intervention chirurgicale lourde sans risque.

La chirurgie est donc réalisée avec certaines restrictions :

- l’animal doit avoir une taille suffisante pour permettre au chirurgien l’accès à la cavité

buccale ;

- l’anesthésie présente moins de risque chez un sujet plus âgé ;

- enfin, les lambeaux de tissus utilisés lors de la chirurgie doivent être suffisamment larges

pour permettre à la muqueuse orale de cicatriser plus facilement (89)(49)(37).

L’âge conseillé pour l’intervention chirurgicale varie alors de 3 semaines, 6-8 semaines, 8 à

12 semaines, 16 semaines à 3-4 mois selon les auteurs (56)(54)(49)(37). L’animal doit donc

être réalimenté à l’aide d’un cathéter spécifique afin d’éviter le passage du lait dans les

voies aérophores en attendant la reconstruction chirurgicale. Le cathéter mis en place peut être

L’étiologie des fentes labio-palatines fait intervenir principalement:

- des facteurs de risque génétiques,

nombreux gènes mis en cause chez l’homme dont la MTHFR, enzyme-clé du

métabolisme des folates,

transmission de type autosomale récessive chez les Bouledogue français et les Boxers ;

- des facteurs de risques environnementaux (iatrogènes, nutritionnels, fumée de

cigarette…).

Les facteurs de risques peuvent agir en synergie.

Bien que les facteurs de risques soient de mieux en mieux identifiés, les fentes

labio-palatines ne sont pas rares et leur prise en charge reste lourde.

47

naso-œsophagien, à œsophagostomie, à gastrotomie ou par intubation gastrique (fig. 16)

(130).

Lors d’intubation gastrique, la longueur de la sonde gastrique à faire déglutir au jeune

correspond à la distance entre la pointe du museau et la pointe du coude (fig. 17 A). Le

volume de lait à administrer pour réalimenter un chiot ou un chaton est d’environ 5 % du

poids vif toutes les 2 à 4 heures (exemples 10 mL pour un chiot de 200 g). La seringue

remplie de lait à 37-38°C est branchée sur la sonde que l’on introduit doucement par la

bouche maintenue horizontalement, la tête en extension (fig. 17 B et C). Lorsque l’estomac

est rempli, le lait progresse plus difficilement. Il faut alors suspendre l’administration.

Figure 16: Principe de l'intubation gastrique d'un nouveau-né (1/2)

(40)

48

Figure 17: Principe de l'intubation gastrique d’un nouveau-né (2/2)

[Crédit photos E. Rosset]

A. Mesure de la longueur de

la sonde à faire déglutir

(longueur tête-coude) et

marquage à l’aide d’un

sparadrap.

B. Après avoir déposé une

goutte de lait sur la lange, le

chiot déglutit naturellement

la sonde dans l’œsophage

jusqu’à l’estomac.

C. Une fois le cathétérisme

réalisé jusqu’à l’estomac,

gavage du chiot avec du lait

(noter sur ce chiot la double

fente labiale).

49

2) Prise en charge chirurgicale : palatoplastie

La prise en charge chirurgicale n’est envisageable que dans le cas de fente de taille

peu volumineuse.

Dans le cas de fente palatine congénitale du palais osseux, elle consiste en l’obturation de la

fente oro-nasale par un volet mucopériosté « overlapping flap » (technique générale

principale présentée de manière simplifiée) (fig. 18):

- incision d’un volet jusqu’à l’os sur un des deux hémi-palais, le long de l’arcade dentaire (en

veillant à protéger l’artère palatine dont le trajet est parallèle au raphé, à 1 centimètre environ

de celui-ci),

- décollement du volet de la muqueuse et du périoste à l’aide d’une rugine,

- apposition du volet sous l’autre hémi-palais, aillant préalablement été incisé au bistouri sur

la même longueur,

- réalisation des sutures qui ne doivent présenter aucune tension : points en U séparés à l’aide

d’un fil synthétique résorbable décimale 1.5 à 2 (49)(37)(130). Afin de limiter au maximum

les tensions sur les sutures, facteur important pour le pronostic, le lambeau doit être bien plus

large que la fente à combler (37).

Il existe cependant de nombreuses autres techniques comme la réalisation de deux volets

mucopériostés.

Une radiographie thoracique pour contrôler l’état des poumons juste avant le chirurgie est

conseillée (54).

50

Figure 18: Prise en charge chirurgicale par la technique d'overlapping flap d'une fente

palatine secondaire médiale chez un Mastiff de 4 mois

(Université de l’Illinois à Urbana, États-Unis, service de dentisterie)

(130).

La réalimentation à l’aide de la sonde devra être poursuivie 8 à 10 jours après la

chirurgie afin d’assurer la cicatrisation des plaies ; la déhiscence des plaies étant l’une des

principales complications. Elle doit ensuite être relayée par un régime liquidien sans sonde

pendant au moins 4 semaines (130). Une antibiothérapie large spectre devra être prescrite

avant la chirurgie puis pendant 10 à 14 jours (37)(130).

Dans la plupart des cas, une seule intervention chirurgicale est suffisante et le

pronostic est bon à excellent (89)(130).

A. Incision parallèle à

l’axe médian sur un des

hémi-palais

B. Le volet est rabattu

sous le mucopérioste de

l’autre côté. Une

incision est réalisée le

long de l’arc dentaire

afin de limiter les

tensions

C. Réparation complète

du palais dur après

suture par points séparés

D. Zone opératoire 3 ans

après la chirurgie

51

Les fentes labio-palatines congénitales sont des malformations d’origine

embryonnaire du palais et/ou de la lèvre. Leur fréquence n’est pas négligeable dans

l’espèce humaine. La prévalence d’animaux affectés dans l’espèce canine n’est pas

déterminée ; en effet, ils ne sont pas conservés car il existe une possibilité de

transmission génétique et les répercussions médicales rencontrées sont lourdes.

Cependant une dominance de la fente palatine seule chez le chien est observée,

touchant principalement les races brachycéphales.

En médecine humaine le diagnostic des fentes labio-palatines peut être réalisé

en anté-natal par l’examen échographique. En médecine vétérinaire, elles sont le plus

souvent découvertes à la mise-bas.

La palatogénèse est un mécanisme complexe, la fusion palatine intervenant au

33ème

jour de gestation chez le chien.

De nombreux facteurs environnementaux et génétiques peuvent être des

facteurs de risques compromettant le bon déroulement de cette palatogénèse, et leurs

interactions sont non négligeables. Les plus importants sont les carences en acide

folique et une mutation de la MTHFR ; ils seront développés dans la troisième partie.

Le traitement des fentes labio-palatines nécessite obligatoirement une chirurgie

dont la prise en charge peut paraitre lourde et onéreuse pour les propriétaires mais dont

les résultats sont souvent un succès.

Après avoir documenté la pathophysiologie des fentes labio-palatines

congénitales chez le chien en comparaison avec l’homme, vont être abordées l’étude

de la gestation, ciblée sur le liquide amniotique et la formation des enveloppes fœtales,

ainsi que les différentes conditions de mise-bas. En effet, le liquide amniotique,

prélevé au cours d’une césarienne programmée, constitue un des échantillons

permettant la réalisation de ce travail.

52

II. Du fœtus dans ses enveloppes fœtales à la mise-bas

La compréhension de l’anatomie et du développement du fœtus dans son milieu

pendant la gestation parait nécessaire pour son abord clinique dans notre étude lors des

prélèvements de liquide amniotique.

De plus, des pathologies graves des enveloppes fœtales telles que l’hydramnios

peuvent être entrainées par une malformation congénitale. Un aperçu de cette affection,

motivant d’avantage la recherche de marqueur anténatal de fentes labio-palatines, sera ensuite

développé.

Enfin, tous les prélèvements réalisés lors de cette étude clinique le sont à partir de

césarienne programmée. Ainsi, une documentation de la mise-bas, eutocique à dystocique,

permettra de replacer la réalisation d’une césarienne programmée dans son contexte.

A. La gestation chez les canidés

Comme chez tous mammifères euthériens placentaires, la gestation correspond au

développement du zygote dans l’appareil génital de la femelle après la fécondation.

Elle est divisée en deux étapes successives :

- une phase tubaire, longue, de six à huit jours, où le zygote en développement remonte la

corne utérine,

- une phase utérine, beaucoup plus longue, s’achevant pas le part et elle-même divisée en

deux étapes successives :

* une phase de pré-implantation, l’œuf (blastocyste) est alors libre dans la

cavité utérine,

* l’implantation ou nidation, où il se fixe à la paroi utérine, qui commence à

partir du dix-septième/dix-huitième jours de gestation (56)(4)(31).

L’implantation permet d’assurer les fonctions de respiration, nutrition et d’élimination du

fœtus.

La gestation chez la chienne présente une durée très variable en se datant par rapport à la date

de la saillie : elle dure environ 57 à 70 jours ; mais elle dure 61 à 63 jours en prenant comme

point de départ la date d’ovulation (31).

Au cours du développement embryonnaire, les membranes fœtales ou enveloppes

fœtales, encore appelées « annexes », vont se développer et assurer protection et nutrition du

fœtus. Le conceptus correspond à l’ensemble embryon-annexes (4). Le placenta est la

membrane la plus externe, unie à la muqueuse utérine, à l’origine de la phase placentaire.

53

C’est un organe à part entière qui n’appartient pas aux annexes fœtales (4). Les annexes et le

placenta vont être expulsés lors de la mise-bas.

B. Le liquide amniotique et ses structures environnantes

1) Présentation et rôles des enveloppes fœtales (fig. 19, 20 et 21)

Les différentes enveloppes fœtales sont décrites depuis le fœtus vers la paroi utérine.

a) L’amnios et le liquide amniotique

i. Description

L’amnios est l’enveloppe la plus interne du conceptus. Il forme la cavité amniotique

dans lequel le fœtus « flotte » dans un liquide : le liquide amniotique, Liquor amnioticus. Sa

paroi est fine, solide et transparente. Elle permet le passage du cordon ombilical dans la cavité

amniotique et se raccorde au tégument du fœtus au voisinage de l’ombilic (4). L’invagination

crée par la paroi autour de l’extrémité amniotique du cordon est parfois appelée hile de

l’amnios (4).

La face externe est constituée d’un conjonctif très mince dérivé du mésoderme extra-

embryonnaire appelé conjonctif inter-annexiel. Elle est adhérente à l’allantoïde. Le

conjonctif est composé de nombreuses fines fibres de collagènes plus ou moins serrées, de

cellules mobiles, de cellules fixes étoilées en quantité importante et de quelques fibres

musculaires lisses (4). En continuité avec le conjonctif du cordon, la couche conjonctivale se

raccorde au derme cutané du fœtus.

La face interne est libre, lisse et présente l’aspect d’un revêtement séreux. Elle

présente cependant au niveau du cordon ombilical des petits reliefs, les plaques amniotiques,

qui lui donnent un aspect rugueux. C’est la face interne de l’amnios qui produit le liquide

amniotique. Elle est constituée d’un épithélium simple à cellules plates ou cubique dérivé

de l’ectoderme extra-embryonnaire. L’épithélium devient stratifié au niveau du cordon

ombilical où il fait transition avec l’épiderme cutané du fœtus (4).

Le liquide amniotique, encore appelé les eaux de l’amnios, est clair et transparent. Il

devient blanchâtre, trouble et visqueux en fin en gestation (4). Il est sécrété par l’amnios et

résorbé en parti par l’utérus. Le tractus urinaire du fœtus joue également un rôle dans la

production du liquide amniotique (50). Chez la chienne, sa quantité augmente

54

progressivement pendant la gestation pour attendre environ 50 à 60 ml en fin de gestation (4).

Chez la femme, il passe de 0 mL à 500-1100 mL en fin de grossesse (50).

C’est un liquide légèrement alcalin composé :

- de chlorures alcalins,

- de phosphate de chaux,

- de glucose,

- d’urée,

- d’albumine en petite quantité,

- d’un mucus de plus en plus abondant au cours de la gestation,

- et d’un pigment proche de ceux de la bile (4).

De multiples échanges ont lieu entre le liquide amniotique et le fœtus et mettent en jeu

plusieurs appareils du fœtus : urinaire, respiratoire, gastro-intestinal et la peau (50).

Figure 19: Le fœtus de chien et ses annexes embryonnaires

(31)

ii. Fonctions

Le rôle de l’amnios est de produire et de contenir le liquide amniotique dont les

fonctions sont très importantes.

Le liquide amniotique joue un rôle essentiel de soutien et de protection du fœtus.

En effet, le fœtus est ainsi protégé des chocs et des compressions locales par la répartition

55

égale des pressions sur toute la surface de son corps (4)(31)(105). Le fœtus est également

mobile dans la cavité amniotique et libre de ses mouvements (4)(31).

Il permet aussi d’empêcher les tissus d’adhérer les uns aux autres lors du développement

rapide de l’embryon et joue le rôle d’un agent antiadhésif (105).

Le liquide amniotique présente également une fonction de nutrition du fœtus. En effet, par

ingestion du liquide, le fœtus y trouve certains nutriments : électrolytes hydrates de carbone,

lipides et protéines (31).

Il permet de plus de lubrifier les voies génitales lors de la mise-bas afin de faciliter le

passage du nouveau-né (4).

Enfin, le liquide amniotique joue un rôle dans l’attachement mère-enfant. Pendant la

gestation, il permet de capter les différences d’odorat, de gouts, de luminosité et d’audition du

fœtus. Ainsi, un premier contact peut être établi entre la mère et le fœtus. De plus, et cela est

particulièrement décrit chez les ovins, l’attraction olfactive de la mère pour le liquide

amniotique à la naissance déclenche le comportement maternel et la reconnaissance du petit

(91)(92).

b) L’allantoïde

L’allantoïde sépare complétement l’amnios du chorion. Elle prend une disposition en

séreuse séparée en un feuillet amniotique et en un feuillet chorial, qui délimitent la cavité

allantoïdienne particulièrement développée dans l’espèce canine (4)(31). La paroi est mince

et transparente. Un pédoncule creux, appelé conduit allantoïdien, permet la communication

de l’allantoïde avec le sinus uro-génital du fœtus.

Le feuillet amniotique recouvre la face externe de l’amnios, sauf au niveau du sac

vitellin. Il fusionne avec la face externe de l’amnios pour former l’allanto-amnios, surface

d’échanges respiratoires (31).

Le feuillet chorial recouvre la face interne du chorion, à laquelle il s’unit de façon

étroite au niveau de la ceinture placentaire pour former l’allanto-chorion.

La cavité allantoïdienne contient le liquide allantoïdien et est traversée par la partie

extra-amniotique du cordon ombilical. Cette dernière, à la sortie du hile amniotique, est

recouverte par l’allantoïde. L’ouraque ou canal de l’ouraque correspond à la courte partie du

conduit allantoïdien reliant l’ombilic au pôle crânial de la vessie du fœtus (4). Par extension,

il désigne aussi souvent le conduit allantoïdien dans son ensemble (31). Le liquide

allantoïdien est produit en faible quantité et d’aspect ambré-jaunâtre. Il devient de plus en

abondant et trouble au cours de la gestation puis régresse en fin de gestation pour atteindre

56

environ 60-70 ml au moment de la mise-bas. Sa quantité maximale est atteinte en milieu de

gestation. Sa composition est proche de celle du liquide amniotique avec d’avantage d’urée et

la présence de l’allantoïne, substance azotée (4).

La paroi comporte une partie interne de type endothéliale d’origine endodermique et

une partie externe correspondant à une lame mésoblastique. La partie endothéliale est formée

d’une seule couche de cellules plates, polygonales, dont les limites sont parfois difficilement

identifiables (4). La lame externe est formée d’une mince couche conjonctive fibrillaire. Ce

tissus conjonctif est en continuité avec le conjonctif du péritoine de l’embryon par

l’intermédiaire du tissus mucoïde du cordon ombilical (4).

L’allantoïde permet de collecter les déchets émis par l’embryon (105).

c) Le sac vitellin, le lécithocoele

Le sac vitellin est une annexe embryonnaire transitoire. Il est mis en place très tôt et

persiste jusqu’à la fin de la gestation avec une forte diminution de taille au cours de la

seconde moitié de gestation. Au moment du part, il correspond à une étroite cavité cylindrique

presque aussi longue que le conceptus, placée coté ventral du fœtus entre l’amnios et le

feuillet amniotique de l’allantoïde.

C’est un sac piriforme translucide délimitant la cavité vitelline contenant le liquide

vitellin en faible quantité. Il est appendu à l’intestin de l’embryon. Ses parois sont très riches

en vaisseaux vitellins, cela constitue le premier réseau vasculaire extra-embryonnaire (83). Le

conduit vitellin, grêle, permet la continuité entre le sac vitellin et l’intestin moyen de

l’embryon. Il achemine également les artères et veines vitelline jusqu’au réseau vasculaire

primitif de l’embryon (4).

La face interne tapissant la cavité vitelline et constituée d’un épithélium simple à

cellules cubiques ou cylindriques.

Le sac vitellin permet d’assurer les premiers échanges entre l’embryon et le milieu

utérin jusqu’à la mise en place du placenta définitif entre le 23ème

et 27ème

jour de gestation

(4). Il persiste cependant chez les carnivores jusqu’à la fin de la gestation mais, même s’il

occupe un volume non négligeable chez ces espèces, il ne rentre pas en contact avec le

chorion et n’intervient pas dans la formation du placenta (4). Il joue un rôle important

d’échange de substances avec l’embryon tout d’abord par absorption puis par échange de

nutriment au niveau du réseau vasculaire.

57

d) Le chorion

Le chorion est l’enveloppe la plus externe du conceptus. Les chorions des fœtus

voisins de la même corne gravide peuvent s’accoler voire se confondre (4). Il forme un sac

cylindroïde aplati en son milieu par une épaisse ceinture, le placenta. Outre au niveau de la

ceinture placentaire, il est transparent, lisse et fin, apposé sur l’endomètre. Pour un conceptus

d’environ 15-16 cm, la ceinture placentaire présente une largeur de 4 cm (4).

Sa face externe est étroitement liée à l’endomètre, la muqueuse utérine, et participe à

la formation du placenta. Les parties ne correspondant pas au placenta sont formées d’un

épithélium simple et cylindrique.

Sa face interne est recouverte d’un tissu conjonctif dense issu du mésoderme extra-

embryonnaire. La couche conjonctivale est cependant moins dense que le conjonctif de

l’amnios. Ce conjonctif est composé de fines fibres de collagènes plus ou moins serrées et de

cellules fixes étoilées en quantité moins importante que dans l’amnios (4). Il contient

également des cellules mobiles. Ce conjonctif contient également les vaisseaux issus du

cordon ombilicale et se distribuant dans le placenta.

A l’inverse de l’amnios, l’épithélium correspond ici à la face externe et le conjonctif à la face

interne.

Il présente de nombreux rôles :

- fonction de nutrition de l’embryon puis du fœtus,

- fonction de fixation du fœtus,

- fonction de support du placenta,

- rôle de protection mécanique du fœtus par le maintien des autres annexes.

2) Le cordon ombilical

Le cordon ombilical assure les échanges vitaux du fœtus. Il est épais et court, ne

mesurant pas plus de 10 cm (4). Il est différencié en une partie amniotique très courte de 2 à 3

cm et une partie allantoïdienne allant du hile de l’amnios au placenta.

58

3) Le placenta, un organe à part entière

La placentation est zonaire, endothéliochoriale, décidue et labyrinthique. Elle est

mise en place dans son intégralité à un mois de gestation (4)(84). Le placenta présente un

aspect fortement spongieux et est de couleur rouge sombre lors de la mise bas. Il contient un

pigment vert issus de la dégradation de l’hémoglobine : l’utéro-verdine (31)(84). Il est formé

à partir de tissus maternel et de structures extra-embryonnaires (56).

La placentation est zonaire de par la présence d’une ceinture placentaire formant un

anneau central autour du conceptus. L’utéro-verdine est concentrée sur les deux anneaux de

part et d’autre de la ceinture zonaire du placenta à l’origine des « bordures vertes » du

placenta, correspondant à des hématomes marginaux d’un diamètre d’environ 8 mm à terme

(4)(105)(83)(84). Ces dernières sont également appelées paraplacenta dont le rôle est encore

inconnu (105). Ainsi, le placenta est séparé en deux zones distinctes : la zone d’échange

centrale et les bordures vertes.

La placentation est de type endothéliochorial : l’endothélium utérin est en contact

direct avec les villosités placentaires (4). Ce type de placentation est caractérisée par l’érosion

complète de l’endomètre (105). Seul l’endothélium capillaire maternel persiste dans la

muqueuse utérine (84). Par conséquent les vaisseaux capillaires maternels sont en contact

direct avec l’épithélium chorionique (105).

Le placenta est dit décidu car il conditionne une dégradation plus ou moins importante

de la muqueuse utérine (84).

Enfin, il est dit labyrinthique car le développement des villosités forme un réseau de

tissus fœtal autour des vaisseaux sanguins maternels (84).

Le placenta chorio-allantoïdien dérive de l’union du chorion et des vaisseaux de

l’allantoïde (31). La placentation est en place dans son intégralité au 23ème

jour de gestation

(31).

En plus des échanges métaboliques et nutritifs entre la mère et l’embryon, le placenta

est un organe endocrine essentiel sécrétant des hormones permettant :

- le maintien de la gestation ;

- le développement des glandes mammaires ;

- la croissance des fœtus (105).

59

Figure 20: Les annexes fœtales du fœtus de chien

(4)

60

Figure 21: Le fœtus de chien découvert et ses annexes

(4)

61

C. Développement embryonnaire des enveloppes fœtales

Lors de l’embryogénèse, un ensemble de phénomène permet la différenciation de

l’embryon de ses annexes. Ses annexes se développent très rapidement en début de gestation.

Tout comme l’embryon, elles dérivent du blastocyste (4). Ce développement est une étape

essentielle précédant l’implantation (105).

A la fin de la blastulation, l’embryon, libre dans la cavité utérine, correspond à une

sphère de trophectoderme (couche de cellules externes de la morula) entourant la masse

cellulaire interne et la cavité blastocytaire (fig. 22 A) (56). La masse cellulaire interne

s’étale en disque plat et se différencie alors en épiblaste et hypoblaste (56)(4). Les cellules

de l’hypoblaste se multiplient progressivement selon une ligne ventrale à l’épiblaste et

tapissant l’intérieur du trophectoderme délimitant alors le sac vitellin primitif vers le 9ème

jour (fig. 22 B et C).

Lors de la gastrulation, l’endoderme sépare l’hypoblaste de l’épiblaste et le

mésoderme se distingue en intra-embryonnaire et extra-embryonnaire dès le 12ème

jour

(56)(4). Ce dernier se différencie également en mésoderme extra-embryonnaire somatique

ou viscéral (fig. 22 C) (56). Ces deux couches délimitent ainsi le cœlome extra-

embryonnaire (fig. 22 D) (113). Le chorion est formé par l’association du mésoderme extra-

embryonnaire somatique et du trophectoderme essentiellement (56)(105). Tandis que le

mésoderme extra-embryonnaire viscéral, l’hypoblaste et l’endoderme forment la

splanchnopleure (56).

Le conceptus est formé de 4 enveloppes fœtales :

-l’amnios qui produit le liquide amniotique permettant principalement au fœtus de se

mouvoir, permettant de le protéger des chocs et permettant la lubrification des voies

génitales pour la mise-bas ;

-l’allantoïde qui produit le liquide allantoïdien, particulièrement développé chez les

canidés, assurant la collecte des déchets produit par le fœtus ;

-le sac vitellin, annexe embryonnaire transitoire assurant les premiers échanges entre le

fœtus et le milieu utérin ;

-le chorion, dont la face externe étroitement liée à la muqueuse utérine intervient dans la

formation du placenta.

