UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEGNE

UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEGNE (U.T.C)

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEGNE

Discipline : Génie Biologique et Médical

Présentée et soutenue publiquement

par

Sabine Bensamoun

le 9 décembre 2003

DETERMINATION DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU

TISSU MUSCULO - SQUELETTIQUE

Directeurs de thèse :

Madame le Professeur M.C. Ho Ba Tho

&

Monsieur le Professeur F. Goubel

JURY :

Pr. Vander Sloten, Université Catholique de Leuven Rapporteur

Pr. Benhamou, Institut IPROS, INSERM-ERITM 101, Orléans Rapporteur

Dr. Stevens, Laboratoire de Plasticité Neuromusculaire, Lille Examinateur

Pr. Duchateau , Laboratoire de Biologie Appliquée, Bruxelles Examinateur

Pr. Goubel, Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical, Compiègne Directeur de Thèse

Pr. Ho Ba Tho, Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical, Compiègne Directeur de Thèse

REMERCIEMENTS

Comme le philosophe Gaston Bachelard l'a décrit dans "Le nouvel esprit scientifique" (1934), c'est le dialogue de l'expérimentateur et du théoricien qui constitue la base de tout travail scientifique. C'est à la croisée des chemins du concret et de l'abstrait qu'il faut comprendre et analyser la science. Quel que soit le point de départ de l'activité scientifique, cette activité doit répondre aux critères suivants : si elle expérimente, il faut raisonner; si elle raisonne, il faut expérimenter. Cette double démarche qui m'a accompagnée dans mes travaux de thèse sera toujours liée à mes futures activités scientifiques.

Il est de coutume de remercier sous forme d’une liste assez exhaustive de noms tous ceux qui ont contribué à un projet de recherche. J’ai souhaité déroger à cet usage en adressant des lettres de remerciements à ceux qui furent les plus impliqués dans ce travail de thèse. De plus, de nombreuses lettres de recommandations ont été établies pour mes dossiers post doctoraux et il m’a donc semblé normal d’écrire en retour quelques remerciements.

Je me permets d’adresser l’expression de ma profonde gratitude aux membres du jury : M. le Professeur Benhamou de l’institut IPROS « Institute of Prevention and Research on Osteoporosis » et M. le Professeur Vander Sloten de l’Université Catholique de Leuven qui ont accepté d’être rapporteurs de ce travail de thèse. Je tiens à remercier aussi Mme le docteur Stevens, en tant qu’examinateur de cette thèse, dont je n’oublie pas qu’elle m’a accueillie au sein de sa dynamique équipe du laboratoire de Plasticité Neuromusculaire pendant plusieurs semaines ; j’ai pu ainsi bénéficier de son encadrement. Et enfin M. le Professeur Duchateau de l’Institut Supérieur d’Education Physique pour avoir accepté d’être examinateur de cette thèse. Veuillez trouver tous ici l’expression de mes sincères remerciements. Toute ma reconnaissance à M. Gamet qui fut le premier à m’initier au domaine du muscle lors de mon DEA ce qui m’a ainsi permis d’entreprendre mon sujet de thèse.

A MADAME LE PROFESSEUR HO BA THO

Le travail de recherche entrepris avec Mme Ho Ba Tho depuis septembre 2000 m’a permis pendant ces trois années de thèse de m’enrichir des qualités scientifiques qu’elle a su m’enseigner. La rigueur de travail qu’elle impose s’est traduite à travers un rapport d’activité mensuel permettant d’établir et de planifier les futurs travaux de recherche, un compte rendu détaillé des réunions de travail sur un sujet précis, et la mise en place de protocoles expérimentaux pour l’apprentissage de multiples techniques. Pour un jeune thésard toute cette rigueur n’est pas facile à mettre en place mais au fil des mois on se rend vite compte que le « chef » avait raison et que la rigueur devient finalement un simple réflexe de travail. L’autonomie d’action que m’a laissée Mme Ho Ba Tho dans mon travail de thèse m’a permis de mener mon projet de recherche selon mes propres convictions et intuitions et de m’adapter personnellement à de nouvelles techniques expérimentales auxquelles j’ai été confrontée. Cette « autonomie » laissée au thésard peut être difficile à gérer lorsqu’on se retrouve, par exemple, seul face à une technique expérimentale inconnue et difficile à utiliser, mais quelle victoire lorsqu’on arrive à la maîtriser ! Je tiens personnellement à remercier Mme Ho Ba Tho pour cette confiance en moi dont elle a fait preuve pendant mon travail de thèse. D’autre part, les collaborations nationales et internationales entreprises par Mme Ho Ba Tho m’ont permis d’acquérir de nouvelles connaissances scientifiques dans les domaines de l’os et du muscle, et de voir le fonctionnement et les habitudes de travail qui se pratiquent à l’extérieur de mon laboratoire. De telles collaborations sont extrêmement enrichissantes pour un thésard, à la fois sur la façon de construire un projet commun et sur le travail d’équipe qui a pu être mené lors de ces collaborations. Enfin, la participation aux congrès est un point que ne néglige pas Mme Ho Ba Tho. En effet, elle encourage vivement ses étudiants à participer à des congrès nationaux et internationaux. Cela permet également d’établir de nombreux contacts qui ne pourront que faire avancer la recherche. Pour toutes ces qualités, je tiens à remercier Mme Ho Ba Tho qui m’a permis d’enrichir mes connaissances scientifiques, et qui a su s’adapter à ma démarche de travail pleine d’entrain et de curiosité.

A MONSIEUR LE PROFESSEUR GOUBEL

Je tiens tout particulièrement à remercier M. Goubel qui m’a permis d’avancer dans la continuité de mes études de physique à travers une orientation biomécanique dans le domaine musculo-squelettique reliant ainsi l’os et le muscle au sein de notre laboratoire. Pour cette excellente orientation je lui suis particulièrement reconnaissante. Au cours de nos différentes réunions de travail qui réunissaient des biomécaniciens du muscle, des physiologistes et des physiciens, il nous est apparu que le langage scientifique employé différait d’un domaine à l’autre. Or, parler la même langue pour mener un projet scientifique commun est vital. M. Goubel a toujours fait preuve d’une grande patience et diplomatie face à ces différentes situations, et a su guider et orienter mon projet de recherche grâce à son expérience scientifique. Il a la qualité de pousser l’étudiant au bout de sa réflexion scientifique, impliquant ainsi une parfaite maîtrise du sujet de recherche. M. Goubel, adepte de footing, a su transmettre au laboratoire un esprit sportif qui m’a vraiment aidée au cours de cette thèse : j’ai pu appliquer l’adage selon lequel l’esprit et le corps sont indissociables, « tels l’os et le muscle ». Pour toutes ces qualités je tiens à remercier M. Goubel qui a réussi également à me convaincre de tempérer mon vif entrain au profit d’une grande patience et d’une profonde réflexion sur les travaux de recherche engagés.

AUX MEMBRES DE L’UMR 6600

L’étude des propriétés mécaniques et morphologiques du muscle et de la fibre isolés a été réalisée en collaboration avec Mme Fleury qui m’a initiée aux techniques de dissection et aux différentes préparations chimiques. Pour sa très grande compétence et sa patience, je ne demande qu’à recommencer à travailler dans de si bonnes conditions avec elle. Elle n’a jamais hésité à m’accompagner lors de déplacements à Lyon, Lille, Reims afin de participer activement à mon travail de thèse. De plus, elle impose une rigueur de travail qui est un modèle à suivre. Mes nombreux déplacements au cours de cette thèse ont été administrativement gérés par Mme Lacourt qui a fait preuve d’une efficacité et d’une rapidité remarquables. Elle m’a permis d’apprendre les modalités à suivre lors de déplacements extérieurs. Elle n’est pas seulement la secrétaire de notre laboratoire mais aussi « l’assistante sociale » qui sait réconforter et redonner de la motivation aux étudiants lorsqu’il y a une « baisse de régime ». De plus, Mme Lacourt qui est la trésorière de l’association « L’Amicale de l’UTC » m’a incitée à faire partie de cette grande famille qui organise des sorties, des repas permettant aux membres de différents laboratoires de se rencontrer. Lors de mes expérimentations, Mme Vanhoutte a toujours répondu « présente » lorsque j’ai eu besoin de ses services pour des petits problèmes de manipulations. Elle n’hésite pas à personnellement s’impliquer et s’attarder sur un problème technique, et à faire partager sa grande expérience, ses « trucs et astuces ». De plus, j’ai eu l’occasion de participer depuis deux ans à la fête de la science sous sa direction ; elle a su me montrer la démarche à suivre et la technique à appliquer pour organiser et rendre attrayantes des conférences grand public. Pour toutes ces raisons, je remercie Mme Vanhoutte avec qui j’ai eu un grand plaisir à travailler. Les étudiants de, l’UMR 6600, ensemble de laboratoires qui regroupe des domaines pluridisciplinaires, ce qui enrichit les échanges scientifiques, n’ont jamais hésité à faire partager leurs multiples connaissances. Enfin, je tiens à remercier tout particulièrement Mme Marque, directrice de l’UMR 6600 que j’ai fréquemment sollicitée pour mes dossiers Postdoctoraux. Mme Marque a toujours su se rendre disponible au moment où j’avais besoin de recommandations. De plus, elle prend toujours la peine de se tenir informée auprès de chacun de l’évolution de notre avenir. Preuve d’intérêt dont je lui suis très reconnaissante.

Résumé :

La caractérisation du tissu musculo-squelettique, qui a fait l’objet de très peu d’études au cours de ces dernières années, fait appel à une connaissance pluridisciplinaire associant les tissus osseux et musculaires. Ainsi, des techniques ultrasonores et mécaniques ont été utilisées pour déterminer les propriétés mécaniques (module d’Young, coefficients élastiques), acoustiques (vitesse de propagation) et élastiques passives (forces et contraintes) d’échantillons osseux (os cortical humain) et musculaires (soleus de rat). Ces différents tests ont été réalisés aux échelles macroscopiques (ostéons, muscles isolés) et microscopiques (lamelles osseuses, fibres musculaires). Parallèlement une caractérisation des propriétés morphologiques (porosité, diamètre des pores, surface des fibres) et biochimiques (degré de minéralisation, analyse du contenu d’hydroxyproline et de titine) de ces deux tissus a été obtenue via l’utilisation de microscopes optique et environnemental, micro scanner et électrophorèses. L’analyse des propriétés mécaniques mesurées aux échelles microscopiques a permis d’expliquer certaines modifications enregistrées aux échelles macroscopiques. Cette étude a également permis de mettre en évidence de fortes corrélations entre les propriétés mécaniques et morphologiques pour ces deux tissus. Mots clés :

Os cortical - Muscle soleus - Ultrasons - Nanoindentation - Titine - Propriétés mécaniques Propriétés morphologiques

Abstract:

The characterisation of the musculo skeletal tissue associate different fields of research where bone and muscle tissue are identified. Different ultrasonic and mechanical techniques were performed in order to determine the mechanical (Young modulus, elastic coefficients), acoustic (velocity) and passive elastic (dynamic, static forces and stresses) properties of bone (human cortical bone) and muscle (soleus of rat) samples. These different tests were performed at the macroscopic (osteons, isolated muscles) and microscopic (osteon lamellae, muscle fibers) levels. Additionally, the morphological (porosity, pores diameters, fibers surfaces) and biochemical (degree of mineralization, content of hydroxyproline and titin) properties were determined with different microscopes (optical, environmental), micro QCT and electrophoresis techniques performed on bone and muscle tissues. The mechanical properties measured at the microscopic level allow to explain the modifications recorded at the macroscopic level. Furthermore, this study showed strong correlation between the mechanical and morphological properties for these two tissues.

Key words:

Cortical bone - Soleus muscle - Ultrasound - Nanoindentation - Titin - Mechanical properties Morphological properties

PUBLICATIONS :

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Luu S., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. 2003

Spatial distribution of acoustic and elastic properties of human femoral cortical bone

Journal of biomechanics. Accepté, sous presse

Bensamoun S., Gherbezza J.M., De Belleval J.F., Ho Ba Tho M.C. 2003

Transmission scanning acoustic imaging of human cortical bone and relation with the

microstructure. Clinical Biomechanics. En révision

Bensamoun S., Fan Z., Rho J-Y., Ho Ba Tho M-C. 2003.

Elastic properties and hardness of human lamellae in process of mineralisation determined

by nanoindentation. Journal of biomechanics. En révision

Bensamoun S., Stevens L., Goubel F., Mounier Y., Linke W.A., Ho Ba Tho M-C. 2003

Age effects on passive mechanical properties of rat muscle fibers.

Article soumis dans Pflügers Archive.

CONGRES INTERNATIONAUX :

• Sessions orales présentées par le premier auteur

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C. (2002).

Mechanical and acoustic properties of human femoral cortical bone. P.369

13TH Conference of the European Society of Biomechanics, Poland.

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Fan Z., Rho J.Y. (2002).

Determination of elastic properties of lamellae from human femur by nanoindentation.

11th International congress on biological and medical engineering, Singapore.

Ho Ba Tho M.C., Bensamoun S., Rho J.Y. (2002)

Macro – Micro characterization of mechanical properties of human bone

11th International congress on biological and medical engineering, Singapore

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. (2003).

Variation of acoustic and elastic properties of human cortical in relation with porosity.

World Congress on Ultrasonic, France

Ho Ba Tho, M.C., Bensamoun, S., Rho, J.Y. (2003)

Macro-Micro characterization of human cortical bone using ultrasound and nanoindentation

technique. World Congress on Ultrasonic, France

Bensamoun S., Stevens L., Goubel F., Mounier Y., Ho Ba Tho M-C. 2003. Effect of age on

passive mechanical properties on isolated fibers and muscles. 14TH Conference of the

European Society of Biomechanics. Submitted

• Séances affichées présentées par le premier auteur Ho Ba Tho M.C., Luu S., Bensamoun S., Klaubunde R. (2001).

Anatomical variation of acoustic and mechanical properties of human cortical bone and

relation to microstructure. P.103

XVIIIth Congress of the International Society of Biomechanics, Zurich.


Mapping of ultrasonic velocities on cortical cross section of human femur. P.421

13TH Conference of the European Society of Biomechanics, Poland.


Spatial distribution of acoustic and elastic properties in relation with the microstructure.

11th International congress on biological and medical engineering, Singapore.

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Fan Z., Rho J.Y. (2003).

Intra and inter variation of elastic properties of human osteon lamellae.

49th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, New Orleans

CONGRÈS NATIONAUX :

• Sessions orales présentées par le premier auteur Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C. (2002).

Propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical fémoral humain.

Journée Os – Ultrasons, Compiègne.


Cartographie des vitesses ultrasonores sur sections corticales fémorales humaines.

Journée Os – Ultrasons, Compiègne.

• Séances affichées présentées par le premier auteur Bensamoun S., Luu S., Fleury M.J., Vanhoutte C., Ho Ba Tho M.C. (2001).

Variation des propriétés mécaniques de l’os cortical en relation avec la microstructure.P.52-53

11ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Compiègne.

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Fan Z., Rho J.Y (2003)

Determination of mechanical properties of osteon lamellae of human femoral bone by

nanoindentation . P28-29

12ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Nantes.

Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Stevens L., Goubel F. (2003)

Effects of age on the mechanical properties of passive rat muscles fibers. P26-27


Bensamoun S., Gherbezza J-M., De Belleval J-F., Ho Ba Tho M.C. (2003)

Cartography of acoustic velocities of human cortical bone and relation with the

Microstructure. P30-31


Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Stevens L., Goubel F. (2003)

Effects of age on the mechanical properties of passive rat muscles fibers. P26-27


NOTATIONS Partie os

A Aire de contact

C33 Coefficient élastique longitudinal

Cij Matrice des coefficients élastiques

Cijkl Tenseur d’élasticité

D Diamètre des pores

∆l Allongement de l’échantillon

ε Déformation de l’échantillon

εi Matrice des déformations

e Epaisseur

Ei Module d’Young

Ekl Tenseur de déformation

f Flèche

F Force de compression

F1, F2, F3 Fémur 1, 2 et 3

G Module de cisaillement

H Dureté

I Moment quadratique

λ, µ Coefficient de Lamé

ν Coefficient de Poisson

N Nombre d’échantillon

Np Nombre total de pores

P Porosité

ρ Masse volumique

ρapp Masse volumique apparente

σ Contrainte

σi Matrice des contraintes

S Section de l’échantillon

SD Déviation standard

Sij Matrice de compliance

Sp Surface totale des pores

Stf Elasticité

t Temps de propagation

Tij Tenseur des contraintes

u Vecteur de déplacement

V Vitesse

Vbar Vitesse de propagation à 75KHz

Vbulk Vitesse de propagation à 2,25MHz

VL Vitesse de propagation d’une onde longitudinale

VT Vitesse de propagation d’une onde transversale

Z Impédance acoustique

Partie Muscle CC Composante contractile

CES Composante élastique série

CEP Composante élastique parallèle

D1..2 Coupe distale (1..2) sur muscle patte droite (D)

D3 Coupe ventrale (3) sur muscle patte droite (D)

G3 Coupe ventrale (3) sur muscle patte gauche (G)

D4..5 Coupe proximale (4..5) sur muscle patte droite (D)

∆L Etirement

E Module d’Young

F Force

Fs Force statique

Fd Force dynamique

L0 Longueur de référence

Ls Longueur slack

Lm Longueur de la fibre à l’intérieur du muscle

m Masse

MHC Myosine

R1, R4, R12 Rats âgés de 1, 4 et 12 mois

S Section

SD Déviation standard

σs Tension statique

σd Tension dynamique

SL0 Longueur de sarcomère au repos

SLy Longueur de sarcomère au point de rupture

SLe Longueur de sarcomère étiré

SREC « Short Range Elastic Component »

T Temps

1

INTRODUCTION

La caractérisation du tissu osseux a permis de répondre à des besoins urgents de la société en

terme de fractures osseuses, vieillissement du tissu osseux et ostéoporose. La résistance

mécanique de l’os est évaluée au moyen de techniques ultrasonores et mécaniques appliquées

in vivo et in vitro. Ces données de contraintes mécaniques sont ensuite intégrées dans des

systèmes de modélisation qui permettent de prédire les risques de fractures et de simuler, par

exemple, l’implantation de prothèses de hanches avec ses risques de descellement lors d’une

fracture du col du fémur. Le tissu osseux qui est un matériau vivant c'est-à-dire en remodelage

permanent voit ses propriétés morphologiques se modifier au cours du temps. Ainsi, des

corrélations entre la morphologie de l’os cortical et ses propriétés mécaniques pourront prédire

de la qualité osseuse. Notons que la qualité de l’os varie d’une personne à une autre suivant ses

antécédents et sa sédentarité.

La caractérisation du tissu musculaire in situ a permis d’évaluer les propriétés mécaniques

de différents groupes musculaires soumis par exemple à des entraînement physiques

(hyperactivité) ou au contraire à une réduction de l’activité physique (l’hypoactivité qui a pour

conséquence une atrophie musculaire). La fonction musculaire est alors évaluée au moyen de

techniques ergométriques qui s’intègrent dans différents domaines : rééducation fonctionnelle,

caractérisation du système musculo-tendineux... Le muscle qui est un matériau vivant subit des

changements de structures et des modifications biochimiques selon les contraintes qui lui sont

exercées (le muscle peut être soit dans un état actif lorsqu’il subit une contraction musculaire,

soit dans un état passif lorsqu’il subit un étirement). Ainsi, la détermination des propriétés

mécaniques des fibres musculaires a permis de caractériser certaines structures internes à la

fibre tel que la desmine et la titine. Ces composants jouent un rôle prépondérant dans

l’élasticité musculaire ainsi que dans certaines myopathies (desminopathie, dystrophie

musculaire de Duchenne).

La caractérisation du tissu musculo-squelettique fait appel à une connaissance

pluridisciplinaire associant les domaines de l’os et du muscle. La mécanique du système

musculo-squelettique qui a fait l’objet de très peu d’études au cours de ces dernières années

prend en considération les différents tissus environnants lors de pathologies ostéoarticulaires ou

musculaires. Ainsi lors d’une pathologie osseuse, se pose la question de savoir comment le

muscle est affecté et comment il est possible d’agir sur celui-ci afin de compenser les

problèmes osseux. De la même façon, se pose la question de savoir comment l’os réagit lors

2

d’une pathologie musculaire. L’os et le muscle forment un ensemble indissociable qui

fonctionne de pair et de nombreux exemples le confirment. La pathologie du pied bot qui est

due à une déformation osseuse peut dans certains cas être traitée par une action de rééducation

au niveau des muscles des pieds qui oblige l’os à se redresser. Les scolioses qui sont dues à une

déformation de la colonne vertébrale peuvent dans les cas les plus simples être soignées par un

renforcement des muscles du dos. L’implantation d’une prothèse de hanche oblige les muscles

à jouer un rôle important dans la stabilité de la prothèse. Tous ces exemples montrent que le

muscle et l’os ne font qu’un d’un point de vue fonctionnel.

La connaissance fondamentale des propriétés mécaniques de l’os et du muscle permettra de

simuler les contraintes mécaniques à appliquer sur ces deux tissus afin de prédire l’évolution

des pathologies et leurs conséquences et afin de mettre en place de meilleurs systèmes de

rééducation.

Ainsi l’objectif de cette thèse a été d’acquérir une connaissance fondamentale des propriétés

mécaniques et morphologiques du tissu musculo-squelettique (os et muscle) humain.

Les modèles utilisés pour le tissu osseux (cortical) sont extraits de fémurs humains présentant

des modifications morphologiques. En ce qui concerne les modèles utilisés pour le tissu

musculaire, les conditions expérimentales étant plus contraignantes que pour l’os, des muscles

de soleus de rats de différents âges ont été choisis pour obtenir des modifications

morphologiques semblables à celles du muscle humain. Les modifications morphologiques

musculaires liées à l’âge sont identiques pour les modèles humain et animal (rat) alors que le

tissu osseux ne possède pas les mêmes propriétés morphologiques entre ces deux espèces.

Une première partie organisée en trois chapitres est consacrée au tissu osseux.

Le premier chapitre explique dans un premier temps l’organisation hiérarchique de l’os cortical

et dans un second temps les différentes techniques ultrasonore, mécanique et radiographique

qui permettent de caractériser l’os cortical.

Le deuxième chapitre expose les différentes techniques ultrasonore et mécanique utilisées ainsi

que les résultats des propriétés acoustiques (vitesses (m/s)) et mécaniques (module d’Young

(GPa), coefficient élastique (GPa), dureté (GPa)) obtenus au moyen de ces techniques à

l’échelle macroscopique (sections fémorales, échantillons cubiques et parallélépipédiques) et

microscopique (lamelles osseuses). Les échantillons d’os cortical choisis pour cette étude

présentent des propriétés morphologiques différentes (variation de la porosité, variation du

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diamètre des pores) et la gamme de porosité sera calculée grâce à différents logiciels d’analyse

d’images.

Le troisième chapitre compare les différents paramètres acoustiques obtenus avec les

différentes méthodes ultrasonores et corrèle ces paramètres acoustiques aux paramètres

morphologiques. Une dernière étape consistera à confronter les résultats des paramètres

mécaniques obtenus aux échelles macroscopique et microscopique.

Une deuxième partie organisée de façon parallèle au tissu osseux présente trois chapitres :

Le premier chapitre expose les différents constituants hiérarchiques du muscle squelettique et

présente les différentes techniques expérimentales permettant de mesurer les propriétés

mécaniques et morphologiques de soleus de rat.

Le deuxième chapitre présente les différentes techniques ergométriques employées pour

caractériser l’élasticité passive aussi bien à l’échelle du muscle (soleus) isolé que sur la fibre

isolée. Les paramètres contrainte dynamique (KN/m2), statique (KN/m2) et module d’Young

(KN/m2) seront calculés sur des muscles (et fibres isolées) présentant des propriétés

morphologiques différentes. Le critère de l’âge des muscles a été choisi afin d’obtenir des

modifications morphologiques. Les paramètres morphologiques (surface des muscles et des

différents types de fibres) seront analysés grâce à un logiciel spécifique d’analyse d’images. De

plus, l’évolution de l’âge entraînant des changements physiologiques une analyse biochimique

du contenu de collagène et de titine (avec isoforme) sera effectuée.

Le troisième chapitre s’attache à corréler les propriétés mécaniques aux propriétés

morphologiques et biochimiques.

Une dernière partie retrace le travail mené en parallèle sur l’os et le muscle et synthétisera les

observations trouvées sur ces deux matériaux biologiques.

La conclusion présente les perspectives de ce travail fondamental de thèse dans le domaine de

la recherche clinique.

4

5

PARTIE

OSSEUSE

1

Chapitre I - Etude bibliographique

I LE TISSU OSSEUX I - 1 Classification des différents types d’os

I - 2 Organisation hiérarchique de l’os humain

I - 2 - 1 Composition de la matrice extracellulaire

a) Composante organique

b) Composante minérale

I - 2 - 2 Architecture de l’os cortical

I - 2 - 3 Remodelage osseux

II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MECANIQUES ET ACOUSTIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN

A Echelle macroscopique A - I In vitro

A - I - 1 Technique mécanique

A - I - 2 Technique acoustique en transmission

a) En contact

b) En immersion A - II In vivo

A - II - 1 Transmission axiale en contact

A - II - 2 Transmission transverse en immersion

A - II - 3 En réflexion B Echelle microscopique

B - I Echelle de l’ostéon

B - I - 1 Tests mécaniques

B - I - 2 Technique par ultrason en immersion et réflexion

B - II Echelle de la lamelle osseuse

B - II - 1 Technique de nanoindentation

2

C Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisation des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical humain

III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MORPHOLOGIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN

III - 1 Les techniques utilisées

III - 1 - 1 Micro – radiographie

III - 1 - 2 Micro-tomographie

III - 1 - 3 Les logiciels de calcul des paramètres morphologiques

III - 2 Les paramètres morphologiques

III - 2 - 1 La porosité

IV SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

3

Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques du tissu cortical humain

I MATERIELS I - 1 Echantillons cubiques

I - 2 Echantillons parallélépipédiques

I - 3 Sections fémorales

II METHODES II - 1 Théorie

II - 1 - 1 Loi de Hooke

II - 1 - 2 Matériau orthotrope

II - 1 - 3 Matériau isotrope transverse

II - 1 - 4 Matériau isotrope

II - 1 - 5 Propagation d’une onde dans un milieu élastique illimité

II - 1 - 5 - 1 Application à l’os cortical

II - 1 - 6 Propagation d’une onde dans un milieu élastique limité

II - 1 - 6 - 1 Application à l’os cortical

II - 2 Mesure expérimentale

II - 2 - 1 Détermination des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical

II - 2 - 1 - 1 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en contact

II - 2 - 1 - 2 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en immersion

II - 2 - 1 - 3 Mesure de la masse volumique

II - 2 - 1 - 4 Calibration

II - 2 - 1 - 5 Analyse statistique

II - 2 - 2 Détermination des propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical II - 2 - 2 - 1 Microscope électronique à balayage

II - 2 - 2 - 2 Technique de nanoindentation


4


II - 2 - 3 Synthèse des échantillons II - 3 Détermination des propriétés morphologiques de l’os cortical

II - 3 - 1 Choix des échantillons

II - 3 - 2 Détermination des paramètres morphologiques

II - 3 - 3 Protocole de mesure

a) Echantillons cubiques et parallélépipédiques

b) Sections fémorales

c) Echantillons parallélépipédiques

II - 3 - 4 Validation de la méthode de mesure

III RESULTATS III - 1 Propriétés mécaniques et acoustiques des échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical (F1, F2, F3)

III - 1 - 1 Mesure de la masse volumique

III - 1 - 2 Mesures des propriétés acoustiques

a) Mesures des vitesses de propagation

b) relations prédictives entre vitesse et masse volumique

III - 1 - 3 Mesures des propriétés élastiques

a) Mesures des modules d’Young (E33) et des coefficients élastiques (C33)

b) Relations prédictives entre les propriétés élastiques et la masse volumique

III - 1 - 4 Analyse statistique

III - 2 Propriétés acoustiques des sections fémorales humaines (F2) III - 2 - 1 Mesure de l’épaisseur des sections

III - 2 - 2 Capteurs plans

III - 2 - 3 Capteurs focalisés

III - 3 Calibration

5

III - 4 Propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical (F1, F2, F3) III - 4 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)

a) A l’échelle microscopique

b) A l’échelle macroscopique

III - 4 - 2 Etude des échantillons parallélépipédiques du fémur 2 (F2)

III - 4 - 3 Calibration

III - 4 - 4 Reproductibilité des mesures effectuées par la technique de nanoindentation

III - 5 Propriétés morphologiques

III - 5 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)

a) Paramètres morphologiques

b) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques

III - 5 - 2 Sections fémorales (F2)

c) Cartographie de la microarchitecture

d) Paramètres morphologiques

e) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques

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Chapitre III - Discussion I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES ACOUSTIQUES, MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES I - 1 Technique de transmission en contact

a) Comparaison des trois fémurs (F1, F2, F3)

b) Variation spatiale

I - 2 Technique de transmission en immersion (F2)

a) Variation spatiale

I - 3 Comparaison des techniques de transmission en contact et en immersion (F2)

I - 4 Corrélation des propriétés acoustiques et morphologiques

a) Echantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)

b) Sections fémorales (F2)

I - 5 Synthèse des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical

II PROPRIETES MECANIQUES DES LAMELLES OSSEUSES II - 1 Comparaison des résultats macroscopique et microscopique

II - 2 Etude du fémur 2

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Chapitre I - Etude bibliographique

I LE TISSU OSSEUX I -1 Classification des différents types d’os

L’os est un tissu de soutien hautement spécialisé, caractérisé par sa rigidité et sa dureté. La

conformation extérieure des os est variée et irrégulière ; on peut distinguer trois types principaux :

Les os longs (fémur, tibia) qui possèdent un corps et deux extrémités : le corps ou diaphyse est en

général cylindrique, les extrémités ou épiphyses sont plus volumineuses que le corps et présentent

des surfaces lisses par lesquelles l’os s’articule avec les os voisins : les surfaces articulaires.

L’épiphyse la plus rapprochée du tronc s’appelle l’épiphyse proximale, la plus éloignée est

l’épiphyse distale.

Figure 1: Anatomie du fémur (Chevrel et coll., 2000)

Les os longs présentent la plupart du temps un cortex externe dense (périoste) composé d’os

cortical ou compact et d’une région interne formée d’os trabéculaire ou spongieux localisé aux

extrémités (épiphyse) des os longs.

L’os cortical forme une coque externe rigide qui résiste à la déformation, et le réseau trabéculaire

interne (os spongieux) renforce l’os en agissant comme un système complexe de piliers.

Les os courts qui ont presque tous une forme cubique ou proche et présentent un plus grand

nombre de facettes articulaires. Certains sont très petits (pisiforme), d’autres plus volumineux

(exemple : calcanéus).

Les os plats (exemple : omoplates, côtes) qui ont une épaisseur extrêmement réduite alors que la

longueur et la largeur sont variables.

8

I - 2 Organisation hiérarchique de l’os cortical humain

I - 2 - 1 Composition de la matrice extracellulaire

Dans la matrice extra-cellulaire de l’os, on distingue deux composantes :

- la matrice organique

- la matrice minérale

La matrice organique est composée de collagène de type I qui forme 90% de la matrice

organique osseuse. La matrice osseuse est constituée à 90% d’ostéoïde. L’ostéoïde est un tissu

de soutien constitué de collagène de type I, inclus dans un gel de glycosaminoglycane

contenant des glycoprotéines spécifiques (ostéocalcines par exemple), qui lient fortement le

calcium. En effet, la matrice organique comprend également plusieurs molécules tel que

l’ostéonectine qui joue un rôle important dans la minéralisation du fait de son affinité pour le

collagène de type I et le calcium. La matrice organique est formée d’os réticulaire et lamellaire.

L’os réticulaire (réparation d’une fracture) est caractérisé par sa distribution aléatoire des fibres

de collagène et est mécaniquement faible. L’os lamellaire est caractérisé par un alignement

parallèle régulier de lamelles de collagène et est mécaniquement très résistant.

La matrice organique est encore plus complexe puisqu’il existe des facteurs de croissance qui

jouent un rôle fondamental dans la régulation du remodelage osseux.

La matrice minérale est constituée de cristaux d’hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) (sous

forme d’une aiguille ou d’une plaquette hexagonale) et de carbonate de calcium. L’os

représente ainsi un réservoir de calcium puisqu’il contient 98% du calcium de l’organisme. De

ce fait, il joue un rôle primordial dans la régulation calcique. Le dépôt de sels minéraux dans

l’ostéoïde confère à l’os sa rigidité et sa force mécanique.

