Université de Sherbrooke

Effet différentiel de la costimulation par la molécule B7 .2 4+ + sur les lymphocytes T CD versus T CDS .

Par

Jonathan Nicol

Programme d'immunologie

Mémoire présenté à la faculté de médecine en vue de l'obtention du

grade Maître en Science (M.Sc)

Avril 2002

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0-612-7 4490-6

Canada

III

Table des matières

Pages

Table des matières .............................................................. .. m

Liste des tableaux ................................................................. VI

Liste des figures .................................................................. VII

Liste des abréviations, sigles et symboles .................................... IX

Résumé .............................................................................. 2

1. Introduction ..................................................................... 4

1.1 L'activation des lymphocytes T ....................................... 4

1.2 Le système B7 /CD28/CTLA-4 .......................................... 7

1.2.1 <:))28 ••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7

1.2.2 CTLA-4 .................................................................. 9

1.2.3 Les molécules de la famille B7 •••••••••••••••••••••••••••••••.••••••••••• 10

1.3 La tolérance des lymphocytes T ....................................... 12

1.3.1 La tolérance centrale .................................................... 13

1.3.2 La tolérance périphérique ............................................... 13

1.4 Les lymphocytes T cytotoxiques ....................................... 15

1.4.1 Les lymphocytes T CD28+ naïfs, mémoires et effecteurs ••••••••••••.•• 15

IV

1.5 Projet de recherche ..........................................••.......... 20

2. Matériel et Méthodes ...................................................... 23

2.1 Génotype des souris B7.2 trangéniques .............................. 23

2.2 Prélèvement et préparation des organes lymphoïdes .............. 24

2.3 Comptage des cellules .................................................... 25

2.4 Marquages des cellules avec anticorps fluorescents ............... 26

2.5 Perfusion de souris ........................................................ 27

2.6 Tri des lymphocytes T CDS+ par sélection négative sur colonne

magnétique ................................................................. 28

2.7 Extraction de I' ARNm ..............................................•.... 31

2.8 Quantification de I' ARN m ....•...................................••.... 32

2.9 Synthèse du cDNA avec de la SuperScript II ........................ 33

2.10 Conditions de PCR ...................................................... 34

2.11 Électrophorèse sur gel d'agarose .................................... 35

2.12 Marquage du CTLA-4 intracellulaire .............................. 36

2.13 Détection d 'IFNy intracellulaire ..................................... 37

2.14 Déplétion in vivo des lymphocytes T CD4+ ........................ 3S

3. Résultats ....................................................................... 39

3.1 Élimination des lymphocytes B par les cellules T CD4+ et

T CDS+ dans les souris B7.2 transgéniques ......................... 39

V

3.2 Phénotype des lymphocytes B périphériques des souris B7 .2

Tg déficientes en CMH de classe II ................................... 44

3.3 Expansion des lymphocytes T CDS+ dans les souris B7 .2 Tg

déficientes en CMH de classe II ....................................... 47

3.4 Phénotype des lymphocytes T dans les souris B7.2 Tg déficien-

tes au niveau du CMH de classe 1 et CMH de classe II ........... 4S

'>-. + 3.5 Etat fonctionnel des lymphocytes T CDS ........................... 54

3.6 Infiltration des lymphocytes T CDS+ B7.2 Tg, au niveau des

organes ..................................................................... 57

3. 7 Expansion polyclonal des lymphocytes T CDS+ .................... 59

3.S Expansion périphérique des lymphocytes T CDS+ ................ 63

3.9 Expression du CTLA-4 sur les lyphocytes T CDS+ B7.2 Tg ..... 65

3.10 Souris B7.2low déficientes dans l'expression des molécules

du CMH de classe II .................................................. . 67

3.11 Déplétion des lymphocytes T CD4+ chez les souris B7.2 Tg

de la lignée 27 ......................................................... ... 73

4. Discussion et conclusion ................................................. 76

5. Remerciements .............................................................. 93

6. Annexe ......................................................................... 94

7. Références .................................................................... 96

VI

Liste des Tableaux

Pages

Tableau 1. Différents marqueurs de surface retrouvés chez les lymphocytes

T CD8+ au stade naïf, mémoire et effecteur ••••••••••••••••••••••••••• • 19

Tableau 2. Expansion polyclonal des lymphocytes T CDS+ au niveau de la

rate des souris CMH II -/- de la lignée B7.2mod •••••••••••••••••••• •••• 61

Figure 1.

Figure 2.

Figure 3.

Figure 4.

Figure 5.

Figure 6.

Figure 7.

Figure 8.

VII

Liste des Figures

Pages Différentes molécules impliquées dans la formation de la synapse immune ........................................................ 6

Montage de la colonne magnétique pour déplétion des lymphocytes B chez les souris CMH II-/- de la lignée B7.2mod ••••••• 30

Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T au niveau de la moelle osseuse ................................................... 41

Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T au niveau de la rate ................................................................ 42

Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T au niveau des ganglions périphériques ............................................ 43

Profil représentatif des lymphocytes B au niveau de la rate chez les souris CMH Il-/- de la lignée B7.2mod ••••.••••••••••••••• •.• 45

Profil représentaif des lymphocytes B au niveau des ganglions périphériques chez les souris CMH Il-/- de la lignée B7.2mod •••••••• .46

Phénotype représentatif des lymphocytes T CD4+ de la rate des souris CMH I -/-de la lignée B7.2mod ••••••••••••••••••••••••••••• •••• 51

Figure 9. Phénotype représentatif des lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH Il -/- de la lignée B7 .2mod ••••••••••••••••••••••••••••• ••• 52

Figure 10. Phénotype représentatif des lymphocytes T CDS+ des ganglions périphériques des souris CMH Il-/- de la lignée B7.2mod •••.••••• •••• 53

Figure 11. RT-PCR (perforine, FasL, Granzyme B, INFy et GAPDH) sur les lymphocytes T CDS+ de la rate, trié par sélection négative sur colonne magnétique, des souris CMH Il-/- de la lignée B7.2mod •••••• 55

Figure 12. Profil représentatif de la détection d'IFNy intracellulaire chez les lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II-/- de la lignée B7 .2mod ............................................................... 56

VIII

Figure 13. Détection de CDS par RT-PCR sur différents organes des souris CMH II-/- de la lign.ée B7.2mod .. ................................. .... 58

Figure 14. Expression des chaînes Vps chez les lymphocytes T CDS+ dans la rate des souris CMH II-/- de la lign.ée B7.2mod •••••••••••••••••••••••• 62

Figure 15. Profil représentatif des lymphocytes T CD4+ et des lymphocytes T CDS+ dans le thymus des souris CMH II-/- de la lign.ée B7.2mod ••• 64

Figure 16. Profil représentatif de l'expression du CTLA-4 sur les lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II-/- de la lign.ée B7.2mod ••••••••• 66

Figure 1 7. Analyse du nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CDS+ au niveau de la rate chez les souris CMH II -/- de la lign.ée B7 .2low ................................................................ 69

Figure 18. Phénotype représentatif des lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II -/- de la lign.ée B7 .2low ••••••••••••••••••••••••••••••••• 70

Figure 19. Profil représentatif de la détection d 'IFNy intracellulaire chez les lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II -/- de la lign.ée B7.2lo\V ...••.•••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••.••.••..•.•.••••••• 71

Figure 20. Profil représentatif de l'expression du CTLA-4 sur les lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II -/- de la lign.ée B7 .2low ••••••••• 72

Figure 21. Phénotype représentatif des lymphocytes T des souris B7 .2mod suite à la déplétion in vivo des lymphocytes T CD4+ •••••••••••••••••••••••• 75

Figure 22. Modèle hypothétique du rôle des lymphocytes T CD4+, CD25+ immu-norégulateurs dans la tolérance périphérique suite à l'activation des lymphocytes T CDS+ des souris B7.2Tg face à des peptides du soi ••••• 87

Figure 23. Modèle hypothétique de l'effet différentiel de la liaison de la molécule B7 .2 exprimée chez les lymphocytes T avec leurs récepteurs le CD28 et le CTLA-4 ........................................................... 90

ADCC:

ADN: ARNm: B7.2low: B7.2mod: B7.2hi: BCR: BSA: CD: cDNA: CMH: CPA: CTLA-4:

Ctrl: Cyc: D.O: FasL: Pacs: Fe: FITC: IL: PBS: PCR: PE: PFA: rpm: SA: SNC: TCR: Tg: Th: vp:

IX

Liste des abréviations, sigles et symboles

Cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante d'anticorps (antibody-dependant cell-mediated cytotoxicity) Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique messager B7.2 exprimé faiblement B7.2 exprimé modérément B 7 .2 exprimé modérément à fortement Récepteur des cellules B (B cell receptor) Albumine sérique bovine Groupe de différentiation ( cluster differentiation) Acide désoxyribonucléique complémentaire Complexe majeur d'histocompatibilité Cellule présentatrice d'antigènes Antigène 4 associé au lymphocyte T cytotoxique ( cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4) Contrôle Cychrome Densité optique Fas ligand Fascan Portion constante de la chaîne lourde des immunoglobulines Fluorescéine isothiocyanate Interleukine Tampon phosphate/saline Réaction de polymérase en châme (PCR) Phyto-érythrine Paraformaldéhydes Révolution par minute Streptavidine Système nerveux central Récepteur des cellules T (T cell receptor) Transgénique Lymphocyte T auxiliaire Chaîne variable beta du TCR

Université de Sherbrooke

Effet différentiel de la costimulation par la molécule B7 .2 + + sur les lymphocytes T CD4 versus T CDS .

Par Jonathan Nicol

Programme d'immunologie

Mémoire présenté à la faculté de médecine en vue de l'obtention du grade Maître en Science (M.Sc)

Résumé

Dans le but de mieux comprendre le rôle in vivo de la molécule B7.2 dans la réponse

immune, un modèle de souris transgénique (Tg) exprimant de façon constitutive B7.2 sur

les lymphocytes B et T a été généré. Il a été démontré que l'expression constitutive de

B7.2 sur les lymphocytes B mène à leur élimination par les lymphocytes T (Fournier et

al.,1997; Van Parijs., et al 1997). Afin de déterminer quelle population de lymphocyte T

(T CD4+ et/ou T CD8l est responsable de l'élimination des lymphocytes B exprimant de

façon constitutive la molécule B7.2, nous avons généré des souris B7.2 Tg déficientes en

lymphocytes T CD4+ (CMH II déficientes) et déficientes en lymphocytes T CD8+

(CMH 1 déficientes). Nos analyses ont démontré, que les deux populations de

lymphocytes T sont capables d'éliminer les lymphocytes B B7.2Tg malgré une plus

grande efficacité d'élimination pour les lymphocytes T CD4+. Un phénomène très

intéressant a été observé uniquement chez les souris B7 .2Tg déficientes au niveau du

CMH Il. Chez ces souris, les lymphocytes T CD8+ subissent une grande expansion dans

3

les organes lymphoïdes périphériques (la moelle osseuse, la rate et les ganglions

périphériques). Cette expansion n'est pas apparente au niveau du thymus suggérant que

ce phénomène est un événement post-thymique. Dans la rate, l'expansion est

accompagnée par un phénotype mémoire pour la quasi totalité des lymphocytes T CDS+

soit :CD44élevé, CD62-Lfaible, CD45RBmodéré et IL-2Rl3modéré. On observe également une

diminution de l'expression du CDS, TCR, et du CD2S. L'analyse de l'expression des

chaînes V(3s du TCR démontre qu'il s'agit d'une expansion polyclonale favorisant

certains clones comme le Vl3 8.3. Ces lymphocytes T CD8+ possèdent également tout le

bagage cytotoxique comme retrouvé chez des cellules effectrices. De plus, on retrouve de

l'infiltration de lymphocytes T CD8+ au niveau du système nerveux central (SNC).

Finalement, d'autres analyses nous démontrent que l'expansion des lymphocytes T CD8+

est due à l'expression de la molécule B7.2 sur les lymphocytes T CDS+, plutôt que de

l'élimination des lymphocytes B. Tous les phénomènes décrits chez les lymphocytes T

CD8+ des souris B7.2Tg, CMH II déficientes sont absents chez les lymphocytes T CD4+

des souris B7.2Tg, CMH 1 déficientes. Ces résultats nous portent donc à croire qu'il

pourrait exister un effet différentiel suite à la costimulation par la molécule B7.2 chez les

lymphocytes T CDS+ vs T CD4+ et que la stimulation dépendante de B7 .2/(CD2S/CTLA-

4) pourrait jouer un rôle important dans l'homéostatie des lymphocytes T CD8+ en

périphérie.

4

1. Introduction

1.1 L'activation des lymphocytes T

Le développement d'une réponse immunitaire adaptative efficace requiert l'activation

complète des lymphocytes T. Le récepteur à l'antigène du lymphocyte T (TCR) doit

reconnaître un peptide antigénique présenté en association avec une molécule du

complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). L'engagement du TCR au complexe

peptide antigénique/CMH n'est pas suffisant pour induire la prolifération et le

développement des fonctions effectrices des lymphocytes T naïfs. L'activation complète

des lymphocytes T nécessite un deuxième signal, dit de costimulation (Schwartz, 1990).

Ce signal de costimulation provient de la liaison de molécules exprimées à la surface des

cellules présentatrices d'antigène (CPA) avec leurs récepteurs présents à la surface des

lymphocytes T. Les deux signaux sont acheminés ainsi aux lymphocytes T dans le

contexte de la synapse immune (Figure 1) (Grakoui et al., 1999) et permettent une

activation complète des lymphocytes T. Lorsqu'un lymphocyte T est stimulé via son

TCR en absence de signal de costimulation, il devient anergique, c'est à dire qu'il est

incapable de proliférer et de se différencier en cellule effectrice, même s'il est stimulé de

nouveau dans des conditions optimales (Mueller et al., 1989). Le récepteur de

costimulation le mieux caractérisé des lymphocytes T naïfs est le CD28 (Greenfield et al.,

1998). D'autres molécules exprimées à la surface des lymphocytes T ont aussi des

propriétés de costimulation (Watts et DeBenedette 1999). Plusieurs de ces molécules,

telles que ICOS, 41BB et OX-40, sont exprimées après activation des lymphocytes T, ce

5

qui indique que, contrairement au CD28, ces récepteurs interviennent plus tard au cours

de la réponse immune plutôt que lors de l'initiation de l'activation des lymphocytes T

naïfs.

LFA-1 (CD11a/CD18)

Antlgen pr.!Méntl ng ceu

Pepttde HC complex

6

Figure 1 : Différentes molécules impliquées dans la formation de la synapse immune

(Malissen 1999).

7

1.2 Le système B7/CD28/CTLA-4

Le récepteur de costimulation CD28 possède deux ligands, B7.1 (CD80) et B7.2

(CD86), qui sont exprimés de façon prépondérante mais non exclusive à la surface des

cellules spécialisées dans la présentation de l'antigène (les cellules dendritiques, les

macrophages, les monocytes et les lymphocytes B activés) (Lenschow et al., 1996). Au

début des années 1990, une autre molécule appelée antigène 4 associé au lymphocyte T

cytotoxique (CTLA-4), a été identifiée à la surface des lymphocytes T activés (Balzano

et al., 1992). Cette molécule présente 31 % d'homologie avec le CD28, et tout comme le

CD28, elle possède comme ligand les molécules B7.1 et B7.2 (Lenschow et al., 1996).

Comme nous l'exposerons dans les sections suivantes, les molécules B7.l, B7.2, CD28 et

CTLA-4 forment un système de récepteurs/ligands qui est impliqué dans la régulation de

l'activation des lymphocytes T.

1.2.1 CD28

La molécule CD28 est exprimée de façon constitutive sur 95% des lymphocytes T

CD4+ naïfs et sur 50 % des T CDS+ naïfs chez l'humain (June et al., 1994), mais chez la

souris, presque 100% des lymphocytes T possèdent le récepteur CD28 (Gross et al.,

1990). Ce récepteur transmet un signal positif d'activation des lymphocytes T seulement

lorsque ce dernier reçoit un signal via son TCR. Cependant quelques études ont rapporté

que le CD28 pourrait transmettre des signaux intracellulaires en absence de stimulation

via le TCR (Seifken et al., 1998). Les signaux intracellulaires transmis par le CD28

·8

conduisent à plusieurs altérations physiologiques dans les lymphocytes T : ils préviennent

!'anergie, par l'augmentation de l'expression de molécules anti-apoptotiques comme Bcl-

XL (Boise et al., 1995), ils augmentent l'expression d'interleukine 2 (IL-2), par leurs

effets sur la transcription du gène de IL-2 et la stabilisation de son acide ribonucléique

messager (ARNm), même chose pour l'IL-2R, le CD40L, certaines cytokines (IFNy,

GM-CSF, et TNFa) ainsi que plusieurs protéines du cycle cellulaire (Thompson et al.,

1989; Gimmi et al., 1991; Fraser et Weiss 1992). Donc les signaux transmis par le CD28

sont nécessaires pour maintenir en vie et promouvoir la prolifération et la différentiation

des lymphocytes T dont le TCR a reconnu un peptide antigénique. L'importance du

CD28 dans l'initiation de l'activation des lymphocytes T a également été démontrée in

vivo. Par exemple, on a montré dans plusieurs systèmes expérimentaux que si on

empêche l'interaction du CD28 avec ses ligands, on peut inhiber la réponse humorale,

prolonger la survie des greffes et supprimer le développement de plusieurs maladies

autoimmunes (Lenschow et al., 1996). De plus, les souris qui ont une délétion du gène

codant pour le CD28 ne peuvent pas développer une réponse immunitaire adaptative

efficace contre les antigènes protéiques, et certains virus. Une des raisons est la

diminution de la survie des lymphocytes T, impliquant une perte d'efficacité dans la

génération d'une réponse mémoire (Dahl et al., 2000). De plus, on note l'absence de

centres germinatifs au niveau de la rate, ce qui suggère une déficience dans l'interaction

entre les lymphocytes T et les lymphocytes B (Samson 2000).