62

Le chorion est l’organe de l’implantation : il développe précocement des villosités,

appelées villosité chorioniques, permettant l’ancrage primitif du blastocyste à l’endomètre

(4)(105).

L’allantogénèse est simple et précoce. L’allantoïde, apparaissant vers le 18ème

jour,

se forme à partir d’une évagination mésoblastique du tube digestif postérieur embryonnaire

lorsque la sac vitellin définitif est formé (fig. 22 D) (56)(105). Un diverticule creux est alors

observé et sera reporté ventralement lorsque se ferme l’extrémité caudale de l’embryon (4).

Parallèlement à la croissance de l’embryon, l’allantoïde se développe dans le cœlome extra-

embryonnaire jusqu’à occuper toute la cavité et former la cavité allantoïdienne (fig. 22 E, F

et H). Le feuillet chorial de l’allantoïde fusionne alors avec le chorion pour former

l’allantochorion vers le 20ème

jour (56)(84). L’allantoïde prend une disposition zonaire en

ceinture et n’atteint pas les extrémités du sac chorial (4).

La formation de l’amnios, d’origine ectodermique, résulte d’une amniogenèse par

plissement (4). Lorsque la délimitation de l’embryon apparait, l’ectoderme extra-

embryonnaire se soulève autour de l’embryon en un pli annulaire : le pli limitant (fig. 22 D et

E, flèches bleues) (4). Il forme alors une lame qui tend à couvrir l’embryon, au début de la

troisième semaine, dont le bord libre correspond au pli chorio-amniotique délimitant

dorsalement à l’embryon un orifice : l’ombilic de l’amnios (fig. 22 F) (4)(105). Ce dernier

fini par se fermer, vers le 24ème

jour du développement, laissant apparaitre la cavité

amniotique ; et l’allantoïde s’insinue entre le chorion et l’amnios (fig. 22 H). Avasculaire au

début de son développement, l’amnios devient vascularisé par les vaisseaux du feuillet interne

de l’allantoïde (83).

Le sac vitellin primitif, volumineux par rapport à l’embryon, régresse progressivement

ainsi que son point d’attache sur l’embryon. Le sac vitellin définitif est alors relié par le

pédoncule vitellin qui s’allonge avec le cordon ombilical dans lequel il prend place pour

devenir le conduit vitellin grêle et long (4).

Au stade gastrula, la phase ventrale de l’embryon forme donc le plafond du sac vitellin

primaire et sa face dorsale correspond au trophoblaste ou cavité amniotique primitive (4).

L’implantation, phénomène par lequel l’embryon se fixe à la muqueuse utérine

établissant des rapports intimes et précédant la formation du placenta, ainsi que le

développement du placenta ne seront pas détaillés dans ce travail.

63

Figure 22: Développement embryonnaire séquentiel des enveloppes embryonnaires, présenté

en coupe longitudinale

D’après (56)

18 19

1. Masse cellulaire interne

2. Trophectoderme

3. Cavité blastocytaire

4. Epiblaste

5. Hypoblaste

6. Mésoderme intra-

embryonnaire

7. Endoderme

8. Mésoderme somatique extra-

embryonnaire

9. Mésoderme viscéral extra-

embryonnaire

10. Sac vitellin primitif

11. Tube digestif primitif

12. Allantoïde

13. Sac vitellin définitif

14. Cœlome extra-embryonnaire

15. Chorion

16. Splanchnopleure

17. Fusion entre la membrane du

sac vitellin et le chorion

18. Allantochorion

19. Cavité amniotique

Dorsal

Antér

ieur

Posté

rieur

Ventral

64

D. Développement anomal des enveloppes fœtales : l’hydramnios, une

conséquence pour la mise-bas chez la femme

L’hydropisie, accumulation anormale de liquide dans le tissu conjonctif ou dans une

cavité, des enveloppes fœtales est rencontrée chez toutes les espèces avec une topographie

différente selon l’espèce. Chez les bovins par exemple, l’hydrallantoïde est la manifestation

la plus fréquente (80 à 85% des cas d’hydropisie des enveloppes fœtales) et entraine de lourde

conséquence pour la vache et le veau (28).

1) Définition

L’hydramnios, également appelé polyhydramnios, est une augmentation

pathologique du volume de liquide amniotique, le plus souvent due à un déséquilibre

entre la production et l’élimination de ce liquide (47). Sa prévalence est d’environ 1% à

2.1% des grossesse dans l’espèce humaine (9)(44)(78).

Le fœtus élimine le liquide amniotique par ingestion et déglutition de celui-ci. Le

liquide amniotique est également éliminé de la cavité par absorption intramembranaire et

intravasculaire (47). La quantité de liquide amniotique est influencée par la production de

liquide pulmonaire fœtal et par la miction fœtale (47)(50). Chez l’homme, le fœtus produit

entre 500 et 1200 mL d’urines par jour et déglutit 210 à 760 mL de liquide amniotique par

jour (50)(47). Un déséquilibre dans ces volumes est à l’origine d’un excès de liquide

amniotique.

Selon les auteurs, 11, 14.2 ou 17% des cas d’hydramnios chez l’homme révèlent la

présence d’une maladie congénitale sous-jacente (47)(22)(44).

2) Etiologie

a) Diabète maternel

L’incidence des polyhydramnios chez les femmes enceintes atteintes de diabète sucré

est de 18.8% (58).

Chez les personnes diabétiques, il a été mis en évidence une relation linéaire entre la

taille du nouveau-né (macrosomie définie pour un enfant de plus de 4 kg) et la quantité de

liquide amniotique ; la pathogénie n’a cependant pas encore été élucidée (123). Une

65

explication possible serait qu’une hyperglycémie fœtale entrainerait une augmentation de la

diurèse osmotique et donc serait à l’origine d’une polyurie fœtale (47).

b) Anomalies congénitales

Une anomalie fœtale est observée dans 8.4% des cas d’hydramnios (9).

i. Anomalies obstructives du fœtus

Toute anomalie due à une obstruction des voies digestives du fœtus entrainera un

défaut d’ingestion de liquide amniotique (73). Parmi celles-ci, sont observées des obstructions

de l’œsophage, de l’intestin ou de l’anus (73)(22).

ii. Anomalies des parois digestives

Un défaut de succion des liquides ou d’acheminement du liquide amniotique telles que

les fentes palatines ou les fistules trachéo-œsophagiennes peut entraîner un hydramnios (22).

iii. Autres malformations

Des anomalies neuromusculaires entrainant un défaut de déglutition du fœtus peuvent

également être à l’origine d’un hydramnios (47).

c) Anémie fœtale

Une anémie fœtale entraine une augmentation du débit cardiaque et donc une

augmentation de la production d’urine (47). Or, une augmentation de la production d’urine est

souvent à l’origine d’un hydramnios (69).

d) Autres étiologies possibles

Des causes infectieuses et virales du fœtus ainsi que les grossesses multiples sont

également rapportés comme causes possibles d’hydramnios (78).

66

3) Diagnostic

La mise en évidence d’un hydramnios est essentielle car celui-ci augmente le risque de

morbidité et de mortalité chez la mère et l’enfant (50).

En médecine humaine, le diagnostic d’un polyhydramnios est réalisé par échographie.

La technique la plus courante est de mesurer l’index de fluide amniotique (AFI, Amniotic

fluid Index). Il correspond à la somme de la profondeur de liquide amniotique mesurée sur 4

quadrants bien précis (47)(90). Un polyhydramnios est défini par un AFI de plus de 25 cm

de liquide amniotique (123). Selon l’AFI, trois niveaux de polydramnios sont définis :

- léger hydramnios : 25-29.9 cm,

- modéré : 30-34.9 cm,

- sévère : ≥ 35 cm (22).

4) Conséquences pour la gestation et la mise-bas

Lors d’hydramnios, la mère peut présenter différents symptômes plus ou moins

graves : dyspnée, travail avant terme, dystocie, rupture précoce des enveloppes

membranaires, prolapsus du cordon ombilicale et hémorragie postpartum (47).

Le pronostic dépend de la sévérité de l’hydramnios et de son étiologie (47). La mortalité

périnatale est trois fois plus importante en cas d’hydramnios (9).

L’hydramnios est donc un facteur prédictif important de mortalité péripartum et de

morbidité pendant le part (78). En médecine humaine, il est donc fortement conseillé de

réaliser une césarienne programmée en cas d’hydramnios. Ainsi, le taux de césarienne chez

les femmes présentant un hydramnios est trois fois plus élevé que les femmes sans

hydramnios puisqu’elle est réalisée dans presque 50% des cas d’hydramnios (9).

En médecine humaine, l’hydramnios peut être traité par amniocentèse thérapeutique

par retrait de large volume de liquide amniotique, avec un taux de complication de 1.5% (34).

L’hydramnios, accumulation anormale de liquide amniotique, est principalement

dû à un défaut de son élimination. Les fentes labio-palatines, entrainant un défaut de

succion du liquide amniotique par le fœtus, en est une cause possible. Son diagnostic

échographique est aisément réalisable. Sa prévalence est non négligeable en médecine

humaine et les conséquences en sont graves pour le fœtus et pour la mère. Une prise en

charge médicale (par amniocentèse) ou chirurgicale (par césarienne) devront être réalisées.

67

E. La mise-bas chez les Canidés

1) La mise-bas normale ou eutocique

Si les mécanismes de la parturition sont bien maitrisés dans l’espèce caprine, ils sont

moins connus chez les carnivores domestiques. Le mécanisme de la mise-bas chez ces

espèces a donc été déduit par analogie avec l’espèce caprine, mais n’a pas encore été

démontré.

a) Une cascade d’activations endocriniennes

En fin de gestation, la mise-bas est déclenchée par une cascade d’activations

endocriniennes particulièrement bien décrites chez la chèvre. Chez la chienne, les

phénomènes endocriniens sont supposés similaires.

Lors du part eutocique, la mise-bas serait induite par les foeti. En effet, les fœti

amorceraient eux-mêmes la mise-bas par une cascade d’activation endocrinienne fœtale (105).

L’axe hypotalamo-hypohyso-surrénalien fœtal est essentiel pour la mise-bas. Ainsi, en fin de

gestation, l’espace critique restant dans l’utérus est le stimulus déclencheur : la dilatation

importante des cornes utérines à l’origine d’une absence d’espace libre entraine un stress

fœtal. Celui-ci va s’exprimer par la libération d’ACTH par l’antéhypophyse fœtal (105). Il

s’en suit une augmentation des corticoïdes fœtaux (cortisol produit par les surrénales fœtales)

et maternels à l’origine de changements endocriniens importants chez la mère :

- chute de la progestéronémie, par conversion de la progestérone en œstrogène par la

synthèse de trois enzymes, entrainant une levée de l’inhibition progestéronique des

contractions utérines,

- augmentation de la prostaglandine PGF2α d’origine fœto-placentaire,

- augmentation des sécrétions génitales (105)(74)(100).

La prostaglandine PGF2α produite permet quant à elle :

- de sécréter la relaxine, glycoprotéine placentaire, indispensable au relâchement du ligament

pelvien nécessaire à la mise-bas,

- d’entrainer la lutéolyse,

- d’augmenter les contractions du myomètre.

L’ensemble de ces évènements va donc avoir pour conséquence une augmentation des

œstrogènes et des prostaglandines, permettant une réactivation du myomètre utérin et

68

l’apparition de contractions grâce à la libération d’ocytocine par la post hypophyse

maternelle.

Le part est alors déclenché par une chute rapide de la progestéronémie à 2ng/mL,

tandis que la concentration en œstradiol reste inchangée ; il commence alors 24 à 36 heures

après ce changement dans le ratio œstrogène/progestérone (74). Cette chute brutale de la

progestéronémie est causée par l’augmentation des PGF2α. Une diminution de la

température rectale de la chienne de 1°C est observée 12 à 18 heures après la chute de

progestéronémie, une hormone hyperthermique (74).

b) Déroulement de la mise-bas

Chez la chienne, la mise-bas intervient entre 57 et 70 jours après la saillie, soit entre

61 et 63 jours après l’ovulation (13). Elle dure en général entre 4 à 8 heures mais peut durer

jusqu’à 34 à 36 heures selon les chiennes et le nombre de chiots.

Il est important de bien connaitre les signes annonciateurs de la mise-bas, bien qu’ils

soient variables d’une chienne à l’autre et pas toujours décelables :

-changement de comportement quelques jours avant la mise-bas, elle devient nerveuse et

agitée (halètement, isolement, confection d’un nid) ;

-montée de lait ;

-chute de la température rectale de 1°C ;

-dilatation vulvaire ;

-écoulement de glaire cervicale ou « chute du bouchon muqueux ».

En cas de pertes vulvaires de couleur verdâtre chez la chienne due à l’utéroverdine (pertes

sanguines chez la chatte) et/ou d’une grande quantité de liquide correspondant au liquide

amniotique, le part est imminent.

La mise-bas peut être décrite en trois étapes successives.

i. Etape I

Elle consiste en une augmentation des contractions du myomètre, un relâchement

du col de l’utérus (cervix) et la fonte du bouchon muqueux. Cette étape dure en moyenne 6

à 12 heures, mais elle peut durer jusqu’à 36 heures chez les jeunes chiennes et/ou primipares

(74).

Les contractions sont faibles, intermittentes et non visibles extérieurement mais

responsables du changement de comportement.

69

ii. Etape II

Elle correspond à l’expulsion des fœtus, chiot par chiot, avec section des cordons

ombilicaux par la mère. Elle peut durer entre 3 et 24 heures selon la chienne et de la taille de

la portée. Le premier nouveau-né apparait généralement entre 2 à 4 heures après le début de

l’étape I. Il faut compter en moyenne 20 à 30 minutes entre chaque expulsion.

iii. Etape III

Cette étape concerne l’expulsion des enveloppes fœtales après chaque chiots

(105)(74). Elle se termine normalement 1 à 2 heures après l’expulsion du dernier chiot.

2) La mise-bas dystocique

La mise-bas dystocique est principalement définie comme une difficulté d’origine

mécanique ou dynamique lors du part. Elle peut être d’origine maternel et/ou fœtale.

a) Etiologies possibles et facteurs favorisants

i. Causes d’origine maternelle

Parmi les causes d’origine maternelle, sont observées :

- l’inertie utérine, primaire ou secondaire,

- des défauts anatomiques de la région pelvienne (fracture, bassin trop étroit…),

- des septums vaginaux,

- des torsions utérines,

- des ruptures utérines…(74).

Un embonpoint de la mère ainsi qu’au contraire une lice trop maigre, peuvent

également se faire ressentir sur les difficultés à la mise-bas et être des facteurs favorisants la

dystocie (12). D’autres facteurs favorisants, telle qu’une chienne saillie dès ses premières

chaleurs ou à l’inverse une chienne gestante pour la première fois après 5 ans, sont à

rechercher. Enfin, des problèmes comportementaux de la mère, tels que la peur, le stress ou

l’anxiété, peuvent perturber le bon déroulement de la mise-bas.

L’inertie utérine est la principale cause de dystocie d’origine maternelle.

70

L’inertie primaire correspond à une absence totale de contraction utérine ou à un

arrêt des contractions avant la sortie du premier chiot (74). Les origines possibles d’une telle

inertie sont une hypocalcémie, une maladie systémique ou encore une malnutrition. Une

inflammation de l’utérus telle qu’une métrite ou une endométrite peut également entrainer une

inertie primaire.

Elle est principalement observée sur des portées avec un nombre important de chiots où

l’utérus est trop sollicité (principalement à partir de 8 fœtus) ou au contraire sur les petites

portées où la stimulation endocrinienne n’est pas suffisante (74).

L’inertie secondaire correspond à un arrêt des contractions après la sortie d’un ou de

plusieurs chiots alors que la mise-bas n’est pas terminée. Les causes d’inertie secondaire sont

similaires à celles de l’inertie primaire. La cause principale dans ce cas étant l’hypocalcémie.

ii. Causes d’origine fœtale

Une malformation congénitale du fœtus, une anomalie de position ou de

présentation du fœtus sont les trois causes fœtales principales (74).

Les présentations antérieure et postérieure sont toutes les deux des présentations

eutociques chez l’espèce canine. Dans 60% des cas, le chiot se présente en position antérieure

(74). Cependant, une présentation postérieure du premier chiot peut parfois entrainer une

plus faible dilatation du cervix due à l’étroitesse de la partie se présentant en premier (74).

Parmi les anomalies congénitales, les plus fréquemment rencontrées lors de dystocies

sont : l’anasarque, l’hydrocéphalie et la hernie abdominale (fig. 23).

La mort d’un fœtus peut également être à l’origine de dystocie obstructive ainsi que

l’engagement simultané de deux chiots provenant de chaque corne.

Enfin, certaines races peuvent être prédisposées aux dystocies. Chez les races

brachycéphales, la taille de la tête des fœtus est fréquemment trop large par rapport à la

largeur de la ceinture pelvienne de la mère ; on parle alors de dystocie céphalo-pelvique (14).

Les races naines (Chihuahua, Yorkshire, Caniche…) ainsi que les races géantes (Montagne

des Pyrénées, Dogue allemand, Terre Neuve…) sont également prédisposées aux dystocies.

71

Anasarque Hydrocéphalie

Figure 23: Malformations congénitales à l'origine de dystocies fœtales

(30)

b) Critères d’alerte

Le tableau II regroupe les critères d’alerte pour lesquelles le propriétaire doit appeler

en urgence son vétérinaire. La présence d’au moins une des huit conditions doit être un motif

d’appel et doit nécessiter une prise en charge vétérinaire.

Tableau II: Critères d'alerte pour le propriétaire lors de mise-bas dystocique

D’après (74)

1 Gestation dont la durée dépasse : - 67 jours depuis le pic de LH

- 65 jours depuis l’ovulation

sans signe de mise-bas - 72 jours depuis la première saillie

2 Plus de 4 heures entre la rupture du premier allanto-chorion et l’expulsion du premier

fœtus

3 Plus de 30 minutes d’effort expulsif sans expulsion de fœtus

4 Plus de 2 heures entre l’expulsion de deux fœtus

5 Absence de contractions pendant 4 à 6 heures après le début du travail

6 Pertes verdâtres plus de deux heures avant l’expulsion du premier fœtus sans signe de

contractions utérines

7 Pertes sanguines importantes à n’importe quel moment de la mise-bas, pertes

vulvaires purulentes ou malodorantes

8 Chienne douloureuse (gémissements, se lèche beaucoup la vulve), présentant un fort

abattement, des tremblements ou des signes de choc avant ou pendant la mise-bas

72

c) Traitement médical d’une dystocie

En cas d’inertie utérine ou en cas d’interruption de la progression des conceptus

dans la filière pelvienne, un traitement médical peut être envisagé (14). Avant de proposer un

traitement médical, le praticien vétérinaire devra au préalable vérifier que :

- l’examen clinique de la chienne est bon,

- le col utérin est dilaté (expulsion d’au moins un chiot),

- il n’y a pas de dystocie obstructive,

- et que les chiots ne sont pas en souffrance fœtale (détermination des fréquences cardiaques

par échographie et détresse fœtale si la fréquence est supérieure à 180 battements par minute)

(74)(14). Le cas échéant, une césarienne d’urgence devra être réalisée.

Enfin, le traitement médical est également contre-indiqué s’il reste plus de 4 chiots à expulser

(14).

Le traitement médical consiste en une stimulation des contractions utérines.

i. Stimulation manuelle

Le réflexe de Fergusson, correspondant à la stimulation réflexe des fibres nerveuses

adrénergiques puis cholinergiques du système nerveux autonome, entraine le déclenchement

des contractions abdominales réflexes lors de l’arrivée du fœtus au passage du col et du vagin.

Ce réflexe peut être stimulé, à l’aide d’une main propre et gantée, en effectuant des

stimulations vaginales digitées.

ii. Stimulation médicamenteuse

Les contractions utérines peuvent être renforcées en première intention par injection

de gluconate de calcium à 10%, à la posologie de 10 à 20 mg/kg ou 0.5 à 1.5 mL/kg en IV

lente sur 3 à 5 minutes (afin d’éviter les arythmies cardiaques) ou en SC, renouvelable toutes

les 4, 6 à 8 heures si nécessaire (74)(14).

La fréquence des contractions peut, quant à elle, être augmentée par injection

d’ocytocine à la posologie de 1 ou 2 unités par chien, quelle que soit sa taille, en IM ou SC,

toutes les 30 à 40 minutes (14). Il ne faudra toutefois pas dépasser 3 à 4 injections sur

l’ensemble de la mise-bas.

Parallèlement, la douleur liée à la mise-bas doit être prise en charge en utilisant un

dérivé morphinique (14). Le clinicien doit également corriger la déshydratation, les pertes

73

des électrolytes et la glycémie ; l’hypoglycémie pouvant également entrainer l’inertie

primaire.

3) La césarienne

a) Motifs de réalisation d’une césarienne

i. Césarienne d’urgence

Les dystocies ne pouvant être prise en charge médicalement, ou pouvant être prise

en charge médicalement mais évoluant depuis plus de 4 heures, sont les motifs de réalisation

d’une césarienne d’urgence et représentent effectivement une réelle urgence médicale (14).

Elles ont pour conséquence systématique une altération importante du pronostic vital des

chiots et le taux de survie des nouveau-nés dépendra étroitement de la rapidité des décisions

prises (14).

ii. Césarienne programmée

Trois cas de césarienne programmée sont fréquemment observés :

- chez les races brachycéphales prédisposées aux dystocies céphalo-pelvique, les éleveurs

choisissent fréquemment de programmer la césarienne ;

- lorsqu’au cours d’un examen radiographique, réalisé dans le but de connaitre le nombre de

fœtus, il est mis en évidence la présence d’un seul fœtus (risque d’inertie utérine primaire

par défaut de stimulation endocrinienne) ;

- et lorsqu’au cours de l’examen radiographique, il est mis en évidence la présence d’un

nombre trop important de fœtus (utérus trop sollicité et hypocalcémie).

b) Programmation d’une césarienne

i. Intérêt de la programmation d’une césarienne

Les avantages de la réalisation d’une césarienne sont nombreux. Ils sont résumés dans

le tableau III.

74

Tableau III: Intérêts de la césarienne programmée

D’après (100)

Pour le propriétaire :

- Cela permet de planifier 2 mois avant le jour et l’heure de

la césarienne.

- Cela rend le suivi de fin de gestation non indispensable

(radiographie, suivi de la chute de température, taux de

progestérone…).

Pour le vétérinaire : - Le planning est organisé pour la césarienne.

- Une équipe complète est opérationnelle (moins de stress).

Pour la lice : - Il n’y a pas de risque de dystocie une fois la rentrée dans

le protocole.

- La récupération est meilleure qu’après une césarienne en

urgence.

Pour le ou les chiots : - Il y a peu ou pas de souffrance fœtale.

- La mortinatalité dans les 15 premiers jours est inférieure à

2% (après une césarienne en urgence, la mortinatalité est

d’environ 13 à 20% et après mise bas naturelle, la

mortinatalité est d’environ 10-25%).

ii. Quand et comment programmer la césarienne ?

La césarienne doit être planifiée ni trop tôt non trop tard. Elle doit être effectuée dans

les heures qui précèdent le terme afin d’optimiser la maturation des chiots et la montée de lait,

sans pour autant que la mise-bas se déclenche toute seule et que s’installe une dystocie (100).

