Travail de génétiqueTravail de génétique

Analyse de l’expression des gènes mis en jeu Analyse de l’expression des gènes mis en jeu lors de la phase aigue de l’inflammation en lors de la phase aigue de l’inflammation en utilisant un modèle des régions codantes chez utilisant un modèle des régions codantes chez le chienle chien

Sophie Bitté Sophie Bitté

Flora BonnetFlora Bonnet Anne-Sophie Bouix Anne-Sophie Bouix Marthe WoygnetMarthe Woygnet

2ème doctorat2006-2007

PLANPLAN

I.I. ObjectifsObjectifs

II.II. Matériel et méthodesMatériel et méthodes

III.III. Résultats et discussionRésultats et discussion

IV.IV. ConclusionConclusion

V.V. IntérêtsIntérêts

BibliographieBibliographie

ObjectifsObjectifs Similitudes entre chien et homme dans réponse face à Similitudes entre chien et homme dans réponse face à

des cas de toxicité de certains médic.humains.des cas de toxicité de certains médic.humains.

!!! Attention aux extrapolations d’infos erronées!!!!!! Attention aux extrapolations d’infos erronées!!!

lancement d’une étude sur le séquençage et lancement d’une étude sur le séquençage et l’expression du génome du chienl’expression du génome du chien

identification de marqueurs biologiques identification de marqueurs biologiques compréhension des mécas d’action mis en jeucompréhension des mécas d’action mis en jeu

importance capitale pour l’industrie pharmaceutique importance capitale pour l’industrie pharmaceutique

Peu d’informations disponibles et coût élevé ( rongeurs)

Identification des mécanismes des marqueurs Identification des mécanismes des marqueurs biologiques mis en jeu biologiques mis en jeu grâce à l’utilisation d’une sonde grâce à l’utilisation d’une sonde reconnaissant spécifiquement des régions codantes du reconnaissant spécifiquement des régions codantes du génome canin.génome canin.

Sonde contient des séquences canines et humainesSonde contient des séquences canines et humaines

compréhension action moléculaire au niveau voies compréhension action moléculaire au niveau voies métaboliques, organes cibles, sites d’action face à unmétaboliques, organes cibles, sites d’action face à un

cas de toxicité.cas de toxicité.

Séquences humaines: augmente capacité d’expression des séquences Séquences humaines: augmente capacité d’expression des séquences possibilités comparaison directe entre possibilités comparaison directe entre génomes humain et caningénomes humain et canin

Cette toxicité résulte de l’administration à des chiens de Cette toxicité résulte de l’administration à des chiens de LPS, mimant ainsi une situation endotoxique.LPS, mimant ainsi une situation endotoxique.

Choix de ce modèle en raison des similitudes à travers Choix de ce modèle en raison des similitudes à travers les espèces au niveau des marqueurs traditionnels de la les espèces au niveau des marqueurs traditionnels de la phase aigue de la RI phase aigue de la RI

comparaison possible entre les profils de transcrits, comparaison possible entre les profils de transcrits, formules sanguines, paramètres hématologiques formules sanguines, paramètres hématologiques du du chien avec ceux d’autres espèces, et notamment chien avec ceux d’autres espèces, et notamment de de l’hommel’homme

Matériel et MéthodesMatériel et Méthodes Séquence codante canineSéquence codante canine

• séquence d’oligonucléotides obtenue à partir du modèle de la séquence U133 humaine ( 12,8 mm)

• 22 774 sites reconnus par la sonde dans la séquence construite

→13 729 spécifiques au chien

( dont 10 079 issus du domaine privé et 3650 de la banque génétique publique)

→ 8945 sites de référence humaine

• synthèse par photolithographie

Conception et sélection de la sondeConception et sélection de la sonde

•attribution score de qualité pour chaque sonde, basée sur l’efficacité de l’hybridation.

•classification des sondes suivant divers paramètres

Animaux d’étudesAnimaux d’études• 9 beagles mâles de 8 à 25 mois, et de 5 à 11 kg.