9

1.2.2 C::'fl.,A-4

Contrairement au CD2S, le CTLA-4 est un régulateur négatif de l'activation des

lymphocytes T (Waterhouse et al., 1996). Il n'est pas exprimé de façon constitutive chez

les lymphocytes T naïfs, mais son expression est induite chez les lymphocytes T CD4+ et

T CDS+, 24 à 4S heures suivant l'activation (Freeman et al., 1992). Il a été démontré chez

les lymphocytes T activés, que le CTLA-4 circulerait de la membrane vers le cytoplasme

à l'intérieur de vésicules et que la majorité de ce CTLA-4 se retrouve principalement de

façon intracellulaire (Leung et al., 1995). Le CTLA-4 joue également un rôle essentiel

dans la régulation de la tolérance face aux molécules du soi. En effet, des souris

déficientes en CTLA-4 meurent 2 à 3 semaines suivant la naissance suite à des maladies

autoimmunes comme une myocardite, une pancréatite et la destruction de plusieurs

organes (Tivol et al., 1995; Waterhouse et al., 1995). Une des caractéristiques des souris

déficientes en CTLA-4, est la grande lymphoprolifération des lymphocytes T CD4+ et des

lymphocytes T CDS+ accompagnée par un débalancement dans le ratio lymphocytes T

CD4+/T CDS+, le ratio passant 2 :1, 3 :1 à 6 :1 allant même jusqu'à 20 :1 (Chambers et

al., 1997). Ceci suggère un effet différentiel de la signalisation via le CTLA-4 chez les

lymphocytes T CD4+ versus les lymphocytes T CDS+. Le CTLA-4 serait très important

dans la régulation négative de la réponse primaire et secondaire des lymphocytes T CD4+

(Chambers et al., 1999) tandis que, son implication dans la régulation négative des

lymphocytes T CDS+ serait seulement lors d'une deuxième rencontre avec l'antigène

(Chambers et al., 199S).

10

1.2.3 Les molécules de la famille B7

B7.1 et B7.2 sont les deux membres de cette famille ayant été décrits comme liant

les molécules CD28 et CTLA-4. Ils ont 25% d'homologie entre eux et font partie de la

superfamille des immunoglobulines (Freeman et al.,1993). Leur affinité pour la molécule

CTLA-4 étant d'au moins 20 fois supérieure à celle pour le CD28 (Linsley et al., 1991).

B7.1 et B7.2 sont exprimés sur les CPA mais à des niveaux différents suivant l'activation

ou non de ces cellules. Chez la plupart des CP A non-activées, on ne retrouve pas

d'expression de la molécule B7.1 mais on retrouve une faible expression constitutive de

la molécule B7.2 (Harris et Ronchese 1999). De plus, la cinétique d'expression des

molécules B7.l et B7.2 est très différente. En général, la molécule B7.2 apparaît

beaucoup plus rapidement et à des niveaux beaucoup plus élevés que la molécule B7.l.

L'expression de la molécule B7.2 sur les lymphocytes B est maximale entre 18 et 24

heures suivant l'activation, tandis que pour la molécule B7.1, on doit attendre de 48 à 72

heures pour une expression maximale (Hathcock et al., 1994). L'expression des

molécules B7.1 et B7.2 ne se limite pas aux CPA. On retrouve de faibles quantités de

B7.2 exprimés de façon constitutive à la surface de lymphocytes T naïfs chez la souris.

L'expression de B7.2 augmente suivant l'activation des cellules T (Greenfield et al.,

1997). Pour ce qui est de B7 .1 on le retrouve à la surface des lymphocytes T seulement

après activation (Azuma et al., 1993). Plusieurs hypothèses tant qu'au rôle des molécules

de la famille B7 ont été suggérées. Une de ces hypothèse est que les lymphocytes T

auraient également un rôle de CP A, ce qui expliquerait la présence de molécules de

costimulation à leur surface cellulaire (Prabhu Das et al., 1995; Hakamada-Taguchi et al.,

11

1998; Schweitzer et Sharpe 1999). D'autres auteurs suggèrent que la présence de B7.2

sur les lymphocytes T aurait plutôt un effet inhibiteur de l'activation en liant

préférentiellement la molécule CTLA-4 (Greenfield et al., 1997; Hollsberg et al., 1997).

Finalement, une étude plus récente a démontré que l'acquisition de la molécule B7.1 par

les lymphocytes Trend ces derniers capables d'agir comme CPA, tandis que l'acquisition

de la même molécule par les lymphocytes T mémoires conduit à l'apoptose lorsqu'il y a

augmentation du signal 1 suite à la liaison du TCR. La molécule B7.l chez les

lymphocytes T pourrait donc jouer un rôle immunostimulateur ou immunorégulateur

dépendant de la maturité de la population des lymphocytes T qui l'exprime (Sabzevari et

al., 2001). Une autre différence marquée entre B7.1 et B7.2 est au niveau de la queue

cytoplasmique. B 7 .1 possède une très petite queue cytoplasmique tandis que B 7 .2

possède une queue beaucoup plus longue. La partie intracellulaire du B7 .2 contient trois

sites potentiels de phosphorylation (Freeman et al., 1993). Jusqu'à présent il y a peu

d'études sur la signalisation potentielle des molécules B7.1 et B7.2, mais deux études

semblent démontrer que la liaison de B7.2 sur les lymphocytes B n'est pas un événement

sans conséquences. Il semble en effet que, suite à la liaison du récepteur des cellules B

(BCR) et de B7.2, il y aurait une augmentation de la sécrétion de IgGl ainsi que de IgE

(Kasprowicz et al., 2000). De même, la signalisation via IL-4 et IL-13 chez les

lymphocytes B additionnée à la liaison du CD40, CD21 et du B7.2 induiraient

l'augmentation d'expression des immunoglobuline IgE et IgG4 (Jeannin et al., 1997). Il

est maintenant établi que B7.l et B7.2 interagissent avec le CD28 et le CTLA-4. Par

contre, il n'est pas encore clair comment ces liaisons influencent le devenir des

lymphocytes T en périphérie suite à la liaison de leurs TCR. Mais les études effectuées

12

avec des souris déficientes au niveau de B7.1 et/ou B7.2, nous indiquent que B7.2 serait

le ligand majeur pour le CD28 dans l'initiation de la réponse des lymphocytes T (Harris

et Ronchese 1999).

1.3 La tolérance des lymphocytes T

La tolérance se définit comme un état de non réponse du système immunitaire

face aux antigènes du soi. C'est une caractéristique essentielle du système immunitaire.

Lorsqu'il y a perte des mécanismes de tolérance, les cellules immunitaires peuvent

s'attaquer à nos propres tissus et causer des maladies autoimmunes. Un bon exemple de

maladie autoimmune est le diabète insulinodépendant. Cette maladie autoimmunue est

caractérisée par la destruction des cellules p productrices d'insuline situées dans les îlots

de Langerhans à l'intérieur du pancréas. La destruction des cellules p est liée à l'action

cytotoxique des lymphocytes T CDS+ et à la cytotoxicité à médiation cellulaire

dépendante d'anticorps (l'ADCC) (Tisch et McDevitt, 1996). Il s'agit donc dans ce cas

de la destruction de nos propres cellules causée par une réponse humorale et cellulaire

face à des antigènes du soi. Il est alors important de posséder des mécanismes de

tolérance fonctionnels pour éviter l'attaque par notre système immunitaire de nos propres

cellules. La tolérance agit à deux niveaux: lors du développement des lymphocytes T

dans le thymus (tolérance centrale) et, en périphérie, lorsque les lymphocytes T ont

atteint le stade mature (tolérance périphérique).

13

1.3.1 La tolérance centrale

Avant de se retrouver en circulation, les lymphocytes T subissent un processus de

maturation dans le thymus. Lors de cette maturation, plus de 98% des thymocytes sont

éliminés par apoptose (Von Boehmer, 1992). Cette élimination est nécessaire pour

développer un répertoire de lymphocytes T fonctionnels et ne présentant pas

d'autoréactivité avec les molécules du soi. Le mécanisme de tolérance au niveau du

thymus s'appelle la délétion clonale (Heath et al., 1996). Lors de la sélection positive et

négative, seulement les thymocytes ayant un TCR fonctionnel et ne reconnaissant pas

avec une trop grande avidité les peptides du soi survivent et atteignent la circulation. Un

thymocyte dont le TCR ne reconnaît pas de molécules du CMH présentant des peptides

du soi sera éliminé. Il s'agit de la sélection positive. Par contre, un thymocyte dont le

TCR reconnaît avec une trop forte avidité le complexe CMH/peptide du soi sera éliminé

par apoptose. C'est la sélection négative. L'avidité est la somme de la force de liaison

entre le ligand et le récepteur (affinité) et la densité du ligand (Oehen et al., 1996).

1.3.2 La tolérance périphérique

Malgré la délétion clonale, il y a en circulation des lymphocytes T matures qui

reconnaissent les molécules du soi (Stockinger, 1999). L'origine de ces lymphocytes peut

s'expliquer de plusieurs façons. Premièrement, ce ne sont pas tous les peptides du soi qui

sont présentés dans les thymus, et/ou certains peptides du soi sont présentés à de trop

faibles niveaux dans le thymus pour induire la tolérance (Ohashi et al., 1991). Une autre

14

raison pour expliquer la présence d'autoimmunité est la mimicrie moléculaire faite par

certains peptides viraux. En effet, certains peptides viraux miment des peptides du soi et

induisent l'activation des lymphocytes T face à leurs propres cellules (Karlsen et Dyrberg

1998; Farris et al., 2000). Pour toutes ces raisons, des mécanismes de tolérance

périphérique sont indispensables. Un premier mécanisme de tolérance périphérique est

l'ignorance immunologique. Ce mécanisme est basé sur le fait que certains lymphocytes

T naïfs en circulation reconnaissent les antigènes du soi, mais avec une trop faible

avidité. En conséquence, ils ne sont pas normalement activés et ils ignorent les antigènes

rencontrés (Stockinger, 1999). Un second mécanisme est l' anergie. Lorsqu'un

lymphocyte T naïf rencontre un antigène en périphérie via son TCR en absence de

signaux de costimulation, il devient anergique (Mueller et al., 1989 ; LaSalle et Rafler,

1994). Un dernier mécanisme impliquerait la participation de cellules suppressives, dont

un type cellulaire a été récemment identifié. Ces cellules suppressives sont les

lymphocytes T CD4+ immunorégulateur ayant comme phénotype CD25+. Ces

lymphocytes T représentent de 5 à 10% des lymphocytes T CD4+ retrouvés dans les

organes lymphoïdes secondaires. Ils auraient comme fonction d'inhiber la production de

IL-2 (Thorton et Shevach, 1998), et de diminuer l'expression de molécules de

costimulation à la surface des cellules dendritiques (Cederbom et al., 2000). Plusieurs

hypothèses non exclusives expliqueraient leurs modes d'action dans la tolérance. En

effet, des évidences semblent démontrer que les lymphocytes T immunorégulateurs

agiraient par contact cellules/cellules (Tak:ahashi et al., 2000) ou par la secrétion de

cytokines comme IL-4 (Zhai et Kupiec-Weglinski, 1999), IL-10 (Asseman et al., 1999) et

TGF~ (Powrie et al., 1996). Un exemple concret de l'utilité des lymphocytes T CD4+

15

CD25+ dans le contrôle de l'autoimmunité a été observé entre autre au niveau du diabète

autoimmun (Salomon et al., 2000). Malgré l'importance que peuvent avoir les

lymphocytes T immunorégulateurs au niveau de l' autoimmunité, leur déplétion peut

quand même avoir des effets positifs. C'est effectivement le cas au niveau de la réponse

immune anti-tumorale. La déplétion des cellules immunorégulatrices induit une réponse

immune suite à la stimulation avec des antigènes de faible avidité comme on retrouve au

niveau des cellules tumorales. Ceci permet une réponse immune spécifique aux antigènes

tumoraux (Shimizu et al., 1999).

1.4 Les lymphocytes T cytotoxiques

Les lymphocytes T cytotoxiques expriment le co-récepteur CD8. Les lymphocytes T

CD8+ répondent aux peptides antigéniques présentés dans le contexte d'un CMH de

classe 1. Ces peptides antigéniques dérivent principalement de pathogènes qui se

multiplient à l'intérieur des cellules, comme les virus et certaines bactéries

intracellulaires (Watts et Powis, 1999). Récemment, il a été démontré que le CMH I

pouvait également présenter des peptides provenant de vésicules d'endocytoses

(Kleijmeer et al., 2001; Norbury et al., 2001). Le principal rôle des lymphocytes T CD8+

dans la défense immunitaire est l'induction de l'apoptose des cellules infectées. Les

fonctions effectrices des cellules T cytotoxiques peuvent être médiées de deux façons :

par l'expression de récepteurs de surface et par la sécrétion de médiateurs cytotoxiques

(Berke, 1995). Un récepteur connu dans l'induction de l'apoptose par les cellules T CD8+

est le Fas ligand (FasL). Le FasL est exprimé à la surface des lymphocytes T CD8+ suite

16

à leur activation; il fait partie de la famille des récepteurs du TNF. La liaison du FasL

avec son récepteur, le Fas, induit un signal apoptotique au niveau de la cellule infectée

(Nagata et Golstein, 1995). Les lymphocytes T CD8+ activés produisent également des

granules contenant des protéines cytotoxiques comme la perforine et les granzymes. Ces

granules sont libérées par exocytose dirigée lors de la reconnaissance de l'antigène sur la

cellule cible. La perforine agit en se polymérisant au travers de la membrane

cytoplasmique et formant ainsi un pore (Browne et al., 1999). Lorsqu'une grande quantité

de pores sont formés, la membrane perd son intégrité cytoplasmique et laisse entrer

rapidement de l'eau et des sels pouvant provoquer la mort de la cellule. Mais le rôle

principal des pores formés par la perforine est de faciliter l'entrée dans la cellule des

granzymes. Les granzymes sont un groupe de sérine-protéases capable d'induire

l'apoptose chez les cellules cibles (Shi et al., 1992). Finalement, les lymphocytes T

cytotoxiques peuvent sécréter des cytokines comme l'IFN-y et le TNF-a. L'IFN-y a un

effet inhibiteur sur la réplication viral (Farrar et Schreiber, 1993). Il induit une

augmentation de l'expression des molécules CMH I, ce qui augmente la chance qu'une

cellule infectée soit reconnue et éliminée. Il active les macrophages à la fois comme

cellules effectrices et comme CPA. Le TNF-a joue également un rôle dans l'activation

des macrophages (Stout, 1993).

1.4.1 Les lymphocytes T CDS+ naïfs, mémoires et effecteurs

Pour débuter cette section il est important de définir l'origine des lymphocytes T

cytotoxiques. Lors d'une réponse immune primaire face à un antigène, les cellules T

17

naïves qui ont un TCR de haute affinité pour l'antigène et qui reçoivent un signal de

costimulation se différencient en lymphocytes T CD8+ effecteurs. La plupart des cellules

effectrices vont mourir par apoptose suite à l'élimination de l'antigène, mais celles qui

survivront à cette apoptose vont se différencier en lymphocytes T CD8+ mémoires

(Opferman et. al., 1999). Il existe plusieurs différences entre un lymphocyte T

cytotoxique naïf, mémoire et effecteur. Premièrement, les marqueurs de surfaces de ces

cellules sont bien différents (tableau 1). Deuxièment, les signaux requis pour la survie

des lymphocytes T cytotoxiques aux différents stades ne sont pas identiques. Pour qu'un

lymphocyte T CD8+ naïf puisse survivre en périphérie, cela nécessite un contact

continuel entre son TCR et un CMH 1 présentant un antigène du soi de faible affinité,

comme le signal impliqué dans la sélection positive au niveau du thymus (Tanchot et al.,

1997). La survie d'un lymphocyte T mémoire ne semble pas nécessité un signal continu

via le TCR (Murali-Krishna et al., 2000), mais pourrait dépendre de cytokines comme IL-

15 (Lodoice et al., 1998; Ku et al., 2000). Également, les lymphocytes T mémoires

répondent beaucoup plus rapidement à une stimulation antigénique qu'un lymphocyte T

naïf. Une raison évoquée serait que les cellules T mémoires demeurent en phase G 1

tardive et même une faible population serait en phase S/G2+M du cycle cellulaire (V eiga-

Femandes et al., 2000). Ces cellules expriment de hauts niveaux d' ARNm et sont ainsi

capables de répondre beaucoup plus rapidement lors de la rencontre de l'antigène (Veiga-

Femandes et al., 2000). Il semble aussi que les lymphocytes T CD8+ naïfs ne possèdent

qu'une seule fonction effectrice, tandis que les lymphocytes T mémoires peuvent en

posséder plusieurs. Finalement, une grande différence entre les lymphocytes T CD8+

naïfs, effecteurs et mémoires est leur localisation. En effet, les lymphocytes T naïfs se

18

retrouvent très rarement dans les tissus périphériques, leur répartition étant largement

limitée aux organes lymphoïdes secondaires. Les lymphocytes T effecteurs et mémoires

ont pour leur part la possibilité de migrer au site d'infection et effectuer leurs fonctions

cytotoxiques (Austraup et.al., 1997).