9

Os cortical

Os spongieux

Ostéon

Lamelle

Canal de Havers

Fibre de collagène

Fibrille de collagène

Molécule de collagène

Cristaux osseux

I - 2 - 2 Architecture de l’os cortical

Les propriétés mécaniques de l’os cortical dépendent des propriétés mécaniques de l’ensemble des

éléments structurels qui le composent tels : les ostéons (10-500µm), les lamelles osseuses (3-7µm),

cristaux d’apatite…

Figure 2 : Organisation hiérarchique de l’os cortical humain (Rho et coll., 1998) Le système haversien (figure 3) est l’élément représentatif de l’os cortical; il est composé d’un

ensemble de canaux nourriciers (diamètre 50-60µm) ou canaux de Havers. L’élément

représentatif du système haversien est l’ostéon (diamètre entre 10 et 500µm): orienté

parallèlement à l’axe longitudinal de l’os, il est généralement composé de 3 à 8 lamelles de

collagène minéralisées (diamètre 3 à 7µm) et organisées de façon concentrique autour du canal

de Havers. Ces lamelles sont alternées en lamelles dites épaisses et fines. La lamelle externe de

l’ostéon, la ligne cémentante, délimite l’ostéon et le système interstitiel. Le système interstitiel

est composé d’anciennes lamelles osseuses ayant appartenu à d’anciens ostéons.

Figure 3 : Représentation du système haversien (Chevrel et coll., 2000)

10

Ascenzi et Bonnucci (1967, 1968, 1990 et 1994) ont identifié trois types d’ostéons selon

l’orientation des fibres de collagène. La sélection des ostéons s’effectue via un microscope

polarisé (figure 4) ; ils sont classés en type I, II et III et représentent respectivement des

orientations transversales, alternées (alternance de fibres longitudinales et transversales) et

longitudinales de fibres de collagène.

Figure 4 : Représentation des différents types d’ostéons avec leur visualisation au microscope polarisé : a) ostéons de type I (orientation transverse), b) ostéons de type II (orientation alternée), c) ostéons de type III. (Ascenzi et Bonucci, 1968)

L’os spongieux est constitué d’un ensemble de travées (ou trabécules) osseuses qui ont une

forme de bâtonnets ou de lamelles. Les espaces situés entre les trabécules sont occupés par de

la moelle osseuse; l’os spongieux se distingue de l’os cortical par une porosité beaucoup plus

importante.

Lorsque l’os spongieux est soumis à des contraintes importantes la zone trabéculaire s’organise

de façon à offrir une résistance maximale à ces contraintes. Ainsi les zones trabéculaires

fortement sollicitées auront une structure lamellaire (forte densité) comparée aux zones moins

sollicitées qui présentent une allure bâtonnet (faible densité). L’os est un matériau vivant qui

adapte sa structure géométrique à la charge qui lui est appliquée.

Figure 5 : Image 3D de l’os trabéculaire (Peyrin et coll., 1997)

11

I - 2 - 3 Remodelage osseux

Le tissu osseux contient trois types de cellules (figure 6) qui servent à l’entretien et au

remodelage de l’ostéoïde.

Les ostéoblastes (30µm) dérivent de cellules mésenchymateuses qui forment une population

de cellules souches pouvant se différencier en cellules plus spécialisées qui forment

l’os. L’objectif des ostéoblastes est de secréter du collagène de type I qui assemblé en fibrilles

dans le milieu extra-cellulaire servira à la formation osseuse.

Les ostéocytes (10µm) sont des cellules osseuses matures issues des ostéoblastes. Par

l’intermédiaire de leurs prolongements cytoplasmiques d’interconnexion les ostéocytes

reçoivent suffisamment de nutriments pour survivre. Ils peuvent aussi résorber la matrice

osseuse qui les entoure pour libérer du calcium en quantité faible.

Les ostéoclastes (50 à 100µm) sont des cellules osseuses multinuclés dont la principale

fonction est de phagocyter les fibres de collagène, et qui jouent donc un rôle essentiel dans la

résorption du tissu osseux.

Avec la contribution de ces trois cellules qui constituent le tissu osseux on peut dire que l’os est

un tissu en remodelage permanent.

a) b)

c)

g Figure 6 : Illustration des principales cellules osseuses a) ostéoblaste b) ostéocyte c) ostéoclaste

(Maillet et coll., 1979)

Ostéocyte Ostéoplaste

Canalicules

12

II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES

MECANIQUES ET ACOUSTIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN

Ce chapitre présente les différentes méthodes expérimentales qui sont utilisées pour

caractériser les propriétés mécaniques (modules d’élasticité, coefficients élastiques) et

acoustiques (vitesse de propagation, impédance, atténuation) aux échelles macroscopique et

microscopique du tissu osseux humain.

A Echelle macroscopique

A - I In vitro

A – I – 1 Technique mécanique

Les tests mécaniques sur des échantillons osseux (cortical ou spongieux) peuvent être

appliqués en traction ou en compression. La réponse du matériau est visualisée par un

diagramme qui représente l’effort « F (N)» appliqué sur l’échantillon en fonction de sa

variation de longueur « l (mm) » (figure 7).

Figure 7 : Diagramme effort - allongement représentant un échantillon soumis à un test de compression

Ce diagramme effort - allongement est constitué de trois phases :

La phase I correspond à la déformation élastique c’est à dire que l’échantillon se déforme

proportionnellement à l’effort. Dans cette phase, l’échantillon déformé s’allonge d’une

longueur ∆l (mm), et on note la déformation (« ε ») de l’échantillon comme étant le rapport

entre l’allongement ∆l et la longueur initiale de l’échantillon l :

Dans cette zone le matériau est élastique et reprend sa forme de départ si l’effort est relâché.

Phase II : le point « Fe » correspond à la limite d’élasticité du matériau

l

F

∆l

Fe

F

∆l

13

Phase III : au-delà de la limite d’élasticité, la déformation continue à augmenter très

rapidement ; lorsque l’effort s’arrête l’échantillon ne reprend pas sa longueur initiale.

A chaque effort F correspond une contrainte σ (N/mm2) : SF

=σ S (mm2) étant la section de

l’échantillon. Le module d’élasticité longitudinale ou module d’Young E (N/mm2) correspond

au rapport entre la contrainte et la déformation (ε).

On en déduit la loi de Hooke qui relie la contrainte (σ), la déformation (ε) et le module de

Young E : eE ×=σ Equation 1

ll

SFE

∆×= Equation 2

De nombreuses études ont comparé les modules d’élasticité obtenus avec des tests en tractions

et en compressions ; certains auteurs ont conclu qu’il y avait des différences significatives des

propriétés mécaniques (Stone et coll., 1983, Kaplan et coll., 1985) alors que d’autres études

(Bensusan et coll., 1983, Rohl et coll., 1991) n’ont pas trouvé de différence entre ces deux

tests mécaniques.

La technique de la flexion en trois points (Choi et Goldstein, 1992) permet également de

mesurer mécaniquement le module d’Young (E). Cette technique consiste à imposer une force

(F) fixe sur une poutre disposée en équilibre puis à mesurer la flèche engendrée par cette force

(figure 8).

Figure 8 : Représentation de la technique trois point de flexion

Les effets de cisaillement sont négligés lorsque les dimensions longitudinales de la poutre

sont très grandes devant les dimensions transversales.

L’équation suivante permet de mesurer la flexion élastique d’une poudre :

fI

FlE 48

3

= Equation 3

E module Young (N/mm2), F la force appliquée (N), f la flèche (mm), l la longueur (mm), I le

moment quadratique (mm4).

F

14

A - I - 2 Technique acoustique en transmission

a) En contact

Plusieurs auteurs (Yoon et Katz, 1976, Van Buskirk et coll., 1981, Ashman et coll., 1984) ont

utilisé une technique acoustique de transmission en contact avec des capteurs plans à

2,25MHz et 75KHz. Cette technique ultrasonore développée par Ashman et coll., 1984 a

consisté à faire passer une onde ultrasonore à travers un échantillon disposé entre deux

capteurs jouant le rôle d’émetteur et de récepteur. Ensuite, il est visualisé sur un oscilloscope

l’impulsion émise par le générateur en entrée et la propagation de l’onde à travers le matériau

en sortie (figure 9). Le temps de propagation de l’onde peut directement être mesuré à

l’oscilloscope, et le module d’Young est déduit des mesures des propriétés acoustiques via

l’équation de propagation des ondes dans un milieu limité ; l’intervalle de valeurs pour les

vitesses obtenues à haute fréquence et dans toutes les directions est entre 3400m/s et 4000m/s

(Ashman et coll., 1984 ; Bensamoun et Ho Ba Tho, 2002 ; Ho Ba Tho et coll., 1991).

Figure 9 : Technique ultrasonore par transmission (Ho Ba Tho et coll., 1991)

Un atlas des propriétés mécaniques a été publié par Ho Ba Tho et coll., 1991 sur sept sujets

humains et sur différents types d’os en utilisant la technique de Ashman et coll., 1984 ; Les

modules d’élasticité dans la direction axiale pour le fémur, humérus et tibia sont

respectivement 19,8 GPa, 20,5 GPa et 20,8 GPa ; les résultats ont de plus démontré que les

propriétés mécaniques de l’os cortical variaient en fonction de la localisation anatomique,

reflétant l’hétérogénéité de l’os. Ces variations ont été estimées avec une résolution spatiale

de 5mm (taille des échantillons).

L

specimen

75 kHz capteurs

Générateur d’impulsionst

V =Lt

(mm)(µs)

OSCILLOSCOPE

impulsion

réponse

t : temps de parcours

15

b) En immersion

Transmission

Une technique ultrasonique en transmission a été proposée par Pithioux et coll., 2002

permettant d’estimer les propriétés élastiques d’os cortical bovin. Deux capteurs focalisés

(émetteur et récepteur) en immersion à 1MHz ont permis d’obtenir des vitesses longitudinales

comprises entre 4042 ± 19m/s et 4326 ± 20m/s ainsi que des coefficients élastiques

longitudinaux (C33) compris entre 28GPa et 39GPa. Ces résultats sont du même ordre de

grandeur que ceux publiés par Katz 1984 (C33 = 29 ± 1GPa), Yoon et Katz 1976 (C33 = 32,5

± 0,0044GPa) et Ashman 1984 (C33 = 27,6GPa).

Figure 10 : Propagation d’une onde ultrasonore en mode transmission (Pithioux et coll., 2002)

Réflexion

Cette technique utilise des capteurs piézo-électriques focalisés en immersion à basse

fréquence : 20MHz et 50MHz. L’onde acoustique émise est réfléchie à la surface du matériau

et reconvertie en signal électrique par le même capteur. Un balayage de la surface de

l’échantillon est effectué dans le but d’obtenir une cartographie 2D des impédances

acoustiques.

ρ×= CijZ Equation 4

Z étant l’impédance acoustique est relié à Cij la constante élastique et ρ la masse volumique.

Cette technique a été appliquée à des matériaux biologiques par Meunier et coll., 1988 dont le

principe est représenté figure 11.

Emetteur fixe

Récepteur mobile

Eau

16

Figure 11 : Dispositif expérimental du microscope acoustique (Bumrerraj et Katz, 2001)

Les travaux de Hasegawa et coll., 1995 ont utilisé la technique de microscopie acoustique afin

de comparer les propriétés acoustiques de trois groupes constitués de sujets pré ménopausées,

ostéoporotiques et post ménopausées. Les vitesses longitudinales obtenues pour le groupe

ostéoporotique (V = 3436 ± 209m/s) sont supérieures au groupe formé de sujets pré

ménopausées (V = 3318 ± 319m/s) et inférieures au groupe post ménopausées (V = 3663 ±

198m/s). Des différences significatives ont été trouvées entre les trois groupes mais aucune

explication n’a été avancée. Les auteurs suggèrent que les propriétés élastiques sont un bon

moyen pour prédire les fractures osseuses.

Les travaux de Meunier et coll., 1988 ont observé la résorption de certaines régions sur des

sections fémorales humaines de personnes jeunes (25 ans) et âgées (74 ans). La distribution

spatiale des impédances acoustiques (résolution 100µm) a montré que la section jeune

présentait de faibles impédances acoustiques dans la région postérieure (7,52 Kg/m2s)

comparée à une augmentation dans la région antérieure (7,78 Kg/m2s). La distribution spatiale

d’impédance chez le sujet âgé a montré différents contrastes dans des régions proches avec de

faibles impédances dans les régions postérieure (5,83 Kg/m2s) et antérieure 6,40 Kg/m2s)

ainsi qu’ un degré de porosité plus important dans la partie endoste.

Stage

Specimen

Coupling Liquid

Reflected waves

Receiver RF Signal

Transmitter

Buffer Rod (Sapphire)

Matching Layer

Acoustic wave

Piezoelectric transducer

17

Certains auteurs tel que Zimmerman et coll., 1990 utilisent la cartographie d’impédance dans

le but d’observer le remodelage osseux après des arthroplasties de hanches. En effet, le

remodelage osseux a été observé après implantation de deux types de prothèses de hanches

(Austin - Moore versus Charnley).

a) b)

Figure 12 : Cartographie fémorale d’impédance pour un sujet implanté (a) avec une prothèse

de Moore et sans prothèse (b) (Meunier et coll., 1988)

La distribution d’impédance en fonction de la localisation anatomique a été étudiée par Weiss

et coll., 1998. L’impédance acoustique du côté postérieur (7,55 Mrayls) est inférieure aux

autres côtés (7,75 – 7,8 Mrayls) (1 Mrayls = 106 Kg/m2s ) ; sur une longueur représentant

20% de la diaphyse, l’impédance acoustique diminue sur la région antérieure alors qu’elle

augmente pour le côté postérieur.

18

A - II In vivo

A - II - 1 Transmission axiale en contact

Une nouvelle technique commerciale (« Sunlight Ultrasound Technologies, Rehovot, Israel »)

in vivo a été utilisée par différents auteurs afin de détecter les personnes ostéoporotiques et

prédire le risque de fracture. Cette technique consiste à mesurer la vitesse de l’onde

ultrasonore qui se propage sur quelques centimètres suivant un mode de transmission axiale le

long de l’os cortical figure 13.

Figure 13 : Propagation de l’onde à travers les tissus mous et le long de l’os

(Barkmann et coll., 2000)

La vitesse de propagation a été mesurée sur 1521 sujets sains âgés de 20 à 90 ans sur de

multiples sites tel que le radius, le tibia, le métatarse et la phalange ; les vitesses mesurées

sont respectivement 4169m/s, 3939m/s, 3663m/s et 4047m/s. Ces mesures ont permis

d’évaluer la précision de cette technique et le recueil d’une base de données (Weiss et coll.,

2000). Les travaux de Barkmann et coll., 2000 menés avec cette même technique ont consisté

à prédire le risque de fracture en comparant des populations de sujets sains et des sujets qui

avaient auparavant eu une fracture de la hanche, cheville, avant-bras, colonne vertébrale.

Le résultat de cette étude ayant démontré des vitesses de propagation plus faibles pour les

sites fracturés permet d’envisager le potentiel de cette nouvelle technique dans la prédiction

du risque de fractures.

Transducers

Soft Tissue

Bone

19

A - II - 2 Transmission transverse en immersion

Les travaux de Laugier et coll., 1994, 1996 ont mesuré le paramètre d’atténuation en

fréquence (BUA : Broadband Ultrasonic Attenuation) afin d’estimer la qualité osseuse à

travers des images paramétriques ultrasonores reconstruites à partir de la pente d’atténuation

ou de la vitesse de propagation. La technique consiste à immerger le talon dans un bain qui est

placé entre deux capteurs piézo-électriques focalisés. L’onde se propage dans la direction

transverse à travers le calcanéum ; cette technique est équivalente à l’ostéodensitométrie par

rayons X, elle a l’avantage d’avoir une meilleure standardisation de la zone à examiner et de

permettre un bon positionnement de la région d’intérêt à observer.

Figure 14 : Représentation de l’atténuation ultrasonore obtenue in vitro sur le calcanéum

(Laugier et coll., 1994)

A - II - 3 En réflexion

Une étude similaire à celle de Hasegawa et coll., 1995 a été menée par Antich et coll., 1993

par une technique in vivo en réflexion sur trois groupes également constitués de sujets pré

ménopausées, ostéoporotiques et post ménopausées. Les résultats obtenus sont en désaccord

avec ceux trouvés par Hasegawa puisque aucune différence significative n’a été obtenue pour

les vitesses acoustiques entre les trois groupes : Vpré ménopausée = 4123 ± 174 m/s,

Vostéoporotique = 4089 ± 178m/s et Vpost ménopausée = 4045 ± 199 m/s).

20

B Echelle microscopique

B - I Echelle de l’ostéon

B - I - 1 Tests mécaniques

Les premiers travaux de recherche menés sur les propriétés mécaniques d’ ostéons isolés ont

été menés par Ascenzi et Bonucci, 1967. Plusieurs tests mécaniques en compression, torsion,

flexion ont été réalisés sur des ostéons de types I (ostéon transverse), II (ostéon alterné) et

III (ostéon longitudinal) possédant des orientations différentes de fibres de collagène.

Des tests de compression furent réalisés sur des ostéons extraits de fémurs humains (30 et 80

ans) avec deux différents niveaux de degré de calcification. Les auteurs ont trouvé que les

valeurs des propriétés élastiques augmentaient du type III au type I aussi bien pour les ostéons

pleinement minéralisés (EIII_minéralisé = 64,4 ± 18,4 Kg/cm2, EI_minéralisé = 94,9 ± 16,6 Kg/cm2)

que pour ceux en début de minéralisation (EIII_ non minéralisé = 49 ± 15,2 Kg/cm2, EI_ non minéralisé =

73,6 ± 5,6 Kg/cm2). L’intervalle de valeur trouvé pour les ostéons en début de minéralisation

est inférieur à celui obtenu pour les ostéons pleinement minéralisés (Ascenzi et Bonucci,

1968).

Les tests en tension ont été réalisés sur différents types d’ostéons secs et humides extraits de

fémurs humains (30 ans) avec deux niveaux de minéralisation. Les ostéons secs présentent

des propriétés mécaniques plus élevées (EIII_sec minéralisé = 238,6 ± 71,2 Kg/cm2,

EIII_humide minéralisé = 119,4 ± 59 Kg/cm2) et le degré de minéralisation augmente les propriétés

élastiques (EIII_sec minéralisé = 238,6 ± 71,2 Kg/cm2, EIII_sec non minéralisé = 203,9 ± 76,4 Kg/cm2

(Ascenzi et Bonucci, 1967).

Les tests en torsion (Ascenzi et coll., 1994) appliqués à des ostéons fémoraux pleinement

minéralisés montrent que le module de cisaillement pour les ostéons de type III

(G=23,15±7,74GPa) est supérieur à celui des ostéons de type II (G=17,7±3,35GPa) (Ascenzi

et coll., 1994).

Les propriétés mécaniques en flexion des ostéons de types II et III (Ascenzi et coll., 1990) ont

montré que les propriétés mécaniques des ostéons de type II (E=2,69±0,93GPa) étaient

supérieures à celles de type III (E=2,32±1,20GPa).

Selon les auteurs, les structures alternées semblent être plus résistantes aux contraintes en

flexion.

21

Pour résumer, tous ces tests réalisés à l’échelle de l’ostéon ont montré que chaque type

d’ostéons avait des propriétés mécaniques bien spécifiques dépendant de l’orientation des

fibres de collagène qui supportent différentes contraintes externes.

Notons le changement d’unité utilisé par Ascenzi et coll. entre 1967-1968 (Kg/cm2) et 1990-

1994 (GPa) pour caractériser les propriétés mécaniques d’ostéons. Il faudrait multiplier les

valeurs affichées en Kg/cm2 par un facteur 105 pour les convertir en unité Pascal (Pa).

B - 1 - 2 Technique par ultrason en immersion et réflexion

La technique du microscope acoustique à haute fréquence 400MHz et 600MHz permet

d’obtenir des images acoustiques de la microstructure (ostéons, travée) avec une résolution de

2,5µm (Bumrerraj et Katz, 2001, Eckardt et Hein, 2001, Katz et Meunier, 1993). Cette

technique permet d’observer la distribution spatiale des impédances acoustiques reflétant les

distributions spatiales des propriétés microstructurales.

Figure 15 : Représentation de la structure haversienne (600MHz) (Katz et Meunier, 1993)

22

Microscope optique

Vidéo caméra

indentateur

échantillon

B - II Lamelles osseuses

Les premiers travaux de recherche réalisés sur les propriétés mécaniques de lamelles

d’ostéons dites épaisses (largeur des lamelles supérieure à 3µm) furent réalisés par Rho et

coll., 1997 en utilisant la technique de nanoindentation figure 16. Cette technique consiste à

faire un test mécanique cyclique de compression dans la direction axiale sur une lamelle

osseuse.

Figure 16 : Technique d’indentation La réponse du matériau (la lamelle) est visualisée en temps réel et le module d’Young E

(GPa) est calculé à partir de l’élasticité S (µN/nm) (mesurée expérimentalement) et l’aire de

contact A (nm2) :

A

SE ×=2π Equation 5

Cette technique expérimentale sera plus amplement détaillée dans le chapitre suivant.

Les modules d’Young des lamelles d’ostéons et des lamelles interstitielles ont été mesurés sur

différents types d’os (fémur, tibia) et sur différents tissus osseux (cortical, spongieux) (Fan et

coll., 2002, Hengsberger et coll., 2002, Oliver et Pharr, 1992, Rho et coll., 1997, Rho et coll.,

1998, Rho et Pharr, 1999, Rho et coll., 2002). Les valeurs des lamelles interstitielles sont

significativement supérieures de (2GPa) par rapport aux lamelles des ostéons secondaires (19-

22,5GPa). L’intervalle de valeur trouvé pour la dureté des lamelles osseuses varie de 0,42GPa

à 0,65GPa (Rho et coll., 1998, Rho et coll., 1999). Selon l’étude menée par Rho et Pharr,

1999 il a été démontré que les propriétés mécaniques des échantillons testés dans un état sec

augmentaient de 9% à 16%.

Les propriétés élastiques des lamelles osseuses au sein d’un même ostéon varient de 2 ± 0,13

GPa suivant la direction radiale (du canal de Havers vers la ligne cémentante). En effet, cette

étude a montré que les propriétés élastiques des lamelles d’ostéons diminuaient du centre

(canal de Havers) vers l’extérieur (ligne cémentante) de l’ostéon (Rho et coll., 1999).

23

Précisons que ce dernier résultat qui a été obtenu sur un total de 5 ostéons nécessiterait une

augmentation du nombre d’échantillons afin de confirmer cette variation de minéralisation.

Les travaux de Martin, 1993 fondés sur un modèle à éléments finis représentant les

différences de minéralisation au sein d’un ostéon ont également montre également une

diminution de la minéralisation du centre vers l’extérieur de l’ostéon. Cependant, les travaux

de Paschalis et coll., 1996 utilisant une méthode par micro spectroscopie infra rouge a obtenu

une augmentation de la densité minérale de l’extérieur vers l’intérieur de l’ostéon avec un

plateau de minéralisation à 50-60µm du centre de l’ostéon. Le détail anatomique des lamelles

osseuses reste alors encore un sujet de débat.

Les propriétés mécaniques des lamelles d’ostéons varient également suivant la localisation

anatomique. En effet les travaux de Zysset et coll., 1999 ont montré que les paramètres

mécaniques (modules d’Young et dureté) étaient inférieurs dans la région du col fémoral

(15,8GPa) comparé à ceux mesurés au milieu de la région diaphysaire (19,1GPa). Cette

observation peut expliquer la fragilité du col fémoral à l’échelle macroscopique.

Différentes catégories de lamelles osseuses (épaisses et fines) ont été sélectionnées afin de

subir des tests de compressions dans différentes conditions expérimentales (variation de la

profondeur d’indentation) et physiologiques (sec ou humide) (Hengsberger et coll., 2002) ; les

propriétés mécaniques des lamelles d’ostéons dites épaisses sont supérieures de (2GPa) pour

de faibles profondeurs d’indentations (0,4mN) alors qu’à de grandes profondeurs

d’indentations (5mN) les lamelles dites fines sont supérieures de 2,5GPa. Le résultat reste le

même, quelles que soient les conditions physiologiques. Selon les auteurs, les lamelles

épaisses et fines qui constituent l’ostéon auraient des contenus différents en collagène et

cristaux d’apatite.

La question de l’influence de l’âge sur les propriétés élastiques des lamelles d’ostéons a été

analysée par Rho et coll., 2002 qui a conclu qu’aucune différence significative des propriétés

élastiques n’a été observée entre des populations jeunes (à 42 ans E = 21,9GPa) et âgées (à 70

ans E = 22,1GPa), vraisemblablement du fait d’un faible nombre d’échantillons testés.

C Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisation des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical humain Les techniques mécaniques et ultrasonores représentent les deux grandes catégories de tests

qui permettent de mesurer les propriétés mécaniques et acoustiques de l’os.

24

Les techniques mécaniques (Yoon et Katz, 1976, Van Buskirk et coll., 1981, Ashman et

coll., 1984, Rho et coll., 1999) sont des tests :

1) invasifs au-delà du point de rupture pour l’échelle macroscopique et également invasifs à

l’échelle de la microstructure où des empreintes d’indentations sont visibles après des

tests de compression.

2) qui nécessitent des dimensions spécifiques d’échantillons testés aux échelles

macroscopique et microscopique.

3) qui imposent des conditions expérimentales standard et souvent difficiles à mettre en

œuvre à cause de l’hétérogénéité de la structure osseuse.

4) qui ne permettent pas de mesurer l’anisotropie au sein d’un même échantillon à l’échelle

macroscopique.

Les techniques ultrasonores (Ashman et coll., 1984, Meunier et coll., 1988, Ho Ba Tho et

coll. 1991) sont des tests :

1) peu invasifs quelle que soit la technique ultrasonore utilisée

2) ne nécessitant pas de dimension spécifique des échantillons ; ils peuvent être de formes

cubiques ou cylindriques mais la longueur d’onde ultrasonore doit être supérieure ou

inférieure aux dimensions transversales de l’échantillon.

3) dont l’anisotropie peut être déterminée au sein du même échantillon.

technique Auteurs E3 (GPa)

Ultrason transmission Ashman et coll., 1984

Ho Ba Tho et coll., 1991

Bensamoun et HoBaTho, 2002

20

19,8

21

Echelle macroscopique

Mécanique compression Reilly et Burstein, 1975 17,7

Echelle microscopique

Ostéon (type II)

lamelle

Mécanique Tension

Mécanique compression

Mécanique flexion

Mécanique torsion

Nanoindentation

Ascenzi et Bonucci, 1967

Ascenzi et Bonucci, 1968

Ascenzi et coll., 1990

Ascenzi et coll., 1994

Rho et coll., 1997…2002

Zysset et coll., 1999

11,7

6, 3

2,3

22,7

[19 – 22,5]

19,1

Tableau 1 : Récapitulatif des modules d’Young axiaux trouvés dans la littérature sur os

cortical aux échelles macroscopique et microscopique.

25

III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES

MORPHOLOGIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN


III - 1 - 1 Micro – radiographie

Des coupes de 100µm d’épaisseur sont réalisées grâce à un microtome. Des

microradiographies de ces sections osseuses sont réalisées avec un tube à rayon X. Le film

est ensuite développé afin d’étudier les propriétés morphologiques sur ces photographies.

Figure 17 : Image microradiographique du cortex de la mi-diaphyse fémorale (Bousson, 2001)

III - 1 - 2 Micro-tomographie

La détermination des propriétés morphologiques nécessite une très haute résolution spatiale.

Pour rappel, l’os cortical a des canaux de Havers de diamètres compris entre 20µm et 70µm ;

les tomographes cliniques qui ont une résolution de l’ordre de 500µm sont donc incapables de

détecter la structure haversienne de l’os cortical.

Des microtomographes composés de tubes à rayon X ont alors été développés avec une

résolution de 14µm (Ruegsegger et coll., 1996, Muller et Ruegsegger, 1997, Hildebrand et

Ruegsegger, 1997) et 7,81µm (Lemineur et coll., 2002) afin de caractériser la micro

architecture osseuse. La microtomographie par rayonnement synchrotron (Peyrin et coll.,

1997) permet d’atteindre des résolutions spatiales qui peuvent être inférieures à 1µm avec un

haut rapport signal sur bruit. La quantification des paramètres morphologiques se fait le plus

26

souvent à partir des images 2D acquises sur l’échantillon qui est placé sur un système rotatif.

Les méthodes de reconstruction en 3D (Peyrin et coll., 1997) de l’échantillon permettent

d’accéder à des informations tridimensionnelles tel que l’analyse 3D du degré de

minéralisation.

Figure 18 : Image microtomographique 3D d’une zone d’excès de minéralisation matricielle

(Bousson, 2001)


De nombreux logiciels de calcul des paramètres morphologiques existent actuellement sur le

marché : OPTILAB (Graftek, France), VISIOLAB 5000 (Biocom, France), Qwin IM1000

(Leica, UK).

Chaque logiciel est adapté et modifié en fonction des paramètres morphologiques

sélectionnés.


Les propriétés morphologiques de l’os cortical ont fait l’objet de peu d’études comparé à l’os

spongieux dont les paramètres morphologiques ont été définis dans plusieurs études

(Destresse, 1998) ; en effet l’os spongieux subit en premier des modifications morphologiques

importantes lors de pathologies et sa structure trabéculaire permet de quantifier ces

transformations.

27

III – 2 -1 La porosité La porosité est définie comme étant le pourcentage de l’aire occupée par les pores de l’os

cortical. La porosité de l’os cortical correspond aux différents canaux nourriciers de l’os tels

les canaux de Havers et de Volkman mais il n’est pas pris en compte les lacunes ostéocytaires

et les canalicules. La porosité est généralement quantifiée à l’aide d’un logiciel de comptage

sur des coupes histologiques fines.

L’étude de Currey et coll., 1988 a conclu que 80% de la variation d’élasticité de l’os cortical

était due à la porosité et à la fraction volumique égale à « 1-Porosité » (cf. p.91) ; de plus une

relation cubique a été trouvée entre le module d’Young et les paramètres porosité et contenu

minéral. Les travaux de Schaffler et Burr, 1988 ont également montré une forte corrélation

(r2 = 0,86) entre l’élasticité de l’os et la fraction volumique.

La distribution intracorticale de la porosité a également été reliée à l’âge des personnes. En

effet les travaux de Bousson et coll., 2001 ont montré que pour des personnes âgées de 60 ans

ou pour de jeunes personnes, à la fois la taille des pores et le nombre de pores augmentaient

avec l’âge, alors que pour des personnes de plus de 60 ans la taille des pores continue à

augmenter mais le nombre de pores diminue.


L’étude bibliographique a présenté les différentes techniques mécaniques et ultrasonores qui

permettent de caractériser les propriétés mécaniques de l’os cortical. Ainsi, le chapitre suivant

détaillera les différentes techniques ultrasonores (en contact et en immersion) qui seront

utilisées pour déterminer les propriétés acoustiques et élastiques de l’os cortical à l’échelle

macroscopique. La caractérisation de l’échelle microscopique de l’os cortical (les lamelles

osseuses) se fera au moyen d’une technique mécanique (nanoindentation) qui sera analysée

dans le chapitre suivant.

L’analyse des propriétés morphologiques de l’os cortical a très peu été étudiée dans la

littérature par rapport à l’os spongieux. Le chapitre suivant met en avant les différentes

techniques d’analyse morphologique qui seront utilisées afin de caractériser les propriétés

morphologiques de l’os cortical.

La corrélation des propriétés morphologiques et mécaniques sera présentée au chapitre III.

28

29

Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques

du tissu cortical humain

I MATERIELS

Les propriétés acoustiques et mécaniques de différents matériaux vont être caractérisées dans

cette étude. Tout d’abord des échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical seront

utilisés puis des sections fémorales serviront à déterminer la distribution spatiale des

propriétés acoustiques.

I - 1 Echantillons cubiques

Des échantillons d’os cortical (figure 1) ont été découpés sur un fémur (côté droit) humain

noté F1 parallèlement à l’axe de la partie supérieure de la diaphyse entre 16% et 40% (sur une

longueur de 8cm) de la longueur totale du fémur dans les zones latérale et médiale. La

technique de découpe est identique à celle utilisée par Ashman et coll., 1984. Ces échantillons

(N = 10) sont de forme cubique (5x5x5mm) et avaient déjà fait l’objet d’une étude menée par

Ho Ba Tho et coll., 2001 (Taylor et coll., 2002).

