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Université du Québec Institut National de la Recherche Scientifique
Institut Armand-Frappier
LES SIDÉROPHORES PRODUITS PAR BURKHOLDERIA THAILANDENSIS
Par
Sok Gheck Tan
Mémoire présenté pour l’obtention
du grade Maîtrise ès Sciences (M. Sc.) en Microbiologie appliquée
Jury d’évaluation
Président du jury et François Lépine examinateur interne INRS-Institut Armand-Frappier
Examinateur externe Alain Stinzi Université d’Ottawa
Directeur de recherche Éric Déziel INRS-Institut Armand-Frappier
© Droits réservés de Sok Gheck Tan, 2014
II
Résumé
Les sidérophores sont des chélateurs d’origine biologique présentant une très haute affinité
pour le Fe3+, un élément essentiel à la survie de la plupart des organismes vivants. Ces
molécules sont produites et sécrétées entre autres par les bactéries et les levures en
conditions limitantes en fer. Les sidérophores sont des facteurs de virulence puisqu’ils
compétitionnent avec les protéines de l’hôte pour l’acquisition du fer permettant ainsi la
survie d’un pathogène. Ce projet s’intéresse principalement aux sidérophores produits par la
bactérie Burkholderia thailandensis, un bacille à Gram négatif utilisé comme modèle
alternatif pour le pathogène Burkholderia pseudomallei, l’agent causatif de la mélioïdose. B.
thailandensis est une espèce avirulente phylogénétiquement et phénotypiquement très
similaire à B. pseudomallei. La production de sidérophores par B. pseudomallei a déjà été
confirmée, mais très peu d’informations sont disponibles concernant les types de
sidérophores produits ainsi que les gènes impliqués dans la régulation et la synthèse de ces
molécules. Les principaux objectifs de ce projet sont d’identifier les sidérophores produits par
B. thailandensis puis d’identifier les gènes impliqués dans la régulation et la synthèse de
ceux-ci. Des analyses par chromatographie liquide à haute performance couplée à la
spectrométrie de masse (CLHP-SM) ont permis de déterminer que la pyochéline, un
sidérophore déjà connu, est produite chez cette bactérie. Des criblages par mutagenèse
aléatoire par transposon ont permis d’identifier des gènes nécessaires à la production de la
malléobactine, un sidérophore de la famille des hydroxamates. La production de ce
sidérophore par B. thailandensis a été confirmée par CLHP-SM. Il a été déterminé que la
malléobactine est en fait un groupe de sidérophores formé d’au moins trois congénères
ayant des masses moléculaires différentes. De plus, il s’agit du sidérophore majoritairement
produit chez cette bactérie. Des analyses par CLHP-SM, CLHP-SM en tandem et RMN ont
été faites afin d’élucider la structure, encore inconnue au moment de cette étude, de la
malléobactine.
_________________________ _________________________
Étudiante Directeur de recherche
III
Remerciements
Tout d’abord, je tiens à remercier mon directeur de recherche, le Dr. Eric Déziel. Je le
remercie de m’avoir permis de vivre cette belle expérience académique en me donnant
l’opportunité d’effectuer ma maîtrise dans son laboratoire. Son soutien, ses nombreux
conseils ainsi que sa grande patience ont été fort appréciés. Je remercie aussi le Professeur
François Lépine pour son aide indispensable lors des analyses de CLHP-SM. Merci à
Sylvain Milot pour son aide sur le CHLP-SM. Un grand merci à Marie-Christine Groleau pour
tout son soutien et son aide.
Un merci particulier au Dr. Annelise Chapalain pour sa grande écoute et ses sages conseils!
Un salut à tous les membres passés et actuels du laboratoire qui ont rendu cette expérience
fort agréable. Merci pour les bons moments.
Merci à ma famille et mes amis pour leurs soutiens et leurs encouragements.
Un chapitre important de ma vie se termine avec la remise de ce manuscrit.
Merci infini pour ce parcours mémorable!
IV
Table des matières
Résumé .................................................................................................................................. II
Liste des tableaux ................................................................................................................ IX
Liste des abréviations ............................................................................................................ X
Introduction ............................................................................................................................ 1
Chapitre 1 – Revue de littérature ............................................................................................ 4
1.1. Burkholderia ................................................................................................................ 5
1.1.1. Le complexe Burkholderia cepacia (BCC)............................................................ 7
1.1.2. Burkholderia pseudomallei ................................................................................... 7
1.1.3. Burkholderia thailandensis ................................................................................... 8
1.2 Le quorum sensing ...................................................................................................... 8
1.2.1. Systèmes de quorum sensing chez le complexe Burkholderia cepacia ...............10
1.2.2. Le quorum sensing chez B. pseudomallei, B. thailandensis et B. mallei .............10
1.3 L’importance du Fer ................................................................................................... 11
1.4 Les systèmes d’acquisition du Fer ............................................................................. 13
1.5 Les sidérophores ....................................................................................................... 14
1.6 Sidérophore chez B. pseudomallei ............................................................................ 16
1.7 Sidérophores chez B. thailandensis ........................................................................... 19
Chapitre 2 – Caractérisation de la malléobactine produite par Burkholderia thailandensis ... 21
2.1. La problématique ....................................................................................................... 22
2.2. Les hypothèses du projet ........................................................................................... 22
2.3. Les objectifs ............................................................................................................... 22
2.4. Méthodologie ............................................................................................................. 23
2.4.1. Bactéries.............................................................................................................23
2.4.2. Conditions de cultures ........................................................................................23
2.4.3. Détection des sidérophores ................................................................................24
2.4.4. Mutagénèse, criblages ........................................................................................26
V
2.4.5. Courbes de croissance par BioScreen ................................................................27
2.4.6. Extraction ADN ...................................................................................................27
2.4.7. PCR semi-aléatoire nichée en deux rondes ........................................................28
2.4.8. Préparation des échantillons pour l’analyse par CLHP-SM .................................30
2.4.9. CLHP-SM ...........................................................................................................31
2.4.10. Courbe de croissance par dosage de protéines totales ...................................31
2.4.11. Extraction des sidérophores ............................................................................32
2.4.12. CLHP Préparatif ..............................................................................................33
2.5. Résultats ................................................................................................................... 34
2.5.1. Détection des sidérophores ................................................................................34
2.5.2. Détection de la pyochéline ..................................................................................34
2.5.3. Criblage ..............................................................................................................38
2.5.4. Caractérisation de la malléobactine ....................................................................50
2.5.4.1. Identification des composés de la malléobactine .........................................50
2.5.4.2. Nature chélatrice des composés 636, 620, 612 et 605 Da. ..........................56
2.5.4.3. Similarité structurelle à l’ornibactine .............................................................59
2.5.4.4. Purification de la malléobactine ...................................................................69
2.5.4.5. Détermination de la structure de la malléobactine........................................75
2.6. Discussion ................................................................................................................. 76
2.7. Conclusion ................................................................................................................. 79
Références ........................................................................................................................... 83
Appendice ............................................................................................................................ 90
VI
Liste des Figures
Figure 1. Représentation schématique d’un système de quorum sensing LuxIR chez Vibrio
fisheri. MI, membrane interne; ME, membrane externe. Adapté de (Waters et al., 2005) ...... 9
Figure 2. Classification des sidérophores selon leur fonction chimique : A) hydroxamate, B)
phénolate, C) catécholate, D) carboxylate. ...........................................................................15
Figure 3. Exemples de sidérophores appartenant à la classe des catécholates (A), des
phénolates (B), des hydroxamates (C), des carboxylates (D) et du groupe mixte (E). Tiré de :
(Andrews et al., 2003, Crosa et al., 2002, Miethke et al., 2007, Zajdowicz et al., 2012) ........15
Figure 4. Représentation structurelle de l’ornibactine. Image tirée de (H. Stephan et al.,
1993a). .................................................................................................................................17
Figure 5. Les gènes de la biosynthèse de l’ornibactine chez B. cenocepacia J2315 et les
homologues chez B. pseudomallei K96243 et B. thailandensis E264 (www.burkholderia.com)
.............................................................................................................................................18
Figure 6. A) Présentation des gènes impliqués dans la biosynthèse et la régulation de
l’ornibactine chez B. cenocepacia. B) Schéma représentatif de l’organisation génétique de
l’ornibactine. Le schéma montre entre autre les gènes impliqués dans la biosynthèse du
sidérophore, les gènes engagés dans son transport à l’extérieur et à l’intérieur de la cellule et
les gènes impliqués dans la libération du fer. Tirée de l’article (Thomas, 2007)....................19
Figure 7. Les gènes de la biosynthèse de la pyochéline chez Pseudomonas aeruginosa et
chez les homologues de Burkholderia. .................................................................................20
Figure 8. Effet du type d’agar sur l’efficacité de détection des sidérophores sur géloses
Chrome Azurol S. .................................................................................................................26
Figure 9. Représentation visuelle de la méthode PCR double-ronde semi-arbitraire. ...........30
Figure 10. Production de sidérophores sur gélose CAS. ......................................................34
Figure 11. Détection par CLHP-SM de la pyochéline dans des cultures de bactéries. .........35
Figure 12. Fragmentogramme de l’ion pseudomoléculaire m/z 323 chez B. cepacia ATCC
25416. ..................................................................................................................................36
Figure 13. Fragmentogramme de l’ion pseudomoléculaire m/z 323 chez P. aeruginosa PA14.
.............................................................................................................................................36
Figure 14. Chromatographie de MRM de la transition de l’ion précurseur m/z 323 vers l’ion
fille m/z 222 pour la détection de la pyochéline.....................................................................37
VII
Figure 15. Exemple d’une plaque de criblage effectué sur B. thailandensis E264. ...............39
Figure 16. Exemple d’une plaque de criblage effectué sur le mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3. .....................................................................................................40
Figure 17. Sélection de transposants d’intérêts sur gélose CAS. ..........................................41
Figure 18. Courbes de croissance de mutants obtenus par criblage différentiel phénotypique
.............................................................................................................................................42
Figure 19. Production de sidérophores sur géloses CAS par des mutants. ..........................50
Figure 20. Comparaison de la production des molécules 790, 762 et 636 Da chez
AhlΔmbaS, B. thailandensis E264 et AhlΔmbaF. ................................................................52
Figure 21. Chromatographies des molécules de 790 Da et de 762 Da .................................53
Figure 22. Fragmentogramme des ions précurseurs m/z 791 et m/z 761 chez B.
thailandensis E264. ..............................................................................................................53
Figure 23. Analyse des chromatogrammes des surnageants de E264AhlΔmbaF, B.
thailandensis E264 et AhlΔmbaS. ........................................................................................54
Figure 24. Spectre de masses au temps de rétention 6 à 9 minutes chez le mutant
AhlΔmbaF. Ions d’intérêts : m/z 606, m/z 613, m/z 621 et m/z 637. ......................................55
Figure 25. Comparaison, par CLHP-SM, de la production des molécules d’intérêts 605 Da,
612 Da, 620 Da et 636 Da chez AhlΔmbaS, B. thailandensis E264, AhlΔmbaF et
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3. .....................................................................................................56
Figure 26. Chromatogramme d’un surnageant du mutant AhlΔmbaF avec l’ajout de gallium
[13 mM] ................................................................................................................................58
Figure 27. Chromatogramme d’un surnageant du mutant AhlΔmbaF avec l’ajout de fer [13
mM] ......................................................................................................................................58
Figure 28. Effet de l’ajout de sérine et ornithine sur la production de la malléobactine chez le
mutant AhlΔmbaF .................................................................................................................60
Figure 29. Analyse par CLHP-SM de l’ornibactine-C6 en mode positif. ................................61
Figure 30. Spectre de masses au Rt de l’ornibactine-C6. .....................................................62
Figure 31. Spectre de masses des ions simplement chargés de l’ornibactine-C6. ................63
Figure 32. Spectre de masses des ions doublement chargés de l’ornibactine-C6. ...............63
Figure 33. Fragmentation de l’ion précurseur de l’ornibactine-C6. .......................................64
Figure 34. Chromatogrammes correspondant à l’ornibactine-C6 et l’ornibactine-C8. ...........65
VIII
Figure 35. Spectre de masses au Rt de l’ornibactine-C6 et de l’ornibactine-C8 chez B.
cepacia ATCC2 5146. ..........................................................................................................66
Figure 36. Fragmentogramme de l’ion précurseur de l’ornibactine-C8 (m/z 737) et de
l’ornibactine-C6 (m/z 709) chez B. cepacia ATCC2 5146. ....................................................67
Figure 37. Fragmentation de l’ion précurseur doublement chargé de l’ornibactine-C8 (m/z
369) et de l’ion précurseur doublement chargé de l’ornibactine-C6 (m/z 355) chez B. cepacia
ATCC2 5146. .......................................................................................................................67
Figure 38. Fragmentogramme des ions précurseurs des molécules d’intérêts chez le mutant
AhlΔmbaF. ...........................................................................................................................68
Figure 39. Production de la malléobactine en fonction de la croissance durant 100 heures
chez B. thailandensis............................................................................................................70
Figure 40. Production de la malléobactine 636 Da en fonction de la croissance durant 160
heures chez B. thailandensis. ...............................................................................................71
Figure 41. Représentation schématique de l’extraction de la malléobactine. ........................72
Figure 42. Évaluation quantitative de la malléobacine de 636 Da lors des étapes d’extraction
avec la résine Amberlite XAD-4 (partie 1). ............................................................................73
Figure 43. Évaluation quantitative de la malléobactine de 636 Da lors des étapes d’extraction
avec la résine Amberlite XAD-4 (partie 2). ............................................................................74
Figure 44. Évaluation structurelle des congénères de la malléobactine et de leur précurseurs.
.............................................................................................................................................75
Figure 45. Représentation structurelle de la malléobactine et ses dérivés. Image adapté de
Franke et al. (Franke et al., 2013).........................................................................................80
Figure 46. Gènes de la biosynthèse de la mallébactine selon (Franke et al., 2013) .............81
IX
Liste des tableaux
Tableau 1. Amorces utilisées lors de cette étude. .................................................................29
Tableau 2. Réactifs utilisés pour l’amplification PCR, ronde 1 et ronde 2. ............................29
Tableau 3. Étapes de réaction pour les amplifications PCR, ronde 1 et ronde 2. ..................30
Tableau 4. Quantification de la pyochéline chez les bactéries d’intérêts ...............................38
Tableau 5. Résultats des criblages effectués sur B. thailandensis E264 souche sauvage et le
mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 ..........................................................................................43
Tableau 6. Récapitulatif des gènes préalablement connus pour être reliés à la malléobactine,
obtenus lors des criblages. ...................................................................................................49
Tableau 7. Ions attendu sur les chromatogrammes s’il y a activité chélatrice .......................57
X
Liste des abréviations
QS Quorum Sensing
BCC complexe Burkholderia cepacia
FK Fibrose kystique
MGC Maladie granulomateuse chronique
CLHP Chromatographie liquide à haute performance
CLHP-SM Chromatographie liquide à haute performance couplée à la
spectrométrie de masse
CLHP-SM/SM Chromatographie liquide à haute performance couplée à la
spectrométrie de masse en tandem
Rt Temps de rétention
AHL N-acyl-homosérine lactone
C6-HSL N-hexanoyl-HSL
C8-HSL N-octanoyl-HSL
C10-HSL N-décanoyl-HSL
3-OHC8-HSL N-3-hydroxy-octanoyl-HSL
3-OHC10-HSL N-3-hydroxy-décanoyl-HSL
3-OC14-HSL N-3-oxo-tétradécanoyl-HSL
MM9 Milieu minimal M9
MM9C Milieu minimal M9 chelexé
MM9M Milieu minimal M9 chelexé et enrichi de 10 mM L-sérine et
L-ornithine
CAS Milieu Chrome Azurol S
MRM Multiple Reaction Monitoring
RMN Résonnance magnétique nucléaire
1
Introduction
Les bactéries sont des microorganismes unicellulaires retrouvées dans pratiquement tous
les types d’environnements. Mesurant que quelques micromètres, ces dernières font parties
des plus petits et des plus nombreux organismes vivants sur terre. À l’encontre des cellules
de type eucaryotes que l’on retrouve chez les organismes complexes comme les animaux et
les plantes, les bactéries sont des procaryotes, c’est-à-dire dépourvus de noyau et autres
organelles encapsulées dans des membranes. La diversité étonnante des bactéries se
mesure entre autres à la capacité de certaines à croître dans des conditions diverses et
même parfois hostiles telles que les milieux aux pH extrêmes, les environnements à très
haute et/ou basse température, aux milieux très salins ainsi qu’aux conditions de haute
pression.
La majorité d’entre elles sont inoffensives et même considérées bénéfiques pour les
organismes dits « supérieurs » tels les animaux. De manière naturelle, pensons ici aux
bactéries dans la flore intestinale qui vivent en symbiose avec d’autres microorganismes
pour aider à la digestion ou même aux bactéries qui décomposent la matière organique et la
transforme en source d’énergie et en nutriments. Dans la même ligne de pensée, les axes
d’applications possibles sont aussi nombreux et diversifiés que les environnements où
peuvent croître ces organismes vivants. Par exemple, il n’est pas rare d’utiliser certaines
bactéries dans l’alimentation pour leur propriété probiotique et/ou de conservation,
d’exploiter les vertus de « décomposeurs » des bactéries dans l’environnement pour la
dépollution de produits dangereux des sols et eaux contaminés ou même d’épandre ces
microorganismes en agriculture comme agents de biocontrôle pour la défense des plantes
contre les insectes et les champignons envahissants.
D’autre part, certaines bactéries sont considérées néfastes et même mortelles pour l’humain.
Parmi les maladies causées par des bactéries, on peut compter l’anthrax, la tuberculose, la
méningite et sans oublier les maladies respiratoires qui sont parfois sans conséquence pour
les gens en santé, mais qui peuvent devenir fatales pour une personne immunodéficiente.
Pour contrer ces microorganismes, les antibiotiques sont intensément utilisés. Cependant,
avec le temps et en raison d’un excès d’exposition aux antibiotiques, certaines bactéries sont
devenues résistantes à leur effet et leur nombre ne cesse de croître.