19

Tableau 1. Différents marqueurs de surfaces retrouvés chez les lymphocytes T CD8+ au

stade naïf, mémoire et effecteur (Dutton et al. , 1998).

Marqueur

CD44

CD45RB

CD62-L

IL-2R~

IL-2Ra

CD69

+/- : Faible + : Modéré ++: Élevé

(

T CDS+ Naïfs

+/-

++

++

+/-

+/-

+/-

T CDS+ mémoires

++

+

+/-

+

+

+/-

+ T CDS effecteurs

++

+

+/-

+

++

++

20

1.5 Projet de recherche

Afin de mieux comprendre le rôle in vivo de la molécule B7 .2, des souns

exprimant de façon constitutive cette molécule sur les lymphocytes B et T ont été

générées grâce à la technique de la transgénèse. Le transgène B7.2 utilisé contient le

promoteur d'une molécule du CMH de classe 1 (H2-Kb) et une séquence« enhancer »de

la chaîne lourdeµ des immunoglobulines connue pour diriger l'expression de transgènes

dans les lymphocytes B et T. Trois lignées transgéniques indépendantes ont été obtenues

dans lesquelles B7.2 est exprimée à des niveaux faibles (lignée B7.2low), modérés

(lignée B7.2mod) ou modérés à élevés (lignée B7.2hi). Dans ces trois lignées, B7.2 est

exprimé de façon similaire à des niveaux élevés sur les lymphocytes T. Ces souris B7.2

transgéniques ont été générées originellement dans le but de vérifier l'hypothèse selon

laquelle une expression constitutive élevée du ligand de costimulation B7.2 sur des

lymphocytes B serait suffisante pour induire l'activation de lymphocytes T auxiliaires

(Th) auto-réactifs et conduire au développement de maladies autoimmunes systémiques.

Contrairement à toute attente, ce système transgénique a révélé que l'expression

constitutive de B7.2 sur les lymphocytes B qui se développent dans la moelle osseuse

conduit à leur élimination. Ce résultat inattendu a été confirmé par un autre groupe de

recherche qui a aussi produit des souris transgéniques exprimant B7.2 de façon

constitutive sur les lymphocytes B (Van Parijs et al., 1997). Les lymphocytes T sont

responsables de l'élimination des lymphocytes B qui se produit dans les souris des

lignées trangéniques B7.2mod et B7.2hi et cette élimination requiert l'expression de la

molécule CD28 (Fournier et al., 1997). Des observations rapportées dans la littérature

21

suggèrent que l'interaction entre CD28 et ses ligands pourraient avoir des effets différents

sur les lymphocytes T CD4+ et CD8+ (Yu et al., 2000). Le but de notre projet de

recherche était de déterminer si l'élimination des lymphocytes B dans les souris

transgéniques B7.2mod et B7.2hi était due à une interaction avec les lymphocytes T

CD4+ et/ou CD8+ et si cette interaction résultait en un effet différentiel sur ces deux types

de lymphocytes T. Dans ce but, nous avons généré des souris B7.2 transgéniques qui

sont déficientes au niveau de l'expression des molécules du C:MH de classe 1 ou de classe

Il. Les souris qui ont une délétion dans le gène qui code pour la molécule P-2

micro globuline sont déficientes dans l'expression des molécules du CMH de classe 1

(Zijlstra et al., 1990). À cause de cette déficience, les lymphocytes CD8+ ne sont pas

positivement sélectionnés dans le thymus et très peu de lymphocytes T CD8+ matures

sont produits. Dans les souris B7.2 transgéniques qui ont aussi une délétion du gène qui

code pour la molécule P-2 microglobuline, nous avons pu étudier l'effet de la molécule

B7.2 in vivo sur les lymphocytes T CD4+. D'autre part, les souris de H-2b qui ont une

délétion dans le gène qui code pour la chaîne p de la molécule du CMH de classe Il 1-A

sont déficientes dans l'expression des molécules du CMH de classe II (Cosgrove et al.,

1991; Grusby et al., 1991), puisque dans la souche génétique H-2b l'autre molécule du

CMH de classe II, 1-E, n'est pas exprimée (Grusby et al., 1991). Dans ces souris

mutantes, les lymphocytes CD4+ ne sont pas positivement sélectionnés dans le thymus et

très peu de lymphocytes T CD4+ matures sont produits. Donc, les souris B7.2

trangéniques qui ont aussi une délétion du gène qui code pour la chaîne p de la molécule

1-A, nous ont permis d'étudier l'effet de la molécule B7.2 in vivo sur les lymphocytes T

CD8+. L'étude de ces souris démontre que les deux types de lymphocytes T sont capables

22

d'éliminer les lymphocytes B qui expriment de façon constitutive la molécule B7.2. Par

contre, les lymphocytes T CD4+ sont beaucoup plus efficaces que les lymphocytes T

CD8+. De plus, notre analyse a permis de révéler un effet différentiel de l'expression de

la molécule B7.2 à la surface des lymphocytes T sur l'activation des lymphocytes T

CD8+.

23

2. Matériel et Méthodes

2.1 Génotype des souris B7 .2 Tg

L'étape la plus critique dans les expériences qui ont été réalisées est

l'identification des souris possédant le transgène B7.2. Pour ce faire, on récolte suite à

une coupure sur la queue de la souris environ 5 gouttes de sang qui sont déposées dans un

tube de Facs contenant contenant 1 ml d'une solution d' Alsevier (dextrose 114 mM,

citrate de sodium dihydrate et NaCl 27 mM) le tout ajusté à pH 6.1. Cette solution

empêche la coagulation des globules rouges. On dépose dans le fond du tube de Facs

environ lml de Ficoll (Pharmacia) à l'aide d'une seringue. On centrifuge le tout à 1600

révolutions par minute (rpm), pendant 20 minutes, à la température de la pièce et on

s'assure que le frein n'est pas engagé sur la centrifugeuse. À partir de cette étape on doit

garder les échantillons sur la glace. On transfère l'anneau de lymphocytes dans un

nouveau tube contenant 3 ml de la solution Facs. La solution de Facs est constituée de :

(PBS lX) tampon phosphate/saline (NaCl 150 mM, NaH2P04 2 mM, Na2HP04 8 mM) et

de 2% de sérum bovin. On centrifuge les échantillons 5 minutes, à 1600 rpm et à 4°C.

On retire le surnageant par inversion du tube, on ajoute 1 ml de tampon de lyse des

globules rouges ( 90ml de 0.16 M NH4Cl et lOml de 0.17 M Tris ajusté à pH 7.2) et on

agite le tout au vortex avant de centrifuger de nouveau 5 minutes à 1600 rpm et à 4°C. On

élimine de nouveau le surnageant par inversion et on lave les cellules avec de la solution

Facs et on centrifuge aux mêmes conditions. On est ensuite prêt à marquer les cellules

avec un anticorps anti-B7.2 marqué à la fluorescéine isothiocyanate (FITC) avant d'aller

24

acquérir les données au cytomètre de flux et identifier les souris B7.2Tg des souris

contrôles (Ctrl).

2.2 Prélèvement et préparation des organes lymphoïdes

Premièrement, on prépare des boîtes de Pétri contenant 5 ml de milieu RPMI 1640

(Gibco BRL) auquel on ajoute au préalable 10 % de sérum de bœuf (Sigma). On sacrifie

ensuite les souris et on prélève en premier les ganglions brachiaux, inguinaux et axilaires

que l'on groupe dans la même boîte de Pétri . Ensuite on prélève le fémur ainsi que le

tibia d'une des pattes de souris que l'on groupe dans une autre boîte de Pétri. On prélève

également la rate et le thymus que l'on place dans des boîtes de Pétri séparées. La

préparation des ganglions, de la rate et du thymus se fait de façon identique. Il s'agit de

dissocier les cellules en les coinçant entre les parties givrées de deux lames de

microscope. On rince avec soin les deux lames de microscope avec 3 ml de milieu RPMI

1640 contenant 10% de sérum. On filtre ensuite les cellules sur une membrane de nylon

pour éliminer les gros aggrégats qui pourrait obstruer la buse du cytomètre de flux On

récupère les cellules dans des tubes de 15 ml, on rince de nouveau la boîte de Pétri avec 5

ml de milieu RPMI + 10% de sérum et on filtre sur membrane de nylon une seconde fois.

On centrifuge ensuite les cellules 5 minutes à 1600 rpm et on aspire le milieu. Lorsque

nécessaire, on lyse les globules rouges avec 5 ml d'une solution d' ACK (NILiCl 0.15 M,

KHC03 1 mM et Na2-EDTA 0.1 M ajusté à pH 7.2) et on centrifuge 5 minutes à 1600

rpm. Il est à noter que lors de la préparation des cellules de la rate, cette dernière étape est

essentielle. Après la centrifugation on aspire et on suspend les cellules dans du milieu

25

RPMI + 10% de sérum. On centrifuge de nouveau et on répète cette dernière étape une

autre fois; si l'on observe encore des débris en suspension dans le milieu, on doit refiltrer

sur une membrane de nylon, les cellules. Finalement, on suspend de nouveau les cellules

dans 4 ml de milieu pour les ganglions, 5 ml de milieu pour le thymus et 10 ml de milieu

pour la rate. Les cellules sont alors prêtes pour être comptées. Toutes les opérations de la

préparation des organes lymphoïdes s'effectuent sur glace et les centrifugations se font à

4°C. Maintenant pour ce qui est de la préparation de la moelle osseuse, les premières

étapes sont quelque peu différentes. On récupère le fémur et le tibia d'une des pattes de

souris en retirant le plus de muscles possible autour de la patte. On coupe ensuite à la

hauteur du genou pour séparer le fémur du tibia. À l'aide d'une seringue de 5 ml et d'une

aiguille de grosseur 22G, on aspire le milieu de culture de la boîte de Pétri. On introduit

l'aiguille à une extrémité du fémur et on pousse le milieu de culture dans l'os pour en

éjecter la moelle osseuse. On fait la même opération avec le tibia pour récupérer la

moelle. Une fois la moelle osseuse récoltée, on peut jeter les os. On passe ensuite

plusieurs fois au travers de la seringue la moelle osseuse pour en séparer complètement

les cellules. Suite à ces étapes, on peut continuer les opérations de préparation des

cellules des organes lymphoïdes, tel que mentionné auparavant, en s'assurant que la lyse

des globules rouges est bel et bien effectuée. Finalement, on suspend la moelle osseuse

dans un volume de 5 ml de milieu RPMI + 10% de sérum.

26

2.3 Comptage des cellules

Une fois les cellules préparées, on les comptent avant le marquage avec des

anticorps fluorescents. Pour ce faire on dilue les cellules dans du bleu de tryphan et on

dépose sur un compteur de cellules. On compte le nombre de cellules sur 4 quadrants et

on fait la moyenne en excluant les cellules mortes qui prendront une coloration bleue

foncée. Le calcul pour connaître le nombre de cellules isolées des organes est le suivant :

moyenne des cellules comptées X dilution X 10 000 X le volume où les cellules sont

suspendues.

2.4 Marquage des cellules avec anticorps fluorescents.

Premièrement, on distribue les cellules dans des tubes de Facs (1 X 106 cellules

par tube) et on lave avec de la solution à Facs. On centrifuge à 1600 rpm pendant 5

minutes à 4°C, on aspire le surnageant et on ajoute 50 µl de 2.4G2. Le 2.4G2 lie les

récepteurs de la portion constante de la chaîne lourde des immunoglobulines (Fe) des

anticorps et empêche ainsi un marquage non spécifique des cellules. On incube les

cellules en présence de 2.4G2 pendant 15 minutes à 4°C, ensuite on ajoute un anticorps

primaire biotiné spécifique à un marqueur de surface que l'on veut identifier. Les

anticorps biotinés utilisés sont le: CD25, CD44, CD45RB, CD62-L, CD69 et IgM (voir

annexe 1). Les anticorps biotinés doivent être combinés à un anticorps secondaire

fluorescent pour être détectés. L'anticorps secondaire se liant au anticorps biotinés est la

streptavidine (SA), elle peut être combinée à plusieurs type de molécules fluorescentes

27

comme la fluorescéine isothiocyanate (FITC), la phyto-érithrine (PE) et le cychrome

(Cyc). On incube les cellules en présence d'anticorps biotinés 25 minutes à 4°C, mais

cette fois-ci, après l'incubation, on lave avec de la solution de Facs, on centrifuge à 1600

rpm pendant 5 minutes à 4°C et on vide les tubes par inversion et en les épongeant. On

ajoute ensuite les anticorps fluorescents et on incube 25 minutes à 4°C dans le noir. Les

anticorps fluorescent peuvent se lier à la biotine comme c'est le cas avec la SA ou avec

des marqueurs de surface cellulaire. Il est important de ne jamais combiner deux

anticorps avec la même fluorescence ou se liant exactement à un même endroit au niveau

d'un récepteur de surface. Les anticorps fluorescents utilisés sont: SA, B7.2, B220, CD4,

CDS, CD23, IL-2Rp, CTLA-4, INFy et les Vps (voir annexe 1). Une fois l'incubation

terminée, on lave les cellules deux fois avec de la solution de Facs et une fois avec du

PBS IX, puis on suspend les cellules dans un volume d'environ 200 µl avant d'aller

acquérir les données au cytomètre de flux. La centrifugation des derniers lavages se fait

dans les mêmes conditions que précédemment et les cellules doivent être entreposées

dans le noir à 4°C. Il serait trop long dans cette section d'énumérer tout les combinaisons

d'anticorps utilisés, pour cette raison, les combinaisons d'anticorps sont tous comprises

dans les titres des figures se rapportant à un marquages cellulaires avec des anticorps

fluorescents.

2.5 Perfusion des souris

La perfusion des souris est l'une des étapes importantes lors du prélèvement des

organes chez les souris B7 .2Tg déficientes au niveau du CMH II dans le but de détecter

28

la présence de lymphocytes T CD8+ qui auraient pu infiltrer les organes de ces dernières.

La perfusion est essentielle pour éliminer le sang circulant au niveau des organes et ainsi

éliminer les lymphocytes T CD8+ en circulation qui auraient pour conséquence de

produire des faux positifs lors de la détection del' ARNm du CD8 au niveau des organes.

Pour se faire on commence par paralyser la souris en injectant de façon intrapéritonéale

100 µl de Ketalean dilué 1 : 5 dans du PBS lX. Par la suite on étale la souris sur le dos et

on coupe la peau pour dégager la cage thoracique. On coupe les côtes et le diaphragme

que l'on relève pour dégager le cœur. On coupe l'oreillette droite et à l'aide d'une

seringue contenant 30 ml de PBS lX on pique dans le ventricule gauche du cœur et on

fait passer tranquillement le PBS lX au travers la circulation sanguine de la souris. Si la

perfusion est bien réussie, le foie de la souris devient d'une couleur jaunâtre et tous les

autres organes vont également pâlir. Dans le cas où effectivement la perfusion est bien

réussie, on peut alors prélever les organes.

2.6 Tri des lymphocytes T CDS+ par sélection négative sur colonne

magnétique

Avant d'extraire l'ARNm des cellules de la rate pour détecter la présence de

molécules cytotoxiques au niveau des lymphocytes T CD8+, nous avons purifié les

lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II déficientes B7.2Tg et Ctrl. Pour ce

faire, on sacrifie les souris, on récupère les cellules de la rate et on les compte. Il est à

noter que le tampon et les cellules doivent rester sur la glace tout au long des

manipulations. Premièrement, on lave les cellules avec du tampon PBS lX, albumine

29

sérique bovine (BSA) 0.5% (Sigma), on centrifuge 5 minutes à 1600 rpm, on enlève le

surnageant et on suspend les cellules dans le tampon PBS lX, BSA 0,5% pour un volume

de 90 µl par 107 cellules totales. À ce volume on ajoute 10 µl de MACS CD19

Microbeads (Miltenyi Biotech GmbH) par 107 cellules totales et on incube 15 minutes à

une température qui se situe entre 6° Cet 12° C. Après l'incubation on lave les cellules en

ajoutant de 10 à 20 fois le volume de PBS lX, BSA 0.5%, on centrifuge 5 minutes à 1600

rpm et on resuspend les cellules dans 500 µl de tampon PBS lx, BSA 0.5% par 108

cellules. Pendant le temps d'incubation, on fait le montage suivant (Figure 2). On utilise

une colonne de type AS pour 3 X 107 cellules positives, une colonne de type BS pour 108

cellules positives ou une colonne de type CS pour 2 X 108 cellules positives (Miltenyi

Biotech GmbH). On remplit la colonne par le bas à l'aide d'une seringue avant le début

du lavage de cette dernière, afin d'éviter la formation de bulles. On lave la colonne avec

du PBS lX, BSA 0.5% pour un volume de 3 à 5 fois le volume de la colonne utilisée.

Lorsque la colonne est lavée, on peut ajouter la suspension cellulaire marquée avec des

billes magnétiques. On lave ensuite la colonne avec du PBS lX, BSA 0.5% pour un

volume de 3 à 5 fois le volume de la colonne utilisée. Il est important de recueillir la

suspension à la sortie de la colonne parce qu'elle contient les cellules d'intérêt.

30

Colonne

Seringue

î Valve 3 voies

Aiguille 22G (résistance au flux)

Récipient----------

Figure 2. Montage de la colonne magnétique pour déplétion des lymphocytes B chez les

souris CMH II-/- de la lignée B7.2mod.