I - 2 Echantillons parallélépipédiques

Deux fémurs humains (F2 et F3) ont été prélevés sur deux cadavres humains, âgés de 70 ans,

du laboratoire d’Anatomie du Centre Hospitalier Universitaire d’Amiens.

Le deuxième fémur (côté droit) noté F2 (figure 1) a été découpé en plusieurs sections entre

40% et 70% de la longueur totale du fémur (sur une longueur de 10cm) avec une scie

diamantée (MICROCUT 2) dans la direction transverse. A partir de chaque section, des

échantillons parallélépipédiques 15x5x4mm (N = 32) sont découpés à la scie diamantée dans

les régions latérale, médiale et postérieure. Le disque de la scie est maintenu à une vitesse

faible et il est humidifié pendant toute la durée de la découpe afin de ne pas échauffer les

échantillons.

30

Le troisième fémur (côté gauche) noté F3 (fig.1) a également été découpé en plusieurs

sections dans la partie inférieure de la diaphyse entre 55% et 70% de la longueur totale du

fémur (ce qui correspond à une longueur de 5,5cm). La technique de découpe est identique à

celle pratiquée sur le fémur F2 et des échantillons parallélépipédiques (15x5x4mm N = 18)

sont découpés parallèlement à l’axe de la diaphyse dans les régions latérale, médiale et

postérieure.

Figure 1 : Localisation anatomique des échantillons

I - 3 Sections fémorales

Une section fémorale du fémur F1 a été récupérée d’une précédente étude de Ho Ba Tho et

coll., 2001.

Des sections fémorales ont été découpées (figure 2) à la scie diamantée sur le fémur F2 (N=4)

et F3 (N = 4) entre les échantillons parallélépipédiques (figure 2). L’identification des

sections fémorales du fémur F2 est reliée à la longueur totale du fémur de la partie proximale

à la partie distale : section 1 (45%), section 2 (50%), section 3 (56%) et section 4 (60%) ; de

même les sections fémorales du fémur F3 sont situées à 56%, 61%, 65% et 70% de la

longueur totale du fémur.

3. Direction axiale

1. Direction Radiale

2. Direction Tangentielle

F1

8cm

F2

10cm

F3

5.5cm

31

L’épaisseur moyenne de ces sections est de l’ordre de 2,09mm ± 0,27mm. Les mesures

d’épaisseur ont été réalisées avec un micromètre numérique (Mitutoyo) dont la précision est

de 0,01mm et le diamètre de la pointe est de 3mm. Un total de 12 mesures a été réalisé en

périphérie de la section. La distribution spatiale des vitesses permettra de vérifier le

parallélisme des faces des sections fémorales.

Les échantillons parallélépipédiques ainsi que les sections fémorales seront stockés dans une

solution de chlorure de sodium à 0,9%.

Figure 2 : Localisation anatomique des sections fémorales ainsi que les échantillons parallélépipédiques appartenant au fémur F2

3P

3M 3L

1P

1M 1L

2P

2M 2L

1

2

3

4

0P

0M 0L

3 Direction axiale

1 Direction Radiale

2 Direction Tangentielle

40%

70%

32

II METHODES

II - 1 Théorie

La caractérisation des propriétés mécaniques de l’os cortical sera réalisée au moyen de

techniques par ultrason qui sera détaillée dans la partie suivante ; la propagation des ondes

ultrasonores à travers les solides peut se faire de deux manières différentes (figure 3) :

- Les ondes peuvent se propager de manière longitudinale (aussi appelées « ondes de

compression ») : le mouvement des particules est parallèle à la direction de

propagation de l’onde.

- Les ondes peuvent se propager de manière transversale (aussi appelées « ondes de

cisaillement »), caractérisées par un mouvement des particules qui est transversal par

rapport à la direction de propagation de l’onde.

a) b)

Figure 3 : Propagation d’ondes longitudinales (a) et transversales (b) (Destresse, 1998)

II – 1 - 1 Loi de Hooke

La loi de Hooke décrit un matériau dont le comportement est élastique linéaire :

ECT klijklij ×= Equation 1

Tij : tenseur des contraintes,

Cijkl : tenseur d’élasticité

Ekl : tenseur de déformation

33

L’équation 1 peut également s’écrire de la façon suivante :

εσ jiji C ×= Equation 2

σi : matrice des contraintes

Cij : matrice des coefficients élastiques

εj : matrice des déformations

L’observation des différentes contraintes agissant sur un parallélépipède est représentée

figure 4.

Figure 4 : Représentation des différentes contraintes agissant sur six faces du parallélépipède

La loi de Hooke généralisée peut alors s’écrire :

σxx = C11εxx + C12εyy + C13εzz + C14εyz + C15εzx + C16εxy Equation 3

. . . . . . .

. . . . . . .

. . . . . . .

. . . . . . . σxy = C61εxx + C62εyy + C63εzz + C64εyz + C65εzx + C66εxy

La matrice des coefficients élastiques Cij est symétrique, le nombre de coefficients

indépendants est alors réduit à 21.

34

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

=

CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC

Cij

666564636261

565554535251

464544434241

363534333231

262524232221

161514131211

Equation 4

II – 1 - 2 Matériau orthotrope

Un matériau orthotrope est un matériau élastique homogène présentant en tous points une

symétrie du comportement mécanique, chacune par rapport à un plan, les deux plans étant

orthogonaux. La matrice des coefficients élastiques est alors constituée de 9 coefficients

indépendants :

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

=

CC

CCCCCCCCCC

Cij

66

55

44

333231

232221

131211

000000000000000000000000

Equation 5

La relation contrainte–déformation est donnée sous la forme d’une matrice de compliance Sij :

σε jiji S ×= Equation 6

[ ]C

G

G

G

EEE

EEE

EEE

S ijij

1

12

31

23

32

23

1

13

3

32

21

12

3

31

2

21

1

100000

010000

001000

0001

0001

0001

−=

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

−−

−−

−−

=

νν

νν

νν

Equation 7

Ei : module d’Young dans la direction i (3 modules d’élasticité indépendants)

νij : coefficient de Poisson dans la direction i et j (3 coefficients de Poisson indépendants)

Gij : module de cisaillement dans le plan ij (3 modules de cisaillement indépendants)

35

II – 1 - 3 Matériau isotrope transverse

Un matériau isotrope transverse est un cas particulier d’un matériau orthotrope ; en effet on

dit qu’un matériau est orthotrope si tout plan passant par un axe de symétrie est un plan de

symétrie mécanique. La matrice des coefficients élastiques est alors réduite à 5 coefficients

indépendants car :

C11 = C22 C13 = C23 C44 = C55 ( )CCC 121166 21

−×=

La matrice des coefficients élastiques est alors sous la forme suivante :

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

=

CC

CCCCCCCCCC

Cij

66

44

44

331313

132212

131211

000000000000000000000000

Equation 8

La matrice de compliance Sij s’écrit :

( )

[ ]C

E

G

G

EEE

EEE

EEE

S ijij

1

31

13

3

1313

3

31

3

31

1200000

010000

001000

0001

0001

0001

−=

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

+

−−

−−

−−

=

ν

νν

νν

νν

Equation 9

II - 1 - 4 Matériau isotrope

Un matériau est isotrope si tout plan passant par un axe quelconque est un plan de symétrie

mécanique. Ainsi, les propriétés mécaniques d’un matériau isotrope sont définies uniquement

par deux constantes indépendantes appelées coefficients de Lamé et sont notées λ et µ

définies par :

λ = C12 = C13 = C21 = C23 = C31 = C32 Equation 10

µ = C44 = C55 = C66 Equation 11

λ + 2µ = C11 = C22 = C33 Equation 12

36

La matrice des coefficients élastiques s’écrit :

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

−

−

−=

200000

02

0000

002

000

000

000

000

1211

1211

1211

111212

121112

121211

CC

CC

CCCCC

CCC

CCC

Cij

Equation 13

La matrice de compliance Sij s’écrit :

( )

( )

( )

[ ]C

E

E

E

EEE

EEE

EEE

S ijij

1

13

1200000

0120000

0012000

0001

0001

0001

−=

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

+

+

+

−−

−−

−−

=

ν

ν

ν

νν

νν

νν

Equation 14

Le comportement élastique d’un milieu isotrope est défini par les λ etν, et on en déduit :

( )µλ

µλµ++

=23E Equation 15

ν

µ22 +

==EG Equation 16

( )µλλν+

=2

Equation 17

37

II - 1 - 5 Propagation d’une onde dans un milieu élastique illimité

Le terme illimité signifie que les dimensions transversales de l’échantillon sont très grandes

devant la longueur d’onde de l’onde ultrasonore qui se propage à travers le matériau en

obéissant à la loi fondamentale de la dynamique :

tudiv i

ij ∂∂= 2

2

ρσ Equation 18

σij : Tenseur des contraintes u : Vecteur de déplacement ρ : Masse volumique du matériau La résolution de l’équation 18 permet d’obtenir les relations entre les vitesses de propagation

de l’onde ultrasonore et les coefficients élastiques. Dans le cas d’un matériau orthotrope les

relations sont les suivantes :

VC 2

1111 ρ=

VC 2

2222 ρ=

VC 2

3333 ρ=

VVC 2

32

2

2344 ρρ ==

VVC 2

31

2

1355 ρρ == Equation 19

VVC 2

21

2

1266 ρρ ==

( )( ) CVCCVCCC 66

2

12/126622

2

12/1266111222 −−+−+= ρρ

( )( ) CVCCVCCC 55

2

13/135533

2

13/1355111322 −−+−+= ρρ

( )( ) CVCCVCCC 44

2

23/234433

2

23/2344222322 −−+−+= ρρ

Vii : Vitesse de l’onde longitudinale se déplaçant dans la direction i

Vij : Vitesse de l’onde transversale se déplaçant dans la direction i avec un déplacement des particules dans la direction j

Vij/k:Vitesse de l’onde transversale se déplaçant dans la direction 2ji + avec un déplacement

des particules dans la direction 2ji −

Vij/ij : Vitesse de l’onde longitudinale se déplaçant dans la direction 2ji + avec un

déplacement des particules dans le plan ij.

38

II – 1 – 5 - 1 Application à l’os cortical

Les travaux de recherche de Van Buskirk et coll., 1981 ont développé un échantillon cubique

composé de 12 arêtes biseautées (figure 5) permettant ainsi de déterminer 18 vitesses de

propagation de l’onde ultrasonore à travers cet échantillon. Les relations ci-dessus permettront

de calculer les coefficients de la matrice d’élasticité grâce aux vitesses de propagation de

l’onde dans les différentes directions.

Figure 5 : Echantillon cubique coupé à 45° (Ho Ba Tho et coll., 2001)

Les vitesses de propagation mesurées dans cette étude ne se feront que dans la direction

longitudinale. Les vitesses qui se propagent dans un milieu illimité sont appelées des

« vitesses Bulk » et sont reliées à l’élasticité du matériau par la relation :

ρ

CV ijBulk

ij= Equation 20

Dans cette étude Vij sera égale à V33.

II - 1 - 6 Propagation d’une onde dans un milieu élastique limité

Le terme limité signifie que les dimensions transversales de l’échantillon sont inférieures

devant la longueur d’onde de l’onde ultrasonore.

La loi fondamentale de la dynamique sera modifiée selon la théorie suivante :

On considère une barre homogène de section A de module d’élasticité E et de cisaillement G.

La contrainte (σ) agissant sur un élément de la barre est représentée (figure 6) :

Figure 6 : Contrainte (σxx) agissant sur un élément (A) de la barre

A σxx

Ox

39

L’élément A subit des contraintes σxx selon l’axe (Ox) et son déplacement longitudinal est

donné par u(x,t). Dans un milieu limité les conditions aux limites et les effets de bords sont à

considérer. Dans le cas présent, on suppose que la barre est homogène impliquant alors

l’absence de force de volume et si on néglige les effets d’inerties latérales alors l’équation de

propagation de l’onde dans une barre est donnée par la relation suivante :

tuEE x

xxxx 2

2

∂∂== εσ Equation 21

L’équation fondamentale de la dynamique devient :

tu

xuE xx

2

2

2

2

∂∂

∂∂ = ρ Equation 22

La résolution de cette équation correspond à la vitesse de propagation d’une onde

longitudinale :

ρEV L

= Equation 23

Par analogie la propagation d’une onde transversale est :

ρGV T

= Equation 24

II – 1 – 6 - 1 Application à l’os cortical

Le mode de propagation de l’onde ultrasonore à travers un échantillon d’os cortical dans un

milieu limité est appelé « mode barre longue ». L’échantillon d’os cortical doit avoir une

petite section devant la dimension de la longueur d’onde et sa structure doit être considérée

comme homogène.

La relation entre les propriétés acoustiques et élastiques du matériau est obtenue en résolvant

l’équation :

VE iij

2ρ= Equation 25

40

Les vitesses de propagation de l’onde (appelées « vitesses Bar » en milieu limité) à travers des

échantillons d’os cortical présentées dans cette étude ne seront mesurées que dans la direction

longitudinale (i = j = 3) :

ρEV Bar 33

33 = Equation 26

Pour résumer,

- Dans un milieu limité, les dimensions de l’onde de propagation doivent être

supérieures à la dimension transversale de l’échantillon. L’onde a alors un

comportement homogène macroscopique qui ne sera pas influencé par les

discontinuités du milieu.

- Dans un milieu illimité, les dimensions de l’onde de propagation doivent être

inférieures à la dimension transversale de l’échantillon. L’onde n’a plus un

comportement macroscopique mais microscopique impliquant une analyse de la

microstructure (pores).

41

II - 2 Mesures expérimentales

II - 2 - 1 Détermination des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical

II - 2 - 1 - 1 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en contact

La technique ultrasonore par transmission représentée figure 7 a été développée au laboratoire

de biomécanique de l’Université de Compiègne afin de mesurer les vitesses de propagation de

l’onde à travers l’échantillon osseux et de mesurer les propriétés élastiques de l’os cortical.

Cette technique est similaire à celle développée par Ashman et coll., 1984. Un couple de

capteurs (Panametrics V106RB et V1011RB) est utilisé soit en haute fréquence (2,25MHz)

soit en basse fréquence (75KHz). Un générateur (HP 3312A) envoie une impulsion qui excite

le premier transducteur piézo-électrique dont le rôle est de transmettre une onde ultrasonore à

une fréquence qui lui est propre. L’onde est ensuite propagée à travers l’échantillon (cubique

– parallélépipédique) et est reçue par le second transducteur qui a la même fréquence de

résonance que le premier transducteur. Le récepteur convertit l’onde ultrasonore en tension

afin de pouvoir la visualiser en sortie sur un oscilloscope (Tektronics TDS 3032). Le temps de

propagation de l’onde à travers l’échantillon est directement mesuré à l’oscilloscope comme

étant la différence de temps entre le début du signal d’entrée et de sortie. La vitesse de

propagation de l’onde est ensuite déduite du rapport entre la longueur de l’échantillon (« L »)

et le temps de propagation de l’onde (« t ») :

Figure 7 : Schéma du montage expérimental du banc de test ultrasonore par transmission

(Ho Ba Tho et coll., 1991)

L

specimen

75 kHz-2,25MHz capteurs

Générateur d’impulsionst

V =Lt

(mm) (µs)

OSCILLOSCOPE

impulsion

réponse

t : temps de parcours

42

Les propriétés élastiques (modules d’Young et coefficients élastiques) peuvent être mesurées

dans les trois directions principales (axiale, tangentielle et radiale) en intervertissant les faces

de l’échantillon (figure 8) en contact avec les transducteurs. Dans cette étude il ne sera mesuré

que les directions axiales des différents échantillons.

Figure 8 : Représentation des trois directions de propagation de l’onde

a) Mesure des vitesses de propagation avec des transducteurs hautes fréquences (2,25 MHz)

Les vitesses longitudinales obtenues avec de hautes fréquences (VBulk) sont comprises entre

3600m/s et 4200m/s (Ashman et coll., 1984 ; Ho Ba Tho et coll., 1991). La longueur d’onde

(λ) est alors de 2mm. La propagation de l’onde se fera dans un milieu illimité si les

échantillons possèdent des dimensions transversales qui seront supérieures à la longueur

d’onde. On peut ainsi en déduire les valeurs des coefficients élastiques des échantillons

osseux qui seront mesurés dans la direction axiale :

VC L

2

33 ×= ρ Equation 27

ρ est la masse volumique (Kg/m3), VL (m/s) la vitesse de propagation dans la direction axiale

et C33 correspond aux coefficients élastiques (Pa) de l’os cortical dans la direction axiale.

V11

V33 Direction axiale

3

Direction tangentielle

2

1Direction radiale

V22

43

b) Mesure des vitesses de propagation avec des transducteurs basses fréquences (75 KHz)

Les vitesses longitudinales (VBar) obtenues avec des capteurs basses fréquences à 75KHz sont

comprises entre 3000m/s et 3500m/s (Ashman et coll., 1984). La longueur d’onde (λ) est de

l’ordre de 45mm, et cette longueur est largement supérieure aux dimensions transversales des

échantillons osseux :

La propagation de l’onde se fait alors dans un milieu limité (mode « barre longue ») et les

propriétés élastiques du matériau sont directement reliées aux vitesses de propagation de

l’onde par la relation :

VE 2

3333 ×= ρ Equation 28

ρ est la masse volumique (Kg/m3), V33 (m/s) la vitesse de propagation dans la direction axiale

et E33 est le module d’Young du milieu traversé dans la direction axiale.

44

II – 2 – 1 - 2 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en immersion

Cette technique ultrasonore en transmission (figure 9) installée au laboratoire Roberval

(CNRS-UMR 6600) agit en mode échographique permettant de caractériser la distribution

spatiale des propriétés acoustiques sur les sections fémorales.

Un générateur (bande passante de 40MHz) (Sofranel 5052) émet des impulsions électriques

qui sont transmises au transducteur piézo-électrique. Le signal électrique est alors converti en

une onde acoustique.

Le transducteur à immersion est caractérisé premièrement par sa forme et deuxièmement par

ses paramètres intrinsèques. Deux types de transducteurs ont été utilisés : des transducteurs

plans à immersion et des transducteurs focalisés à immersion.

Le transducteur focalisé à immersion est de forme sphérique ; les fréquences utilisées sont

5MHz et 10MHz (Panametrics A308R et KB-Aerotech D14835) avec des distances focales de

75mm et des diamètres de tache focale de l’ordre de 1,24mm. La longueur d’onde à 5MHz et

10MHz est respectivement de 0,8mm et 0,4mm. Le transducteur plan émet des ondes

longitudinales aux fréquences de 5MHz et 10MHz (Panametrics V309 et Panametrics V311).

Figure 9 : Technique ultrasonique en transmission avec des capteurs en immersion

eau pilotage X-Y-Z

Table antivibration (Microcontrol MM2500)

Section fémorale

Transducteur focalisé 5MHz et 10MHz

Ordinateur

Generateur (Sofranel 5052) (S f l 5052

Oscilloscope (LeCroy 9410)

45

Une partie de l’onde acoustique est réfléchie sur le transducteur à immersion qui agit cette

fois-ci comme récepteur et retransforme l’onde acoustique en signal électrique afin de

mesurer les vitesses acoustiques dans la direction axiale sur chaque section fémorale.

Le transducteur est translaté automatiquement par un logiciel MICROXYZ (Controller Driver

MM 2500 Version 2,0) développé au sein du laboratoire Roberval afin d’obtenir plusieurs

mesures en surface des sections osseuses. Le transducteur est déplacé dans les directions X, Y

et Z par ordinateur avec une précision respective de 1µm, 0,1µm et 1µm et un pas de

déplacement de 0,5mm. La première étape a été d’utiliser le logiciel MICROXYZ pour régler

le parallélisme entre la surface du transducteur et le fond de la cuve ; ensuite le transducteur

est translaté suivant l’axe Z afin de focaliser le signal sur la surface osseuse. Un balayage

automatique est effectué suivant les directions X et Y avec un pas de 0,5mm. Chaque section

fémorale issue de F1, F2 et F3 est placée au fond d’une cuve disposée sur une table anti-

vibration et remplie d’eau déminéralisée à une température de 20°C. En chaque point

d’acquisition, deux échos sont enregistrés : le premier entre l’eau et le matériau (écho 1) et le

deuxième entre le matériau et l’eau (écho 2) figure 10.

Figure 10 : Représentation des échos à travers la section osseuse

Les acquisitions ont été moyennées (n=10) afin d’obtenir un signal de meilleure qualité. Le

nombre de points d’acquisition varie entre 1460 et 1734. Le temps (« t ») de propagation entre

les deux échos est mesuré avec un logiciel CACTUS (« CarACterisation of an ultrasonic

transducer) développé au sein du laboratoire Roberval afin de mesurer la vitesse (m/s)

écho 1 écho 2

écho 1

écho 2

t(µs)

Amplitude

mm

46

moyenne représentant toute la surface de la section. Cette vitesse est déterminée par le rapport

entre l’épaisseur (« e ») de la section et le temps de propagation (µs) entre les deux échos :

t

eV×

= 2 Equation 29

La représentation des lignes iso acoustiques est visualisée avec le logiciel Matlab qui permet

d’obtenir une cartographie de couleurs représentant la distribution spatiale des vitesses

longitudinales.

Des régions d’intérêts ont été définies par des carrés de 3mm localisés dans les régions

postérieure, latérale et médiale.

La reproductibilité de l’expérience (placement des échantillons et mesures de vitesses) a été

quantifiée en refaisant trois fois l’expérience depuis le début.

II - 2 - 1 - 3 Mesure de la masse volumique

Deux types de masse volumique existent :

- La masse volumique apparente correspond au rapport de la masse de la matrice osseuse

par le volume global de l’échantillon obtenu à partir de ses dimensions externes.

- La masse volumique réelle correspond au rapport de la masse de la matrice osseuse par

le volume occupé uniquement par la matrice osseuse. Cette masse volumique n’est

mesurée que lorsqu’on étudie l’os spongieux ; en effet dans le cas de l’os cortical, le

volume occupé par la matrice osseuse est largement supérieur à la porosité contrairement

à l’os spongieux qui a une porosité importante.

Les échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical ont été séchés sur du papier

absorbant avant que la masse volumique apparente soit calculée. La masse des échantillons a

été mesurée au moyen d’une balance digitale (Sartorius BP61S) dont la précision est de

0,1mg. Le volume des échantillons a été calculé avec les dimensions des échantillons qui sont

mesurées avec un micromètre (Mitutoyo, 293, Japan) dont la précision est de 0,01mm.

47

La masse volumique apparente est alors égale à :

VM

app=ρ Equation 30

ρapp étant la masse volumique apparente

M la masse de l’échantillon

V le volume de l’échantillon


La calibration des deux techniques ultrasoniques en transmission a été effectuée avec

différents matériaux isotropes tels que le cuivre, l’inox, plexi glass et le PVC.

Les vitesses théoriques de propagation des ultrasons, à travers ces matériaux, dans des milieux

illimité (transducteurs à hautes fréquences : 2,5MHz, 5MHz et 10MHz) et limité

(transducteurs à basses fréquences : 75KHz) sont connues de la littérature (Ashman et coll.,

1984). L’intervalle de vitesse théorique pour ces échantillons est compris entre 2680m/s et

5010m/s à haute fréquence et entre 2160m/s et 5000m/s à basse fréquence.

Chaque matériau a la même dimension avec un diamètre et une hauteur de 5x5mm.


Des tests Anova ont été réalisés avec le logiciel Statgraphics (Sigma Plus) afin de déterminer

les variations des propriétés acoustiques et élastiques en fonction de la localisation

anatomique.

48

II - 2 - 2 Détermination des propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical

II - 2 - 2 - 1 Microscope électronique à balayage

Un microscope électronique environnemental à balayage (XL 30 ESEM Philips) a été utilisé

sous vide à 20KV avec un agrandissement de 45. Toutes les surfaces des échantillons

(cubiques et parallélépipédiques) ont été scannées avec un faisceau d’électrons afin d’avoir

une cartographie des électrons rétrodiffusés reflétant la minéralisation de la surface des

échantillons (figure 11a). Cette étude a été réalisée à l’Université de Memphis (Tennessee,

USA) au département : « Integrated Microscopy Center ». L’avantage de cette technique est

qu’aucun échantillon n’a dû subir de revêtement en surface.

a)

b)

Figure 11: Image filtrée (b) réalisée à partir de l’image originale en niveaux de gris (SEM) (a) sur la surface d’un échantillon osseux F2. Trois différents types d’ostéons sont sélectionnés : osteon blanc (89-107), 2: osteon gris (110-122) et 3: osteon noir (120-127).

Noir Gris Blanc

Blanc

Noir Gris

49

Toutes les images SEM ont été réalisées dans des conditions identiques (condition

physiologique, distance focale, pression). Ensuite, un filtrage des images SEM a permis

d’identifier trois types d’ostéons. Un histogramme de niveaux de gris (0-255) effectué sur les

images SEM originales a permis d’identifier qualitativement trois niveaux de gris (89-107,

110-122, 120-127) correspondant respectivement aux ostéons blancs, gris et noirs.

II - 2 - 2 - 2 Technique de nanoindentation

Les mesures du module d’Young ont été déterminées grâce à un test mécanique qui applique

des tests de compression à l’échelle de la microstructure. La technique de nanoindentation est

composée d’un indenteur de type Berkovich qui a une pointe pyramidale en diamant ainsi que

d’un microscope optique (figure 12).

Figure 12 : Représentation de l’association entre le microscope optique et l’indenteur

Toutes les régions qui seront indentées c'est-à-dire qui vont subir un test de compression sont

auparavant sélectionnées et mémorisées au moyen du microscope optique ; ensuite l’indenteur

est optiquement dirigé sur les régions qui doivent être indentées. Le test de compression est

un test cyclique qui est constitué de sept segments (figure 13) avec des chargements,

déchargements et un maintien de la force de compression pendant 10 secondes lorsque la

Indenteur Berkovich (pointe diamantée)

Echantillon d’os cortical

Microscope optique

50

charge est maximale. La viscoélasticité du matériau qui est représentée à travers un hystérésis

et pendant le fluage est alors réduite.

Figure 13 : Cycle de chargement appliqué par l’indenteur

La force maximale de compression est d’environ 2500µm et ceci implique une profondeur de

déformation du matériau qui est de l’ordre de 400nm (figure 14). Ceci provoque une

déformation radiale de l’ordre de 2,8µm (= 400nm x 7) (Hengsberger et coll. 2002).

Figure 14 : Réponse du matériau au test de compression

50% de la force maximale

95% de la force maximale

Pente = S tf

0

Déplacement (nm)

Forc

e (µ

N)

4

5

6

7

1 2

3

Premier cycle

Deuxième cycle

Troisième cycle

Temps (s)

Cha

rgem

ent (

µN)

51

L’élasticité du matériau sera mesurée expérimentalement dans la zone linéaire du dernier

déchargement (entre 50% et 95% de la force maximale appliquée) (figure 14).

Le module élastique E de l’échantillon est relié à l’élasticité (Stf) et à l’aire de contact (A) par

la méthode d’Oliver et Pharr 1992 :

122 11

2

−

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡ −+

−=×

EES

s

s

i

itf

Aννπ Equation 31

ν est le coefficient de Poisson et les indices s et i correspondent respectivement à l’échantillon

et à l’indenteur. L’indenteur est caractérisé par un module d’élasticité Ei = 1140GPa et un

coefficient de Poisson de l’ordre de νi = 0,07.

La dureté du matériau peut être mesurée comme étant le rapport entre la force maximale

(Fmax) appliquée et l’aire de contact (A).

A

FH max= Equation 32

L’équation 32 est généralement appliquée à l’échelle macroscopique pour des matériaux

homogènes isotropes mais l’os étant un matériau anisotrope le module d’Young calculé sera

considéré comme une moyenne des constantes élastiques anisotropes.

Les tests de nanoindentation ont été réalisés sur les trois types d’ostéons sélectionnés

précédemment et appartenant aux échantillons des fémurs F1, F2 et F3. Chaque indentation

est effectuée trois fois sur une même lamelle osseuse dite épaisse (Hengsberger et coll., 2002)

localisée à mi distance entre le canal de Havers et la ligne cémentante de l’ostéon (figure 15).

En effet, la lamelle localisée au centre de l’ostéon représente la valeur moyenne de toutes les

lamelles. Un total de 138 et 22 indentations a respectivement été réalisé sur les ostéons du

fémur 1 et du fémur 3 qui sont principalement constitués d’ostéons blancs. Le fémur 2 a subi

351 indentations, sur des échantillons secs, réalisés sur 61 ostéons blancs, 17 ostéons gris et

39 ostéons noirs. Une dizaine d’indentations par échantillons testés ont été produites sur les

lamelles interstitielles des échantillons appartenant à F1, F2 et F3. La reproductibilité a été

obtenue en ré exécutant le test de nanoindentation trois fois à trois moments différents.

52

Figure 15 : Localisation des indentations


La calibration a été réalisée avec de la silice qui est caractérisée comme un matériau élastique

isotrope. Ce matériau est utilisé pour calibrer la forme de la pointe de l’indenteur. La silice est

couramment utilisée pour ce type de calibration à cause du faible rapport entre le module

d’élasticité et la dureté.


Des tests Anova ont été réalisés avec le logiciel Statgraphics 5,0 (Sigma Plus, Maryland,

USA) afin d’étudier la variation des propriétés élastiques (E) et mécaniques (H) au sein d’une

même lamelle épaisse et entre les différents types d’ostéons.

Indentation autour d’une meme lamelle

× ×

×

53

II – 2 – 3 Synthèse des échantillons

Tableau 1 : Résumé de tous les échantillons utilisés par les techniques ultrasonore et mécanique

Matériau

Os cortical

Taille des

échantillons

(mm)

Nombre

d’échantillons

Test US - contact

75KHz - 2,25MHz

Test US – immersion

5MHz - 10MHz

Test nanoindentation

Fémur : F1

Echantillons

cubiques

5 x 5 x 5

6

x

x

x

Fémur : F2

Echantillons

parallélépipédiques

Sections fémorales

15 x 5 x 4

12

4

x

x

x

x

Fémur : F3

Echantillons

parallélépipédiques

Sections fémorales

15 x 5 x 4

6

4

x

x

x

x

54

II - 3 Détermination des propriétés morphologiques de l’os cortical


La détermination des propriétés morphologiques va être effectuée :

- sur les échantillons cubiques issus du fémur F1 et sur les échantillons parallélépipédiques

issus des fémurs F2 et F3 qui ont tous précédemment subi des tests par ultrason.

- Sur les sections fémorales issues du fémur F2 où trois localisations seront étudiées :

les parties latérale, médiale et postérieure.


Les paramètres morphologiques mesurés sont :

- la surface de chaque pore

- le diamètre moyen de l’ensemble des pores

- la porosité : pourcentage de l’aire occupée par les pores de l’os cortical

II - 3 - 3 Protocole de mesure

a) Echantillons cubiques et parallélépipédiques

Les échantillons cubiques issus du fémur F1 et les échantillons parallélépipédiques issus des

fémurs F2 et F3 qui ont précédemment subi des tests par ultrason sont disposés dans un

micro-scanner (Skyscan 1072). L’échantillon est ensuite fixé sur un support et un faisceau

d’électrons tourne autour de l’échantillon. L’échantillon est balayé sur une hauteur de 7mm et

une coupe sur deux est acquise : épaisseur de coupe de 15,62 µm. La résolution des images

acquises est de 7,81µm (figures 16, 17, 18) et le grossissement utilisé est de x40. Ce protocole

expérimental a été réalisé par Mme Brunet au sein de l’institut IPROS dirigé par le Pr.

Benhamou (« Institute of Prevention and Research on Osteoporosis »).

55

Figure 16 : Exemple d’acquisition au micro scanner sur un échantillon cubique (F1)

(arêtes coupées à 45°)

Figure 17 : Acquisition au micro scanner d’un échantillon parallélépipédique issu de F2

Figure 18 : Acquisition au micro scanner d’un échantillon parallélépipédique issu de F3

56

Le format des images acquises est sous forme BMP et un système d’analyse d’image LEICA

QWIN permet de mesurer automatiquement la surface des pores (figure 19). Ce logiciel ne

sera utilisé que pour détecter la porosité des échantillons cubiques et parallélépipédiques. La

porosité des régions d’intérêts des sections fémorales sera mesurée à l’aide d’un autre logiciel

dont la technique de mesure sera détaillée ci après. De plus, les échantillons issus des fémurs

F2 et F3 seront également soumis à cette même technique.