Contrairement à la chatte, il est déconseillé de réaliser une césarienne plus de 24 à 48 heures

avant le terme car le pronostic vital de plus de 90% des chiots de la portée est alors en jeu

(13). La date de programmation de la césarienne est donc une étape très importante.

Deux cas de figures se présentent selon si la date d’ovulation est connue ou non.

Lorsque la date de l’ovulation est connue, grâce à un suivi de chaleurs, la planification

de la césarienne est plus aisée. Les chiennes sont revues une première fois autour du 25ème

jour après l’ovulation afin de confirmer la gestation par échographie. Elles sont de nouveau

présentées au 60ème

jour de gestation post-ovulation afin de réaliser un contrôle

échographique et un dosage de la progestéronémie :

-si la progestéronémie est inférieure à 6 nmol/L (équivalent à 2 ng/mL), la chienne est

considérée à terme et la césarienne peut être réalisée dans les heures qui suivent ;

-si la progestéronémie est supérieure à 12 nmol/L (4 ng/mL), la chienne reçoit une injection

d’aglépristone (Alizine® NDV) à 15 mg/kg et la césarienne doit être réalisée 18 à 24 heures

après l’injection ;

75

-si la progestéronémie est comprise entre 6 et 12 nmol/L, elle est considérée comme

douteuse et la mise-bas peut s’initier seule ou attendre. L’injection d’aglepristone est réalisée

et la planification de la césarienne maintenue ; excepté si la mise-bas démarre, généralement

la nuit, auquel cas le propriétaire est invité à se rapprocher de la clinique pour ne pas attendre

la dystocie (13)(100).

Lorsque la date d’ovulation est inconnue, la durée de gestation est très variable si elle

est évaluée par rapport à la saillie. La chienne doit donc être suivie tous les jours vers la fin

de la date du terme estimée, afin de réaliser des échographies abdominales et des dosages de

la progestérone. L’échographie permettra d’évaluer la maturité des fœtus en regardant

l’aspect des différents organes, la présence de péristaltisme intestinal ou non, ou en évaluant

le diamètre bipariétal (100). Les dosages de progestéronémie seront interprétés de la même

manière que pour les chiennes à date d’ovulation connue.

La césarienne est donc programmée par injection d’aglépristone, stéroïde de

synthèse, présentant une action anti-progestative par compétition avec la progestérone pour

ses récepteurs. Cette action anti-progestative entrainerait une maturation des chiots. Elle

permet ainsi d’optimiser le taux de survie de la portée (100).

Les différentes étapes de la césarienne seront présentées dans la partie 2, I C 1).

76

Le liquide amniotique, produit par l’amnios, est le liquide dans lequel baigne

directement le fœtus.

L’hydramnios résulte d’un déséquilibre entre la production et l’élimination du

liquide amniotique, le plus souvent dû à un défaut de son élimination. Un défaut

d’élimination est principalement causé par une malformation congénitale du fœtus

dont les fentes labio-palatines. Les conséquences peuvent en être dramatiques tant

pour la mère que pour le fœtus, pendant la grossesse ainsi qu’à la mise-bas.

Les dystocies d’origine fœtale ou maternelle sont fréquentes chez les canidés.

Selon la situation, une décision rapide de prise en charge médicale (injection de

calcium et d’ocytocine) ou chirurgicale (césarienne d’urgence) devra être réalisée.

Les césariennes programmées sont de plus en plus fréquentes afin d’éviter les

complications chez les races brachycéphales, présentant un rapport céphalo-pelvique

augmenté, et sur les portées à chiot unique ou trop nombreux.

Les césariennes programmées serviront de support pour le prélèvement de

liquide amniotique pour cette étude.

Il a déjà été évoqué qu’une carence en folates était un facteur de risque pour les

fentes labio-palatines. Une augmentation de la concentration sanguine en

homocystéine, métabolite intervenant dans le cycle biochimique des folates, va

maintenant être commentée comme autre facteur de risque possible.

77

III. L’homocystéine, un marqueur potentiel des fentes palatines

Au cours de ce chapitre, la biochimie clinique de l’homocystéine sera tout d’abord

étudiée afin de mieux comprendre l’importance de ce composé chimique en médecine

humaine principalement, mais aussi vétérinaire. Puis, la place éventuelle de l’homocystéine

dans les fentes labio-palatines sera discutée.

A. Métabolisme de l’homocystéine

1) Synthèse de l’homocystéine

L’homocystéine (2-amino-4-mercaptobutyric acid) (3) est un acide aminé soufré non

protéinogène (fig. 24). Il est formé à partir de la méthionine provenant des protéines

alimentaires, un acide aminé essentiel (89).

Figure 24: Molécule de L-Homocystéine

(3)

Sa synthèse provient d’un mécanisme complexe, intervenant dans le compartiment

cytoplasmique selon une réaction de déméthylation en trois étapes (fig. 25).

Une première réaction fait intervenir la méthionine adénosyl transférase, en présence

d’ATP, à l’origine de la S-adenosylmethionine (SAM) à partir de la méthionine (82)(108).

La SAM sert alors de donneur de groupement méthyl pour différents accepteurs: acide

guanidine acétique, phospholipides (tel que la phosphatidyl étholamine), protéines,

neurotransmetteurs ou hormones (18)(108). Cette déméthylation est catalysée par une enzyme

du groupe des méthyl-transférase produisant la S-adénosylhomocystéine (SAH) (18)(108).

La SAH est alors hydrolysée en homocystéine et adénosine (108)(82).

78

Figure 25: Métabolisme de l'homocystéine

D’après (81)

CYCLE DES

METHYLS

ACTIVES Reméthylation

Transsulfuration

Déméthylation

CYCLE DES

FOLATES

79

2) L’homocystéine dans le métabolisme de la méthionine et de la cystéine

Une fois synthétisée, l’homocystéine est soit méthylée en méthionine

« reméthylation », soit utilisée pour former la cystéine par « transsulfuration » (53).

a) « Cycle des méthyls activés »

L’homocystéine peut régénérer la méthionine par transfert d’un groupement méthyl du

méthyltétrahydrofolate (méthyl-THF) à l’homocystéine catalysée par l’homocystéine

méthyltransférase également appelée méthionine synthase (MS) utilisant comme co-

enzyme la vitamine B12 ou cobalamine (108) (fig. 25).

Ainsi, ces réactions de dégradation par transméthylation et de synthèse par

reméthylation de la méthionine forment le cycle des méthyles activés (108)(18).

b) Synthèse de la cystéine à partir de l’homocystéine

L’homocystéine permet la synthèse irréversible de la cystéine, un acide aminé soufré

rentrant dans la synthèse des protéines (fig. 25). Sa synthèse, en deux étapes, fait intervenir la

sérine et est catalysée successivement par la cystathionine β-synthétase (CBS) réalisant une

transsulfuration puis par la cystathionase (108)(18). La CBS utilise la vitamine B6

(pyridoxine ou phosphate de pyridoxal) comme cofacteur (18).

3) Homocystéine et cofacteurs vitaminiques : folates, vitamine B6 et B12

Folates, vitamine B6 et vitamine B12 sont tous les trois des vitamines hydrosolubles

du groupe B intervenant dans l’homocystéinémie.

a) Métabolisme des folates et vitamine B12

i. Les folates ou vitamines B9

La vitamine B9, folate, ou encore appelé acide folique est formée d’une base, la

ptéridine, attachée à :

- une molécule d’acide p-aminobenzoïque (PABA),

- une molécule d’acide glutamique (86)(124) (fig. 26).

La substance pure, l’acide folique, est l’acide ptéroyl-glutamique (52).

80

Figure 26: Molécule d'acide folique

(86)

Les animaux ne pouvant synthétiser l’acide folique, son apport est exclusivement

alimentaire, les principales sources étant : le foie, la levure, le germe de blé et les légumes à

feuilles (86)(6). Les folates se trouvent dans l’alimentation sous forme réduite, liés à plusieurs

unités d’acide glutamique (polyglutamates) (6)(122).

La forme active du folate est le tétrahydrofolate (THF) qui rentre dans la synthèse

des purines, des pyrimidines et des acides nucléiques (86)(52)(116). Elle est donc essentielle à

la synthèse de l’ADN et de l’ARN. Le THF est formé par hydrogénation de l’acide folique

dépendant de la vitamine C ; une carence en vitamine C peut donc être à l’origine de

symptômes de carences en acide folique (52).

La forme circulante du folate est le méthyltétrahydrofolate (méthyl-THF), obtenu

dans la voie de reméthylation du cycle des méthyls activés (38).

L’acide folique est un donneur/accepteur de groupements méthyl, méthylène et

méthenyl dans de nombreux métabolismes (48). En plus de la biosynthèse de nucléotides, il

intervient dans la synthèse des phospholipides, dans le métabolisme d’acides aminés, dans la

production de neurotransmetteurs et dans la formation de la créatinine (48).

L’acide folique est un facteur hématopoïétique et un facteur de croissance ; ainsi,

une carence sera à l’origine d’une anémie macrocytaire avec leucopénie et d’arrêt de

croissance chez le jeune (124)(97).

Les doses de supplémentation en acide folique recommandées chez le chien sont

estimés à 0.3 mg/kg d’aliment (52). L’AAFCO (Association of American Feed Control

81

Officials) quant à elle recommande une ration à 0.18 mg/kg d’acide folique pour les chiens et

à 0.8 mg/kg pour les chats.

ii. La vitamine B12 ou cobalamine

La vitamine B12 présente une structure cyclique complexe enfermant un ion cobalt

(124). Elle est synthétisée par les micro-organismes exclusivement, absorbée au niveau

intestinal et stockée au niveau du foie (124). Les formes coenzymes actives sont la

méthylcobalamine ou la désoxyadénosylcobalamine (86). C’est sous sa forme

méthylcobalamine que la vitamine B12 joue un rôle clef dans la conversion combinée de

l’homocystéine en méthionine et du méthylhydrofolate en tétrahydrofolate (86).

Chez l’homme et le chien les besoins quotidien en cobalamine sont de 1 à 2 µg/jour

(124).

iii. Cycles des folates

L’acide folique et la vitamine B12 agissent en synergie dans de nombreux processus

physiologiques (52). Le cycle des folates nécessite de la vitamine B12 et a lieu dans tout type

de tissu (57) (fig. 25). La MTHFR, 5,10-méthylène tétrahydrofolate réductase, est une

enzyme-clée du cycle.

b) Vitamine B6 ou pyridoxine, et homocystéinémie

La vitamine B6 est essentiellement apportée par l’alimentation. Elle est synthétisée

par les végétaux et certains micro-organisme (124).

Chez l’homme, une carence en vitamine B6 se traduit par des lésions buccales et des

troubles nerveux et mentaux ; tandis que chez le chien, elle se manifeste par une dermatite

accompagnée d’anémie et par des contractions épileptiformes (124).

La forme active est l’ester phosphorique du pyridoxal qui se comporte comme

coenzyme dans de nombreuses réactions métaboliques.

c) Conclusion (fig. 27)

Une carence en folates, vitamine B6 ou vitamine B12, tous normalement apportés dans

l’alimentation, peut donc être à l’origine d’une accumulation cellulaire de l’homocystéine

82

entrainant son passage dans la circulation sanguine à l’origine d’une hyperhomocystéinémie

(18). La quantité d’homocystéine dans le sang est donc bien inversement proportionnelle à la

quantité de folates, et ce quel que soit l’âge, le sexe ou l’ethnie (102).

Figure 27: Bilan du métabolisme de l'homocystéine et cofacteurs vitaminiques

(88)

L’homocystéine est un acide aminé soufré non apporté par l’alimentation et formé

dans l’organisme à partir de la méthionine. Il est synthétisé par démethylation de la

méthionine dans le cycle des méthyl activé, et dégradé :

-soit par reméthylation de la méthionine faisant intervenir le cycle des folates, la MTHFR,

la MS et les vitamines B6 et B12 ;

-soit par transulfuration à l’origine de la synthèse de la cystéine et faisant intervenir la

CBS et la vitamine B6.

L’apport en acide folique est exclusivement alimentaire. Sa forme active est le THF

essentielle à la synthèse des acides nucléiques.

Folates, vitamine B6 et vitamine B12 jouent des rôles clés dans le métabolisme de

l’homocystéine et influenceront donc les taux d’homocystéiménie.

83

B. L’hyperhomocystéinémie

1) L’homocystéine dans le sang

L’homocystéine existe sous différente forme dans le sang (tab. IV). Le dosage de

l’homocystéine plasmatique comprend toutes les différentes formes de l’homocystéine.

Tableau IV: Les différentes formes d'homocystéine dans le sang humain

D’après (88) et (98)

Homocystéine

totale

(tHcy)

Forme réduite

≈ 1% Homocystéine

Forme libre

30%

Forme oxydée

Homocystine

(HcyS-SHcy)

Homocystéine-cystéine disulfure

(HcyS-SCys)

Homocystéine disulfure

(HcyS-SR)

Homocystéine-protéine disulfure

(HcyS-Albumine)

Forme liée aux

protéines 70%

2) L’homocystéinémie en médecine humaine

Les dosages de l‘homocystéine ne sont, pour l’instant, réalisés qu’en médecine

humaine.

a) Méthode de dosage sanguin de l’homocystéine

La détermination de tHcy nécessite au préalable une réaction de réduction des formes

disulfures (117). Le choix du réducteur dépend de la méthode dosage utilisée ; les différents

réducteurs peuvent être : le dithioerythritol, le dithiothréitol (DTT), le mercaptoethanol, le

trialkylphosphine, tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), le sodium et le potassium

(117)(119)(25). La forme réduite est alors directement dosée ou dosée après dérivatisation

(117).

Les dosages sont réalisés sur plasma de préférence ou sur sérum (25). Les

échantillons de sang sont donc prélevés principalement sur tube hépariné ou sur tube EDTA,

et peuvent être conservés à la condition d’être centrifugés et conservés au froid (98)(117). Il

84

est conseillé de réaliser les prélèvements après un jeûne de 12 heures au moins afin de limiter

l’influence de la méthionine exogène sur l’homocystéine (126).

L’intervalle dosable par les méthodes de quantification de l’homocystéine doit être

compris entre 3 et 40 µmol/L (98). Comme la précision des mesures dépend de la méthode

utilisée et du laboratoire, il est conseillé d’avoir des valeurs de références adaptées au

laboratoire et d’être prudent lors de comparaison de résultats venant de différents laboratoires

(98). Les principales méthodes sont les suivantes.

i. Chromatographie en phase liquide à haute performance

(HPLC)

Développée dans les années 1980, l’HPLC est une méthode très sensible qui reste la

plus utilisée pour la mesure de tHcy dans les laboratoires d’analyse (25)(87).

La chromatographie permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs

composés d’un mélange afin de les identifier et de les quantifier. Le sérum est mis dans un

solvant, le tout étant introduit dans l’éluant, une phase liquide mobile, et placé dans la

colonne chromatographique. Une pompe haute pression pousse la phase mobile dont les

constituants migrent plus ou moins selon leur affinité avec la phase stationnaire contenue dans

la colonne. A la sortie de la colonne, un chromatogramme est enregistré représentant un pic

pour chaque soluté.

ii. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse (CG-SM)

Cette méthode chromatographique est également utilisée dans le dosage de

l’homocystéine (117). L’éluant utilisé est sous une phase gazeuse et la spectrométrie de masse

est une méthode utilisant le rapport masse/charge des molécules individualisées, traduit sur un

spectre en ionisation dont l’intensité des pics donne une analyse quantitative.

Ces deux méthodes chromatographiques sont très précises, mais chères et nécessitant

un matériel très spécifique. Elles sont donc peu adaptées à un diagnostic de routine en

laboratoire. De plus, les échantillons doivent être dosés un à un. Les méthodes suivantes sont

donc de plus en plus utilisées.

85

iii. Méthode immunologique

Les méthodes immunologiques ont été développées dans les années 90s. Elle sont

basées sur la réaction d’un anticorps spécifiques de la SAH, produit de l’homocystéine dans

le cycle des méthyl activés (25)(41). Il s’agit alors d’une compétition entre la SAH provenant

de l’échantillon plasmatique et de la SAH utilisée comme traceur portant un chromophore

fluorescent pour l’anticorps anti-SAH (25) (fig. 28). La tHcy est alors mesurée par

spectrophotométrie (41).

(1) Etape de réduction de l’Hcy plasmatique

(2) Conversion de l’Hcy en SAH puis réaction anticorps/SAH

Figure 28: Méthode immunologique de dosage de l'homocystéine

(25)

Le coût de cette méthode reste cher et elle est moins précise que les méthodes

chromatographiques (25). Cependant, c’est une méthode rapide qui donne de bons résultats.

iv. Méthode enzymatique

La méthode enzymatique est la plus récente. Elle sera d’avantage détaillée dans la

partie 2, étude expérimentale.

C’est la méthode la plus rapide, avec un coût moins important que les précédentes et

apportant une précision aussi intéressante qu’avec les méthodes chromatographiques (25).

Une seule étude dosant l’homocystéine dans l’espèce canine est décrite, utilisant une

méthode immunologique par polarisation de fluorescence (111).

86

b) Valeurs de référence

Aucune valeur de référence n’est vraiment établie en médecine humaine, les résultats

de dosages variant d’une méthode à l’autre et d’un laboratoire à l’autre. Seuls des ordres de

grandeurs à titre indicatifs peuvent être fournis.

La valeur moyenne du taux plasmatique total en homocystéine (tHcy) est estimée à 10

µmol/L chez l’adulte (88). Une autre étude met en évidence une moyenne comparable à la

littérature à 11.5 ± 3.4 µmol/L chez des sujets sains tout sexe confondue âgés de 20 à 69 ans

(87). Enfin, un tHcy compris entre 5 et 15 µmol/L est considéré comme normal (99).

Cependant, il existe de nombreuses variations du taux plasmatique en homocystéine :

- quel que soit le groupe ethnique, la concentration en homocystéine est plus élevée chez

l’homme que chez la femme (102)(61) (tab. V),

- la concentration en homocystéine augmente avec l’âge (61) (tab.V),

- elle varie selon le groupe ethnique (61),

- la tHcy dépend de la fonction rénale et de la synthèse en créatinine

(hyperhomocystéinémie en cas d’insuffisance rénale) (10)(42),

- il existe une variation au cours du cycle menstruel chez la femme: la concentration

augmente de 1.1 µmol/L lors de la phase folliculaire (110),

- la concentration en homocystéine décroit au cours d’une grossesse normale : elle chute au

premier semestre avec une moyenne de 5.6 µmol/L à 8-16 semaines de grossesse, puis

diminue au maximum au second semestre à 4.3 µmol/L à 20-28 semaines, se stabilise à 5.5

µmol/L à 36-42 semaines, puis se normalise 2 à 3 jours post-partum; contre une tHcy

moyenne à 7.9 µmol/L pour le groupe témoin de femmes non enceinte (125)(2).

Cette dernière variation peut être mis en relation avec le taux d’albumine qui décroit

également pendant la grossesse (125) ou avec la forte demande du fœtus en méthionine (2).

L’augmentation de tHcy avec l’âge est attribuée au statut vitaminique (103) et/ou à la

perte de la fonctionnalité rénale (61).

Le tableau suivant présente les différentes valeurs de l‘homocystéinémie en fonction

du sexe et de l’âge, à utiliser en tenant compte des variabilités entre les différents laboratoires

et les méthodes utilisées.

87

Tableau V: Valeurs moyennes de la tHcy chez l'espèce Humaine (en µmol/L)

D’après (98)(61)(55)

HOMME FEMME

Valeurs critiques

dans les pays

consommant une

alimentation enrichie

en acide folique

dans les pays

consommant une

alimentation pauvre en

acide folique

JEUNES

(12-29 ans) 8,4 6,8

> 15%

> 20-25%

ADULTES

(30-69 ans) 10,1 8,3

≥ 70 ans 12,6 11,1

MOYENNE 9,4-9,8

9,6 ± 2,8

7,4-8,2

8,4 ± 2,5

3) Les causes d’hyperhomocystéinémie

a) Déficit nutritionnel : l’hyperhomocystéinémie comme marqueur

d’une carence en folates, vitamines B6 et/ou B12

Une augmentation de la tHcy peut mettre en évidence une carence vitaminique. En

cas d’hyperhomocystéinémie, il convient alors de doser ces vitamines dont une carence est

mis en évidence par un taux inférieur à 7.5 nmol/L pour l’acide folique et inférieur à 200

pmol/L pour la cobalamine (98). Les personnes à risque sont principalement les patients

âgés de plus de 75 ans, les nouveau-nés et enfants ici d’une mère végétarienne, et les

végétariens (98).

L’hyperhomocystéinémie peut donc être contrôlée dans un premier temps par une

supplémentation vitaminique : folates, cobalamine, pyridoxine (87).

b) Anomalie génétique à l’origine d’un déficit enzymatique

i. Déficit en cystathionine β-cynthétase (CBS)

Le gène codant pour la CBS est situé sur le chromosome 21 et présente de 40 à 181

mutations selon les auteurs dont deux majeures : la mutation Gly-ser vitamine B6 non

88

sensible et la mutation Ile-thr vitamine B6 sensible (38)(57). Il s’agit d’une maladie

autosomique à transmission récessive (38).

ii. Déficit en 5,10-méthylène tétrahydrofolate réductase

(MTHFR)

Cette enzyme est importante dans le métabolisme de l’homocystéine, elle permet la

méthylation des folates : elle catalyse la réaction irréversible du méthylène-THF en méthyl-

THF (fig. 25) (86)(118). Le gène codant pour la MTHF est situé sur le chromosome 1, et 9

mutations sont observées principalement, sur 67 mutations enregistrées chez des patients

présentant une MTHFR déficiente (38)(57). Il s’agit également d’une maladie autosomique

récessive (38). Les deux mutations les plus fréquentes à l’origine d’une défaillance

enzymatique de MTHFR et donc d’une accumulation d’homocystéine sont C677T et A1298C

(57).

Il a déjà été évoqué qu’une mutation C677T pouvait être à l’origine de fentes labio-

palatines (partie 1, I E 1) a) iv).

iii. Déficit en méthionine synthase (MS)

Peu de cas sont décrits (20 individus recensés) et une seule mutation est enregistrée

(118).

89

C. L’homocystéine en médecine humaine

1) Homocystinurie

Dès 1962, GERRITSEN T., VAUGHN J.G. et WAISMAN H.A. proposent une

technique d’isolation et d’identification de l’homocystéine dans les urines, observant des

anomalies dans les échantillons d’acide aminé soufrés chez les enfants atteints d’anomalies

congénitales, de retard mentaux et de retard de croissance (43).

L’homocystinurie est alors décrit comme une maladie génétique rare et grave due à

un déficit en CBS entraînant une hyperhomocystéinémie congénitale. Les patients atteints

présentent des troubles oculaires (myopie progressive, dyslocation du cristallin…),

squelettique, psychiatrique, un retard mental et des risques d’accidents vasculaires

thromboemboliques artériels ou veineux (98). La tHcy est généralement supérieure à 100

µmol/L (98).

La concentration plasmatique totale en homocystéine tHcy comprend toutes les

formes de l’homocystéine : réduites (1% environ) et oxydées. Le dosage de

l’homocystéinémie n’est réalisé qu’en médecine humaine, avec différentes méthodes : par

chromatographie (en phase liquide haute performance ou en phase gazeuse), par des tests

immunologiques ou par des tests enzymatiques.

