Un pathogène d’actualité

Clostridium difficile

Dr Levent: Équipe opérationnelle en hygiène - référent en antibiothérapie. CHSA

Manica Vasseur: Laboratoire de biologie. CHSA

Maubeuge FMC 09/11/2006

2. Diagnostic Bactériologique

Manica Vasseur – Biologiste Laboratoire. CHSA

La bactérie : caractéristiques et facteurs de virulence

Le diagnostic bactériologique

État des résistances

2. Caractéristiques de la bactérie

Bacille Gram Positif anaérobie strict

Spore subterminale peu déformante

Souches:

toxinogènes (pathogènes)

non toxinogènes (non pathogènes)

Toxine A:entérotoxine

Toxine B: cytotoxine

2. Caractéristiques de la bactérie

La Toxine A induit:

une inflammation importante

Une infiltration massive de la muqueuse intestinale par des polynucléaires et des cellules mononuclées

Une nécrose de l’épithélium intestinal

Une accumulation de fluide dans l’épithélium intestinal

2. Caractéristiques de la bactérie

La Toxine B :

1000 fois plus puissante/toxine A. Elle est cytotoxique

induit un effet cytopathogène (rétraction cellulaire, dépolimérisation des filaments d’actine du cytosquelette

Induit une augmentation de la perméabilité de la muqeuse intestinale

2. Caractéristiques de la bactérie

Les toxines A et B agissent en synergie

Distinction classique Toxine A/Toxine B n’est pas aussi tranchée. Les 2 toxines sont dotées de propriétés cytotoxiques et entérotoxiques (Savidge et coll 2003)

Polypeptides de grandes tailles (308 et 270 Kda) présentant toutes 2 des structures primaires similaires

Joueraient un rôle dans l’adhérence bactérienne (Tasfeyne et coll-2001, Borriello et coll-1998)

Domaine transmembranaire intervenant dans la translocation des toxines dans le cytosol

Domaine N terminal

Activité enzymatique toxique Site de liaison aux cellules cibles

Mécanisme d'action des toxines

Liaison aux récepteurs des entérocytes

Production de cytokines proinflammatoires

par les monocytes (TNF IL1 ,et 6) et les entérocytes (MIP 2, IL8 )

Internalisation

Inactivation des proteines Rho

Désorganisation du cytosquelette cellulaire

Augmentation de la perméabilité paracellulaire

Diarrhée aqueuse

Action directeActions indirectes

Infiltration massive de polynucléaires activés

Nécrose des cellules coliques

Inflammation sévéreDestruction des cryptes intestinales Lésions épithéliales

Pseudomembranes : PN , fibrine , débris cellulaires

Induction de

L'apoptose de certaines cellules intestinales

2. Caractéristiques de la bactérie

Autres facteurs de virulence:

Facteurs d’adhésion

Structures spécifiques favorisant la persistance de la bactérie dans le tube digestif continuellement lavé par les fluides intestinaux

Structures d’adhésion au mucus: flagelles ou Fumbriae

Structures d’adhésion aux cellules hôtes: prteines de la couche S, Adhésine Cwp66, Proteine Fbp68

2. Caractéristiques de la bactérie

Autres facteurs de virulence:

Enzymzes hydrolytiques (gélatinases, hyaluronidases…)

facilitent le maintien de la bactérie dans le tube digestif

Les souches les plus virulentes sont les plus protéolytiques dans les modèles animaux.