Figure 19 : Les surfaces vertes correspondent à la porosité qui sera détectée puis mesurée.

b) Sections fémorales

Suite aux mesures acoustiques effectuées sur les sections fémorales, toutes les sections ont

été poncées avec du papier à grain (800, 1200) puis polies avec de la poudre d’aluminium

(diamètre des grains = 0,3µm). La qualité du polissage a été vérifiée avec un microscope

optique en réflexion (Leica DMLS, grossissement x10). Toutes les sections ont ensuite été

scannées sous vide à 20KV au moyen d’un microscope environnemental à balayage (XL

30 ESEM-FEG) au grossissement x22. Cette technique a l’avantage de ne pas traiter en

surface les échantillons. Ce travail a été réalisé au département d’analyse physico

chimique de l’Université de Compiègne. Les sections fémorales sont alors balayées par un

faisceau d’électrons afin d’obtenir une cartographie des électrons secondaires qui

indiquent la composition de la microstructure.

Environ 40 images au format Tiff (712 x 484 pixels) sont acquises sur chaque section avec

une résolution de 5µm par pixel. Après reconstruction de chaque section fémorale, trois

régions d’intérêts sont définies par des carrés de 3mm dans les parties latérale, médiale et

postérieure. Ces régions d’intérêts sont localisées aux mêmes endroits que celles définies

sur les cartographies de vitesses.

57

Les images des régions d’intérêts vont être transférées sur un logiciel développé par

Ho Ba Tho et coll., 1993 afin de pouvoir effectuer un seuillage de la microstructure

(figure 20) contenue dans les différentes régions d’intérêts.

Figure 20 : Exemple de détection de seuil réalisée dans la région d’intérêt postérieure d’une section fémorale.

Les données géométriques détectées sont ensuite transférées vers un logiciel Patran V.9

(MSC. Software) afin de calculer individuellement l’aire des particules (figure 21) ainsi

que la surface totale de la région d’intérêt.

Figure 21 : Représentation de l’aire des particules contenues dans la région postérieure d’une section fémorale.

La porosité est définie en pourcentage comme le rapport entre l’aire totale occupée par les

pores et l’aire totale de la région d’intérêt. La taille des pores a été définie par le diamètre

« D » calculé à partir de la relation suivante :

D =

4Sp

πNp

Equation 33

D : diamètre moyen des pores en µm, Sp: surface totale des pores, Np: nombre total des pores Remarque : cette hypothèse de circularité est confirmée pour la plupart des ostéons qui sont de forme circulaire. Cependant, à partir d’un certain seuil de porosité (les canaux s’assemblant pour former des lacunes) cette hypothèse de circularité n’est plus vérifiée et il sera nécessaire de calculer la longueur caractéristique du pore.

58

II - 3 - 4 Validation de la méthode de mesure

La précision de la méthode a été réalisée en utilisant des formes géométriques connues tels

des cercles (figure 22) et des ellipsoïdes (figure 23).

Figure 22. Représentation de différents diamètres de cercles correspondant aux différentes

tailles de particules.

Les valeurs théoriques des diamètres des cercles et les valeurs obtenues par le logiciel Patran

sont résumées dans le tableau ci-dessous.

Cercles Surface théorique

(mm2)

Surface obtenue par Patran (mm2)

% d’écart

D des cercles

Diamètre moyen

D= Π×4patranS

C1 19,64 28,6 43,4% 5mm 6,03mm C2 78,74 97,81 24% 10mm 11,1mm C3 314,16 351,86 11% 20mm 21,1mm C4 1245,66 1322,9 6% 40mm 41mm

Tableau 2 : Comparaison entre les valeurs théoriques et les valeurs obtenues avec Patran

C1 C4

C2 C3

59

La même démarche a été réalisée avec des ellipses (figure 23) qui ont des longueurs d’axes

différentes.

Figure 23 : Représentation de différentes tailles d’ellipses correspondant aux différentes

tailles de particules

ellipse Surface théorique(mm2)

Surface obtenue par Patran(mm2)

% d’écart

E1 39,27 42,99 9,4% E2 157,08 168,02 6,9% E3 628,32 637,17 1,4%

Tableau 3 : Comparaison entre les valeurs théoriques et les valeurs obtenues avec Patran

La reproductibilité des mesures a été quantifiée en répétant trois fois le processus.

10*20 20*40

60

61

F1

F2

F3

1100 1400 1700 2000 2300 800 Masse volumique (kg/m3)

III RESULTATS

III - 1 Propriétés mécaniques et acoustiques des échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical (F1, F2, F3)

III – 1 - 1 Mesure de la masse volumique

La précision de la masse volumique est de 5 kg/m3. La reproductibilité est de 20 kg/m3 (1%).

La masse volumique des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques est représentée

tableau 1 et varie de 855 kg/m3 à 2127 kg/m3.

Figure 1 représente la gamme de valeurs des masses volumiques des différents échantillons.

Les valeurs sont contenues dans des cases (« box whiskers ») divisées par une ligne

horizontale qui représente la valeur médiane. Les valeurs représentées par un petit carré ne

sont pas prises en compte car elles sont trop éloignées des autres valeurs.

Masse volumique (kg/m3)

Fémur 1 (N = 10)

1855 – 1932

1892 ± 29 Fémur 2 (N=32)

855 – 2127

1608 ± 275 Fémur 3 (N=18)

979 – 1688

1221 ± 161

Tableau 1 : Valeurs maximum, minimum et moyenne avec écart type (SD) de la masse volumique des échantillons cubiques (Fémur 1) et parallélépipédiques

(Fémurs 2 et Fémur 3).

Figure 1 : Représentation des intervalles de valeurs de la masse volumique pour les trois fémurs.

62

De plus, la variation spatiale de la masse volumique (ρ) a été étudiée sur certains échantillons

du fémur 2 et est représentée tableau 2. Les valeurs varient de 1468 à 2127 kg/m3. La masse

volumique du côté postérieur est plus faible comparée aux autres côtés. Les résultats

statistiques (figure 2) montrent que la masse volumique varie en fonction de la localisation

anatomique.

Numéro des échantillons

ρMédial

(kg/m3)

ρPostérieur

(kg/m3) ρLatéral

(kg/m3)

0L-M-P

2000 ± 7

1582 ± 4

1845 ± 7

1L-M-P

2127 ± 5

1468 ± 9

1888 ± 6

2L-M-P

1870 ± 7

1708 ± 6

1744 ± 5

3L-M-P

1785 ± 7

1731 ± 6

1650 ± 7

Tableau 2 : Valeurs moyennes avec écarts types (SD) de la masse volumique en fonction de la

localisation anatomique

Figure 2 : Intervalle de valeurs de la densité en fonction de la localisation anatomique

(* : P<0,05)

*

Latéral

Médial

Postérieur

1400 1600 1800 2200 2000 Masse volumique (kg/m3)

63

III - 1 - 2 Mesures des propriétés acoustiques

a) Mesures des vitesses de propagation

La précision des mesures de vitesses obtenues avec la technique par transmission en contact à

2,25 MHz et 75KHz est de 60m/s (min 20 m/s – max 80 m/s), ce qui implique une précision

de 0,5 GPa et 0,3 GPa pour la mesure des coefficients élastiques et modules d’Young. La

reproductibilité est obtenue sur trois mesures et est de 125m/s (84 m/s – 172 m/s).

Les valeurs des vitesses de propagation, dans la direction axiale, à travers des échantillons

d’os cortical appartenant à F1, F2 et F3 sont représentées tableau 3.

Le mode de propagation de l’onde étant différent, les vitesses mesurées à basse fréquence

« Vbar » sont plus faibles que les vitesses mesurées à haute fréquence « Vbulk ».

Os cortical Vbar (m/s) Vbulk (m/s)

Fémur1

3194 – 3570

3338 ± 127

3938 –4238

4018 ± 103

Fémur2

1716 – 3883

3461 ± 372

3531 –4006

3839 ± 151

Fémur3

1433 – 3492

2826 ± 536

2250 – 3646

3014 ± 422

Tableau 3 : Valeurs minimum, maximum et moyenne avec écart type (SD) des propriétés acoustiques.

La gamme des valeurs obtenue pour les vitesses Vbar et Vbulk est représentée par des « box -

whiskers ».

Figure 3 : Représentation des intervalles de valeurs des Vbar pour les échantillons appartenant

à F1, F2 et F3.

F2

F3

F1

2400 2900

1400 1900 3400 3900

Vitesse « Bar » (m/s)

64

Figure 4 : Représentation des intervalles de valeurs des Vbulk pour les échantillons appartenant

à F1, F2 et F3.

La variation spatiale des vitesses « bulk » a été observée sur les échantillons du fémur F2. Le

tableau 4 résume toutes les valeurs des vitesses longitudinales obtenues à 2,25 MHz.

L’intervalle de valeurs varie de 3548 m/s à 3967 m/s. La valeur moyenne et la médiane de

toutes ces vitesses est de l’ordre de 3859 ± 109 m/s et 3909 m/s. Les vitesses du côté

postérieur sont plus faibles (3548 – 3814 m/s) comparées aux autres côtés (3858 – 3967 m/s).

La figure 5 illustre via des « box-whiskers » cette variation spatiale de vitesse en fonction de

la localisation anatomique.


Vbulk_Médial

Vbulk_postérieur

Vbulk_Latéral

0L-M-P

3858 ± 26

3784 ± 24

3910 ± 26

1L-M-P

3948 ± 21

3548 ± 19

3927 ± 20

2L-M-P

3926 ± 25

3775 ± 22

3967 ± 25

3L-M-P

3908 ± 28

3814 ± 26

3947 ± 28

Tableau 4 : Valeurs moyennes avec écarts types (SD) de la variation spatiale

des vitesses « bulk »

F1

F2

F3

2200 2600 3000 3400 3800 4200 4600

Vitesse « Bulk » (m/s)

65

Figure 5 : Distribution spatiale des vitesses « bulk » (* : P<0,05, ** : P<0,001)

b) relations prédictives entre vitesses et masse volumique

Les relations prédictives entre les différentes vitesses et la masse volumique sont représentées

figure 6.

La relation entre la vitesse de propagation (V) en mode « bar » et la masse volumique (ρ) est

la suivante : Vbar = 97 ρ0,49 R2 = 0,51 Equation 1

La relation entre la vitesse de propagation en mode « bulk » et la masse volumique est la

suivante : Vbulk = 69 ρ0,52 R2 = 0,40 Equation 2

Figure 6 : Relation entre les vitesses de propagation et la masse volumique d’échantillons

d’os cortical humain.

Latéral

Médial

Postérieur

3500 3600 3700 3800 3900 4000

Vitesse « Bulk » (m/s)

* *

*

0 500

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

0 500 1000 1500 2000 2500

Masse volumique (Kg/m3)

Vbar

Vbulk

Vite

sse

(m/s

)

66

III - 1 - 3 Mesures des propriétés élastiques

a) Mesures des modules d’Young (E33) et des coefficients élastiques (C33) Les valeurs des modules d’Young obtenues dans la direction axiale à basse fréquence et les

coefficients élastiques obtenus également dans la direction axiale à haute fréquence sont

représentés dans le tableau 5 ci dessous. Le mode de propagation de l’onde influe sur les

valeurs du module d’Young qui sont plus faibles que celles des coefficients élastiques.

Os cortical

E33 (GPa)

C33 (GPa)

Fémur 1

19 – 24

21 ± 2

29 – 34

31 ± 2 Fémur 2

2 – 32

20 ± 5

11 – 33

24 ± 5 Fémur 3

2 – 18

10 ± 4

5 – 19

11 ± 4 Tableau 5 : Valeurs minimum, maximum et moyenne avec écart type (SD)

des propriétés élastiques La variation des coefficients élastiques (C33) en fonction de la localisation anatomique est

représentée tableau 6. L’intervalle de valeur varie de 18,5 GPa à 33,1 GPa. Les coefficients

élastiques du côté postérieur varient de 18,5 GPa à 25,2 GPa comparés aux autres côtés (25,7

GPa à 33,1 GPa). Les résultats statistiques (figure 7) montrent des différences significatives

entre le côté postérieur et les côtés latéral et médial.


C33_Médial

(GPa) C33_Postérieur

(GPa) C33_Latéral

(GPa)

0L-M-P

29,8 ± 0,24

22,7 ± 0,25

28,2 ± 0,30

1L-M-P

33,1 ± 0,2

18,5 ± 0,14

29,1 ± 0,22

2L-M-P

28,8 ± 0,23

24,3 ± 0,22

27,4 ± 0,25

3L-M-P

27,3 ± 0,28

25,2 ± 0,27

25,7 ± 0,28

Tableau 6 : Valeurs moyennes avec écarts types (SD) représentant la variation des coefficients élastiques en fonction de la localisation anatomique.

67

Figure 7 : Illustration des coefficients élastiques (C33) en fonction de la localisation anatomique (* : P<0,05, ** : P<0,001)

b) Relations prédictives entre les propriétés élastiques et la masse volumique

Les relations entre les propriétés élastiques et la masse volumique permettront de prédire des

valeurs de propriétés élastiques.

Les relations linéaires entre module d’Young, coefficient élastique et la masse volumique sont

représentées figure 8.

La relation entre le module d’Young (E) et la masse volumique (ρ) est la suivante :

E33 = 0,011ρ R2 = 0,70 Equation 3

La relation entre le coefficient élastique (C) et la masse volumique (ρ) est la suivante :

C33 = 0,014 ρ R2 = 0,72 Equation 4

Figure 8 : Relation entre le module d’Young, le coefficient élastique et la masse volumique d’échantillons d’os cortical humain.

Latéral

Médial

Postérieur

Coefficient élastique C33 (GPa)

* * *

19 22 25 28 31 34

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 500 1000 1500 2000 2500

Elas

ticité

(GPa

) E

C

Masse volumique (Kg/m3)

68

III - 1 - 4 Analyse statistique

Des tests statistiques (Anova) ont été réalisés afin d’étudier les différences de propriétés

mécaniques et acoustiques entre les trois fémurs. Le tableau 7 résume les résultats statistiques

obtenus. Des différences significatives entre les trois fémurs sont obtenues pour la densité, les

vitesses « bulk » et les coefficients élastiques. Pas de différence significative entre le fémur 1

et le fémur 2 pour les vitesses bar et les modules d’Young.

Propriétés Test Anova Vbar F1 = F2, F1 ≠ F3, F2 ≠ F3

Vbulk F1 ≠ F2 ≠ F3 (p < 0,01)

E33 F1=F2, F1 ≠ F3, F2 ≠ F3

C33 F1 ≠ F2 ≠ F3 (p < 0,01)

ρ F1 ≠ F2 ≠ F3 (p < 0,01)

Tableau 7 : Comparaison des propriétés acoustiques et mécaniques entre F1, F2 et F3

69

III - 2 Propriétés acoustiques des sections fémorales humaines (F2)

III - 2 - 1 Mesure de l’épaisseur des sections

La figure 9 représente la localisation des 12 points de mesures d’épaisseur réalisés en

périphérie de la section fémorale. Le tableau 8 résume les valeurs d’épaisseur moyennes des

différentes sections dont les distributions spatiales de vitesses seront représentées dans le

prochain paragraphe. La plus grande variation d’épaisseur trouvée est de l’ordre de 0,086mm

et correspond à la section 1 du fémur 2. Plus la variation d’épaisseur sera petite, meilleur sera

le parallélisme des faces de la section.

Figure 9 : Superposition de la cartographie de vitesse et de la cartographie d’épaisseur réalisée

sur la section 3 du F2.

Fémur N° de la section

Epaisseur (mm)

F1 1 1,289 ± 0,010

1 1,728 ± 0,054

2 1,934 ± 0,030

3 2,455 ± 0,027

F2

4 2,142 ± 0,026

Tableau 8 : Epaisseur moyenne avec écart type (SD) des sections issues de F1 et F2

2,210mm

2,129mm

2,132mm

2,131mm

2,128mm

2,153mm

2,135mm

2,144mm

2,105mm

2,131mm

2,141mm

2,170mm 0.041

0.009

0.000 0.023 0.009

70

III - 2 - 2 Capteurs plans

La précision des vitesses mesurées avec la technique par transmission en mode écho est de

137 m/s ; la reproductibilité est obtenue en refaisant l’expérience complète c'est-à-dire depuis

le début de l’expérience trois fois et est de l’ordre de 140 m/s.

La distribution spatiale des vitesses axiales obtenue avec des transducteurs plans à 5MHz et

10MHz est représentée figures 10 et 11.

Figure 10 : Cartographie de vitesse obtenue sur une section fémorale de F1 à 5 MHz

Figure 11 : Cartographie de vitesse obtenue sur une section fémorale de F1 à 10 MHz

Vitesse (m/s)

Vitesse (m/s)

71

La forme géométrique des sections fémorales n’est pas respectée avec des capteurs plans. Le

tableau 9 résume toutes les vitesses moyennes obtenues à 5 MHz et 10 MHz sur les

différentes sections appartenant à F1 et F2 ; chaque vitesse moyenne représente l’ensemble de

toutes les vitesses acquises à la surface de la section fémorale.

Fémurs Numéro de la

section

5MHz Vitesse_Plan

(m/s)

10MHz Vitesse_Plan

(m/s) F1 1 3750± 112 4002± 120

1 4401± 330 4468± 312

2 4185± 167 -

3 4295± 129 4223± 126

F2

4 4242± 144 4382± 149

Tableau 9 : Valeurs moyennes des vitesses avec écarts types (SD) obtenues pour des

transducteurs plans à 5 MHz et 10 MHz.

Les résultats des vitesses moyennes obtenues sur les sections fémorales du fémur F3 sont

inexploitables ; en effet ces sections étant très poreuses aucune représentation correcte de la

distribution spatiale de vitesses n’a pu être obtenue aussi bien avec un capteur plan que

focalisé aux fréquences de 5 MHz et 10 MHz.

72

Artéfacts

Vitesse (m/s)

III - 2 - 3 Capteurs focalisés

La distribution spatiale des vitesses moyennes obtenue à 5 MHz et 10 MHz est représentée

dans le tableau 10 ci-dessous.

Fémurs

Numéro de la

section

5MHz

Vitesse_Focalisée

(m/s)

10MHz

Vitesse_Focalisée

(m/s)

F1 1 3729± 112 3777± 113

1 4158± 291 4373± 328

2 4064± 203 4222± 211

3 4067± 122 4138± 124

F2

4 4147± 141 4320± 147

Tableau 10 : Valeurs moyennes des vitesses avec écarts types (SD) obtenues avec des

transducteurs focalisés à 5 MHz et 10 MHz. Les vitesses moyennes obtenues avec des capteurs plans (à 5MHz et 10MHz) sont supérieures

de 100m/s à 250m/s comparées à celles mesurées avec des capteurs focalisés.

L’utilisation de capteurs focalisés permet de respecter la forme géométrique des sections

fémorales et de faire une analyse plus fine en surface de la distribution des vitesses

longitudinales.

L’utilisation de capteur focalisé à 10 MHz a révélé la présence d’artéfacts en surface des

cartographies de vitesses figure 12.

Figure 12 : Distribution spatiale de vitesses de la section 3 obtenue avec

un capteur focalisé à 10 MHz

73

Vitesse (m/s)

L M

P

d)

M L

P

Vitesse (m/s)

Vitesse (m/s)

M L

P

L’emploi du capteur 5 MHz a permis de diminuer la présence de ces artéfacts ; ainsi il sera

présenté figure 13 les différentes distributions spatiales des vitesses de toutes les sections

fémorales appartenant au fémur F1 et F2.

a) b)

c)

e)

Figure 13 : Cartographies de vitesses des sections fémorales appartenant au F1 et F2 et obtenues avec un capteur focalisé à 5 MHz

a) section 1 F1 b) section 1 F2 c) section 2 F2 d) section 3 F2 e) section 4 F2

(cf. p.31)

Vitesse (m/s)

Vitesse (m/s)

M L

P

b)

74

L’analyse des propriétés acoustiques sur les sections fémorales se fera au moyen du

transducteur focalisé à 5 MHz ; en effet à cette fréquence les artéfacts ont diminué et les

valeurs moyennes des vitesses sont plus proches de la littérature (4000 m/s) que celles

obtenues à 10 MHz.

Toutes ces cartographies sont marquées par des carrés localisés dans les zones latérale (L),

médiale (M) et postérieure (P). Les propriétés acoustiques de ces zones précises seront par la

suite comparées aux propriétés morphologiques de ces mêmes zones.

Les cartographies de vitesses montrent des variations locales de vitesses qui seront

significatives uniquement si la distribution d’épaisseur est uniforme sur toute la section.

Ainsi, la variation d’épaisseur devra être considérée pour confirmer les variations

significatives de vitesses. Les variations significatives de vitesses sont représentées par un

changement de couleur. On dispose de 6 niveaux de couleurs différentes (bleu foncé, bleu

gris, vert, jaune, orange et rouge) espacées chacune d’un intervalle de 200m/s. Chaque

variation de couleur représente une variation significative de vitesses. La section 1 est une

exception car il faudra un changement de couleur équivalent à 2 franges (par exemple du bleu

au jaune) pour que la variation de vitesse soit significative, ceci étant dû à une trop grande

variation d’épaisseur (0,054mm). Une variation d’épaisseur de 0,05 mm et 0,03 mm entraîne

respectivement une variation de vitesse de 243 m/s et 175 m/s.

On observe sur ces distributions spatiales de vitesses des variations périphériques pour toutes

les sections.

Le côté postérieur présente de faibles vitesses qui varient entre 3400 m/s et 3800 m/s, soit une

variation de vitesse de 400 m/s (ou 11% de variation).

Les vitesses réparties sur le côté médial semblent être plus faibles que celles réparties sur le

côté latéral ; cette observation est uniquement significative pour la section 4. L’intervalle de

valeur des vitesses localisées sur les côtés latéral et médial est entre 4000-4200m/s, soit une

variation de 5%.

Une variation significative de vitesses est observée le long de la diaphyse, localisée entre 45%

et 60% de la longueur totale du fémur, au niveau du côté postérieur.

Une variation significative de vitesse dans la direction radiale apparaît ; en effet, les vitesses

augmentent de la partie endoste à la partie périoste (3800 m/s – 4200 m/s, soit une variation

de 11%).

75

Globalement les vitesses varient de 3400 m/s à 4200 m/s selon la localisation anatomique ;

cette différence de 800 m/s représente une variation de vitesse de l’ordre de 20%.

III - 3 Calibration

Les vitesses acoustiques des différents matériaux testés à haute et basse fréquences avec les

deux techniques par ultrason (en contact et en immersion) sont représentées tableaux 11et 12.

Les intervalles de valeurs des vitesses longitudinales qui se propagent à 5 MHz et 2,25 MHz

varient respectivement de 2327 m/s à 4710 m/s et de 2358 m/s à 4751 m/s. La vitesse

longitudinale qui se propage dans l’os cortical (4000 m/s) est incluse dans l’intervalle des

vitesses théoriques de ces matériaux. L’intervalle de valeurs des vitesses longitudinales qui se

propagent à 75 KHz est compris entre 2069 m/s et 4034 m/s.

Matériaux

(5x5x5mm)

Vitesses

longitudinales (m/s)

5MHz

Vitesses

théoriques (m/s)

Vitesses


2,25MHz

Cuivre 4710 ± 28

5010 4731 ± 23

Inox 6041 ± 41

5790

5674 ± 46

Plexi Glass 2720 ± 14 2680

2879 ± 24

PVC 2327 ± 12

- 2358 ± 8

Tableau 11 : Vitesses acoustiques (« bulk ») avec écarts types des échantillons utilisés pour

calibrer les deux techniques ultrasonores.

Matériaux

(5x5x5mm)

Vitesses


75KHz

Vitesses

théoriques (m/s)

Cuivre 3621

3750

Inox 4034

5000

Plexi Glass 2069

2160

PVC 2642

-

Tableau 12. Vitesses acoustiques (« bar ») des échantillons utilisés pour calibrer la technique

de transmission en contact.

76

III - 4 Propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical (F1, F2, F3) III - 4 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)

a) A l’échelle microscopique

Les valeurs des modules d’Young obtenues dans la direction longitudinale pour les lamelles

interstitielles sont pour le fémur 1(F1), fémur 2 (F2) et fémur 3 (F3) respectivement égales à

22 ± 2 GPa, 22 ± 3 GPa et 12 ± 3 GPa. Les valeurs des modules d’Young axiaux obtenues sur

des lamelles osseuses d’ostéons blancs sont de 19 ± 3 GPa (N = 138 indentations), 21 ± 3 GPa

(N = 51 indentations) et 10 ± 5 GPa (N = 22 indentations) pour les fémurs F1, F2 et F3. Les

valeurs sont significativement plus faibles pour le F3 comparées aux fémurs F1 et F2 (P <

0,001).

b) A l’échelle macroscopique

Les mêmes échantillons qui ont été testés en nanoindentation avaient précédemment été

soumis à la technique de transmission en contact avec des capteurs basses fréquences 75 KHz.

Les modules d’Young axiaux mesurés sur les échantillons de F1 (N=6), F2 (N= 6) et F3

(N=3) sont respectivement égaux à 21± 2 GPa, 20 ± 5 GPa et 10 ± 4 GPa. Si on augmente le

nombre d’échantillons avec ceux du fémur 3 précédemment testés, alors les propriétés

élastiques du fémur 3 sont significativement inférieures à celles mesurées sur F1 et F2.

La figure 14 illustre les propriétés élastiques des trois fémurs obtenues par deux différentes

techniques de mesure.

Figure 14 : Modules d’Young calculés sur des échantillons d’os cortical mesurés à l’échelle macroscopique (E_macro) et à l’échelle microscopique sur des lamelles interstitielles (E_LI (micro)) et sur des lamelles d’ostéons (E_OL (micro)) blancs pour les trois fémurs.

Elas

ticité

(GPa

)

0

5

10

15

20

25

30

E_macro E_LI (micro) E_OL (micro)

F1

F2 F3

77

III - 4 - 2 Etude des échantillons parallélépipédiques du fémur 2 (F2) Les variations intra lamellaires des modules d’Young E et dureté (H) sont calculées à partir

des écarts types obtenus lors des trois indentations exécutées sur une même lamelle osseuse.

Les valeurs sont résumées dans les tableaux 13 et 14. Aucune différence significative n’est

trouvée entre les trois types d’ostéons pour les modules d’Young (E) et dureté (H). Les

variations des propriétés élastiques (E) et mécaniques (H) au sein d’une même lamelle

osseuse sont respectivement E = 2,72 ± 1,74 GPa (avec un intervalle qui varie de 0,19 GPa à

8,48 GPa) et H = 0,11 ± 0,09 GPa (avec un intervalle qui varie de 0,01 GPa à 0,43 GPa),

dépendant du type d’ostéons testés.

E (GPa)

Ostéons Blancs (N=61)

E (GPa)

Ostéons Gris (N=17)

E (GPa)

Ostéons Noirs (N=39)

0,19 – 7,76 2,81

2,93 ± 1,83

0,93 – 5,93 2,42

2,69 ± 1,57

0,24 – 8,48 2,12

2,45 ± 1,70

Tableau 13 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) des

variations intra lamellaires des modules d’Young.

H (GPa)

Ostéons Blancs (N=61)

H (GPa)

Ostéons Gris (N=17)

H (GPa)

Ostéons Noirs (N=39)

0,02 – 0,43 0,11

0,15 ± 0,10

0,02 – 0,26 0,06

0,10 ± 0,08

0,01 – 0,31 0,05

0,09 ± 0,08


variations intra lamellaires de la dureté des lamelles osseuses.

Les variations des modules élastiques (E) et dureté (H) pour les différents ostéons sont

résumées dans les tableaux 15 et 16. Les propriétés élastiques et mécaniques des lamelles

osseuses d’ostéons blancs et gris sont dans la même gamme de valeurs mais significativement

(P < 0,001 et P < 0,05) supérieures aux lamelles d’ostéons noirs (figures 15 et 16). Les

lamelles d’ostéons blancs ont des modules d’Young et dureté qui sont significativement

supérieurs à ceux des ostéons gris (écart d’environ E = 2 GPa et H = 0,13 GPa, P<0,05) et

supérieurs à ceux des ostéons noirs (écart d’environ E = 8 GPa et H = 0,27 GPa, P<0,001). De

78

Eblc

Egris

Enoir

Box-and-Whisker Plot

7 11 15 19 23 27 31

response

Blanc

Gris

Noir

E (GPa)

* *

* *

*

plus, les propriétés élastiques (E) et mécaniques (H) des lamelles d’ostéons gris sont

supérieures à celles des ostéons noirs de E = 6 GPa et H = 0,14 GPa.

E (GPa) Osteons Blancs (N=61)

E (GPa) Osteons Gris (N=17)

E (GPa) Osteons Noirs (N=39)

13,87 – 27,06 21,59

21,30 ± 3

16,88 – 22,63 19,15

19,27 ± 1,78

7,04 – 17,59 13,33

12,95 ± 2,66


modules d’Young pour les différents ostéons

H (GPa) Osteons Blancs (N=61)

H (GPa) Osteons Gris (N=17)

H (GPa) Osteons Noirs (N=39)

0,26 – 0,85 0,56

0,55 ± 0,15

0,25 – 0,6 0,43

0,41 ± 0,09

0,09 – 0,52 0,29

0,30 ± 0,10

Tableau 16 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) de la

dureté pour les différents types d’ostéons .

Figure 15 : Intervalle de valeurs des modules Young pour différents types d’ostéons (**: P < 0,001 et *: P < 0,05).

79

Figure 16 : Intervalle de valeurs de la dureté pour différents types d’ostéons (**: P < 0.001 et *: P < 0.05).

III - 4 - 3 Calibration La calibration a été réalisée sur de la silice ; le module d’Young mesuré avec cette technique

de nanoindentation est de l’ordre 72,1 GPa ± 0,5 GPa. Cette valeur expérimentale est proche

de la valeur théorique de ce matériau qui est de 72 GPa. Le faible écart entre ces deux valeurs

théorique et expérimentale permet de valider les résultats mesurés par la technique de

nanoindentation

III - 4 - 4 Reproductibilité des mesures effectuées par la technique de nanoindentation La reproductibilité de la mesure du module Young ainsi que la dureté du matériau sont

effectuées sur trois ostéons en reproduisant trois fois le test de nanoindentation sur une même

lamelle épaisse située au centre de l’ostéon à trois jours d’intervalle.

Les valeurs de reproductibilité obtenues pour le module d’Young (∆E = 1,33 GPa) et la

dureté (∆H = 0,03 GPa) sont calculées à partir de l’écart type de la moyenne des propriétés

mécaniques pour les trois mesures et les trois jours.

Hblc

Hgris

Hnoir


0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

response

White

Grey

Dark

H (GPa)

* * *

* * *

* *

Blanc

Gris

Noir

80

III - 5 Propriétés morphologiques III - 5 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)

a) Paramètres morphologiques Les porosités des fémurs F2 et F3 ont été calculées avec deux logiciels différents (Patran et

Qwin) alors que la porosité du F1 est uniquement mesurée avec le logiciel QWin. Les

résultats sont dans la même gamme de valeurs et l’écart peut varier de 1% à 17%.

Les échantillons du fémur 1 (F1) prélevés au niveau de la diaphyse supérieure ont une

porosité comprise entre 4% et 10%. Les échantillons du fémur 2 (F2) prélevés entre 40% et

70% de la longueur totale du fémur ont un intervalle de porosité qui est plus large (7% - 45%)

que celui du fémur 1. Le fémur 3 (F3) qui avait une masse volumique très inférieure aux deux

autres fémurs contient des échantillons avec une porosité élevée (35% - 69%). Les tableaux

17, 18 et 19 résument les valeurs de porosité des différents échantillons appartenant à F1, F2

et F3.

Tableau 17 : Porosité du fémur F1 mesurée avec le logiciel Qwin

Tableau 18 : Résultats et comparaison des porosités du fémur F2 mesurées avec le logiciel Qwin et Patran

Tableau 19 : Résultats et comparaison des porosités du fémur F3 mesurées avec

le logiciel Qwin et Patran

Fémur 1 Numéro de l’échantillon

Porosité Qwin

1 4% 2 9% 3 7% 4 8% 5 13% 6 10%


Porosité Patran

Porosité Qwin

Ecart

1 5% 7% 2% 2 9% 11% 2% 3 38% 54% 16% 4 28% 45% 17%


Porosité Patran

Porosité Qwin

Ecart

1 66% 69% 3% 2 68% 72% 4% 3 62% 61% 1% 4 50% 52% 2% 5 63% 62% 1% 6 28% 35% 7%

81

Des reconstructions en trois dimensions de certains échantillons appartenant à F1, F2 et F3

permettent d’avoir une visualisation de la largeur des canaux de Havers. La figure18 illustre

des reconstructions 3D d’échantillons appartenant à F1, F2 et F3. Il apparaît que la largeur des

canaux de Havers augmente du fémur 1 au fémur 3.