31

2.7 Extraction del' ARNm

Pour débuter, il est important de mentionner que tout le processus d'extraction

doit se faire dans un environnement exempt de RNAse. Pour ce faire, on doit porter des

gants tout au long de l'expérimentation, utiliser des instruments, des réactifs et du

matériel (embouts de pipettes, tubes eppendorfs) adéquats pour cette fin.

Comme étape préliminaire à l'extraction, on sacrifie les souris et on récupère la

rate de celles-ci. On isole les cellules de la rate et on trie ensuite par sélection négative

sur colonne magnétique les lymphocytes T CD8+, en retirant les cellules exprimant le

CD19 comme décrit précédemment. L'extraction débute par l'homogénéisation des

cellules. Dans cette étape on suspend les cellules pour avoir une concentration de 10

millions de cellules par ml de Trizol (Gibco BRL). La deuxième étape est celle de la

séparation de l' ARNm des lymphocytes T CD8+. On laisse les cellules reposer à la

température de la pièce pour 5 minutes et on ajoute 200 µl de chloroforme (Sigma). On

mélange vigoureusement à la main pendant 15 secondes et on laisse reposer 3 minutes à

la température de la pièce. On centrifuge ensuite à une vitesse de 12000 X g pendant 15

minutes à 4°C. Suite à la centrifugation on récupère la phase acqueuse (phase du haut);

celle-ci devrait représenter environ 500µ1. La troisième étape est l'étape de la

précipitation de l' ARNm. On ajoute le même volume de 2-propanol que la phase

acqueuse recueillie, soit environ 500µ1. On agite lentement le tube par inversion une

vingtaine de fois et on laisse reposer 10 minutes à la température de la pièce. Ensuite on

centrifuge à 12000 X g pendant IO minutes à 4°C. Après la phase de précipitation de

l' ARNm on enchaîne avec le lavage de l' ARNm; pour ce faire on retire doucement le

32

surnageant par inversion en faisant attention de ne pas perdre le culot. On ajoute 1 ml

d'éthanol 75% et on agite au vortex. On centrifuge à 7500 X g pendant 5 minutes à 4°C.

Finalement, la dernière étape consiste en la dissolution de l'ARNm et l'entreposage. On

doit d'abord retirer le surnageant encore une fois avec une grande précaution. On fait

sécher les eppendorfs à l'envers jusqu'à ce que les culots deviennent transparents. On

suspend l' ARNm dans un volume d'eau exempt de RNAse de façon à obtenir une

concentration d' ARN entre 0,5 et 10 µg/µl. On incube le tout pendant 10 minutes à 55°C

et on s'assure quel' ARNm est bien dissous en mélangeant à l'aide d'une pipette. Lorsque

l' ARN est bien dissous on peut le congeler à une température de -80°C.

Lors de l'extraction de l'ARNm des organes de souris CMH II déficientes B7.2Tg et

Ctrl, l'étape préliminaire et l'étape d'homogénéisation changent quelque peu.

Premièrement les souris sont perfusées avec du PBS IX avant d'être sacrifiées, afin

d'éliminer les lymphocytes T CDS+ se trouvant dans la circulation sanguine au niveau

des organes. Ensuite, on isole les organes, on en coupe des petits morceaux que l'on met

dans 1 ml de Trizol. On homogénéise le tout avec des potters préalablement nettoyés à

l'eau et au savon et rincés à l'éthanol 70%. Le reste des manipulations se fait exactement

comme expliqué plus haut dans la section.

2.8 Quantification de l' ARNm

Avant de passer à l'étape de synthèse de l'acide désoxyribonucléique

complémentaire ( cDNA), on doit quantifier notre ARNm. Pour ce faire on doit lire la

densité optique (D.O) à 260 nm et 280 nm de l' ARNm. Dans ce cas, le blanc utilisé pour

33

faire le zéro sur le spectrophotomètre est constitué de la même eau utilisée pour diluer

l' ARNm. La dilution del' ARNm se situe autour de 1 :70. Ensuite, on fait le ratio D.O 260

nmJ D.O 280 nm; un ratio acceptable se situe entre 1.5 et 2.0. Finalement, le calcul utilisé

pour quantifier l' ARNm est le suivant :D.O 260 nm X facteur de dilution X 40 = µg/ml

d' ARNm. Encore une fois il est important que les manipulations de l' ARNm se fassent

dans un environnement et avec du matériel exempts d' ARNase.

2.9 Synthèse du cDNA avec de la SuperScript Il

Suite à la quantification de l' ARNm, on prélève 5 µg de ARNm auxquels on

ajoute 0.5 µl d'oligo(dt) (Pharmacia) 500µg/ml. On complète ensuite avec de l'eau pour

obtenir un volume total de 12 µl. On incube le mélange à 70°C pour une période de 10

minutes puis on le met sur la glace. On centrifuge « quick spin » pour amener le tout dans

le fond de l'eppendorf, puis on ajoute 4 µl de 5X 1 st strand buffer (Pharmacia), 2 µl de

DTT O. lM (Sigma) et 1 µl de dNTP 1 OmM (Pharmacia). On agite le tout au vortex et on

centrifuge de nouveau pour amener le mélange dans le fond de l' eppendorf. On incube à

42°C pendant 2 minutes, on ajoute 1 µl de SuperScript II (Gibco BRL), on mélange et on

centrifuge le tout. Ensuite, on incube 50 minutes à 42°C et 15 minutes à 70° C, pour

finalement ajouter 80 µl d'eau et ainsi obtenir du cDNA dans un volume de 100µ1. Le

cDNA ainsi synthétisé est conservé à -80°C.

34

2.10 Conditions de PCR

Lorsque nous sommes en possession du cDNA on peut alors débuter la réaction

de polymérase en chaîne (PCR). Comme les quantités des différentes solutions à pipetter

sont très petites, une bonne façon de procéder et d'effectuer un mélange proportionnelle

des différents réactifs selon le nombre de réaction de PCR désiré. Une réaction de PCR

devant contenir: 5 µl de cDNA, 32.55 µl d'eau, 1.6 µl d'amorce 5' 25 µM, 1.6 µl amorce

3' 25 µM, 5 µl de tampon lOX pour PCR (Pharmacia), 4 µl de dNTP 2.5mM et 0.25 µl de

Taq polymérase (Pharmacia). On mélange le tout, on centrifuge, on ajoute à la surface 50

µl d'huile, et ensuite, on est prêt à effectuer le PCR. Les conditions pour le PCR changent

selon la partie du cDNA que l'on veut amplifier. Le GAPDH nous sert de contrôle interne

de l'amplification pour fin de comparaison. Les conditions pour l'amplification du

GAPDH, de la perforine, du FasL, de l 'INFy et du CDS sont tous identiques, soient la

dissociation des brins d'acide désoxyribonucléique (ADN) à 94°C pendant 30 secondes,

l'hybridation des amorces à 57°C pendant 45 secondes et l'élongation des amorces à

72°C pendant 1 minute. Ces trois étapes du cycle sont répétées 30 fois, suivies par la suite

d'une période d'élongation supplémentaire à 72°C pendant 10 minutes et finalement le

tout est maintenu à une température de 4°C jusqu'à la mise sur gel d'agarose (Sigma).

Pour ce qui est de l'amplification de cDNA de granzyme B on utilise les mêmes

conditions à l'exception du nombre de cycles qui est réduit à 25 au lieu de 30.

Voici maintenant la composition des amorces utilisées: GAPDH-5' CAC TCA

CGG CAA ATT CAA CGG Cet GAPDH-3' ATC ACA AAC ATG GGG GCA TCG G,

perforine-5' TCA ATA ACG ACT GGC GTG TGG G et perforine-3' GTG GAG CTG

35

TTA AAG TTG CGG G, FasL-5' CTC TGG TTG GAA TGG GAT TAG G et FasL-3'

GGT TTA GGG GCT GGT TGT TGC, INFy-5' CAT TGA AAG CCT AGA AAG TCT

G et IFNy-3' CTC ATG AAT GCA TCC TTT TTC G, CD8-5' GAC GCC GAA CTT

GGT CAG AAG et CD8-3' GTC TCT GGG GCT GAG ATG TC, Granzyme B-5' GCC

CAC AAC ATC AAA GAA CAG G et GranzymeB-3' GAG AAC ACA TCA GCA

ACTTGG.

2.11 Électrophorèse sur gel d'agarose

Pour la migration de l'ADN amplifiée suite au PCR, on utilise un gel d'agarose de

2% et si l'on veut vérifier l'intégrité de l'ARN isolé on utilise un gel d'agarose de 1%.

Premièrement, on dissout la quantité d'agarose requise dans du tampon TAE IX (IL de

solution stock TAE 50X: 242g Tris, 57.lml acide acétique et 100 ml 0.5M EDTA) en le

chauffant dans un erlenmeyer au four à micro-onde jusqu'à ce que la solution soit

transparente. On laisse refroidir l'agarose dissoute jusqu'à ce qu'on soit capable de la

tenir dans nos mains. On ajoute du bromure d'éthidium (Sigma) pour une concentration

de 0.5 µg/ml. On peut ensuite couler le gel d'agarose et attendre qu'il polymérise.

Pendant le temps de la polymérisation on peut préparer les divers échantillons d' ARN ou

d' ADN à faire migrer. Si l'on veut faire migrer del' ARN, on utilise 5 µl d' ARN que l'on

mélange avec 2 µl de tampon de chargement et 3 µl d'eau. Pour la migration des diverses

fractions d' ADN amplifiées par PCR, on utilise 17 µl de fraction d' ADN avec 3 µl de

tampon de chargement, on agite le tout au vortex et on centrifuge pour récupérer tout le

mélange dans le fond de l'eppendorf. Finalement, on s'assure que les cuves de l'appareil

36

à électrophorèse sont bien remplies et que le tampon TAE lX couvre le gel d'agarose,

puis on dépose sur le gel les divers mélanges. On applique ensuite un courant constant de

1 OO à 150 volts, dépendant de la grosseur du gel, de façon à ce que les échantillons

migrent du pôle négatif vers le pôle positif.

2.12 Marquage du CTLA-4 intracellulaire

Les organes lymphoïdes sont prélevés et préparés comme mentionné

précédemment. On isole les cellules de la rate et on les marque à l'aide d'anticorps

monoclonaux fluorescents environ 2X106 cellules. Il s'agit d'un marquage triple ou 3

différents marqueurs fluorescents ont été utilisés. Le premier anticorps utilisé est un

anticorps biotiné spécifique au CD44 et lié au fluorescent SA Cyc et le second anticorps

est le CDS Fitc (voir annexe 1). Une fois les cellules marquées à leur surface, on les fixe

en les incubant pendant 10 minutes à la température de la pièce, avec de la

paraformaldéhyde 1 % (PFA 1 %) (Sigma). Ensuite, on perméabilise les cellules en les

lavant une fois dans du PBS lX contenant 2% de sérum et 0.3% de saponine (Sigma), et

une seconde fois dans du PBS lX contenant 2% de sérum et 0.03% de saponine. Les

cellules sont lavées et suspendues dans une solution PBS lX contenant 2% sérum et

0.03% de saponine pour un volume final de 100µ1. À ce volume on ajoute 2 µl de

l'anticorps fluorescent anti-CTLA-4 PE (voir annexe 1) et on agite le tout au vortex.

L'anticorps peut donc se lier au CTLA-4 intracellulaire. On incube les lymphocytes

pendant 45 minutes sur la glace. Finalement on lave les cellules 2 fois dans du PBS lX

contenant 2% sérum et 0.03% de saponine, puis 2 fois dans la solution de Facs et

37

finalement 2 fois dans du PBS lX avant d'acquérir les données au cytomètre de flux. Il

est important que toutes les périodes d'incubation soit effectuées à l'abris de la lumière.

2.13 Détection d'IFNy intracellulaire

Premièrement on isole les lymphocytes de la rate selon la méthode mentionnée

précédemment. On suspend les cellules 1X106 par ml de milieu RPMI + 10 % de sérum

et on ajoute de la brefeldine (Sigma) pour une concentration 20µg/ml. On distribue dans

une plaque à culture cellulaire de 24 puits à fond plat à raison de 1 ml de la suspension

cellulaire par puits. Ensuite on stimule les cellules en ajoutant, soit un anticorps anti-CD3

(2Cll) pour une concentration de lµg/ml par puits ou bien l'équivalent de PBS lX

comme contrôle négatif. On incube la plaque à 3 7°C pendant 3 heures et on récupère les

cellules. On compte alors les cellules et on les distribue à raison de 2X106 cellules par

tube de Facs. On marque les cellules à l'aide de CD8 PE (voir annexe 1) tel que

mentionné dans la section 2.4. Lorsque le marquage est terminé on ajoute 100µ1 du

tampon Cytofix/Cytoperm (Pharmigen) tout en agitant au vortex pour fixer les cellules.

On incube 20 minutes sur la glace dans le noir. On lave deux fois avec lml de la solution

Perm/Wash lX (Pharmigen) pour perméabiliser la membrane des cellules; les

centrifugations s'effectuent toutes à 4°C et 2000rpm. Suite au dernier lavage on ajoute

0.5µ1 d'anticorps INFy couplé au FITC (voir annexe 1) et on incube 30 minutes sur la

glace dans le noir. On lave deux fois avec 1 ml de la solution Perm/Wash IX; les

centrifugations s'effectuent aux mêmes conditions que précédemment. Finalement, on

suspend les cellules dans du PBS lX avant de prendre les lectures en cytométrie de flux.

38

2.14 Déplétion in vivo des lymphocytes T CD4+.

Pour dépléter in vivo les lymphocytes T CD4+, il s'agit d'injecter les souris de

façon intrapéritonéal trois jours consécutifs avec 0,5mg d'un anticorps anti-CD4

(GKl.5), dans un volume de PBS IX n'excédant pas 500µ1. Ensuite, on injecte les souris

à tous les trois jours avec la même quantité d'anticorps pour une période de 27 jours.

Comme contrôle négatif, on se sert de souris chez lesquelles on ne déplète pas les

lymphocytes T CD4+. À la fin des 27 jours, on sacrifie les souris, on récupère la rate et on

isole les lymphocytes pour un marquage des cellules à l'aide d'anticorps fluorescents,

dans le but d'acquérir des données par cytométrie de flux. Les anticorps utilisés sont le

CD25, CD62-L, CD44 biotinés lié au SA Cyc et le CD4, CD8 PE (voir annexe 1) Pour ne

pas sous-estimé les lymphocytes T CD4+ lors du marquage, il est important d'utiliser un

anticorps reconnaissant un épitope différent que l'anti-CD4 (GKl.5), utilisé pour la

déplétion de ces cellules. Pour cette raison nous avons utilisé le CD4 PE de Pharmigen le

clone RM4-4.

3. Résultats

3.1 Élimination des lymphocytes B par les cellules T CD4+ et T CDS+

dans les souris B7 .2 transgéniques

Pour déterminer si l'élimination des lymphocytes B dans les souris B7.2mod et

B7.2hi était due à leur interaction avec les lymphocytes T CD4+ et/ou les lymphocytes T

CDS+, nous avons généré des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe 1

ou CMH de classe Il. La présence de lymphocytes B dans la moelle osseuse, la rate et les

ganglions périphériques dans ces souris a été déterminée par cytométrie de flux en

examinant les cellules qui expriment l'antigène B220, un marqueur de surface exprimé

par les lymphocytes B à tous les stades de leur différentiation.

Dans les souris B7.2 Tg déficientes en CMH de classe 1, il y a une diminution

importante de la fréquence et du nombre absolu de lymphocytes B (cellules B220) dans la

moelle osseuse comparativement aux souris Ctrl (Figure 3 A et B). Dans les souris B7.2

Tg déficientes au niveau du CMH de classe II, il y a aussi une diminution de la fréquence

et du nombre absolu de lymphocytes B dans la moelle osseuse, mais cette diminution est

moins importante que celle observée dans les souris B7.2 Tg déficientes en CMH de

classe 1 (Figure 3 C et D). Très peu de lymphocytes B sont détectés dans les organes

lymphoïdes périphériques des souris B7.2 Tg, déficientes en CMH de classe 1 (Figure 4

A et B; Figure 5 A et B), ce qui est cohérent avec leur élimination presque complète

dans la moelle osseuse, l'organe lymphoïde primaire au niveau duquel se produit le

développement des cellules B. Dans les souris Tg déficientes au niveau du CMH de

40

classe II, la diminution des lymphocytes B dans la rate rappelle celle observée dans la

moelle osseuse (Figure 4 C et D). En effet, comparativement aux souris Ctrl, le nombre

absolu de lymphocytes B dans la rate est diminué, mais cette diminution est moins

importante que celle observée dans les souris B7.2 Tg déficientes en CMH de classe 1.

De façon surprenante il n'y a pas de diminution du nombre absolu de lymphocytes B

dans les ganglions périphériques des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de

classe Il (Figure 5 C et D).

Ces résultats indiquent donc que les deux sous-populations de lymphocytes T sont

capables d'éliminer les lymphocytes B qui expriment de façon constitutive le ligand de

co-stimulation B7.2, mais que les lymphocytes T CD4+ semblent plus efficaces que les

lymphocytes T CD8+. Il est important de noter que des résultats identiques ont été

obtenus avec les deux lignées de souris B7.2 Tg.