• période d’adaptation de 3 semaines

• ration: 300 g le matin et eau à volonté

• formation 3 groupes (contrôle, LPS 4h, LPS 24h)

~chiens traités: dose unique en IV de 0,2 mg/kg de LPS en solution saline

~chiens contrôles: injection de l’excipient uniquement

• mise à jeun la nuit précédent l’injection, et 4h avant l’euthanasie

• euthanasie des animaux 4h ( groupe 2), ou 24h (groupe 3) après l’administration de LPS

Evaluation des paramètres hématologiques et Evaluation des paramètres hématologiques et chimiqueschimiques

••collecte d’échantillons sanguinscollecte d’échantillons sanguins

→ → tube avec EDTAtube avec EDTA:: détermination du taux de réticulocytes, détermination du taux de réticulocytes, plaquettes, leucocytes…plaquettes, leucocytes…

→→ tube avec citrate de sodiumtube avec citrate de sodium: : détermination de détermination de prothrombine et thromboplastine, via une centrifugation prothrombine et thromboplastine, via une centrifugation pendant 10 min. à 3000 tours/min.pendant 10 min. à 3000 tours/min.

→ → tube sans anti-coagulanttube sans anti-coagulant: : détermination des détermination des concentrations en glucose, cholestérol, triglycérides…, via concentrations en glucose, cholestérol, triglycérides…, via une centrifugation; et détermination de l’activité de ALP, une centrifugation; et détermination de l’activité de ALP, GGT, ALT, AST.GGT, ALT, AST.

→→ kits immunologique: kits immunologique: détermination des concentrations de détermination des concentrations de SAA et CMPSAA et CMP

••évaluations histopathologiques sur le foie, le évaluations histopathologiques sur le foie, le cœur, les reins et les tissus du tractus gastro- cœur, les reins et les tissus du tractus gastro- intestinalintestinal

Préparation des échantillons

•prélèvement de 150 mg de foie et homogénéisation dans 1 ml d’ARN stat.60

•extraction ARN total Purification ARN sur colonnes

Mise en solution avec ARN canin

Transcription inverse en double brin d’ADN

•synthèse ARN puis fragmentation

Hybridation avec la sonde canine

Méthodes d’amplification rapide d’une séquence d’ADN: PCR

• utilisée pour confirmer la série de changements transcriptionnels observés lors de l’expérience.

• utilisation d’amorces pour certains gènes spécifiques SAA , Il 8 , ND 5 , TIMP1 , SDF2L1

• suivi du protocole classique, 3 fois par prélèvement.Traitement ARN par ADNase et Transcription inverse

Electrophorèse des produits obtenus

Incubation des tubes à PCR pendant 2 min à 50°C

Dénaturation des proteines à 95°C pendant 10 min

Série d’incubations,± 50, à 95°C pdt 15 sec, puis 60° pdt 1 min

RESULTATSRESULTATS

Paramètres performance de la séquence codanteParamètres performance de la séquence codante signal d’intensité totalsignal d’intensité total détermination du gène « présent » ou « absent »détermination du gène « présent » ou « absent »

calculés par algorithmes standard affymetrixcalculés par algorithmes standard affymetrix

résumés pour le profil de transcription d’un résumés pour le profil de transcription d’un échantillon de foie de chien (n = 4)échantillon de foie de chien (n = 4)

Sondages provenant de séquences de chien Sondages provenant de séquences de chien = expression en moyenne + grande que = expression en moyenne + grande que sondages provenant séquences humainessondages provenant séquences humaines

Tt signal d’intensité = déterminant majeur Tt signal d’intensité = déterminant majeur appelé dans l’attribution des gènes de appelé dans l’attribution des gènes de détectiondétection 1 augmentation des valeurs d’intensités 1 augmentation des valeurs d’intensités

+ de gènes dérivés du chien = appelés « + de gènes dérivés du chien = appelés « présent »présent »

28% sondages spécifiques au chien = « 28% sondages spécifiques au chien = « présent »présent »

8% de ceux humains8% de ceux humains

Signal d’intensité sondes dérivées canine>homme Signal d’intensité sondes dérivées canine>homme MAIS MAIS dépend région codante =analyséedépend région codante =analysée

Autres expériences : pour voir si stratégie : Autres expériences : pour voir si stratégie : séquences dérivées de l’homme dans modèle de séquences séquences dérivées de l’homme dans modèle de séquences

codante canines améliore l’hybridation à travers les espècescodante canines améliore l’hybridation à travers les espèces

Déterminer si source de faible intensité du signal humain = Déterminer si source de faible intensité du signal humain =

- faible réaction inter espèce - faible réaction inter espèce

ouou - d’efficacité- d’efficacité échantillons identiques foie CN hybridés séquentiellement échantillons identiques foie CN hybridés séquentiellement

pour les modèles de séquences codants pour les chiens et pour les modèles de séquences codants pour les chiens et l’homme U133Al’homme U133A