F1 F2 F3

Figure 18 : Reconstruction longitudinale 3D des échantillons appartenant aux trois fémurs

Canaux de Havers

82

b) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques

Les valeurs des propriétés acoustiques et morphologiques mesurées sur les mêmes

échantillons cubiques et parallélépipédiques sont représentées figure 17

300032003400360038004000420044004600

0 20 40 60 80

porosité (%)

Vite

sse

(m/s

)

300032003400360038004000420044004600

0 20 40 60 80

Porosité (%)

Vite

sse

(m/s

)

Figure 17: Courbe de régression entre la vitesse (m/s) et la porosité (%) mesurée avec le

logiciel QWin (a) et Patran (b)

Les vitesses varient de 2512m/s à 4150m/s pour l’ensemble des échantillons et la porosité

mesurée par le logiciel QWin et Patran est respectivement comprise entre 4% et 72% et entre

5% et 68%. Les relations prédictives entre la porosité (%) (P), mesurée par deux logiciels

d’analyse d’images, et la vitesse (m/s) (V) ainsi que le coefficient de détermination sont :

V = 4214 e -0,0047 p , R2 = 0,79 N=16 (Logiciel Qwin) Equation 5 V = 5065 P -0,11 P ≠ 0 R2 = 0,67 N=16 (Logiciel Qwin) Equation 6 V = 4202 e -0,0051 p , R2 = 0,75 N=10 (Logiciel Patran) Equation 7 V = 5099 P -0,11 P ≠ 0 R2 = 0,57 N=10 (Logiciel Patran) Equation 8

a)

b)

83

Latéral

Postérieur

Latéral

Latéral Latéral

III - 5 - 2 Sections fémorales (F2)

a) Cartographie de la microarchitecture

Les quatre sections fémorales appartenant au fémur 2 et dont la distribution spatiale de vitesse

a été quantifiée précédemment sont représentées figure 19 sous la forme de cartographies

représentant leurs microarchitectures. Chaque cartographie est un assemblage d’environ 40

images acquises au microscope électronique à transmission.

Figure 19 : Représentation de la microarchitecture des section 1 (a), section 2 (b),

section 3 (c) et section 4 (d) du F2

Médial

Postérieur

Médial

Médial

Médial

Postérieur

Postérieur

a) b)

c) d)

84

b) Paramètres morphologiques

Les propriétés microstructurales tels le diamètre des pores et la porosité seront déterminées

sur des régions d’intérêts (carrés de 3mm de côté) similaires à celles disposées sur les

cartographies de vitesses. La précision de la technique de mesure du diamètre des pores est de

10µm. La reproductibilité des mesures de surfaces des pores et de la porosité est

respectivement de 4% (0,2% – 10%) et 0,011%.

Les valeurs des diamètres moyens de pores et porosité calculées sur les régions d’intérêts sont

résumées tableau 20 et tableau 21.

Fémur 2 Diamètres moyens des pores (µm)

Médial

Diamètres moyens des pores (µm)

Postérieur

Diamètres moyens des pores (µm)

Latéral

Section 1 62 ± 41

253 ± 243

47 ± 17

Section 2 60 ± 25

191 ± 168

59 ± 30

Section 3 64 ± 38

140 ± 51 54 ± 19

Section 4 83 ± 26 122 ± 81

83 ± 41

Tableau 20 : Taille moyenne avec écart type (SD) des pores en fonction de la localisation anatomique

Tableau 21 : Valeur de porosité en fonction de la localisation anatomique

Fémur 2 Porosité (%)

Médial

Porosité (%)

Postérieur

Porosité (%)

Latéral

Section 1 3,5%

47% 3,1%

Section 2 3,4%

40% 4,6%

Section 3 5%

20% 3,7%

Section 4 5% 15% 4,6%

85

Le nombre total de pores contenu dans les différentes régions d’intérêts peut varier de 41 à

132 pores, le nombre moyen de pores par région est d’environ 70 ± 23 pores.

Le diamètre moyen des pores du côté postérieur est significativement supérieur aux diamètres

des côtés latéral et médial (supériorité d’un facteur 2 pour les sections 1 à 3) (P < 0,01). La

taille des pores pour le côté postérieur varie entre 112 ± 51 µm et 253 ± 243 µm comparée

aux autres côtés dont l’intervalle de valeurs est compris entre 47 ± 17 µm et 83 ± 41 µm.

Les résultats de la porosité montrent une tendance similaire aux résultats des diamètres de

pores. En effet, l’intervalle de valeurs de la porosité pour le côté postérieur est supérieur

(9,7% - 47%) aux autres côtés (3,1% - 5%).

D’une manière générale, le diamètre des pores et la porosité varient en fonction de la

localisation anatomique, à savoir entre 47 µm et 253 µm pour le diamètre des pores et entre

3% et 47% pour la porosité.

c) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques

Les valeurs des propriétés acoustiques et microstructurales mesurées sur les mêmes régions

d’intérêts (latérale, médiale et postérieure) appartenant aux quatre sections fémorales sont

illustrées figures 20 et 21.

3300

3500

3700

3900

4100

4300

0 10 20 30 40 50

Porosité (%)

Vite

sse

(m/s

)

Figure 20 : courbe de régression entre la vitesse (m/s) et la porosité (%)

(N = 12, R2 = 0,89, p < 0,001)

86

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50

Porosité (%)

D(µ

m)

Figure 21 : Données regroupées de la porosité (%) et du diamètre moyen des pores D (µm)

Les intervalles de valeurs de la vitesse, porosité, et diamètre des pores varient respectivement

de 3500 m/s à 4200 m/s, 3,1% à 47% et de 47 µm à 253 µm. La variation de vitesse est moins

importante (facteur 1,2) que la porosité (facteur 14) et le diamètre des pores (facteur 5).

La relation prédictive entre la vitesse (m/s) (V) et la porosité (%) (P) ainsi que le coefficient

de détermination (r2) sont exprimés par l’équation suivante :

V = 4175 e -0,0038P R2 = 0,89 Equation 9

V= 4497 P-0,06 P≠0 R2 = 0,9 Equation 10

Les relations prédictives entre la vitesse et la porosité obtenues sur les sections fémorales et

sur les échantillons cubiques et parallélépipédiques sont du même ordre de grandeur. Ce

résultat prouve la fiabilité à la fois des deux différentes techniques ultrasonores et des

techniques d’analyse d’images utilisées pour déterminer les propriétés acoustiques et

morphologiques.

87

Chapitre III - Discussion

I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES ACOUSTIQUES, MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES

I - 1 Technique de transmission en contact

a) Comparaison des trois fémurs (F1, F2, F3)

L’intervalle de valeurs des propriétés mécaniques mesurées dans cette étude est supérieur

(aussi bien pour la valeur minimale que maximale) à celui présenté par d’autres études

(Ho Ba Tho et coll., 1991). Les tests statistiques ont montré des différences significatives

entre les masses volumiques, les vitesses « bulk » et les coefficients élastiques des

échantillons appartenant aux trois fémurs. Les échantillons du fémur 3 prélevés en basse

diaphyse présentent des propriétés acoustiques (vitesses « bar » et « bulk ») et mécaniques

(coefficients élastiques et modules d’Young) qui sont significativement inférieures à celles

des fémurs 1 et 2. Cependant, aucune différence significative n’a été trouvée entre les vitesses

« bar » et les modules d’Young du fémur 1 et du fémur 2. Ce dernier résultat démontre

l’influence du mode de propagation de l’onde ainsi que l’influence du milieu biologique qui

est traversé. En effet, le tissu osseux qui est souvent considéré comme un milieu homogène et

continu doit être vérifié.

Les vitesses « bar » et modules d’Young mesurés dans cette étude sont respectivement

inférieurs aux vitesses « bulk » et coefficients élastiques. Ce dernier résultat n’est pas

surprenant puisque le mode de propagation de l’onde est différent à haute et basse fréquences.

Les différences de valeurs obtenues avec les trois fémurs peuvent s’expliquer par des

variations significatives des propriétés acoustiques et mécaniques en fonction de la

localisation anatomique (Ho Ba Tho et coll., 1991). L’intervalle de valeurs des propriétés

mécaniques et acoustiques est lié à la localisation anatomique et à la personne même.

b) Variation spatiale

La technique de transmission en contact ne montre aucune différence significative entre les

vitesses « bulk » et coefficients élastiques pour les côtés latéral et médial, alors que le côté

88

postérieur présente des vitesses acoustiques et coefficients élastiques qui sont

significativement plus faibles. Cette dernière observation est en accord avec les résultats de

propriétés élastiques trouvés lors de précédentes études (Meunier et coll., 1988, Ashman et

coll., 1984, Weiss et coll., 1998, Ho Ba Tho et coll., 1991). Le côté postérieur est plus poreux

car relié à un environnement plus vascularisé. Ces résultats sont également en accord avec

l’étude de Ho Ba Tho et coll., 1991 qui a fait un atlas des propriétés mécaniques de l’os

cortical sur sept sujets humains.

I - 2 Technique de transmission en immersion (F2)

a) Variation spatiale

La distribution spatiale de vitesses obtenue sur les sections fémorales a également révélé des

vitesses acoustiques plus faibles du côté postérieur. De plus, on observe que ces variations

significatives de propriétés acoustiques varient en fonction de la longueur du fémur. Ce

résultat permet de confirmer l’observation qualitative de Weiss et coll., 1998 qui à travers une

cartographie d’impédance a trouvé le même phénomène au niveau du côté postérieur.

Ces résultats démontrent une variation de porosité côté postérieur qui varie avec la longueur

du fémur suggérant une influence locale et significative de la vascularisation.

La technique en immersion a l’avantage de pouvoir estimer la distribution spatiale de vitesses

localisées. Les vitesses obtenues côté latéral semblent être supérieures à celles côté médial

mais sans aucune différence significative. Des variations radiales de vitesses qui sont

significatives (∼ 200 m/s) sont également présentes sur la distribution spatiale de vitesse.

Les points rouges localisés dans la partie endoste des sections fémorales sont essentiellement

dus à des artéfacts qui ont des vitesses très élevées (4400 m/s). Ces valeurs non significatives

augmentent les vitesses moyennes des sections fémorales. Ces artéfacts sont reliés à des trous

qui sont en fait des pores à très grands diamètres situés dans la partie endoste. Ces trous sont

de plus en plus présents au fur et à mesure que la section se rapproche de la métaphyse (la

section est plus grande et l’épaisseur de l’os cortical diminue) et par conséquent contient plus

d’artéfacts tel que la section 4. Les artéfacts présentent des vitesses élevées alors qu’on aurait

dû s’attendre à des vitesses plus faibles. En fait, ceci est dû à un problème de traitement du

signal et notamment à la détection du deuxième écho. L’atténuation du deuxième écho

implique une détection au hasard du temps de propagation de l’onde qui se trouve proche du

89

premier écho. Par conséquent, le temps de propagation entre les deux échos est diminué, ce

qui implique une augmentation de la vitesse. Ces artéfacts démontrent que la technique

ultrasonore en transmission est sensible à la microarchitecture (taille des pores). En fait, ces

artéfacts seront dépendants du rapport entre la longueur d’onde et le diamètre du pore. Nous

avons trouvé expérimentalement que les diamètres des pores devaient être inférieurs de trois

fois la dimension de la longueur d’onde pour que les artéfacts soient évités.

I - 3 Comparaison des techniques de transmission en contact et en immersion (F2)

La calibration des deux techniques ultrasonores a montré que les vitesses expérimentales

obtenues sur les différents matériaux à hautes fréquences (2,25MHz et 5MHz) étaient du

même ordre de grandeur et proches des vitesses théoriques (∆V ∼ 25 m/s pour la technique en

contact et ∆V ∼ 24 m/s pour la technique ultrasonore en immersion). Cet écart de vitesse est

correct étant donné que la précision des deux techniques ultrasonores est de l’ordre de 100

m/s, sauf pour l’inox qui présente une vitesse supérieure (∼ 4%) avec la technique ultrasonore

en immersion.

La différence moyenne de vitesses obtenue pour les deux techniques est équivalente comparée

aux vitesses théoriques. Le cuivre présente pour les deux techniques ultrasonores une même

vitesse mais qui est inférieure (∼ 300 m/s ou 6%) à la vitesse théorique du cuivre ; ceci peut

être dû à la qualité du matériau qui peut être un alliage et non un matériau purement constitué

de cuivre.

Comparaison des propriétés acoustiques

Les vitesses « bulk » de propagation obtenues à travers les échantillons parallélépipédiques

sont du même ordre de grandeur que celles obtenues par la technique ultrasonore en

immersion. En effet, les échantillons parallélépipédiques prélevés du côté postérieur

présentent un intervalle de vitesses équivalent au côté postérieur des sections fémorales. La

comparaison des régions latérale et médiale indique une différence de vitesse qui est au plus

de 200 m/s (valeur moyenne 100 m/s) entre ces deux techniques.

De plus, la technique ultrasonore en immersion étant sensible au choix de la fréquence il était

indispensable de comparer ces valeurs avec une autre technique ultrasonore qui permet de

mesurer des vitesses absolues et propriétés élastiques tel que cela a été réalisé dans cette

étude.

90

D’une manière générale, les vitesses acquises avec la technique de transmission en contact

sont inférieures à celles mesurées par la technique en immersion.

La précision, la calibration et les résultats de vitesses obtenus par les deux techniques

ultrasonores permettent de conclure que les vitesses acquises avec des transducteurs focalisés,

en immersion ou en contact, sont du même ordre de grandeur.

De plus, la comparaison des vitesses entre ces deux techniques indique une même variation en

périphérie et le long du fémur.

L’intervalle de vitesses « bulk » (3400 m/s – 4200 m/s) obtenu par les deux techniques

expérimentales ultrasonores sont du même ordre de grandeur que celui mesuré in vivo sur des

os longs humains (Barkman et coll., 2000, Weiss et coll., 2000, Antich et coll., 1991). Par

contre, nos résultats ne sont pas dans la même gamme que ceux trouvés par Hasegawa et coll.,

1995 (3318 m/s – 3663 m/s) qui avait utilisé des biopsies osseuses de crête corticale. Cette

différence de données peut être liée aux échantillons utilisés qui ne sont pas localisés dans la

même région.

Comparaison des propriétés mécaniques La distribution spatiale de la masse volumique et des coefficients élastiques (C33) obtenue sur

les échantillons parallélépipédiques montre de faibles valeurs pour le côté postérieur avec une

augmentation de ces valeurs le long du fémur. Précédemment, la même observation sur les

sections fémorales a été obtenue pour la distribution de vitesses au niveau du côté postérieur.

Ce dernier résultat atteste de l’habilité de la technique ultrasonore en transmission à

déterminer des vitesses absolues même si un capteur focalisé est utilisé. D’après ces derniers

résultats il sera alors possible de calculer les coefficients élastiques des sections fémorales

localisées au niveau postérieur. En effet, la masse volumique des échantillons

parallélépipédiques au niveau postérieur étant connue il sera alors possible de déterminer très

localement sur les sections fémorales la distribution postérieure des coefficients élastiques.

Précisons que cet assemblage de données est possible uniquement du fait que les vitesses

obtenues avec les transducteurs focalisés et plans sont équivalentes. En principe les vitesses

acquises avec des transducteurs focalisés sont des vitesses relatives et ne doivent pas être

utilisées comme des vitesses absolues car la propagation du rayon est différente (Bensamoun

et coll., 2002).

L’avantage de cette technique ultrasonore en immersion est de pouvoir directement estimer la

distribution spatiale des propriétés élastiques comparées à d’autres études (Zimmerman et

coll., 1990). Précisons que cette mesure ne sera possible que dans une direction alors que la

91

technique ultrasonore en contact permet de déterminer l’anisotropie de l’échantillon dans les

trois directions. Les autres directions (pour les sections fémorales) n’ont pas pu être

examinées à cause de la difficulté de la découpe due à une géométrie complexe de la diaphyse

fémorale. De plus, le plan transverse est un plan intéressant puisqu’il permet de voir la

résorption osseuse qui est reliée au remodelage osseux (dû au processus de l’âge, contact

entre os et implant, etc…).

Pour résumer, ces deux techniques sont complémentaires, l’une permet d’observer la

distribution spatiale et l’autre de mesurer l’anisotropie locale.

I - 4 Corrélation des propriétés acoustiques et morphologiques

a) Echantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)

L’étude réalisée au micro scanner sur les échantillons cubiques et parallélépipédiques a

permis de confirmer que les échantillons utilisés pour les tests ultrasonores étaient

homogènes. La porosité des échantillons du fémur 3 étant comprise entre 35% et 72% les

propriétés mécaniques et acoustiques de ces échantillons sont beaucoup plus faibles que celles

des fémurs 1 et 2 qui ont des porosités plus faibles. Une relation étroite existe donc entre les

propriétés microstructurales et les propriétés acoustiques-mécaniques.

b) Sections fémorales (F2)

L’intervalle de porosité (3% - 47%) mesuré sur la distribution spatiale de la microarchitecture

est supérieur à la gamme de valeurs généralement trouvée dans la littérature. Ceci est

certainement dû à la localisation anatomique de la région à étudier. La valeur moyenne de

porosité trouvée dans la littérature est de 10% ; l’intervalle varie entre 2% et 32% (Currey et

coll., 1988, Martin et Ishida, 1989, Watcher et coll., 2001, Watcher et coll., 2002). Selon notre

revue bibliographique aucune valeur moyenne de taille des pores n’est disponible dans la

littérature pour comparer les valeurs des paramètres morphologiques.

Les variations significatives des diamètres de pores et porosité sont corrélées aux variations

de vitesses. Ceci démontre une relation significative entre les variations de propriétés

acoustiques avec celles de la microstructure. Cependant, l’ordre de variation n’est pas le

même.

92

Une variation radiale de vitesses acoustiques (de 3800 m/s à 4200 m/s) a été observée entre

les parties endoste et périoste. Cette variation de vitesse de l’ordre de 10% est due à une zone

plus vascularisée en endoste qui se traduit par une porosité plus importante.

La variation maximale de vitesse en périphérie est de l’ordre de 800 m/s (3400 m/s à 4200

m/s) soit de 20% ; cette variation de vitesse correspond à une variation du diamètre des pores

de l’ordre d’un facteur 5 (de 47µm à 253 µm) et à une variation de porosité de l’ordre d’un

facteur 15 (de 3,1% à 47%). On constate que les variations de vitesses sont plus faibles que

les variations des paramètres caractérisant la microstructure. Par exemple, l’augmentation de

vitesse (3400 m/s à 4000 m/s) du côté postérieur avec la longueur du fémur est fortement

corrélée à la porosité et aux diamètres des pores qui diminuent suivant la longueur du fémur.

Cette augmentation de vitesse est de l’ordre de 11% alors que la porosité diminue d’un facteur

3 (47% à 15%) et d’un facteur 2 (253 µm à 122 µm) pour le diamètre des pores.

Ces résultats sont importants pour la compréhension et l’interprétation des mesures

acoustiques in vivo (Hasegawa et coll., 1995, Antich et coll., 1993).

Notre étude montre que les vitesses mesurées in vivo correspondent à une porosité de 15%.

Cette corrélation entre les propriétés acoustiques et microstructurales a montré que pour de

faibles variations de vitesses il pouvait y avoir de grands changements au niveau de la

microstructure osseuse. Ensuite, il serait important de corréler ces modifications

microstructurales avec des os pathologiques.

Les sections fémorales utilisées dans cette étude ont été prélevées sur un seul fémur (F2).

L’intervalle de valeurs des vitesses acoustiques trouvées est du même ordre de grandeur que

l’atlas des propriétés mécaniques regroupant huit sujets cadavériques humains (Ho Ba Tho et

coll., 1991).

I - 5 Synthèse des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical

La technique ultrasonore en immersion a permis de caractériser la distribution spatiale de

vitesses avec une résolution de 500 µm. Cette technique permet d’avoir une distribution

spatiale des propriétés acoustiques et mécaniques qui sera beaucoup plus précise (par exemple

dans la direction radiale et périphérique). La technique ultrasonore en immersion doit prendre

en considération certains points techniques tel qu’un excellent parallélisme des faces afin

d’avoir la meilleure interprétation possible. De plus les hétérogénéités au niveau de la

microarchitecture doivent être prises en considération. Lorsque ces différents points seront

93

sous contrôle, une estimation quantitative de la distribution spatiale des propriétés élastiques

sera déduite des cartographies de vitesses acoustiques et de masses volumiques.

Les résultats des propriétés acoustiques et mécaniques trouvés au sein d’un même fémur

suggèrent l’importance des mesures suivant la localisation anatomique. En effet, la

diminution des propriétés acoustiques est liée à la détérioration des propriétés

morphologiques (augmentation de la porosité, formation de lacunes). Cependant, de grands

changements microstructuraux reflètent de faibles variations de vitesses, démontrant ainsi que

la vitesse n’est pas si sensible aux changements de la microstructure. Ces résultats permettront

aux cliniciens et chercheurs d’avoir une meilleure compréhension (avantage et limitation) de

l’utilisation de techniques ultrasonores pour l’estimation des propriétés matérielles et

structurelles de l’os cortical.

II PROPRIETES MECANIQUES DES LAMELLES OSSEUSES II - 1 Comparaison des résultats macroscopique et microscopique

Les valeurs des propriétés élastiques des lamelles interstitielles obtenues sur les échantillons

du fémur 2 et fémur 3 sont légèrement inférieures à celles trouvées dans la littérature

(E = 25 – 27 GPa) par d’autres auteurs Rho et coll., 1997 et Zysset et coll., 1999.

Les variations des propriétés élastiques mesurées à l’échelle macroscopique, avec la technique

de transmission en contact, pour les trois fémurs sont similaires aux mesures obtenues à

l’échelle microscopique. A l’échelle macroscopique, le volume des échantillons cubiques ou

parallélépipédiques étant considéré comme homogène (hypothèse d’un milieu continu pour la

propagation de l’onde) les mesures ultrasonores reflètent alors l’ensemble des propriétés

élastiques homogénéisées (c'est-à-dire les propriétés mécaniques des lamelles interstitielles et

des différents types d’ostéons).

Dans cette étude, une variation des propriétés élastiques de l’ordre de 40% (de 13,33 GPa à

21,59 GPa) entre les différents types d’ostéons appartenant au fémur 2 a traduit un processus

dynamique de remodelage osseux. Il est intéressant de remarquer que les variations mesurées

à l’échelle microscopique, sur le même échantillon, sont plus importantes que celles

enregistrées à l’échelle macroscopique (de 11% à 20%) (Ho Ba Tho et coll., 1991).

94

Cette caractérisation des propriétés élastiques aux échelles macroscopique et microscopique

permettra de mieux interpréter les résultats mesurés sur des échantillons cubiques ou

parallélépipédiques avec la technique de transmission en contact. En effet, les faibles valeurs

des propriétés élastiques d’os cortical mesurées à l’échelle macroscopique peuvent avoir deux

interprétations possibles. La première serait due à une altération des propriétés élastiques des

ostéons minéralisés qui serait liée à une importante porosité. La seconde pourrait être due à un

tissu osseux dense constitué principalement d’ostéons en processus de minéralisation.

La connaissance du milieu microscopique permettra également de modéliser de façon plus

correcte le comportement de l’os cortical à différentes échelles.

II - 2 Etude du fémur 2 Dans cette étude trois différentes catégories d’ostéons (blancs, gris et noirs) ont été

caractérisées par une analyse qualitative de leur niveau de gris. Ces différences de niveau de

gris ont été confirmées dans cette étude par des mesures quantitatives, les ostéons blancs étant

les plus minéralisés comparés aux ostéons noirs qui sont les moins minéralisés. En effet, les

valeurs des propriétés mécaniques diminuent avec le niveau de gris des ostéons. Ces résultats

sont en accord avec l’étude de Ascenzi et Bonucci, 1968 réalisée à l’échelle de l’ostéon et sur

n’importe quel type d’ostéon (I-II-III).

Nos données sont statistiquement significatives et fournissent un intervalle de valeurs des

propriétés élastiques qui pourront être utilisées comme valeurs de références pour les lamelles

d’ostéons plus ou moins minéralisées. L’intervalle de valeurs des modules d’élasticité (E) et

de dureté (H) obtenu pour les ostéons blancs et gris est dans la même gamme de valeurs que

celles publiées dans la littérature par Rho et coll., 1997, Rho et coll., 1998, Rho et coll., 1999,

Rho et coll., 2002 et Zysset et coll., 1999. Notons que dans la littérature, le degré de

minéralisation des ostéons n’était pas spécifié, contrairement à notre étude.

Les variations du module d’Young et de dureté calculées au sein de lamelles osseuses

présentant des variations de degrés de minéralisation sont respectivement de l’ordre de E =

2,72 ± 1,74 GPa (intervalle entre 0,19 GPa et 8,48 GPa) et H = 0,11 ± 0,09 GPa (intervalle

entre 0,01 GPa et 0,43 GPa). Ce résultat a démontré une hétérogénéité de la lamelle osseuse

suggérant une variation de l’orientation des fibres de collagène et une variation du degré de

minéralisation. Ce dernier résultat n’est pas en accord avec l’étude de Ascenzi et Bonucci,

95

1968 qui considère la lamelle osseuse comme étant homogène pour tous les types d’ostéons

(I, II, III).

Cette étude a permis de caractériser les propriétés mécaniques de différents types de lamelles

osseuses en processus de minéralisation. En effet, une base de données des propriétés

élastiques à l’échelle de la microstructure a été établie, reflétant ainsi le processus de

remodelage osseux.

96

97

PARTIE MUSCULAIRE

98

99

Chapitre I – Etude bibliographique

I LE TISSU MUSCULAIRE I - 1 Classification des différents types de muscles

I - 2 Organisation hiérarchique du muscle strié squelettique

I - 2 - 1 Les différents types de tissus conjonctifs

I - 2 - 2 Architecture des fibres musculaires

I - 2 - 3 Composants responsables de la contraction musculaire

I - 2 - 4 Composants sollicités lors de l’étirement musculaire d’une fibre

II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MECANIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE (SOLEUS DE RAT) II - 1 Modèle de Hill II - 2 Relations caractéristiques du tissu musculaire

II - 2 - 1 Relation Force – Longueur

II - 2 - 1 - 1 Caractérisation de la composante élastique parallèle à l’échelle macro et microscopique

a) Caractérisation de la CEP à l’échelle macroscopique

b) Caractérisation de la CEP à l’échelle microscopique

II - 2 - 1 - 2 Etude du filament intermédiaire : la desmine

II - 2 - 1 - 3 Isoforme de titine

II - 2 - 1 - 4 Influence de la SREC sur l’élasticité passive

II - 2 - 1 - 5 Influence des ponts faiblement attachés sur l’élasticité passive II - 2 - 2 Relation Tension – Extension

II - 2 - 2 - 2 Caractérisation de la composante élastique série (CES)

à l’échelle macro et microscopique II - 2 - 3 Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisations des propriétés mécaniques passives du tissu musculaire

100

III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MORPHOLOGIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE


III - 1 - 1 Microscope optique




101

Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques du tissu strié squelettique de soleus de rat

I MATERIELS

I - 1 Le modèle animal

II METHODES

II - 1 Analyse biochimique

II - 1 - 1 Analyse du contenu d’hydroxyproline

II - 1 - 2 Analyse des isoformes de titine à l’échelle du muscle

II - 1 - 3 Analyse des isoformes de titine à l’échelle de la fibre

II - 2 Techniques ergométriques

II - 2 - 1 A l’échelle du muscle

II - 2 - 1 - 1 Préparation des muscles isolés

II - 2 - 1- 1 Montage expérimental du muscle isolé

II - 2 - 2 A l’échelle de la fibre

II - 2 - 2 - 1 Protocole de pelage

II - 2 - 2 - 2 Montage expérimental de la fibre isolée

II - 3 Mesure de l’élasticité passive des muscles et fibres isolés

II - 3 - 1 Détermination du type de muscle et du type de fibre

II - 3 - 2 Tests mécaniques passifs

II - 3 - 2 - 1 Recherche de la longueur « slack » de la fibre et du muscle

II - 3 - 2 - 2 Le test d’étirement en rampe

II - 3 - 2 - 3 Le test de relaxation

II - 3 - 2 - 4 Le test de relaxation incrémental

II - 3 - 3 Analyse statistique

II - 4 Détermination des propriétés morphologiques du tissu strié squelettique



102

II - 4 - 2 - 1 Protocole de mesure

a) Etude histochimique

b) Protocole de découpe du muscle

c) Mesure des paramètres morphologiques

d) Validation de la méthode de mesure

III RESULTATS III - 1 Résultats de l’analyse biochimique

III - 1 - 1 Evolution du contenu de collagène et d’hydroxyproline en fonction de l’âge

III - 1 - 2 Isoformes et contenu de titine à l’échelle du muscle

III - 1 - 3 Electrophorèses de fibres musculaires

III - 2 Résultats des tests mécaniques

III - 2 - 1 Mesure des propriétés mécaniques passives du muscle

III - 2 - 2 - 1 Résultats de l’analyse statistique

III - 2 - 3 Mesure des propriétés mécaniques passives des fibres musculaires

III - 2 - 3 - 1 Résultats des tests mécaniques passifs

III - 2 - 3 - 2 Résultats de l’analyse statistique

III - 3 Résultats de l’analyse morphologique

III - 3 - 1 Diamètres des fibres en fonction de l’âge

III - 3 - 2 Evolution du type et du nombre de fibres en fonction de l’âge

a) Coupe ventrale

b) Evolution longitudinale

III - 3 - 3 Evolution des paramètres morphologiques en fonction de l’âge

a) Evolution de la surface du muscle

b) Evolution de la surface des différents types de fibres

103


I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES I - 1 l’échelle des fibres musculaires

a) comparaison des valeurs mécaniques avec la littérature

b) Comparaison des trois populations de rats

I - 2 l’échelle du muscle

I - 3 Comparaison des échelles macroscopique et microscopique

I - 4 Analyse morphologique

104

105

Chapitre I – Etude bibliographique

I LE TISSU MUSCULAIRE

Le squelette osseux est principalement recouvert par un tissu musculaire squelettique. Ces

muscles sont attachés aux os et peuvent être activés volontairement assurant ainsi la mobilité

du corps en se servant, comme de leviers, des os auxquels ils sont attachés.

I - 1 Classification des différents types de muscles Les muscles squelettiques jouent un rôle important dans le maintien de la posture et au niveau

de la stabilité des articulations.

Le muscle est un organe doué de contractilité qui permet les mouvements chez l’Homme et chez les animaux. Les muscles

représentent 43% du poids corporel total de l’adulte et contiennent 79% d’eau et 7,5% de lipides.

Les muscles du corps humain sont répartis en deux types de muscles : les muscles striés et lisses. Il existe trois types de tissu

musculaire : le tissu strié squelettique (e.g. quadriceps, soleus) et cardiaque (cœur) qui correspondent aux muscles striés et le

tissu musculaire lisse (e.g. paroi des veines, des artérioles) qui correspond au muscle lisse.

I - 2 Organisation hiérarchique du muscle strié squelettique

Figure 1 : Représentation du système muscle – os – tendon (Tortora et Grabowski, 2001)

106

I - 2 - 1 Les différents types de tissus conjonctifs

Dans un muscle intact, les fibres (ou cellules) musculaires sont entourées de différentes

couches de tissu conjonctif. Chaque fibre se trouve à l’intérieur d’une fine gaine de tissu

conjonctif appelée endomysium. Plusieurs fibres et leur endomysium sont placés côte à côte

et forment un ensemble nommé faisceau ; chaque faisceau est à son tour délimité par une

gaine plus épaisse de tissu conjonctif, le périmysium. Les faisceaux sont regroupés dans un

revêtement composé de tissu conjonctif nommé l’épimysium qui enveloppe l’ensemble du

muscle. Toutes ces gaines de tissu conjonctif organisées parallèlement au réseau contractile

vont participer à la production de force passive du muscle, soutenir chaque cellule et renforcer

l’ensemble du muscle qui procure au tissu musculaire son élasticité naturelle.

D’autres structures tels les tendons, l’aponévrose sont des structures en série avec le réseau

contractile et ont pour rôle majeur la transmission de la force contractile.

I - 2 - 2 Architecture des fibres musculaires

On distingue deux grands types de fibres : les fibres lentes (type I) et les fibres rapides (type

II). On peut ainsi définir des muscles dit lents (riches en fibres de type I) comme le soleus du

rat, des muscles rapides (riches en fibres de type II) comme l’EDL (extensor digitorum longus

du rat) et des muscles mixtes comme le quadriceps femoris ou le biceps brachii de l’Homme.