Pour ces raisons, au cours des dernières décennies, les scientifiques cumulent les
recherches afin de trouver de nouvelles approches pour remédier à cette problématique
alarmante. Une effervescence se fait sentir pour la découverte et l’élucidation des
mécanismes et des stratégies qu’emploient les bactéries pour contourner le système
2
immunitaire et ainsi infecter l’hôte. Une de leurs stratégies est notamment leur capacité à
communiquer entre elles ainsi qu’avec leur environnement via ce qu’on appelle le quorum
sensing (QS). Effectivement, les bactéries ont toujours été considérées et étudiées comme
des cellules individuelles. La découverte d’une communication intercellulaire entre certains
organismes procaryotes vient donc révolutionner la manière d’étudier ces derniers et un
intérêt grandissant s’est manifesté à l’égard de leur agissement en communauté. Le QS est
déclenché par l’atteinte d’un seuil critique de la densité de population en lien direct avec la
détection de molécules de signalisation libérées dans l’environnement par les bactéries. Ce
phénomène alerte les bactéries qu’elles sont en nombre suffisant pour activer ou réprimer
l’expression de gènes cibles. Ces gènes regroupent plusieurs facteurs de virulence tels que
la production d’exoenzymes (cellulases, protéases, pectinases) de toxines et même de
sidérophores.
Les sidérophores sont des molécules chélatrices présentant une très haute affinité pour le
Fe3+, un élément essentiel à la survie de la plupart des organismes vivants. Ces molécules
sont produites et sécrétées entre autres par les bactéries et les levures en conditions
limitantes en fer. Les sidérophores sont considérés comme des facteurs de virulence
puisqu’ils compétitionnent avec les protéines de l’hôte (p. ex. transferrine, lactoferrine et
ferritine) pour l’acquisition du fer, permettant ainsi à un pathogène de survivre et d’établir une
infection.
Ce projet s’intéressait tout d’abord aux sidérophores produits par la bactérie Burkholderia
thailandensis, un bacille à Gram négatif utilisé comme modèle alternatif pour le pathogène
Burkholderia pseudomallei, l’agent causatif de la mélioïdose. Il a été confirmé que les deux
bactéries produisent deux types de sidérophores soit la pyochéline et la malléobactine.
Les objectifs principaux de ce projet étaient de caractériser la malléobactine puisque la
structure de cette dernière n’avait pas encore été élucidée et d’identifier les gènes impliqués
dans sa production.
Durant l’étude, la caractérisation structurelle de la malléobactine chez B. thailandensis fut
cependant rapportée par l’équipe de Christian Hertweck (Franke, Ishida et al. 2013). On
confirme dans cet article l’hypothèse émise par Alice et al. (Alice, Lopez et al. 2006) que la
malléobactine est constituée d’un groupe de molécules comportant des masses moléculaires
différentes tout comme l’ornibactine, un sidérophore produit chez quelques membres du
complexe Burkholderia cepacia (BCC). Ce groupe de chercheurs a également identifié les
gènes impliqués dans la régulation et la synthèse de la malléobactine. La majorité des
résultats présentés dans ce mémoire concordent fortement avec les résultats obtenus dans
l’article de Franke et al. (Franke, Ishida et al. 2013). Ceci démontre que les expériences
3
effectuées auraient éventuellement mené aux mêmes conclusions que celles émises par
l’équipe de Christian Hertweck.
4
Chapitre 1 – Revue de littérature
5
1.1. Burkholderia
Le genre Burkholderia est un groupe de bactéries à Gram négatif hautement versatiles
pouvant nicher dans divers environnements. La première espèce de ce genre, initialement
nommé Pseudomonas cepacia, a été découverte en 1949 par le pathologiste Américain
Walter Hagemeyer Burkholder, un pionnier dans la taxonomie bactérienne. Il a décrit cette
bactérie comme étant l’agent étiologique du « sour skin » qui est en fait la pourriture des
bulbes d’oignions (Burkholder, 1950).
En 1992, Yabuuchi et al. (Yabuuchi et al., 1992) proposent et créent le genre Burkholderia,
nom donné en hommage à Bukholder, afin de réunir quelques bactéries appartenant au
groupe d’homologie II du genre Pseudomonas. Ces chercheurs se sont basés sur l’étude de
données telles que des séquençages d’ARNr 16S, d’homologies ADN-ADN, des
compositions de lipides et d’acide gras cellulaires et des caractéristiques phénotypiques pour
ainsi créer le nouveau genre (Coenye et al., 2001, Woods et al., 2006). De nos jours, selon
le LPSN « List of Prokaryotic names with Standing in Normenclature »
(http://www.bacterio.net), le genre comprend 74 espèces dont l’espèce type est Burkholderia
cepacia (Burkholder, 1950, Palleroni et al., 1981).
Tel que mentionné plus haut, les microorganismes appartenant au genre Burkholderia sont
reconnus comme étant des bactéries ubiquitaires ayant des niches écologiques très variées.
En effet, on peut les retrouver dans le sol, la rhizosphère, l’eau ainsi que chez l’humain, les
insectes, les animaux et les plantes (Stoyanova et al., 2007). Initialement, on les considérait
comme étant des bactéries saprophytes affectant les plantes et la rhizosphère, à l’exception
de deux espèces soit B. pseudomallei et B. mallei, qui sont deux pathogènes primaires chez
l’humain et l’animal. Chez les plantes, les Burkholderiaceae peuvent jouer des rôles
contradictoires. En effet, certains d’entre eux sont connus pour avoir une interaction
bénéfique envers les plantes tandis que d’autres sont d’importants phytopathogènes. Par
exemple, Burkholderia phymatum et Burkholderia tuberum vivent en symbiose avec les
fabacées en formant des nodosités pour la fixation de l’azote atmosphérique (Moulin et al.,
2001, Vandamme et al., 2002).
À l’opposé, parmi les phytopathogènes, on peut inclure entre autres B. caryophylli qui
occasionne le flétrissement chez les œillets (Kawanishi et al., 2009), Burkholderia
andropogonis qui cause d’importantes taches brunes et lésions sur les feuilles, les
bourgeons et les tiges chez une grande variété de plantes telles le trèfle blanc et l’œillet. Ce
pathogène fait également des dégâts dans les récoltes plus commerciales et importantes
comme les récoltes du maïs, de pois chiche, du café et du citron (Duan et al., 2009) .
6
En raison de leur grande versatilité, certaines espèces du genre Burkholderia peuvent
s’avérer utiles pour l’environnement et l’agriculture. En effet, ces bactéries ont le potentiel
d’être d’efficaces agents de biocontrôle, de bioremédiation et de promoteurs pour la
croissance des plantes. Cependant, l’utilisation des BCC dans des applications
biotechnologiques reste proscrite pour l’instant puisque certaines espèces sont des
pathogènes opportunistes de l’humain et que la possibilité d’infection reste un enjeu encore
trop important (Vial et al., 2011).
7
1.1.1. Le complexe Burkholderia cepacia (BCC)
Les BCC sont des microorganismes hautement adaptifs retrouvés dans des niches
écologiques très diverses (Vial et al. 2011). Ce sont d’importants pathogènes opportunistes
chez l’humain pouvant causer de graves infections respiratoires. Ces microorganismes ne
sont pas considérés comme une menace pour la population en santé, mais peuvent vite
engendrer des complications aggravantes et même mortelles pour les personnes souffrant
de Fibrose kystique (FK), les gens immunodéprimés ainsi que les personnes atteintes de la
maladie granulomatose septique chronique (MGC). Des études taxonomiques approfondies
ont révélé que le complexe Burkholderia cepacia est composé de 17 espèces très similaires
qui se différencient seulement en combinant une multitude de diagnostics moléculaires
(Sousa et al., 2011).
1.1.2. Burkholderia pseudomallei
B. pseudomallei, comme la majorité des autres espèces du genre Burkholderia, est dit
saprophyte et est retrouvé dans des niches environnementales diverses comme l’eau, les
sols humides et les rizières (Brook et al., 1997). Il s’agit cependant de l’agent étiologique de
la mélioïdose, une maladie infectieuse endémique au Sud-est de l’Asie et au nord de
l’Australie (Dance, 1991). Au même titre que B. mallei qui est l’agent responsable de la
morve chez les animaux, cette bactérie est considérée un pathogène primaire tant chez les
humains que chez les animaux (Coenye et al., 2003). Les individus qui contractent la
mélioïdose peuvent être asymptomatique ou développer de multiples manifestations
cliniques comme des infections pulmonaires et cutanées pouvant rapidement devenir des
pneumonies aigue ou chronique, des abcès, et même évoluer vers une septicémie fatale
(Cheng et al., 2005). L’infection par la bactérie se fait surtout par contact de plaies avec des
sols ou des eaux contaminés, par inhalation de particules infectieuses et plus rarement par
ingestion (Leelarasamee et al., 1989). Les traitements par antibiotiques contre cette bactérie
s’avèrent longs, fastidieux et parfois inefficaces puisque le microorganisme est naturellement
résistant à une panoplie d’antibiotiques. La forme latente peut se maintenir sur des périodes
étendues et des rechutes de la mélioïdose ont même été observées après un traitement
réussi. De plus, ce pathogène est considéré comme une arme biologique potentielle qui peut
présenter un risque de bioterrorisme. Pour ces raisons, cette bactérie nécessite d’être
manipulée avec précaution et requiert un confinement de niveau 3 (Rotz et al., 2002).
8
1.1.3. Burkholderia thailandensis
L’espèce B. thailandensis fut créée lorsque des groupes de chercheurs se sont penchés sur
l’étude de la pathogénicité de B. pseudomallei en comparant des souches virulentes et
avirulentes. Les dissimilitudes observées dans les profils biochimiques, phénotypiques et
génotypiques ont permis de conclure que les souches avirulentes de B. pseudomallei
représentaient en fait une nouvelle espèce à part entière (Brett et al., 1997, Wuthiekanun et
al., 1996). Ce n’est qu’après une analyse phylogénétique de l’ADNr 16s de B. thailandensis
E264, dont le nom initial fut « B. pseudomallei-like E264 », et de B. pseudomallei 1026b, un
isolat clinique virulent, que l’on confirma définitivement la présence d’une nouvelle espèce.
En effet, l’accumulation d’informations sur les différences au niveau de leurs séquences
d’ADNr 16s, de leurs profils biochimiques ainsi que de leur virulence prouve suffisamment
qu’il s’agit bien de deux espèces distinctes et ce même si B. pseudomallei et B. thailandensis
possède un très haut niveau de similarité dans leurs séquences génomiques (Brett et al.,
1998).
Cette découverte a rendu possible une panoplie d’études sur la pathogénicité de B.
pseudomallei. Par exemple, B. thailandensis possède la capacité d’assimiler le L-arabinose
comme source de carbone à l’opposé de B. pseudomallei ainsi que de B. mallei qui ne
possèdent pas l’opéron d’assimilation de l’arabinose. Cette particularité génétique suggère
que les gènes qui encodent l’assimilation de l’arabinose pourrait être considérés comme
« antivirulents » et que la perte de cette capacité autant chez B. pseudomallei que chez B.
mallei serait liée à l’augmentation de la virulence chez ces derniers (Moore et al., 2004).
Cette ressemblance au niveau de la séquence génomique entre B. thailandensis et sa
consœur pathogène ainsi que la non-nécessité d’un confinement de niveau 3, en raison de
son absence de virulence pour l’humain, fait de B. thailandensis le modèle alternatif idéal
pour étudier ses consœurs pathogènes.
1.2 Le quorum sensing
Le QS est un système de communication intercellulaire bien reconnu chez les bactéries.
Cette stratégie permet à ces dernières de déclencher l’expression coordonnée de gènes
particuliers en réponse à une densité précise de leur population (Williams, 2007). À leur tour,
ces gènes dont l’expression est coordonnée par la coopération de la population rendent
possible des phénomènes de groupe tels la formation de biofilm, la motilité de type
swarming, la bioluminescence, ainsi que l’expression de divers facteurs de virulence tels que
9
la production d’exoenzymes, d’antibiotiques et de toxines (Miller et al., 2001, Wade et al.,
2005, Whitehead et al., 2002). Le phénomène du QS a été identifié pour la première fois
chez la bactérie Vibrio fischeri, une bactérie marine bioluminescente qui colonise les organes
à lumière de certains poulpes (Ruby et al., 1999). Chez ce microorganisme, les gènes de la
bioluminescence (lux) sont contrôlés par le système LuxIR (Bassler, 2004). Des études plus
approfondies du mécanisme ont permis d’établir qu’il y avait production d’une molécule de
signalisation diffusible nommée auto-inducteur par une autoinducteur-synthase (I) qui est le
produit du gène luxI. Lorsqu’il est synthétisé, l’auto-inducteur diffuse dans le milieu
extracellulaire et s’accumule. À forte densité cellulaire, sa concentration atteint un certain
seuil qui permet à cette dernière de se lier à un régulateur transcriptionnel (R) qui est le
produit du gène luxR. Cette association permet l’activation de gènes cibles en plus d’activer
l’autoinducteur-synthase elle-même (Figure 1). Il s’agit donc également d’une boucle de
rétroactivité positive, une des caractéristiques majeur du QS (Fuqua et al., 1994). Étant
donné que ce système est le premier à avoir été décrit, on parlera d’homologues au système
LuxIR pour les protéines jouant le même rôle chez d’autres bactéries (Fuqua et al., 1994).
Figure 1. Représentation schématique d’un système de quorum sensing LuxIR chez Vibrio fisheri. MI, membrane interne; ME, membrane externe. Adapté de (Waters et al., 2005)
Des systèmes de QS ont été identifiés chez de nombreuses bactéries à Gram positif et
négatif ainsi que chez certaines mycètes. La majorité des bactéries à Gram négatif
produisent des dérivés d’acides gras nommés N-acyl-homosérine lactones (AHLs) comme
10
molécules de signalisation tandis que chez les Gram positif, la communication se fait plutôt
par l’entremise d’acides aminés et d’oligo-peptides (Miller et al., 2001).
1.2.1. Systèmes de quorum sensing chez le complexe Burkholderia cepacia
Chez les BCC, la présence d’un système de QS a été mise en évidence lors d’une
expérience qui consistait à additionner du surnageant de culture de Pseudomonas
aeruginosa contenant des AHLs dans la culture de B. cepacia. Cette co-culture a stimulé la
production de facteurs de virulence tels des sidérophores, des protéases et des lipases chez
B. cepacia. (McKenney et al., 1995). Cette observation a permis d’appuyer le principe qu’une
communication entre différentes espèces est possible en raison de la haute conservation
génétique des éléments de régulation du QS et de la similarité existante entre la structure
des AHLs produits par ces différentes bactéries. L’identification de gènes homologues à
LuxIR chez B. cepacia a été réalisée par la suite grâce à une mutagénèse aléatoire par
transposon Tn5-OT182 sur la bactérie B. cepacia K56-2. L’observation de mutants
hyperproducteurs de sidérophore sur le milieu solide chrome azurol S (CAS) a tout d’abord
permis l’identification d’un gène homologue à luxR. Cet homologue a été nommé cepR. Au
cours de la même étude, l’homologue de luxI, nommé cepI, a été identifié à 727 pb en amont
de cepR. La synthase CepI produit majoritairement du C6-HSL et du C8-HSL (Lewenza et al.,
1999). Des études subséquentes révèlent que toutes les espèces du BCC possèdent le
système CepIR et produisent du C6-HSL et du C8-HSL (Gotschlich et al., 2001, Lutter et al.,
2001).
1.2.2. Le quorum sensing chez B. pseudomallei, B. thailandensis et B. mallei
B. pseudomallei, B. thailandensis ainsi que B. mallei possèdent des systèmes de QS
homologues (Majerczyk et al., 2014, Smith et al., 1997). Cependant, la complexité de ces
systèmes est plus remarquable chez ces derniers que pour les espèces de BCC. En effet, on
leur associe plusieurs orthologues LuxIR qui produisent une panoplie de molécules de
signalisation différentes. B. pseudomallei et B. thailandensis possèdent trois paires LuxIR
(LuxIR-1, LuxIR-2 et LuxIR-3) ainsi que deux homologues de LuxR (LuxR-4 et LuxR-5) dits
« orphelins » puisqu’aucun homologue LuxI ne leur ai encore associé (Majerczyk et al.,
2014). Le système LuxIR-2 est absent chez B. mallei, ce qui serait le résultat d’une délétion
de la région encodant ce système chez cette espèce (Ong et al., 2004).
11
Chez les trois bactéries, le système LuxIR-1 contrôle la production du C8-HSL (Duerkop et
al., 2007, Song et al., 2005). Chez B. pseudomallei, les systèmes LuxIR-2 et LuxIR-3
produisent quant à eux du 3-OH-C10-HSL et du 3-OH-C8-HSL, respectivement (Gamage et
al., 2011). Chez B. thailandensis, le système LuxIR-2 produit majoritairement du 3-OHC10-
HSL ainsi qu’une petite quantité de 3-OHC8-HSL et le système LuxIR-3 contrôle la
production du 3-OHC8-HSL. Il est rapporté que B. thailandensis synthétise un antibiotique qui
agit contre des bactéries Gram positif et que la production de cet antibiotique est sous le
contrôle de LuxIR-2. Le système LuxIR-3 contrôle également la production du 3-OHC8-HSL
chez B. mallei (Chandler et al., 2009, Duerkop et al., 2009, Ulrich et al., 2004). Le QS chez
B. pseudomallei, nommé BpsIR, est requis pour sa pathogénicité chez des modèles murins.
Le système serait entre autre impliqué dans la sécrétion de quelques facteurs de virulences
tel la phospholipase C et les sidérophores (Chan et al., 2005, Song et al., 2005, Ulrich et al.,
2004). Par homologie, chez B. thailandensis, le système de QS est appelé BtaIR.