Aucune valeur de référence de tHcy n’est vraiment établie en médecine humaine et

les résultats doivent être comparés aux références du laboratoire. Cependant, la littérature

indique des valeurs de référence normales comprises entre 5 et 15 µmol/L avec une

moyenne à 10 µmol/L chez l’adulte. L’homocystéinémie varie principalement :

- avec l’âge (elle augmente avec l’âge),

- avec le sexe (plus élevée chez l’homme),

- avec le groupe ethnique,

- avec le statut rénal (elle augmente en cas d’insuffisance rénale),

- avec la grossesse (chute pendant la grossesse).

Une carence en vitamine B et un déficit enzymatique dû à une anomalie

enzymatique sont les principales causes d’hyperhomocystéinémie.

90

2) Risques cardio-vasculaires

L’homocystéine est principalement connue en médecine humaine pour les risques

cardio-vasculaires qu’elle implique. En effet, l’idée qu’un taux élevé d’homocystéine pouvait

être un facteur de risque pour les maladies cardio-vasculaires occlusives est apparue en

observant des maladies cardio-vasculaires chez de jeunes à très jeunes patients atteints

d’homocystinurie et en observant de l’athérosclérose préclinique lors de haut taux

plasmatique d’homocystéine (116)(88). Avec ces observations, c’est Mc CULLY en 1969 qui

fonda la théorie de « l’homocystéine sur l’athérosclérose » (79). Depuis, de très

nombreuses études ont été publiées mettant en évidence un lien entre le taux élevé

d’homocystéine plasmatique et les pathologies occlusives des artères coronariennes,

cérébrales et périphériques, et des veines (88)(101). Puis, la question critique de savoir si

l’homocystéine était un simple marqueur des maladies cardiovasculaires, un facteur de risque

ou les deux, a été étudiée. Le mécanisme n’est pas encore décrit mais de nombreuses études

démontrent que l’homocystéine est bien un facteur de risque. En effet, des apports en acides

foliques ou vitamines B12 permettant de diminuer le taux d’homocystéine plasmatique total

entrainent une diminution des maladies cardio-vasculaires chez les personnes à risque (88).

Les hypothèses expliquant le rôle de l’homocystéine dans la formation d’athérosclérose sont

les suivantes :

- un effet toxique direct dégradant l’endothélium artériel,

- un effet inflammatoire vasculaire,

- un effet accélérant l’oxydation du LDL (Low-Density lipoprotein),

- un effet synergique avec d’autres facteurs de risques (25)(87).

Il s’agit principalement de la théorie des modifications oxydatives et de la théorie

hémostatique (87).

Les maladies coronariennes représentent la principale causent de mortalité dans les

pays développés (101). En France, 30% des décès sont d’origine cardio-vasculaires et dans

50% des cas, il n’existe pas de facteurs de risques connu : hypertension, diabète, obésité,

tabagisme… ; et 10% des décès d’origine coronarienne seraient liés à un taux élevé

d’homocystéine (16).

Un patient présentant une homocystéinémie supérieure à 15 µmol/L présente un haut

risque de maladies cardiovasculaire et coronarienne (98)(121). Une complémentation

vitaminique ainsi qu’une hygiène de vie stricte sont alors fortement conseillées : arrêt du

tabagisme, de la consommation d’alcool…(98)(16).

91

Ainsi, le dosage de l’homocystéine en médecine humaine est important tant par les

effets directs de l’homocystéine sur les risques cardiovasculaires que par son marquage d’un

défaut de métabolisme des folates et de la vitamine B12.

Les folates et la vitamine B12 jouent également un rôle essentiel dans la prévention de

l’hyperhomocystéinémie impliquant des lésions de l’endothélium vasculaire.

3) Troubles neurologiques

Une hyperhomocystéinémie peut également être un facteur de risque pour la

maladie d’Alzheimer et pour de la démence (7). En effet, les personnes exposées à un risque

de maladie cardiovasculaires présentent également un risque pour la démence et la maladie

d’Alzheimer. Dans l’étude de BEISER A. et al. en 2002, le risque de développer la maladie

d’Alzheimer est doublé lorsque tHcy est supérieure à 14 µmol/L (7).

D. Folates, vitamine B12, homocystéine et maladies congénitales

La carence ou le surdosage de certains nutriments semble avoir un rôle dans

l’apparition de maladies congénitales, comme il a déjà été évoqué dans la partie 1, I E 2) c)

(20).

1) Folates, vitamine B12 et défauts du tube neural

Une carence en acide folique est responsable de l’anémie gravidique

mégaloblastique, dont l’efficacité de l’acide folique dans le traitement était connue dès 1945

(6)(122). Cependant, de nombreuses études épidémiologiques ont également mis en évidence

L’homocystéine est principalement connue en médecine humaine comme facteur

de risque pour les maladies cardio-vasculaires. Un patient présentant une homocystéinémie

supérieure à 15 µmol/L est considéré à risque et doit avoir une hygiène de vie stricte.

Un déficit en CBS (Cystathionine β-synthétase) entraine l’homocystinurie, une

maladie héréditaire rare et grave.

L’homocystéine peut également être un facteur de risque pour la maladie

d’Alzheimer et la démence.

92

un lien entre des carences en acide folique et la fréquence des avortements, le taux de

prématurité et les anomalies de fermeture du tube neural (6). Dès les années 80, il est

démontré l’effet significatif d’une supplémentation en acide folique sur la diminution du

risque de défauts de fermeture du tube neural.

Les défauts du tube neural, spina bifida, encéphalocèle et anencéphalie, surviennent

15 à 28 jours après la conception chez l’homme, le tube neural se fermant normalement

entre le 22ème

et le 28ème

jour, c’est-à-dire lorsque, le plus souvent, la femme ne sait pas

encore qu’elle est enceinte (6)(20).

Différentes valeurs de supplémentation en acide folique ont été recommandées.

Parmi celles-ci, une supplémentation de 400 µg/j à 800 µg/j d’acide folique pendant la

période périconceptionnelle peut réduire significativement l’incidence des anomalies de

fermeture du tube neural (86)(21). Les nombreuses études réalisées ont mis en évidence une

réduction du risque de défaut du tube neural de 70% (122). Par ailleurs, les femmes ayant

déjà eu un nouveau-né atteint d’un défaut du tube neural ont un risque augmenté de 2 à 3% de

mettre au monde un autre enfant atteint de cette maladie (17). Pour ces personnes à risque

élevé de récurrence, une supplémentation à 4 mg/j est conseillée, à commencer au moins un

mois avant la conception (6).

Ainsi, le niveau minimal d’apport en acide folique, pour assurer une prévention

efficace, ne pouvant être apporté par l’alimentation, les autorités sanitaires de différents pays

ont recommandé une prévention médicamenteuse utilisant l’acide folique durant la période

périconceptionnelle. Les insuffisances de cette supplémentation ciblée et sa très mauvaise

observance ont conduit en 1996 les Etats-Unis, puis le Canada et le Chili entre autres pays, à

enrichir systématiquement les farines en folates (122). Cependant, depuis 2006 des études

mettent en évidence une augmentation du risque de cancer du sein et du cancer colorectal

suite à ces enrichissements et ceux-ci sont donc remis en cause (122).

2) Folates et fentes palatines

a) Résultats en médecine humaine

Quelques années après avoir mis en évidence les effets bénéfiques d’une

complémentation en acide folique sur les défauts de fermeture du tube neural, des études ont

montré que l’acide folique pouvait aussi avoir un effet sur la diminution d’autres

malformations congénitales : les fentes palatines. C’est le cas de l’étude de LAMMER E. J. et

al. mettant en évidence que, chez les femmes utilisant des multivitamines contenant de l’acide

93

folique de un mois avant la conception à deux mois après la conception, le risque de fentes

oro-faciales est diminuée de 25 à 50% (106). D’autres études comme celle de ITIKALA P. R.

ont mis en évidence une diminution du risque de fentes labio-palatines de 48% lorsque les

mères sont complémentées pendant la période périconceptionnelle mais aucune diminution du

risque lorsque la complémentation a lieu après le second semestre de grossesse (60).

b) Résultats en médecine vétérinaire

Chez l’espèce canine, des fentes palatines ont été formées expérimentalement par

administration d’antagonistes d’acides foliques, le diazo-oxonorleucine, du 25ème

au 28ème

jour de gestation (62).

Les chiens semblent également répondre positivement à une supplémentation en

acides foliques. Une supplémentation à 5 mg/jour/chien chez des Bouledogue Français de

15 jours avant la saillie jusqu’à la fin de la gestation permet de réduire de 48.54% l’incidence

des fentes palatines (45). Chez le Boston Terrier, avec la même supplémentation le risque est

diminué de 76% (35). Une troisième étude met en évidence une diminution de la prévalence

des fentes palatines, chez le Bouledogue Français, de 4.5% (de 9.6 à 5.1%) lors d’une

supplémentation en acide folique à différentes concentrations (de 0.25 à 2 mg/kg/j) (11). La

prévalence est au contraire multipliée par trois lorsque la mère est nourrie avec une ration

mixte (commerciale et ménagère) plutôt que commerciale (11).

Comme chez la femme, une supplémentation en acide folique ne permet

malheureusement pas de prévenir tous les cas de fentes palatines, probablement dus à

l’origine multifactoriel de cette pathologie (45). Cependant, le type d’alimentation de la

chienne joue également un rôle dans le développement des fentes labio-palatines.

3) L’homocystéine, marqueur potentiel des fentes palatines ?

a) L’homocystéinémie de la mère

Il a été démontré que plusieurs facteurs intervenant dans les facteurs de risques des

fentes labio-palatines, tels qu’une mutation de MTHFR ou un défaut en acide folique, sont

également à l’origine à l’origine d’une hyperhomocystéinémie. De nombreuses études portant

sur les fentes labio-palatines et mettant en évidence des défauts en acides foliques chez la

mère mettent également en évidence une hyperhomocystéinémie chez la mère. L’étude de

94

BLOM H. J. et al., en 1999, met en évidence une augmentation significative de tHcy chez

les mères donnant naissance à un enfant présentant une fente orofaciale (129). En effet

une hyperhomocystéinémie (>19.1 µmol/L si à jeun et >50.1 µmol/L après bolus de

méthionine) est observée dans 15.6% des cas de mère ayant eu un enfant à fente palatine

(contre 3.6% pour la population contrôle) (129). De plus, ils notent une diminution

significative de la concentration en vitamine B6 mais aucune différence en vitamine B12.

L’hyperhomocystéinémie pourrait donc être un marqueur de fentes labio-palatines.

Cependant, une hyperhomocystéinémie elle-même pourrait être responsable de

maladies congénitales et donc un facteur de risque. En effet, lorsque tHcy est élevée,

l’homocystéine rentre en compétition avec SAM pour la réaction de méthylation de

l’ADN par une DNMT (ADN méthyltransférase), perturbant les mécanismes épigénétiques

(57). Ainsi l’impact de fortes concentrations en homocystéine sur le développement du fœtus

n’est pas encore bien établie mais son influence sur l’épigénome fœtal semble jouer un rôle

fondamental dans l’étiologie des malformations embryonnaires (57).

b) L’homocystéine dans le liquide amniotique

D’une manière générale, la concentration plasmatique totale en homocystéine (tHcy)

diminue au cours d’une grossesse normale, et la concentration totale en homocystéine du

liquide amniotique (aHcy) est plus faible que tHcy (63). La valeur moyenne de aHcy à 16

semaines est de 0.16 ± 0.03 µmol/L selon KANG S. S. et al. (63). Parmi les rares études

dosant aHcy, les résultats sont assez variables.

L’essai de BLOM H. J. et al. fait partie de ces études, leur objectif étant de comparer

les concentrations obtenues avec la prévalence des anomalies du tube neural (107). Ne

pouvant prélever de liquide amniotique au moment de la formation de l’anomalie, soit entre la

troisième et la quatrième semaine de grossesse, l’amniocentèse est réalisée à la moitié du

troisième semestre de grossesse. La concentration moyenne en homocystéine totale dans le

liquide amniotique est significativement plus élevée chez la femme portant un enfant

atteint d’anomalie du tube neural : 2.6 µmol/L contre 1.5 µmol/L pour le groupe témoin

(107). Ils démontrent également que seule tHcy varie significativement avec le stade de

grossesse mais non la concentration en homocystéine dans le liquide amniotique. Le transfert

transplacentaire d’homocystéine plasmatique peut être un facteur important déterminant le

taux d’homocystéine dans le liquide amniotique et donc à l’origine d’une corrélation positive

entre les deux compartiments (107). Cependant la hausse de concentration dans le liquide

95

amniotique peut également être due à une fuite d’homocystéine du défaut de fermeture du

tube neural du fœtus vers le liquide amniotique.

Il convient alors de se demander ce qu’il en est chez l’espèce canine et s’il en est de

même avec les fentes labio-palatines.

Une supplémentation en acide folique en période périconceptionnelle permet de

diminuer significativement l’incidence des anomalies de fermeture du tube neural et des

fentes labio-palatines. Chez le Bouledogue français, une telle supplémentation à 5

mg/chien/jour permet de diminuer de près de 50 % le risque de fentes labio-palatines.

Chez la femme donnant naissance à un enfant présentant une fente orofaciale, il est

mis en évidence une augmentation significative de l’homocystéinémie.

L’hyperhomocystéinémie ne serait pas seulement un marqueur de la déformation mais

également un facteur de risque en perturbant les mécanismes épigénétiques lors de

l’embryogénèse.

Chez l’homme, une augmentation significative de la concentration totale en

homocystéine du liquide amniotique, aHcy, est mis en évidence lors d’une grossesse avec

un enfant atteint d’anomalie de fermeture du tube neural.

96

L’homocystéine est acide aminé soufré non apporté par l’alimentation et formé à

partir de la méthionine, un acide aminé essentiel. Il est connu depuis longtemps en

médecine humaine comme facteur de risque pour les maladies cardio-vasculaires. Son

dosage en laboratoire ne fait pas partie des examens de routine et il est demandé pour les

patients à risque. Lorsqu’il est réalisé, celui-ci est principalement fait dans les

laboratoires français en utilisant la HPLC.

Une hyperhomocystéinémie peut être d’origine exogène par carence en vitamines

B12 et folates, plus rarement en vitamine B6, ou endogène par anomalie génétique.

Une carence en acide folique et vitamine B12 est connue depuis longtemps

comme facteur de risque des fentes labio-palatines. Or une carence en ces vitamines

implique une hyperhomocystéinémie. Il en est de même pour une mutation du gène

MTHFR. L’homocystéine pourrait donc être un marqueur de fentes labio-palatines. De

plus de récentes études suggèrent que de forts taux d’homocystéine pourraient être

directement responsables de malformations congénitales, dont les fentes labio-palatines.

Etant donné l’importance de l’homocystéine et des folates dans certains

métabolismes comme la méthylation des protéines ou de l’ADN ou encore la synthèse

des purines, il n’est pas surprenant qu’un dérèglement dans leur cycle soit à l’origine de

lourdes pathologies.

Les variations significatives observées en médecine humaine des concentrations

plasmatique et amniotique totale en homocystéine lors d’une grossesse pathologique

sont-elles également observées chez l’espèce canine sujette aux malformations

congénitales ?

97

PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE

Après avoir détaillé les différents aspects intervenant dans cette étude clinique et

justifié le rôle éventuel de l’homocystéine dans les fentes labio-palatines congénitales, la

méthode expérimentale utilisée va tout d’abord être expliquée. La mise en place du test

enzymatique permettant le dosage de l’homocystéine sera particulièrement détaillée, celui-ci

n’ayant jamais été encore utilisé en médecine humaine, ni pour le dosage sur liquide

amniotique.

Puis, les résultats obtenus au cours de ce travail seront décrits et discutés.

98

I. Objectifs

L’absence de diagnostic anténatal des fentes labio-palatines en médecine vétérinaire,

et la place de l’homocystéine dans le métabolisme des folates, dont la complémentation est

connue comme réduisant le risque de fentes labio-palatines, ont conduit à l’hypothèse que

l’homocystéine pourrait être un marqueur anténatal de fentes labio-palatines.

L’objectif de notre étude est de mettre en place une méthode enzymatique de

dosage de l’homocystéine, dans le plasma de chienne et dans le liquide amniotique de la

portée, afin d’évaluer un lien éventuel entre la concentration en homocystéine et l’apparition

de fentes labio-palatines et donc de proposer un dosage anténatal qui aurait une valeur

prédictive positive de l’anomalie congénitale. A notre connaissance, l’évaluation d’une telle

prédictivité n’a jamais été réalisée dans l’espèce canine.

De février 2013 à juin 2014, pour toutes césariennes réalisées aux hôpitaux de

chirurgie du CHEVAC, via le CERREC, service de reproduction de VetAgro Sup, des

prélèvements ont été réalisés. Ces prélèvements correspondent au sang de la mère d’une part

et au liquide amniotique d’autre part.

II. Protocole expérimental : matériels et méthodes

A. Sélection des animaux

Les femelles gestantes ont été recrutées au CERREC, lors des consultations de suivi de

gestation. Nous avons décidé de ne recruter que des chiennes présentées pour des césariennes

programmées afin de permettre les prélèvements de liquide amniotique chez les nouveau-nés.

La proposition d’une césarienne programmée a été faite aux éleveurs pour prévenir des

problèmes de dystocies liées à la race, ou parce que la femelle a déjà présenté une dystocie, ou

bien lors de chiot unique. La demande est parfois venue des éleveurs ne préférant prendre

aucun risque chez des races susceptibles de présenter une dystocie.

Tous les petits nés lors de ces césariennes programmées sont entrés dans l’étude.

Au total, 35 césariennes présentées au CERREC sont prises dans l’étude, toutes races

confondues, correspondant à un total de 171 chiots.

Parmi les races présentées, sont observées :

- 15 mères Bouledogue Français (BF), soit 42.9% des effectifs,

99

- 7 mères Bull Terrier miniature (Bull Ter. min.),

- 4 mères Saint Bernard (St B),

- 2 mères Bouvier Bernois (BB),

- 2 mères Terre Neuve (TN),

- 2 mères Boxer,

- 1 mère Berger Allemand,

- 1 mère Beagle,

- 1 mère Colley.

Dans les analyses statistiques utilisées pour l’exploitation des résultats, les Bouviers

Bernois, les Terres neuves ainsi que les Saints Bernard sont regroupés sous le terme de

« grandes races » ou « grands ».

B. Prélèvement du sang de la mère

De 24 à 48 heures avant chaque césarienne, une prise de sang sur tube hépariné à la

veine céphalique est réalisée chez la mère.

Le matériel utilisé est une seringue 5 mL stérile et une aiguille 21G. Une compression

est réalisée à l’aide d’un garrot positionnée en arrière du coude, de l’alcool est appliqué sur le

lieu de prélèvement afin de visualiser la veine puis le prélèvement est réalisé par une personne

expérimentée.

Chaque prélèvement est identifié par date et par animal, centrifugé, le plasma séparé

et stocké en congélation dans des tubes stériles (-25°C).

C. Prélèvement du liquide amniotique

Les prélèvements de liquide amniotique sont réalisés au cours de la césarienne et non

par amniocentèse afin de limiter les risques liés à celle-ci.

1) Réalisation de la césarienne au CHEVAC: Hystérotomie

Les chiennes dont la césarienne est programmée reçoivent une injection

d’aglépristone (Alizine® NDV) à 15 mg/kg environ 18 à 24h avant l’intervention suivant la

progestéronémie (partie 1, II E 3) b ii).

La zone chirurgicale est tondue au cours du dernier contrôle échographique afin de

limiter le stress de la chienne le jour de la césarienne.

100

a) Protocole anesthésique

L’anesthésie doit être la plus courte possible.

A leur arrivée au bloc de chirurgie, les chiennes ont été préoxygénées pendant 5

minutes, afin de maintenir une oxygénation fœtale maximale, et un cathéter veineux

périphérique a été posé sur un des membres thoraciques.

Aucune prémédication n’est réalisée. L’induction est réalisée à partir d’un bolus

d’alfaxalone 3 mg/kg IV ou propofol 6 mg/kg IV, sur une minute. La chienne est ensuite

directement intubée. Si l’intubation n’est pas possible, de nouveaux bolus au quart de la dose

initiale sont réalisés toutes les 15 secondes jusqu’à ce que la chienne soit intubée. L’entretien

de l’anesthésie est permis par l’inhalation d’isoflurane à 2% dans 100% d’O2. Au cours de

l’anesthésie, des bolus d’alfaxalone ou de propofol peuvent être effectués au dixième de la

dose initiale au besoin.

Les chiennes sont monitorées pendant toute la durée de la chirurgie. Toutes les 5

minutes, la fréquence cardiaque, l’ECG, la pression partielle, la fréquence respiratoire, la

saturation en oxygène (SpO2), la fraction inspirée en oxygène (FiO2), l’Endtidal CO2 (EtCO2)

et la température œsophagienne sont relevés.

Une injection de morphine à 0.2 mg/kg en IV est réalisée après extraction du dernier

chiot, puis une seconde en SC au moment de l’extubation.

b) Technique chirurgicale (fig. 29)

La table est inclinée de 13° afin de limiter l’écrasement du diaphragme, de l’aorte et de

la veine cave postérieure par le poids de l’utérus gravide.

Une injection de lidocaïne à 0.2 mg/kg est réalisée en traçante sur le lieu d’incision 2

minutes avant le début de la chirurgie.

La césarienne est réalisée par un chirurgien expérimenté qui travaille rapidement.

La voie d’abord est une laparotomie ombilico-pubienne avec une ouverture à la

lame froide au niveau de la ligne blanche. Les deux cornes utérines sont extériorisées de

l’abdomen. Une seule incision au niveau de la grande courbure en région caudale de la

corne présentant le plus de chiots, ou sur le corps de l’utérus, est réalisée au scalpel. Les

chiots et leurs enveloppes sont désinsérés un à un par cette ouverture.

La fermeture de l’utérus est réalisée en deux plans, un surjet simple suivit d’un

surjet enfouissant, à l’aide d’un PDS® 3/0 ou 2/0 (monofil résorbable). L’utérus est ensuite

remis en position physiologique.

101

Après examen de l’utérus et de la cavité abdominale, la paroi abdominale est suturée :

-fermeture du plan musculaire : surjet simple avec des points d’arrêt au Safil® 2/0 (tressé

résorbable),

-surjet sous cutané au Safil® 2/0,

-fermeture du plan cutané : surjet transdermique au Safil® 3/0.

102

A B

C D

E F

Figure 29: Présentation de différentes étapes de la césarienne

[Crédit photos M. Courchay]

A- Extériorisation des deux cornes utérines de la cavité abdominale

B- Site pour l’incision au niveau de la grande courbure caudalement à une des deux cornes

C- Incision de la corne utérine droite dans le cas présenté

D- Extraction d’un chiot encore enveloppé de ses annexes

E- Suture du premier plan de l’utérus par un surjet simple (PDS® 3/0 ou 2/0)

F- Suture du second plan de l’utérus par un surjet enfouissant (PDS® 3/0 ou 2/0)

103

c) Médication

Après extraction du dernier chiot, une injection de meloxicam à 0.1 mg/kg en SC est

réalisée, ainsi qu’une antibioprophylaxie à base de céfalexine de 25 à 30 mg/kg en IV.

La chienne reçoit une fluidothérapie à base de Ringer Lactate à 10 mL/kg/h pendant

toute la durée de la chirurgie.

Une injection de métoclopramide (Emeprid® NDV) à 0.5 mg/kg IV est réalisée

pendant la chirurgie; ainsi qu’une injection d’ocytocine 0.025 UI/kg IV après fermeture de

l’utérus.