Figure 3. Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T au niveau de la moelle osseuse. (A) Sélection sur les lymphocytes; Fréquence des lymphocytes B marqués avec B220 PE et des lymphocytes T CD4+ marqués avec CD4 FITC, profil représentatif des souris CMH 1-/- lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=8. (B) Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CD4+ chez les souris CMH 1-/- lignée B7.2hi et B7.2mod. (C) Sélection sur les lymphocytes; Fréquence des lymphocytes B marqués avec B220 PE et des lymphocytes T CD8+ marqués avec CD8 FITC, profil représentatif des souris CMH II-/- lignée B7.2mod Ctrl n=5 et Tg n=8. (D) Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CD8+ chez les souris CMH II-/- lignée B7.2hi et B7.2mod.

A

CMH I-/-

B

c

CMH II-/-

D

Ctrl

0 0 -\-o-~~ .......................... ..-.ft

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0

-0-

0

B220+

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6

z 0 _,_ ___ ,.__ ........ __.,._. Ctrl B7.2 Ctrl B7.2

V 0

0

hi mod

Ctrl

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B220+

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hi mod

~

V 0

i;,., .B7.2 Tg

~ ~~;~~·.-"~: ~. . ;.' "·~~· 19% 0

0

104

CD4+

• ~ 0 • i o.s-7-i-+ T z

O Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 hi mod

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CDS+

•

+ • •

• • • 1 • § -g-z 0 -i...-r--....--'ïl...._....,......1

Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 hi mod

41

Figure 4. Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T au niveau de la rate. (A) Sélection sur les lymphocytes; Fréquence des lymphocytes B marqués avec B220 PE et des lymphocytes T CD4+marqués avec CD4 FITC, profil représentatif des souris CMH I-/- lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=8. (B) Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CD4+ chez les souris CMH I-/- lignée B7.2hi et B7.2mod. (C) Sélection sur les lymphocytes; Fréquence des lymphocytes B marqués avec B220 PE et des lymphocytes T CDS+ marqués avec CDS FITC, profil représentatif des souris CMH II-/- lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=IO. (D) Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CD8+ chez les souris CMH II-/- lignée B7.2hi et B7.2mod.

42

V V 0 0

(") Ctrl (")

0 0

A ~ O(".J N o NO

~-=-ca_:-0 0

0 0 0 0

CMH I-/-CD4+

80 B220+ 40 ..--- ..---'O 'O 0 0

0 ...... ...... X 60- T X 30- _a_ .._, .._, 0 Cil Cil ~ ~ 0 :; --§- - 0 E _a_ :::: ~

B ~ 40- 20-(,,1 (,,1

~ ~ -1- • "O "O 0 ~ ~ -1--'"' 20- r... 10-.Q .Q • 1 s s 0 0 z - z 0 0 1 1 1

Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 hi mod hi mod

V V 0 0

(") Ctrl (") 15 % B7.2 Tg 0 ; . .. ,, ..... 0 - · ~·- · .. · ..

. : ., .., . ..~ •.· · . ··~· · (· ... ~·:~::. ~ . c O(".J O(".J No \Qf,~~,;.:· ~ ·: ./.: No N ~ N ~ ca~ ca~

0 ; ~..;: ;.. ... ·: '%1·. 0 ' ... ~ ~:. :~·~ ' 21 o/t 0 .: :" .. , :"' . / '' . . 0 0

0 0

104

CMH II-/-B220+ CDS+

..--- 80 ..--- 150 'O 'O 0 0 ...... ...... • ~ 60 0 X • .._, ~ 0 Cil 100 - 1 ~ - T ] D E -ij-~ 40 ~ • () (,,1 • 1 ~

0 ~ • • "O "O so- • ~ 20 • ~ r... • r... • .Q • + .Q

-8- • e e -s-0 0 z 0 z 0 Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 Ctr l B7.2 hi mod hi mod

Figure 5. Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T au niveau des ganglions périphériques. (A) Sélection sur les lymphocytes; Fréquence des lymphocytes B marqués avec B220 PE et des lymphocytes T CD4 + marqués avec CD4 FITC, profil représentatif des souris CMH I-/- lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=S. (B) Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CD4+ chez les souris CMH 1-/- lignée B7.2hi et B7.2mod. (C) Sélection sur les lymphocytes; Fréquence des lymphocytes B marqués avec B220 PE et des lymphocytes T CDS+ marqués avec CDS FITC, profil représentatif des souris CMH II-/- lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=lO. (D) Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CDS+ chez les souris CMH II-/- lignée B7.2hi et B7.2mod.

43

V V 0 0

(") Ctrl (") ~7~2 Tg A 0 C)

~ . .. ·. ·. O(\J O(\J No No N - ~_:-co_

0 C)

0 0 0 0

CMH I-/-,-.. 10

B220+ 15 CD4+

,-.. .., .., 0 0 0 ..... ..... ~ 8 6 ~ 0 '-" '-"

"' 0 "' 10 0 1 Q,I Q Q,I _8_

] 6 -g- ] -0- • B ~ ~ 0 -8

(,) (,) • Q,I 4 Q,I

"O "O 5 .. Q,I Q,I

""' 2 ""' .t:2 .t:2 s s 0 0 0 0 z z

Ctrl Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 hi mod

V V 0 0

(") Ctrl (") ~7.2 Tg 0 0

~ ~ ... c NO N 0 co_:- co_:-

0 0

0 . 49% 0 0 0

104 104

CMH II-/- B220+ CDS+ ~ 15 ,-.. 60 .., 0 0 • ..... ..... ~ ~ • '-"

Jl 10 - : "' Q,I 40- • .E • ] • D ~ • ~ (,) (,) • Q,I 8 0 Q,I

"O 5- --cr • +~ "O 20- 1 -----Q,I Q,I 1 ""' 0 1 ""' .t:2 0 • .t:2 --%- • -e-s s • 0 0 0 z 1 1 1 1 z 0

Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 Ctrl B7.2 hi mod hi mod

44

3.2 Phénotype des lymphocytes B périphériques des souris B7 .2 Tg

déficientes en CMH de classe II

Il est étonnant d'observer dans les souris B7.2 Tg déficientes en CMH de classe II

une grande diminution du nombre de lymphocytes B au niveau de la moelle osseuse et de

la rate, mais non au niveau des ganglions périphériques. Nous avons donc tenté

d'identifier la population de lymphocytes B résistante à l'élimination par les lymphocytes

T CDS+. Dans les souris Ctrl, la majorité des lymphocytes B expriment des niveaux

variables d'IgM ainsi que les marqueurs de surface CD23 et CD21. Ce phénotype est

caractéristique des lymphocytes B qui ont atteint le stade mature de leur différentiation

(Loder et al., 1999). Dans les souris B7.2 Tg, on remarque que bien que les lymphocytes

B expriment l 'IgM, ces cellules B expriment des niveaux plus faibles de CD23 et de

CD21 que ceux exprimés par les lymphocytes B des souris Ctrl (Figure 6 et 7). Les

lymphocytes B qui sont au stade immature de leur différentiation se caractérisent par une

faible expression du CD23 et du CD21 . Donc, les lymphocytes B restants dans les souris

B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II possèdent un phénotype

caractéristique de cellules B immatures.

Ctrl

B7.2 Tg

(") 0

~o 0.,.... V

(") 0

~o 0.,.... V

. . . · .. . :·

·:' ....

19%

45

Figure 6. Profil représentatif des lymphocytes B au niveau de la rate chez les souris CMH II -/-lignée B7.2mod Ctrl n=4 et Tg n=7. Sélection sur les lymphocytes; marquages CD23 PE et IgM biot + SA CyC.

Ctrl

B7.2 Tg

V 0

M 0

0

46

25%

2%

Figure 7. Profil représentatif des lymphocytes B au niveau des ganglions périphériques chez les souris CMH II-/- lignée B7.2mod Ctrl n=4 et Tg n=7. Sélection sur les lymphocytes; marquages CD23 PE et IgM biot + SA CyC.

47

3.3 Expansion des lymphocytes T CDS+ dans les souris B7.2 Tg

déficientes en CMH de classe II

Nous avons aussi examiné la présence des lymphocytes T dans les organes

lymphoïdes des souris B7.2mod et B7.2hi déficientes dans les molécules du CMH de

classe I ou CMH de classe II afin de déterminer si l'élimination des lymphocytes B par

les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ avait une quelconque conséquence sur ces derniers.

Dans les souris B7.2 Tg déficientes en CMH de classe I, le nombre absolu de

lymphocytes T CD4+ retrouvés dans la moelle osseuse n'est pas significativement

différent à celui des souris Ctrl (Figure 3 B). Par contre, une légère diminution du

nombre absolu des lymphocytes T CD4+ est observée dans la rate et à un moindre degré

dans les ganglions lymphatiques (Figure 4 B et 5 B). Cette diminution du nombre de

lymphocytes T CD4+ peut s'expliquer par l'absence presque totale de lymphocytes B

dans les organes lymphoïdes de ces souris. En effet, il est bien connu maintenant que les

lymphocytes T CD4+ naïfs ont besoin de recevoir des signaux via leurs TCR pour

survivre en périphérie et ces signaux proviennent de la liaison du TCR avec les molécules

du CMH de classe II exprimées par les CP A, dont font partie les lymphocytes B (Ernst et

al., 1999). Une diminution du nombre de cellules B pourrait être à l'origine d'une

diminution des signaux de survie pour les lymphocytes T CD4+.

Contrairement aux lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CDS+ dans les souris

B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II semblent avoir subi une expansion

très importante dans tous les organes lymphoïdes examinés (Figure 3 D, 4 D et 5 D).

Cette expansion est particulièrement impressionnante au niveau de la rate, ce phénomène

48

étant confirmé par le fait que la plupart de ces souris présentent une splénomégalie.

Encore une fois, l'augmentation du nombre de lymphocytes T CDS+ est observée dans les

deux lignées de souris Tg.

Ces résultats suggèrent que l'interaction entre la molécule B7 .2 et son récepteur

CD2S a un effet différentiel sur les lymphocytes T CD4+ versus les lymphocytes T CDS+.

3.4 Phénotype des lymphocytes T dans les souris B7 .2 Tg déficientes au

niveau du CMH de classe 1 et CMH de classe II.

Suite à l'élimination des lymphocytes B par les lymphocytes T chez les souris Tg

déficientes au niveau du CMH de classe I et CMH de classe II, il se peut que les

lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CDS+ aient subi un certain changement

phénotypique. De plus, l'expansion importante des lymphocytes T cytotoxiques pourrait

être accompagnée d'un changement dans l'expression de certains marqueurs de surface.

Pour ces raisons nous avons caractérisé le phénotype des lymphocytes T CD4+ et des

lymphocytes T CDS+. Premièrement, nous avons regardé le niveau d'expression de

certains marqueurs de surface typiques des cellules mémoires: le CD44, CD62-L,

CD45RB et IL-2Rp. Nous avons aussi examiné la présence de marqueurs d'activation

des lymphocytes T: le CD25 et le CD69. Ces marqueurs apparaissent tôt dans

l'activation des lymphocytes T et sont dits des marqueurs d'activation précoce.

Finalement, nous avons caractérisé les récepteurs directement impliqués dans

l'interaction entre les lymphocytes T et les CP A : le TCR avec son co-récepteur (CD4 ou

CDS) ainsi que le CD2S.

49

Il n'y a aucune différence significative dans l'expression des marqueurs

d'activation ou de mémoire entre les lymphocytes T CD4+ isolés des organes lymphoïdes

des souris B7 .2 Tg et des souris Ctrl (Figure 8 A et B ). Cependant, les lymphocytes T

CD4+ isolés des souris B7.2 Tg montrent une grande diminution dans l'expression du

récepteur CD28 (Figure 8 C). Cette diminution de l'expression du CD28 à la surface

cellulaire indique qu'il y a eu interaction in vivo entre le CD28 et son ligand B7.2. En

effet, on a rapporté une diminution de l'expression du CD28 sur les lymphocytes T

incubés in vitro avec des cellules CHO transfectées avec l' ADNc codant pour le ligand

B7 .1 (Linsley et al., 1993).

Dans les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II, plus de 95%

des lymphocytes T CD8+ de la rate possèdent un phénotype de cellules mémoires. En

effet, la presque totalité de ces lymphocytes T ont comme phénotypes CD44élevé, CD62-

Lfaïble, CD45RBmodéré et IL2Rpmodéré, ce qui est caractéristique des cellules T mémoires

(Figure 9 A). Malgré le fait que les lymphocytes T CD8+ présentent tous un phénotype

mémoire, il n'y a aucun indice démontrant l'activation récente de ces cellules,

puisqu'elles n'expriment pas le CD25 et le CD69 (Figure 9 B). De plus, on observe une

légère diminution dans l'expression de la chaîne p du TCR ainsi que du co-récepteur

CD8 (Figure 9 C), suggérant qu'il y a eu contact entre le TCR et des complexes peptide

du soi/CMH de classe 1. En effet, la diminution de l'expression du TCR est un reflet que

le lymphocyte T a reçu un stimulus via son récepteur pour l'antigène (Valitutti et al.,

1995). De plus, tout comme les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+ des souris

qui portent le transgène B7.2 montrent une diminution de l'expression du CD28

indiquant qu'il y a eu interaction in vivo entre le CD28 et son ligand B7.2. Toutefois cette

50

diminution est moins importante que celle observée sur les lymphocytes T CD4+. Même

si on observe une expansion des lymphocytes T CD8+ dans les ganglions lymphatiques

des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II, il semble que le phénotype

mémoire soit restreint principalement au niveau des lymphocytes T de la rate. En effet,

bien que la fréquence de lymphocytes T CD8+ avec un phénotype mémoire soit plus

élevée dans les ganglions lymphatiques des souris B7.2 Tg que dans les souris Ctrl

(Figure 10 A), cette fréquence est moins élevée que dans la rate. De plus, on n'observe

pas de diminution de l'expression du TCR et du co-récepteur CD8 sur les lymphocytes T

CD8+ présents dans les ganglions lymphatiques (Figure 10 C). Pour ce qui est de

l'expression des marqueurs d'activation précoce, on ne retrouve aucune différence entre

la rate et les ganglions périphériques (Figure 10 B).

En résumé, malgré le fait qu'il y ait eu interaction in vivo entre le ligand B7.2 et

le récepteur CD28 exprimé par les lymphocytes T CD4+ et CD8+, cette interaction se

traduit par une altération du phénotype des lymphocytes T CD8+ uniquement. Cela

constitue une indication supplémentaire que la molécule B7.2 aurait un effet différentiel

sur les lymphocytes T CD4+ versus les lymphocytes T CD8+.

Figure 8. Phénotype représentatif des lymphocytes T CD4+ de la rate des souris CMH 1-/- de la lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=8 (A) Sélection sur les lymphocytes T CD4+ marquage (CD44 biot, CD45RB biot et CD62L biot) + SA PE (B) Sélection sur les lymphocytes T CD4+ marquage (CD25 biot et CD69 biot) + SA PE. (C) Sélection sur les lymphocytes marquage TCR biot +SAPE, CD4 FITC et anti-CD28 (37N) + goat anti-hamster FITC.

51

0 ~ If) 0

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Figure 9. Phénotype représentatif des lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH II-/- de la lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=lO (A) Sélection sur les lymphocytes T CDS+ marquage (CD44 biot, CD45RB biot et CD62L biot) + SA FITC et IL-2R~ biot +SA CyC (B) Sélection sur les lymphocytes T CDS+ marquage (CD25 biot et CD69 biot) +SA FITC. (C) Sélection sur les lymphocytes marquage TCR biot + SA FITC, CDS PE et anti-CD28 (37N) + goat anti-hamster FITC.

52

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Figure 1 O. Phénotype représentatif des lymphocytes T CD8+ des ganglions périphériques des souris CMH II-/- de la lignée B7.2mod Ctrl n=6 et Tg n=lO (A) Sélection sur les lymphocytes T CD8+ marquage (CD44 biot, CD45RB biot et CD62L biot) + SA PE (B) Sélection sur les lymphocytes T CD8+ marquage (CD25 biot et CD69 biot) + SA PE. (C) Sélection sur les lymphocytes marquage TCR biot +SA FITC, CD8 PE et anti-CD28 (37N) + goat anti-hamster FITC.

53

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10° 0

100 101 10° 1o<l

54

3.5 État fonctionnel des lymphocytes T CDS+

Puisque nous sommes en présence d'une expansion phénoménale de lymphocytes

T CDS+ présentant un phénotype mémoire dans la rate des souris B7.2 Tg CMH de classe

II déficientes, nous avons voulu caractériser leur état fonctionnel. Pour ce faire nous

avons premièrement déterminé à l'aide de la technique de RT-PCR si ces cellules

expriment l' ARNm codant pour des molécules impliquées dans la cytotoxicité des

lymphocytes T CDS+, telles que perforine, Fas-ligand, granzyme B et INFy. Comme le

montre la Figure 11, l' ARNm codant pour ces molécules est difficilement détectable

dans les lymphocytes T CDS+ qui ont été triés par cytométrie de flux à partir d'une

suspension cellulaire de la rate des souris CMH de classe II déficientes Ctrl, et qui sont

constitués en grande majorité de lymphocytes T ayant un phénotype naïf. Par contre ces

ARNm sont abondants, particulièrement ceux codant pour granzyme B, dans les

lymphocytes T CDS+ isolés de la rate des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH

de classe Il. Nous avons aussi déterminé si les lymphocytes T CDS+ isolés des souris

B7 .2 Tg déficientes en CMH de classe II pouvait produire la cytokine INFy après une

courte stimulation in vitro. Comme le montre la Figure 12, l'INFy est détecté

uniquement dans les lymphocytes T CDS+ isolés des souris B7.2 Tg déficientes au niveau

du CMH de classe II, lymphocytes qui ont été stimulés in vitro pendant 3 heures en

présence d'un anticorps anti-CD3i::.