1.3 L’importance du Fer
Le fer est un élément fondamental pour la survie des organismes vivants, incluant les
microorganismes. Ce métal agit comme cofacteur pour de nombreuses enzymes impliquées
dans des processus biologiques divers et essentielles comme le transfert d’électrons, le
cycle de Krebs, ainsi que la synthèse de l’ADN (Andrews et al., 2003, Caza et al., 2013). Le
fer existe principalement sous deux formes naturellement réversibles c’est-à-dire le fer
ferreux Fe2+ (forme réduite) ainsi que le fer ferrique Fe3+ (forme oxydée). Malgré son
abondance dans l’environnement, le fer est très peu biodisponible pour les êtres vivants. En
effet, en présence d’oxygène, le fer ferreux tend à s’oxyder spontanément en fer ferrique qui
est très peu soluble à pH neutre. De plus, dans l’environnement, le Fe3+ réagit avec les ions
de OH- pour former des complexes très stables d’hydroxydes ferriques Fe(OH)3. Tous ces
facteurs font en sorte que la concentration du fer ferreux disponible pour l’utilisation des
microorganismes dans l’environnement n’est que de l’ordre de 10-19 à 10-18 M (Miethke et al.,
2007). Dans un hôte mammifère, le fer est vigoureusement séquestré par des protéines
spécialisées telle l’hémoglobine, la ferritine, la lactoferrine et la transferrine afin de maintenir
une homéostasie stricte de cet élément (Miethke et al., 2007, H. M. Yang et al., 1991). En
effet, malgré l’importance de son implication dans les réactions biologiques, le fer est un
élément potentiellement très toxique en raison de la formation intracellulaire de radicaux
hydroxylé OH• (Braun, 1997). Ces radicaux libres se forment suite à une chaîne de réactions
chimiques impliquant entre autres la réduction du fer ferrique en fer ferreux ainsi que la
12
production de dérivés réactifs de l'oxygène qui est en fait une conséquence naturelle liée à la
vie aérobie.
O2- + Fer3+ Fe2+ + O2
Tout débute lorsque des molécules d’oxygène se transforment en radical anion superoxyde
O2- suite à l’acceptation d’un électron. Lorsque cet ion acquiert un deuxième électron, un ion
peroxyde O22- se forme. De prime à bord, cet ion n’est pas toxique. Cependant, ce dernier se
transforme spontanément, à pH physiologique, en peroxyde d'hydrogène H2O2 et en
dioxygène O2 suivant la réaction suivante :
2O2- + 2H+ H2O2 + O2
Lorsque le peroxyde d’hydrogène rencontre le fer ferreux, il se forme une réaction dite « de
Fenton » qui implique l’oxydation du fer ferreux. Le mélange de ces deux réactifs produit
spontanément un radical hydroxyle OH•.
Fe2+ + H2O2 Fe3++ OH- + OH•
Une autre réaction peut également subvenir si le radical anion superoxyde O2- vient à
rencontrer le peroxyde d'hydrogène H2O2. Il y a alors formation du radical hydroxyle OH•
suivant la réaction de Haber – Weiss (Andrews et al., 2003, Halliwell et al., 1984) :
O2- + H2O2 OH• + OH- + O2
Le radical hydroxyle OH• est de loin le plus destructeur puisqu’il peut réagir fortement et
endommager plusieurs molécules organiques cellulaires, telles que la membrane lipidique,
les protéines cellulaires ainsi que l’ADN (Cadet et al., 1999, Chen et al., 1999). Pour ces
raisons, la régulation, le transport, le stockage ainsi que l’utilisation du fer sont
rigoureusement contrôlés chez les êtres vivants. Encore une fois, en raison de tous ces
facteurs, la concentration du fer biodisponible est très faible, de l’ordre du 10-24 M environ
dans le sérum (Cornelis, 2010, Raymond et al., 2003, Wandersman et al., 2004). Ces
Catalysé par Fe
13
concentrations de fer biodisponible ne sont pas suffisantes considérant qu’une cellule
bactérienne nécessite entre 105 à 106 d’ions ferriques afin de maintenir une concentration
interne d’environ 10-6 M (Braun et al., 1999, Raymond et al., 2003).
1.4 Les systèmes d’acquisition du Fer
Comme mentionné plus tôt, le fer est primordial pour la croissance des microorganismes
incluant les bactéries. La capacité d’un pathogène d’acquérir le fer d’un hôte est un des
préalables essentiels pour l’établissement et le maintien d’une infection (Caza et al., 2013,
Payne et al., 1978, H. M. Yang et al., 1991).
Pour faire face à la rareté du fer biodisponible, les bactéries ont établi plusieurs stratégies
d’acquisition. La mise en œuvre de ces mécanismes est dépendante de plusieurs facteurs
dont la disponibilité du fer dans l’environnement, du degré d’oxydation de ce dernier ainsi
que la forme sous laquelle il subsiste (ionique ou complexé) (Andrews et al., 2003).
Il existe deux catégories de mécanismes d’acquisition du fer, la façon directe et la façon
indirecte. De manière directe, le fer ionique peut être assimilé par des perméases suite à
l’action de réductases ou de ferroxidases. Cette méthode d’acquisition se produit
normalement lorsque la concentration du fer est suffisante dans le milieu. L’assimilation du
fer peut également se faire par l’incorporation des protéines de l’hôte qui sont liées à des
ions de fer. On parle ici de protéines spécialisées comme les lactoferrines, les transferrines,
les ferritines les hèmes ainsi que les hémoprotéines. Le grand désavantage avec
l’assimilation des protéines de l’hôte, c’est la nécessité d’un récepteur spécifique pour
chacune de ces sources de fer (Miethke et al., 2007).
Une autre manière d’acquérir le fer, de façon indirecte cette fois-ci, est la sécrétion de
molécules capables d’aller s’associer fortement (chélater) au fer disponible et même d’aller
« extirper » le fer des protéines de l’hôte. Ces molécules sont nommées sidérophores
(Ratledge et al., 2000). Ces dernières sont considérées des facteurs de virulence en raison
de cette capacité d’entrer en compétition avec les protéines d’un hôte pour l’acquisition du
fer et de maintenir la survie d’un pathogène.
14
1.5 Les sidérophores
Les sidérophores sont des molécules de faibles masses moléculaires, généralement moins
de 1 kDa, qui possèdent une très haute affinité pour le fer ferrique (Faraldo-Gomez et al.,
2003). Ces chélateurs sont synthétisés et utilisés par une grande variété de bactéries, de
levures, de moisissures et même par certaines plantes (Crowley et al., 1988, Raymond et
al., 1984). Les sidérophores sont produits seulement durant des périodes importantes de
carence intracellulaire en fer. Présentement on compte environ 500 sidérophores isolés et
caractérisés (Boukhalfa et al., 2002, Lamont et al., 2002).
Les sidérophores forment souvent des liaisons hexadentates avec le fer ferrique satisfaisant
ainsi les six sites de coordination sur l’ion ferrique. Ce complexe extrêmement stable fait
d’eux les plus efficaces ligands du fer retrouvés dans la nature (Winkelmann, 2002). Ces
molécules sont classées en cinq grands groupes selon leur structure chimique et le
groupement impliqué dans la liaison au Fer (Figures 2 et 3). Tout d’abord, il y a la famille des
catécholates dont fait partie l’entérobactine, un sidérophore produit entre autres par les
bactéries Escherichia coli et Salmonella enterica serovar Typhimurium (Crosa et al., 2002). Il
s’agit du sidérophore ayant la plus puissante affinité connue pour le fer ferrique, Kd de 10-52
M (Caza et al., 2013).
La deuxième classe de sidérophores est les hydroxamates, incluant par exemple le
ferrichrome, un sidérophore produit par le basidiomycète Ustilago maydis (Neilands, 1995).
Ces derniers sont considérés d’excellents ligands du fer ferrique puisqu’ils forment
également des liaisons hexadentates avec l’ion. La troisième catégorie de sidérophore est
celle des phénolates. Les sidérophores de ce type sont très semblables aux catécholates
avec cependant un hydroxyle de moins sur l’anneau de benzène. On considère parfois les 2
groupes comme un seul ensemble. On associe la pyochéline, produit par P. aeruginosa,
ainsi que la yersiniabactine, produit par Yersinia pestis, à ce groupe (Ankenbauer et al.,
1988, Carniel, 1999).
Le quatrième groupe est celui des carboxylates qui se distinguent par leurs groupements
carboxyles. La particularité avec ces sidérophores est qu’ils possèdent un pKa se situant
entre 3,5 et 5. Ceci fait d’eux des chélateurs de fer très efficaces lors des conditions de pH
faible (Miethke et al., 2007). Parmi les carboxylates les plus connus, on peut nommer la
staphyloferrine A produite par Staphylococcus ainsi que l’achromobactine produite par
Dickeya dadantii (Konetschny-Rapp et al., 1990, Munzinger et al., 2000).
Le dernier groupe de sidérophore est en fait un mélange des 4 groupes précédents. En effet,
plus les recherches s’approfondissent sur l’étude de ces molécules, plus la classification
15
devient complexe. La découverte de nouveaux sidérophores montre qu’il est possible de
retrouver des structures chimiques pouvant appartenir à au moins deux familles différentes
sur une seule molécule, engendrant ainsi la classification d’un groupe plus hétéroclite, dont
fait partie la mycobactine T produit par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (De Voss et
al., 2000).
Figure 2. Classification des sidérophores selon leur fonction chimique : A) hydroxamate, B) phénolate, C) catécholate, D) carboxylate.
Figure 3. Exemples de sidérophores appartenant à la classe des catécholates (A), des phénolates (B), des hydroxamates (C), des carboxylates (D) et du groupe mixte (E). Tiré de : (Andrews et al., 2003, Crosa et al., 2002, Miethke et al., 2007, Zajdowicz et al., 2012)
16
1.6 Sidérophore chez B. pseudomallei
B. pseudomallei produit de la pyochéline, un sidérophore de la famille des phénolates bien
connu chez P. aeruginosa ainsi qu’un sidérophore de la famille des hydroxamates nommé la
malléobactine (Brandel et al., 2012, H. M. Yang et al., 1991). La malléobactine a été décrite
pour la première fois par Yang et al. (1991) comme étant un sidérophore d’une masse
moléculaire inférieure à 1 kDa provenant de la famille des hydroxamates. On relate dans cet
article que la malléobactine a la capacité d’extirper le fer des transferrines et qu’elle jouerait
un rôle probable dans la pathogénicité de B. pseudomallei. Elle permettrait en effet la
multiplication de l’organisme dans le tissu de l’hôte ainsi que sa survie dans le sang.
Peu de temps après, l’équipe de Pamela Sokol (H. Yang et al., 1993) confirme que la
malléobactine peut en effet extraire le fer des transferrines, et ce à des pH variés.
Néanmoins, les données montrent que c’est à pH 7,4 que l’efficacité de la malléobactine à
acquérir le fer des transferrines est la plus élevée. Il a également été confirmé que ce
sidérophore pouvait entrer en compétition pour le fer avec les lactoferrines à des pH allant
de 5 à 7,4. Cette information est très pertinente puisque la lactoferrine est retrouvée
notamment sur les surfaces mucosales où elle joue un rôle important dans la première ligne
de défense de l’hôte contre les infections et l’inflammation (Ward et al., 2002). Puisque les
infections causées par B. pseudomallei sont principalement initiées dans les régions
mucosales, cette capacité de la malléobactine d’extirper le fer des lactoferrines pourrait jouer
un rôle important durant le stade initial d’une infection. Alice et al. (Alice et al., 2006) ont
ensuite rapporté des masses moléculaires de la malléobactine et stipulent qu’il ne s’agirait
pas d’une seule molécule mais bien d’un groupe de molécules, tout comme l’ornibactine
(Figure 4), un sidérophore produit par les BCC (Agnoli et al., 2006, Meyer et al., 1995).
Notamment, on rapporte une certaine similitude entre la malléobactine et l’ornibactine. En
effet, on leur reconnaît des structures de base analogue, la masse des différents congénères
est très rapprochée, et finalement, il a été observé que malléobactine peut rétablir la
croissance d’un mutant de B. cenocepacia déficient en production d’ornibactine (Alice et al.,
2006).
Pour mieux comprendre cette similitude entre l’ornibactine et la malléobactine, une
comparaison entre les gènes impliqués dans la production des sidérophores chez B.
cenocepacia (identifiés par Agnoli et al. 2006), B. pseudomallei (Alice et al.2006) et B.
thailandensis a été effectuée à partir du site www.burkholderia.com.
Bien que les opérons codant pour les fonctions reliées à la malléobactine et à l’ornibactine
présentent des similitudes (Figure 5), il est possible de remarquer quelques différences
importantes. Tout d’abord, B. pseudomallei ne possède pas les gènes orbK et orbL qui
17
codent pour des protéines similaires à des N-acétyltransferases, protéines essentielles à la
biosynthèse de l’ornibactine (Figure 6) (Agnoli et al., 2006). De plus, B. pseudomallei
possède un gène supplémentaire (BPSL1780) situé en aval du gène BPSL1779, un gène
homologue à orbE chez B. cenocepacia qui code pour un transporteur à ATP Binding
Cassette (ABC), et dont la fonction est encore inconnue. Jusqu’à maintenant, malgré toutes
ces informations, il n’est pas encore clair si la malléobactine et l’ornibactine sont deux
sidérophores distincts ou il s’agit de la même molécule.
Figure 4. Représentation structurelle de l’ornibactine. Image tirée de (H. Stephan et al., 1993a).
18
Figure 5. Les gènes de la biosynthèse de l’ornibactine chez B. cenocepacia J2315 et les homologues chez B. pseudomallei K96243 et B. thailandensis E264 (www.burkholderia.com)
19
Figure 6. A) Présentation des gènes impliqués dans la biosynthèse et la régulation de l’ornibactine chez B. cenocepacia. B) Schéma représentatif de l’organisation génétique de l’ornibactine.
Le schéma B montre entre autre les gènes impliqués dans la biosynthèse du sidérophore, les gènes engagés dans son transport à l’extérieur et à l’intérieur de la cellule et les gènes impliqués dans la libération du fer. Tirée de l’article (Thomas, 2007).
1.7 Sidérophores chez B. thailandensis
B. thailandensis produirait une pyochéline analogue à celle produite par P. aeruginosa et B.
pseudomallei. D’après la Figure 7, les gènes bien connus de la biosynthèse de la pyochéline
de P. aeruginosa sont retrouvés chez B. thailandensis. La seule différence remarquée sur
les gènes de biosynthèse du sidérophore est l’absence d’un homologue au gène fptB
(PA4220) chez B. thailandensis et chez B. pseudomallei. Ce gène fait partie de l’opéron
fptABCX (PA4218_PA4221) qui est impliqué dans le transport de la ferri-pyochéline chez P.
aeruginosa. Cependant, une mutation sur fptB ainsi que sur fptC (PA4219) n’a aucun impact
sur l’utilisation et la production de la pyochéline alors qu’une mutation sur les gènes fptA et
fptX (PA4218) affecte l’utilisation de la pyochéline et diminue la production de cette dernière
A
B
20
(Michel et al., 2007). Ceci suggère que l’absence de ce gène n’affecterait pas la production
de la pyochéline chez B. thailandensis et de même chez B. pseudomallei.
Figure 7. Les gènes de la biosynthèse de la pyochéline chez Pseudomonas aeruginosa et chez les homologues de Burkholderia.
Les gènes nécessaires à la synthèse et la régulation de la pyochéline chez P. aeruginosa PAO1 sont aussi retrouvés chez B. pseudomallei souche K96243 et B. thailandensis E264 (www.burkholderia.com et
www.pseudomonas.com).
Tout comme chez B. pseudomallei, les gènes homologues à la biosynthèse de l’ornibactine
sont également retrouvés chez B. thailandensis (Figure 5). Notons que les mêmes
différences entre les gènes de biosynthèse de l’ornibactine chez B. cenocepacia et B.
pseudomallei sont également retrouvées chez B. thailandensis (absence d’homologues aux
gènes orbK et orbL et présence d’un gène supplémentaire (BTHI2420) homologue à
BPSL1780). Par similitude, B. thailandensis pourrait produire un sidérophore semblable
sinon identique à la malléobactine. Cependant, tout comme mentionné pour B. pseudomallei,
il reste à savoir si la malléobactine est bien un sidérophore distinct de l’ornibactine.
21
Chapitre 2 – Caractérisation de la malléobactine produite par Burkholderia thailandensis
22
2.1. La problématique
Étant phénotypiquement et phylogénétiquement très similaire à B. pseudomallei (Brett et al.,
1998, Haraga et al., 2008), il n’est pas surprenant de retrouver chez B. thailandensis des
gènes homologues aux gènes de la biosynthèses et de la régulation de la malléobactine
décrits chez B. pseudomallei (Figure 5) (Alice et al., 2006). Ceci est un bon indicateur que B.
thailandensis serait en mesure d’utiliser un système impliquant les sidérophores pour
l’acquisition du fer très similaire à celui exprimé par B. pseudomallei. De plus, chez B.
thailandensis, l’identification d’un groupe de gènes (BTH_II1821 à BTH_II1833) ressemblant
fortement aux gènes de la biosynthèse de la pyochéline chez P. aeruginosa suggère que B.
thailandensis serait également en mesure de produire de la pyochéline. Malgré ces
observations, aucune étude concrète n’avait été menée sur B. thailandensis pour confirmer
cette hypothèse. De plus, aucune information, au moment de cette étude, n’était encore
connue sur la structure de la malléobactine. Cette information est pertinente afin de
confirmer si la malléobactine est bel et bien un sidérophore distinct de l’ornibactine.
2.2. Les hypothèses du projet
L’hypothèse du travail était que B. thailandensis produit de la pyochéline et de la
malléobactine et que cette dernière possède une structure différente de l’ornibactine.
2.3. Les objectifs
Les objectifs du projet étaient de confirmer la production de la pyochéline et de la
malléobactine chez B. thailandensis, d’identifier les gènes reliés à la biosynthèse et la
régulation de la malléobactine et finalement d’élucider la structure de cette dernière. Pour
confirmer si un système d’acquisition du fer est fonctionnel chez cette bactérie, la mise en
évidence de la production de sidérophores chez B. thailandensis E264 a été effectuée sur
géloses CAS (Schwyn et al., 1987). Des analyses par CLHP-SM ont permis la détection de
la pyochéline et de la malléobactine. Des criblages par mutagenèse aléatoire par transposon
ont permis d’identifier des gènes nécessaires à la production de la malléobactine. Des
analyses par CLHP-SM, CLHP-SM en tandem et RMN ont été faites afin d’élucider la
structure de la malléobactine.