Enfin, une injection de ranitidine (Azantac® NDH) est réalisée à 1 mg/kg IV pour les

races brachycéphales, afin d’éviter les reflux gastriques.

d) Traitement proposé

Une antibiothérapie est prescrite pendant 10 jours : céfalexine à 15 mg/kg par voie

orale deux fois par jour. Le métoclopramide est à continuer pendant trois jours pour

favoriser la montée de lait à 0.5 mg/kg trois fois par jour. Enfin, une analgésie à base

d’AINS ou de tramadol (Topalgic LP® NDH, pendant 5-7 jours à 3 mg/kg une fois par jour)

pourra être administrée selon les besoins de la chienne.

2) Prélèvement stérile du liquide amniotique au cours de la césarienne

A chaque fois qu’un nouveau-né est désinséré de l’utérus, le liquide amniotique est

prélevé sur une table opératoire installée juste à côté de la table de chirurgie (fig. 30). Le

chirurgien tend le chiot encore enveloppé de l’amnios (fig. 29 D et 31) à un autre

intervenant, en stérile, qui prélève alors, à l’aide d’une seringue de 5 mL et d’une aiguille

21G, le liquide amniotique par ponction à travers l’amnios (fig. 32).

Une fois le prélèvement fait, le chiot est alors rapidement débarrassé de ses enveloppes

fœtales et les mesures habituelles de réanimation des chiots sont rapidement entreprises :

aspiration des sécrétions nasales et buccales, friction dans des champs propres et ligature du

cordon ombilical.

Les prélèvements réalisés sont directement déposés dans des tubes stériles secs

identifiés (au nom de la mère, de la date et en fonction du rang de naissance) et conservés au

froid (-20°C) (fig. 33).

104

Les chiots présentant une malformation sont euthanasiés au pentobarbital (Doléthal®

NDV) à la posologie de 182.2 mg/kg.

Figure 30: Préparation de la table stérile pour le prélèvement du liquide amniotique

[Crédit photos M. Courchay]

Figure 31: Nouveau-né encore enveloppé de ses annexes fœtales

[Crédit photos M. Courchay]

Champ stérile pour

l’accueil des nouveau-

nés

Aiguilles 21G et

seringues 5 mL

préparées pour le

prélèvement du liquide

amniotique

Clamps pour

l’hémostase des

cordons ombilicaux

105

Figure 32: Prélèvement stérile du liquide amniotique

[Crédit photos M. Courchay]

Figure 33: Prélèvements de liquide amniotique effectués lors d'une césarienne programmée

sur une portée de 8 chiots

[Crédit photo J. Paquette]

-tubes 1 et 6 : absents car poches fœtales rompues à l’extériorisation de l’utérus

-tubes 2,7 et 8 : prélèvements contaminés

106

D. Dosage de l’homocystéine par la méthode enzymatique

Les dosages de l’homocystéine sont réalisés en utilisant la méthode enzymatique à

trois réactifs. Les kits de dosage proviennent des laboratoires Diazyme, situés à Poway en

Californie.

Cette méthode repose sur une étape d’amplification enzymatique qui augmente la

détection du signal et donc la sensibilité du test. Elle est utilisée pour déterminer ex vivo tHcy

de manière quantitative dans le sérum ou le plasma d’échantillons humains.

1) Présentation du test enzymatique à trois réactifs

a) Principe du test

Ce test enzymatique est basé sur le dosage du produit de conversion d’un co-

substrat, non produit par conversion de l’homocystéine et absent de l’échantillon de départ.

L’absorbance de l’échantillon est suivi en fonction du temps : A340nm = ƒ(t).

L’absorbance en UV est suivie à 340 nm.

Ce test permet de mesurer des concentrations de tHcy variant de 3 à 50 µmol/L.

b) Les réactions chimiques mises en jeu (fig. 34)

Les formes oxydées de l’homocystéine sont tout d’abord réduites en utilisant le TCEP

comme agent réducteur (tris(2-carboxyethyl)phosphine).

L’homocystéine libre de l’échantillon est transformée par la méthionine synthase

(MS), en présence de S-adénosyl méthionine (SAM) comme co-substrat donneur de

groupement méthyl, en méthionine (produit de la conversion de l’homocystéine) et SAH

(produit de la conversion du co-substrat).

La S-adénosyl homocystéine (SAH), générée au cours de la réaction, est ensuite

hydrolysée en homocystéine et adénosine (Ado) par la SAH hydrolase.

L’homocystéine formée rentre dans la réaction de conversion catalysée par la MS

réalisant ainsi un cycle avec un système d’amplification du signal.

L’adénosine formée est immédiatement hydrolysée en inosine et ammoniac, catalysée

par l’adénosine désaminase (ADA).

107

Enfin, la glutamate déshydrogénase (GLDH) catalyse la réaction de l’ammoniaque

avec le 2-oxoglutarate et le NADH formant le NAD+.

NADH, présentant un maximum d’absorption spécifique à 340 nm, est suivie en

fonction du temps. Ainsi en suivant l’absorbance à 340 nm, l’évolution de la réaction

chimique est évaluée et la courbe A340nm = ƒ(t) correspond à la cinétique de disparition du

NADH.

La concentration en homocystéine de l’échantillon est donc proportionnelle à la

quantité de NADH oxydée en NAD+.

Figure 34: Schéma des réactions enzymatiques mises en jeu lors du dosage par la méthode

enzymatique de l'homocystéine

D’après (25)

c) Composition des réactifs

La composition des réactifs est présentée dans le tableau VI.

- Première étape : Réduction de l’homocystéine

Hcy-R Hcy + R

- Deuxième étape : Conversion de l’homocystéine en méthionine et accumulation du SAH

Hcy + SAM SAH + Met

- Troisième étape : Hydrolyse du produit SAH

SAH Hcy + Ado

- Quatrième étape : Détection de l’accumulation de l’Ado par le couple NAD/NADH

Ado Inosine + NH3 Détection (340 nm)

2-oxoglutarate + NADH NAD+

MS

SAH hydrolase

TCEP

ADA GLDH

Cycling

108

Tableau VI: Composition des réactifs du test enzymatique

D’après (25)

INGREDIENTS CONCENTRATIONS

Réactif 1

SAM 0,1 mM

NADH > 0,2 mM

TCEP > 0,5 mM

2-oxoglutarate 5,0 mM

Réactif 2 MS 5,0 KU/L

GLDH 10 KU/L

Réactif 3 SAH Hydrolase 3,0 KU/L

ADA 5,0 KU/L

d) Réalisation du test

Les différentes étapes du test enzymatique proposées par les laboratoires Diazyme

sont présentées dans la figure 28.

Figure 35: Procédure du test enzymatique recommandée par les laboratoires Diazyme

D’après (25)

L’échantillon est introduit en même temps que le réactif R1, ne contenant que des

substrats. Après ajout du réactif R2, comprenant la Méthionine Synthase (MS), la conversion

de l’homocystéine en méthionine démarre et la SAH s’accumule jusqu’à l’ajout de R3. Cette

accumulation est fonction de la concentration initiale en homocystéine de l’échantillon. La

présence de R3, et donc des deux dernières enzyme-clés, permet de démarrer le cycling. À

partir de A1 les mesures d’absorbance commencent.

Echantillon : 18 µL

R1 : 240 µL R3 : 25 µL

R2 : 38 µL

37°C

0 5 7 10 temps

340 nm A1 A2 (min)

109

2) Validation du test enzymatique à trois réactifs

Les mesures sont réalisées en utilisant les kits à trois réactifs commercialisés par les

laboratoires Diazyme. Une validation minimale du système de dosage a dû être mise en œuvre

afin de l’adapter à l’analyseur automatique utilisé (Konelab20, Thermo) et aux matrices

biologiques utilisées pour cette étude. Ce système de dosage a donc été adapté à l’analyseur

Konelab20 du service de biochimie de VetAgro Sup, le laboratoire de biologie médicale.

La sélectivité (capacité du test à doser le substrat) et la spécificité (interactions

possibles lors du dosage) du test correspondent à celles données par les laboratoires

Diazyme : il existe un risque de 10% d’interférences avec d’autre substances chimiques (20

µmol/L SAM, 1mmol/L L-Cystéine, 2500 mg/dL triglycérides etc…).

a) Programmation du test

L’appareil Konelab20 prélève le volume d’échantillon programmé pour le test, les

échantillons étant préalablement déposés dans des cupules rassemblées sur des segments (fig.

36), et les dépose dans les cuvettes (fig. 37). Il prélève ensuite les réactifs un à un, selon la

programmation enregistrée, pour les déposer dans les cuvettes. La mesure de l’absorbance est

réalisée à partir des cuvettes dans lesquelles se déroulent les réactions enzymatiques.

Figure 36: Analyseur Konelab20, laboratoire de biologie médicale, VetAgro Sup

[Crédit photos M. Courchay]

Disque à réactifs

Cupule contenant

un échantillon

Segment

110

Figure 37: Présentation schématique du fonctionnement interne de l'analyseur Konelab20

[Thermo SCIENTIFIC]

Afin d’avoir un volume total « échantillon+R1+R2+R3 » adapté au volume des

cuvettes de l’appareil Konelab20, les volumes respectifs ont dû être diminués par rapport aux

recommandations des laboratoires Diazyme.

La programmation du test permettant d’optimiser la calibration sur l’appareil

Konelab20 est présentée dans la figure 38.

Figure 38: Programmation du test enzymatique à trois réactifs pour le dosage de

l'homocystéine sur l'appareil Konelab20 du laboratoire de biologie médicale de VetAgro Sup

La cinétique du test est programmée pour 9 mesures d’absorbance en 4 minutes, de

A1 à A9. L’analyseur donne donc la courbe A340nm = ƒ(t) pour chaque échantillon. La

Echantillon : 20 µL

R1 : 160 µL R3 : 17 µL

R2 : 27 µL

37°C

0 0.5 4.5 5 9 temps

340 nm A1 A9 (min)

111

réponse R du test, pour un échantillon donné, correspond à la valeur de la pente de la droite

obtenue par régression linéaire de A340nm = ƒ(t), soit R=ΔA/min. La réponse est ensuite

traduite en concentration (µmol/L) grâce à la courbe d’étalonnage. Il est donc impératif de

positionner le dosage, lors de sa validation, dans la phase linéaire de la cinétique

enzymatique. Si l’étape d’amplification cinétique est un avantage pour gagner en sensibilité,

elle entraine un élément de complication supplémentaire pour la validation. Compte-tenu des

concentrations en analyte rencontrées, beaucoup plus faibles dans le plasma des chiens que

celles retrouvées chez l’homme, l’étape d’amplification a fait l’objet d’une attention

particulière afin de permettre d’atteindre ces concentrations avec un maximum de fidélité.

b) Calibration et courbe d’étalonnage

La courbe d’étalonnage a été réalisée à partir de 4 calibrants fournis avec le kit. Leur

concentration cible, la réponse R ainsi que leur concentration calculée à partir de la

programmation du test réalisée dans cette étude, sont présentées dans le tableau VII.

Pour chaque calibrant, le graphe A340nm = ƒ(t) est présenté dans la figure 39 et une

linéarité de la réponse est observée.

Tableau VII: Réponse du test et concentrations des calibrants

CALIBRANTS Réponse

R = ΔA/min

Concentration cible

(µmol/L)

Concentration

calculée (µmol/L)

1 -0.012 2.00 0.54

2 -0.022 6.70 7.31

3 -0.036 15.00 16.95

4 -0.049 27.60 26.50

112

Figure 39: Absorbance en fonction du temps permettant d'obtenir la réponse R pour chaque

calibrant

La réponse du test pour chaque calibrant en fonction de leur concentration cible

permet d’obtenir une droite de régression linéaire correspondant à la droite

d’étalonnage (fig. 40). Le coefficient de détermination r2 ainsi obtenue est égal à 0.981.

Ainsi, dans nos mains et sur notre appareillage, le domaine analytique obtenu dans ces

conditions modifiées d’amplification cinétique s’étend de 2 à 27 µmol/L environ (intervalle

de travail) (fig. 40).

Les contrôles, dont les concentrations sont fournies par les laboratoires Diazyme, sont

également représentés sur la figure 37. Un contrôle supplémentaire dilué est également

introduit pour prendre en considération les concentrations rencontrées chez le chien.

Les dosages ayant été réalisés sur trois jours, toutes les concentrations obtenues au

cours de cette étude sont calculées à partir de cette courbe d’étalonnage, rentrée comme telle

1.37

1.38

1.39

1.4

1.41

1.42

1.43

1.44

0 100 200 300

Ab

sorb

an

ce

temps (secondes)

Calibrant 1

1.32

1.34

1.36

1.38

1.4

1.42

1.44

0 100 200 300

Ab

sorb

an

ce

temps (secondes)

Calibrant 2

1.1

1.15

1.2

1.25

1.3

1.35

1.4

0 100 200 300

Ab

sorb

an

ce

temps (secondes)

Calibrant 4

1.24

1.26

1.28

1.3

1.32

1.34

1.36

1.38

1.4

1.42

0 100 200 300

Ab

sorb

an

ce

temps (secondes)

Calibrant 3

Régression

linéaire

R

r2 = 0.967

r2 = 0.999 r

2 = 0.999

r2 = 0.991

113

dans l’analyseur. Le passage régulier de contrôles permet de s’assurer de l’absence de

déviation analytique pendant cette courbe période.

Dans la matrice biologique plasma de chienne, une estimation de la limite de détection

(LOD) et de la limite de quantification (LOQ) est réalisée sur la base des recommandations

européennes de validation des tests biologiques (76) à partir d’un échantillon plasmatique

naturellement faible en Hcy et dosé 10 fois consécutives. En accord avec les

recommandations, la LOD est calculée par une pondération d’un facteur 3 de la dispersion des

points par rapport à la moyenne et la LOQ par un facteur 10. Dans nos conditions analytiques

et dans le plasma de chien, la LOD de notre dosage enzymatique est de 0.4 µmol/L et la LOQ

de 1.35 µmol/L (fig. 40).

Figure 40: Courbe d'étalonnage obtenue après paramétrage du test enzymatique à trois

réactifs sur l'appareil Konelab20

c) Répétabilité du test

La répétabilité du test, ou fidélité illustrée par l’étroitesse de l’accord entre les

résultats d’essai, est évaluée sur les deux matrices biologiques utilisées pour cette étude, soit

le plasma et le liquide amniotique. Elle est réalisée à partir d’échantillons ayant fait l’objet de

-0.055

-0.045

-0.035

-0.025

-0.015

-0.005

0 5 10 15 20 25 30 35

Rép

on

se R

(ΔA

/min

)

Concention en Hcy (µmol/L)

calibrants

controles

Régréssion linéaire

(Calibrants)

r2 = 0.981

LO

D

LO

Q

Intervalle de travail

114

dosages réitérés (n= 2 à 3) dans des conditions de répétabilité (même jour, même opérateur,

même réactif…).

Pour chaque type de prélèvement, la répétabilité est évaluée en fonction des gammes

de concentrations obtenues, à partir d’un minimum de 15 prélèvements, et répartis selon 2 à

3 gammes de concentrations. La répétabilité, exprimée en %, est calculée en accord avec les

recommandations européennes de validation des dosages biologiques (24)(76). Elle est

représentée par le coefficient de variation de répétabilité, CVr, correspondant à l’écart-type de

répétabilité divisé par la moyenne des concentrations obtenue pour chaque échantillon, et

exprimée en pourcentage.

i. Répétabilité sur le plasma

Dans le plasma, et en fonction de la gamme de concentration rencontrée de l’analyte,

les résultats de répétabilité sont les suivants :

- ]0 ; 4.5] µmol/L, CVr varie de 0 à 24% ;

- >4.5 µmol/L, CVr varie de 3.69 à 20.47%.

Les deux gammes de concentration choisies sont considérées pour couvrir les besoins

analytiques.

ii. Répétabilité sur le liquide amniotique

Pour la matrice biologique liquide amniotique, trois gammes de concentrations sont

considérées et donnent les résultats suivants :

- valeur basses, ]0 ; 11] µmol/L, CVr varie de 3.0 à 56.60% ;

- valeurs moyennes, ]11 ; 30] µmol/L, CVr varie de 0.41 à 9.80% ;

- valeurs hautes, >30 µmol/L, CVr varie de 0.48 à 2.95%.

On observe, en règle générale, une répétabilité satisfaisante, l’incertitude devenant

plus grande en limite basse du domaine analytique.

E. Dosage des autres paramètres biochimiques

La fonction rénale des chiennes est évaluée par dosage enzymatique des

concentrations plasmatiques en urée, créatinine, protéines totales et albumine sur Konelab20

115

par les réactifs dédiés à ces dosages (Thermo). Les valeurs de référence sont celles proposées

par le laboratoire de biochimie de VetAgro Sup.

Du fait de l’interdépendance entre le métabolisme de l’homocystéine avec celui de la

cobalamine et de l’acide folique, les concentrations plasmatiques de ces deux vitamines sont

également évaluées dans le plasma des chiennes. Le principe de dosage est un immunodosage

par compétition en phase solide. Ces dosages sont réalisés sur Immulite 2000 (Siemens).

F. Analyse des résultats

L’ensemble des résultats est rassemblé dans Excel (Annexe 1 et 2).

Le calcul des moyennes et de l’erreur-type (sem, Standard Error of the Mean) ainsi

que les analyses statistiques sont réalisés à partir du logiciel Prism.

Les analyses statistiques utilisées sont réalisées :

-par la comparaison de deux groupes par un test de comparaison de moyenne (test t de

Student),

-par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA one way), suivie d’un test de Tukey,

pour la comparaison de plus de deux groupes.

Le critère retenu de significativité d’exclusion de l’hypothèse nulle est considéré pour une

probabilité inférieure à 5% (p-value p <0.05, notée * dans les graphiques).

Les représentations graphiques indiquent des moyennes ± sem.

Les analyses de corrélations entre deux paramètres sont réalisées par régression

linéaire et calcul du coefficient de détermination r2.

III. Résultats

A. Description des effectifs

Sur les 35 chiennes présentées pour césarienne et rentrant dans l’étude, 28

prélèvements sanguins ont pu être réalisés. Six portées ont présenté des fentes labio-

palatines correspondant à 17.1% des portées atteintes de la malformation. En tenant

compte uniquement des Bouledogues français, 4 portées sur 15 ont présenté des fentes

palatines soit 26.7% des portées.

116

Sur les 171 chiots, 110 dosages sur liquide amniotique ont pu être réalisés. Huit chiots

ont présentés des fentes labio-palatines, soit 4.7% des chiots.

Ainsi, pour 96 couples mères/chiots, à la fois tHcy et aHcy sont disponibles.

1) Age moyen des chiennes le jour de la césarienne et nombre moyen de

chiots par portée

Les différentes moyennes sont présentées dans le tableau VIII.

L’âge moyen des chiennes le jour de la césarienne est de 3.3 ans, avec un minimum à

1 an et un maximum à 8 ans et demi. Les Bouledogues Français sont mises plus jeunes à la

reproduction par rapport aux autres races puisque leur âge est de 2.4 ans le jour de la mise-

bas.

Le nombre moyen de chiots par portée est de 5.3, avec une taille de la portée

significativement plus importante chez les grandes races (fig. 41).

Tableau VIII: Age des chiennes le jour de la césarienne, nombre de chiots par portée et

nombre de fentes labio-palatines

Effectifs

Age

(années)

Nombre

chiots

Nombre

fentes

total 35 3.3±0.3 5.3±0.5 8

BF 15 2.4±0.2 5.2±0.4 6

Bull Ter 7 3.8±0.8 3.6±0.7 0

Grands 8 4.0±0.4 8.0±1.1 0

divers 5 4.4±1.2 3.6±0.9 2

tou

sB

F

bu

ll t

er

gra

nd

es r

aces

div

ers

0

2

4

6

8

1 0

n o m b re c h io ts

no

mb

re

*

3 5 1 5 7 8 5

Figure 41: Représentation graphique par un diagramme en bâtons du nombre moyen de

chiots par portée en fonction de la race (*p<0.05)

117

Parmi les deux fentes palatines observées chez les races autres que les Bouledogues

français (tab. VIII), une est présente sur une portée de Boxer, l’autre est présente dans la

portée de Beagle.

2) Statut rénal et nutritionnel chez la mère

Les statuts rénal et nutritionnel du patient en médecine humaine ayant une influence

sur tHcy, ces statuts sont étudiés pour chaque chienne (tab. IX) (les valeurs usuelles sont

indiquées entre crochets).

Tableau IX: Moyennes des statuts nutritionnels (en violet) et rénaux (en vert) des chiennes

Effectifs Urée Créatinine Protéine Albumine B12 Folates

mmol/L

[2-7]

µmol/L

[60-135]

g/L

[50-72]

g/L

[27-38]

pg/mL

[200-600]

ng/mL

[4-13]

total 28 6.4±0.4 72.5±4.3 66.8±1.2 29.4±1.1 285±27 10.7±0.8

BF 10 5.7±0.6 73.5±7.2 62±1.3 30.9±3.1 328±59 9.5±1.3

Bull

Ter 7 4.5±0.9 54.4±3.4 71±2.6 28.9±1.0 241±33 13.7±0.7

Grands 7 7.7±0.9 91.9±7.0 70±1.6 28.9±0.8 288±40 9.6±2.4

divers 4 7.4±0.7 68.0±13.0 66±2.7 27.5±1.2 225±46 11.0±1.0

Aucune chienne ne présente de signes biologiques d’insuffisance rénale chronique.

Les protéines totales plasmatiques ainsi que l’albuminémie de ces chiennes sont dans les

intervalles de référence correspondant permettant d’exclure également tout syndrome

néphrotique ou d’insuffisance fonctionnelle hépatique grave. Ces éléments biologiques

permettent ainsi d’exclure l’existence de pathologies systémiques reconnues comme pouvant

affecter les concentrations plasmatiques de tHcy.

D’une manière générale, le statut nutritionnel en vitamines B des chiennes est correct

et les moyennes sont dans les valeurs usuelles. Cependant, 10 femelles présentent une légère

carence en vitamine B12 tandis que 5 femelles présentent des concentrations en acide folique

plasmatique plutôt abaissées.

Les représentations graphiques en nuage de points présentées dans les figures 42 et 43

mettent en évidence la répartition des bilans biochimiques de ces chiennes.

118

U r é e C r é a t in in e

0

2

4

6

8

1 0

1 2

1 4

1 6

1 8

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

mm

ol/

L

µm

ol/L

P r o té in e s Alb u m in e

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

2 0

2 4

2 8

3 2

3 6

4 0

g/L

g/L

Figure 42: Représentation graphique en nuage de points du statut rénal des mères en fin de

gestation (moyennes et sem indiqués en rouge, valeurs de référence indiquées en vert)

B 1 2 F o la te s

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

pg

/mL

ng

/mL

Figure 43: Représentation graphique en nuage de points du statut nutritionnel en vitamine B

des mères en fin de gestation (moyennes et sem indiqués en rouge, valeurs de référence

indiquées en vert)

Sur la base de cette étude, il n’y a pas de différence significative entre les

concentrations plasmatiques en acide folique et en cobalamine entre les différentes races de

chiens (fig.44).

Cependant, concernant l’urémie et la créatinémie, une différence significative est

observée entre les moyennes obtenues chez les grandes races et les moyennes obtenues chez

les Bull terriers miniatures (fig. 44)

.