Sur les 8945 RefSeq dérivés séquentiels de la sondeSur les 8945 RefSeq dérivés séquentiels de la sonde

humaine sur les modèle de séquences codants chez lehumaine sur les modèle de séquences codants chez le

chien : chien : 965 transcriptions « présentes » sur au – 1type de modèle 965 transcriptions « présentes » sur au – 1type de modèle

de séquences codante sur échantillon de foiede séquences codante sur échantillon de foie Sur ces 965 -> 10% « présents » sur les 2 types de modèleSur ces 965 -> 10% « présents » sur les 2 types de modèle 32% uniquement CN32% uniquement CN 58% uniquement homme U133A58% uniquement homme U133A

Haut % gènes détectés exclusivement sur base Haut % gènes détectés exclusivement sur base 3’de la sonde du modèle U133A suggère : 3’de la sonde du modèle U133A suggère :

La localisation de la sonde = facteur important dans La localisation de la sonde = facteur important dans la détection des nucléotides du modèlela détection des nucléotides du modèle

Différentes expressions des gènes en réponses Différentes expressions des gènes en réponses aux LPSaux LPS

Test de l’aptitude du modèle de la Test de l’aptitude du modèle de la séquence codante canine a détecter séquence codante canine a détecter l’expression des différents gènes l’expression des différents gènes

CN Beagle ♂ traités doses non CN Beagle ♂ traités doses non létales d’endotoxines bactériennes létales d’endotoxines bactériennes

mesure expression gène mesure expression gène hépatique à 4H et 24H après hépatique à 4H et 24H après l’administration de LPS l’administration de LPS

Nombre de transcription détectéeNombre de transcription détectée = pas variable entre = pas variable entre les 2 gpesles 2 gpes

Mais Mais gènes régulés négativementgènes régulés négativement = 4h > 8h = 4h > 8h Evaluer l’intensité de la réponse inflammatoire :Evaluer l’intensité de la réponse inflammatoire :

Observations cliniqueObservations clinique Composition sériqueComposition sérique Paramètres hématologiques et histopathologiquesParamètres hématologiques et histopathologiques

corrélation avec données de l’expressioncorrélation avec données de l’expression

génique obtenue par modèle séquence codantegénique obtenue par modèle séquence codante

caninecanine

Observations cliniques concordent avec Observations cliniques concordent avec l’évolution d’1 endotoxémiel’évolution d’1 endotoxémie : : activité et vomissementactivité et vomissement prise nourriture ( 24H)prise nourriture ( 24H)

Effets hématologiques du médiateur LPS Effets hématologiques du médiateur LPS mesuré :mesuré : LeucocyteLeucocyte à 2 et 4h mais à 24h à 2 et 4h mais à 24h NeutropénieNeutropénie modérée à 2 et 4h modérée à 2 et 4h NeutrophilieNeutrophilie modérée à 24h modérée à 24h Légère prolongation activité partielle Légère prolongation activité partielle

thromboplastinethromboplastine et et prothrombineprothrombine minime minime réticulocyteréticulocyte 2 h après 2 h après

administrationadministration

Changements morphologiques : Changements morphologiques : congestion congestion nécrose nécrose vacuolisation des cellules hépatiquesvacuolisation des cellules hépatiques

Dans littérature, administration LPS causeDans littérature, administration LPS cause:: Changements majeurs niveau Changements majeurs niveau marqueurs chimiquesmarqueurs chimiques de de

réponse aigue de l’inflammationréponse aigue de l’inflammation [CRP][CRP] de 4 à 24h de 4 à 24h Activité Activité ALTALT et et ASTAST relativement relativement

disponibilité séquences ADN des marqueurs SAA, ALP, disponibilité séquences ADN des marqueurs SAA, ALP, Albumine et AST ont permis comparaison changements Albumine et AST ont permis comparaison changements chimiques avec donnée expression géniques des séquences chimiques avec donnée expression géniques des séquences codantescodantes

Détermination sériques de ces 4 protéinesDétermination sériques de ces 4 protéines [SAA][SAA] pendant 2h après administration LPS + pendant 2h après administration LPS + continue toute la période d’étudecontinue toute la période d’étude ARNm SAA = suractivé dans foie à 4 et 24hARNm SAA = suractivé dans foie à 4 et 24h transcription induite + de 100 transcription induite + de 100 * dans gpes 4 et 24h* dans gpes 4 et 24h

activité activité ALPALP tout au long de l’étude tout au long de l’étude expression ARNm ALP à 4 et 24hexpression ARNm ALP à 4 et 24h

[albumine sérique][albumine sérique] de 15% (point 24h) de 15% (point 24h) niveau transcrition ambumine de 4 * à 24hniveau transcrition ambumine de 4 * à 24h

