Transitoires calciques et différenciation neuronale

• Neuroblastes de la moelle épinière d’embryon de xénope (HOLLIDAY and SPITZER 1990).

• Précurseurs neuraux de la zone ventriculaire de néocortex d’embryons de rat (OWENS and KRIEGSTEIN 1998).

• Cellules de crêtes neurales troncales d’embryons de souris (CAREY and MATSUMOTO 1999).

• Précurseurs de neurones GABAergiques d’embryons de drosophile (KUPPERS et al. 2003).

Transitoires calciques de neurones NT2N humains

A

B

Gao et al. 1998, EJN 10:2416-25

Control

Ca2+ 0

mM

Nif. 1

0 µM

GVIA 5

µM

MVIIC

5 µ

M

Ni 0.5

mM

Ni 5 m

M

Canaux calciques voltage-dépendants et différenciation neuronale

• Les canaux de type L sont indispensables à l’induction neurale chez le xénope et sont régulés par noggin (Leclerc et al. 2000).

• Les canaux de type N déterminent le phénotype neurochimique GABAergique dans la moelle épinière d’embryons de xénope via une régulation de l’expression de la GAD67 (Watt et al. 2000).

• L’expression des canaux de type L est corrélée avec la maturation de l’excitabilité de neurones de Purkinje de rats néonataux (Liljelund et al. 2000).

Codage fonctionnel des transitoires calciques chez le xénope

• Les « spike » calciques de 2-3/h au niveau du soma déterminent la différenciation des neurones GABAergiques (Gu et Spitzer 1995).

• Les ondes calciques d’environ 8/h au niveau du cône de croissance inhibent la pousse neuritique (Gomez et Spitzer 1999)

• Les transitoires calciques, d’environ 10/min, des filopodes régulent le guidage axonal (Gomez et al. 2001).

Rôle des canaux calciquesdans la différenciation

neuronale Méthodologie:

– Pharmacologie et électrophysiologie in vitro.

– Transgenèse– Clonage in silico de canaux– Modulation in vivo des courants– Microscopie multiphotonique in vivo

Modèle animal : Xenopus laevis et tropicalis

Xenopus laevis

Advantages du modèle

•Modèle d’ embryologistes•Milliers d’oeufs de grandes tailles.•Chorion transparents et développement externe des embryons.•Table de développement embryonnaire établie.

•Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser.•Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin.• Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires.

•Modèle de génétique:•Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2007 par le “Joint Genome Institute » au NIH.

F. TIAHO

Advantages du modèle

•Modèle d’ embryologistes•Milliers d’oeufs de grandes tailles.•Chorion transparents et développement externe des embryons.•Table de développement embryonnaire établie.

•Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser.•Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin.• Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires.

•Modèle de génétique:•Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le “Joint Genome Institute » au NIH.

F. TIAHOF. TIAHO

METHODES: solutions

Dissection

Mark’s Modified Medium

•NaCl100 mM•KCl 2 mM•CaCl2 0.2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•pH 7.8

Dissociation

Barth Medium•NaCl 88 mM•KCl 1 mM•NaHCO3 2.4 mM•Na2HPO4 2 mM•KH2PO4 0.1 mM•EGTA 0.5 mM•pH 8.1

Culture

Mark’s Modified Medium

•NaCl100 mM•KCl 2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•CaCl2 ±0.5 mM •EGTA ± 1 mM•pH 7.8

Fil de platine

Fil de platine

Pointe de pipette Pasteur

Pointe de pipette Pasteur

1. Couteau

2. Raquette

METHODES in vitro: dissection et culture des cellules neurectodermiques

1. Dissection 2. Culture

B

DC

A

1 mmNeurone

C.I.

C.E.

20 µm

Exemples de neurones

Advantages du modèle

•Modèle d’ embryologistes•Milliers d’oeufs de grandes tailles.•Chorion transparents et développement externe des embryons.•Table de développement embryonnaire établie.

•Biologie et physiologie cellulaire facile à réaliser.•Les cellules du neurectoderme, mésoderme et endoderme peuvent être séparées, dissociées et mises en culture primaire dans un milieu salin.• Il existe de nombreux anticorps pour l’immuno-identification de différents types cellulaires.

•Modèle de génétique:•Le séquençage complet du génome de Xenopus tropicalis est prévu pour fin 2004 par le “Joint Genome Institute » au NIH.

F. TIAHOF. TIAHO

METHODES: solutions

Dissection

Mark’s Modified Medium

•NaCl100 mM•KCl 2 mM•CaCl2 0.2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•pH 7.8

Dissociation

Barth Medium•NaCl 88 mM•KCl 1 mM•NaHCO3 2.4 mM•Na2HPO4 2 mM•KH2PO4 0.1 mM•EGTA 0.5 mM•pH 8.1

Culture

Mark’s Modified Medium

•NaCl100 mM•KCl 2 mM•MgCl2 1 mM•Hepes 5 mM•CaCl2 ±0.5 mM •EGTA ± 1 mM•pH 7.8

F. TIAHO

Propriétés des neurones différenciés

•ImmunologieIls sont tous 3A10 positifs.

•Electrophysiologie Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium.

•Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma.

Dans les expériences suivantes les neurones sont définis par des critères morphologiques uniquement.

F. TIAHO

Analyses des neurones différenciés

•La calcein-AM et le propidium iodide sont utilisés pour distinguer les cellules vivantes et mortes.•Les neurones sont identifiés par le critère morphologique.•Le nombre de neurones ou leur pourcentage dans chaque boîte de Petri sont déterminés.•Pour les statistiques, les tests de ou t-test de student sont utilisés. •Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope à épifluorescence (Olympus IX70).

-350 pA

-20 mV

0 mV

A Current clamp

B Voltage clamp

I (nA)

Vm (mV)

Vm (mV)

I (nA)

METHODES in vitro:

2. Electrophysiologie

50 µm 50µm

Neurone

Anti-islet1Anti-myosin

1. Immunocytofluorescence

3A10A1 A2

20 µm

3A10

F. TIAHO

Propriétés des neurones différenciés

•ImmunologieIls sont tous 3A10 positifs.

•Electrophysiologie

Ils sont tous excitables lorsque le milieu de culture ne contient pas de calcium.

•Morphologie Taille des neurites > deux fois le diamètre du soma.

Pour dénombrer en routine les neurones dans les cultures nous utilisons le critère morphologique

ATP AchIGF BTX

Dépolarisation

GVI-A

Ni

Ca2+

Différen

ciation

neu

ron

ale

??TRP

Bilan des résultats

Ca2+

Ca2+Ca2+

Ca2+

Ca2+ Ca2+

Ca2+

F. TIAHO

Groupe1 Groupe2

Groupe 1A Groupe 1B Groupe 2A Groupe 2B

Mercredi AM Prép. solutionsObservation cultureDissection

Prép. solutionsDissectionObservation culture

Mercredi PM DissectionCulture

DissectionCulture

Jeudi AM Comptage Comptage Prép. solutionsObservation cultureDissection

Prép. solutionsDissectionObservation culture

Jeudi PM DissectionCulture

DissectionCulture

Vendredi AM Comptage Comptage

Vendredi PM

Planification de la culture cellulaire

  GROUPE 1A GROUPE 1B

Nombre NOM PRENOM NOM PRENOM

1        

2        

3        

4        

5        

  GROUPE 2A GROUPE 2B

6        

7        

8        

9        

10        

FICHE-GROUPES