119

tou

sB

F

bu

ll t

er

gra

nd

es r

aces

div

ers

0

2

4

6

8

1 0

u r é e

mm

ol/

L*

tou

sB

F

bu

ll t

er

gra

nd

es r

aces

div

ers

0

5 0

1 0 0

1 5 0

c r é a t in in e

µm

ol/

L

*

tou

sB

F

bu

ll t

er

gra

nd

es r

aces

div

ers

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

B 1 2

pg

/mL

tou

sB

F

bu

ll t

er

gra

nd

es r

aces

div

ers

0

5

1 0

1 5

2 0

fo la te sn

g/m

L

Figure 44: Représentation graphique par un diagramme en bâtons du statut rénal et

nutritionnel en vitamines B selon la race

B. Résultats relatifs à l’homocystéinémie (tHcy) chez la mère en fin de

gestation

1) Valeurs moyennes

La valeur moyenne de l’homocystéiménie obtenue chez les chiennes en fin de

gestation est de 4.5 µmol/L avec une faible variabilité (sem à 0.34 µmol/L) (tab. X).

120

Une différence significative est observée chez les grandes races et autres races que

Bouledogue français et Bull terrier miniature (fig. 45). En effet, par exemple tHcy est presque

le double chez les grandes races par rapport aux Bouledogues français : 6.0 vs 3.5 µmol/L.

Les concentrations totales en homocystéine plasmatique chez la mère en fin de

gestation varient de 1.8 à 7.3 µmol/L, toutes races confondues (fig. 46).

Tableau X: Valeurs moyennes de l'homocystéinémie des mères

Effectifs tHcy Urée Créatinine Protéine Albumine B12 Folates

µmol/L mmol/L

[2-7]

µmol/L

[60-135]

g/L

[50-72]

g/L

[27-38]

pg/mL

[200-600]

ng/mL

[4-13]

total 28 4.5±0.34 6.4±0.4 72.5±4.3 66.8±1.2 29.4±1.1 285±27 10.7±0.8

BF 10 3.5±0.4 5.7±0.6 73.5±7.2 62±1.3 30.9±3.1 328±59 9.5±1.3

Bull

Ter 7 3.7±0.6 4.5±0.9 54.4±3.4 71±2.6 28.9±1.0 241±33 13.7±0.7

Grands 7 6.0±0.6 7.7±0.9 91.9±7.0 70±1.6 28.9±0.8 288±40 9.6±2.4

divers 4 5.9±0.7 7.4±0.7 68.0±13.0 66±2.7 27.5±1.2 225±46 11.0±1.0

tou

sB

F

bu

ll t

er

gra

nd

es r

aces

div

ers

0

2

4

6

8

tH c y

µm

ol/

L

* *

2 8 1 0 7 7 4

Figure 45: Représentation

graphique par un diagramme en

bâtons de tHcy moyenne obtenue,

en fonction de la race (*p<0.05)

Figure 46: Représentation

graphique par un nuage de points

de tHcy obtenue, en fonction de la

race

121

2) Résultats en fonction du statut rénal ou nutritionnel de la chienne

Il existe une corrélation positive significative entre l’urée (r2 = 0.57, p = 0.001) ainsi

que pour la créatinine (r2 = 0.42, p = 0.01) et tHcy (fig. 47). Par ailleurs, il n’y a aucune

corrélation entre tHcy et les protéines totales, l’albumine ou le statut nutritionnel en

vitamines B (fig. 47 et 48).

0 2 4 6 8

0

5

1 0

1 5

c o r ré la t io n tH c y /u r é e

tH c y (µ m o l/L )

Uré

e (

mm

ol/

L)

r2= 0 .5 7

0 2 4 6 8

0

5 0

1 0 0

1 5 0

c o r ré la t io n H c y /c r é a t

tH c y (µ m o l/L )

Cré

at

(60

-13

5µ

mo

l/L

) r2= 0 .4 2

0 2 4 6 8

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

tH c y /p r o té in e s

H c y (µ m o l/L )

pro

t (

g/L

)

r2= 0 .0 4

0 2 4 6 8

2 0

2 5

3 0

3 5

tH c y /a lb u m in e

H c y (µ m o l/L )

Alb

um

( g

/L)

r2= 0 .0 4

Figure 47: Régression linéaire entre tHcy et le statut rénal

0 2 4 6 8

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

tH c y /B 1 2

H c y (µ m o l/L )

B1

2

r2= 0 .0 6

0 2 4 6 8

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

tH c y /fo la te s

H c y (µ m o l/L )

Fo

late

s

r2= 0 .0 0 0 6

Figure 48: Régression linéaire entre tHcy et le statut nutritionnel

122

3) Résultats en fonction de l’âge de la chienne

La concentration totale en homocystéine plasmatique évoluant fortement avec l’âge

chez l’homme, les variations en fonctions de l’âge de la mère le jour de la césarienne ont été

étudiées (fig. 49).

0 2 4 6 8

0

2

4

6

8

1 0

c o rr é la t io n tH c y /â g e

H c y (µ m o l/L )

âg

e

r2= 0 .3 0

Figure 49: Régression linéaire entre tHcy et l'âge de la mère

Une corrélation significative, avec un coefficient de détermination r2 = 0.30 (p =

0.011), est observée : tHcy augmente avec l’âge.

4) Résultats en fonction de la présence de fentes labio-palatines au sein de la

portée

Le nombre de dosages tHcy chez les mères présentant dans leur portée une ou

plusieurs fentes palatines est insuffisant pour pouvoir obtenir un résultat significatif.

Cependant, en moyenne, une légère tendance à une diminution de tHcy en cas de fentes

labio-palatines est notée (4.73 ± 0.39 µmol/L sans vs 3.63 ± 0.55 µmol/L avec) (fig. 50).

123

s a n s lé s io n s a v e c lé s io n s

0

2

4

6

tH c y m è re s

µm

ol/

L

2 2 6

s a n s lé s io n s a v e c lé s io n s

0

5

1 0

1 5

fo la te s

ng

/mL

2 2 6

Figure 50: Représentations graphiques par un diagramme en bâtons de tHcy ou de la

concentration plasmatique en folates en fonction de la présence de fentes palatines ou non

De même, malgré une tendance à une diminution de la concentration plasmatique

moyenne en folates chez les mères présentant, dans leur portée, un ou plusieurs petits

avec une fente labio-palatine, la différence entre les groupes n’apparaît pas significative

(11.99 ± 1.26 ng/mL avec vs 10.76 ± 1.28 ng/mL sans) (fig. 50).

C. Résultats relatifs à la concentration en homocystéine dans le liquide

amniotique (aHcy)

1) Valeurs moyennes

Les concentrations en homocystéine obtenues dans le liquide amniotique de chaque

chiot, aHcy, sont bien plus faibles que les tHcy. Elles sont cependant beaucoup plus étalées

avec en minimum 24 échantillons dont la concentration est en dessous du seuil minimum

détectable par le test enzymatique, et en maximum des concentrations pouvant aller jusqu’à

43.5 µmol/L (fig. 51) (tab. XI).

La concentration moyenne mesurée toutes races confondues est de 5.9 ± 0.13 µmol/L

(tab. XI).

124

0 2 4 6 810

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

0

5

1 0

1 5

2 0

H c y a m n io tiq u e : d is tr ib u tio n

B in C e n te r

Nu

mb

er o

f v

alu

es

Figure 51: Répartition du nombre d'échantillon en fonction de aHcy

L’histogramme de distribution indique une distribution gaussienne mais entachée par

les valeurs inférieures au seuil de détection (fig. 51). Les comparaisons des moyennes entre

les groupes doivent donc en tenir compte et les données doivent aussi être comparées à la

valeur médiane. La valeur médiane de l’histogramme de distribution est à 3.65 µmol/L.

Tableau XI: Valeurs moyennes de aHcy

Nombre

de

chiots

Nombre

de fentes

aHcy

µmol/L Min Max

total 110 8 5.9±0.73 0.2 43.5

BF 50 6 8.2±1.4 0.3 43.5

Bull

Ter 14 0 5.9±1.6 0.4 18.3

Grands 39 0 3.2±0.6 0.2 17.8

divers 7 2 5.5±2.3 0.3 17.1

St B 21 0 3.6±1.1 0.2 17.8

BB 10 0 3.6±0.8 0.7 8.5

TN 8 0 1.5±0.5 0.2 3.7

aHcy (µmol/L)

125

2) Résultats en fonction de la race

Il existe une différence significative entre les grandes races et les Bouledogues

français : la concentration est 2.6 fois plus importante chez les races brachycéphales, 8.2 vs

3.2 µmol/L (tab. XI) (fig. 52).

tou

sB

F

Bu

ll T

Gra

nd

s

div

ers

0

2

4

6

8

1 0

1 2

a H c yµ

mo

l/L

*

Figure 52: Représentation graphique par un diagramme en bâtons des valeurs moyennes de

aHcy en fonction de la race (*p<0.05)

3) Résultats en fonction du sexe du chiot

La nature du sexe du chiot n’est connue seulement que sur 58 échantillons de liquide

amniotique de nouveau-nés identifiés. Il en ressort une nette différence significative : aHcy

est plus élevée chez les femelles (fig. 53).

126

m â le s fe m e lle s

0

2

4

6

8

1 0

a H c y c h io ts

µm

ol/

L3 3 25

*

Figure 53: Représentation graphique par un diagramme en bâtons de aHcy moyenne en

fonction du sexe des chiots (*p<0.05)

La moyenne pour les mâles est de 3.7 ± 0.7 µmol/L, et pour les femelles : 7.8 ± 1.7

µmol/L. Cette différence est également observée avec des valeurs médianes à 2.8 µmol/L

pour les mâles et 4.1 µmol/L pour les femelles.

4) Résultats par rapport à la mère

a) En fonction de l’âge de la mère

Il n’existe aucune corrélation entre aHcy d’un chiot et l’âge de sa mère à la mise-bas

(fig. 54).

0 2 4 6

0

1 0

2 0

3 0

a H c y c h io t / â g e m è r e

a n s

µm

ol/

L a

mn

ioti

qu

e

r2= 0 .0 2 8

Figure 54: Régression linéaire entre aHcy et l'âge de la mère

127

b) En fonction de tHcy de la mère

Il n’existe pas de corrélation entre aHcy du chiot et tHcy de sa mère (fig. 55) et ce

quelle que soit la race.

0 2 4 6 8

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0

4 5

a H c y c h io ts / tH c y m è re

µ m o l/L p la s m a tiq u e

µm

ol/

L a

mn

ioti

qu

e

d iv e rs

B ouv

T e rre N

S t B e r

B u ll te r

B F

Figure 55: Corrélation nulle entre aHcy et tHcy

5) Résultats en fonction du nombre de chiots au sein de la portée

Enfin, il n’existe pas de corrélation entre la concentration en liquide amniotique d’un

chiot et le nombre de chiot dans sa portée (fig. 56).

0 5 1 0 1 5

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

c o r r e l a H c y /n b c h io ts p o r té e

N o m b re c h io ts /p o rté e

aH

cy

r2= 0 .0 4 0

Figure 56: Régression linéaire entre aHcy et le nombre de chiots dans la portée

128

6) Résultats en fonction de la présence de fente labio-palatine

Cinq prélèvements ont pu être réalisés chez des chiots atteints de fentes palatines. La

concentration en aHcy tend à être plus élevée en cas de malformation (fig. 57).

s a n s lé s io n s a v e c lé s io n s

0

2

4

6

8

a H c y c h io ts

µm

ol/

L

9 5 5

Figure 57: Représentation graphique par un diagramme en bâtons de la valeur moyenne aHcy

en fonction de la présence ou non de fentes labio-palatines

.

129

IV. Discussion

A. Sélection des animaux et prélèvements des échantillons

Les prélèvements étant réalisés lors de césariennes programmées, les chiennes

Bouledogue français sont par conséquent les plus nombreuses dans cette étude car plus

sujettes aux dystocies. Les moyennes obtenues sur l’ensemble des chiennes ne représentent

donc pas une moyenne générale pour tout type de chienne en fin de gestation. Cependant, cela

permettait d’obtenir un nombre plus important de fentes labio-palatines, ces races étant

prédisposées à cette malformation congénitale, et de limiter les risques liés à l’amniocentèse.

Concernant le prélèvement du sang de la mère, 7 prélèvements n’ont pas pu être

réalisés, pour, dans certains cas, ne pas stresser d’avantage les chiennes. Pour les

prélèvements de liquide amniotique, 31 dosages (sur un total de 171 chiots) n’ont pas pu être

effectués pour deux raisons principales : poches rompues lors de l’extraction du chiot de la

corne utérine ou pas assez de liquide amniotique prélevé pour le test enzymatique. De plus,

les prélèvements de liquide amniotique réalisés qui apparaissaient macroscopiquement

contaminés par le sang de la mère, du méconium ou autre, ont été écartés de l’analyse (fig.

33). En effet, même si la concentration libre en homocystéine dans les érythrocytes est

considérée comme n’excédant pas 10% de la quantité sanguine totale, la libération

enzymatique accompagnant l’hémolyse contribuerait éventuellement à la production continue

d’homocystéine dans l’échantillon hémolysé, majorant ainsi la concentration de 180% (115).

Enfin, pour certaines césariennes, le nombre d’opérateurs étant limité ou la

précipitation pour la réanimation des chiots étant prioritaire, le recueil de certaines données a

pu être manquant, comme par exemple le sexe du chiot.

B. Mise au point du test enzymatique à trois réactifs

L’utilisation des cuvettes spécifiques à l’analyseur Konelab20 nous a obligés à réduire

les quantités de réactifs et d’échantillons par rapport à ce qui est recommandé par le fabricant.

Les différentes durées d’incubation ont donc dû être adaptées afin d’obtenir un étalonnage

avec une régression linéaire satisfaisante et l’étape d’amplification enzymatique a été

optimisée pour étendre le domaine analytique vers les basses concentrations. Le coefficient de

détermination ainsi obtenu (r2 = 0.981) illustre une bonne corrélation entre les valeurs cibles

et les valeurs calculées.

130

Avec une limite de quantification à 1.35 µmol/L, avec une incertitude associée de 9%

environ, et une limite de détection de l’ordre de 0.4 µmol/L, l’exploitation de certains dosages

a été rendu impossible en ce qui concerne les prélèvements de liquide amniotique. Ainsi, sur

140 prélèvements de liquide amniotique recueillis, 30 dosages de aHcy ont été écartés car

inférieurs aux limites de détection. Certaines valeurs inférieures à la LOQ ont toutefois été

conservées permettant d’étudier 110 dosages de liquide amniotique.

C. Résultats de l’étude

1) L’homocystéinémie des chiennes en fin de gestation

La valeur moyenne, toutes races confondues, de tHcy obtenue chez la chienne est

globalement plus faible que la référence moyenne chez la femme : respectivement 4.5 ± 0.34

et 8.4 ± 2.5 µmol/L (tab. V). Cependant, cette concentration reste proche de celles rapportées

dans la littérature en médecine humaine en fin de grossesse chez la femme : 5.5 µmol/L

(125)(2). Les résultats obtenus sont également en accord avec l’unique étude dosant tHcy

chez la chienne pendant la gestation (entre le 25ème

et le 35ème

jour de gestation) dont les

concentrations moyennes étaient de 3.9 ± 1.72 µmol/L (111). Cette même étude met en

évidence des valeurs d’homocystéinémie plus élevées lorsque la chienne est en anœstrus (7.8

± 0.6 µmol/L) (111). Etant donné que la diminution de l’homocystéinémie constatée chez la

femme pendant la grossesse ait été attribuée à la forte sollicitation du fœtus, pour ses besoins

de développement et de croissance, tant en cystéine qu’en acides nucléiques, l’homocystéine

étant au carrefour métabolique de ces deux voies (2), il convient de penser que cette

diminution est également justifiée pour la chienne. Par ailleurs, cette diminution a également

été observée chez les femmes supplémentées en acide folique pendant leur grossesse (125).

Un élément surprenant qu’apporte cette étude est la variation importante de

l’homocystéinémie chez les chiennes gestantes en fonction de leur race. En effet, si notre

étude ne prétend pas mettre en avant un nombre de races différentes important, une

augmentation de l’homocystéinémie de l’ordre de 42% a été observée chez les chiennes

gestantes de grandes races (Saint Bernard, terre Neuve et Bouvier bernois) et les autres races

(Beagle, Berger Allemand, Colley et Boxer) en comparaison aux races Bouledogue français et

Bull terrier miniature.

Pour tenter d’expliquer cette différence, plusieurs hypothèses peuvent être avancées comme

l’existence d’une différence génétique raciale impliquant le métabolisme de l’homocystéine

ou de l’acide folique, d’une différence liée à une sollicitation métabolique en acide folique

131

accrue du fait d’un nombre de chiots plus important, ou encore d’une supplémentation

alimentaire notamment en vitamines B9 et/ou B12 différente entre les deux gabarits de races.

L’idée qu’une variation interraciale dans le métabolisme de l’homocystéine puisse exister

chez le chien trouve écho dans l’observation de variations de tHcy au sein de différents

groupes ethniques en humaine. Cependant, les variations de concentrations plasmatiques en

homocystéine, rattachées à des différences ethniques, semblent d’avantage être expliquées par

des carences vitaminiques liées à des comportements alimentaires différents que par des

différences métaboliques (66)(61)(98).

Par ailleurs, l’hyperhomocystéinurie congénitale, ainsi que des homocystéinémies plus ou

moins sévères associées à des variants génétiques des deux principales enzymes impliquées

dans les deux voies métaboliques de l’homocystéine, ont été associées à des différences de

leur prévalence en fonction des groupes ethniques chez l’homme. C’est le cas, par exemple,

du variant thermolabile le plus fréquent de la MTHFR (mutant C677T) dont la fréquence

dépend du groupe ethnique (71). A notre connaissance, et sans que cette hypothèse puisse être

écartée, aucune anomalie équivalente n’a été décrite chez le chien. Son existence et son

importance reste donc à caractériser.

Les concentrations en acide folique et vitamines B12 étant similaires chez toutes les races

(tab. IX) et non significativement différentes (fig. 44), la dernière hypothèse, concernant

l’influence d’une supplémentation en vitamines, peut être exclue. Par ailleurs, tHcy ne semble

pas être corrélée aux concentrations sanguines en vitamine B12 et folates (fig. 48). D’après le

métabolisme de l’homocystéine documenté dans la partie 1, III, et d’après ce qui est décrit en

médecine humaine, une corrélation négative était attendue (18).

Les grandes races, mettant au monde un nombre plus important de nouveau-nés, présentent

des taux d’homocystéinémie plus élevée. Pourtant, une étude en médecine humaine révèle que

l’homocystéinémie de la mère n’est pas influencée et n’augmente pas en cas de gémellité

(94).

Comme décrit en médecine humaine, une corrélation positive est observée entre tHcy

d’une part et l’urémie et la créatinémie d’autre part (fig. 47). Il peut alors être proposé qu’une

insuffisance rénale chez le chien entraine également une hyperhomocystéinémie (10).

Toutefois, aucune des chiennes incluses dans cette étude ne présentait de signes biologiques

qui puissent justifier l’existence d’une insuffisance rénale chronique. Il faut donc considérer

que cette dépendance entre tHcy plasmatique et les concentrations en urée et créatinine puisse

être le fait du débit de filtration rénale. En effet, une différence significative dans les

concentrations plasmatiques en urée et en créatinine apparaît entre nos deux groupes de

132

chiennes : les grandes races présentant une urémie et une créatinémie physiologiquement plus

élevées (fig. 44).

En s’intéressant à l’âge de la chienne le jour du prélèvement, les résultats sont

également en accord avec ce qui est observé en médecine humaine : tHcy augmente

significativement avec l’âge (fig. 49) (61). Or, l’augmentation de l’homocystéinémie chez

l’homme âgé semble être attribuée à la perte de la fonctionnalité rénale (61). En effet,

l’homocystéine étant liée à 80% environ aux protéines plasmatiques dans les conditions

physiologiques, la fraction libre s’accumulerait en cas d’altération du débit de filtration rénale

(augmentation estimée à 0.2 µmol/L/an) (127).

Ainsi, l’élément le plus fort de notre étude pour expliquer cette différence

d’homocystéinémie chez les chiennes semble être la fonction rénale, même si des carences

nutritionnelles ou métaboliques en acide folique puissent altérer cette concentration.

Enfin, le faible nombre de fentes labio-palatines apparues au cours de l’étude était

insuffisant pour réaliser des comparaisons significatives : 6 portés ont présenté la

malformation. Cependant, nos résultats sont en accord avec la littérature et une nette

augmentation de la prévalence des fentes labio-palatines est observée chez les Bouledogue

français : 26.7% des portés de Bouledogue français sont atteintes. Par ailleurs, en moyenne,

une légère tendance à une diminution de tHcy en cas de fentes labio-palatines est notée,

paradoxalement à ce qui était attendu d’après les résultats en médecine humaine (fig. 52)

(129), mais il ne serait pas possible de conclure sans augmenter le nombre de cas

ultérieurement. Si nous nous intéressons uniquement aux résultats chez le Bouledogue

français, nous pouvons noter le cas d’une mère ayant mis bas une portée présentant trois

fentes palatines (annexe 1), son homocystéinémie est de 2.3 µmol/L, soit une faible

concentration comparée à la moyenne chez cette race (3.5 ± 0.4 µmol/L) (tab. X).

2) La concentration en Homocystéine dans le liquide amniotique

Comme évoqué précédemment et en analysant la courbe de Gausse pour la

concentration en homocystéine dans le liquide amniotique (fig. 51), la plupart des chiots

présente une faible concentration en homocystéine. Ces résultats sont en accord avec les

résultats obtenus en médecine humaine (63). La concentration moyenne reste élevée à 5.9 ±

0.73 µmol/L et supérieure à la valeur moyenne de tHcy. La valeur médiane selon

l’histogramme de distribution est à 3.65 µmol/L (donc plus faible que la moyenne

plasmatique tHcy), les valeurs les plus fréquentes entre 1.5 et 4.5 et trois valeurs sont très

hautes, supérieures à 30 µmol/L. Le résultat est en partie dû à la présence de cinq

133

concentrations en homocystéine dosées dans le liquide amniotique particulièrement élevées :

29.6, 30.2, 33.5, 38.3 et 43.5 µmol/L, mais qui n’avaient pas de motif d’exclusion. La

question se pose alors de savoir quelle serait l’explication d’une telle différence dans ces

résultats, alors que les résultats aHcy des autres chiots de ces portées sont dans les

concentrations faibles observées chez les autres chiots (annexe 2). Une hypothèse proposée

pourrait être la présence d’une contamination plasmatique au moment du prélèvement à

travers l’amnios. Cependant, ces valeurs sont plus hautes que la valeur maximale en tHcy

obtenue et aucun cas n’est décrit en médecine humaine. Par ailleurs, une contamination

érythrocytaire lors du prélèvement du liquide amniotique pourrait expliquer de telles

augmentations de aHcy. En effet, les cellules sanguines, en particulier les érythrocytes,

produisent de l’homocystéine cytoplasmique qui est relarguée en continu dans le milieu

extracellulaire (29)(117). L’hémolyse, quant à elle, n’interfère pas avec la concentration

d’homocystéine plasmatique (29)(117), ce qui pourrait également être le cas avec la

concentration dans le liquide amniotique. Bien que l’hémoglobine libre n’altère pas le dosage,

il s’agit alors peut-être d’une accélération du catabolisme de la méthionine, comme les

augmentations de 180% de la concentration plasmatique de Hcy, qui sont constatées lorsque

le sang total est maintenu à température ambiante avant la séparation de la fraction cellulaire

(115).