Activité sérique Activité sérique ASTAST gpe 4h après administation gpe 4h après administation transcription hépatique séquence AST de 2* à 4 et 24htranscription hépatique séquence AST de 2* à 4 et 24h

Différents gènes exprimés sont choisis pourDifférents gènes exprimés sont choisis pourconfirmation par PCR en temps réelconfirmation par PCR en temps réel

PCR RT pour SAA, IL-8, TIMP1, NDS et SDF2L1PCR RT pour SAA, IL-8, TIMP1, NDS et SDF2L1

confirmation résultats des modèles des régions confirmation résultats des modèles des régions codantes codantes induction induction SAASAA confirmée : gpe 4 et 24h confirmée : gpe 4 et 24h rapide et brute induction IL-8 et rapide et brute induction IL-8 et TIMP1TIMP1 confirmée par PCR confirmée par PCR Activité de régulation de Activité de régulation de ND5 ND5 détectée par sondes et PCRdétectée par sondes et PCR SDF2L1SDF2L1 transcrit avec faible intensité transcrit avec faible intensité

corrélé avec résultats modèle de séquences codantes, PCRcorrélé avec résultats modèle de séquences codantes, PCR

confirme : confirme :

primeur pour homme SDF2L1< pour l’amplification que primeur primeur pour homme SDF2L1< pour l’amplification que primeur du chien du chien

Corrélation biologique et implication des Corrélation biologique et implication des résultats aux mesures transcriptionnellesrésultats aux mesures transcriptionnelles

Expression gènes combinés = exprimés tôtExpression gènes combinés = exprimés tôt + tard = réponses transcriptionelles aux + tard = réponses transcriptionelles aux

endotoxines des bactériesendotoxines des bactéries Induction importante dans la transcription Induction importante dans la transcription

codant les cytokines et d’autres médiateurs de codant les cytokines et d’autres médiateurs de l’inflammation = s’observe 4h post admi LPSl’inflammation = s’observe 4h post admi LPS IL-6IL-6 induit+++ à 4h puis basal à 24h induit+++ à 4h puis basal à 24h IL-8IL-8 transcription à 4h, 20*> au gpe contrôle transcription à 4h, 20*> au gpe contrôle

rapide et marquée transcription rapide et marquée transcription remodelage matrice extracellulaire tel remodelage matrice extracellulaire tel TIMP1TIMP1

temps dépendante de protéines temps dépendante de protéines additionnelles de la matrice extracellulaire additionnelles de la matrice extracellulaire comme comme ElafineElafine et et IHRPIHRP

taux de taux de glucose plasmatiqueglucose plasmatique sous régulation transcriptions impliquées sous régulation transcriptions impliquées

dans la régulation de glucose ( surtt 24h)dans la régulation de glucose ( surtt 24h) Ex gènes répressés : UDP gluc Ex gènes répressés : UDP gluc

phosphorylasephosphorylase transporteur glucose transporteur glucose

type5type5 phosphoglucomutasephosphoglucomutase

Famille Famille cytP450cytP450 = sous régulés à 24h= sous régulés à 24h Changement de transcription similaires dans la Changement de transcription similaires dans la

phase 2 de la biotransformation enzymatique phase 2 de la biotransformation enzymatique (incluant plusieurs GST et UDP glucuro)(incluant plusieurs GST et UDP glucuro)

taux taux cholestérols et triglycéridescholestérols et triglycérides à 8 et 24h à 8 et 24h

massive expression gène codant pour massive expression gène codant pour enzymes impliquées dans métobo cholestérols enzymes impliquées dans métobo cholestérols observé à 24hobservé à 24h

Ex : ACAT, LCAT, CYP7A 7*à 24h mais Ex : ACAT, LCAT, CYP7A 7*à 24h mais pas à 4hpas à 4h

Implication des réponses transcrites mesurées :

Modifications au niveau de la matrice extra cellulaire:Modifications au niveau de la matrice extra cellulaire:

● TIMP1 : augmente 4h et 24h post administration LPS

● MMP9 : augmente 24h post administration LPS

Contrôle du remodelage de la MEC via équilibre entre le taux de métalloprotéinases activées et le taux de TIMPs. ( formation de complexes irréversibles )

● ETAFIN : augmente post administration LPS inhibiteur sérique du gène de la famille des Troppines

Contrôle protéolyse MEC via l’inhibition de l’elastase

DISCUSSION

● IHRP : protéine de l’inflammation augmente post administration LPS ( expression du gène IHPR inductible par LPS )

L’ activité des enzymes extra-cellulaires des chiens traités au LPS serait donc liée au contrôle de la protéolyse des constituants de la MEC et préserverait ainsi l’intégrité des tissus.