Autres facteurs de virulence Sécrétion d'autres toxines Toxine binaire ( ADP ribosyl- transférase spécifique de l'actine )

Dépolymérisation de l'actine

Ballonisation des cellules

Aurait un rôle dans la virulence de souches particuliéres

2. Réponse immunitaire de l’hôte

La production d’anticorps (IgG anti-toxine A notamment) serait protectrice

Une bonne réponse humorale pourrait assurer une bonne protection contre les récidives (Kyne et coll- Lancet 2001)

Facteurs de virulence et réponse immunitaire

Le degré de virulence de chaque souche et les différents niveaux de réponse de l'hôte pourraient expliquer les présentations cliniques très variées observées

Le diagnostic biologique : Principes d’utilisation des tests

Respect des indications :

• Patients diarrhéiques

• Facteurs de risque : antibiothérapie < 4 s ( la durée de l'antibiothérapie majore le risque ) ou hospitalisation récente , chimiothérapie , laxatifs , stimulants gastro-intestinaux, tous les facteurs modifiant l'écosystéme ou la motilité intestinale )

Test non effectué

•sur selles solides

• sur écouvillon

Quantité de selles suffisante (au minimum 3 ml )

Généralement un seul prélévement suffit

Inutiles chez les patients asymptomatiques

Test de contrôle pendant ou après le traitement non recommandé

Un test positif sans diarrhée ne nécessite pas de traitement (portage sain)

Taux d’isolement de Clostridium difficile

Diarrhées post antibiotiques : d'autres responsables ?

Staphylococcus aureus Candida Clostridium perfringens Klebsiella Oxytoca

Mise en évidence des toxines

Mise en évidence de Clostridium Difficile

Isolement Dépistage de l'antigéne Ag GDH

Elisa Cytotoxicité PCR

4. Le diagnostic biologique

Selles

Mise en évidence des toxines dans les selles

- Recherche de l'Effet cytopathogéne

- Recherche des toxines

- Recherche par PCR

La technique de référence :Culture cellulaire

Sensibilité 80-90% Spécificité 100% Infrastructure lourde requise

Recherche d' un effet cytopathogène de la toxine B

Après dépôt d’un filtrat

de selles sur les cellules

L’ECP correspond à une

ballonisation des cellules

Recherche de toxines

Test Elisa ou immunochromatographiques utilisant des anticorps monoclonaux dépistant -la toxine A -ou les toxines A et B

En France : 1 à 3% des souches sont Toxine A- B+

Technique rapide : environ 30 minutes Limites des tests :

Spécificité > 97% Sensibilité : 52- 95% (100- 1000 pg de toxines) Faux négatifs

Techniques de biologie moléculaire La PCR : Amplification génétique

Sensibilité (91 à 97%) Spécificité : 100%

Nécessitant un équipement particulier :non réalisable dans les laboratoires classiques

Problème de fiabilité : présence d’inhibiteurs de la réaction dans les prélèvements

Techniques de PCR en temps réel :

Plus rapides et plus fiables

Réalisable dans tous les laboratoires

En développement

Problème de côut

Mise en culture

Ensemencement d'une suspension de la selles sur un milieu contenant:

des inhibiteurs: Cyclosérine Céfoxitine du Taurocholate : permettant la germination de spores ( augmente la

sensibilité de la culture )

Incubation en anaérobiose stricte 48-72 h à 37°C

Aspect en culture

Colonies circulaires à bords irréguliers (3-5 mm), non hémolytiques

- présentant un aspect de verre fritté - odeur caractéristique de crottin de cheval - colonies fluorescentes sous UV

Identification

Equipement enzymatique : Rapid 32A ( bioMérieux )

Inoculum lourd (4 - 5 McF )

Importance de la culture

Manque de sensibilité des tests de recherche de toxine

10 % des infections à Clostridium Difficile ne seraient dépistées que par la culture

Méthodes génotypiques : • PCR-ribotypage•Toxinotypie

Typage des souches recues au CHSA

N° sexe Date pvt origine Toxinotype PCR ribotype Toxine binaire ERY CM MXF5 MTZ1 F 24/05/06 A III O 27 pos 6 12 62 F 18/05/06 A III O 27 pos 6 12 63 M 28/06/06 A XXIV O 27 pos 6 12 64 F 23/06/06 A III O 27 pos 6 6 95 M 12/06/06 A III O 27 pos 6 12 86 M 12/06/06 A III O 27 pos 6 12 67 F 02/09/06 A III "027" pos 6 12 6 338 F 31/08/06 B III "027" pos 6 13 6 329 M 01/09/06 A III "027" pos 6 15 6 28