Dans notre étude, les concentrations observées sont significativement plus élevées

chez les Bouledogues français (8.2 ± 1.4 µmol/L) par rapport aux grandes races (3.2 ± 0.6

µmol/L) contrairement aux résultats obtenus avec tHcy. Ce résultats pourrait être expliqué par

la taille des portées significativement plus petite chez les brachycéphales qui entrainerait alors

une diffusion placentaire d’homocystéine sanguine plus importante pour chaque chiot, par

rapport à une portée présentant beaucoup de fœtus. Cependant aucune corrélation n’est mise

en évidence entre la taille de la portée et la concentration en homocystéine de chaque chiot

(fig. 56) ni entre aHcy de chaque chiot et tHcy de la mère (fig. 55) et cette différence ne peut

être expliquée.

Les résultats de cette étude mettent en évidence que, dans le liquide amniotique du

fœtus, la concentration en homocystéine apparait significativement plus importante chez la

femelle que chez le mâle ; alors que chez l’homme, les concentrations plasmatiques sont au

contraire plus élevées que chez la femme du même âge (61)(102).

Contrairement à ce qui observé pour les concentrations en homocystéine chez la mère,

il n’y a pas de corrélation entre l’âge de la mère et la concentration en homocystéine dans le

liquide amniotique du fœtus. Cela pourrait être expliqué par un taux de diffusion placentaire

de l’homocystéine identique quel que soit l’âge de la mère. Il pourrait alors être intéressant

134

pour éclairer cette hypothèse de calculer les aHcy des chiots d’une même lice, pour chacune

de ses portées, année après année, tant qu’elle peut être une femelle reproductrice. Cependant,

n’observant aucune corrélation entre tHcy et aHcy, entre aHcy et le nombre de chiots de la

portée, et les variations de aHcy étant extrêmement importantes au sein d’une même portée

(annexe 2), l’hypothèse d’une diffusion placentaire selon un gradient de concentration est peu

probable.

Enfin, concernant aHcy en fonction de la présence de fentes labio-palatines ou non,

comme pour la concentration plasmatique, le nombre d’échantillons de chiots présentant la

malformation n’est pas suffisant pour avoir un résultat significatif. Seuls 5 prélèvements ont

pu être réalisés sur les 8 nouveau-nés présentant la malformation congénitale. En étudiant la

même lice que précédemment ayant mis bas à trois chiots porteurs de fente palatine, la

moyenne de aHcy sur sa portée est de 7.2 µmol/L, soit une concentration légèrement plus

faible que la moyenne obtenue chez le Bouledogue français (8.2 ± 1.4 µmol/L), mais plus

élevée que la moyenne pour toutes races confondues (5.9 ± 0.73 µmol/L) et plus élevée que la

médiane (3.65 µmol/L).

D. Perspectives

Les résultats de notre étude permettent d’avoir un ordre de grandeur de

l’homocystéinémie chez la chienne en fin de gestation et de la concentration en homocystéine

dans le liquide amniotique, dosées par un une méthode enzymatique à trois réactifs.

Le nombre trop faible de chiots atteints de fente palatine est malheureusement

insuffisant pour pouvoir conclure sur une corrélation positive entre le taux d’homocystéine et

la prévalence des fentes labio-palatine, et donc sur l’utilisation de ce test pour le diagnostic

anté-natal des fentes labio-palatines dans l’espèce canine. Cependant, cette corrélation ne peut

pas être exclue suite aux résultats obtenus. Une poursuite de l’étude afin d’obtenir un plus

grand nombre de cas permettant de réaliser des statistiques sur les fentes labio-palatines est

donc nécessaire. Par ailleurs, la possibilité de réaliser une étude en dosant le liquide prélevé

par amniocentèse pour vérifier l’hypothèse des contaminations et de doser l’homocystéine à

chaque stade de la gestation, lorsqu’assez de liquide amniotique est prélevable par

amniocentèse, ne peut pas non plus être écartée.

De plus, l’utilisation de ce test enzymatique pourrait être envisagée afin de mettre en

place des valeurs de référence de l’homocystéinémie chez le chien : en fonction de l’âge de

l’animal, de sa race et de son sexe. Il pourrait être aussi réalisé pour comparer la validité et le

coût de cette analyse par rapport aux autres dosages effectués en médecine humaine.

135

Enfin, la mise en place de ce test enzymatique chez l’espèce canine pourrait permettre

la réalisation d’études portant sur la recherche de l’influence de l’homocystéine sur d’autres

pathologies telle que les maladies cardio-vasculaires. Dans ce cas également, une suite de

l’étude avec un plus grand nombre d’échantillons pourrait confirmer ou infirmer cette

hypothèse pour l’espèce canine.

136

137

CONCLUSION

Les fentes labio-palatines congénitales sont le plus souvent chez le chien des fentes du palais

secondaire, plus graves que la fente labiale seule et plus fréquentes chez les races Brachycéphales.

L’origine de cette affection est multifactorielle. Chez l’homme, comme chez le chien, il n’est pas

possible de les prévenir totalement. Une complémentation en acide folique, vitamine intervenant dans

la dégradation de l’homocystéine, diminue la prévalence des anomalies de formation du tube neural et

des fentes labio-palatines chez l’homme et le chien. Chez la femme, une hyperhomocystéinémie

pendant la grossesse est liée à ces pathologies et la concentration en homocystéine dans le liquide

amniotique augmente lors de défaut du tube neural. L’évaluation de l’homocystéine comme facteur de

risque et/ou comme marqueur n’a pas été réalisée chez le chien.

L’objectif lors de cette thèse était donc de doser l’homocystéine totale dans une population de

chiennes présentées pour césarienne programmée, afin d’évaluer ses taux dans le sang de la mère et

dans le liquide amniotique des chiots. L’étude a permis de mettre en place un test enzymatique à trois

réactifs dosant l’homocystéine chez l’espèce canine. La concentration moyenne en homocystéine

mesurée dans le sang de 35 lices avant la mise-bas est de 4.5±0.34 µmol/L, avec un taux

significativement plus élevé chez les grandes races, avec l’âge et avec l’urémie et la créatinémie. Les

concentrations dans les liquides amniotiques présentent une plus grande variabilité mais une

concentration significativement plus haute chez les femelles que chez les mâles.

Le faible nombre de fentes palatines observées lors de l’étude ne permet pas de corréler leur

apparition et le taux d’homocystéine. Augmenter l’effectif serait nécessaire pour conclure sur l’utilité

potentielle du test pour la détection des fentes labio-palatines en anténatal. La mise en place de ce test

enzymatique, rapide et spécifique, pourrait aussi être utilisée pour l’étude de l’influence de

l’homocystéinémie sur les maladies cardio-vasculaires dans l’espèce canine.

CONCLUSION

138

139

BIBLIOGRAPHIE

1. ACS N., BANHIDY F., PUHO E., CZEIZEL A. E. (2005). Maternal influenza during pregnancy and

risk of congenital abnormalities in offspring. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular

Teratology. 73(12):989–96

2. ANDERSON A., HULTBERG B., BRATTSTROM L., ISAKSSON A. (1992). Decreased serum

homocysteine in pregnancy. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 30(6):377–79

3. ATTWOOD T., CAMPBELL P., PARISH H., SMITH A., VELLA F., et al. (2006). Oxford Dictionary

of Biochemistry and Molecular Biology. Oxford; New York: OUP Oxford. 736 pp. 2nd ed.

4. BARONE R. (2001). Anatomie comparée des mammifères domestiques. Tome 4, Splanchnologie II.

Paris: Vigot. 896 pp. 3rd ed.

5. BARONE R. (2010). Anatomie comparée des mammifères domestiques : Tome 1, Ostéologie. Paris:

Vigot. 761 pp. 5 revue et corrigée ed.

6. BEAUFRERE B., BRESSON J. L., BRIEND A., FARRIAUX J., GHISOLFI J., et al. (1995). Acide

folique et grossesse, société française de pédiatrie - comité de nutrition. Arch Fr Pediatr. 2(2):173–81

7. BEISER A., SESHADRI S., SELHUB J., JACQUES P. F., ROSENBERG I. H., et al. (2002). Plasma

homocysteine as a risk factor for dementia and alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine.

346(7):476–83

8. BENDER P.L. (2000). Genetics of cleft lip and palate. Journal of Pediatric Nursing. 15(4):242–49

9. BIGGIO J. R., WENSTROM K. D., DUBARD M. B., CLIVER S. P. (1999). Hydramnios prediction of

adverse perinatal outcome. Obstet Gynecol. 94(5, Part 1):773–77

10. BOSTOM A. G., CULLETON B. F. (1999). Hyperhomocysteinemia in chronic renal disease. JASN.

10(4):891–900

11. BRIAND Q. (2014). Les fentes oro-faciales congénitales chez le chien: étude rétrospective des facteurs

de risques nutritionnels et génétiques chez les Bouledogues Français et les boxers présentés au CERREC

de 2007 à 2013. Thèse de Doctorat vétérinaire thesis. Université Claude-Bernard-Lyon 1. 116 pp.

12. BUFF S. (2004). Conduite à tenir et prévention de la mortinatalité chez la chienne. Le Nouveau Praticien

Vétérinaire Canine Féline. 4(17):13–15

13. BUFF S. (2004). Planification et induction de la mise bas chez la chienne. Le Nouveau Praticien

Vétérinaire Canine Féline. 3(15):31–34

140

14. BUFF S. (2004). Quand réaliser une césarienne lors de dystocie chez la chienne et la chatte. Le Nouveau

Praticien Vétérinaire Canine Féline. 4(17):39–41

15. CALNAN J. (1961). The comparative anatomy of cleft lip and palate: part 1 classification of cleft lip and

palate in dogs. Br J Plast Surg. 14:180–84

16. CAUSSE E. (2008). Intérêt du dosage de l’homocystéine en médecine générale. 20ème Forum Médical

de Rangueil

17. Centers for Disease Control (CDC). (1991). Use of folic acid for prevention of spina bifida and other

neural tube defects--1983-1991. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 40(30):513–16

18. CHANGO A., PERRIN M.O., TRONEL H., NICOLAS J.P. (1997). Aspects nutritionnel, biochimique et

clinique de l’hyperhomocystéinémie. Nutrition Clinique et Métabolisme. 11(3):201–11

19. CUERVO R., COVARRUBIAS L. (2004). Death is the major fate of medial edge epithelial cells and the

cause of basal lamina degradation during palatogenesis. Development. 131(1):15–24

20. CZEIZEL A. E. (2005). Folic acid-containing multivitamins and primary prevention of birth defects. In

Preventive Nutrition, ed FACN A. B., DECKELBAUM R. J., pp. 603–27. Humana Press

21. CZEIZEL A. E., DUDAS I. (1992). Prevention of the first occurrence of neural-tube defects by

periconceptional vitamin supplementation. New England Journal of Medicine. 327(26):1832–35

22. DASHE J. S., McINTIRE D. D., RAMUS R. M., SANTOS-RAMOS R., TWICKLER D. (2002).

Hydramnios: anomaly prevalence and sonographic detection. Obstetrics and gynecology. 100(1):134–39

23. DAVIES M. (2011). Excess vitamin a intake during pregnancy as a possible cause of congenital cleft

palate in pupppies and kittens. Veterinary Record. 169(4):107

24. DESENFANT M., PRIEL M., RIVIER C. (2003). De la validation des méthodes d’analyse à l’évaluation

de l’incertitude des résultats de mesure. Actes du Congrès Internationale de Métrologie, Toulon, France.

25. Diazyme Laboratories. (Page consultée le 9 juin 2014) Diazyme Laboratories [en ligne].

http://www.diazyme.com

26. DOCO-FENZY M., FRANCOIS-FIQUET C., GAILLARD D., LANDAIS E., NGUYEN P., POLI-

MEROL M. L. (2014). Role of angiogenesis-related genes in cleft lip/palate: review of the literature. Int

J pediatr Otorhinolaryngol. 78(10):1579–85

27. DORAY B., BADILA-TIMBOLSCHI D., SCHAEFER E., FATTORI D., MONGA B., et al. (2012).

Épidémiologie des fentes labio-palatines : expérience du registre de malformations congénitales d’alsace

entre 1995 et 2006. Arch Fr Pediatr. 19(10):1021–29

28. DROST M. (2007). Complications during gestation in the cow. Theriogenology. 68(3):487–91

141

29. DUCROS V., CANDITO M., CAUSSE E., COUDERC R., DEMUTH R., et al. (2001). Dosage de

l’homocystéine plasmatique : étude des facteurs de variation préanalytiques sur la concentration en

homocystéine plasmatique totale. Annales de Biologie Clinique. 59(1):33–39

30. DUMON C. (2005). Pathologie néonatale du chiot. EMC - Vétérinaire. 2(1):30–53

31. DUMON C., FONTBONNE A. (1992). Les indispensables de l’animal de compagnie. Reproduction du

chien et du chat. Paris: PMCAC Editions. 289 pp.

32. DYCE K. M., SACK W. O., WENSING C. J. G. (1991). Anatomía veterinaria. Panamericana. 845 pp.

33. DYCE K. M., SACK W. O., WENSING C. J. G. (2010). Textbook of Veterinary Anatomy. St. Louis:

Saunders. 864 pp. 4th ed.

34. ELLIOTT J. P., SAWYER A. T., RADIN T. G., STRONG R. E. (1994). Large-volume therapeutic

amniocentesis in the treatment of hydramnios. Obstet Gynecol. 84(6):1025–27

35. ELWOOD J. M., COLQUHOUM T. A. (1997). Observations on the prevention of cleft palate in dogs by

folic acid and potential relevance to humans. N Z Vet J. 45(6):254–56

36. EVANS H. E., DE LAHUNTA A. (2012). Miller’s Anatomy of the Dog. Saunders. 872 pp. 4th ed.

37. FAU D. (2012). Chirurgie du palais. EMC vétérinaire-Odontologie-Stomatologie. 4:14

38. FAYOL V. (2001). Données récentes sur l’homocystéine. Immuno-analyse & Biologie Spécialisée.

16(2):78–86

39. FERGUSON M. W. J. (1988). Palate development. Development. 103(Supplement):41–60

40. FONTBONNE A., LEVY X., FONTAINE E., GILSON C. (2007). Guide pratique de reproduction

clinique canine et féline. Paris. 272 pp. Med'Com ed.

41. FRANTZEN F., FAAREN A. L., ALFHEIM I., NORDHEI A. K. (1998). Enzyme conversion

immunoassay for determining total homocysteine in plasma or serum. Clinical Chemistry. 44(2):311–16

42. GALE C. R., ASHURST H., PHILLIPS N. J., MOAT S. J., BONHAM J. R., MARTYN C. N. (2001).

Renal function, plasma homocysteine and carotid atherosclerosis in elderly people. Atherosclerosis.

154(1):141–46

43. GERRITSEN T., VAUGHN J.G., WAISMAN H.A. (1962). The identification of homocystine in the

urine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 9(6):493–96

44. GOLAN A., WOLMAN I., LANGER R., DAVID M. P. (1992). Fetal malformations associated with

chronic polyhydramnios in singleton pregnancies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 47(3):185–88

45. GUILLOTEAU A., SERVET E., BIOURGE V., ECOCHARD C. (2006). Folic acid and cleft palate in

brachycephalic dogs. Waltham focus. 16(2):30–33

142

46. GUYOT A., SOUPRE V., VAZQUEZ M-P., PICARD A., ROSENBLATT J., et al. (2013). Diagnostic

anténatal des fentes labiales avec ou sans fente palatine : étude rétrospective et revue de la littérature. J

Gynecol Obstet Biol Reprod. 42(2):151–58

47. HAMZA A., HERR D., SOLOMAYER E. F., MEYBERG-SOLOMAYER G. (2013). Polyhydramnios:

causes, diagnosis and therapy. Geburtshilfe und Frauenheilkunde. 73(12):1241–46

48. HAND M. S., THATCHER C. D., REMILLARD R. L., ROUDEBUSH P., NOVOTNY B. J. (2010).

Small Animal Clinical Nutrition. Topeka, Kan.: Mark Morris Institute. 1314 pp. 5th ed.

49. HARVEY C. E., LAPEIRE C., BOURDEAU P. (1988). Défauts palatins chez le chien et le chat. Le

point Vétérinaire. 20(115):5–14

50. HASHIMOTO B. E., KRAMER D. .J., BRENNAN L. (1993). Amniotic fluid volume: fluid dynamics

and measurement technique. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 14(1):40–55

51. HENNET P. (1997). Anomalies du développement du palais et des lèvres. Le point Vétérinaire.

28(185):79–83

52. HOFFMANN-LA ROCHE. (1972). Nutrition Animale- L’Acide Folique dans l’Alimentation Animale.

Neuilly sur seine: F. HOFFMAN-LA ROCHE et Cie. 14 pp.

53. HORTON H.R., MORAN L.A., OCHS R., RAWN J., SCRIMGEOUR K. (1994). Principes de

biochimie. Bruxelles: De Boeck Services. 720 pp. 1st ed.

54. HOSGOOD G., HOSKINS J. D. (1998). Small animal paediatric medicine and surgery. Butterworth-

Heinemann. 324 pp.

55. HOUZE P., DUSSAUCY M;, COUSTIES Y., BOUSQUET B. (1999). Evaluation de la technique bio-

rad pour le dosage de l’homocystéine plasmatique totale par chromatographie liquide haute performance.

Ann Biol Clin. 57(5):611–16

56. HYTTEL P., SINOWATZ F., VEJLSTED M., BETTERIDGE K. (2009). Essentials of domestic animal

embryology. Edinburgh; New York: Saunders Ltd. 472 pp. 1st ed.

57. IACOBAZZI V., INFANTINO V., CASTEGNA A., ANDRIA G. (2014). Hyperhomocysteinemia:

related genetic diseases and congenital defects, abnormal dna methylation and newborn screening issues.

Mol Genet Metab. 113(1–2):27–33

58. IDRIS N., WONG S. F., THOMAE M., GARDENER G., McINTYRE D. H. (2010). Influence of

polyhydramnios on perinatal outcome in pregestational diabetic pregnancies. Ultrasound Obstet

Gynecol. 36(3):338–43

143

59. ISHIZUKA Y., WATANABE C., WADA A., SAITO Y., NAGAO T., MIZUTANI M. (1993). Palatal

slit and cleft palate in rats treated with glucocorticoid. Cong. Anom. 33:147–55

60. ITIKALA P. R., WATKINS M. L., MULINARE J., MOORE C A., LIU Y. (2001). Maternal

multivitamin use and orofacial clefts in offspring†. Teratology. 63(2):79–86

61. JACQQUES P. F., ROSENBERG I. H., ROERS G., SELHUB J., BOWMAN B. A., et al. (1999). Serum

total homocysteine concentrations in adolescent and adult americans: results from the third national

health and nutrition examination survey. Am J Clin Nutr. 69(3):482–89

62. JURKIEWICZ M. J., BRYANT D. L. (1968). Cleft lip and palate in dogs: a progress report. Cleft Palate

J. 5:30–36

63. KANG S.S., WONG P. W. K., ZHOU J, COOK Y. (1986). Total homocyst(e)ine in plasma and amniotic

fluid of pregnant women. Metabolism. 35(10):889–91

64. KERNAHAN D. A., STARK R. B. (1958). A new classification for cleft lip and cleft palate. Plast

Reconstr Surg. 22(5):435–41

65. KONIG H. E., LIEBICH H. G. (2005). Veterinary Anatomy of Domestic Mammals: Textbook and

Colour Atlas. Stuttgart; New York: Manson Publishing Ltd. 681 pp.

66. KRAJCOVICOVA-KUDLACKOVA M., BLAZICEK P., GINTER E., VALACHICOVA M. (2004).

Homocysteine and its nutritional determinants in two ethnic groups of slovakia. Cent. Eur. J. Public

Health. 12(4):217–19

67. LANGMAN J. (1965). Embryologie médicale. Développement normal et pathologique. Paris: Masson et

Cie. 339 pp.

68. LANGMAN J., SADLER T.W. (2007). Embryologie médicale. Paris: Pradel Editions. 532 pp. 8th ed.

69. LEE S. M., JUN J. K., LEE E. J., LEE J. H., PARK C. W., et al. (2010). Measurement of fetal urine

production to differentiate causes of increased amniotic fluid volume. Ultrasound Obstet Gynecol.

36(2):191–95

70. LIDRAL AC, ROMITTI PA, BASART AM, DOETSCHMAN T, LEYSENS NJ, et al. (1998).

Association of msx1 and tgfb3 with nonsyndromic clefting in humans. The American Journal of Human

Genetics. 63(2):557–68

71. LIEW S-C., GUPTA E. D. (2014). Methylenetetrahydrofolate reductase (mthfr) c677t polymorphism:

epidemiology, metabolism and the associated diseases. European Journal of Medical Genetics

72. LITTLE J., CARDY A., MUNGER R.G. (2004). Tobacco smoking and oral clefts: a meta-analysis.

Bulletin of the World Health Organization. 82(3):213–18

144

73. LLOYD J. R., CLATWORTHY H. W. (1958). Hydramnios as an aid to the early diagnosis of congenital

obstruction of the alimentary tract: a study of the maternal and fetal factors. Pediatrics. 21(6):903–9

74. LOPATE C., ed. (2012). Management of pregnant and neonatal dogs, cats, and exotic pets. Wiley-

Blackwell. 336 pp. 1st ed.

75. LORENTE C.A., MILLER S.A. (1978). Vitamin a induction of cleft palate. Cleft Palate J. 15(4):378–85

76. MAGNUSSON B., ORNEMARK U. (2014). Eurachem Guide: The fitness for purpose of analytical

methods-A laboratory guide to method validation and related topics. 62 pp. 2nd ed.

77. MARTINELLI M, SCAPOLI L, PEZZETTI F, CARINCI F, CARINCI P, et al. (2001). C677t variant

form at the mthfr gene and cl/p: a risk factor for mothers? American Journal of Medical Genetics.

98(4):357–60

78. MAZOR M., GHEZZI F., MAYMON E., SHOHAM-VARDI I., VARDI H., et al. (1996).

Polyhydramnios is an independent risk factor for perinatal mortality and intrapartum morbidity in

preterm delivery. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 70(1):41–47

79. McCULLY K. S. (1969). Vascular pathology of homocysteinemia: implications for the pathogenesis of

arteriosclerosis. Am J Pathol. 56(1):111–28

80. McGEADY T. A., QUINN P. J., FITZPATRICK E. S., RYAN M. T., CAHALAN S. (2006). Veterinary

Embryology. Oxford; Ames, Iowa: Wiley-Blackwell. 392 pp.

81. MEDINA M.A., URDIALES J.L., AMORES-SANCHEZ M.I. (2001). Roles of homocysteine in cell

metabolism. European Journal of Biochemistry. 268(14):3871–82

82. METZLER D.E. (1977). Biochemistry: the chemical reactions of living cells. Academic Press. 1129 pp.

83. MIGLINO M. A., AMBROSIO C. E., MARTINS D. D. S., WENCESLAU C. V., PFARRER C.,

LEISER R. (2006). The carnivore pregnancy: the development of the embryo and fetal membranes.

Theriogenology. 66(6–7):1699–1702

84. MORE J. (1969). La placentation chez les mammifères. Anatomie et physiologie. Toulouse, France.:

Institut Nationale de la Recherche Agronomique. 204 pp.