NB: Une autre hypothèse explicative serait une inhibition directe des enzymes extra-cellulaires.

TIMP1,ELAFIN et IHRP:

marqueurs non invasifs de la phase aigue de la réponse inflammatoire ( dans sang et ARNm ).

Modification au niveau des médiateurs de l’inflammationModification au niveau des médiateurs de l’inflammation::Chez l’homme : 1- phase symptomatique à 4 hChez l’homme : 1- phase symptomatique à 4 h 2- phase asymptomatique à 24 h2- phase asymptomatique à 24 hChez le chien:Chez le chien: 1- inflammation précoce1- inflammation précoce 2- modifications voies métaboliques 2- modifications voies métaboliques

plus tardivementplus tardivementDans la littérature:Dans la littérature:

Les LPS induisent une situation d’endotoxémie responsable d’ Les LPS induisent une situation d’endotoxémie responsable d’ une augmentation de l’expression des médiateurs de une augmentation de l’expression des médiateurs de l’inflammation.l’inflammation.

Détection de l’induction de cytokines pro inflammatoires comme : IL 6 , IL 8 , TNF alpha

capables d’activer des voies de signalements intra-cellulaires ainsi que d’activer des facteurs de transcription impliqués dans l’activation de gènes codant pr des molécules inflammatoires

Modifications au niveau du métabolisme des lipides:Modifications au niveau du métabolisme des lipides:

Suite à l’administration de LPS: perturbation du métabolisme lipidique au niveau du foie

Diminution expression de gènes codant pr enzymes responsables du catabolisme du cholestérol et des triglycérides explique l’augmentation tardive des taux sériques de cholestérol et TG

Modification au niveau du enzymes de la Modification au niveau du enzymes de la biotransformationbiotransformation::

• diminution expression et activité de certaines isoenzymes hépatiques lors phase aigue de l’inflammation

• observations en accord avec le fait que l’expression de certaines enzymes de la biotransformation diminue fortement suite administration de LPS

Ex: niveau de transcription de CYP2D15 fortement à 24h post LPS

diminution expression d’enzymes de la détoxification

Identification de nouveaux biomarqueurs de la phase aigue de l’inflammation:

• activation du transcrit Sec61a: translocase de protéines impliquées dans la sécrétion protéique ( augmente à 4 h et à 24 h )Sec 61 serait impliquée dans sécrétion des prot. de la phase aigue de l’inflam., synthétisées dans les hépatocytes et transportées dans le sang.La machinerie de translocation des prot. pourrait etre sensible à la [ ]° en cholestérol dans membrane du RE.• SDF2L1: prot. sécrétoires fonctionnant comme enzymes O-glycosylantes dans levures. Lien entre phase aigue inflammation et état de glycosylation des protéines circulantes.

CONCLUSIONNombreux changements ( connus ou non ) au niveau de la transcription, dans le foie lors phase aigue inflam.

Confirmation de ces résultats via paramètres comme: biochimie, hématologie, histopathologie et analyses PCR

Génétique moléculaire: outil génial pour mieux comprendre les «  mystères » des mécanismes inflammatoires.

+ découverte de nouveaux marqueurs de toxicité ainsi que de nouveaux gènes mis en jeu lors RI.

INTERETS• pour développement industrie pharmaceutique en médecine humaine:

tests des effets moléculaires chez le chien permettent meilleure prévision des effets chez l’homme

évaluation toxicité éventuelle des médicaments

• à l’inverse, exploitation résultats obtenus chez l’homme à des fins thérapeutiques chez le chien.

renforcement panel médical VT

!!! Ne pas abuser des chiens comme animaux de laboratoire !!!

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHIE

Higgins, M.A. Berridge,B.R. Higgins, M.A. Berridge,B.R. Mills,B.J. Schultze,A.E. Gao, H. Mills,B.J. Schultze,A.E. Gao, H. Searfoss,G.H. Baker,T.K.and Searfoss,G.H. Baker,T.K.and Ryan,T.P (2003). Gene expression Ryan,T.P (2003). Gene expression analysis of the acute phase response analysis of the acute phase response using a canine microarrayusing a canine microarray

Griffiths. Gelbart. Miller.Lewortin.Griffiths. Gelbart. Miller.Lewortin.(2001)Analyse génétique moderne. (2001)Analyse génétique moderne. DeBoeckDeBoeck UniversitéUniversité