En conclusion, ces résultats indiquent que les lymphocytes T CDS+ B7.2 Tg qui

ont subi une expansion dans les souris déficientes au niveau du CMH de classe II et qui

ont maintenant un phénotype mémoire, ont également un potentiel de cellules effectrices.

55

Perforine

Fas Ligand

GranzymeB

IFNy

Gapdh

Figure 11 . RT-PCR (perforine, FasL, Granzyme B, IL-2, INFy et GAPDH) des lymphocytes T CD8+ de la rate et des ganglions, de souris CMH II déficientes Ctrl et B7 .2mod, trié par sélection négative sur colonne magnétique résultats représentatifs de Ctrl n=4 et Tg n=6 . Les amorces utilisées ainsi que les conditions d'extraction de l 'ARN et du RT PCR sont décrits à la section 2.10.

56

Ctrl

Tg

So/o

~ .,,_~;........, ........ _,....,....,...,...........--.!!:;:~!M-.............. ......1

1)( 101 10~ 1 C~ IFN

Figure 12. Profil représentatif de la détection d ' IFNy 1intracellulaires chez les lymphocytes T CD8+ de la rate des souris CMH II -/- lignée B7.2mod Ctrl n=3 et Tg n=S après stimulation avec 5 µg/ml anti-CD3 soluble pendant 3 heures en présence de brefeldine 20µg/ml. Sélection sur les lymphocytes T CD8+ marquages IFNy FITC.

57

3.6 Infiltration des lymphocytes T CDS+ B7.2 Tg, au niveau des organes

Nous avons remarqué, que les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe

II, avaient une durée de vie plus courte. L'expansion, le phénotype mémoire et le

potentiel cytotoxique des lymphocytes T CDS+ pourraient jouer un rôle important dans la

diminution de la longévité des souris B7.2 Tg. En effet, il est connu que les cellules

mémoires ont une meilleure capacité de migrer hors des organes lymphoïdes que les

cellules naïves (Westermann et Pabst, 1996). Un nombre augmenté de lymphocytes T

CDS+ possédant un caractère effecteur et ayant la possibilité de circuler plus librement

dans le corps des souris pourrait donc être à l'origine de la diminution de la qualité de vie

des souris. Pour vérifier si les lymphocytes T CDS+ Tg se localisent effectivement dans

divers organes des souris, nous avons prélevé les organes des souris suite à la perfusion

de ces dernières. La perfusion est nécessaire pour éliminer les lymphocytes T CDS+

circulant dans les vaisseaux sanguins au niveau des organes. Ensuite, pour détecter la

présence de lymphocytes T CDS+, nous avons utilisé la technique de RT-PCR avec des

amorces spécifiques pour la chaîne a. de la molécule CDS. Les résultats obtenus sont

concluants; on détecte la présence de l 'ARNm codant pour la chaîne a. de la molécule

CDS dans certains organes et spécialement au niveau de la moelle osseuse et du cerveau

(Figure 13).

58

Ctrl Tg

CDS

Gapdh ····--· 1 23 4 5 6 7 1 23 4 5 6 7

Figure 13. Détection de CD8 par RT PCR sur différentes organes de souris CMH II-/- de la lignée B7.2mod suite à la perfussion des souris (1. Ganglions périphériques 2. Foie 3. Intestin 4. Coeur 5. Rein 6. Cerveau 7. Moelle épinière) résultats représentatif de Ctrl n=3 et Tg n=3. Les amorces utilisées ainsi que les conditions d'extraction de l'ARN et du RT PCR sont décrits à la section 2.10.

59

3.7 Expansion polyclonale des lymphocytes T CDS+

Nous avons également déterminé si l'expansion des lymphocytes T CD8+ est

polyclonale (plusieurs clones), oligoclonale (quelques clones) ou bien monoclonale (un

seul clone). En effet, si l'expansion des lymphocytes T CD8+ dans les souris B7.2 Tg

déficientes au niveau du CMH de classe II se produit suite à la rencontre d'un antigène

bien particulier, on peut s'attendre à ce qu'un seul ou bien quelques clones des

lymphocytes T CD8+ prolifèrent. Si cette expansion est due à un autre mécanisme,

comme un manque dans la régulation négative qui résulte en l'activation, on peut

s'attendre à une expansion générale de tous les lymphocytes T CD8+. Pour vérifier la

représentation clonale des lymphocytes T CD8+ chez les souris B7.2 Tg déficientes au

niveau du CMH de classe Il, nous avons analysé l'expression des différentes chaînes

variables p (Vps) du TCR. Chez les souris de la souche C57/BL6, les lymphocytes

exprimant les chaînes Vps 2, 3, 4, 5.1 et 5.2, 6, 7, 8.1 et 8.2, 8.3, 9, IOb, 11, 12, 13 et 14

sont présents, tandis que la chaîne VP 17a sert de contrôle négatif, car les lymphocytes T

n'expriment pas cette chaîne dans ces souris. Lorsqu'on analyse l'expression des chaînes

vps sur les lymphocytes T CD8+, en terme de nombre absolu, toutes les sous-populations

de lymphocytes T exprimant les vps sont augmentées (Tableau 2). On est donc en

présence d'une expansion polyclonale des lymphocytes T CD8+. Il est cependant

intéressant de noter que l'expansion polyclonale semble quand même favoriser les

lymphocytes T CD8+ exprimant certaines chaînes vps. C'est le cas des lymphocytes T

CD8+ qui expriment la chaîne vp 8.3 qui sont 1.5 fois plus fréquents chez les souris Tg

que chez les souris Ctrl (Figure 14 A). Finalement, lorsqu'un TCR interagit avec le

60

CMH, on remarque une diminution de l'expression du TCR à la surface cellulaire. On

observe un phénomène semblable chez les lymphocytes T CDS+ de la rate des souris B7.2

Tg déficientes au niveau du CMH de classe II. On remarque que plus la fréquence d'un

clone est augmentée par rapport au contrôle, plus il y a une diminution de l'expression à

la surface cellulaire de cette chaîne vp (Figure 14 B). Prenons pour exemple les

lymphocytes T qui expriment la chaîne vp 8.3, ces lymphocytes T ont une fréquence très

augmentée et également une grande diminution d'expression de cette chaîne vp à la

surface cellulaire. Par contre, les lymphocytes T qui expriment la chaîne vp 5.1-5.2 ont

une fréquence diminuée et seulement une faible diminution du TCR à leur surface. Nous

avons également étudié la représentation clonale des lymphocytes T CD4+ chez les souris

Tg et Ctrl déficientes au niveau du CMH de classe 1, et dans ce cas aucune différence n'a

été observée entre les lymphocytes T CD4+ Tg et Ctrl.

61

Tableau 2. Expansion polyclonal des lymphocytes T COS+ au niveau de la rate des souris CMH Il -/-de la lignée B7.2mod Ctrl n=5 et Tg n=9. Nombre absolu (X 106) de lymphocytes T COS+ exprimant les différentes chaînes de V~s marquées au FITC.

VBs Ctrl Tg 2 O.SS +/- 0.13 5.36 +/- 0.92

3 0.46 +/- 0.03 4.S4 +/- 1.64

4 0.76 +/- 0.06 5.SS +/- 1.60

5.1-5.2 2.4S +/- 0.1 S 11.32 +/-1 .29

6 1.34 +/- 0.06 6.23 +/- O.S6

7 0.69 +/- 0.04 3.47 +/- 0.59

8.1-8.2 2.55 +/- 0.20 1 S.11 +/- 1.43

8.3 1.05 +/- 0.13 10.44 +/- 0.79

9 0.52 +/- O.OS 4 .35 +/- 0.4S 10b 0.5S +/- 0.03 3.S7 +/- O. 7 4

11 1.05 +/- 0.13 7.04 +/- 0.90

12 0.60 +/- 0.03 5.17+/-0.99 13 0.64 +/- O.OS 3.04 +/- 0.3S

14 0.76 +/- 0.21 3.43 +/- O.S6

17a 0.14 +/- 0.06 1.40 +/- O.S3

Figure 14. Expression des chaînes V~s chez les lymphocytes T CD8+ dans la rate de souris CMH II -/-de la lignée B7.2mod, résultats représentatifs de Ctrl n=5 et Tg n=9. (A) Fréquence d'expression des chaînes V~s maruqages des chaînes V~s FITC, sélection sur les lymphocytes T CD8+ de la rate * p<0.005. (B) Niveau d'expression des chaînes V~s 5.1-5.2, 8.1-8.2 et 8.3, à la surface cellulaire sélection sur les lymphocytes T CD8+, marquages chaînes V~s au FITC.

o 1 Ctrl 15 - • 1 B7.2 Tg

A 10-

s- B 1 1 § 1 §

1 • 1

0 1 ~ 1 e 1 s e 1 ~ i s 1

V~2 V~3 V~4 V~S.1- V~~ V~7 V~8.1- V~S.3* V~9 V~lO V~ll V~12 V~13 V~14 V~17 V~S.2* V~8.2

B

10° 10 1 102 103 104 OO 101 102 103 104 VbS .1-5.2 Vb8 . 1~ .2

Ctrl

Tg

63

3.8 Expansion périphériques des lymphocytes T CDS+

L'expansion observée chez les lymphocytes T CD8+ des souris B7.2 Tg déficientes

en CMH de classe Il peut-être périphérique ou bien se produire au cours du

développement des lymphocytes T dans le thymus. Pour déterminer si l'expansion des

lymphocytes T CD8+ observée en périphérie se produit d'abord au thymus, nous avons

marqué à l'aide d'anticorps fluorescents les co-récepteurs CD4 et CD8 au niveau du

thymus des souris Tg et Ctrl déficientes en CMH de classe IL Les résultats démontrent

que dans le thymus la fréquence des lymphocytes T CD8+ chez les souris Tg n'est pas

différente de celle des souris Ctrl (Figure 15). De plus, contrairement à ce que nous

avons observé dans la rate, aucune différence dans la fréquence de l'expression des

chaînes V~ du TCR n'a été observée entre les thymocytes des souris B7.2 Tg et Ctrl. Ces

résultats indiquent que l'expansion des lymphocytes T CD8+ dans les souris B7.2 Tg

déficientes en CMH de classe II est un phénomène qui a son origine en périphérie.

Ctrl

Tg

V 0

M 0

V 0

M 0

oo<'Jo e~

0

0 0

~ 10°

()4

79%

5%

83%

4% 104

Figure 15 . Profil représentatif des lymphocytes T CD4+ et des lymphocytes T CD8+ dans le thymus des souris CMH II -/- de la lignée B7.2mod Ctrl n=3 et Tg n=6. Sélection sur les lymphocytes, marquage CD4 FITC et CD8 PE.

65

3.9 Expression du CTLA-4 sur les lymphocytes T CDS+ B7 .2 Tg

Comme mentionné dans l'introduction (section 1.2.2), 24 à 4S heures suivant

l'activation des lymphocytes T, il y a induction de l'expression de la molécule CTLA-4 à

la surface de ces derniers. Le CTLA-4 joue un rôle dans la régulation négative de

l'activation des lymphocytes T. Dans les cas des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du

CMH de classe II, on observe une très grande expansion des lymphocytes T CDS+. Nous

avons donc vérifié s'il y avait présence ou non du CTLA-4 dans les lymphocytes T CDS+

des souris Tg. Pour marquer le CTLA-4, on doit d'abord perméabiliser les cellules,

puisque le CTLA-4 se retrouve principalement dans des vésicules intracellulaires. Par la

suite, on peut détecter la molécule à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-CTLA-4

fluorescent. Effectivement, 37.5% des lymphocytes T CDS+ CD44élevé dans la rate des

souris Tg expriment le CTLA-4, comparativement à seulement 1S% chez les souris Ctrl

(Figure 16). Si l'on regarde au niveau des lymphocytes T CDS+ seul, 33% des cellules T

CDS+ des souris Tg expriment le CTLA-4, comparativement à S% pour les cellules T

CDS+ des souris Ctrl. Ces résultats indiquent que le niveau d'expression de la molécule

CTLA-4 est plus élevé chez les lymphocytes T CDS+ Tg que chez les lymphocytes T

CDS+ Ctrl. De plus, le niveau d'expression de la molécule CTLA-4 est plus élevé chez

les lymphocytes T CDS+ qui ont un phénotype mémoire.

V 0

M 0

Ctrl ~ c:. 0 <...> .,....

0

V 0

33 % M

0

Tg ~ c:. 0 <...> .,.... - ..

0

..

104

Figure 16. Profil représentatif de l'expression du CTLA-4 sur les lymphocytes T CD8+ de la rate des souris CMH II -/- de la lignée 27, Ctrl n=3 et Tg n=3 . Marquage CTLA-4 PE et CD44 biot + SA CyC.

3.10 Souris B7.2low Tg déficientes dans l'expression des molécules du

CMH de classe Il

67

Afin de déterminer si l'expansion des lymphocytes T CD8+ observée chez les

souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II est une conséquence de

l'élimination des lymphocytes B par les lymphocytes T CD8+, nous avons généré des

souris B7.2low CMH de classe II déficientes. Chez les souris de la lignée B7.2low, on

retrouve le même niveau d'expression de la molécule B7.2 sur les lymphocytes T, mais

l'expression de B7.2 n'est pas détectée sur les lymphocytes B. Il n'y a pas élimination

des lymphocytes B dans la moelle osseuse ou en périphérie dans les souris B7.2low,

puisque cette élimination requiert l'expression de la molécule B7.2 sur les lymphocytes B

(Fournier et al., 1997). Les résultats obtenus sont très intéressants puisque dans la rate des

souris B7.2low Tg déficientes au niveau du CMH de classe II, on observe quand même

une grande expansion des lymphocytes T CD8+, tout à fait similaire à celle retrouvée

dans les souris B7.2mod et B7.2hi Tg déficientes en CMH de classe II, mais par contre,

aucune diminution du nombre de lymphocytes B n'est observée (Figure 17). Nous avons

également observé un changement du phénotype des lymphocytes T CD8+ des souris

B7.2low. Comme dans le cas des lymphocytes T CD8+ de la lignée transgénique

B7.2mod, les lymphocytes T CD8+ de la lignée B7.2low ont presque tous un phénotype

mémoire. Ils ne démontrent aucun signe d'activation précoce et ils ont diminué

l'expression à leur surface des molécules CD8 et CD28 (Figure 18 A, B et C). De plus,

25% des lymphocytes T CD8+ de la lignée B7.2low expriment l'IFNy, ce qui est similaire

aux résultats obtenus avec les lymphocytes de la lignée B7.2mod (Figure 19).

68

Finalement, 60% des lymphocytes T CD8+ CD44élevé Tg expriment la molécule CTLA-4

(Figure 20). Donc, malgré le fait qu'il n'y ait aucune élimination des lymphocytes B, les

lymphocytes T CD8+ dans les souris B7.2low subissent également une très grande

expansion et possèdent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de cellules

mémoires.

Ces résultats montrent que l'interaction entre B7.2 sur les lymphocytes B et le

CD28 chez les lymphocytes T CD8+ des souris Tg n'est pas responsable des

caractéristiques retrouvées au niveau des lymphocytes T CD8+. De plus, comme le même

phénotype se retrouve dans les trois lignées B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de

classe II, on peut affirmer que cette expansion de lymphocytes T CD8+ mémoires est

associée avec l'expression de B7.2 sur les lymphocytes T. En effet, il s'agit du

dénominateur commun qui caractérise les trois lignées B7.2 Tg (Fournier et al., 1997).

Enfin, il est important de souligner que cette expansion phénoménale de lymphocytes T

CD8+ mémoires se produit uniquement dans les souris B7 .2 Tg qui sont déficientes au

niveau du CMH de classe II et qui sont incapables de générer des lymphocytes T CD4+.

Même si en présence de lymphocytes T CD4+ les souris B7.2 Tg ont une légère

diminution du ratio de lymphocytes T CD4+/CD8+, comparativement aux souris non-

transgéniques (Fournier et al., 1997; Yu et al., 2000), l'altération dans l'homéostasie des

lymphocytes T CD8+ atteint des proportions phénoménales en l'absence d'expression de

molécules du CMH de classe II.

69

400 - • •

fil ~ 300 --::t --~ (J

~ "O fil c 200 -0 .... --.... ~

100 - • • 1 1 • 0 • 1 1 1 1

CDS Ctrl CDS Tg B220 Ctrl B220 Tg

Figure 17. Analyse des lymphocytes B et des lymphocytes T CD8+ au niveau de la rate chez les souris CMH II-/- lignée B7.2low. Nombre absolu des lymphocytes B et des lymphocytes T CD8+ (sélection sur les lymphocytes) les lymphocytes B sont marqués avec B220 PE et les lymphocytes T CD8+ sont marqués avec CD8 FITC

Figure 18. Phénotype représentatif des lymphocytes T CDS+ de la rate des souris CMH Il-/- de la lignée B7.2low Ctrl n=3 et Tg n=4 (A) Sélection sur les lymphocytes T CDS+ marquage (CD44 biot, CD62L biot et IL-2R~ biot ) + SA CyC (B) Sélection sur les lymphocytes T CDS+ marquage (CD25 biot et CD69 biot) + SA CyC. (C) Sélection sur les lymphocytes marquage, CDS PE et anti-CD28 (37N) + goat anti-hamster FITC.