23
2.4. Méthodologie
2.4.1. Bactéries
Les bactéries étudiées au cours de ce projet étaient la souche E264 de B. thailandensis
isolée en Thaïlande par l’équipe de Donald Woods (Brett et al., 1998), le mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 qui provient d’une mutation par échange allélique non-marqué sur
B. thailandensis E264 (Chandler et al., 2009), la bactérie P. aeruginosa, plus précisément la
souche clinique UCBPP-PA14 (PA14) (Rahme et al., 1995) ainsi que la souche LMG1222 de
B. cepacia (ATCC 25416) qui est la souche référence des BCC (Palleroni et al., 1981). Le
mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 est un mutant qui ne produit plus d’AHLs. Lors d’une étude
antérieure non-publiée, il a été observé que ce mutant surproduit des sidérophores comparé
à la souche sauvage (observation faite sur milieu CAS). C’est en effet par cette même
observation qu’il a été possible de confirmer que B. thailandensis produisait bel et bien des
sidérophores. Ce mutant sera entre autre utile lors du criblage pour la détection de mutants
sous-producteurs de sidérophores. Toutes les bactéries étaient conservées dans 15% de
glycérol à -70˚C, dans des tubes cryogéniques.
2.4.2. Conditions de cultures
Les souches étaient cultivées en pré-culture dans des tubes en verres contenant 3 ml de
Tryptic Soy Broth (TSB) (BD – Difco Laboratories). Les tubes étaient incubés à 37°C avec
agitation dans un tambour rotatif à 240 tours/minute. Le temps d’incubation se situait entre
18 et 24 heures. Lorsque nécessaire, le milieu était supplémenté d’antibiotique.
Le milieu minéral M9 (MM9) contenant par litre de H2O (milli-Q) : 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4,
1 g NH4Cl, 0,5 g NaCl et 3 mg CaCl2 a été utilisé comme milieu limitant en fer pour favoriser
la production de sidérophores. Avant utilisation, le milieu était supplémenté avec 1 mM
MgSO4·7H2O et 0,2% dextrose comme source de carbone. Pour extraire les ions de fer du
MM9 afin de le rendre pauvre en fer, le milieu était traité avec 5 g/L de résine Chelex-100
(Sigma). Le milieu de culture avec résine était mélangé durant 5 heures à température pièce
(TP). La résine était ensuite retirée du milieu par décantation suite à la stérilisation de ce
dernier par passage sur filtre 0,2 µm. La résine Chelex-100 est une résine échangeuse
d’ions utilisée pour extraire les métaux de transition. Il est à noter ici que le MgSO4·7H2O doit
être ajouté après le traitement du milieu MM9 avec la résine puisque le Chelex-100 possède
la propriété de complexer également le Mg, diminuant ainsi l’efficacité de la résine à
complexer le fer.
24
L’inoculation du milieu MM9C (MM9 chelexé) se fait avec une suspension bactérienne
provenant d’une pré-culture effectuée dans du TSB. Les cellules sont tout d’abord lavées
deux fois avec du MM9C puis un aliquote est utilisé pour ensemencer du milieu MM9C afin
d’avoir une densité optique à 600 nm (DO600) initiale de 0,05.
Pour promouvoir la production des sidérophores de B. thailandensis, le milieu MM9C a été
parfois enrichi avec deux acides aminés, 10 mM L-sérine et 10 mM L-ornithine (Sigma). Ce
milieu enrichi portera le nom de MM9M. La croissance se fait à 37oC durant une période de
24 à 100 heures d’incubation dépendamment de l’expérience. Lorsque nécessaire,
l’antibiotique tétracycline (45 µg∙ml-1) était ajouté aux milieux de culture
2.4.3. Détection des sidérophores
Pour détecter la production de sidérophores par les bactéries, un milieu de culture
contenant un colorant, le Chrome Azurol S (CAS), lié à un ion de fer a été utilisé.
Lorsque des sidérophores sont produits, ces derniers brisent la liaison du complexe colorant-
fer libérant ainsi le colorant. Ceci résulte à un changement de coloration du milieu passant
du bleu-vert à une couleur orangé (Schwyn et al., 1987). La préparation du milieu nécessite
les préparations et les étapes suivantes :
Solutions mères
MM9 (10x)
KH2PO4 3 g/L
NaCl 5 g/L
NH4CL 10 g/L
H2O 1 L Autoclaver
1mM FeCl36H2O dans 10 mM HCl
432 l de HCl pure dans 500 ml H2O
0,135g de FeCl36H2O
100mM CaCl2
0,147g dans 10 ml de H2O Autoclaver
HDTMA (Sigma)
0,365 g dans 200 ml de H2O
HDTMA-CAS
Chrome azurol S 0,605 g/L
H2O 500 ml/L
Solution FeCl3 100 ml/L
HDTMA (Ajouter lentement) 400 ml/L
Autoclaver
25
Casamino acide déferré
10 g de casamino acide dans 100 ml de H2O
Extraire le fer avec du 3,8-hydroxyquinoline dans du chloroforme
o 3 g dans 100 ml de chloroforme
o mélanger les 2 solutions de 100 ml
o mélanger pendant 1 heure Extraire avec un volume égale de
chloroforme. Mélanger 1 heure et faire
autoclaver
1M MgCl2
2,03 g dans 10 ml de H2O Faire autoclaver
Glucose 20%
20 g dans 100 ml de H2O Faire filtrer
Préparation du milieu CAS
Étape 1 : Solution principale
H2O 750 ml/L
NaOH 6 g/L
Pipes (Sigma) 30,24 g/L
Mm9 (10x) 100 ml/L (voir dans les solutions mères)
agar 15 g/L
Mélanger ces ingrédients et autoclaver, puis refroidir à 50C
Étape 2 : Ajouter au mélange refroidit
Casamino acide déferrer 30 ml/L (voir dans les solutions mères)
Glucose 20% 10 ml/L
MgCl2 1M 1 ml/L (voir dans les solutions mères)
CaCl2 100mM 1 ml/L (voir dans les solutions mères)
HDTMA-CAS 100 ml/L (voir dans les solutions mères) Mélangez et coulez.
À la préparation de ce milieu, nous avons découvert que l’utilisation de l’agar Noble (Difco)
était préférable à un agar granulé standard (Difco) L’agar Noble est purifié et est
normalement utilisé pour tester des conditions nutritionnelles nécessitant l’absence de
contaminants. Dans notre cas, la différence entre les deux types d’agar se voit surtout dans
la qualité et le contraste des halos produits par les sidérophores. En effet, l’agar Noble
donne un teint vert au milieu comparativement à la couleur bleu-vert normalement observé.
De plus, dans un milieu CAS préparé avec de l’agar Noble, la dimension des halos formés
autour des colonies est beaucoup plus importante (Figure 8). Ceci permet une meilleure
26
analyse visuelle, le but visé par cette amélioration dans le protocole. Notons que l’eau
utilisée pour faire le milieu est de l’eau milli-Q.
Figure 8. Effet du type d’agar sur l’efficacité de détection des sidérophores sur géloses Chrome Azurol S.
Différence entre un milieu CAS contenant A) de l’agar granulé standard et B) de l’agar noble.
2.4.4. Mutagénèse, criblages
Un criblage a été effectué pour trouver des mutants affectés dans des gènes impliqués dans
la production de sidérophores. La méthode utilisée pour les criblages sur les bactéries B.
thailandensis E264 et le triple mutant ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 est la mutagénèse aléatoire par
insertion d’un transposon. La méthode impliquait le transfert du plasmide pIT2 portant le
transposon ISlacZ/hah (6,16 kpb) par conjugaison avec la bactérie Escherichia coli souche
χ7213 (Δasd) (Jacobs et al., 2003, Kang et al., 2002). pIT2 est un vecteur suicide non-
réplicatif chez Burkholderia, alors que χ7213 est un auxotrophe pour le diaminopimelate
(DAP), permettant d’éliminer facilement la souche donneuse. De plus, le transposon
ISlacZ/hah contient un gène résistance à la tétracycline, permettant d’effectuer une
sélectivité des transposants d’intérêts.
Seules les étapes du criblage sur B. thailandensis E264 ont été décrites pour éviter une
redondance d’informations puisque les mêmes étapes sont utilisées pour le criblage du triple
mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3.
Tout d’abord, une culture sur la nuit à 37oC avec agitation de B. thailandensis E264 et d’E.
coli χ7213 a été effectué respectivement dans du TSB ou du TSB modifié contenant 150
µg∙ml-1 tétracycline et 62,5 µg∙ml-1 DAP.
A B
27
Les cultures ont été par la suite diluées dans du TSB à DO600 de 0,05 pour croître jusqu’à
une DO600 de 0,5. Un volume de 100 µl de chaque culture a été mélangé ensemble. Le
mélange a été centrifugé à 6 200 x g durant trois minutes. Le culot de bactérie a ensuite été
resuspendu dans 100 µl NaCl 0,8 %. Des aliquotes de 25 µl ont été déposés sur gélose TSB
contenant 62,5 µg∙ml-1 DAP puis incubé à 37oC pour 24h. Les cellules ont finalement été
recueillies puis resuspendues dans 15 ml NaCl 0,8 %.
Le criblage a été fait sur des plaques de polystyrène de 20 cm x 20 cm contenant 200 ml de
milieu gélosé CAS avec 150 µg∙ml-1 tétracycline pour la sélectivité. Chaque plaque a été
incubée à 37oC pour 72 h et contenait environ 500 colonies. Les colonies produisant un halo
orangé significativement différent de la souche receveuse ont été recueillies puis transférées
dans des plaques de 96 puits contenant du milieu TSB frais. Les plaques de 96 puits ont
ensuite été incubées à 37oC pour 24 h. Par après, les mutants candidats ont été déposés sur
gélose CAS (plaque de 20 cm x 20 cm) sans tétracycline pour une meilleure évaluation de la
formation de halo orangé par rapport aux souches contrôles, soit B. thailandensis E264 ou
soit le triple mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3. Les mutants d’intérêts ont ensuite été identifiés
puis conservés à -20˚C dans du glycérol 15 %.
2.4.5. Courbes de croissance par BioScreen
La vérification de l’absence d’un défaut de croissance des mutants d’intérêts a été effectuée
avec un appareil BioScreen (OY Growth Curves AB, Ltd, Helsinki, Finlande). Cet instrument
permet l’incubation, l’agitation et le suivi de la croissance par spectrophotométrie. L’appareil
a été programmé pour faire une cinétique de croissance durant 24 heures afin de remarquer
les défauts de croissance potentiels de certains mutants. L’inoculation des cultures a été
faite dans du TSB à partir de cultures de 16 heures et ajusté à une DO600 initiale de 0,05.
L’incubation a été faite à 37ºC et les cultures ont été effectuées en triplicata. La croissance
cellulaire par densité optique (DO) (mode balayage, 420-580 nm) a été prise à chaque 15
minutes pour toutes les cultures.
2.4.6. Extraction ADN
L’ADN génomique des transposants sélectionnés a été extrait afin de pouvoir procéder à une
PCR double ronde semi-aléatoire. Pour ce faire, la technique de l’extraction rapide a été
utilisée. À partir d’une pré-culture, 1 ml de culture a été prélevé puis centrifugé à 13 000 x g
durant 1 minute. Le culot a ensuite été lavé deux fois avec 200 μl de PBS puis a été
resuspendu dans 200 μl de PBS et incubé durant 10 minutes à 100˚C. Les tubes ont ensuite
28
été transférés sur la glace pour 10 minutes, puis centrifugés 10 minutes à 13 000 x g.
Finalement, le surnageant, contenant l’ADN, a été transféré dans un nouveau tube puis
conservé à -20˚C.
2.4.7. PCR semi-aléatoire nichée en deux rondes
Suite à l’extraction de l’ADN des transposants considérés intéressants selon leur phénotype
au cours des criblages fait sur B. thailandensis E264 ou le triple mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3, le site d’insertion du transposon était identifié par la méthode PCR
double-ronde semi-aléatoire (Jacobs et al., 2003). En résumé, la méthode consistait à faire
une « première ronde » de PCR avec l’amorce lacZ-211 spécifique au transposon (Tableau
1). L’amorce est couplée à trois amorces aléatoires (CEKG2A, CEKG2B et CEKG2C). Ceci
permet de générer une banque d’amplicons de longueurs différentes ayant comme origine
commune l’extrémité du transposon. La « deuxième ronde » de PCR amplifie les produits
spécifiques de la « première ronde ». Cette fois-ci, une autre amorce interne (lacZ-148)
spécifique au transposon remplace l’amorce lacZ-211. Cette amorce est couplée avec une
autre amorce (CEKG4) qui est spécifique aux amorces aléatoires de la « première ronde ».
La Figure 9 montre un exemple visuel de la méthode PCR double-ronde semi-arbitraire. Les
réactifs et les étapes de réaction pour les amplifications PCR sont présentés au Tableau 2 et
3. Suite à l’amplification, les produits des PCR ont été envoyés au Centre d’innovation
Génome Québec (Université McGill) ou au Centre de la Biologie moléculaire et génomique
fonctionnelle (Institut de la recherche clinique de Montréal) pour le séquençage de l’extrémité
5’ du transposon.
29
Tableau 1. Amorces utilisées lors de cette étude.
Amorce Séquence (5’ à 3’) Réference
lacZ-211
TGCGGGCCTCTTCGCTATTA
(Jacobs et
al., 2003)
lacZ-148 GGGTAACGCCAGGGTTTTCC (Jacobs et
al., 2003)
lacZ-124L CAGTCACGACGTTGTAAAACGACC (Jacobs et
al., 2003)
CEKG2A GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNAGAG (Jacobs et
al., 2003)
CEKG2B GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNACGCC (Jacobs et
al., 2003)
CEKG2C GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT (Jacobs et
al., 2003)
CEKG4 GGCCACGCGTCGACTAGTAC (Jacobs et
al., 2003)
Tableau 2. Réactifs utilisés pour l’amplification PCR, ronde 1 et ronde 2.
A) Ronde 1 B) Ronde 2
Réactif µl par réactif
Rx Tampon maison 10X 1
dNTPs 10 mM 0.2
lacZ-211 (10 pmol/μL) 0.5
CEKG 2A (10 pmol/μL) 2
CEKG 2B (10 pmol/μL) 1
CEKG 2C (10 pmol/μL) 1
H2O (mili-Q) 2.3
Taq enz (0.5 U/μL) 1
ADN (matrice purifiée) 1
TOTAL: 10
Réactif µl par réactif
Rx Tampon maison 10X 5
dNTPs 10 mM 1
lacZ-148 (10 pmol/μL) 2.5
CEKG 4 (10 pmol/μL) 20
H2O (mili-Q) 9.5
Taq enz (0.5 U/μL) 2
Produit de la ronde 1 10
TOTAL: 50
30
Tableau 3. Étapes de réaction pour les amplifications PCR, ronde 1 et ronde 2.
A) Ronde B) Ronde 2
Programme PCR
# cycles Température Temps (min)
1X 95°C 02:00
6X 95°C 00:30
30°C 00:30
72°C 01:30
30X 95°C 00:30
45°C 00:30
72°C 02:00
1X 72°C 05:00
∞ 4°C ∞
Figure 9. Représentation visuelle de la méthode PCR double-ronde semi-arbitraire.
Image tirée de Tremblay, J. (2007)
2.4.8. Préparation des échantillons pour l’analyse par CLHP-SM
Les sidérophores présents dans les cultures de bactéries ont été détectés et analysés par
CLHP-SM. Pour préparer les échantillons pour l’analyse, 1 ml de culture bactérienne était
centrifugé à 16 000 x g durant 15 minutes à température ambiante (25oC) pour enlever les
Programme PCR
# cycles Température Temps (min)
1X 95°C 01:00
30X 95°C 00:30
52°C 00:30
72°C 02:00
1X 72°C 05:00
∞ 4°C ∞
31
cellules. Le surnageant est séparé du culot et les deux phases sont conservées. Un volume
de 500 µl du surnageant a été prélevé et transféré dans un vial en borosilicate et le reste du
surnageant était conservé pour des futurs tests, si nécessaire. À ce 500 µl de surnageant,
une quantité de standards interne, le 4-hydroxy-2-heptyquinoline marqué au deutérium
(HHQ-D4) conservé dans du méthanol, a été ajoutée pour une concentration finale de 5
mg/L (Lepine et al., 2003). La quantification des sidérophores a été faite en intégrant l’aire
sous la courbe des pics chromatographiques correspondants aux ions pseudomoléculaire
(m/z) cibles obtenue par CLHP-SM. Cette intégration est par la suite comparée à celle du
standard interne et un calcul s’en suit avec la concentration du standard interne.
2.4.9. CLHP-SM
Les analyses par CLHP-SM ont été effectuées sur un module CLHP séparatif Waters
Alliance HT 2795 couplée au spectromètre de masse Micromass Quattro Premier XE
(Waters Corporation Milford, Massachusetts, USA). Les échantillons ont été injectés dans
une colonne Phenomenex Kinetex-C8 2.6µ 4.6 mm X 100 mm à un débit de 400 µl / min. Le
programme d’élution passe par un gradient H2O/acétonitrile contenant 1% d’acide acétique.
La phase mobile est initialement composée à 100% H2O. Un changement linéaire des
concentrations entre l’H2O et l’acétonitrile s’effectue jusqu’à un ratio de 100% acétonitrile à
7 minutes. Cette phase mobile est maintenue à 100% acétonitrile jusqu’à 11 minutes puis le
gradient retourne graduellement à 100% H2O pour le reste du programme, c’est-à-dire un
total de 15 minutes. La sortie du CLHP passe par un séparateur en T de type « Valco »
avant d’être injectée dans le spectromètre de masse. Les analyses ont été effectuées par
électronébulisation en mode négatif ou en mode positif, tout dépendent de l’expérience. Le
voltage du capillaire était de 3 kV et le voltage du cône était de 30 V. L’intervalle de masses
allant de m/z 200 à m/z 800 a été programmé pour la détection des sidérophores en mode
balayage.