Les fibres lentes I ont une vitesse de contraction lente et une résistance à la fatigue très élevée.

Les fibres rapides II sont également composées de types IIa, IIb, IIc, etc… Les fibres IIa ont

une vitesse de contraction rapide et sont peu fatigables. Les fibres de type IIb sont à

contraction rapides et fatigables. Les fibres de type IIc sont qualifiées d’intermédiaires.

La cellule musculaire est une fibre (figure 2) dont le diamètre varie en moyenne de 10 à

100µm et dont la longueur peut atteindre 20cm. La fibre musculaire est limitée par une

membrane cellulaire appelée le sarcolemme ; elle renferme plusieurs centaines de myofibrilles

(diamètre ≈ 1µm) dont chacune se divise en compartiments de 2,5µm environ, délimités

chacun par deux disques Z et appelés sarcomères.

Selon la taille de la fibre chaque cellule peut posséder des centaines ou des milliers de

myofibrilles, qui constituent environ 80% de son volume.

107

Les myofibrilles sont entourées par le sarcoplasme (cytoplasme) qui contient plusieurs

noyaux cellulaires, des mitochondries, des lysosomes, des inclusions de glycogènes, etc.

Figure 2 : Composition d’une fibre musculaire (a) (Bodem et coll., 2002) avec la structure du

filament fin (b) (actine) et épais (c) (myosine) (Silbernagl et Despopoulos, 1999).

Au microscope, les sarcomères d’une myofibrille apparaissent comme une succession de

bandes alternativement claires et sombres (d’où le nom de muscle strié). Cette alternance de

bandes claires et sombres provient de la disposition des filaments (épais) de myosine et (fins)

d’actine.

Muscle

Fibres

Fibre isolée

Filament de myosine

Ponts d’union Filament d’actine

Bande A

Sarcomère

Bande A Ligne Z Bande

I Zone H

a)

Actine Tropomyosine

Troponine

b)

Méromyosine légère

Méromyosine lourde

c)

108

Titine Actine Myosine

I - 2 - 3 Composants responsables de la contraction musculaire

La contraction musculaire est provoquée par la formation de ponts d’union entre les têtes de

myosine et les filaments fins d’actine (figure 3); la formation de ces ponts va entraîner le

glissement des filaments fins par rapport aux filaments épais (théorie des filaments glissants)

pour finalement conduire au raccourcissement du sarcomère et à la contraction musculaire.

Figure 3 : Illustration du phénomène de contraction musculaire (Silbernagl et Despopoulos, 1999)

I - 2 - 4 Composants sollicités lors de l’étirement musculaire d’une fibre

L’étirement musculaire, à l’échelle microscopique est principalement dû à un troisième

filament appelé titine ou connectine.

Figure 4 : Représentation du filament de titine en rouge (« Protein of the year », Science)

Il sera abordé plus loin dans ce chapitre le rôle de la titine dans l’élasticité passive en

corrélation avec ses composantes structurales.

La titine est une protéine dite « géante » car sa masse moléculaire est largement supérieure

aux autres filaments myofibrillaires et varie en fonction du type de muscles : 2993 kDa pour

le muscle cardiaque et 3700 kDa pour le muscle soleus humain (Labeit et Kolmerer 1995,

Labeit et coll. 1997, Maruyama 1997). Ce filament relie les deux bandes Z et vient

longitudinalement s’attacher au filament de myosine auquel il sert de maintien structural lors

de la contraction musculaire (Horowits et Podolsky 1988).

La titine est composée de domaines extensibles localisés dans la bande I et inextensibles

localisés dans la bande A (figure 5).

Actine

Tête de myosine

109

Figure 5 : Représentation des différents domaines de la molécule de titine de soleus humain (Labeit et coll., 1997)

Le segment de titine localisé dans la bande I est tout d’abord constitué de domaines Ig

(immunoglobuline) suivis d’un inter-domaine nommé N2-A (composé de 4 domaines Ig et

une séquence de 106 résidus d’acides aminés). Ensuite présence d’un domaine PEVK (P :

Proline, E : glutamate, V : Valine, K : lysine) constitué de 2174 résidus d’acides aminés, suivi

d’un autre domaine composé de type Ig (Labeit et Kolmerer, 1995). Le segment de titine localisé dans la bande A est formé par la répétition de domaines de type fibronectine (FN3) et de

domaines de type Ig.

La titine possède des sites de fixation au niveau de la strie Z constituée de protéines

myofibrillaires tel que l’α actinine et la téléthonine et des sites de fixation dans la bande M

pour des protéines telles que myomésine et la protéine M (Gregorio et coll., 1999)

Le filament de desmine (figure 6) (poids moléculaire 52 kDa) est un filament intermédiaire

qui est organisé parallèlement aux sarcomères et qui s’attache aux extrémités des bandes Z.

La desmine possède également des propriétés élastiques pour des longueurs de sarcomères

supérieures à 4,5µm (Wang et coll., 1993). La desmine a aussi un rôle structural dans le

maintien des sarcomères s’ils subissent des détériorations (Wang et Ramirez-Mitchell, 1983).

Figure 6 : Représentation du filament de desmine (Anderson, 2000)

110

II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES

MECANIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE (SOLEUS DE RAT)

II - 1 Modèle de Hill

Un modèle musculaire a été présenté par Hill en 1938 puis modifié par la suite et schématisé

par Shorten (1987). Ainsi le muscle a été assimilé à un modèle à trois composantes : une

composante purement contractile (CC), une composante élastique parallèle (CEP) et une

composante élastique série (CES) (figure 7).

La composante contractile CC est localisée au niveau du sarcomère et est composée :

1) d’un générateur de force qui correspond à la production de force par les ponts actine-

myosine et 2) d’un amortisseur qui traduit le comportement visqueux de la CC illustré par la

relation force-vitesse.

La composante élastique série CES est l’élément de transmission de la force contractile.

Elle est composée d’une partie passive associée aux structures tendineuses et d’une partie

active localisée au niveau des ponts actine-myosine.

La composante élastique parallèle CEP englobe tous les tissus conjonctifs qui entourent le

muscle : tissu conjonctif, sarcolemme. Elle correspond également à l’interaction résiduelle

entre les protéines d’actine et de myosine lorsque le muscle est au repos. La CEP est

également présente au niveau des protéines de connexion tel que la titine.

Ce modèle est encore le plus utilisé pour caractériser les composantes contractile et élastique

du muscle.

Une attention particulière sera attribuée à la CEP puisqu’elle caractérise les propriétés

élastiques du muscle à l’état passif. En effet, l’objectif de ce travail de thèse est de déterminer

l’élasticité passive du muscle et de la fibre isolée.

Figure 7 : Modèle musculaire à trois composantes

Composante contractile

CC

CEPComposante élastique parallèleTissu conjonctif, sarcolemme

TendonsTissu conjonctif

Composante élastique sérieCES

Pontsmyofibrilles

Active PassiveEtat actif

Etat passif

tendon

Composante contractileCC




Pontsmyofibrilles


Etat passif

tendon





Pontsmyofibrilles


Etat passif

tendon





Pontsmyofibrilles


Etat passif

tendon




Pontsmyofibrilles

Active Passive



Pontsmyofibrilles


Etat passif

tendon GF

111

Longueur

Force

II - 2 Relations caractéristiques du tissu musculaire

II – 2 - 1 Relation Force - Longueur

II - 2 - 1 - 1 Caractérisation de la composante élastique parallèle (CEP) à l’échelle macro et microscopique

La composante élastique parallèle est caractérisée par la relation force – longueur obtenue par

différents protocoles expérimentaux qui sont : les tests de traction à vitesse quasi-statique et

variable, les test de relaxation.

a) Caractérisation de la CEP à l’échelle macroscopique

Le muscle isolé subit des étirements en rampe avec des vitesses quasi statiques (figure 10)

à partir de sa longueur « slack » (Ls) (longueur du muscle pour lequel il développe une force

minimale). Au delà de cette longueur, les composantes structurelles qui interviennent sont les

substances collagéniques qui constituent les différentes couches du tissu conjonctif (type I :

épimysium, types I et III : périmysium et endomésium, types IV et V : sarcolemme) (Kovanen

et coll., 1984).Une relation force – longueur peut alors être enregistrée. Une augmentation

non linéaire de la force (figure 10) en fonction de l’étirement permet de caractériser le muscle

comme ayant des propriétés mécaniques non Hookéennes ; la force augmente de façon

exponentielle en fonction de la longueur. De plus, ce test d’étirement – relâchement permet de

montrer le comportement viscoélastique du muscle (figure 11) qui se traduit par un

phénomène d’hystérésis assez important lorsque la vitesse d’étirement est rapide comparée à

une faible vitesse d’étirement (figure 10).

Figure 10 : Relation force - longueur Figure 11 : Etirement du muscle à vitesse rapide (Goubel et Lensel-Corbeil, 1998) (Goubel et Lensel-Corbeil, 1998)

Les travaux de Kovanen et coll., 1980 et Laurent et coll., 1978 ont permis de montrer que la

compliance (mesure inverse de la pente dans la relation force – longueur) des muscles lents

était inférieure à celle des muscles rapides. Ceci est dû à la composition du muscle puisque les

Longueur

Force

112

-50 0 50 100 150 200 250 3000

200

400

600

800

1000

Temps (s)

Tens

ion

pass

ive

(mN

)

Longueur

CEP

CC

Courbe globale Fmax

L0

muscles lents ont beaucoup plus de collagène que les muscles rapides. Des études menées

(Kovanen et coll., 1984) sur des muscles lathyriques (muscles dépourvus de collagène) ont

également montré l’influence du collagène dans le développement de forces élastiques

passives.

Le muscle isolé est soumis à un test de relaxation (figure 13) à partir de sa longueur

« slack » (Ls). Le muscle subit un ou plusieurs (test cyclique) étirements maintenus pendant

un certain temps avec une vitesse variable. La force passive développée par le muscle dépend

de l’amplitude et de la vitesse d’étirement. Le comportement viscoélastique du muscle est

encore mis en évidence par une décroissance exponentielle de la force au cours du test. Ces

tests mécaniques permettent de solliciter le muscle en condition dynamique et statique afin de

mieux comprendre et interpréter les différentes composantes structurales qui entrent en jeu.

Figure 12 : Tension passive développée par des muscles soleus (sains et sans desmine) de souris soumis à un test de relaxation (Anderson et coll., 2002).

La relation force - longueur à l’échelle de l’organe est donc une association de la composante

contractile avec la composante élastique parallèle figure 14.

Figure 13 : Représentation de la relation force – longueur développée par le muscle (Goubel et Lensel-Corbeil, 1998)

113

Longueur de sarcomère (µm) 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3

0

0,4

0,8

1,2

Elas

ticité

(MN

m-2

)

b) Caractérisation de la CEP à l’échelle microscopique

Les tests mécaniques passifs utilisés à l’échelle macroscopique (muscle) sont également

applicables à l’échelle microscopique (fibre) afin de définir les éléments structuraux

responsables de l’élasticité passive.

En effet, la fibre isolée peut subir des étirements en rampe avec des vitesses variables

(figure 14) démontrant le comportement viscoélastique de la fibre musculaire.

Figure 14 : Illustration du comportement viscoélastique de fibre de spoas suite à différents tests d’étirement / relâchement (Granzier et Wang, 1993).

Ainsi des tests d’étirements cycliques effectués par Wang et coll., 1991 et 1993 sur fibres

isolées ont montré que l’élasticité résultait d’une association entre la matrice exosarcomérique

et endosarcomérique ; la matrice exosarcomérique concerne le réseau des filaments

intermédiaires qui enveloppe et interconnecte les sarcomères ; la matrice endosarcométrique

comprend à la fois des filaments extensibles tels que la titine qui relie la ligne Z et M et des

filaments inextensibles tels que la nébuline.

L’utilisation d’anticorps RT13 a permis de caractériser les zones spécifiques du filament de

titine qui étaient sollicitées pour de petits et grands étirements. L’étirement de la molécule de

titine ainsi que la relation tension passive - longueur de sarcomère est représentée figure 15.

titine actine

myosine

Longueur du sarcomère (µm)

Tens

ion

Figure 15 : Représentation des différentes phases de la relation tension passive - longueur de sarcomère en fonction de l’étirement de la molécule de titine. (Wang et coll., 1991).

114

Cette courbe est divisée en quatre parties :

Phase I : la fibre est étirée à une longueur SL0 « SL : slack length » qui correspond à sa

longueur de sarcomère au repos. A cet étirement les domaines Ig compris dans la

bande I restent repliés sur eux mêmes. La force développée est alors quasi nulle.

Phase II : A partir d’une longueur caractéristique (SLe), les domaines Ig du filament de titine

commencent à se déployer pour de faibles étirements alors que le domaine PEVK se

déplie pour des étirements plus importants. L’association de ces polypeptides va

générer une force qui augmente de façon exponentielle avec l’étirement.

Phase III : Pour de grands étirements, le point Sly « Slack length yield » (point de rupture)

correspond à l’élongation maximale que peuvent supporter les domaines

extensibles de la bande I. Le relâchement de la fibre avant ce point implique un

retour de celle-ci à son état initial.

Phase IV : Au delà du point SLy, c’est à dire pour de grands étirements il y a recrutement

d’une partie du filament inextensible de titine relié à la myosine qui est situé dans

la bande A ; ceci produit des changements structuraux irréversibles au sein de la

titine ainsi qu’une désorganisation du sarcomère.

115

II - 2 - 1 - 2 Etude du filament intermédiaire : la desmine

Les travaux de Salviati et coll., 1990, Wang et coll., 1993, Granzier et coll., 2000 ont consisté

à étudier les propriétés physiologiques et ultra structurelles de fibres pelées de lapin. La

technique a consisté à extraire par étape les filaments supposés responsables de l’élasticité

passive (figure 16). Cette étude a permis de mettre en évidence d’une part l’implication des

filaments intermédiaires (desmine) dans le développement de force passive et d’autre part la

structure viscoélastique des filaments responsables de l’élasticité passive.

Figure 16 : Relation tension passive/longueur réalisée sur fibre pelée avant (A) et après

extraction de iodure de potassium (B) (Wang et coll., 1993)

Ainsi pour de faibles longueurs de sarcomère (jusqu’à 4,5µm) c’est la matrice

endosarcométrique (filament de titine) qui est responsable de la force développée alors que

pour de grands étirements (longueur de sarcomères supérieure à 4,5µm) c’est la matrice

exosarcométrique (filament intermédiaire : la desmine) qui intervient pour générer des forces

passives.

Une récente étude (Anderson et coll., 2002) menée sur des souris dépourvues du filament de

desmine a montré d’une part que l’absence de desmine n’induisait pas une adaptation des

protéines de titine et a montré d’autre part une augmentation significative de la raideur du

muscle. Cette augmentation n’étant pas liée à une modification de la titine, il est émis comme

hypothèse qu’une adaptation d’autres structures s’est produite.

0

0

10

20

10

20

30

SLy

SLo

A

B

KI extracted

2 3 4 5 6Longueur sarcomère (µm)

116

II - 2 - 1 - 3 Isoforme de titine

Les travaux de Wang et coll., 1991 ont montré que l’élasticité passive était dépendante des

isoformes de titine. Ainsi six muscles squelettiques différents de lapin qui expriment à eux

tous trois tailles d’isoformes de titine ont été utilisés. Les fibres isolées extraites de ces mêmes

muscles ont développé des forces plus faibles pour des isoformes de titine à haut poids

moléculaire comparées à de faibles poids moléculaires. L’isoforme cardiaque qui a le plus

petit poids moléculaire développe des forces passives importantes comparées aux fibres

squelettiques qui ont des isoformes de hauts poids moléculaires.

De plus une forte corrélation a été trouvée entre deux paramètres indépendants SLe et SLy et

la taille des isoformes de titine. Pour des isoformes de titine à haut poids moléculaire, les

longueurs caractéristiques SLe et SLy des sarcomères sont plus élevées.

Toutes ces données indiquent que les caractéristiques élastiques des muscles sont liées aux

différentes isoformes de titine.

II - 2 - 1 - 4 Influence de la SREC sur l’élasticité passive

Les travaux de Haugen et Sten-Knudsen 1981 menés sur des fibres intactes d’amphibiens ont

montré que lorsque des étirements en rampe étaient effectués avec de faibles amplitudes la

réponse de la fibre était biphasique : une première phase avec une raideur importante

comparée à une deuxième phase qui contient une raideur plus faible alors que l’étirement se

poursuit. Pour de grandes amplitudes d’étirements, le recouvrement des filaments d’actine et

de myosine diminue impliquant une diminution de l’effet SREC « Short Range Elastic

Component » qui correspond à un petit nombre de ponts attachés, dans un état d’équilibre,

entre l’actine et la myosine.

La raideur passive mesurée via les différents tests mécaniques (figure 17) serait alors

constituée d’une raideur initiale due au phénomène SREC.

117

Figure 17 : Réponse d’une fibre d’amphibien suite à un étirement lent, imposé à partir de 6

longueurs de muscles différents (Haugen et Sten-Knudsen 1981).

Le même phénomène est observé à l’échelle macroscopique (muscle entier).

Cependant les travaux de Bagni et coll., 1995 n’ont constaté aucune présence du phénomène

SREC sur des fibres pelées d’amphibiens. Ces résultats restent encore inexpliqués, Bagni et

coll. ont conclu que le petit nombre de ponts entre l’actine et la myosine était négligeable

comparé au rôle de la titine dans l’élasticité passive.

II - 2 - 1 - 6 Influence des ponts faiblement attachés sur l’élasticité passive

Certains travaux ont démontré que les ponts entre actine et myosine n’étaient pas dans un état

d’équilibre stable mais en équilibre rapide entre attachement et détachement. Cependant

certaines études (Bagni et coll. 1992, Mutungi et Ranatunga 1996) ont montré une

incompatibilité temporelle entre la fréquence des cycles attachement-détachement et les temps

de relaxation. Il fut conclu que la présence de ces ponts ne pouvait pas être remise en question

mais la contribution de ces ponts à la génération de force passive devra être considérée

comme négligeable.

20µN3,56µN3,43µN3,28µN3,13µN2,68µN2,38µN

50ms

66µm

118

II - 2 - 2 Relation Tension – Extension

II - 2 - 2 - 2 Caractérisation de la composante élastique série (CES) à

l’échelle macro et microscopique

La composante élastique série est caractérisée par une courbe tension – détente obtenue

lorsque le muscle ou la fibre sont maintenus dans des conditions isométriques maximales.

La fibre subit des détentes rapides, ceci induit des variations de longueurs importantes qui ont

pour conséquence des chutes brutales de tension.

La relation tension – détente obtenue (figure 18) a été caractérisée en trois phases par Huxley

et Simmons 1971 qui ont corrélé les différentes phases de la relation tension/détente avec les

caractéristiques de la méromyosine lourde. La phase de détente rapide T1 est caractérisée par

l’élément élastique S2 qui se détend instantanément et la phase de réétirement T2 est

caractérisée par la rotation de la tête de myosine S1 qui va réétirer le segment S2.

Variation de tension Amplitude de détente Rotation de la tête de myosine

Figure 18 : Schématisation des différents phénomènes qui interviennent lorsque la fibre subit une détente rapide (Ford et coll., 1977 et Huxley et coll., 1971)

Plusieurs études (Kawai et Schachat 1984) ont montré que la CES présentait des propriétés

élastiques différentes selon le type de fibres. Les travaux de Toursel (1999) ont examiné la

relation structure - fonction des éléments contractiles appartenant aux fibres musculaires.

Cette étude a montré que les transformations des isoformes de myosine s’accompagnaient

d’une modification des caractéristiques élastiques.

Les résultats obtenus à l’échelle microscopique sont extrapolables à l’échelle macroscopique.

Le complexe muscle-tendon de soleus de rat est caractérisé comme ayant une CES plus raide

qu’un muscle rapide (Wells 1965). De plus, la CES est capable de modifier ses propriétés

élastiques selon les contraintes qui lui sont appliquées (Almeida-Silveira et coll., 2000).

a)

Temps T0 T2 T1

1

2 3

c)

b)

119

II - 2 - 3 Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisation des propriétés

mécaniques passives du tissu musculaire

Les différents tests mécaniques exécutés à l’échelle de l’organe et de la fibre ont permis de

conclure que :

A l’échelle macroscopique les propriétés mécaniques passives du muscle ont fortement été

corrélées avec la composition intramusculaire du collagène. Les études de Kovanen et coll.,

1984 ont montré que les muscles lents (forte concentration de collagène) avaient des

contraintes à la rupture plus importantes que les muscles rapides. Des modèles lathyriques

(Kovanen et coll., 1984) qui ont une perte de collagène montrent une diminution de la

résistance du muscle lorsque des étirements sont exécutés. Tous ces résultats visent à conclure

que les propriétés mécaniques passives du muscle à l’échelle macroscopique sont dépendantes

du contenu de collagène.

A l’échelle microscopique les propriétés mécaniques passives des fibres isolées sont

dépendantes du filament de titine et de ses isoformes (Horowitz et Podolsky, 1986) pour de

petites longueurs de sarcomères et du filament de desmine pour de grandes longueurs de

sarcomères (Salviati et coll., 1990).

120

III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES

MORPHOLOGIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE


Les paramètres morphologiques sont mesurés sur des coupes musculaires découpées au

microtome (épaisseur de l’ordre de 10µm) et prélevées au centre du muscle. Ensuite des

colorations de la myosine ATPase permettent de mettre en évidence certaines catégories de

fibres. Ce protocole expérimental est toujours utilisé pour préparer les coupes musculaires

afin de déterminer des propriétés morphologiques et autres.

III - 1 - 1 Microscope optique

L’acquisition d’une aire représentative de la section musculaire sous microscope optique

permet de mesurer les paramètres morphologiques. Plusieurs études (Polgar et coll., 1973

Halkjaer-Kristensen et Ingemann-Hansen, 1981) prennent des régions qui contiennent en

moyenne 200 fibres pour représenter la section entière du muscle qui contient environ 3000

fibres. Dans les années 80 l’acquisition des images sous microscope optique était faite au

moyen de photographies.


De nombreux logiciels d’analyse morphologique (Summagraphics 10, USA ; Haff 315, Leica)

permettent de mesurer les propriétés morphologiques du muscle


Les paramètres morphologiques les plus souvent mesurés dans la littérature sont :

- L’aire moyenne des fibres dites lentes (type I)

- L’aire moyenne des fibres dites rapides (type II)

- La surface totale de la coupe musculaire

De nombreuses études (Larson et coll., 1978 ; Tsuneko et coll., 1984) se sont intéressées à

l’évolution de l’aire des fibres lentes et rapides suivant l’âge. Ces travaux ont montré pour le

121

muscle pectoral mineur que l’aire des fibres lentes (type I) augmente après 60 ans alors que

l’aire des fibres rapides diminue après 40 ans. La répartition de l’aire des fibres en fonction de

la localisation anatomique a notamment été analysée par les travaux de Punkt et coll., 1998.


L’étude bibliographique a principalement développé les techniques mécaniques passives

permettant de déterminer les propriétés mécaniques passives du muscle et fibre isolés. De

plus, une revue bibliographique a présenté les différents composants structurels, à l’échelle du

muscle et de la fibre, qui sont responsables de l’élasticité passive. Ainsi le deuxième chapitre

présentera les différentes techniques mécaniques utilisées sur le muscle et sur la fibre isolés

afin de mesurer le module d’Young et les contraintes dynamiques et statiques. Les éléments

structuraux tel que le collagène et la titine seront analysés afin d’expliquer certains

phénomènes mécaniques.

Les propriétés morphologiques seront déterminées sur des coupes entières de muscles soleus

comparé à la littérature qui généralement se limite à l’analyse de 200 fibres.

122

123

Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques du tissu strié squelettique de soleus de rat

I MATERIELS

I - 1 Le modèle animal

L’objectif de cette étude est d’analyser l’évolution des propriétés mécaniques passives des

muscles et fibres striés squelettiques en fonction de l’âge. Le paramètre « âge » a été choisi

dans le but d’obtenir des propriétés morphologiques différentes. Ainsi, des rats mâles Wistar

âgés de 1mois (poids : 104 ± 4g), 4 mois (poids : 395 ± 8g) et 12 mois (poids : 631 ± 46g)

seront utilisés. Ce modèle animal est basé sur l’étude de Kovanen et Suominen, 1987 qui

étudie les propriétés élastiques passives en fonction de l’âge. Les trois populations de rats

seront notées R1, R4 et R12 correspondant respectivement aux rats âgés de 1, 4 et 12 mois.

Les rats de 1 mois proviennent d’une même portée et ont été élevés dans une animalerie située

à l’Université de Compiègne. Les rats de 4 mois ont été achetés à la société Harlan. Les rats

de 12 mois ont été achetés à la société Janvier à l’âge de 6 mois puis élevés au sein de notre

animalerie. Les rats sont placés dans une animalerie qui est éclairée 12 heures sur 24 heures et

où la température est maintenue constante. Des cages (42x42x18cm) abritent environ 3 rats de

même âge ne subissant aucune activité physique et la nourriture (Teklab 18% de protéine,

Harlan) ainsi que l’eau est accessible à volonté.

II METHODES

II - 1 Analyse biochimique

II - 1 - 1 Analyse du contenu d’hydroxyproline

Les muscles congelés dans l’azote liquide et appartenant au groupe de R1, R4 et R12 vont

subir une analyse du contenu en collagène et plus particulièrement en hydroxyproline. En

effet, l’hydroxyproline correspond aux différents types de collagène qui ne peut être dissous à

cause de fortes liaisons et est donc relié aux propriétés mécaniques (Kovanen et coll., 1984).

124

Cette étude a été réalisée en collaboration avec le Dr. Bellon au Laboratoire de Biochimie

Médicale et Biologie Moléculaire CNRS FRE 2260 de l’ Université de Reims qui a effectué

une partie du protocole expérimental :

Les tissus musculaires sont découpés en morceaux puis broyés à l’aide d’un potter. Il sera

utilisé 12 muscles pour R1, 13 muscles pour R4 et 7 muscles pour R12. La solution de

broyage est alors disposée dans des tubes à azote afin que la solution soit ensuite lyophilisée

pour obtenir le poids sec. Environ 20 mg de tissu lyophilisé par échantillon ont été pesés puis

disposés dans une ampoule à verre scellée auquel on a ajouté 3ml HCL 6N. Les ampoules

sont ensuite scellées au chalumeau.

La partie suivante a été réalisée par le laboratoire de l’Université de Reims :

Les ampoules sont ensuite hydrolysées pendant 24 heures à 110°C. Le lendemain les

ampoules sont ouvertes et le contenu est évaporé sous courant d’azote. Le résidu est alors

repris pour être vortexé et centrifugé. Un dosage colorimétrique par la technique PDAB

(p-diméthylaminobenzaldéhyde) permettra d’évaluer la quantité totale d’hydroxyproline

contenu dans chaque muscle.

I - 2 - 2 Analyse des isoformes de titine à l’échelle du muscle

La séparation des isoformes de titine a été réalisée en collaboration avec le Pr. Linke

(Université de Heidelberg, Allemagne). Les isoformes de titine sont déterminés par des

électrophorèses sur des gels de polyacrylamide en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS –

PAGE). Cette technique est similaire à celle employée par Linke et Granzier, 1998 et Neagoe

et coll., 2002. Environ 30 à 60 mg de tissu musculaire congelé appartenant aux populations de

1, 4 et 12 mois sont mélangés à une solution tampon qui est constituée de 100 µl d’eau glacée

à laquelle on ajoute 40 µg/ml de leupeptine. Les échantillons sont rapidement centrifugés et

un tampon de solubilisation (1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, 10% glycérol, 8 µg/ml

leupeptine, 6 µM de bleue de bromphenol, 4,3 mM Tris-HCl, pH 8,8, 4,3mM EDTA) est

ajouté aux dépôts. Ensuite, les échantillons sont incubés pendant 5 minutes dans de la glace

puis chauffés dans un bain-marie à 95°C pendant 3 minutes. Le contenu total de protéines est

alors déterminé par spectrophotométrie. Une quantité équivalente de protéines (80 µg) pour

les trois âges est disposée sur un gel SDS - PAGE. Afin de détecter les protéines géantes

(titine) il a été utilisé un gel de concentration 2,8% avec un tampon de Laemmli. Les bandes

de protéines sont visualisées avec du bleu de Coomassie puis digitalisées et analysées selon

leurs densités optiques au moyen d’un logiciel (Phoretix, Newcastle upon Tyne, UK). Des

125

courbes de calibrations sont utilisées afin de normaliser la densité optique par protéine et

l’unité de densité sur chaque gel.

I - 3 - 2 Analyse des isoformes de titine à l’échelle de la fibre

La séparation des isoformes de titine réalisée sur des fibres musculaires a été faite en

collaboration avec le Pr. Linke (Université de Heidelberg, Allemagne). Une technique

similaire à celle précédemment décrite sur le muscle sera utilisée. Des fibres musculaires

extraites de muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois seront placées dans des eppendorfs puis

stockées à -180°C avant l’analyse électrophorétique. Un gel de concentration 2% avec un

tampon de Laemmli sera utilisé pour visualiser les isoformes de titine.

II - 2 Techniques ergométriques

II - 2 - 1 A l’échelle du muscle

II - 2 - 1 - 1 Préparation des muscles isolés

L’étude des propriétés élastiques passives sera menée sur un muscle typiquement lent

(soleus). Les rats sont anesthésiés avec une injection intrapéritonéale d’uréthane (1,2g/Kg) et

le muscle soleus est alors disséqué au niveau des pattes droite et gauche. Un total de 16, 16 et

10 muscles soleus ont été respectivement disséqués sur des rats âgés de 1, 4 et 12 mois.

Pendant la dissection les extrémités distale et proximale du muscle sont attachées avec un fil

noué au début de l’extrémité tendineuse. Les muscles disséqués sont ensuite immédiatement

pesés sur une balance (BP61S, Sartorius). Les rats sont ensuite sacrifiés avec une solution

létale d’uréthane.

Ces muscles vont subir des tests mécaniques puis ils seront plongés dans de l’isopentane

(permettant la conservation des structures musculaires internes) et congelés dans de l’azote

liquide afin de déterminer ultérieurement leurs propriétés morphologiques.

II - 2 - 1 - 2 Montage expérimental du muscle isolé Le muscle soleus avec ses attaches est disposé dans une cuve remplie de solution

physiologique (Ringer). Cette cuve est alimentée en oxygène (95% d’oxygène et 5% de

dioxyde de carbone) et maintenue à une température constante de 25°C avec un pH de 7,3

126

grâce à un système de circulation. Le muscle est alors mis dans des conditions physiologiques

in vitro qui sont proches de celles in vivo. Les fils vont permettre d’attacher l’extrémité

proximale du muscle à un capteur de force (Entran, ELJ-SO56D-2,5, France, étendue de

mesure : 2,5N, fréquence de résonance supérieure à 1kHz) et l’extrémité distale à un capteur

de déplacement (EX58 n°07-S01 PRODERA, France) ; précisons qu’aucun espace libre n’est

laissé entre les capteurs et le muscle. Le muscle est alors maintenu en position horizontale

dans une cuve sous contrôle physiologique (figure 1).

Figure 1 : Position horizontale du muscle au sein de la cuve

Le protocole expérimental permettant d’imposer des étirements aux muscles est le suivant :

un logiciel (Myotest 3009) développé au sein du laboratoire de l’UTC par la société Bio2M

permet de rentrer manuellement certains paramètres tels que : la distance d’étirement, la durée

de l’étirement ainsi que la vitesse d’étirement. Les paramètres théoriques sont ensuite envoyés

à un PID (Potentiel Intégrateur Dérivateur) (UTC service électronique) qui est relié à un pot

vibrant (EX58 n°07-S01 PRODERA, France) auquel est relié le capteur de déplacement

(figure 2). On visualise ensuite sur un oscilloscope (Hewlett Packard 54645A 100MHz)

l’étirement imposé ainsi que la réponse du muscle soumis à cette contrainte. Les signaux de

forces et de déplacements sont également enregistrés sur un ordinateur.

Capteur de déplacement

Direction de l’étirement

Capteur de force

Fil

Muscle soleus

127

Avant tout test d’étirement, on impose manuellement au muscle quelques séries d’étirements /

raccourcissements afin de diminuer les effets de thixotropie (effet mémoire); ces pré

étirements auront pour but de remettre le muscle dans un état nouveau dit stable qui ne sera

plus dépendant des phénomènes qu’il aura précédemment subis.