10 F 26/09/06 C III "027" pos 6 14 10 3611 F 22/09/06 A III "027" pos 6 12 10 3712 F 22/09/06 A III "027" pos 6 13 10 327 F 22/09/06 A III "027" pos 6 12 10 37

13 F 25/06/06 A "027" pos 6 13 6 4614 F 26/09/06 C III "027" pos 6 14 10 3615 M 30/09/06 A "027" pos 6 17 10 3116 F 05/10/06 A "027" pos 6 12 10 3217 ERY : erythromycine

CM : clindamycineMXF : moxifloxacineMTZ : métronidazole

Méthodes génotypiques :• PCR-ribotypage• Toxinotypie• Marqueurs de différenciation des souches isolées

En période épidémique

Démonstrer l'existence de contamination croisée entre patients hospitalisés Analyse des souches en circulation Suivi de l'émergence de nouveau variants Différencier une rechute d'une réinfection en cas d'isolement répété d'un Clostridium Difficile chez un même patient

Typage des souches

4. La sensibilité aux antibiotiques

En pratique courante, les études de sensibilité sont rarement effectuées En effet: ► les traitements habituels sont toujours efficaces (pour l’instant) ► ATBgramme standard (par diffusion en gélose) mal adapté

aux anaérobies stricts

Antibiotiques incriminés

Fréquemment : Clindamycine, Lincomycine, Amoxicilline, Augmentin Céphalosporines, Bactrim

Moins souvent:

Macrolides, Phénicolés, Quinolones, Cotrimoxazole, Rifampicine,Tétracyclines

Jamais Aminosides

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (2)

CéphalosporinesCéfoxitine

MoxalactamFluoroquinolones

Résistance naturelle

AmoxicillinePipéracillineImipénème

GlycopeptidesImidazolés

ErythromycineTétracyclineRifampicine

Chloramphénicol

Habituellement sensible

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (3)

► 3 souches Vanco-R (Dworczynski 1991) ► 3%Souches toxinogénes Vanco-I (Pelaez 1998

► 11% (49/469) de souches R (Pelaez 1998) ►6%Souches toxinogénes metro cmi > 32 ( 415 isolats )(Pelaez 2000) ► 3% de souches non toxinogénes I (Barbut 1999)

Vancomycine

Métronidazole

Vancomycine: 0,25-4 mg/l Métronidazole: 0,25-1 mg/l

CMI

La vancomycine et le métronidazole sont les molécules les plus fréquemment prescrites

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (1)

Rares études disponibles sur la fréquence des résistances

23,764,223

14,5

11,6---

7,58-6

18,522,79,7-

TetracyclinesErythromycineRifampicineChloramphénicol

Barbut 1999Niyogi 1992Levett 1988Delmée 1988

% de résistance de C.difficile aux ATB

Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (4)

Chromosomique transférable (altération du ribosome) Chromosomique transférable (modification du ribosome)Inactivation enzymatique

MacrolidesTétracyclines

Chloramphénicol

Mécanismes de résistanceAntibiotiques

Mécanismes et supports génétiques des résistances

Sensibilité de C.difficile aux quinolones

Ofloxacine , Ciprofloxacine: CMI 8 à 16 mg/l

Levofloxacine : CMI 4 à 8 mg/L

Moxifloxacine : cmi plus basses : 0,5 à 2 mg/lRésistance à la moxifloxacine 12% : étude Allemande ( 1986-2001)

Sensibilité de C.difficile au linézolide

Cmi des souches sensibles : 0,03 à 4 mg/l

Des souches résistantes ont été décrites :

Ackerlman et Coll en 2003 : 23 souches de sensibilité diminuée sur 192 isolats

Résistance associée aux fluoroquinolones et macrolides