La spectrométrie de masse en tandem (CLHP-SM/SM) est effectuée dans les mêmes
conditions que le mode balayage. Le voltage variait entre 18 V et 35 V pour la seconde
collision. Le standard interne HHQ-D4 est détecté à un m/z de 248 en mode positif et à un
m/z 246 en mode négatif.
2.4.10. Courbe de croissance par dosage de protéines totales
B. thailandensis forme parfois des agrégats cellulaires dans le milieu MM9 rendant ainsi
l’évaluation de la croissance cellulaire impossible par mesure de DO600. La croissance
32
cellulaire était donc évaluée par dosage de protéines totales plutôt que par DO600. Pour ce
fait, la méthode de Bradford a été employée.
Tout d’abord, il est nécessaire de préparer une solution de NaOH 0.1 N. Par la suite, une
solution réactionnelle de Bradford est préparée. Pour un volume de 100 ml, 80 ml de NaOH
0.1 N est ajouté à 20 ml de réactif de Bradford (Bio-rad). La solution est conservée à 4oC
dans un tube de 50 ml enveloppé de papier d’aluminium.
La deuxième étape consiste à préparer les échantillons à analyser. Les culots bactériens
conservés à l’étape 2.4.9 sont individuellement resuspendus dans 1 ml de NaOH 0.1 N. Les
mélanges sont vortexés puis les échantillons sont incubés à 70oC durant 60 minutes. Après
le temps d’incubation, les solutions sont vortexées à nouveau. Pour chaque échantillon, 1 µl
est ajouté à 1 ml de la solution réactionnelle de Bradford et le tout est mélangé. Le blanc est
préparé avec 1 ml de la solution réactionnelle de Bradford.
L’absorbance est mesurée avec des cuvettes spectrophotométriques à 595 nm et la
quantification des protéines totales est calculée par rapporté à une courbe standard
préparée avec du Bovine serum albumin (BSA).
2.4.11. Extraction des sidérophores
La résine Amberlite XAD-4 (Sigma) a été employée afin d’extraire les sidérophores des
surnageants. Cette résine est conservée dans une solution d’eau contenants des sels
comme le chlorure de sodium et le carbonate de sodium afin de retarder la croissance
bactérienne.
Pour activer la résine, il faut effectuer un lavage et se défaire des sels. La résine est tout
d’abord trempée et agitée dans un excès d’eau milli-Q à proportion de 10% p/v durant 30
minutes et est ensuite laissée décanter. L’eau est ensuite retirée puis la résine est transférée
dans du méthanol à proportion de 10% p/v durant 30 minutes jusqu’à la décantation. Par la
suite, un rinçage rapide au méthanol est répété trois fois. La résine activée est finalement
trempée dans une solution d’eau milli-Q à proportion de 50 % p/v avant d’être utilisée.
Une quantité de résine active (10% p/v) est ajoutée au surnageant de la culture bactérienne.
La solution résine-surnageant est mélangée durant 16 heures à 4oC. La résine est ensuite
récupérée par filtration sur du verre fritté. La résine est lavée dans un volume égal d’eau
purifiée. Les molécules absorbées, incluant les sidérophore, sont ensuite éluées de la résine
avec un excès de méthanol durant 4 heures. Le méthanol est par la suite recueilli par
filtration. La résine est lavée trois fois avec du méthanol. Tous les volumes de méthanol sont
recueillis et combinés. Le méthanol est ensuite évaporé au Rotovap (pompe à vide). Le
33
ballon contenant le résidu est pesé afin d’évaluer la quantité recueillie en mg. Un volume
d’H2O est ensuite ajouté au ballon. La solution est ensuite filtrée sur une membrane de PTFE
0.2 µm pour enlever les particules résiduelles restantes. La solution extraite est à nouveau
concentrée à sec au Rotovap. Le ballon est encore une fois pesé pour évaluer la quantité
recueillie en mg. Un dernier volume d’H2O est ajouté au ballon afin d’avoir une concentration
finale du matériel extrait (sidérophores) de 100 mg/ml.
2.4.12. CLHP Préparatif
La mixture de sidérophores produite par B. thailandensis a été séparée par CLHP préparatif.
Le module utilisé est le Waters Delta Prep 4000 couplé au détecteur Waters 486 (Waters
Corporation Milford, Massachusetts, USA). La séparation des congénères de la
malléobactine s’est effectuée en phase inverse sur une colonne Phenomenex Curosil-PFP
5µ 250 mm x 10.00 mm à un débit de 4 ml/min. Le programme d’élution passe par un
gradient H2O/acétonitrile. La phase mobile est initialement composée à 95 % H2O. Un
changement linéaire des concentrations entre l’H2O et l’acétonitrile s’effectue jusqu’à un
ratio de 100% acétonitrile à 22 minutes. Cette phase mobile est maintenue à 100%
acétonitrile jusqu’à 28 minutes puis le gradient retourne graduellement à 95 % H2O pour le
reste du programme, c’est-à-dire un total de 35 minutes. La détection se fait à une longueur
d’onde de 220 nm.
34
2.5. Résultats
2.5.1. Détection des sidérophores
Suite à 24 heures d’incubation à 37oC, B. thailandensis E264 et le mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 démontrent tous les deux une production de sidérophores sur
géloses CAS (Figure 10). Le triple mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 présente toutefois une
formation de halo nettement plus importante que la souche sauvage, ce qui indique une
production supérieure de sidérophores. Notons cependant que cela ne nous informe pas sur
la nature du ou des sidérophore(s) produit(s).
Figure 10. Production de sidérophores sur gélose CAS.
WT) La souche sauvage B. thailandensis E264 et btaI123) le mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 ont été ensemencés en déposant une goutte de 5 µl de culture sur la surface, puis la gélose ensemencée a été incubée pendant 24h à 37°C.
2.5.2. Détection de la pyochéline
L’analyse du génome de la souche E264 montre la présence de gènes codant pour les
enzymes impliqués dans la synthèse de la pyochéline (voir section 1.7). Pour confirmer que
B. thailandensis produit bel et bien de la pyochéline, une analyse par CLHP-SM a été
effectuée à partir du surnageant de cette bactérie. Une culture de 72 heures dans un milieu
MM9C a été utilisée pour l’analyse. L’expérience s’est faite par électronébulisation négative
en mode balayage. Cette première expérience ne fut pas très concluante puisqu’aucun ion
pseudomoléculaire de la pyochéline, m/z 323, n’a pu être identifié sur le chromatogramme.
L’hypothèse d’un manque de sensibilité dans la détection de la molécule dans ces conditions
expérimentales a donc été émise. Une autre stratégie, celle d’effectuer une spectrométrie de
masse en tandem (CLHP-SM/SM) en mode Multiple Reaction Monitoring (MRM), a donc été
envisagée. Cette méthode permettra premièrement d’abaisser significativement les limites
de détection en minimisant le bruit de fond et deuxième d’effectuer une quantification de la
35
pyochéline. Pour se faire, il était question de trouver tout d’abord les ions « filles » de l’ion
« précurseur » de la pyochéline. Sachant que B. cepacia et P. aeruginosa produisent ce
sidérophore, nous avons tout d’abord évalué la production de la pyochéline chez ces deux
bactéries (Figure 11).
Figure 11. Détection par CLHP-SM de la pyochéline dans des cultures de bactéries.
(A) chez B. cepacia ATCC 25416 et chez (B) P. aeruginosa PA14. L’analyse a été faite par électronébulisation négative en mode balayage. Le temps de rétention de la pyochéline est d’environ 8 minute dans ces conditions et l’ion pseudomoléculaire suivi est m/z 323 puisque la pyochéline possède une masse de 324 Da. Les bactéries ont été cultivées dans du milieu MM9C à 37
oC durant 24h. Aucune extraction de sidérophores n’a été effectuée. Le
surnageant a été directement injecté.
La détection de la pyochéline dans les deux cultures bactériennes confirme la validité de
notre méthode. Afin de déterminer les ions filles, une fragmentation de l’ion précurseur de la
pyochéline a été effectuée pour les deux échantillons. Aux Figures 12 et 13, on remarque
que les ions précurseurs fragmentés présentes des patrons identiques de spectre de
masses confirmant ainsi que les deux bactéries produisent des pyochélines identiques. Les
ions « filles » les plus abondants sont les suivants : m/z 118, m/z 178, m/z 189, m/z 222 et
m/z 245.
36
Figure 12. Fragmentogramme de l’ion pseudomoléculaire m/z 323 chez B. cepacia ATCC 25416.
Figure 13. Fragmentogramme de l’ion pseudomoléculaire m/z 323 chez P. aeruginosa PA14.
Suite à ces résultats, l’ion fille m/z 222 est considéré le plus abondant. Cet ion sera donc
choisi pour faire un suivi MRM de la transition de l’ion précurseur vers l’ion fille, c.-à-d. m/z
323 > m/z 222.
La quantification de la pyochéline dans chaque souche bactérienne a été calculée par
rapport au standard interne qui est le HHQ-D4. Ce standard interne a été ajouté au
surnageant de chaque échantillon à une concentration de 5 mg/L. La molécule HHQ-D4
possède quatre hydrogènes qui ont été remplacés par des ions deutérium (D) afin d’avoir
une molécule synthétique comme standard de quantification. La quantification est donc
arbitraire car non ajustée versus un standard de pyochéline pure.
37
Tel que présenté dans la Figure 14 et le Tableau 4, nous avons été en mesure de quantifier
la production de la pyochéline chez B. cepacia ATCC 25416, P. aeruginosa PA14, le mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 ainsi que B. thailandensis E264. Avec les résultats obtenus, il est
possible de conclure que B. thailandensis possède bien la capacité de produire de la
pyochéline mais que ce dernier n’est pas produit par la souche sauvage dans nos conditions
expérimentales. Cependant, un mutant surproducteur de sidérophores, tel que montré par le
résultat sur gélose CAS (Figure 10), nous permet de bien voir la production. Notons aussi
que B. cepacia est un grand producteur en comparaison avec P. aeruginosa.
Figure 14. Chromatographie de MRM de la transition de l’ion précurseur m/z 323 vers l’ion fille m/z 222 pour la détection de la pyochéline.
A) Standard interne HHQ-D4, Détection de la pyochéline chez B) B. cepacia ATCC 25416, C) P. aeruginosa PA14, D) mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 et E) B. thailandensis E264.
38
Tableau 4. Quantification de la pyochéline chez les bactéries d’intérêts
Identification de la Figure 12
Standard interne et
bactéries Quantité relative de pyochéline produit1
A HHQ-D4 5 mg/L
B B. cepacia ATCC 25416 6,5 mg/L
C P. aeruginosa PA14 63 µg/L
D mutant E264 ΔbtaI1 ΔbtaI2 ΔbtaI3 9 µg/L
E B. thailandensis E264 Aucune détection significative
Quantité relativement calculée par rapport au standard interne HHQ-D4 dont la concentration injecté est de 5 mg/L. Résultat d’une seule injection, d’une seule culture. Les bactéries ont été cultivées dans du milieu MM9C à 37
oC durant 24h. Aucune extraction de sidérophores n’a été effectuée. Le surnageant a été directement
injecté.
2.5.3. Criblage
Afin d’identifier des gènes impliqués dans la production de sidérophores chez B.
thailandensis, nous avons effectué un criblage par mutagénèse aléatoire sur la souche
sauvage E264 ainsi que sur le mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3. La bactérie E. coli χ7213
portant le transposon ISlacZ/hah sur le plasmide pIT2 a été utilisée comme souche
donneuse. Le but de ces criblages était de trouver des gènes de la biosynthèse et de la
régulation de la malléobactine. Le motif d’effectuer deux criblages a été initié par le fait qu’il
est techniquement difficile de visualiser les mutants produisant moins de sidérophores que la
souche sauvage B. thailandensis, car elle ne produit pas un très grand halo sur gélose CAS
(Figure 10). D’autre part, nos travaux préliminaires avaient révélé que le triple mutant des
gènes btaI, ne produisant donc aucune AHL, est un surproducteur de sidérophores. Ce
dernier a donc été utilisé comme souche receveuse pour identifier des mutants produisant
moins de sidérophores.
La Figure 15 montre un exemple de plaque de gélose CAS produite pour le criblage sur la
souche E264. Approximativement 29 650 colonies ont été analysées par Myriam Burns, une
stagiaire d’été.
39
Figure 15. Exemple d’une plaque de criblage effectué sur B. thailandensis E264.
Les transposants sont étalés sur des géloses CAS contenant l’antibiotique tétracycline à une dilution permettant d’observer des colonies bien définies. Après 72h d’incubation à 37°C, le diamètre du halo autour des colonies est noté. La flèche rouge indique une colonie surproductrice. (photo : Myriam Burns)
À la Figure 16, il est possible de voir un exemple de colonie formée par un transposant sous-
producteur obtenue lors d’un criblage avec le mutant surproducteur comme souche
receveuse. Approximativement 31 000 transposants ont été analysés durant ce deuxième
criblage pour un total d’environ 60 000 colonies analysées. La taille du génome de B.
thailandensis E264 est d’environ 6.72 Mb codant près de 5713 gènes prédits. Le nombre de
mutants criblés est considéré suffisant pour l’identification des gènes de biosynthèses de la
malléobactine.
40
Figure 16. Exemple d’une plaque de criblage effectué sur le mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3.
Les transposants sont étalés sur des géloses CAS contenant l’antibiotique tétracycline à une dilution permettant d’observer des colonies bien définies. Après 72h d’incubation à 37°C, le diamètre du halo autour des colonies est noté. La flèche rouge indique une colonie sous-productrice.
En se basant sur la formation de leur halo, près de 6000 candidats ont été présélectionnés et
répliqués sur une nouvelle gélose CAS. La Figure 17 présente un exemple de confirmation
de transposants sur géloses CAS en comparaison avec les souches receveuses B.
thailandensis E264 et le triple mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3.
Suite à cette confirmation, 204 transposants ont été considéré des surproducteurs et 164
ont été confirmé comme sous-producteurs.
41
Figure 17. Sélection de transposants d’intérêts sur gélose CAS.
Les mutants sont comparés aux témoins selon la mesure de leur halo. (Wt, B. thailandensis E264 souche sauvage ; btaI123, mutant E264Δbta1Δbta2Δbta3). Tous les mutants de cette figure proviennent du criblage effectué sur le triple mutant E264Δbta1Δbta2Δbta3.La mesure des halos n’est qu’à titre indicatif, elle n’a pas été
effectuée en triplicata. Il était question ici de faire une présélection (visuelle) arbitraire des mutants d’intérêts comme les mutants 214 et 213 qui présentent une bonne diminution de la production de sidérophore (une production presque égale à la souche sauvage) comparé au triple mutant E264Δbta1Δbta2Δbta3.
La Figure 18 montre un exemple de courbes de croissance des mutants choisis suite à
l’évaluation de leur halo sur gélose CAS en comparaison avec les témoins. Seuls les
mutants ne montrant ni défaut ou retard de croissance ont été sélectionnés pour être
séquencés. On compte approximativement 15 mutants montrant un retard de croissance par
rapport à la souche sauvage. Le tableau 5 montre la liste des mutants pour lesquels le site
d’insertion du transposon a été déterminé.
42
Figure 18. Courbes de croissance de mutants obtenus par criblage différentiel phénotypique sur milieu gélosé CAS.
Les cultures témoins sont la souche sauvage E264 et le triple mutant E264Δbta1Δbta2Δbta3. Du TSB non-ensemencé a été utilisé comme témoin négatif (blanc). Les souches (en triplicata) ont été cultivées dans du TSB liquide. Les prélèvements de densité optique (balayage 420-580 nm) pour les courbes de croissance ont été effectués par Bioscreen (Growth Curves AB) sur une période de 24h d’incubation à 37°C.