Trois tests mécaniques passifs vont être imposés au muscle : le test d’étirement en rampe, le

test de relaxation et le test de relaxation incrémental. A la fin de chaque test le muscle est

détaché puis congelé dans de l’azote liquide afin que ses propriétés morphologiques soient

déterminées.

128

Figure 2 : Chaîne d’acquisition des signaux force et déplacement.

Tige PID

Consigne théorique

Mesure

Signal d’erreur

Amplificateur de

puissance

Pot

vibrant

Capteur Capteur de force

Conditionneur Oscilloscope

Acquisition sur PC

Alimentation

129

II - 2 - 2 A l’échelle de la fibre

II - 2 - 2 - 1 Protocole de pelage

Le muscle soleus de la patte droite, appartenant à des rats âgés de 1, 4 et 12 mois, est disséqué

puis découpé dans le sens longitudinal des fibres en 2-3 morceaux. Ces petits bouts de muscle

vont subir un pelage chimique grâce à une solution de pelage qui contient :

Propionate de potassium, Acétate de magnésium 170 mM, MOPS (acide 3 morpholino

propane sulfonique) 5 mM, ATP 2,5 mM et K2EGTA 2,5m M ; l’EGTA (éthylène glycol bis

[β aminoéthyl éther N, N’ tetra-acide acétique]) a les propriétés de fixer des cations

métalliques en formant un complexe stable ; celui-ci va alors perméabiliser l’enveloppe

externe de la fibre (le sarcolemme) sans altérer les structures sous-jacentes (Eastwood et coll.,

1979).

Le protocole de pelage est issu des travaux de Mounier et coll., 1989 :

Après isolement des morceaux de muscles, ceux-ci sont directement disposés dans la solution

de pelage pendant quatre heures à une température de 0°C ; ensuite la solution de pelage est

renouvelée par de la solution fraîche et les biopsies restent 24 heures à une température de

0°C ; le lendemain les biopsies sont rincées avec de la solution de pelage puis stockées dans

une solution de conservation composée de 50% de glycérol et 50% de solution de pelage ; les

biopsies peuvent alors être conservées à une température de -20°C pendant 2 mois. Afin

d’éviter la détérioration des protéines de titine deux stratégies sont appliquées :

- Ajouter des inhibiteurs de protéase tel que la leupeptine (20 µg/ml), l’aprotinine

(5 µg/ml) et de la pepstatine (1 µg/ml).

- Les fibres musculaires sont testées 10 jours après le pelage de façon à ce que la

dégradation n’ait pas eu le temps de commencer.

A partir de chaque biopsie, il sera alors possible d’extraire un grand nombre de fibres

musculaires (1-3mm) sous loupe binoculaire.

130

II - 2 - 2 - 2 Montage expérimental de la fibre isolée

Les fibres musculaires (1-3 mm de long) sont extraites des biopsies de R1, R4 et R12 au

moyen de pinces très fines sous loupe binoculaire. En moyenne, 4 à 5 fibres par muscle sont

isolées et un total de 19, 18 et 24 fibres ont respectivement été disséquées des biopsies âgées

de 1, 4 et 12 mois.

Un fil de soie est noué à chaque extrémité de fibre isolée puis l’ensemble est disposé dans une

cuve (2x1cm) remplie de solution relaxante (R) (même composition que la solution de

pelage). L’étape suivante sera de suspendre la fibre par ses deux extrémités dans la cuve: le fil

de soie noué à une extrémité sera glissé et ainsi fixé sous un clip qui est disposé sur le bras

d’un vibrateur électromagnétique (Cambridge Technology Inc, Watertown, USA; modèle

6350) dont le système d’asservissement est piloté par ordinateur ; la deuxième extrémité de la

fibre qui est libre sera dans un premier temps enroulée avec une pince très fine autour d’un

crochet qui est monté sur une jauge de contrainte (AE 801, AME, Horton, Norway ; fréquence

de résonance dans l’air 4,52 kHz) et dans un second temps collée sur ce même crochet grâce à

de l’acétate de cellulose qui est dissous dans une goutte d’acétone.

La tension qui sera développée par la fibre ainsi que le déplacement induit par le moteur

seront visualisés sur un oscilloscope numérique (Nicolet ; modèle 310) et imprimés sur un

enregistreur papier (Gould ; modèle 40-8474-02) (figure 3).

La longueur de la fibre ainsi que son diamètre seront mesurés sous loupe binoculaire (x 80)

qui contient un oculaire micrométrique. La fibre étant considérée comme cylindrique, sa

section est calculée par la relation π d2/ 4, d étant le diamètre de la fibre.

La longueur de sarcomère de la fibre est mesurée par un système de diffraction d’onde à

travers la fibre ; en effet un faisceau laser Hélium/Néon (Melles-Griot, Carlsbad, USA ;

longueur d’onde 632,8 nm, puissance 10 mW) est dirigé perpendiculairement à la fibre et le

réseau de diffractions apparaît sur un support gradué permettant de lire la longueur du

sarcomère de la fibre. Lorsque la fibre est étirée à 120% de sa longueur initiale, la longueur de

sarcomère est de 2,6 µm pour les fibres musculaires de rats âgés de 1, 4 et 12 mois.

131

Figure 3 : Montage expérimental d’une fibre isolée (Toursel, 1999).

Ordinateur

Oscilloscope numérique

Enregistreur

Synchronisation

Système d’asservissement

Disquette de sauvegarde

Micromanipulateur

Support Jauge de contrainte

Crochet de fixation

Fibre musculaire Cuve en verre

Clip de fixation Pompe à vide

Vibrateur électromagnétique

Micromanipulateur

132

a)

b) c) Figure 4 : Visualisation du plan de travail utilisé (a) pour fixer la fibre isolée au sein d’une cuve (b) entre le capteur de force (c) et le dispositif d’étirement motorisé

Loupe Binoculaire

Cuve

Cuve

2 cm

Etirement motorisé

Crochet fixé sur le capteur de force

133

II - 3 Mesure de l’élasticité passive des muscles et fibres isolés II - 3 - 1 Détermination du type de muscle et du type de fibre

Le muscle soleus a été choisi pour cette étude car il est majoritairement constitué de fibres

lentes et devient de plus en plus lent avec l’évolution de l’âge.

Les fibres isolées qui vont subir des tests mécaniques seront uniquement des fibres lentes.

Ainsi, un critère d’identification basé sur la différence de sensibilité des fibres lentes et

rapides au calcium (Ca2+) et au strontium (Sr2+) sera utilisé (Mounier et coll., 1989). En effet,

il est bien connu que les fibres rapides sont moins sensibles au Sr2+ qu’au Ca2+ alors que les

protéines contractiles des fibres lentes ont la même affinité pour le Sr2+ et Ca2+ (Takagi et

Endo, 1977). Les travaux de Stephenson et Williams 1981 ont montré que les tensions

relatives développées par des fibres rapides et lentes induisaient des relations tension/pCa et

tension/pSr (pCa = - log [Ca2+] et pSr = - log [Sr2+]) qui étaient d’allures différentes.

Figure 5 : Identification d’une fibre rapide (EDL : Extensor Digitorum Longus) et d’une fibre

lente (Soleus) par le test du strontium (Stephenson et Williams, 1981).

134

Le protocole de typage des fibres qui a été utilisé dans cette étude ne reprend pas l’ensemble

de toutes les concentrations en Ca2+ et Sr2+ mais uniquement certaines concentrations qui sont

particulièrement sensibles aux différences typologiques. Les concentrations utilisées sont les

suivantes :

- pCa 4,2 qui induit une tension maximale pour les deux types de fibres

- pCa 5,0 qui induit une tension à 95% pour les deux types de fibres

- pSr 3,4 qui induit une tension maximale pour les deux types de fibres

- pSr 5,0 qui induit une tension à 80% pour les fibres lentes et à 10% pour les fibres rapides

Le protocole expérimental est alors le suivant :

La fibre est étirée à 120% de sa longueur de repos (longueur de la fibre in situ et par

conséquent développement d’une force maximale) dans la cuve qui contient de la solution R.

La fibre est ensuite lavée par la solution W* qui enlève toute trace d’EGTA avant d’aborder

l’expérimentation. Les solutions pCa* 5,0 et pCa* 4,2 sont mises successivement dans la cuve

induisant une contraction maximale de la fibre en saturant tous les sites calciques libres de la

troponine C qui actionne le phénomène de contraction. La cuve est ensuite vidée puis remplie

d’une solution relaxante R qui provoque le relâchement de la fibre. La solution de lavage est

ensuite ajoutée de façon à enlever de nouveau les traces d’EGTA. Les solutions pSr 3,4 puis

pSr 5,0 sont ensuite successivement ajoutées et les fibres lentes développent une grande

tension lorsque la solution pSr 5,0 est ajoutée (figure 6). * La solution de lavage W est composée de Kprop 185mN, MgAgc2, 2,5mM, MOPS 10mM,

ATP 2,5mM.

La solution PCa est obtenue en ajoutant à la solution de lavage du Ca-EGTA et K2-EGTA.

La solution PSr est obtenue en ajoutant à la solution de lavage du Sr-EGTA et du K2-EGTA.

Figure 6 : Exemple d’enregistrement d’une contraction développée par une fibre musculaire

Solution R de relaxation

Solution PCa 5

Solution PCa 4,2

Solution R

Solution W

Solution PSr 5

Solution PSr 3,4

Solution R

Solution R

135

Ce test d’identification permet, en plus de déterminer le type de la fibre, de confirmer sa

viabilité c'est-à-dire son aptitude à développer des forces ; en effet une fibre qui aurait été

endommagée lors du pelage chimique ou lors de la dissection serait immédiatement détectée

par des tensions développées trop faibles ou dans le pire des cas par une rupture de la fibre.

Ce test permet de mettre en condition la fibre (positionnement des protéines sarcoplasmiques)

avant qu’elle ne subisse différents tests mécaniques.

II - 3 - 2 Tests mécaniques passifs

II - 3 - 2 - 1 Recherche de la longueur « slack » de la fibre et du muscle

La fibre isolée venant d’être identifiée est relâchée à sa longueur de repos pendant une dizaine

de minutes.

Avant d’effectuer les différents tests mécaniques, la longueur dite « slack length » (Ls) de la

fibre est dans un premier temps recherchée ; cette longueur Ls correspond au début de tension

développée par la fibre lorsque celle-ci est manuellement et très doucement étirée. Une fois la

longueur Ls trouvée les trois tests mécaniques (étirement en rampe, test de relaxation et test

de relaxation incrémental) (Anderson 2000) qui permettent de caractériser l’élasticité passive

du muscle seront appliqués. Ces tests mécaniques sont respectivement effectués sur 19, 18 et

24 fibres lentes issues des populations R1, R4 et R12.

Des pré-manipulations ont permis de déterminer les vitesses et les amplitudes d’étirements

qui seront appliquées.

Une démarche identique à la fibre sera appliquée au muscle ; en effet avant de tester

mécaniquement le muscle, sa longueur Ls sera recherchée par un étirement manuel permettant

ensuite d’imposer au muscle trois tests d’étirements passifs identiques sur le principe à ceux

appliqués sur la fibre.

136

∆L Fs = 50mN

Déplacement (mm)

Force (mN)

T(s)

II - 3 - 2 - 2 Le test d’étirement en rampe

Ce test est utilisé depuis plusieurs décennies afin de caractériser l’élasticité passive des fibres

et des muscles.

Protocole expérimental appliqué à la fibre :

Il consiste à étirer la fibre à partir de sa longueur Ls avec une amplitude correspondant à 50%

de sa longueur « slack » et à imposer une vitesse très lente et constante de 0,005Ls/s. La fibre

subit cet étirement pendant 100 secondes et est relâchée avec la même vitesse (figure 7). La

fibre est ensuite complètement relâchée à sa longueur Ls pendant 5 minutes afin que les

composantes élastiques de la matrice sarcomérique et endosarcomérique retrouvent leur état

initial ;

Figure 7 : Représentation expérimentale de la force développée par une fibre isolée R12 soumise à un test d’étirement en rampe (∆L : étirement (mm), Fs : force statique (µN), T : temps (s)).

Protocole expérimental appliqué au muscle :

De même que pour les tests menés sur la fibre, les muscles appartenant à R1, R4 et R12 sont

étirés à partir de Ls avec une vitesse très lente de 1mm/s ; les muscles seront étirés avec une

amplitude qui correspond à 20% de leur longueur de repos. Par conséquent R1, R4 et R12

seront respectivement étirés de 3mm, 5mm et 6mm. Le muscle est ensuite relâché à sa

longueur Ls (figure 8).

Figure 8 :

Représentation expérimentale de la force développée par un muscle R12 lors d’un test d’étirement en rampe

100s∆L

Fs70µN

T (s)

100s∆L

Fs70µN

T (s)

100s∆L

100s100s∆L

Fs70µN

T (s)

Fs70µN70µN

T (s)

137

Paramètres mesurés :

Ce test permet d’obtenir aussi bien pour la fibre que pour le muscle une relation tension

passive / longueur d’étirement pour les trois populations R1, R4 et R12 ; l’étirement en rampe

met en évidence le comportement non linéaire de la fibre et du muscle. Lorsque l’amplitude

d’étirement atteint 50% de la longueur « slack » pour la fibre et 20% de la longueur slack

pour le muscle, la force maximale développée pour cet étirement est analysée ; en ce point la

force est appelée « force statique » Fs (unité de Fs : µN(fibre) ou mN(muscle)) et il sera

calculé en ce point le module d’Young E (kN/m2) comme étant le rapport entre la tension

statique σs (kN/m2) et la déformation ∆l (mm).

La contrainte est égale par définition à la force développée divisée par la section. La fibre est

considérée comme ayant une section circulaire alors que la section (S) du muscle soleus est

définie par la relation de Ranatunga, 1982 :

L

mSm×

=72.0

Equation 1

m équivaut à la masse du muscle en mg et 0,72xLm correspond à la longueur des fibres en

mm.

La section est définie par le rapport entre la masse et la longueur des fibres au sein du muscle.

On suppose que la masse volumique du muscle est de l’ordre de 1 g.cm3 et que la longueur de

la fibre équivaut à 72% de la longueur totale du muscle. La longueur de la fibre est mesurée

sous une loupe binoculaire (x 80) qui contient un oculaire micrométrique.

138

650µN

8s

Fd (µN)

T (s)

60s

Fs650µN

8s

Fd (µN)

T (s)

60s

Fs650µN

8s

Fd (µN)

T (s)

60s

Fs650µN

8s

Fd (µN)

T (s)

60s

Fs

II - 3 - 2 - 3 Le test de relaxation

Protocole expérimental appliqué à la fibre:

Une fois la longueur « slack » de la fibre trouvée, celle-ci va subir un étirement d’amplitude

50%Ls avec une vitesse très rapide 10Ls/s. L’étirement est maintenu pendant 60 secondes

puis la fibre est relâchée à sa longueur Ls (figure 9). La reproductibilité sera obtenue en

laissant la fibre reposer 5 minutes, de façon à ce que toutes les structures élastiques retrouvent

leur état initial, puis en recommençant le test depuis le début.

Figure 9 : Représentation expérimentale de la force développée par une fibre isolée R4 soumise à un test de relaxation (Fd : force dynamique, Fs : force statique). Protocole expérimental appliqué au muscle:

A partir de la longueur « slack », les différents muscles vont subir les mêmes étirements que

le test en rampe (R1 : 3mm, R4 : 5mm et R12 : 6mm) mais avec des vitesses d’étirement qui

sont différentes. En effet des pré-manipulations ont été réalisées afin de rechercher la vitesse

maximale pour laquelle le muscle développe une force maximale. Il sera alors appliqué des

vitesses de l’ordre de 600mm/s pour les groupes R4 et R12 et une vitesse de 250mm/s pour le

groupe de R1. L’étirement sera maintenu pendant 180 secondes puis le muscle sera relâché à

sa longueur Ls. De même que pour la fibre, la reproductibilité sera calculée en refaisant le test

deux fois sans oublier de laisser reposer le muscle pendant 10 minutes afin d’éviter les

phénomènes de thixotropie.

Figure 10 : Représentation expérimentale de la force développée par un muscle isolé R4 soumis à un test de relaxation (Fd : force dynamique, Fs : force statique).

625mV

20ms

139


Le comportement fibre/muscle à ce test d’étirement est tout d’abord caractérisé par un pic de

force passive nommé Fd « force dynamique » qui sera directement mesuré sur le graphe; en

effet Fd correspond à la force maximale développée par la fibre ou le muscle lorsqu’ils sont

soumis aux conditions dynamiques du test. La force dynamique est ensuite suivie d’une

décroissance exponentielle et au bout d’un certain temps t (60 secondes pour la fibre ou 180

secondes pour le muscle) un état statique prend place. La deuxième force mesurée est alors

appelée force statique « Fs » et est atteinte à la fin du plateau d’étirement lorsque la fibre ou le

muscle sont complètement relaxés d’où également son nom de force relaxée. Les tensions

statiques seront mesurées de la même façon que pour le test d’étirement en rampe. Les

tensions dynamiques seront calculées au moyen du rapport entre les forces dynamiques

développées et la surface du muscle ou de la fibre.

II - 3 - 2 - 4 Le test de relaxation incrémental

Protocole expérimental appliqué à la fibre :

Ce test est une copie du test de relaxation sauf que l’amplitude d’étirement est divisée par 5 ;

en effet la fibre à partir de sa longueur Ls va subir un enchaînement de 5 tests de relaxation.

Chaque incrément correspond à un étirement d’amplitude 10%Ls et à une vitesse d’étirement

de 10Ls/s. Chaque étirement est maintenu pendant une durée de 60 secondes et à la fin du test

complet la fibre est relâchée à sa longueur Ls (figure 11). La reproductibilité sera comme

précédemment déterminée après un temps de repos accordé à la fibre.

Figure 11 : Représentation expérimentale de la force développée par une fibre isolée R4

soumise à un test de relaxation incrémental (Fs : force statique).

60s

T (s)

Fs50µN

60s

T (s)

Fs50µN

60s

T (s)

Fs50µN

140

Protocole expérimental appliqué au muscle :

L’étirement du muscle n’est pas contrôlé par le même logiciel que les deux précédents tests ;

ce logiciel a également été développé au sein du laboratoire de l’UTC. Ce test est une copie

du test de relaxation sauf que le pas d’étirement est divisé par 4 : on notera L1, L2, L3 et L4

les quatre longueurs d’étirement imposées à R1, R4 et R12 (tableau 1).

Tableau 1 : Représentation des différentes longueurs d’étirement pour des muscles isolés âgés de 1, 4 et 12 mois et soumis à un test de relaxation incrémental.

Les vitesses d’étirement sont très rapides (imposées par le logiciel) et la durée de l’étirement

est de l’ordre de 60 secondes. A la fin du test le muscle est relâché et il revient à sa longueur

Ls. La reproductibilité est également mesurée dans les mêmes conditions que les tests

précédents.

Figure 12 : Représentation expérimentale de la force développée par un muscle isolé R4

soumis à un test de relaxation incrémental (Fd : force dynamique (mN),

Fs : force statique (mN)).

L1

(mm) (%Ls)

L2

(mm) (%Ls)

L3

(mm) (%Ls)

L4

(mm) (%Ls)

R1 0,7 4 1,5 8,6 2,2 12,7 3 17,3

R4 1,2 4,8 2,5 10,2 3,7 15,1 5 20,4

R12 1,5 4,9 3 9,83 4,5 14,7 6 19,6

L 1 L 2 L3 L4

Fd

Fs = 40mN

60S

141


Comme pour le test de relaxation, la fibre ou le muscle sont soumis à la fois à des conditions

dynamiques et statiques. La force statique (Fs) ou relaxée atteinte au dernier incrément sera

mesurée pour être comparée avec les autres forces statiques enregistrées lors des précédents

tests. De plus, l’évolution des forces statiques (Fs) et dynamiques (Fd) en fonction de la

longueur d’étirement sera mesurée.

II - 3 - 3 Analyse statistique Des tests Anova ont été réalisés avec le logiciel Statgraphics (Sigma Plus) afin de déterminer

les variations des forces et tensions dynamiques et statiques développées entre les trois

populations de muscles.

Des tests Kruskall-Wallis réalisés avec le même logiciel Statgraphics ont été réalisés afin

d’étudier les variations de forces dynamiques et statiques entre les trois populations de fibres.

142

II - 4 Détermination des propriétés morphologiques du tissu strié squelettique II - 4 - 1 Choix des échantillons

Lorsque le test d’étirement mécanique effectué sur le muscle isolé est fini, celui-ci est détaché

puis retiré de la cuve pour être plongé dans de l’isopentane permettant ainsi de conserver les

structures géométriques internes du muscle avant qu’il ne soit définitivement congelé dans de

l’azote liquide.

Huit muscles par groupe d’âge (R1, R4 et R12) qui ont préalablement subi des tests

mécaniques, soit un total de 24 muscles seront analysés afin de déterminer leurs propriétés

morphologiques en fonction de l’âge.


Les paramètres morphologiques mesurés sont :

- La surface totale du muscle

- La surface moyenne des fibres lentes (type I)

- La surface moyenne des fibres intermédiaires (type IIc)

- La surface moyenne des fibres rapides (type IIa)

Les paramètres morphologiques des fibres de type IIb ont été mesurés avec un pH 4,5 sur la

coupe ventrale de chaque muscle soleus. Les résultats obtenus étaient inexploitables compte

tenu du très faible pourcentage de fibres IIb au sein du soleus. Pour cette raison, il ne sera pas

tenu compte du pourcentage de fibres IIb dans cette étude.

II - 4 - 2 - 1 Protocole de mesure

a) Etude histochimique

Les muscles congelés appartenant à R1, R4 et R12 vont être découpés en plusieurs sections

transverses au moyen d’un microtome cryostat. Les coupes sont espacées de 10µm,

l’épaisseur de coupe est de l’ordre de 7µm et les muscles sont maintenus à -20°C pendant la

découpe. Les coupes sont ensuite disposées sur des lamelles de verre puis colorées par la

méthode de Brooke et Kaiser (1970) à un pH de 4,3 qui met en évidence l’activité

143

enzymatique de la myosine. Cette technique de coloration permettra l’identification des fibres

« lentes » (type I) qui apparaissent sous une couleur noire et l’identification des fibres

« rapides » (type II) : le type II est divisé en deux sous groupes qui correspondent aux fibres

intermédiaires (type IIc) représentées par une couleur marron clair et aux fibres rapides (type

IIa) qui sont représentées par une couleur blanche.

b) Protocole de découpe du muscle

Tous les muscles vont être découpés longitudinalement de la partie distale à la partie

proximale suivant 5 régions (figure 13) identifiées par la numérotation suivante : D1….D5 ou

G1….G5, D signifiant le muscle de la patte droite et G le muscle de la patte gauche.

Figure 13 : Schéma de découpe d’un muscle de 13mm de longueur appartenant à R1.

A l’intérieur des zones 1, 2, 3, 4 et 5 il sera effectué 5 coupes successives espacées de

10µm. Toutes ces coupes seront ensuite soumises à une coloration à pH = 4,3.

Après coloration des différentes coupes, il sera choisi la coupe la plus représentative de

chaque zone à étudier.

c) Mesure des paramètres morphologiques

Les lamelles de verre qui contiennent les différentes coupes sont ensuite disposées sur une

platine motorisée sous un microscope optique à transmission. Un logiciel (QWIN Leica)

pilote automatiquement la platine, avec un pas de balayage de 2 mm suivant l’axe X et Y,

permettant d’obtenir une reconstruction totale de la coupe musculaire (figure 14). Cette

Distal Proximal

0.0 5 mm

D2/G2 D1/G1 D3/G3 D4/G4 D5/G5

3.28mm

6.65mm

9.74mm 12.97mm

144

cartographie représente un assemblage de plusieurs images qui peuvent varier de 25 à 90

images selon l’âge du muscle et la zone longitudinale à étudier.

Le comptage ainsi que la mesure de l’aire des différents types de fibres ont été réalisés sur

l’ensemble de la coupe au moyen d’un seuillage. Les paramètres morphologiques à étudier

sont directement programmés au sein du logiciel.

L’aire de chaque fibre, ici en vert (figure 16), correspond à l’aire de chaque pixel qui est

contenu dans une fibre (aire d’un pixel = 0,99 µm2). Toutes les images seuillées de la coupe

sont visualisées l’une après l’autre afin de réajuster parfois le seuillage ; en effet des

différences de contrastes peuvent exister sur un même type de fibre, ceci étant dû à la découpe

de la section qui n’est pas homogène sur toute la surface.

Les résultats sont ensuite directement obtenus sous un fichier texte.

Figure 14 : Représentation d’une coupe ventrale de muscle R1

145

Figure 15 : Représentation des différents types de fibres (I, IIc et IIa) appartenant à la région

d’intérêt définie par un carré blanc sur la précédente coupe musculaire R1

Figure 16 : Seuillage des fibres de type I

Type I

Type IIc

Type IIa

60µm

60µm

146

d) Validation de la méthode de mesure

La calibration ainsi que la précision de la méthode de mesure des paramètres morphologiques

ont été réalisées en utilisant une cellule de Thoma dont la géométrie (figure 17) et les

dimensions sont connues.

Figure 17 : Représentation d’une cellule de Thoma

Tableau 2 : Comparaison entre les surfaces théoriques et les surfaces obtenues par QWin

Surface théorique(µm2)

Surface obtenue QWIN

Pourcentage d’écart

625 615 1,6% 1250 1287 2,9% 2500 2489 0,4% 5000 4918 1,6%

1200 µm2

625 µm2

2500 µm2

147

0 50

100 150 200 250

R1 R4 R12

Col

lagè

ne (µ

g)

**

III RESULTATS III - 1 Résultats de l’analyse biochimique III - 1 - 1 Evolution du contenu de collagène et d’hydroxyproline en fonction de l’âge Le contenu d’hydroxyproline calculé pour 1mg de poids sec diminue avec l’augmentation de

l’âge. Les valeurs moyennes avec écart type (SD) d’hydroxyproline contenu par les muscles

« soleus » de rats âgés de 1 (R1), 4 (R4) et 12 (R12) mois sont respectivement de 0,49 ± 0,19

µg, 0,30 ± 0,15µg et 0,14 ± 0,08µg. La reproductibilité réalisée sur des muscles âgés de 12

mois avec un contenu équivalent de tissu lyophilisé est de l’ordre de 4%.

Le collagène contenu dans le muscle entier sec a été calculé à partir du contenu total

d’hydroxyproline dans le muscle sec et à partir du facteur de conversion 7,25 (Woessner

1961). La quantité de collagène augmente significativement jusqu’à l’âge de 4 mois puis

diminue non significativement à l’âge de 12 mois (figure 1b).

Figure 1 : Evolution du contenu d’hydroxyproline (a) et de collagène (b) en fonction de l’âge

(P.S : Poids Sec) (* : P < 0,05 ** :P < 0,001)

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70

R1 R4 R12hydr

oxyp

rolin

e (µ

d/m

g p.

s)

**

*

**

a)

b)

148

III - 1 - 2 Isoformes et contenu de titine à l’échelle du muscle

L’électrophorèse de titine (figure 2a) réalisée sur un gel SDS - polyacrylamide 2% a permis de

conclure la présence d’une seule isoforme en fonction de l’âge. Le poids moléculaire de la

molécule de titine (3700 KDa) trouvée au sein du muscle soleus de rat est équivalent à celle

du soleus de lapin. Le contenu relatif de titine montre une légère augmentation entre R1 et R4

puis une diminution entre R4 et R12 ; cette tendance n’étant pas significative aucune

différence significative du contenu de titine entre les trois groupes n’a pu être observée (figure

2b). Un gel SDS - polyacrylamide 2,8% a permis de conclure que le rapport titine / myosine

(MHC) (figure 2c) est toujours proche de 0,1 quel que soit l’âge. Le nombre d’observations

réalisées est de 4.

Figure 2 : Représentation des électrophorèses de titine sur gel SDS à 2,8% (a), ainsi que du contenu relatif de titine (%) total au sein de chaque muscle (b) et représentation du

rapport titine / myosine en fonction de l’âge (c).

Titine

Nébuline

MHC

2,8% SDS-PAGE

3700 KDa

800 KDa

205 KDa

1 4 12

a)

Contenu de titine

1 4 120

50

100

150

200

b)

Rapport titine : MHC

Mois

1 4 120

0,05

0,10

0,15

c)

149

Fibres isolées

Titine

Nébuline

Soleus de lapin

III - 1 - 3 Electrophorèses de fibres musculaires Les électrophorèses de titine (figure 3) ont été effectuées sur des fibres musculaires de R1, R4

et R12 avec un gel SDS - polyacrylamide 2%. Ces données ont permis de conclure que la

mobilité de la titine était non significativement différente entre les trois groupes. Ce résultat

confirme celui obtenu à l’échelle du muscle à savoir une seule isoforme de titine en fonction

de l’âge. Le nombre d’observations réalisées est de 4.

Figure 3 : Profils électrophorétiques réalisées sur un gel SDS 2% caractérisant des fibres

lentes soleus issues de R1, R4 et R12.

150

III - 2 Résultats des tests mécaniques III - 2 - 3 Mesure des propriétés mécaniques passives du muscle

a) Test d’étirement en rampe

Les différents muscles de R1, R4 et R12 ont subi un étirement de 20% de leur longueur

initiale. Ce test met en évidence le comportement non linéaire de la force passive en fonction

de l’étirement pour les trois populations.

Le tableau 1 résume les forces et tensions statiques obtenues pour un test d’étirement en rampe.

R1 n = 16

R4 n = 16

R12 n = 10

Poids du muscle (mg)

Longueur du muscle (mm)

Section (mm2)

73,7 ± 5,2

17 ± 1

6,11 ± 0,42

201,6 ± 23,9

24 ± 1

11,99 ± 1,22

271,7 ± 23,6

30 ± 1

13,2 ± 1,21

Test d’étirement en

rampe

Fs (mN)

σs (kN/m2)

13 – 67 27

30 ± 11

4,02 – 12,14 4,52

5,33 ± 2,15

39 – 75 48

52 ± 12

3,08 – 6,28 4,22

4,36 ± 0,93

20 – 34 27

27 ± 4

1,39 – 2,48 2,04

2,04 ± 0,32

E (kN/m2)

20,11 – 60,7

27,31 31,04 ± 11,09

15,39 – 31,38

21,08 21,82 ± 4,64

6,95 – 12,40

10,21 10,21 ± 1,61

Tableau 1 : Valeur moyenne avec écart type (SD) du poids, de la longueur et de la section du muscle. Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) du muscle soleus soumis à un test d’étirement en rampe (3mm (R1), 5mm (R4) et 6mm (R12)) à une vitesse de 1 mm/s. (Fs (mN) : force statique, σs (KN/m2) : tension statique, E (KN/m2) : module d’Young).

La force statique augmente significativement d’un facteur 1,7 entre les groupes R1 et R4 puis

diminue significativement avec le même facteur entre R4 et R12. Les rats de 4 mois

développent donc une plus grande résistance à l’étirement que les deux autres populations. La

tension statique diminue non significativement entre R1 et R4 puis diminue significativement

d’un facteur 2 entre R4 et R12. Le module d’Young suit logiquement la même évolution que

151

la tension statique : il diminue non significativement d’un facteur 1,2 entre R1 et R4 puis

diminue significativement d’un facteur 2 entre R4 et R12.

Figure 4 : Illustration des valeurs moyennes avec écart type des forces statiques (Fs), modules

d’Young (E) et tension statique (σs) de muscles isolés R1, R4 et R12.

b) Test de relaxation Au cours de ce test les muscles sont dans un premier temps dans un état dynamique puis

statique. Un comportement viscoélastique des muscles pour les trois populations est observé.

Le tableau 2 résume les paramètres dynamiques (Fd et σd) et statiques (Fs et σs) obtenus pour

les muscles de 1, 4 et 12 mois.

R1 n = 16

R4 n = 16

R12 n = 10

Fd (mN)

σd (kN/m2)

77 – 128 108

104 ± 12

14,08 – 23,08 16,80

17,34 ± 2,67

215 – 456 278

296 ± 66

19,02 – 35,56 23,11

24,88 ± 4,75

162 – 229 188

191 ± 21

11,12 – 18,8014,90

14,79 ± 2,32

Test de relaxation

Fs (mN)

σs (kN/m2)

13 – 34 27

26 ± 4

4,02 – 7,45 4,92

5,51 ± 1,48

22 – 61 40

40 ± 11

2,04 – 4,47 3,21

3,25 ± 0,69

19 – 27 20

21 ± 3

1,39 – 1,93 1,63

1,63 ± 0,18

0

10 20 30 40 50 60

R1 R4 R12

Fs (mN)σs (KN/m²)E (KN/m²)

Tableau 2 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) du muscle soleus soumis à un test de relaxation (étirement : 3mm (R1), 5mm (R4) et 6mm (R12)) à une vitesse de 250mm/s (R1) et 600mm/s (R4 et R12). (Fd (mN): force dynamique, σd (KN/m2) : tension dynamique, Fs (mN): force statique, σs (KN/m2) : tension statique).