70

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CD28

0 OO

3o/o

71

Ctrl

Tg

Figure 19. Profil représentatif de la détection d'IFNy intracellulaires chez les lymphocytes T CD8+ de la rate des souris CMH II -/- lignée B7.2mod Ctrl n=l et Tg n=2 après stimulation avec 5 µg/ml anti-CD3 soluble pendant 3 heures en présence de brefeldine 20µg/ml. Sélection sur les lymphocytes T CD8+ marquages IFNy FITC.

Ctrl

Tg

V 0

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. .

0 o,_"T"T"TTT1rnr-"T"T"TTT1mr-"T"T"TTT1mr-.,....,-rTTmt .,....1 OO 101 102

ClLA-4

72

Figure 20. Profil représentatif de l'expression du CTLA-4 sur les lymphocytes T CD8+ de la rate des souris CMH II -/- de la lignée 31 , Ctrl n= l et Tg n=2. Marquage CTLA-4 PE et CD44 biot + SA CyC.

3.11 Déplétion des lymphocytes T CD4+ chez les souris B7.2 Tg de la

lignée 27

73

Une hypothèse qui pourrait expliquer l'expansion des lymphocytes T CDS+ dans les

souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II, est l'absence de lymphocytes

T CD4+ immuno-régulateurs. Comme nous l'avons mentionné dans l'introduction, les

lymphocytes T CD4+ immuno-régulateurs seraient impliqués au niveau de la tolérance

périphérique. Nous croyons que l'absence de cette population régulatrice dans les souris

B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH de classe II résulterait en un manque important

des mécanismes contrôlant la prolifération des lymphocytes T CDS+. Pour vérifier cette

hypothèse nous avons effectué une déplétion in vivo des lymphocytes T CD4+ dans une

souris B7.2mod. Cette déplétion s'effectue en injectant à intervalles réguliers dans la

cavité péritonéale un anticorps monoclonal, le GKl .5, dirigé contre la molécule CD4.

Comme on peut le constater, après 27 jours de déplétion, la fréquence des lymphocytes T

CD4+, au niveau de la rate, passe de 2S% à S% (Figure 21 A). La déplétion est donc

partielle, ce qui correspond à ce qui est rapporté dans la littérature à ce sujet. En effet,

lors de la déplétion avec le GKl .5, seulement la population de lymphocytes T CD4+ naïfs

est éliminée (Chace et al., 1994). La diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+

dans les souris qui ont subi le traitement avec l'anticorps monoclonale GK 1.5 se traduit

évidemment par une augmentation de la fréquence des lymphocytes T CDS+, ces derniers

passant de 30% à une fréquence de 55% (Figure 21 B). De plus, ces lymphocytes T

CDS+ possèdent une proportion légèrement plus élevée de cellules mémoires que les

lymphocytes T CDS+ pour lesquels il n'y a pas eu de déplétion. Ce changement de

74

phénotype se traduit par l'augmentation de l'expression du CD44 et la diminution de

l'expression du CD62L (Figure 21 C). Malheureusement ces expériences ne nous

permettent pas d'observer une lymphoprolifération des lymphocytes T CD8+ aussi

spectaculaire que celle observée dans les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH

de classe II. Une explication possible pour ce résultat est qu'il n'y a pas de disparition

complète des lymphocytes T CD4+ dans les souris qui ont subi le traitement avec

l'anticorps anti-CD4. De plus, il est important de noter que les lymphocytes T CD4+ qui

ont échappé à la déplétion, possèdent un phénotype de cellules immuno-régulatrices, soit

CD4+ et CD25+ (Figure 21 D). Malgré tout, le nombre de lymphocytes T CDS+

augmente, ainsi que la proportion des lymphocytes T CDS+ mémoire dans les souris B7.2

Tg qui ont été traitées in vivo avec l'anticorps anti-CD4, ce qui suggère que l'absence de

lymphocytes T CD4 + immuno-régulateurs pourrait être à l'origine de l'altération de

l'homéostasie des lymphocytes T CDS+ dans les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du

CMH de classe II.

Figure 21. Phénotype représentatif de la déplétion des lymphocytes T CD4+ avec le GKl .5 chez les souris Tg de la lignée B7.2mod non-déplétées n=2 et déplétées n=4. (A) Sélection sur les lymphocytes, fréquence des lymphocytes T CD4+, marquage CD4 PE. (B) Sélection sur les lymphocytes, fréquence des lymphocytes T CD8+, marquage CD8 PE. (C) Sélection sur les lymphocytes T CD8+ marquage (CD44 biot et CD62L biot) + SA CyC. (D) Sélection sur les lymphocytes T CD4+ marquage CD25 FITC.

75

Ctrl B7.2 Tg V V e e

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76

4. Discussion et conclusion

Nos résultats démontrent clairement que les lymphocytes T CD4+ ainsi que les

lymphocytes T CD8+ sont capables d'éliminer les lymphocytes B chez les souris Tg. La

disparition des lymphocytes B semble prendre origine au niveau même de la moelle

osseuse, là où les lymphocytes B se développent. Cette élimination précoce des

lymphocytes B expliquerait pourquoi leur nombre est autant réduit dans les organes

périphériques, comme dans la rate et les ganglions périphériques. La signification

physiologique du phénomène d'élimination des lymphocytes B qui expriment de façon

constitutive B7.2 par les lymphocytes T en absence d'antigène étranger n'est pas connue.

On a suggéré que cela pouvait représenter un mécanisme de tolérance pour éliminer les

lymphocytes B qui reconnaissent des antigènes du soi au cours de leur développement

(Fournier et al., 1997; Van Parijs., et al 1997). Si ces cellules n'étaient pas éliminées, la

présence d'un haut niveau de la molécule B7.2 pourrait activer des lymphocytes T qui

reconnaissent les peptides du soi présentés à leur surface, et ainsi conduire au

développement de maladies auto-immunes. Il existe quand même une différence

d'efficacité entre les lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans l'élimination des lymphocytes B.

En effet, chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH 1, on ne retrouve

pratiquement plus de cellules B, tandis que chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau

du CMH II, le nombre de lymphocytes B est diminué dans la moelle osseuse et dans la

rate, mais aucunement dans les ganglions périphériques. Les lymphocytes B

périphériques, chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH Il, ont un

phénotype immature. Une explication possible serait que l'élimination des lymphocytes

77

B par les lymphocytes T CD4+ se ferait très tôt dans le développement des cellules B,

tandis que les lymphocytes T CD8+ interviendraient à un stade plus tardif de la

maturation des lymphocytes B. Ceci aurait pour effet de permettre à certains lymphocytes

B de quitter la moelle osseuse avant même d'avoir terminé leur maturation et de se

retrouver dans les organes périphériques. Certaines études indiquent que la rate peut être

un site de maturation des lymphocytes B. De plus, des lymphocytes B avec un phénotype

immature ont été retrouvés dans les ganglions périphériques suggérant qu'il pourrait y

avoir maturation des lymphocytes B en périphérie ailleurs que dans la rate (Rolink et al.,

1998).

En plus d'éliminer les lymphocytes B avec une efficacité différente, les

lymphocytes T CD8+ des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH II et les

lymphocytes T CD4+ des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH I réagissent

différemment. Le nombre de lymphocytes T CD8+ augmente de façon phénoménale en

périphérie, tandis que le nombre de lymphocytes T CD4+ diminue légèrement. La

diminution du nombre de lymphocytes T CD4+ dans les organes lymphoïdes

périphériques des souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH I peut être corrélée avec

la disparition des lymphocytes B. En effet, les lymphocytes T CD4+ naïfs ont besoin pour

survivre en périphérie de signaux provenant de la liaison de leur TCR avec des peptides

du soi présentés par un CMH II (Janeway et al., 1998). On retrouve le CMH II

majoritairement chez les CPA (cellules dendritiques, macrophages, lymphocytes B). Il a

été proposé que le signal nécessaire pour la survie des lymphocytes T CD4+ naïfs

provenait de leur interaction avec des cellules dendritiques (Brocker, 1997 ; Brocker,

1999). Nos expériences démontrent que la diminution des lymphocytes B, dans les souris

78

B7.2 Tg déficientes au niveau du C:MH I, a une incidence sur la survie des lymphocytes T

CD4+ naïfs en périphérie, puisqu'on retrouve un nombre réduit de ces derniers. Ce

résultat ne va pas à l'encontre de la théorie qui dit que les cellules dendritiques sont

capables de fournir un signal de survie aux lymphocytes T CD4+; il soulève cependant la

possibilité que les lymphocytes B pourraient également jouer un rôle semblable.

Comme on observe une diminution massive des lymphocytes B, attribuée aux

lymphocytes T CD4+, il était intéressant de déterminer si l'élimination des lymphocytes

B était accompagnée de changement de phénotype au niveau des lymphocytes T CD4+.

En fait, aucun changement phénotypique n'a été observé, à l'exception d'une diminution

de l'expression à la surface du CD28. Il est déjà connu que le CD28 est intemalisé suite à

son interaction avec ses ligands B7.l et B7.2 (Hwang et al., 2000). Cette diminution est

due à la liaison de la molécule B7.2 exprimée à de hauts niveaux sur les lymphocytes T

CD4+ avec le récepteur CD28, mais non à l'interaction avec la molécules B7.2 exprimée

sur les lymphocytes B. En effet, cette diminution de l'expression du CD28 est déjà

apparente au niveau du thymus. Pour ce qui est de la représentation clonale des

lymphocytes T CD4+, elle ne change pas même lors de l'élimination des lymphocytes B.

Contrairement aux lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+ des souris B7.2

Tg déficientes au niveau du CMH II subissent une expansion phénoménale dans les

organes lymphoïdes périphériques. La rate ainsi que les ganglions périphériques doublent

et parfois même triplent de volume dans ces souris. De plus, on observe un changement

de phénotype des lymphocytes T CD8+. Près de 100% des lymphocytes T CD8+ ont un

phénotype mémoire (CD44élevé, CD45RBmodéré, CD62-Lfaible et IL-2R~modéré) et cela sans

que l'on observe une augmentation des marqueurs d'activation précoce comme CD25 et

79

CD69 (Dutton et al., 199S). On remarque aussi une diminution du niveau d'expression du

TCR, du CD28 ainsi que du CDS à la surface des lymphocytes T CDS+ B7.2 Tg. La

diminution de l'expression de ces molécules à la surface cellulaire suggère que les

lymphocytes T CD8+ ont reçu un signal via l'interaction de leur TCR et du CD28 avec

leurs ligands. Du point de vue fonctionnel, on remarque un plus grand potentiel

cytotoxique chez les lymphocytes T CD8+ B7.2 Tg, que chez les lymphocytes T CD8+

Ctrl. En effet, les lymphocytes T CD8+ B7.2 Tg expriment l' ARNm de plusieurs

molécules effectrices comme la perforine, le fas ligand, le granzyme B et l'IFNy. On

détecte également chez environ 30% des lymphocytes T CD8+ B7.2 Tg la présence

d'INFy intracellulaire suite à la stimulation des lymphocytes T CD8+ via le CD3 pour une

très courte période de temps. La présence d 'IFNy intracellulaire est caractéristique de

cellules T CD8+ mémoires fonctionnelles, puisque suite à une aussi courte stimulation

via leur TCR, les lymphocytes T CDS+ naïfs sont incapables de produire de l'IFNy

(Murali-Krishan et Ahmed, 2000; Goldrath et al., 2000). Les lymphocytes T CD8+ B7.2

Tg infiltrent aussi les organes non-lymphoïdes. La meilleure capacité des cellules

mémoires à migrer en dehors d'organes lymphoïdes expliquerait la présence des

lymphocytes T CD8+ à l'intérieur d'organes non-lymphoïdes. Cela pourrait également

expliquer le fait que les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH II ont une

longévité moins grande que des souris Ctrl. En effet, les lymphocytes cytotoxiques qui

infiltrent les organes possèdent un bagage effecteur complet et ceux-ci ont la capacité de

détruire les cellules, même celles du soi. Il est intéressant de noter que l'infiltration des

lymphocytes T CD8+ B7.2 Tg semble beaucoup plus grande au niveau du système

nerveux central que dans n'importe quel autre organe. Ce résultat est en accord avec deux

80

autres études qui ont démontré une recirculation et/ou accumulation préférentielle des

lymphocytes T CDS+ au niveau du système nerveux central (Carson et al ., 1999; Brabb

et al., 2000).

Une autre caractéristique intéressante est que les lymphocytes T CDS+

s'expandent de façon polyclonale. En effet, le nombre absolu de chacune des chaînes VPs

est augmenté. Par contre, lorsqu'on regarde au niveau de la fréquence de représentation

des différents vps, on remarque que certaines fréquences sont changées de façon

significative par rapport au Ctrl. C'est le cas de la fréquence des chaînes VPs 5 .1-5 .2 et 6

qui est diminuée en faveur de la chaîne Vp S.3. L'augmentation de la fréquence de

certains lymphocytes T, comme ceux qui expriment la chaîne vp S.3, se traduit par une

plus grande baisse de l'expression à la surface cellulaire de cette chaîne vp. Cela peut

avoir comme signification que certains lymphocytes T CDS+ B7 .2 Tg comme ceux

exprimant le vp S.3 sont favorisés dans la reconnaissance d'un antigène par rapport à sa

représentation originale chez une souris Ctrl. Finalement, la caractérisation des

lymphocytes T CDS+ chez les souris B7.2Tg déficientes au niveau du CMH II démontre

une expression augmentée de l'autre récepteur pouvant lier le B7.2 et cela avec 20 fois

plus d'affinité que le CD2S : il s'agit de la molécule CTLA-4. Cette molécule est

reconnue comme étant une molécule inhibitrice de l'activation et de la prolifération des

lymphocytes T. Chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH II, plus du tiers

des cellules CDS+ expriment le CTLA-4 et pourtant on remarque une grande expansion

des lymphocytes cytotoxiques. Il semble donc que le CTLA-4 ne joue pas son rôle dans

la régulation négative de l'activation des lymphocytes T CDS+. Il est déjà connu que le

CTLA-4 régule la réponse primaire et secondaire des lymphocytes T CD4+ lors de leur

81

activation par un peptide spécifique (Chambers et al., 1999), ce qui n'est pas le cas pour

les lymphocytes T CDS+ (Chambers et al., 199S). En effet, une théorie veut que le

CTLA-4 joue un rôle seulement dans la régulation négative de la réponse secondaire des

lymphocytes T CDS+.

Comme mentionné dans l'introduction, l'expression du transgène B7.2 sur les

lymphocytes B est indispensable pour qu'il y ait élimination de ces derniers. Une

question demeure. Est-ce que l'expression du transgène B7.2 sur les lymphocytes B est

également impliquée au niveau de l'expansion et du changement de phénotype des

lymphocytes T CDS+ des souris CMH II déficientes? Pour déterminer si l'expansion des

lymphocytes T CDS+ B7.2 Tg chez les souris CMH II déficientes est une conséquence de

l'élimination des lymphocytes B ou bien de l'interaction entre la molécule B7.2 sur les

lymphocytes T avec le CD2S, nous avons généré des souris CMH II déficientes de la

lignée transgénique B7.2low. Ces souris n'expriment pas le transgène B7.2 sur les

lymphocytes B mais expriment le transgène B7.2 sur les lymphocytes T à des niveaux

identiques aux deux autres lignées B7.2 transgéniques. Comme attendu, dans les souris

B7.2low déficientes au niveau du CMH II, il n'y a pas élimination des lymphocytes B,

puisque cette élimination nécessite l'expression de B7.2 sur les lymphocytes B. Malgré

tout, on remarque une très forte lymphoprolifération des cellules T CDS+. L'expansion

des lymphocytes T CDS+ est également accompagnée par un changement de phénotype

des cellules naïves vers des cellules mémoires, ainsi qu'une diminution d'expression du

CD2S et du CDS à la surface cellulaire. Comme chez les souris des lignées B7.2hi et

B7.2mod, les lymphocytes T CDS+ B7.2 Tg de la lignée de souris B7.2low ne présentent

aucun signe d'activation précoce. Les lymphocytes T CDS+ de la lignée de souris

82

B7.2low, présentent environ le même niveau d'expression de la cytokine IFNy que celui

retrouvé chez les lymphocytes T CD8+ de la lignée de souris B7.2mod. Finalement, le

niveau d'expression du CTLA-4 sur les lymphocytes cytotoxiques est de plus de 50%.

Toutes ces informations nous démontrent qu'il existe une similitude entre les

lymphocytes T CD8+ des différentes lignées de souris B7.2Tg déficientes au niveau du

CMH IL On peut donc en déduire que l'expansion, le changement de phénotype et l'état

fonctionnel cytotoxique des lymphocytes T CD8+ chez les souris B7.2 Tg déficientes au

niveau du CMH II sont dus à l'expression de la molécule B7.2 sur les lymphocytes T,

plutôt que sur les lymphocytes B et que le phénomène observé n'est aucunement la

conséquence de l'élimination des lymphocytes B.

Nous sommes donc en présence d'une expansion périphérique et polyclonale des

lymphocytes T CD8+ mémoires, non-activés, effecteurs et ayant la possibilité d'infiltrer

les organes non-lymphoïdes. Pour qu'un lymphocyte T CD8+ naïf prolifère et devienne

mémoire, il doit obligatoirement recevoir signalisation via le TCR (Tanchot et.al., 1997).

Dans notre cas, les souris B7.2 Tg ont été gardées dans un milieu stérile exempt de

pathogènes. Il semble donc peu probable qu'elles aient rencontré un antigène étranger.