43
Tableau 5. Résultats des criblages effectués sur B. thailandensis E264 souche sauvage et le mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3
Mutants1 Chromosome
Gènes (redondance) /
nom
Position du transposon (pb à partir du début du gène)
2
Brin3
Position du gène
dans l’opéron
Production de Sidérophores
4
(sous-production : - surproduction : +)
VS la souche receveuse
Fonction du gène5
1 2670521 - 2670793 51
- Région intergénique (entre BTH_II2171
et BTH_II2172)
m64 1 BTH_I2534 270 - 1/2 +
Régulateur de réponse contenant un domaine de récepteur de type CheY,
ATPase de type AAA, domaines de liaison à l’ADN
m34 1 BTH_I2751 24 + 1/2 + GalM, enzyme Galactose mutarotase et
autres enzymes reliées
104 1 1242806 - 1242992 64 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_I1099
et BTH_I1100)
88 1 2936270 - 2936689 127 N/A N/A - Région intergénique (entre BTH_I2569
et BTH_I2570)
141 1 BTH_I0658 / rfaF 636 - N/A - Processus relié à la biosynthèse de la
lipopolysaccharide
54 1 3571672 - 3573270 815 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_I3133
et BTH_I3134)
m56 2 1101623 - 1102704 436 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_II0937
et BTH_II0936)
m43 1 1580151 - 1581042 10 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_I1403
et BTH_I1404)
108 1 BTH_I0007 1058 + 1/3 + Voie de sécrétion de Type II, composant
PulD
42 1 BTH_I0116 (4) 1744 + 2/2 - bactériophage phiC31, protéine de
résistance pglZ
131 1 BTH_I0188 312 + 2/5 + Épimérase L-alanine-DL-glutamate et enzymes reliés à la superfamille des
44
énolases
193 1 BTH_I0250 478 + 1/3 - Protéine FlgK associée au flagelle
190 1 BTH_I0432 574 + 1/5 - Protéine hypothétique
G3 1 BTH_I0640 (2) 1026 - N/A + Transporteur de type « major facilitator
family »
m53 1 BTH_I0727 730 - N/A + Synthétases acyl-CoA réductase
(formation AMP) / ligases AMP-acide II
90 1 BTH_I0738 402 - N/A + 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase
103 1 BTH_I0781 273 - N/A + Protéine de réparation d’ADN (RadC)
133 1 BTH_I1094 394 - N/A +
Régulateur de réponse contenant un domaine de récepteur CheY et un domaine de liaison à l'ADN HTH
13 1 BTH_I1099 (4) 2522 + N/A + 23S ribosomal ARN
104 1 BTH_I1101 -123 + 1/2 + Transposase et dérivés inactivés
214 1 BTH_I1195 1698 + N/A - transketolase
99 1 BTH_I1268 518 - 3/4 + Paraquat inductible protéine B
m5 1 BTH_I1403 (7) /
hmqR 179 - 1/3 +
Régulateur transcriptionnel de type LysR
G5 1 BTH_I1457 -295 + 1/2 + Co-chaperon GroES (HSP10)
14 1 BTH_I1531 159 - N/A + 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate
synthase
130 1 BTH_I1615 (2) 16 - 1/2 + Asp-tRNAAsn/Glu-tRNAGln
amidotransférase sous-unité A et autres amidases reliées
208 1 BTH_I1658 666 + N/A - Protéine du domaine radical SAM
110 1 BTH_I1756 1411 - N/A +
Système de transport multidrogue de type ABC, ATPase et composants
perméase
m47 1 BTH_I1878 68 + 2/2 + Domaine DnaJ- contenant protéines 1
(co-chaperon HscB; Provisoir)
109 1 BTH_I1882 114 - N/A + Lipoprotéine membrane externe
45
70 1 BTH_I1951 1031 - 1/3 + RND – efflux multidrogue-protéine
membranaire MexE
151 1 BTH_I2059 0 - N/A + transporteur
147 1 BTH_I2127 330 + 2/2 + Homologue de la sous-unité gamma-
décarboxylase carboxymuconolactone
46 1 BTH_I2417 (2) /
mbaJ 4 - 2/4 -
Modules peptide synthétase non-ribosomique et protéines apparentées
40 1 BTH_I2418 / mbaI 7733 - 1/4 - Modules peptide synthétase non-
ribosomique et protéines apparentées
m8 1 BTH_I2423 / mbaD 1898 - 3/3 + Sous-unité de transporteur perméase
d’un complexe fer-hydroxamate
m9 1 BTH_I2424 / mbaC 737 - 4/4 +
Systèmes de transport de type ABC cobalamine/Fe3 +-sidérophores,
composants ATPase
152 1 BTH_I2427 / mbsS -14 - 1/4 - Facteur sigma-70, fonction
extracytoplasmique
198 1 BTH_I2503 -72 - N/A - Protéine hypothétique
62 1 BTH_I2519 1901 - N/A - Exoribonucléase R
180 1 BTH_I2535(4) 1772 - 9/9 - helicase/secretion, protéine de type
TadE
m29 1 BTH_I2537 264 - 7/9 + Flp protéine d'assemblage de pili TadD,
contient des répétions TPR
m20 1 BTH_I2539 (4) 545 - 5/9 + Flp protéine d'assemblage de pili TadB
m45 1 BTH_I2554 / lpdA-1 114 - 2/2 +
Complexe Pyruvate/2-oxoglutarate dehydrogénase, composante
dihydrolipoamide dehydrogénase (E3), et enzymes reliées
7 1 BTH_I2569 90 - N/A + Régulateur transcriptionnel de type
LysR
105 1 BTH_I2705 2196 - 1/5 + Élément Rhs, protéine Vgr
216 1 BTH_I2716 317 - N/A - Régulateur transcriptionnel de type
LysR
m35 1 BTH_I2954 2483 + 2/3 + protéine du système de sécrétion Type
46
VI, composante VasK
m70 1 BTH_I3014 4832 - 1/2 +
Glutamate synthase (GltS), amidotransférases de glutamine classe
II (Gn-AT)
141 1 BTH_I3127 -266 + N/A - Protéine hypothétique
54 1 BTH_I3134 -784 + N/A + Prediction d’un régulateur
transcriptionnel avec un domaine CBS en C-terminal
22 1 BTH_I3136 (2) 1725 + N/A +
Transporteur de type ABC, sous-unité de liaison d'ATP, système alcool
déshydrogénase PQQ-dépendante
33 1 BTH_I3208 160 - N/A + Protéine hypothétique
58 1 BTH_I3221 48 - N/A + Protéine de type AraC, domaine de
liaison à l’ADN
m58 1 3679320 - 3682589 1502 N/A N/A + Région intergénique (entreBTH_I3230 et
BTH_I3231)
149 2 BTH_II0035 227 - N/A + Régulateur transcriptionnel Crp/FNR
m10 2 BTH_II0164 / flhB 186 - 6/7 + Voie de biosynthèse des flagelles,
composante FlhB
m19 2 BTH_II0169 868 - 1/7 + Protéine flagellaire FliM
89 2 BTH_II0186 432 + 3/3 + Protéine flagellaire (flgD)
92 2 BTH_II0295 132 - 2/2 - Transporteur pour la résistance aux
médicaments de la famille EmrB/QacA : perméase efflux Arabinose
m69 2 BTH_II0480 1802 + 2/4 + Cytochrome oxydase d'ubiquinol o,
sous-unité I
m42 2 591314 - 592175 818 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_II0499
et BTH_II0500)
199 2 BTH_II0715 -163 - N/A - Predicttion d’une acyltransférases
m55 2 944125 - 944778 223 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_II0805
et BTH_II0806)
31 2 BTH_II0937 (2) 1099 + N/A + Protéine hypothétique
47
210 2 BTH_II1515 104 + N/A + Prédiction d’un transducteur de signal : protéine contenant le domaine CBS et
une liaison cAMP
m67 2 BTH_II1576 / hmqL -65 + N/A + Activité oxidoréductase, jouant le rôle d’un donneur singulier en incorporant
une molécule d’oxygène
m26
2
BTH_II1929 (2) /
hmqG
723
-
N/A
+
Protéine hypothétique
m32 2 BTH_II1933 / hmqC 410 - 3/7 +
3-oxoacyl-(protéine de type acyl-transporteur) synthase III (processus de
biosynthèse des HMAQ)
m27 2 BTH_II2024 (2) 38 + 1/3 + Protéine périplasmique TonB, relie la
membrane interne et externe
m6 2 BTH_II2032 1047 - 4/4 + Polyferredoxin
55 2 BTH_II2070 422 + 1/2 - Protéine de la famille des aldehyde
dehydrogénase
2 2 BTH_II2072 1083 + 1/2 - Transporteur de type « major facilitator
family »: Arabinose efflux perméase
m17 2 BTH_II2188 -1 - 2/4 + methylcitrate synthase
m1 2 BTH_II2189 / prpB 760 - 1/4 + Actvité methylisocitrate lyase (PEP
phosphonomutase et enzymes reliées)
188 2 BTH_II2341 316 - N/A - Protéine hypothétique
34 2 BTH_II2342 848 - 7/7 + Protéine hypothétique
m23 1 BTH_I3190 (2) 120 + N/A + Perméase reliée à l’assimilation du
Glycerol (Major Intrinsic Protein Family)
m61 1 BTH_I1878 / hscB 63 + 1/2 + Protéine servant à l’assemblage du Fe-
S (co-chaperon HscB)
m33 2 1846389 - 1846961 558 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_II1575
et BTH_II1576)
m4 1 2163997 - 2164929 599 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_I1915
et BTH_I1916)
m13 2 1846389 - 1846961 470 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_II1575
et BTH_II1576)
48
m28 1 1102582 - 1102694 20 N/A N/A + Région intergénique (entre BTH_I1915
et BTH_I1916)
G1 1 BTH_I2422 (3) /
mbaF 688 - 2/3 +
Protéine réducatase (FhuF) du complexe sidérophore-Fer
1. L’identification numérique précédée d’un « m » représente les mutants trouvés chez la bactérie B .thailandensis E264 souche sauvage. Les autres ont été générés dans le mutant surproducteur 2. Le signe (-) signifie que la position du transposon débute avant le gène 3. Le signe + ou – fait référence au brin codant identifié par BLAST (http://www.burkholderia.com) 4. La production de sidérophores est basée sur la mesure du halo des mutants sure Pétri CAS comparé à leur contrôle référent (B. thailandensis souche sauvage ou mutant E264Δbta1Δbta2Δbta3) 5. Les fonctions prédites des gènes sont listés sur le site web Burkholderia (http://www.burkholderia.com
49
Le criblage nous a donné des résultats très intéressants. Notamment, il a été
possible d’identifier, chez B. thailandensis, quelques gènes de la biosynthèse et de la
régulation de la malléobactine tels que décrit dans l’article d’Alice et al. 2006, ce qui
valide l’approche expérimentale choisie.
Par homologie avec les gènes de la biosynthèse et de la régulation de l’ornibactine
chez B. cenocepacia, une interruption des gènes mbaI, mbaJ et mbaS (gènes
directement reliés à la biosynthèse de la malléobactine) devrait résulter en une
diminution dans la production du sidérophore. Cette hypothèse est confirmée avec
nos résultats du criblage. À l’opposée, une interruption des gènes mbaD, mbaC et
mbaF (gènes reliés à la régulation de la malléobactine) devrait augmenter la
production du sidérophore. Encore une fois, cette observation est confirmée dans les
résultats du criblage. Notons ici que les noms donnés aux gènes de la malléobactine
proviennent de l’article Alice et al. 2006 (Tableau 6).
Tableau 6. Récapitulatif des gènes préalablement connus pour être reliés à la malléobactine, obtenus lors des criblages.
Homologues chez B. cenocepacia
Gènes mutés chez B. thailandensis
Production de sidérophores
par rapport à la souche
sauvage E264
Fonction
BCAL1697 / orbJ BTH_I2417 / mbaJ - Non-ribosomal peptide
synthetase modules and related proteins
BCAL1696 / orbI BTH_I2418 / mbaI - Non-ribosomal peptide
synthetase modules and related proteins
BCAL1692 / orbD BTH_I2423 / mbaD + iron-hydroxamate
transporter permease subunit
BCAL1691 / orbC BTH_I2424 / mbaC +
ABC-type cobalamin/Fe3+-sidérophores transport
systems, ATPase components
BCAl1688 / orbS BTH_I2427 / mbaS - extracytoplasmic-function
sigma-70 factor
BCAL1693 / orbF BTH_I2422 / mbaF + sidérophore-iron reductase
FhuF
L’identification de mutants dans les gènes mbaS et mbaF se révèle très utile pour la
continuation du projet. En effet, comme le montre la Figure 19, le mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3ΔmbaS (renommé AhlΔmbaS) et le mutant
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3ΔmbaF (renommé AhlΔmbaF) démontrent une variation très
marquée dans la production de sidérophores. En effet, AhlΔmbaS ne produit presque
50
pas de halo comparé à la souche sauvage tandis que AhlΔmbaF produit un halo
similaire au surproducteur E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 c’est-à-dire une surproduction
par rapport à la souche sauvage. Ce résultat est très pertinent puisque la presque
absence de halo autour du mutant AhlΔmbaS montre que la malléobactine serait
très probablement le sidérophores principalement produit chez B. thailandensis. Ces
deux mutants seront utilisés ultérieurement pour étudier d’avantage la caractérisation
de la malléobactine chez B. thailandensis.
Figure 19. Production de sidérophores sur géloses CAS par des mutants.
A) B. thailandensis souche sauvage B) mutant AhlΔmbaS C) mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 et D) mutant AhlΔmbaF Les bactéries ont été ensemencées en déposant une goutte de 5 µl de culture sur la
surface, puis la gélose ensemencée a été incubée pendant 24h à 37°C.
2.5.4. Caractérisation de la malléobactine
2.5.4.1. Identification des composés de la malléobactine
Selon la littérature, nous savons que la malléobactine est un sidérophore de la
famille des hydroxamates similaire à l’ornibactine (Agnoli et al., 2006, Majerczyk et
al., 2014, H. M. Yang et al., 1991). Nous savons également que la malléobactine
serait en fait un groupe de molécules avec des masses moléculaires de 790 Da, 762
Da et 636 Da. L’article d’Alice et al. 2006 suggère que les deux composés de
masses 790 et 762 Da identifiés comme étant la malléobactine seraient en fait
de l’ornibactine, plus précisément de l’ornibactine-C8 et de l’ornibactine-C6
51
respectivement. Il n’est pas précisé dans l’article s’il est question des formes apo ou
ferri (sans ou avec ion de fer) mais ces masses suggéreraient plutôt des formes ferri-
ornibactine (H. Stephan et al., 1993a) .
Comme mentionnée plus tôt, trois composés, dont les masses sont 790, 762 et 636
Da ont été identifiés comme étant de la ferri-malléobactine (Alice et al., 2006). Nous
avons investigué les surnageants, par CLHP-SM, de B. thailandensis E264,
AhlΔmbaS et AhlΔmbaF afin d’identifier la présence de ces trois composés.
Curieusement, seules les molécules de masses 790 et 762 Da étaient visibles en
mode négatif tandis que la molécule de 636 Da était seulement visible en mode
positif. De plus, les deux molécules de 790 et 762 Da possèdent des temps de
rétention supérieurs au standard interne HHQ-D4 tandis que la molécule de 636 Da
possède un temps de rétention inférieur au standard interne. Ces informations nous
indiquent déjà qu’il y a une différence dans la nature de ces molécules contrairement
à ce qu’il est décrit dans Alice et al. 2006.
Autre observation importante, la production des composées 790 et 762 Da ne
concorde pas avec la nature de la mutation chez AhlΔmbaS et AhlΔmbaF. En effet,
une mutation sur le gène mbaS devrait montrer une réduction dans la production de
la malléobactine et une mutation sur le gène mbaF devrait montrer une augmentation
de cette production, hors tel n’est pas le cas observé. Comme le montre la Figure 20,
la molécule 790 Da est également produite dans les trois souches tandis que la
molécule de 762 Da est sous produite chez AhlΔmbaS et AhlΔmbaF par rapport à la
souche sauvage. Seule la production du composé 636 Da est en concordance avec
les attentes. Ceci indique fortement que Alice et al. ont tiré des conclusions erronées
concernant l’identité de ces molécules puisque les molécules de 790 et 762 Da ne
semblent pas du tout être reliées à la malléobactine.
52
Figure 20. Comparaison de la production des molécules 790, 762 et 636 Da chez AhlΔmbaS, B. thailandensis E264 et AhlΔmbaF.
Quantification arbitraire basée sur le standard interne HHQ-D4. Les analyses ont été effectuées par électronébulisation positif en mode balayage. Les bactéries ont été cultivées dans du MM9C durant 72h à 37
oC. Le graphique est dépourvu d’écart-type car l’analyse a été faite en un seul exemplaire. Le but
ici était d’observer si une variation dans la production des molécules 790, 762 et 636 était observable chez AhlΔmbaS, B. thailandensis E264 et AhlΔmbaF. Des analyses subséquentes confirment cependant ces résultats.
Une fragmentation SM/SM a été effectuée sur les deux composés 790 et 762 Da.
Les résultats montrent des patrons de fragmentation relativement semblables (Figure
21 et 22). Les ions filles les plus abondants sont les suivants : m/z 163, m/z 205, m/z
225 et m/z 535. Avec les informations cumulées jusqu’à maintenant au sujet de ces
deux molécules, nos analyses indiquent que les molécules de 790 et 762 Da décrites
dans l’article de Alice et al. 2006 seraient en fait des congénères de rhamnolipides,
des glycolipides que nous avons précédemment découverts dans les surneageants
de cultures de B. thailandensis (Dubeau et al., 2009). Pour être plus spécifique, il
s’agirait des composés Rhamnose-Rhamnose-C14-C14 et Rhamnose-Rhamnose-C14-
C16 dont les masses molécules sont de 762 Da et 790 Da respectivement (Dubeau et
al., 2009).
53
Figure 21. Chromatographies des molécules de 790 Da et de 762 Da
Les molécules ont été analysées chez B. thailandensis E264. L’analyse a été faite par électronébulisation négative en mode balayage. La bactérie a été cultivée dans du MM9C durant 72h à 37
oC.
Figure 22. Fragmentogramme des ions précurseurs m/z 791 et m/z 761 chez B. thailandensis E264.
La fragmentation des ions pseudomoleculaires m/z 791 et m/z 761 montre des spectres de masses très similaires aux spectres de masses des congénères de rhamnolipides présentés dans l’article de Dubeau et al., 2009.
B
A
A
B
54
Suite à ces résultats, nous avons décidé de continuer notre investigation des
surnageant des mutants AhlΔmbaS et AhlΔmbaF, ainsi que de la souche sauvage à
la recherche de masses pouvant être associées à la malléobactine. La stratégie est
d’identifier des différences dans les chromatogrammes des bactéries par analyse
CLHP-SM. Effectivement, en analysant les surnageants des trois bactéries, nous
remarquons la présence de composés sortant après 6 à 9 minutes d’élution chez
AhlΔmbaF et qui ne sont pas présent chez B. thailandensis souche sauvage et
AhlΔmbaS (Figure 23). L’analyse du spectre de masses à cet intervalle de temps
montre un groupe d’ions forts intéressants dont fait partie l’ion m/z 637 (Figure 24).
Figure 23. Analyse des chromatogrammes des surnageants de E264AhlΔmbaF, B. thailandensis E264 et AhlΔmbaS.
Les analyses ont été effectuées par électronébulisation positif en mode balayage. Les bactéries ont été cultivées dans du MM9C durant 72h à 37
oC.
A
B
C
55
Figure 24. Spectre de masses au temps de rétention 6 à 9 minutes chez le mutant AhlΔmbaF. Ions d’intérêts : m/z 606, m/z 613, m/z 621 et m/z 637.
56
En évaluant la production de ces composés chez le mutant AhlΔmbaS, B.
thailandensis E264, AhlΔmbaF et E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 (Figure 25), nous
remarquons qu’il y a une concordance avec la nature des mutations. C’est-à-dire que
AhlΔmbaS produit peu de ces molécules tandis que AhlΔmbaF et
E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 surproduisent ces molécules comparé à la souche
sauvage, comme attendu d’après les observations sur géloses CAS.
Figure 25. Comparaison, par CLHP-SM, de la production des molécules d’intérêts 605 Da, 612 Da, 620 Da et 636 Da chez AhlΔmbaS, B. thailandensis E264, AhlΔmbaF et E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3.