85. MOSSEY P.A., LITTLE J., MUNGER R.G., DIXON M.J., SHAW W.C. (2009). Cleft lip and palate.

The Lancet. 374(9703):1773–85

86. MURRAY R.K., GRANNER D.K., MAYES P.A., RODWELL V.W. (2003). Biochimie de Harper.

Sainte-Foy, Québec: 2305, rue de l’Université. 933 pp. 25th ed.

87. NICOLAS J. P., CHANGO A. (1997). Dérégulation du métabolisme de l’homocystéine et conséquences

pour le système vasculaire. Bulletin de l’Académie nationale de médecine. 181(2):313–31

145

88. NYGARD O., VOLLSET S.E., REFSUM H., BRATTSTROM L., UELAND P.M. (1999). Total

homocysteine and cardiovascular disease. J. Intern. Med. 246(5):425–54

89. PETERSON M. E., KUTZLER M. (2010). Small Animal Pediatrics: The First 12 Months of Life. St.

Louis: Saunders. 544 pp. 1st ed.

90. PHELAN J. P., AHN M. O., SMITH C. V., RUTHERFORD S. E., ANDERSON E. (1987). Amniotic

fluid index measurements during pregnancy. J Reprod Med. 32(8):601–4

91. PICARD M., PORTER R. H., SIGNORET J. P. (1994). Comportement et adaptation des animaux

domestiques aux contraintes de l’élevage: bases techniques du bien-être animal. Paris: 4. 228 pp. Inra

ed.

92. POINDRON P., LEVY F., KELLER M. (2007). Maternal responsiveness and maternal selectivity in

domestic sheep and goats: the two facets of maternal attachment. Dev Psychobiol. 49(1):54–70

93. POPESKO P. (1980). Atlas d’anatomie topographique des animaux domestiques. Volume 1. Tête et cou,

Vol. 1. Paris: maloine. 211 pp.

94. POWERS R. W., DUNBAR M. S., LAIVUORI H. M., HARGER G. F., LYKINS D. L., ROBERTS J.

M. (2005). Maternal plasma homocysteine concentrations are not increased in twin pregnancies.

Hypertens Pregnancy. 24(1):49–58

95. PRESCOTT N. J., WINTER R. M., MACOLM S. (2002). Maternal mthfr genotype contributes to the

risk of non-syndromic cleft lip and palate. J Med Genet. 39(5):368–69

96. RAJION ZA, ALWI Z. (2007). Genetics of cleft lip and palate : a review. The Malaysian Journal of

Medical Sciences : MJMS. 14(1):4–9

97. REFSUM H. (2001). Folate, vitamin b12 and homocysteine in relation to birth defects and pregnancy

outcome. Br J Nutr. 85(Supplement S2):S109–13

98. REFSUM H. (2004). Facts and recommendations about total homocysteine determinations: an expert

opinion. Clinical Chemistry. 50(1):3–32

99. ROBINSON K. (2000). Homocysteine and Vascular Disease. Springer Science & Business Media. 476

pp.

100. ROSSET E. (2014). La césarienne, de sa planification à sa réalisation. Congrès du G.E.R.E.S, AFVAC

Sud-Est; Reproduction et Néonatalité: pas qu’une question d’éleveur. GRASSE

101. SCHAFFER A., VERDOIA M., CASSETTI E., MARINO P., SURYANPRANATA H., DE LUCAS G.

(2014). Relationship between homocysteine and coronary artery disease. results from a large prospective

cohort study. Thrombosis Research. 134(2):288–93

146

102. SELHUB J., JACQUES P. F., ROSENBERG I. H., ROGERS G., BOWMAN B. A., et al. (1999). Serum

total homocysteine concentrations in the third national health and nutrition examination survey (1991-

1994): population reference ranges and contribution of vitamin status to high serum concentrations. Ann.

Intern. Med. 131(5):331–39

103. SELHUB J., JACQUES P. F., WILSON P. W., RUSH D., ROSENBERG I. H. (1993). Vitamin status

and intake as primary determinants of homocysteinemia in an elderly population. JAMA. 270(22):2693–

98

104. SENDERS C. W., EISELE P., FREEMAN L. E., SPONENBERG D. P. (1985). Observations about the

normal and abnormal embryogenesis of the canine lip and palate. Journal of craniofacial genetics and

developmental biology. 2:241–48

105. SENGER P. L. (2012). Pathways to Pregnancy and Parturition. Redmon: Current Conceptions. 381 pp.

3rd ed.

106. SHAW G. M., WASSERMAN C. R., O’MALLEY C. D., TOLAROVA M. M., LAMMER E. J. (1995).

Risks of orofacial clefts in children born to women using multivitamins containing folic acid

periconceptionally. The Lancet. 346(8972):393–96

107. STEEGERS-THEUNISSEN R. P.M., BOERS G. H., BLOM H. J., NIJUIS J. G., THOMAS C. M.G., et

al. (1995). Neural tube defects and elevated homocysteine levels in amniotic fluid. Am J Obstet Gynecol.

172(5):1436–41

108. STRYER L. (1997). LA BIOCHIMIE. 4ème édition. Paris: Médecine Sciences Publications. 1065 pp. 4th

ed.

109. SWENSON M.J., WIERSIG D.O. (1967). Teratogenicity of vitamin a in the canine. Federation Proc., p.

486

110. TALLOVA J., TOMANDL J., BICIKOVA M., HILL M. (1999). Changes of plasma total homocysteine

levels during the menstrual cycle. Eur J Clin Invest. 29(12):1041–44

111. TRISOLINI C., MINOIA G., MANCA R., RIZZO A., ROBBE D., et al. (2008). Plasma homocysteine

levels in cycling, pregnant, and spayed bitches. Animal Reproduction Science. 108(1):29–36

112. TUCHMANN-DUPLESSIS H. (1971). Malformations congénitales des mammifères. Sous la direction

de H. [Herbert] Tuchmann-Duplessis. Paris: Masson et Cie. 25 pp.

113. TUCHMANN-DUPLESSIS H., DAVID G., HAEGEL P. (1982). Embryologie. Travaux pratiques.

Enseignement dirigé. Volume 1. Embryogenèse, étapes initiales du développement. Annexes. Placenta,

Vol. 1. Paris: Masson et Cie. 113 pp. 3rd ed.

147

114. TUCHMANN-DUPLESSIS H., HAEGEL P. (1979). Embryologie. Travaux pratiques. Enseignement

dirigé. Volume 2. Organogenèse, Vol. 2. Paris: Masson. 157 pp. 2nd ed.

115. UBBINK J. B., VERMAAK W. J., VAN DER MERWE A., BECKER P. J. (1992). The effect of blood

sample aging and food consumption on plasma total homocysteine levels. Clin Chim Acta. 207(1–

2):119–28

116. UELAND P.M., REFSUM H., BERESFORD S.A., VOLLSET S.E. (2000). The controversy over

homocysteine and cardiovascular risk. Am. J. Clin. Nutr. 72(2):324–32

117. UELAND P. M., REFSUM H., STABLER S. P., MALINOW M. R., ANDERSSON A., ALLEN R. H.

(1993). Total homocysteine in plasma or serum: methods and clinical applications. Clinical Chemistry.

39(9):1764–79

118. VAN DER PUT N.M., VAN DER MOLEN E.F., KLUIJTMANS L.A., HEIL S.G., TRIJBELS J.M., et

al. (1997). Sequence analysis of the coding region of human methionine synthase: relevance to

hyperhomocysteinaemia in neural-tube defects and vascular disease. QJM. 90(8):511–17

119. V. DUCROS, M. CANDITO, E. CAUSSE, R. COUDERC, K. DEMUTH, et al. (2002). Comparaison du

dosage de l’homocystéine plasmatique totale dans neuf laboratoires par six techniques différentes.

Annales de Biologie Clinique. 60(4):421–28

120. VEAU V., LE HYARIC M. (1936). Le bec-de-lièvre chez les Animaux. Recueil de médecine vétérinaire,

Vol. Tome CXII. Paris: Vigot frères. 1228 pp.

121. VEERANNA V., ZALAWADIYA S.K., NIRAJ A., PRADHAN J., FERENCE B., et al. (2011).

Homocysteine and reclassification of cardiovascular disease risk. J Am Coll Cardiol. 58(10):1025–33

122. VIDAILHET M., BOCQUET A., BRESSON J. L., BRIEND A., CHOURAQUI J-P., et al. (2008).

Prévention par l’acide folique des défauts de fermeture du tube neural : la question n’est toujours pas

réglée. Archives de Pédiatrie. 15(7):1223–31

123. VINK J. Y., POGGI S. H., GHIDINI A., SPONG C. Y. (2006). Amniotic fluid index and birth weight: is

there a relationship in diabetics with poor glycemic control? Am J Obstet Gynecol. 195(3):848–50

124. VUILLAUME R. (1977). Biochimie des vitamines. Paris: Maisons-Alfort. 136 pp.

125. WALKER M. C., SMITH G. N., PERKINS S. L., KEELY E. J., GARNER P. R. (1999). Changes in

homocysteine levels during normal pregnancy. American Journal of Obstetrics & Gynecology.

180(3):660–64

148

126. WANAT S., BRAZIER M., BOITTE F., LEMAY C. (2005). Étude des concentrations sériques en

vitamines b9 et b12 dans une population de femmes ayant porté un fœtus atteint de malformation du tube

neural. Immuno-analyse & Biologie Spécialisée. 20(1):28–31

127. WIDIANA I. G., SUWITRA K. (2004). Relationship between creatinine clearance and plasma

homocysteine levels in predialytic chronic renal failure patients. Acta Med Indones. 36(1):15–18

128. WONG F. K., HAGG U. (2004). An update on the aetiology of orofacial clefts. Hong Kong Med J.

10(5):331–36

129. WONG W. Y, ESKES T. K.A.B., KUIJPERS-JAGTMAN A-M., SPAUWEN P. H.M., STEEGERS E.

A.P., et al. (1999). Nonsyndromic orofacial clefts: association with maternal hyperhomocysteinemia.

Teratology. 60(5):253–57

130. ZACHER A. M., MARRETTA S. M. (2013). Oral and maxillofacial surgery in dogs and cats. Veterinary

Clinics of North America: Small Animal Practice. 43(3):609–49

149

ANNEXES

1) Annexe 1: Tableau Excel des résultats maternels

- Nb = Nombre

- Colonne N = 0 si absence de fente palatine, 1 en présence

- Cases grisées = pas de prélèvement réalisé

Urée

[2-7]

Créat

[60-135]

Prot

[50-62]

Albm

[27-38]

B12

[200-600]

Folates

[4-13]

mmol/L µmol/L g/L g/l pg/ml ng/ml (µmol/L)

2,5 BF 16/04/2014 5 4 0 8,8 84 66 29 381 8,67 3,6

1,8 BF 30/06/2013 3 1 6,5 102 66 28 333 7,24 2,5

1,2 BF 04/11/2013 4 4 0

2,0 BF 15/07/2013 5 5 7,4 123 63 27 173 3,75 5,5

2,8 BF 11/12/2013 6 5 0

2,1 BF 10/12/2013 7 5 0

BF 12/09/2013 8 6 1 6,1 68 58 29 215 5,67 3,4

2,7 BF 20/09/2013 2 1 1 5,3 57 66 30 513 15,3 2,7

2,1 BF 19/05/2014 7 7 3,4 69 58 28 280 8,44 3,0

1,7 BF 03/02/2013 6 3 28 5,9 67 58 766 14,4 3,2

3,2 BF 13/02/2013 4 1

BF 27/03/2013 5 1 1 5 56 63 27 207 11,3 3,4

1,0 BF 27/09/2013 5 3

4,1 BF 27/06/2014 7 5 5,5 60 56 27 212 >24 5,5

3,4 BF 06/06/2014 4 4 3 3,2 57 58 25 197 12,1 2,3

4,9 Bull Ter min 07/10/2013 5 3 0,9 45 69 28 <150 10,9 2,05

2,2 Bull Ter min 09/10/2013 3 3 4,7 52 77 31 384 13,4 3,4

Bull Ter min 26/10/2013 4 3 6 54 74 31 172 15,2 3,7

Bull Ter min 26/10/2013 6 6 4,7 56 62 29 273 15,9 1,8

4,3 Bull Ter min 30/06/2014 4 0 5,6 52 64 24 227 >24 5,8

Bull Ter min 17/06/2014 1 0 7,8 73 67 28 227 13,8 5,9

Bull Ter min 16/06/2014 2 0 2,1 49 81 31 160 12,8 2,9

3,4 St BERNARD 12/09/2013 4 4 0 7,9 89 74 30 384 7,3 5,8

4,3 St BERNARD 04/04/2014 11 6 0 10,1 130 67 28 167 21,2 6,5

2,8 St BERNARD 06/02/2013 12 10 0 4,9 80 65 29 412 3,67 5,1

5,4 St BERNARD 14/03/2013 8 8 0 5,8 101 73 27 197 4,18 7,4

4 Bouv Bernois 27/05/2013 9 5 0 5,9 79 68 30 <150 5,13 2,9

4,2 Bouv Bernois 25/06/2014 6 5 0 7,8 82 76 32 294 11,8 6,7

Terre neuve 21/01/2014 4 0 11,7 82 67 26 276 14,1 7,3

Terre neuve 10 10 0

3,8 Boxer 28/03/2014 3 3 1 9,3 79 62 28 168 10,2 3,9

1,7 Boxer 14/11/2013 7 4 0

3,3 Colley 11/02/2014 2 2 0 6,3 80 63 29 10 6,4

8,6 Berger all 19/12/2013 3 1 0 7,6 84 74 29 190 14 7,2

4,4 Beagle 16/01/2014 3 3 1 6,4 29 65 24 317 10 6,1

35 28

Dosage

Hcy

Statut rénal de la mère Statut nutritionnel

Age

(a)RACE Date CESA

Nb

chiots

Nb

echantN

150

2) Annexe 2: Tableau Excel des résultats concernant les nouveau-nés

2,5 BF 5 0 3,6 38,3 n°1 M 4,3Bull Ter min 5 0 5,8 17,1 n°2

2,5 5 0 2,7 n°2 M 4,3 5 0 n°3

2,5 5 0 5 n°3 M 4,3 5 0 0,9 n°4

2,5 5 0 n°4 F 4,3 5 0 0,4 n°5

2,5 5 0 n°5 F Bull Ter min 0 5,9 n°1

1,8 BF 3 2,5 14,8 n°1 Bull Ter min 0 2,9 n°1 M

1,8 3 n°2 0 2,5 n°2 F

1,8 3 3,9 n°3 3,4 StB 4 0 5,8 2,7 n°1 F

1,2 BF 4 0 8,6 n°1 M 3,4 4 0 0,4 n°2 F

1,2 4 0 10 n°2 M 3,4 4 0 3,6 n°3 F

1,2 4 0 5,8 n°3 M 3,4 4 0 n°4 M

1,2 4 0 11,9 n°4 F 4,3 StB 11 0 6,5 2,9 n°1 M

2,0 BF 5 5,5 1 4,3 11 0 0,55 n°2 F

2,0 5 43,5 2 4,3 11 0 n°3 F

2,0 5 7,6 3 4,3 11 0 n°4 M

2,0 5 6,8 4 4,3 11 0 n°5 M

2,0 5 -0,75 5 4,3 11 0 1,7 n°6 M

2,8 BF 6 0 6 n°1 F 4,3 11 0 0,65 n°7 F

2,8 6 0 7 n°2 M 4,3 11 0 n°8 M

2,8 6 0 3,7 n°3 F 4,3 11 0 n°9 M

2,8 6 0 1,8 n°4 F 4,3 11 0 n°10 F

2,8 6 0 8,4 n°5 M 4,3 11 0 n°11 F

2,8 6 n°6 F 4,3 11 0 n°12 M

2,1 BF 7 0 2 n°1 F 2,8 StB 12 0 5,1 0,2

2,1 7 0 3,3 n°2 M 2,8 12 0 3,2

2,1 7 0 4,1 n°3 M 2,8 12 0

2,1 7 0 5,6 n°4 M 2,8 12 0 -1,55

2,1 7 0 3,5 n°5 F 2,8 12 0 1,25

2,1 BF 7 n°6 M 2,8 12 0 1,4

2,1 7 n°7 F 2,8 12 0 1,85

BF 8 3,4 N°1 F 2,8 12 0 17

8 0 29,6 n°2 F 2,8 12 0 10,2

8 0 5,1 n°3 M 2,8 12 0 0,35

8 0 2,7 n°4 F 5,4 StB 8 0 7,4 1,2 1

8 1 5,85 n°5 F 5,4 8 0 1,8 2

8 0 n°6 F 5,4 8 0 1,3 3

8 0 2 n°7 F 5,4 8 0

8 0 33,6 n°8 M 5,4 8 0

2,7 BF 2 0 2,7 12,1 n°1 F 5,4 8 0 1,8 6

2,7 2 1 n°2 5,4 8 0 17,8 7

2,1 BF 7 0 3,0 1,9 n°1 M 5,4 8 0 3,8 8

2,1 7 0 n°2 M 4 BB 9 0 2,9 4,8 n°1 F

2,1 7 0 2,2 n°3 F 4 9 0 4,1 n°2 M

2,1 7 0 6,1 n°4 F 4 9 0 1,2 n°3 M

2,1 7 0 3,8 n°5 M 4 9 0 n°4 M

2,1 7 0 3,9 n°6 F 4 9 0 n°5 F

2,1 7 0 n°7 F 4 9 0 8,5 n°6 M

1,7 BF 6 3,2 4 9 0 4,6 n°7 F

1,7 6 0 30,2 n°2 F 4 9 0 n°8 F

1,7 6 0 4 n°4 M 4 9 0 n°9 F

1,7 6 0 3,7 n°6 F 4,2 BB 6 6,7

3,2 BF 4 0 4,2 6 0 4,5 n°1

3,2 4 0,3 3 4,2 6 0 4,6 n°2

BF 5 3,4 4,8 4,2 6 0 0,7 n°3

5 1 (n°5 ) 4,2 6 0 2,7 n°4

1,0 BF 5 0 4,2 6 0 0,7 n°6

1,0 5 0 1,1 2 TN 0 7,3 3,7 n°1 M

Age

(a)RACE

Nb

chiotN

Type

chiot

Type

chiot

Age

(a)RACE

Nb

chiottHcy aHcy tHcy aHcy

µmol/L µmol/L

N

151

- Nb = Nombre

- Colonne N = 0 si absence de fente palatine, 1 en présence

- Cases grisées = pas de prélèvement réalisé

- Colonne type chiot = M pour Mâle, F pour Femelle, avec numéro de rang de naissance

1,0 5 0 3,3 3 0 1,8 n°2 M

4,1 BF 7 0 5,5 2,5 n°1 0 0,3 n°3 M

4,1 7 0 2,7 n°2 0 -1,2 n°4 F

4,1 7 0 6,4 n°3 TN 10 0 0,2 n°1

4,1 7 0 6 n°5 10 0 n°2

4,1 7 0 2,1 n°7 10 0 0,5 n°3

3,4 BF 4 1 2,3 9,1 n°1 10 0 n°4

3,4 4 0 8,3 n°2 10 0 n°5

3,4 4 1 4,8 n°3 10 0 n°6

3,4 4 1 6,5 n°4 10 0 2,35 n°7

4,9Bull Ter min 5 0 2,1 2,2 n°1 F 10 0 n°8

4,9 5 n°2 F 10 0 0,5 n°9

4,9 5 n°3 M TN 10 0 2,8 n°10

4,9 5 0 n°4 F 3,8 Boxer 3 1 3,9 n°1 M

4,9 5 0 3,3 n°5 M 3,8 3 n°2 F

2,2Bull Ter min 3 0 3,4 0,45 n°1 M 3,8 3 0 n°3 M

2,2 3 0 0,9 n°2 F 1,7 Boxer 7 0 1 1

2,2 3 0 n°3 F 1,7 7 0 2

Bull Ter min 4 0 3,7 18,3 n°1 F 1,7 7 0 3

4 0 10,9 n°2 M 1,7 7 0 1,9 4

4 n°3 Colley 2 0 6,4 n°1 M

4 0 6,6 n°4 F 2 0 0,25 n°2 M

Bull Ter min 6 1,8 n°1 M 8,6 Berger all 3 0 7,2 2,2

6 n°2 M 8,6 3 0

6 0 3,4 n°3 F 8,6 3 0

6 12,2 n°4 F 4,4 Beagle 3 6,1 10 n°1 F

6 3,8 n°5 M 4,4 3 0 17,1 n°2 F

6 n°6 F 4,4 3 1 6 n°3 M

4,3Bull Ter min 5 0 5,8 -4,45 n°1

152

NOM PRENOM : COURCHAY MARION

TITRE : LES FENTES LABIO-PALATINES CONGENITALES CHEZ

LE CHIEN : MISE AU POINT D’UN TEST ENZYMATIQUE POUR LE

DOSAGE DE L’HOMOCYSTEINE, MARQUEUR ANTENATAL

POTENTIEL DES FENTES LABIO-PALATINES, DANS LE SANG DE

LA MERE ET DANS LE LIQUIDE AMNIOTIQUE DES CHIOTS

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, 2014

RESUME :

En médecine vétérinaire, les fentes labio-palatines congénitales sont peu fréquentes mais ne sont

néanmoins pas rares chez les races Brachycéphales (7.9% des chiots) et entrainent de lourdes pertes

pour les éleveurs. Leur développement durant la période embryonnaire est un mécanisme complexe

d’origine multifactorielle. Les carences en acide folique, apporté dans l’alimentation, en font partie et

sa complémentation permet de réduire la fréquence d’apparition de cette malformation. Le diagnostic

en médecine humaine peut être réalisé par échographie, mais celui-ci apparait compliqué, voire

impossible, dans l’espèce canine. Une augmentation de la concentration totale en homocystéine, acide

aminé soufré intervenant dans le cycle des folates, est observée dans le plasma chez la femme pendant

la grossesse en présence d’un fœtus atteint de la déformation et dans le liquide amniotique lors

d’anomalie du tube neural. Au cours de cette étude clinique, la mise en place d’un test enzymatique à

trois réactifs a permis de doser, sur 35 chiennes, toutes races confondues : 28 homocystéinémies chez

la lice en fin de gestation et 110 concentrations en homocystéine dans le liquide amniotique des chiots.

26.7% des portées de Bouledogues français ont présenté au moins une fente labio-palatine.

L’homocystéinémie obtenue est de 4.5±0.34 µmol/L. Une différence significative de

l’homocystéinémie entre les races de petites tailles et de grandes tailles a été mise en évidence ; et des

moyennes plus élevées ont été observées avec l’âge, l’urémie et la créatinémie. Les concentrations

obtenues dans le liquide amniotique présentent une grande variabilité et sont significativement plus

élevées chez les fœtus femelles. Le faible effectif ne permet pas de conclure quant à la présence de

changement de concentration en homocystéine en cas de fentes. La mise en place de cette analyse

enzymatique pourrait permettre de donner des valeurs de références chez l’espèce canine et de

poursuivre cette étude.

MOTS CLES : - Division palatine

- Liquide amniotique

- Césarienne

- Homocystéine

- Analyse enzymatique

JURY :

Président : Monsieur le Professeur Olivier CLARIS

1er Assesseur : Monsieur le Docteur Samuel BUFF

2ème Assesseur : Monsieur le Docteur Thierry BURONFOSSE

Membre invité : Madame le Docteur Emilie ROSSET

DATE DE SOUTENANCE : 10 Décembre 2014

ADRESSE DE L’AUTEUR : 15, rue Jean Tassel, 91430 IGNY