De plus, le phénomène d'expansion des lymphocytes T CD8+ a une incidence de 100%

chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH Il. Une seconde possibilité

expliquant un changement de phénotype des lymphocytes T CD8+ naïfs vers un

phénotype mémoire, est un changement suite à une prolifération homéostatique. La

prolifération homéostatique est un phénomène de maintien de la population

lymphocytaire indépendante de la production de cellules T en provenance du thymus. Ce

phénomène peut être observé expérimentalement lorsque l'on transfert des lymphocytes

83

T chez des souris immunodéficientes, comme les souris Rag -/- , Scid ou chez des souris

irradiées (Murali-Krishna et al., 1999). Dans ces conditions, ce sont des peptides du soi

de faibles affinités pour le TCR qui conduisent à la l'expansion des lymphocytes T naïfs

(Goldrath Bevan et, 1999). Ces peptides sont les mêmes qui sont présentés aux

lymphocytes T immatures lors de la sélection positive dans le thymus et qui leur donnent

un signal de survie (Ernst et al., 1999). Un fait intéressant est que lors de la prolifération

homéostastique, les lymphocytes T naïfs acquièrent tous un phénotype de cellules

mémoires (Goldrath et al., 2000; Surh et Sprent 2000). Lorsque la population totale des

cellules T atteint son niveau initial, il y a alors arrêt de la prolifération; dans aucun cas la

prolifération homéostatique atteint des niveaux aussi élevés de lymphoprolifération

(Goldrath et al., 2000). En effet, la prolifération homéostatique des lymphocytes T arrête

toujours chez les souris lymphopéniques lorsque le niveau de lymphocytes redevient

normal. Dans notre cas on observe une lymphoprolifération des lymphocytes T CDS+ qui

atteint des niveaux non-physiologiques. Ceci écarte donc la possibilité que l'on soit en

présence d'une prolifération homéostatique.

Deux autres hypothèses n'étant pas mutuellement exclusives demeurent. La

première, est qu'il y a absence d'une population immunorégulatrice de lymphocytes T

CD4+ CD25+, chez les souris B7.2Tg déficientes au niveau du CMH Il. L'absence de

cette population immunorégulatrice rendrait possible la prolifération et la différentiation

des lymphocytes T CDS+ suite à la reconnaissance de peptides du soi. La seconde, est que

la liaison de la molécule B7.2Tg sur les lymphocytes T avec ses récepteurs, aurait un

effet différentiel sur les lymphocytes T CDS+ versus les lymphocytes T CD4+. Dans ce

cas-ci, la liaison de la molécule B7.2 avec son récepteur CD2S sur les lymphocytes T

84

CDS+ aurait pour effet de diminuer le seuil d'activation des lymphocytes T CDS+, ce qui

résulterait en une prolifération et une différentiation des cellules cytotoxiques face à des

antigènes du soi. Dans les souris B7 .2 Tg dans lesquelles on retrouve à la fois des

lymphocytes T CD4+ et CDS+, on a observé un léger débalancement dans le ratio

CD4+/CDS+ en faveur des CDS+ (Xu et al., 2000). Cependant, l'augmentation des cellules

CDS+ n'atteint jamais l'expansion phénoménale observée dans les souris B7.2 déficientes

au niveau du CMH II. De plus, ces dernières meurent très jeunes contrairement aux

souris B7.2 Tg dans lesquelles on retrouve à la fois des lymphocytes T CD4+ et CDS+ qui

ont une espérance de vie identique aux souris de type sauvage. Ces résultats suggèrent

fortement que les cellules T CD4+ sont impliquées dans le maintien de l'homéostasie des

cellules CDS+ dans les souris B7.2 Tg.

Un des mécanismes de tolérance connu en périphérie est la présence de cellules

suppressives, soient les lymphocytes T CD4+ CD25+ immunorégulateurs (Shevach,

2000). Cette population cellulaire est absente chez les souris B7.2Tg déficientes au

niveau du CMH II. L'absence de cette population pourrait être responsable du fait que les

lymphocytes T CDS+ prolifèrent de façon incontrôlée. Dans ce cas-ci, la rencontre du

TCR chez les lymphocytes T cytotoxiques avec des peptides du soi, présentés par un

CMH de classe 1, additionnée au signal de costimulation provenant de la liaison de la

molécule B7 .2Tg présente sur les lymphocytes T CDS+ avec le CD2S, conduiraient à

l'expansion et à la différentiation des cellules cytotoxiques. Comme la population de

lymphocytes T CD4+ CD25+ n'est pas absente chez les souris B7.2Tg déficientes au

niveau du CMH 1, les lymphocytes T CD4+ n'auraient pas la possibilité de proliférer

85

contrairement aux lymphocytes T CD8+ des souris B7.2Tg déficientes au niveau du CMH

II.

Pour vérifier le véritable impact de l'absence des lymphocytes T

immunorégulateurs chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH Il, nous avons

déplété les lymphocytes T CD4+ chez des souris de la lignée B7.2 Tg mod. Comme il

avait déjà été observé (Chace et al., 1994) la déplétion n'est pas à 100% efficace, mais on

observe quand même une forte diminution dans la proportion de lymphocytes T CD4+

chez les souris B7.2Tg. Le fait que la fréquence des lymphocytes T CD4+ diminue

semble profiter davantage aux lymphocytes T CD8+. Il semble que les lymphocytes T

CD8+ changent quelque peu de phénotype puisqu'on observe une plus grande proportion

de cellules T CD8+ CD44élevé et CD62Lfaible, ce qui est caractéristique des cellules

mémoires. Une possibilité pouvant expliquer que l'on n'observe pas une expansion aussi

radicale ainsi qu'un changement de phénotype aussi net, est qu'il reste encore beaucoup

de lymphocytes T CD4+. Lorsqu'on caractérise le phénotype des lymphocytes T CD4+

restants, la proportion des cellules T CD4+ CD25+ est augmentée puisque ces cellules

sont plus résistantes à la déplétion par des anticorps (Chace et al., 1994). Les cellules

immunorégulatrices non-déplétées peuvent donc jouer leur rôle dans la répression de la

prolifération des lymphocytes T CD8+. Il nous est donc impossible de conclure de façon

certaine que l'absence des lymphocytes T CD4+ immunorégulateurs soit la cause de la

prolifération et de la différentiation des lymphocytes T CD8+ chez les souris B7.2Tg

déficientes au niveau du CMH IL Par contre, le fait qu'il y ait un léger changement de

phénotype vers un type mémoire nous donne de bons indices sur l'implication des

cellules immunorégulatrices dans le devenir des lymphocytes T CD8+ chez les souris

86

B7.2Tg (Figure 22). Une approche ciblant la déplétion de la population de lymphocytes

T CD4+ CD25+, nous aurait certainement donné une meilleure compréhension de

l'importance de ces cellules immunorégulatrices chez les souris B7.2Tg. Pour dépléter

ces cellules, on pourrait utiliser la méthode de déplétion in vivo qui consiste à injecter

chez les souris B7.2Tg, de façon intrapéritonéal et à intervalles réguliers, un anticorps

qui cible directement le CD25.

Souris B7.2Tg, CMH II déficientes

Cl\1H+Ag du soi ____ .., TCR/CD8

OB7.2Tg-- CD28 Cellules T

Cellule T

Cl\1H+Ag du soi _ __,..,~ TCR/CD8

Souris B7.2Tg

87

Absence de lymphocytes

T CD4+, CD25+

Figure 22. Modèle hypothétique du rôle des lymphocytes T CD4+, CD25+ immunorégulateur dans la tolérance périphérique suite à 1 ' activation des lymphocytes T CD8+ de souris B7,2 Tg face à des peptides du SOI.

88

La deuxième hypothèse consiste en la possibilité qu'il existe une signalisation

différentielle des récepteurs CD28 et/ou CTLA-4 chez les lymphocytes T CD4+ versus

CD8+, suite à la liaison de la molécule B7.2. Cette hypothèse n'est pas mutuellement

exclusive à la possibilité qu'un manque au niveau de la tolérance périphérique soit

également à l'origine de l'expansion et de la différentiation des lymphocytes T CD8+.

Des indices d'effets différentiels de la liaison du CTLA-4 sur les lymphocytes T

CD4+ versus CD8+ sont déjà décrits dans la littérature. Il est bien connu que les souris

déficientes en CTLA-4 meurent rapidement suite à la lymphoprolifération des

lymphocytes T CD4+ et CD8+. Un fait intéressant est que chez les souris déficientes au

niveau du CTLA-4 et des lymphocytes T CD4+, il n'y a pas de lymphoprolifération des

lymphocytes T CD8+. De façon contraire, les souris déficientes au niveau du CTLA-4 et

des lymphocytes T CD8+ meurent rapidement suite à la prolifération des lymphocytes T

CD4+ (Chambers et al., 1999).

Comme expliqué précédemment, la prolifération et la différentiation des

lymphocytes T CD8+ proviendrait de la liaison du TCR avec une molécule du CMH de

classe I présentant des peptides du soi ainsi que du signal de costimulation impliquant le

transgène B7.2 et le CD28, tous deux retrouvés chez les lymphocytes T. La présence du

transgène B7.2 aurait comme effet de réduire le seuil d'activation des lymphocytes T

CD8+, ce qui rendrait possible leur activation suite à la présentation d'antigènes du soi.

L'effet différentiel de la molécule B7.2 pourrait être impliquée à plusieurs niveaux lors

de la signalisation des lymphocytes T via leurs récepteurs . Une des possibilités est que le

signal suivant la liaison de la molécule B7.2 avec le CD28 a un effet beaucoup plus

activateur chez les lymphocytes T CD8+ que chez les lymphocytes T CD4+. Une autre

89

possibilité est que le signal inhibiteur de l'activation passant par la liaison de la molécule

B7.2 et du récepteur CTLA-4 soit plus efficace chez les lymphocytes T CD4+ que chez

les lymphocytes T CDS+. Certainement que la combinaison des deux effets est également

possible (Figure 23). Pour notre part, nous avons détecté la présence de la molécule

CTLA-4 chez les lymphocytes T CDS+ des souris B7.2Tg déficientes au niveau du CMH

II, mais comme mentionné précédemment, il ne semble pas y avoir d'incidence sur la

prolifération des cellules T cytotoxiques. Il aurait également été intéressant de détecter la

présence de la molécule CTLA-4 chez les lymphocytes T CD4+ des souris B7.2Tg

déficientes au niveau du CMH 1, puisque chez celles-ci, la présence de la molécule B7.2

ne conduit pas à une expansion et à une différentiation. Pour vérifier l'hypothèse selon

laquelle la liaison de la molécule B7.2Tg exprimée chez les lymphocytes T CD4+ avec le

CTLA-4 conduit à l'inhibition de leur prolifération, il nous suffirait de bloquer in vivo, à

l'aide d'un anticorps spécifique, la molécule CTLA-4 chez les souris B7.2 Tg déficientes

au niveau du CMH 1. De cette façon, on observerait une lymphoprolifération des

lymphocytes T CD4+, puisqu'il n'y aurait plus aucun signal inhibiteur d'activation de ces

derniers.

90

CMH+ Ag du soi -----. TCR/CD8

OB7.2Tg-- CD28

Cellule T

Cellules T CTLA-4 --B7.2Tg 0 8 1 / Cellule T

CMH+ Ag du soi ----lili- TCR/CD4

Figure 23. Modèle hypothétique de l' effet différentiel de la liaison de la molécule B7.2 exprimée chez les lymphocytes T avec leur récepteur le CD28 et le CTLA-4. La liaison de la molécule B7.2Tg avec le CD28 résulterait en une expansion périphérique des lymphocytes T CD8+, tandis que la liaison de B7.2Tg avec le CTLA-4 résulterait en une inhibition de la prolifération des lymphocytes T CD4+.

91

En conclusion, nos recherches ont permis de démontrer une différence d'efficacité

dans l'élimination des lymphocytes B des souris B7.2 Tg par les lymphocytes T CD4+ et

les lymphocytes T CD8+. Les lymphocytes T CD4+ étant beaucoup plus efficaces dans

l'élimination des lymphocytes B B7.2 Tg que les lymphocytes T CD8+. De plus,

l'élimination des lymphocytes B ne semble pas avoir de répercussion sur les lymphocytes

T CD4+ ou les lymphocytes T CD8+. En effet, la prolifération des lymphocytes T CD8+

observée chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH II ne provient pas de

l'élimination des lymphocytes B et on n'observe aucun changement au niveau des

lymphocytes T CD4+. La prolifération des lymphocytes T CD8+ semble se produire suite

à la reconnaissance de peptides du soi et par l'abaissement du seuil d'activation à cause

de la présence de la molécule B7.2 sur les lymphocytes T. Il demeure évident, lorsque

l'on observe la proportion non physiologique que prend l'expansion des lymphocytes T

CD8+ chez les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH II, qu'il y a un manque soit

au niveau de mécanismes de tolérance périphérique et/ou de l'effet inhibiteur de

l'activation des lymphocytes T CD8+ suite à la signalisation via le CTLA-4. En effet, la

prolifération des lymphocytes T CD8+ ne semble pas du tout contrôlée. Il en résulte que

les souris B7.2 Tg déficientes au niveau du CMH II ont une espérance de vie plus courte

que la moyenne des souris. La molécule B7 .2 sur les lymphocytes T CD8+ vs CD4+

pourrait également jouer un rôle différentiel dans l'activation des deux sous-populations

de lymphocytes T, puisque la réponse des deux types de lymphocytes T est bien

différente l'une de l'autre. Dans cette optique, la liaison de la molécule B7.2 avec le

CD28, tous deux exprimés sur les lymphocytes T CD8+, conduirait à la prolifération et à

92

la différentiation des lymphocytes T cytotoxiques, suite à la liaison de ces derniers avec

des peptides du soi de faible affinité pour le TCR.

Plusieurs voies s'ouvrent à nous dans la poursuite de ces études. Une première

serait de déterminer pourquoi les lymphocytes T CD4+ sont plus efficaces que les

lymphocytes T CD8+ dans l'élimination des lymphocytes B et quel moyen ces

lymphocytes T utilisent pour induire l'apoptose des lymphocytes B. Une autre question

importante serait de déterminer comment les lymphocytes T CD4+ immunorégulateurs

jouent leur rôle dans la tolérance périphérique des cellules CD8+.

93

5. Remerciements

J'aimerais tout d'abord remercier particulièrement le Dr. Sylvie Fournier pour son

support tout au long de l'exécution de mon projet de recherche, et pour les nombreux

conseils et suggestions qu'elle m'a apportés. Je tiens aussi à mentionner mon

appréciation envers le temps qu'elle a investi en moi et la confiance qu'elle m'a donné

tout au long de ma maîtrise. Je ne pourrai jamais te rendre tout ce que tu m'as donné

Sylvie, mais je veux simplement te remercier de tout coeur.

J'aimerais également remercier tous les professeurs du département

d'immunologie, Dr Jana Stankova, Dr Claire Dubois, Dr Gilles Dupuis, Dr Marek Rola-

Plescznski et Dr Patrick McDonald pour la façon dont vous communiquez votre intérêt

envers la science à l'intérieur de vos cours, des présentations et des discussions. J'ai

vraiment apprécié les deux années passées en votre présence.

J'aimerais aussi remercier tous mes collègues de laboratoire, Alexandre

Blanchette mon partenaire de Volleyball, Marcel Brisebois le comique de service, les

stagiaires Josée, Geneviève et Jonathan, pour le plaisir que j'ai eu à travailler avec vous

et la bonne ambiance qui a régnée dans le laboratoire durant ces deux années. J'aimerais

également remercier tous les autres étudiants que j'ai côtoyés, pour les bonnes

discussions que nous avons entretenues.

Finalement, mes derniers mercis vont à ma famille qui m'ont encouragé depuis

mon jeune âge dans mes études et à ma femme que j'aime beaucoup, pour avoir toujours

cru en ma réussite, pour m'avoir appuyé dans les moments de tous les jours, puisque

comme on le sait, la vie ne se limite pas au temps passé en classe ou dans un laboratoire.

94

6. Annexe 1.

Anticorps Clone Concentration Quantité Compagnie

(mg/ml) (µI)

Anti-Hamster 0.7 1 Caltag lab.

FITC

SA-FITC 1 1.5 Caltag lab.

SA-PE 0.3 2.5 Caltag.lab

SA-Cyc 0.5 0.5 Pharmingen.

B7.2 FITC GLl 2.5

B7.2 PE RMMP-1 2 Cederlane

B220 FITC RA3-6B2 0.2 2 Gibco

B220PE RA3-6B2 0.1 3 Cederlane

CD4 FITC H129.19 0.25 0.7 Gibco

CD4PE RM4-4 0.5 1 Pharmingen

CD8 FITC 53-6.7 0.5 1 Pharmingen

CD8PE 53-6.7 0.25 0.7 Gibco

CD23 FITC B3B4 0.5 1 Pharmingen

CD25-biotine 7D4 0.5 1 Pharmingen

CD28 37N 1 1

CD44-biotine Im7 0.5 0.5 Pharmingen

CD45RB- 16A 0.5 0.5 Pharmingen

biotine

95

Anticorps Clone Concentration Quantité Compagnie

(mg/ml) (µl)

CD62-L-biotine MEL-14 0.1 3 Cederlane

CD69-biotine Y245 0.5 0.5 Pharmingen

IL-2RP FITC TM-Bl 0.5 1 Pharmingen

CTLA-4PE U C 10-4F10-11 0.5 2 Pharmingen

INFyFITC XMGl.2 0.5 0.5 Pharmingen

IgM biotine 11/41 0.5 1 Pharmingen

vps FITC 20 Pharmingen

96

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