Quantification arbitraire basée sur le standard interne HHQ-D4. Les analyses ont été effectuées par électronébulisation positif en mode balayage. Les bactéries ont été cultivées dans du MM9C durant 72h à 37
oC. Le graphique ne montre pas d’écart-type dû au fait qu’il s’agit d’analyses sur des anciennes
injections au CLHP-MS. Il s’agit en fait du même chromatogramme présenté à la figure 20.
2.5.4.2. Nature chélatrice des composés 636, 620, 612 et 605 Da.
Jusqu’à maintenant, nous avons été en mesure d’identifier des masses pouvant être
associées à la malléobactine. Un groupe de molécules ont étés constatées au même
temps de rétention que la molécule de 636 Da qui a déjà été identifiée comme étant
un plausible congénère de la malléobactine par (Alice et al. 2006). De plus, la
production de ces molécules concorde bien avec les mutations chez B. thailandensis
qui affectent certains gènes de la biosynthèse et la régulation de la malléobactine.
57
Pour faire suite aux expériences, nous avons voulu vérifier les propriétés chélatrices
de ces molécules. Pour se faire, nous avons utilisé deux métaux trivalents, c’est-à-
dire le gallium (Ga(III)) ainsi que le fer (Fe(III)) pour l’expérience. La masse
moléculaire du gallium est de 69,72 g/mol avec la perte de 3 charges, nous devons
ajouter une masse de 66 Da à nos molécules d’intérêts. Le même principe est
employé pour le fer dont la masse est de 55,84 g/mol. Avec la perte de 3 charges, on
doit additionner 53 Da. Si nos molécules d’intérêts sont en mesure de complexer un
de ces métaux, nous devrions observer l’apparition de pics correspondant aux ions
de chaque molécule plus 66 Da (pour le gallium) ou plus 53 Da (pour le fer) (Tableau
7).
Tableau 7. Ions attendu sur les chromatogrammes s’il y a activité chélatrice
Ions des molécules d’intérêts (m/z)
Ions des molécules d’intérêt + Ga(III)
Ions des molécules d’intérêt + Fe(III)
606 672 659 613 679 666 621 687 674 637 703 690
D’après les résultats présentés aux Figure 26 et 27, les molécules d’intérêts
présentent des propriétés chélatrices de métaux. En effet, les molécules 605 Da, 620
Da et 636 Da sont en mesure de chélater le gallium (III) ainsi que le fer (III). La
même conclusion est tirée pour la molécule de 612 Da même si les ions ne sont pas
très apparents sur le chromatogramme.
58
Figure 26. Chromatogramme d’un surnageant du mutant AhlΔmbaF avec l’ajout de gallium [13 mM]
Figure 27. Chromatogramme d’un surnageant du mutant AhlΔmbaF avec l’ajout de fer [13 mM]
+ 66
+ 66
+ 66
+ 53
+ 53
+ 53
59
2.5.4.3. Similarité structurelle à l’ornibactine
Selon la littérature, la malléobactine serait très similaire structurellement à
l’ornibactine. Cette hypothèse est appuyée par la très grande homologie entre les
gènes de la biosynthèse et de la régulation de ces deux sidérophores (Figure 5). De
plus, l’article d’Alice et al. 2006 stipule que la malléobactine peut alimenter un mutant
de B. cenocepacia déficient en ornibactine. Nous avons voulu ici démontrer que nos
molécules d’intérêts possèdent bel et bien une structure homologue à l’ornibactine
en effectuant deux expériences différentes.
La première expérience consistait à enrichir notre milieu de culture qui est le MM9
avec de la L-sérine (10 mM) et de la L-ornithine (10 mM). Sachant que l’ornibactine
est de base un sidérophore tétrapeptidique avec un regroupement L-ornithine–D-
hydroxyaspartate–L-serine–L-ornithine (Figure 4), nous avons émis l’hypothèse
qu’en rajoutant ces deux acides aminés, nous allions trouver une augmentation de la
production de nos molécules d’intérêts. Cette hypothèse s’est effectivement
confirmée. Il est possible d’observer une augmentation de la production de ces
molécules lors de l’ajout des deux acides aminés comparée au milieu MM9C (Figure
28). Avec ces résultats, ce milieu enrichi sera dorénavant utilisé dans les
expériences subséquentes afin de maximiser la production de nos molécules
d’intérêts.
La Figure 28 présente des expériences fait en unicata. Des analyses subséquentes
en comparant seulement le milieu MM9 avec le milieu modifié MM9+serine+ornithine
(MM9M) confirme sans aucun doute l’augmentation de la production de sidérophores
lors de l’ajout des deux acides aminés.
60
Figure 28. Effet de l’ajout de sérine et ornithine sur la production de la malléobactine chez le mutant AhlΔmbaF
La bactérie a été cultivée dans le milieu de culture MM9C avec l’ajout de L-sérine et/ou de L-ornithine à une concentration de 10 mM chacun. L’incubation a été faite à 37
oC durant 72h.
La deuxième expérience consistait à une analyse par CLHP-SM. Tout d’abord, afin
de vérifier ses caractéristiques structurelles et d’obtenir une source de comparaison,
nous nous sommes procurés de l’ornibactine-C6 pure chez EMC microcollections
GmbH (Allemagne). Il s’agit de la forme non complexée (forme apo) dont la masse
moléculaire est de 708 Da. La molécule possède la formule chimique suivante
C28H53N8O13. Avant d’effectuer l’analyse en CHLP-SM, nous avons préparé une
solution d’ornibactine-C6 à une concentration de 500 mM. En effectuant un balayage
en mode positif, il faut rajouter un proton de plus [M + H]+ à la masse de l’ornibactine-
C6 afin d’obtenir son ion pseudomoléculaire de m/z 709. La Figure 29 montre le
chromatogramme obtenu par total ion count (TIC) de la solution pure ainsi que la
correspondance en analysant la m/z 709 seulement.
61
Figure 29. Analyse par CLHP-SM de l’ornibactine-C6 en mode positif.
A) Chromatographie (TIC) de la solution à 500 mM de l’ornibactine-C6 pure. B) Chromatographie de l’ion m/z 709. Le Rt de la molécule est de 7.50 minutes.
Suite à une fragmentation de l’ornibactine-C6, on peut remarquer un autre ion
intéressant, soit l’ion m/z 762, qui représente l’ornibactine-C6 complexé à un ion de
fer (Figure. 30). L’apparition de cette forme ferri-ornibactine-C6 n’est pas si
surprenante puisque la solution-mère d’ornibactine-C6 pure n’a pas été déferrée et
que des traces de fer ont bien pu légèrement contaminer la solution.
A
B
62
Figure 30. Spectre de masses au Rt de l’ornibactine-C6.
Une autre observation intéressante sur la Figure 30 est la présence des ions m/z 355
et m/z 382 que nous suspectons être les formes doublement chargé (Masse = 1/2
(M+2H)) de l’ornibactine-C6 et de la ferri-ornibactine-C6, respectivement. En effet,
les molécules ionisées de hautes masses peuvent acquérir plus d’un état de charge,
[M + nH]n+. Une bonne façon d’identifier rapidement s’il est question d’ions
doublement chargé, est d’observer la différence de masses (Δ) entre l’ion
pseudomoléculaire et son ion isotopique (M+2). En temps normal, un ion
pseudomoléculaire doublement chargé possèdera un ion isotopique à une distance
de Δ = 0.5 Da comparativement à un ion simplement chargé où l’ion isotopique est à
une distance de Δ = 1 Da (Figure 31 et 32).
Ornibactine-C6
Ferri-Ornibactine-C6
Ornibactine-C6
(doublement chargé)
Ferri-ornibactine-C6
(doublement chargé)
63
Figure 31. Spectre de masses des ions simplement chargés de l’ornibactine-C6.
Figure 32. Spectre de masses des ions doublement chargés de l’ornibactine-C6.
Il peut s’avérer très utile de repérer les ions multiplement chargés d’une molécule
d’intérêt. Ceci permet d’une part d’appuyer la présence de cette molécule, comme
dans notre cas, et d’autre part de déterminer le poids moléculaire d’une molécule de
façon très précise. Par exemple, dans le cas des protéines, grosses molécules qui
peuvent générer des ions simplement chargés pouvant parfois excéder la valeur m/z
couverte par l’éventail de balayage du CLHP-SM (rarement plus haut que 4000 m/z),
ces dernières peuvent générer quelques ions correspondants à des états de charges
Δ =1.05 Da
Δ =1.04 Da
Δ =71 Da
Δ =79 Da
64
différents. De cette manière, il suffit de calculer la charge des différents ions et par la
suite de calculer la masse de la molécule.
Un peu comme pour la pyochéline auparavant, nous avons fragmenté l’ion
précurseur de l’ornibactine-C6 à la recherche d’ions filles. La fragmentation de l’ion
m/z 709 nous montre un spectre de masses dont les ions les plus abondants sont
m/z 247, m/z 334 et m/z 465 (Figure 33). En fragmentant l’ion m/z 355, nous
retrouvons un spectre de masses très similaire au spectre de masses de la
fragmentation de l’ion m/z 709 (Figure 34). On y retrouve également les ions
observés plus tôt c’est-à-dire m/z 247, m/z 334 et m/z 465. Ceci vient appuyer le fait
que l’ion m/z 355 est très probablement l’état doublement chargé de la molécule de
l’ornibactine-C6.
Figure 33. Fragmentation de l’ion précurseur de l’ornibactine-C6.
A) m/z 709 (ion pseudomoléculaire simplement chargé) et B) m/z 355 (ion pseudomoléculaire doublement chargé)
Nous avons ensuite analysé le surnageant de la bactérie B. cepacia ATCC 25146 qui
est connue pour produire de l’ornibactine-C6 et de l’ornibactine-C8 (Meyer et al.,
1995). Avec les informations obtenues précédemment à savoir que l’ornibactine-C6
possède un Rt de 7,50 minutes environ dans nos conditions expérimentales, nous
nous attendions donc à détecter l’ion pseudomoléculaire de l’ornibactine-C6 chez B.
cepacia ATCC25146 au même Rt. Comme observé à la Figure 34, la
A
B
65
chromatographie de l’ion de l’ornibactine-C6 montre bien un Rt de 7,50 minutes.
Nous avons également été en mesure d’observer l’ornibactine-C8 dont la masse
moléculaire est de 736 Da. L’ion pseudomoléculaire de l’ornibactine-C8 possède un
Rt de 8 minutes.
Figure 34. Chromatogrammes correspondant à l’ornibactine-C6 et l’ornibactine-C8.
A) Chromatographie (TIC) d’un surnageant de B. cepacia ATCC 25146. B) Chromatographie de l’ion pseudomoléculaire de l’ornibactine-C6. C) Chromatographie de l’ion pseudomoléculaire de l’ornibactine-C8. L’ionisation s’est fait en mode positif et l’analyse en mode balayage. Les bactéries ont été cultivées dans du MM9M durant 72h à 37
oC.
A
B
C
66
Les spectres de masses des deux ions pseudomoléculaires de l’ornibactine-C6 et
l’ornibactine-C8 chez B. cepacia ATCC 25146 montrent également des ions
doublement chargés pour chaque molécule (Figure 35). La fragmentation de ces
quatre molécules présente des spectres de masses très similaires à l’expérience de
l’ornibactince-C6 pure. Nous détectons encore une fois les ions filles m/z 247, m/z
334 et 465 comme majoritairement abondant (Figures 36 et 37). Cet exercice nous a
permis de confirmer en premier lieu que B. cepacia ATCC 25146 produisait bel et
bien l’ornibactine-C6 et l’ornibactine-C8 et deuxièmement il nous a été possible
d’évaluer le patron du spectre de masse de l’ornibactine et de déterminer les ions
filles majoritairement produits suite à la fragmentation de l’ion précurseur en mode
positif.
Figure 35. Spectre de masses au Rt de l’ornibactine-C6 et de l’ornibactine-C8 chez B. cepacia ATCC2 5146.
A
B
67
Figure 36. Fragmentogramme de l’ion précurseur de l’ornibactine-C8 (m/z 737) et de l’ornibactine-C6 (m/z 709) chez B. cepacia ATCC2 5146.
Figure 37. Fragmentation de l’ion précurseur doublement chargé de l’ornibactine-C8 (m/z 369) et de l’ion précurseur doublement chargé de l’ornibactine-C6 (m/z 355) chez B. cepacia ATCC2 5146.
En transposant cet exercice à nos molécules d’intérêts, il est possible premièrement
d’observer que la fragmentation des ions m/z 606, m/z 613, m/z 621 et m/z 637
présente des patrons de spectres similaires entre eux (Figure 38). Ceci nous montre
que ces molécules sont très probablement des congénères. Deuxièmement, nous
remarquons que les ions majoritaires communs entre les quatre spectres sont m/z
247 et m/z 334. Il s’agit de deux ions filles également retrouvé chez le spectre de
A
B
A
B
68
fragmentation de l’ornibactine. Toute porte à croire ici, qu’en effet, nos molécules
d’intérêts possèdent des similarités structurelles à l’ornibactine.
Figure 38. Fragmentogramme des ions précurseurs des molécules d’intérêts chez le mutant AhlΔmbaF.
A) m/z 637, B) m/z 621, C) m/z 613 et D) m/z 606. L’ionisation s’est fait en mode positif. La bactérie a été cultivée dans du MM9M durant 72h à 37
oC.
Avec les informations cumulées jusqu’à maintenant sur nos molécules d’intérêts, il
nous est possible de conclure que ces molécules sont bel et bien des sidérophores
produits par l’activité des enzymes codés par les gènes mba, considérés
responsable de la production de la malléobactine. De plus, puisque nous avons été
en mesure de retrouver la fameuse molécule de 636 Da décrite chez Alice et al.
2006 et de confirmer que cette dernière possède des propriétés chélatrice de fer,
nous pouvons considérer que ces molécules sont les réelles molécules de
malléobactine, dont la structure reste inconnue, mais vraisemblablement similaire à
l’ornibactine.
B
A
C
D
69
2.5.4.4. Purification de la malléobactine
Pour déterminer la nature de la malléobactine, il faut la purifier. Pour purifier les
sidérophores il faut être en mesure de les extraire du milieu de culture. La plupart
des méthodes d’extractions visent à isoler ces molécules d’intérêts en fonction de
leur polarité. De manière générale, les sidérophores sont des molécules de polarité
moyenne pouvant former un grand nombre de liaisons hydrogène. La technique
favorisée dans notre étude est l’utilisation de résines adsorbantes de type Amberlite
XAD-4 (Sigma). L’emploi de cette résine a été inspiré de Persmark et al. (Persmark
et al., 1989). Elle a déjà été utilisée par Sayyed et al. (Sayyed et al., 2006) pour la
purification de sidérophores chez la bactérie Alcaligenes faecalis ainsi que par
Weinsing et al. (Wensing et al., 2010) pour la purification de la pyoverdine et de
l’achromobactine chez Pseudomonas syringa.
Avant de procéder à l’extraction de la malléobactine, nous avons voulu estimer les
conditions pouvant permettre une production maximale du sidérophore. Il a déjà
établi que le milieu MM9M était un milieu qui pouvait grandement favoriser la
production de ces molécules. Toutes nos conditions expérimentales jusqu’à présent
se sont effectuées dans le milieu MM9M à une incubation à 37oC durant 24 à 72
heures. Nous avons voulu évaluer si un temps plus long d’incubation pouvait nous
permettre d’obtenir une plus grande production de ces molécules tout en ayant des
cellules dans la phase stationnaire de leur croissance. Maintenant que nous
connaissons les masses des congénères vraisemblablement reliés à la
malléobactine, il devenait possible d’effectuer un suivi de la cinétique de production
au cours du temps.
La Figure 39 nous montre qu’il est effectivement, possible de continuer l’incubation à
un temps d’environs 100 heures avant de voir un déclin de la phase stationnaire des
cellules bactériennes (Figure 40). Ceci nous montre également que la production de
sidérophores est maximale après la fin de la phase logarithmique de croissance.
Notons ici qu’il arrive que B. thailandensis forme des agrégats cellulaires dans le
milieu MM9M rendant ainsi l’évaluation de la croissance cellulaire impossible par
mesure de DO600. Lorsque cela survient, la croissance cellulaire est évaluée par
dosage de protéines totales. Pour ce fait, la méthode de Bradford a été employée.
70
Figure 39. Production de la malléobactine en fonction de la croissance durant 100 heures chez B. thailandensis.
La bactérie a été cultivée dans du MM9M durant 100 hr à 37oC. La croissance cellulaire a été évaluée
par dosage de protéines totales (méthode de Bradford). La production des congénères de la malléobactine a été évaluée par CLHP-SM en mode balayage positif. La quantification relativement a été calculée par rapport au standard interne HHQ-D4 dont la concentration ajouté était de 5 µg/ml. La production a ensuite été rapportée par quantité de protéine totale (µg/ml)/cellule. Les résultats représentent des données moyennes de réplica. Les barres d’erreur représentent des triplicatas techniques.
71
Figure 40. Production de la malléobactine 636 Da en fonction de la croissance durant 160 heures chez B. thailandensis.
La bactérie a été cultivée dans du MM9M durant 160 hr à 37oC. La croissance cellulaire a été évaluée
par DO600. La production de la malléobactine A (636 Da) a été évaluée par CLHP-SM en mode balayage positif. La quantification relativement a été calculée par rapport au standard interne HHQ-D4 dont la concentration ajouté était de 5 µg/ml. Les résultats représentent des données moyennes de réplica. Les barres d’erreur représentent des triplicatas techniques.
Lors de la première expérience d’extraction des sidérophores par la résine XAD-4,
nous avons évalué la présence de la malléobactine par CLHP-SM à chaque étape du
procédé. Pour alléger le document, seul le suivi sur la malléobactine de 636 Da sera
présenté ici. Un volume de 2,8 L de surnageant a été utilisé pour l’exercice. Durant
les premières étapes de l’extraction (Figure 41), nous remarquons qu’’environ 13%
de la malléobactine n’a pas été absorbée par la résine. Il y a eu un autre 11% de
perte du sidérophore suite au lavage des résines par du H2O. Finalement, environ
70% de la malléobactine détectée dans le surnageant au départ est bien récupéré
lors de l’élution au méthanol (Figure 42).
72
Figure 41. Représentation schématique de l’extraction de la malléobactine.
Le surnageant de 2,8 L de cultures de la souche AhlΔmbaF cultivée dans le milieu MM9M a été
récupéré par centrifugation avec 100 hr d’incubation. La résine Amberlite XAD-4 (Sigma) a été ajoutée (ration de 10% p/v) pour adsorber les molécules de sidérophores. Les points rouges représentent la malléobactine, alors que les points bleus et jaunes représentent des molécules contaminantes co-extraites par la résine.
73
Figure 42. Évaluation quantitative de la malléobacine de 636 Da lors des étapes d’extraction avec la résine Amberlite XAD-4 (partie 1).
A) Surnageant avant l’ajoute des résines. B) Surnageant élué des résines. C) lavage des résines avec du H2O. D) Élution des sidérophores avec du méthanol. La quantification a été calculée par rapport au standard interne HHQ-D4 ajouté à une concentration de 5 µg/ml.
Suite à l’évaporation à sec du méthanol au Rotovap, les sidérophores ont été
resuspendus dans 10 ml d’H2O. Malgré qu’il aurait été plus simple de garder les
sidérophores dans du méthanol, la détection de la malléobactine n’est pas optimale
dans cette phase. Les pics des ions pseudomoléculaires ne sont pas clairs et il n’est
pas rare d’observer des longues « trainées » produites par les pics sur le
chromatogramme. Ce problème n’est pas observé lorsque les sidérophore sont
resuspendus dans du H2O. La solution de 10 ml de sidérophores est par la suite
filtrée sur membrane PTFE de 0,2 µm pour éliminer la matrice résiduelle. Afin de
récupérer le plus de malléobactine possible, un 10 ml d’H2O supplémentaire a été
filtré pour laver la membrane PTFE de 0,2 µm (Figure 43). La solution finale de
sidérophores était de couleur jaune.
74
Figure 43. Évaluation quantitative de la malléobactine de 636 Da lors des étapes d’extraction avec la résine Amberlite XAD-4 (partie 2).
F) Resuspension des sidérophores dans 10 ml d’H2O. G) 10 ml d’H2O filtré dans la membrane de PTFE de 0.2 µm suite à la filtration de la solution de sidérophores. H) 10 ml de méthanol filtré dans la membrane de PTFE de 0.2 µm suite à la filtration du H2O. La quantification a été calculée par rapport au standard interne HHQ-D4 ajouté à une concentration de 5 mg / L.
Durant L’extraction des sidérophores, nous avons été en mesure d’extraire un
équivalent de 2 g d’une mixture contenant des sidérophores et provenant d’une
quantité de 10 L de surnageant avec la méthode des résines Amberlite XAD-4. Suite
à cette étape d’extraction, nous avons procédé à une purification de chaque
congénère de la malléobactine par CLHP préparatif. Seul les molécules de 605 Da et
636 Da ont pu être isolées et purifiées. Lors de l’isolement de la molécule de 605 Da,
on a remarqué la présence d’une molécule de 464 Da. La même observation est
faite pour la molécule de 636 Da. En effet, nous remarquons que cette dernière est
souvent accompagnée d’une molécule de 534 Da. On suspecte ces molécules d’être
des précurseurs de la malléobactine. Il est également à noter que la molécule de 464
Da est également présente, à forte abondance, lors de la fragmentation de
l’ornibactine-C6 et de l’ornibactine-C8. Il pourrait s’agir d’un précurseur commun aux
deux sidérophores.
75
2.5.4.5. Détermination de la structure de la malléobactine
Seules les molécules de 636 Da et 605 Da ont été purifiées et analysées par
résonance magnétique nucléaire (RMN) au Québec/Eastern Canada High Field
NMR Facility (McGill University). Malheureusement, les spectres d’analyses RMN
n’ont pas montrés des résultats très concluants concernant la structure de ces
deux molécules. Cependant, à l’aide des techniques de spectrométrie de
masses, des résultats obtenus par RMN ainsi que des données de la littérature,
nous avons été en mesure d’émettre des prédictions de ce que pourraient
ressembler les congénères de la malléobactine dont les masses moléculaires
sont de 636 Da, 605 Da, 620 Da ainsi que leurs précurseurs dont les masses
sont de 464 Da, 534 Da et 622 Da (Figure 44).
HN
O
NH
OH
O
HN
N
O H
HO
OHO
OH
O
O
N
O
NH2
H2N
O
NH
OH
O
HN
N
O H
HO
NH
O
OH
O
NH2
HO
M+H = 465 M+H = 535
HN
O
NH
OH
O
HN
N
O H
HO
NHO
OH
O
O
N
O
NH2
O
M+H= 606
HN
O
NH
OH
O
HN
N
O H
HO
NHO
OH
O
O
N
O
NH2
O
NH2
M+H= 621
HN
O
NH
OH
O
HN
N
O H
HO
NHO
OH
O
O
N
O
NH2
O
HO
M+H= 637
NH2
HN
O
NH
OH
O
HN
N
O H
HO
NHO
OH
O
O
N
O
NH2
NH2
HO
M+H= 623
HO
H
H
H
HO
H
HO
H
HO
HO
Figure 44. Évaluation structurelle des congénères de la malléobactine et de leur précurseurs.
Travaux effectués par le Pr. François Lépine.
76
2.6. Discussion
Afin de mieux comprendre la pathogénicité de B. pseudomallei, une étude de ses
mécanismes d’acquisition du fer a été entreprise. Plus précisément, il a été question,
dans ce document, d’étudier les sidérophores produits par cette bactérie en utilisant
B. thailandensis comme modèle alternatif. Selon la littérature, il est déjà connu que
B. pseudomallei produit de la pyochéline ainsi qu’un autre sidérophore nommé la
malléobactine. Cependant, la composition chimique et la structure de cette dernière
restaient inconnues.
Tout d’abord nous avons mis en évidence que la souche B. thailandensis E264
produit bel et bien des sidérophores en cultivant cette dernière ainsi que le mutant
surproducteur dépourvu de AHLs, E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3, sur un milieu gélosé
CAS. Le milieu initialement bleu a viré à l’orange révélant la sécrétion de
sidérophores diffusant autour des colonies. Le mutant du QS a démontré une
formation d’un halo orangé beaucoup plus importante que la souche sauvage. Ceci
indique déjà qu’il existe en effet une corrélation entre la production de sidérophores
et le QS chez cette bactérie et que ce système semble réguler négativement leur
production.
Avec cette certitude que B. thailandensis produit des sidérophores, nous avons tout
d’abord voulu confirmer que la bactérie produisait de la pyochéline en effectuant des
tests avec les bactéries P. aeruginosa PA14 et B. cepacia ATCC 25146 qui sont
connues pour produire ce sidérophore. Grâce au CLHP-SM en tandem, la
fragmentation de l’ion pseudomoléculaire précurseur de la pyochéline nous a permis
d’établir un spectre de fragmentation de ce sidérophore. Les ions « filles » les plus
importants résultants de cette fragmentation sont les ions : m/z 118, m/z 178, m/z
189, m/z 222 et m/z 245. L’ion m/z 222 étant le dominant, il a été utilisé pour faire la
transition à partir de l’ion précurseur en mode MRM. Avec cette technique, nous
avons été en mesure de confirmer la présence, et même de quantifier la pyochéline
chez B. thailandensis ainsi que chez le mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3. La
quantification a été calculée relativement par rapport à un standard interne, le HHQ-
D4 qui a été ajouté à une concentration précise dans chaque échantillon à être
analysé. Les résultats de cette expérience nous ont montré que B. thailandensis
produit bel et bien de la pyochéline, mais que cette dernière n’est pas produite en
grande quantité dans nos conditions expérimentales.
La mise en évidence de la production de la malléobactine chez B. thailandensis a été
plus complexe. Dans l’article de Alice et al. 2006, on rapporte chez B. pseudomallei
77
des molécules ayant des masses de 790, 762 et 636 Da attribuées à la
malléobactine. Tout d’abord, nous n’avons pas été en mesure d’observer la molécule
de 636 Da dans les conditions expérimentales de l’article chez la bactérie B.
thailandensis. Également, nos études nous montrent que les molécules de 762 et
790 Da sont en fait des molécules de rhamnolipides et plus précisément du Rha-
Rha-C14-C14 and Rha-Rha-C14-C16 respectivement (Dubeau et al., 2009). Sachant,
que B. thailandensis possède les gènes homologues de la biosynthèse de la
malléobactine identifiés chez B. pseudomallei, nous avons envisagé de faire un
criblage sur la bactérie par mutagénèse aléatoire par insertion d’un transposon afin
d’identifier des gènes impliqués, directement ou non, dans la production de la
malléobactine. De plus, ce criblage allait permettre d’identifier des mutants
potentiellement utiles pour les étapes subséquentes. Deux criblages ont été
effectués, l’un sur la souche sauvage B. thailandensis E264 afin d’identifier des sur-
producteurs de sidérophores et l’autre sur le mutant E264ΔbtaI1ΔbtaI2ΔbtaI3 afin
d’identifier des sous-producteurs de sidérophores. Le criblage nous a permis
d’identifier des gènes bien intéressants tels les gènes BTH_I2417 (mbaI),
BTH_I2418 (mbaJ) et BTH_I2427 (mbaS) qui sont vraisemblablement directement
reliés à la synthèse de la malléobactine. Une mutation dans ces gènes a créé une
réduction dans la production de sidérophores, tel que vu sur milieu CAS. En
parallèle, nous avons également été en mesure d’identifier des gènes reliés à
l’assimilation du sidérophore tels BTH_I2423 (mbaD), BTH_I2424 (mbaC) et
BTH_I2427 (mbaF). Il s’agit de gènes qui ont un effet indirect sur l’activation de la
production de la malléobactine. Une mutation dans ces gènes résulte donc en une
surproduction du sidérophore. L’évaluation de la formation de halo sur géloses CAS
des mutants comparativement à la souche sauvage B. thailandensis E264 montrent
que la malléobactine est le principal sidérophore produits chez cette bactérie.
Avec la confirmation que la malléobactine est bien produite chez B. thailandensis et
que ce dernier est le sidérophore principalement produit, nous avons procédé à
l’identification de ce sidérophore. Une comparaison des surnageants du mutant
sous-producteur, AhlΔmbaS, de la souche sauvage B. thailandensis E264 et du sur-
producteur AhlΔmbaF au CLHP-SM a montré la présence de molécules
intéressantes dont les masses moléculaires sont les suivantes 605 Da, 612 Da, 620
Da, ainsi que la molécule de 636 Da décrite dans l’article de Alice et al. 2006.
Ne sachant pas si ces molécules étaient reliées entre elles, nous avons effectué une
fragmentation de chaque ion pseudomoléculaire de ces composés d’intérêts. Les
78
spectres de fragmentation présentent des ions « filles » communs entre les quatre
molécules. Ceci montre que les molécules sont effectivement des congénères.
Pour la suite des choses, nous avons voulu démontrer que ces molécules
possédaient effectivement un pouvoir de chélation. Nous avons préparé deux
solutions indépendantes de fer (III) et de gallium (III) et nous les avons mélangés à
des échantillons de surnageant du mutants AhlΔmbaF. Les résultats ont montré que
les quatre molécules sont en mesure de chélater autant le fer que le gallium tout
comme l’ornibactine, un sidérophore produit par les BCC (H. Stephan et al., 1993a,
Holger Stephan et al., 1993b).
En parlant de ce dernier, il a été proposé que la malléobactine et l’ornibactine
seraient similaires en raison de la grande similarité entre leurs gènes de biosynthèse.
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons effectué des tests sur un des congénères
de l’ornibactine, c’est-à-dire l’ornibactine-C6. Nous avons utilisé une solution
d’ornibactine-C6 pure procurée de la compagnie « EMC microcollections GmbH »
(Allemagne) ainsi qu’un surnageant de B. cepacia ATCC 25416 qui est connue pour
produire ce sidérophore également. Encore une fois, en utilisant la CLHP-SM en
tandem, nous avons effectué une fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de
l’ornibactine-C6 pour chaque échantillon. Les spectres de fragmentations montrent
une particulière abondance des ions « filles » m/z 247, m/z 334 et m/z 465. En
comparant ces spectres aux spectres de nos quatre molécules d’intérêts, nous
remarquons qu’il y a deux de ces trois ions qui sont en communs. Avec le fait que
nos quatre molécules d’intérêts ne possèdent pas du toutes les mêmes masses
moléculaires que les congénères de l’ornibactine et que ces derniers ne montrent
pas un patron de masses identiques au CLHP-SM, nous pouvons confirmer que B.
thailandensis produit un sidérophore nommé la malléobactine et que ce dernier
possède une structure similaire à l’ornibactine.
Avec la certitude que B. thailandensis produit bel et bien de la malléobactine, nous
avons mis de l’avant des expériences d’isolement et de purification du sidérophore
afin de le caractériser structurellement. Le mutant AhlΔmbaF a été utilisé pour faire
les expériences puisqu’il s’agit d’un surproduction spécifique de la malléobactine. Le
milieu pauvre en fer MM9 a été supplémenté avec de la L-ornithine et de la L-sérine
pour augmenter la production du sidérophore en question. La technique d’isolement
de la malléobactine a été d’utilisé la résine Amberlite XAD-4 (Sigma). À partir d’un
volume de 10 L de surnageant, nous avons été en mesure de récupérer une mixture
d’environ 2 g contenant des sidérophores. La purification de la malléobactine s’est
effectuée par CLHP préparatif. Il a fallu effectuer de nombreux cycles d’injections afin
79
de parvenir à séparer les molécules ciblées. Cette méthode a comme conséquence
une grande perte de matériels. Seules les molécules de 605 Da et de 636 Da ont pu
être purifiées suffisamment. Les analyses RMN et CLHP-SM à haute performance
nous on permit d’élaborer des croquis des molécules de la malléobactine ainsi que
de quelques précurseurs du sidérophore en question.
2.7. Conclusion
Malheureusement, tout récemment, la structure de la malléobactine a été élucidée
par le groupe de Christian Hertweck (Franke et al., 2013). Les chercheurs confirment
que la malléobactine est constituée d’un groupe de molécules, tout comme
l’ornibactine. Ceux-ci affirment que la molécule principale est la malléobactine A qui
est en fait la molécule de 636 Da étudiée dans ce mémoire. La malléobactine A est
constituée de l’association d’une putrescine, d’un N-hydroxy-N-formylornithine, d’une
L-serine, d’un acide D-threo-β-hydroxyaspartique et d’un acide α-formylé L-ANPA
(acide 2-amino-5-nitropentanoique). Ce dernier est retrouvé en N-terminal au lieu
d’un résidu N-hydroxy-N-acylornithine comme observé chez l’ornibactine (voir Figure
45). L’acide α-formylé L-ANPA a seulement été connu jusqu’à ce jour comme étant
un composé synthétique. C’est la première fois qu’on rapporte un tel composé
comme produit naturel. La structure des congénères de la malléobactine A, dont font
partie nos molécules de 620 Da et 612 Da, a également été élucidée durant ces
travaux. De plus, ces chercheurs ont identifié et renommé tous les gènes impliqués
dans la biosynthèse et la régulation de la malléobactine (Figure 46). Notre quête
pour l’élucidation structurelle de la malléobactine a donc pris fin avec les résultats
très concluants de Franke et al (2013). Nous pouvons cependant confirmer que nous
étions très près du but puisque nous avons été en mesure d’identifier les molécules
de la malléobactine que rapporte le groupe de Christian Hertweck dans leur article.
Néanmoins, malgré les évidences que B. thailandensis et B. pseudomallei produisent
les mêmes sidérophores, il reste à prouver officiellement ce fait en élucidant par
exemple la structure des sidérophores produits chez B. pseudomallei et les comparer
à ceux décrits chez B. thailandensis.
80
Figure 45. Représentation structurelle de la malléobactine et ses dérivés. Image adapté de Franke et al. (Franke et al., 2013)
81
Figure 46. Gènes de la biosynthèse de la mallébactine selon (Franke et al., 2013)
Ceci dit, puisque la structure de la malléobactine a été élucidée, il serait intéressant
de diriger l’intérêt vers le lien existant entre le QS et la production de ce sidérophore.
Sachant qu’en général le QS de B. thailandensis régule négativement la production
de sidérophores, il serait intéressant de déterminer lequel ou lesquels des trois
systèmes (LuxIR-1, LuxIR-2 et LuxIR-3) régule(ent) véritablement ou du moins
possède le plus fort impact sur la production des sidérophores.
De plus, lors du criblage, les gènes hmqC et hmqG, impliqués dans le système des
HMAQs, ont été identifiés. Des études sur l’opéron HMAQ chez B. ambifaria AMMD
ont montrées qu’une mutation polaire sur le gène hmqA et sur le gène hmqG de
l’opéron hmqABCDEFG augmente la production de sidérophores (Vial et al., 2008).
Cette information concorde avec les résultats du criblage effectué durant cette étude.
En effet, une surproduction est observée chez un mutant possédant une mutation sur
le gène BTH_II1929 (hmqG) lorsque comparé à B. thailandensis E264. Puisque
plusieurs gènes du système des HMAQs ont été identifiés lors du criblage, avec un
82
intérêt particulier sur le gène BTH_I1403, il serait également intéressant d’étudier la
corrélation entre ce système et la production de sidérophores.
83
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90
Appendice
TOCSY de la molécule de 636 Da
91
92
COSY de la molécule de 636 Da
93
94
Spectre 1D de la molécule de 636 Da
95
96
97
Spectre HSQSC de la molécule de 606 Da
98
Spectre HMBC de la molécule de 606 Da
99
100
101
Spectre HSQC aromatique de la moécule de 606 Da
102
Spectre 1D de la moécule de 606 Da
103
104
105
TOCSY de la molécule de 606 Da
106
107
108
COSY de la molécule de 606 Da
109
110
Insertion des transposons sur les gènes de biosynthèse de la malléobactine