152

La force dynamique augmente significativement (P <0,001) d’un facteur 2,5 entre les rats de 1

et 4 mois puis diminue significativement (P <0,001) d’un facteur 1,5 entre les rats de 4 et 12

mois. La force statique suit la même tendance que la force dynamique, avec toujours une

résistance à l’étirement qui est maximale pour les rats âgés de 4 mois. Les forces statiques

développées pour R1, R4 et R12 sont respectivement inférieures aux forces dynamiques d’un

facteur 4, 7 et 9. De plus les valeurs des forces statiques obtenues par ce test de relaxation sont

proches de celles mesurées par le test d’étirement en rampe.

La tension dynamique développée par R4 est significativement supérieure aux groupes R1

(P<0,001) et R12 (P<0,001) d’un facteur 1,5. Les tensions statiques développées par R1 et R4

sont significativement supérieures à celle développée par R12. On note que les tensions

statiques sont dans le même intervalle que celles obtenues par le test d’étirement en rampe.

Tous ces résultats sont illustrés figure 5.

a)

Figure 5 : Illustration des valeurs moyennes avec écart type des forces / tensions dynamiques (Fd, σd) (a) et statiques (Fs, σs) (b) obtenues avec le test de relaxation

0 50

100 150 200 250 300 350

R1 R4 R12

Fd (mN)

σd (KN/m²)

0

10

20

30

40

50

R1 R4 R12

Fs (mN)

σs (KN/m²)

b)

153

0

20

40

60

80

100 120

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Longueur (mm)

Fd_R1 (mN)Fs_R1 (mN)

a)

0

20 40 60 80

100 120 140

0 1 2 3 4 5 6

Longueur (mm)


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1 2 3 4 5 6 7

Longueur (mm)


b)

c)

c) Test de relaxation incrémental Le muscle soumis au test de relaxation incrémental à partir de sa longueur « slack » (Ls) va

développer 4 forces dynamiques et 4 forces statiques. Les niveaux de forces statiques et

dynamiques développés par les muscles de 1, 4 et 12 mois à chaque incrément sont illustrés

sur la figure 6. Ces courbes représentent les forces statiques et dynamiques pour chaque

longueur de muscle. Pour chaque groupe il apparaît une augmentation des forces statiques et

dynamiques avec la longueur d’étirement ; en effet plus la longueur d’étirement est importante

et plus le muscle développe de hauts niveaux de résistance à l’étirement. Ce test met encore en

évidence le caractère non linéaire de l’élasticité des muscles et l’allure des courbes est

similaire à celle obtenue avec le test d’étirement en rampe.

Figure 6 : Représentation de la

force statique (Fs) (mN) et

dynamique (Fd) (mN) pour des

muscles R1 (a), R4 (b) et R12 (c)

soumis à une succession d’incréments

154

Toutes les courbes obtenues en condition statique et dynamique sont résumées sur la figure 7.

Il apparaît, comme pour les deux autres tests, que les muscles de 4 mois développent des

niveaux de résistance à l’étirement qui sont supérieurs aux muscles de 1 et 12 mois.

Figure 7 : Résumé de toutes les forces dynamiques (Fd) (a) et statiques (Fs) (b) obtenues au

cours de ce test d’étirement cyclique pour les trois populations.

Le tableau 3 et figure 7 résument les valeurs de forces statiques obtenues au cours de ce test

incrémental. On observe pareillement aux deux tests mécaniques précédents que la force

statique développée pour les rats de 4 mois est supérieure aux deux autres groupes et que la

valeur moyenne de Fs est dans le même intervalle que ceux des autres tests. De même que

pour les deux autres tests mécaniques, les tensions statiques développées par R1 et R4 sont

encore significativement supérieures à celle de R12.

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Longueur (mm)a)

-5 0 5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7

Longueur (mm)b)

Fd_R1 (mN)

Fd_R4 (mN)Fd_R12 (mN)

Fs_R1 (mN)Fs_R4 (mN)Fs_R12 (mN)

155

R1 n = 16

R4 n = 16

R12 n = 10

Test de relaxation

incrémental

Fs (mN)

σs (kN/m2)

15 – 40 27

27 ± 7

2,72 – 9,12 4,86

5,46 ± 1,97

28 – 59 38

41 ± 12

2,65 – 4,36 3,31

3,40 ± 0,76

20 – 30 21

22 ± 4

1,44 – 2,21 1,61

1,65 ± 0,25

Tableau 3 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) du muscle soleus R1, R4 et R12 soumis à un test de relaxation incrémental (4 longueurs successives d’étirement équivalentes à 3mm/ 4 = 0,75mm (R1), 5mm / 4 = 1,25mm (R4) et 6mm / 4 = 1,5mm (R12)) à une vitesse de 1 mm/s. (Fs : force statique, σs : tension statique).

Figure 8 : Illustration des valeurs moyennes avec écart type des forces (Fs) / tensions (σs)

statiques obtenues lors du test de relaxation incrémental.

0

10

20

30

40

50

R1 R4 R12

Fs (mN)

σs(KN/m²)

156

III - 2 - 2 - 1 Résultat de l’analyse statistique Le tableau 4 résume les valeurs de forces et tensions obtenues lors des différents tests mécaniques en condition passive. Tableau 4 : Analyse statistique des différents paramètres mécaniques mesurés et calculés pour

les trois populations de muscles isolés R1, R4 et R12 (** : P < 0,001 * : P < 0,05).

Tests mécaniques

Test ANOVA – Kruskall wallis

Fd

σd

R1≠R4** R1≠R12** R4 ≠R12** R1≠R4** R1=R12 R4 ≠R12**

Test de relaxation Fs

σs

R1≠R4** R1≠R12** R4 ≠R12** R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**

Fs

σs

R1≠R4** R1=R12 R4 ≠R12** R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**

Étirement en rampe

E

R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**

Test de relaxation incrémental

Fs

σs

R1≠R4** R1≠R12* R4 ≠R12** R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**

157

III - 2 - 3 Mesure des propriétés mécaniques passives des fibres musculaires III - 2 - 3 - 1 Résultats des tests mécaniques passifs Les fibres musculaires isolées ont subi les mêmes tests d’étirements que ceux effectués à

l’échelle du muscle : test d’étirement en rampe, test de relaxation et test de relaxation

incrémental. Les courbes caractéristiques obtenues à l’échelle de la fibre sont similaires à

celles obtenues à l’échelle du muscle. Les figures 10 à 12 représentent le comportement

mécanique de fibres isolées lorsqu’elles sont soumises aux trois différents tests passifs.

Figure 9 : Représentation de la résistance à l’étirement émise par une fibre isolée lors du test

d’étirement en rampe (étirement ∆L : 50% Ls et vitesses : 0,005Ls/s, Fs (µN): force statique, t: temps)

Figure 10 : Représentation de la résistance à l’étirement émise par une fibre isolée lors du test

de relaxation (étirement ∆L: 50% Ls et vitesses : 10Ls/s)

Figure 11 : Représentation de la résistance à l’étirement émise par une fibre isolée lors du test de relaxation incrémental (étirement ∆L: 10% Ls et vitesses : 10Ls/s)

∆L

650µN

8s

F (µN)

t(s)

Fd

Fs

60s

t(s)

Fs 50µN

100s

∆L

Fs 70µN

t(s)

158

Le tableau 5 résume les valeurs des forces et tensions obtenues lors des trois différents tests

passifs.

Tableau 5 : Valeur moyenne avec écart type (SD) des forces et tensions développées en condition statique et dynamique par des fibres lentes de soleus soumises à différents tests mécaniques.

- Le test d’étirement en rampe reflète le comportement non linéaire de la fibre (figure

10). Ce test met en évidence une augmentation significative (P<0,001) de la force

passive entre R1 et R4 puis une diminution non significative de la force statique pour

les fibres appartenant à R12 (figure 12). Les tensions statiques ainsi que le module

d’Young sont du même ordre de grandeur entre R1 et R4 puis ces paramètres

diminuent significativement (P<0,001) entre R4 et R12.

Figure 12 : Représentation des forces (Fs) (µN), tensions (σs) (KN/m2) statiques et module

Young (E) de fibres isolées R1, R4 et R12

R1 n = 19

R4 n = 18

R12 n = 24

Fd (µN)

σd (KN/m2)

80 ± 50

138 ± 66

400 ± 300

124 ± 32

300 ± 200

61± 42

Test de relaxation

Fs (µN)

σs (KN/m2)

20 ± 20

33 ± 24

80 ± 40

35 ± 15

100 ± 100

22 ± 22 Fs (µN)

σs (KN/m2)

30 ± 20

53 ± 43

200 ± 100

51 ± 27

100 ± 70

25 ± 22

Étirement en

rampe

E (KN/m2)

106 ± 86

103 ± 53

49 ± 44


E (KN/m2)

20 ± 20

41 ± 41

100 ± 70

39 ± 19

90 ± 60

18 ± 22

0 50

100 150 200 250 300

R1 R4 R12

Fs (µN)

σs (KN/m²) E (KN/m²)

159

0100 200 300 400 500 600 700

R1 R4 R12

Fd (µN) σd (KN/m²)

0

50

100

150

200

R1 R4 R12

Fs (µN)

σs (KN/m²)

- Le test de relaxation montre le comportement viscoélastique de la fibre qui se traduit

par une chute de force alors que l’étirement est maintenu (figure 11). La fibre isolée

est toute d’abord dans un état dynamique puis statique. Ce test révèle une

augmentation significative des forces statiques et dynamiques entre les fibres de R1 et

R4 puis une chute non significative des paramètres de relaxation pour les fibres isolées

de R12. Les tensions dynamiques et statiques sont dans un même intervalle pour les

fibres de R1 et R4 alors qu’une diminution significative des tensions apparaît pour le

groupe R12.

Figure 13 : Représentation des forces (Fd, Fs) (µN) et tensions (σd, σs) (KN/m2)

dynamiques (a) et statiques (b) de fibres isolées R1, R4 et R12

- Le test de relaxation incrémental qui est une succession de 5 tests de relaxation permet

également de quantifier la résistance passive des fibres ; il apparaît de même que pour

les tests précédents une augmentation significative de la force statique entre les

groupes de fibres R1 et R4 suivie par une légère diminution non significative de la

résistance à l’étirement pour le groupe de fibres R12. Les tensions statiques sont

a)

b)

160

0

50

100

150

R1 R4 R12

Fs (µN) σs (KN/m²)

équivalentes pour les fibres de R1 et R4 puis une décroissance significative apparaît

pour les fibres appartenant à R12.

Figure 14 : Représentation des forces (Fs) (µN) et tensions (σs) (KN/m2) statiques de fibres isolées R1, R4 et R12 soumises au test incrémental.

- Ces trois tests montrent des tensions passives et dynamiques ainsi qu’un module

Young qui sont du même ordre de grandeur pour R1 et R4 comparé aux tensions

développées par le groupe de fibres R12 qui sont significativement inférieures aux

groupes R1 et R4.

III - 2 - 3 - 2 Résultats de l’analyse statistique Tableau 6 : Analyse statistique des différents paramètres mécaniques mesurés et calculés pour

les trois populations de fibres isolées R1, R4 et R12 (* : P < 0,05, ** : P < 0,001)

Tests mécaniques

Test Kruskall-Wallis

Fd

σd

R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12** R4≠ R12**

Test de relaxation

Fs

σs

R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**

Fs

σs

R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**

Étirement en rampe

E R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**


Fs

σs

R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**

161

Ces tests statiques ont montré des différences significatives entre les forces développées par

les fibres de R1 et R4 alors qu’aucune différence significative n’apparaît entre R4 et R12.

Les tensions développées par les fibres appartenant à R1 et R4 sont équivalentes alors qu’une

différence significative intervient entre les autres groupes.

III - 3 Résultats de l’analyse morphologique III - 3 - 1 Diamètres des fibres en fonction de l’âge Les diamètres de fibres appartenant aux rats de 1, 4 et 12 mois varient de 15 µm à 138 µm.

Les diamètres moyens de R1, R4 et R12 sont respectivement de 29 ± 11µm, 55 ± 19µm et

87 ± 29µm. La figure 9 illustre via des « box-whiskers » des différences significatives entre

les diamètres des trois groupes.

Figure 15 : Représentation des intervalles de valeurs des diamètres de fibres appartenant à R1, R4 et R12 (** : P < 0,001)

R1

R4

R12


0 30 60 90 120 150

response

0 30 60 90 120 150

R1

R4

R12 * *

* * *

*

Diamètre (µm)

162

III - 3 - 2 Evolution du type et du nombre de fibres en fonction de l’âge Les figures 16, 17 et 18 représentent le résultat de coupes réalisées dans la partie ventrale du

muscle (zone D3/G3).

Figure 16 : section transverse d’un muscle R1

(coloration ATPase pH = 4.3)





Type I

Type IIa

Type IIc

50µm

50µm

50µm

163

Ces différentes coupes montrent que le muscle soleus devient de plus en plus lent avec l’âge,

ce qui se traduit par une augmentation relative du nombre de fibres de type I. On observe

également une augmentation du diamètre des fibres avec l’âge, ce que confirment les mesures

de diamètres obtenues lors des tests mécaniques effectués sur les fibres isolées.

a) coupe ventrale

Le tableau 7 résume l’évolution des différents pourcentages de fibres I, IIc et IIa en fonction

de l’âge.

Tableau 7 : Evolution des types de fibres (%) en fonction de l’âge (type I : fibre lente, type IIc : fibre intermédiaire, type IIa : fibre rapide)

Figure 19 : Illustration de l’évolution du type de fibres avec l’âge ( * : P < 0,05, ** : P < 0,001)

(type I : fibre lente, type IIc : fibre intermédiaire, type IIa : fibre rapide).

Coupe ventrale (G3/D3)

% type I % type II c % type IIa

R1

85,86 ± 6,37 3,04 ± 2,03 11,10 ± 5,99

R4

95,74 ± 5,22 1,07 ± 1,12 3,19 ± 4,81

R12

98,61 ± 1,53 0,34 ± 0,21 1,04 ± 1,46

% de fibres en fonction de l'âge

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

R1 R4 R12

I

II c

II a

** *

* **

* **

**

164

* * * *

*

R1

R4

R12

Nombre de fibres

1600 1800 2000 2200 2400

On observe une augmentation significative (13%) du pourcentage de fibres lentes avec l’âge.

Le muscle soleus est significativement constitué de fibres lentes dès l’âge de 1 mois. Les

muscles de 1 mois ont un pourcentage de fibres de type IIa qui est significativement supérieur

à celui des fibres de type IIc. Les type IIc et IIa sont prédominants pour les muscles de 1 mois

puis diminuent significativement avec l’âge.

Le nombre de fibres en fonction de l’âge a été mesuré sur la coupe ventrale de chaque muscle

(tableau 8) :

Coupe ventrale (G3/D3)

R1

R4 R12

Nombre de fibres totales

1901,5 ± 162,86 1906,5 ± 199,92 2115 ± 110,67

Tableau 8 : Représentation du nombre de fibres pour des muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois

Aucune augmentation significative du nombre de fibres n’a été trouvée entre les rats âgés de 1

et 4 mois (figure 20); par contre une augmentation significative du nombre de fibres est

obtenue entre les populations R1 et R12 et entre R4 et R12.

Figure 20 : Evolution du nombre de fibres en fonction de l’âge (* : P < 0,05 ** : P < 0,001)

165

b) Evolution longitudinale

L’évolution longitudinale du pourcentage de fibres lentes (type I) ne montre aucune différence

significative en fonction de la localisation longitudinale (D1/G1...D5/G5) de la coupe (tableau

9 et figure 21) pour les groupes R4 et R12. Par contre le groupe R1 a une augmentation

significative du nombre de fibres lentes de la partie ventrale vers la partie distale et vers la

partie proximale du muscle.

Numéro de la coupe R1 % de fibres I

R4 % de fibres I

R12 % de fibres I

D1/G1

92,09 ± 5,54 97,03 ± 4,87 98,81 ± 1,73

D2/G2

86,17 ± 8,16 96,98 ± 4,37 98,57 ± 1,39

D3/G3

85,86 ± 6,37 95,74 ± 5,22 98,61 ± 1,53

D4/G4

91,05 ± 6,56 96,56 ± 4,98 98,79 ± 1,66

D5/G5

94,71 ± 5,94 98,04 ± 2,68 99,73 ± 0,68

Tableau 9 : Evolution longitudinale du pourcentage de fibres lentes appartenant à R1, R4 et R12

type I

020406080

100120

R1 R4 R12

D1D2D3D4D5

Figure 21 : Illustration de la répartition longitudinale du pourcentage de type I (fibres lentes) en fonction de l’âge (* : P < 0,05)

* *

166

L’évolution longitudinale intra musculaire des fibres rapides « intermédiaires » (type IIc) ne

montre aucune différence significative suivant la localisation de la coupe pour les groupes R4

et R12. Le groupe R1 a une diminution significative du type IIc de la partie ventrale vers la

partie distale et proximale (figure 22, tableau 10).

Tableau 10 : Evolution longitudinale du pourcentage de fibres rapides intermédiaires appartenant à R1, R4 et R12

Type IIc

0123456

R1 R4 R12

D1D2D3D4D5

Figure 22 : Illustration de la répartition longitudinale du pourcentage de type IIc (fibres

intermédiaires) en fonction de l’âge (* : P < 0,05)

On observe bien que le groupe R1 est majoritairement constitué de fibres IIc comparé aux

autres groupes.

L’évolution longitudinale intra musculaire des fibres rapides « blanches » (type IIa) ne montre

aucune différence significative suivant la localisation de la coupe pour les groupes R4 et R12

Numéro de la coupe R1 % de fibres IIc

R4 % de fibres IIc

R12 % de fibres IIc

D1/G1

1,31 ± 1,13 0,5 9 ± 0,95 0,30 ± 0,74

D2/G2

2,77 ± 1,17 0,83 ± 0,53 0,56 ± 0,41

D3/G3

3,04 ± 2,03 1,07 ± 1,12 0,34 ± 0,21

D4/G4

0,30 ± 0,18 0,66 ± 0,53 0,48 ± 0,47

D5/G5

0,24 ± 0,36 0,38 ± 0,53 0,17 ± 0,49

** *

*

167

(figure 23, tableau 11). Le groupe R1 a de la même façon que pour les fibres IIc une

diminution significative du pourcentage de fibres IIa de la partie ventrale vers la partie

proximale.

Tableau 11 : Evolution longitudinale du pourcentage de fibres rapides (type IIa) appartenant

à R1, R4 et R12

type IIa

0

5

10

15

20

R1 R4 R12

D1D2D3D4D5

Figure 23 : Illustration de la répartition longitudinale du pourcentage de type IIa (fibres

rapides) en fonction de l’âge (* : P < 0,05)

Numéro de la coupe R1 % de fibres II a

R4 % de fibres II a

R12 % de fibres II a

D1/G1

6,61 ± 5,02 1,02 ± 1,02 0,89 ± 1,54

D2/G2

10,28 ± 6,83 0,69 ± 0,74 0,87 ± 1,21

D3/G3

11,10 ± 5,99 3,19 ± 4,81 1,04 ± 1,46

D4/G4

4,08 ± 5,62 0,34 ± 0,44 0,73 ± 1,39

D5/G5

3,62 ± 5,99 1,57 ± 2,16 0,10 ± 0,20

*

*

168

La variation inter musculaire du nombre total de fibres en fonction de la localisation

longitudinale montre une diminution significative du nombre de la partie ventrale vers les

parties distale et proximale. Le tableau 12 résume le nombre total de fibres par coupe

longitudinale.

Numéro de la coupe

R1

R4 R12

D1/G1

117 ± 50 143 ± 63 138 ± 100

D2/G2

1278 ± 328 1387 ± 247 1059 ± 232

D3/G3

1903 ± 163 1907 ± 200 2115 ± 110

D4/G4

1577 ± 178 1213 ± 222 1422 ± 217

D5/G5

381 ± 306 364 ± 237 266 ± 220

Tableau 12 : Représentation longitudinale du nombre total de fibres pour des muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois.

0

500

1000

1500

2000

2500

R1 R4 R12

D1D2D3D4D5

Figure 24 : Evolution longitudinale du nombre de fibres en fonction de l’âge

On observe une parfaite symétrie du nombre de fibres par rapport à la coupe ventrale. En

effet, la coupe ventrale contient le plus grand nombre de fibres comparé aux coupes distale et

proximale.

169

* * *

* * *

***

Surface musculaire (mm2)

Surface musculaire (mm2)

R1

R4

R12

0 4 8 12 16 20

III - 3 - 3 Evolution des paramètres morphologiques en fonction de l’âge

a) Evolution de la surface du muscle

La variation intramusculaire de la surface du muscle montre une augmentation significative de

la surface de la partie distale à la partie ventrale du muscle et de la partie proximale à la partie

ventrale du muscle. En effet, la partie ventrale est la région musculaire qui a la plus

importante section. La variation inter musculaire montre une augmentation significative de la

surface des muscles en fonction de l’augmentation de l’âge et quelle que soit la localisation de

la coupe. Par exemple, la coupe ventrale du muscle (G3/D3) (tableau 13) a montré une

augmentation significative d’un facteur ∼2 de la taille des sections entre R1 et R4 puis une

augmentation significative d’un facteur 1,5 entre R4 et R12.

Numéro de la coupe

R1 Surface totale (mm2)



D1/G1

0,46 ± 0,20 1,01 ± 0,41 1,43 ± 1,06

D2/G2

3,50 ± 0,72 7,89 ± 2,09 8,30 ± 1,36

D3/G3

5,28 ± 0,53 11,55 ± 0,78 16,09 ± 1,71

D4/G4

4,63 ± 1,31 7,22 ±1,57 11,30 ± 2,46

D5/G5

1,10 ± 0,77 2,19 ± 1,53 2,09 ± 1,70

Tableau 13 : Représentation longitudinale de la surface totale de coupes musculaires appartenant à des muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois

Figure 25 : Illustration de l’évolution de la surface ventrale du muscle en fonction de l’âge. (** P < 0,001)

170

Figure 26 : Evolution longitudinale de la surface du muscle en fonction de l’âge.

On observe une augmentation progressive des différentes surfaces en fonction de l’âge.

b) Evolution de la surface des différents types de fibres

L’évolution de la surface des différents types de fibres en fonction de l’âge a été réalisée sur la

coupe ventrale du muscle car cette région comporte le plus grand nombre de fibres.

Le tableau 14 résume les différentes valeurs de surfaces correspondantes aux types I, IIc et

IIa. Les valeurs minimales et maximales montrent une inhomogénéité des surfaces pour un

même type de fibres au sein d’un même muscle.

G3/D3 Surface I µm2 Surface IIc µm2 Surface IIa µm2

R1 616 – 1275 928

954 ± 246

495 – 1052 795

820 ± 186

699 – 1222 1035

993 ± 218

R4 1883 - 3165 2131

2275 ± 441

1555 – 3455 2002

2181 ± 713

1786 – 2987 2073

2253 ± 441 R12 2214 – 3703

3200 3108 ± 482

1450 – 3454 2131

2389 ± 867

1383 – 4758 3042

2989 ± 1208

Tableau 14 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) des surfaces de muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois.

0

5

10

15

20

R1 R4 R12Surf

ace

du m

uscl

e (µ

m2 )

D1D2D3D4D5

171

Figure 27 : Illustration de l’évolution des surfaces de fibres en fonction du type de fibre et de l’âge

La surface des fibres lentes (type I) augmente significativement d’un facteur 2 entre 1 et 4

mois et d’un facteur 1,5 entre 4 et 12 mois. Ce résultat suit l’évolution trouvée pour les fibres

lentes, qui augmente d’un facteur 2 entre 1 et 4 mois et encore d’un facteur 2 entre 4 et 12

mois.

La surface des fibres rapides intermédiaires (type IIc) augmente significativement d’un facteur

2,5 entre 1 et 4 mois puis une stabilisation de la surface apparaît à partir de 4 mois.

La surface des fibres rapides (type IIa) augmente significativement d’un facteur 2 entre 1 et 4

mois et d’un facteur 1,5 entre 4 et 12 mois.

Surface des fibres (µm2)

0 500

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

R1 R4 R12

III cII a

172

173


I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES

I - 1 l’échelle des fibres musculaires a) comparaison des valeurs mécaniques avec la littérature

L’élasticité des fibres musculaires est principalement due à la présence des filaments de titine

dont les propriétés élastiques ont été caractérisées dans de nombreuses études (Labeit et coll.,

1997, Linke et Granzier, 1998, Wang et coll., 1993). Dans cette étude, les fibres musculaires

issues des trois populations de rats âgés de 1, 4 et 12 mois ont subi trois différents tests

mécaniques passifs (test d’étirement en rampe, test de relaxation, test de relaxation

incrémental) avec différentes vitesses d’étirement (10Ls/s et 0,005Ls/s). La réponse de ces

fibres aux tests mécaniques a montré un comportement viscoélastique qui est en accord avec

d’autres études menées sur des fibres squelettiques de lapins (Bartoo et coll., 1997, Wang et

coll., 1993) et de rats (Mutungi et coll., 1996).

L’intervalle de valeurs des propriétés mécaniques mesurées dans cette étude pour un groupe

d’âge donné est en accord avec d’autres études. L’étude de Toursel et coll., 2002, a obtenu un

module d’Young de l’ordre de 93,4 ± 2,17 KN/m2 pour son groupe contrôle composé de fibres

soleus de rats âgés de 4 mois comparé à notre module d’Young 103 ± 53 KN/m2 obtenu sur le

même modèle animal. L’étude de Anderson et coll., 2002, réalisée sur des fibres soleus

appartenant à des souris de 5 mois a obtenu des valeurs de tensions dynamiques et statiques

respectivement de l’ordre de 103 ± 10 KN/m2 et 38 ± 3 KN/m2 semblables à notre étude qui a

mesuré des tensions dynamiques équivalentes à 124 ± 32 KN/m2 et des tensions statiques de

l’ordre de 35 ± 15 KN/m2.

b) Comparaison des trois populations de rats

Les forces dynamiques et statiques développées par les fibres pelées de 4 mois sont

significativement supérieures aux forces développées par les rats de 1mois. La comparaison

des forces entre les groupes de 4 et 12 mois a révélé une légère diminution, qui est non

significative, pour les rats âgés de 12 mois. Ces variations de forces en fonction de l’âge ne

sont pas corrélées à des changements d’isoformes de titine puisqu’il a été démontré qu’aucune

isoforme de titine n’apparaissait avec l’évolution de l’âge. Une variation de la quantité de

174

titine en fonction de l’âge pourrait expliquer ces variations de résistance à l’étirement. Cette

hypothèse a été rejetée car des électrophorèses de titine sur muscle entier ont démontré que le

contenu de titine était constant quel que soit l’âge.

L’augmentation de forces entre 1 et 4 mois est reliée à la croissance du muscle (Baldwin et

coll., 1984, Goldspink et coll., 1970) ; en effet durant cette période il apparaît une

prolifération des myofibrilles qui entraîne une hypertrophie du muscle (le diamètre des fibres

a doublé). Les tensions dynamiques calculées après les tests statistiques ont révélé une

diminution significative de la résistance à l’étirement pour les fibres de 12 mois comparé à

celles de 4 mois. Cette chute de tension pourrait s’expliquer par une perte de myofibrilles en

fonction de l’âge. Cette hypothèse est en accord avec les travaux de Ansved et Edström et

coll., 1991, qui a étudié les effets de l’âge (5-6 mois et 21-25mois) sur la structure et

l’ultrastructure de fibres rapides et lentes extraites de rats. En effet, leurs observations basées

sur une analyse au microscope optique ont démontré d’une part une perte de myofilaments

dans la région centrale des fibres appartenant à des vieux rats et d’autre part une légère

augmentation de l’espace intermyofibrillaire. Selon ces auteurs, ces modifications structurales

sont similaires au processus de dénervation qui implique une perte de myofibrilles en

périphérie des fibres musculaires.

I - 2 l’échelle du muscle A l’échelle du muscle, les changements de propriétés mécaniques passives en fonction de

l’âge ont été principalement mesurés par Kovanen et coll., 1984 sur le muscle soleus de rats.

Cette étude a consisté à appliquer des tests mécaniques d’étirements passifs (équivalents au

test d’étirement en rampe) qui ont été exécutés jusqu’au point de rupture avec une vitesse de

1mm/min sur des muscles soleus âgés de 1, 2, 4, 10 et 24 mois. Ces travaux ont montré une

résistance à l’étirement qui augmentait entre les populations de 1 et 4 mois (environ

0,2N/mm2) et qui diminuait entre 4 et 12 mois. Notre étude a utilisé deux tests

supplémentaires (test de relaxation et test de relaxation incrémental) d’étirements passifs à

grande vitesse comparé à l’étude de Kovanen et coll., 1984 afin de caractériser les propriétés

mécaniques passives. Les résultats de notre étude ont démontré une augmentation

significative de forces entre 1 et 4 mois alors qu’une diminution significative de force

intervient pour les muscles rats de 12 mois. Ces variations de forces en fonction de l’âge ne

sont pas reliées aux isoformes de titine car il a été prouvé au moyen d’électrophorèses

qu’aucune isoforme de titine n’apparaissait suivant l’âge. La composante élastique parallèle à

175

l’échelle du muscle englobe les filaments de titine mais elle est majoritairement composée de

substances collagéniques qui se trouvent au niveau de l’épimysium, périmysium, endomysium

et sarcolemme. En effet, il existe différents types de collagène (type I, III, IV et V) qui se

répartissent différemment dans le muscle et qui interviennent dans l’élasticité passive.

De nombreuses études (Kovanen et coll., 1984, Kovanen et Suominen, 1989) se sont

intéressées au rôle du collagène dans les fonctions mécanique et physiologique du muscle.

Ainsi, il est fréquemment utilisé un modèle animal soumis à un entraînement physique (tapis

roulant) afin d’observer les modification collagéniques que cela peut entraîner. Les études de

Kovanen ont conclu que la structure du collagène était adaptable aux entraînements imposés

et que certains paramètres mécaniques en étaient affectés. De plus, des études suivant l’âge

(Konanen et coll., 1987, Alnaqeed et coll., 1984) ont démontré que la concentration de

collagène augmentait avec l’avancée de l’âge. Ainsi, à l’âge de 1 mois (soleus de rats), il a été

démontré une forte activité enzymatique (enzyme « PH : Prolyl-4-hydrolase » et « GGT :

Galactosylhydroxylysyl Glucosyl Transferase ») traduisant la biosynthèse du collagène à cet

âge. A l’âge de 2 mois, cette activité enzymatique chute de façon très importante indiquant

que les fibres de collagènes se sont reliées entre elles, les rendant beaucoup plus résistantes à

l’action des collagénases. Notre étude a montré une augmentation de force entre l’âge de 1

mois et 4 mois avec à cette même période une augmentation du contenu de collagène. Ces

deux phénomènes sont étroitement liés, puisque pendant la période de croissance il y a une

augmentation du degré de liaison entre les fibres de collagène. En effet, la présence

d’hydroxyproline au sein du muscle permet aux molécules de collagène d’avoir une triple

hélice stable (Kovanen et Suominen, 1989). Ce phénomène physiologique implique une

augmentation de la force passive développée à l’âge de 4 mois.

Une diminution du contenu d’hydroxyproline en fonction de l’âge a été démontrée au cours de

ce travail. Ce résultat est en accord avec l’étude de Kovanen et Suominen, 1989 qui a obtenu

une concentration d’hydroxyproline qui diminue fortement entre 2 et 10 mois (soleus de rat).

L’étude de Ducomps et coll., 2003 a également obtenu la même décroissance

d’hydroxyproline sur des lapins (muscle SMP : Semimembranosus Proprius) âgés de 50, 90 et

140 jours. La chute de force observée pour les rats de 12 mois peut alors être due à leur

sédentarité qui influe à la fois sur la quantité de collagène qui diminue à l’âge de 12 mois et

sur la qualité du collagène. Cette chute de force observée pour les rats de 12 mois peut

également provenir du même phénomène que celui observé à l’échelle de la fibre à savoir une

perte de myofibrilles qui serait amplifiée à l’échelle du muscle.

176

I - 3 Comparaison des échelles macroscopique et microscopique

La détermination des propriétés mécaniques passives sur le muscle et la fibre a permis de

conclure que l’évolution des forces entre 1 et 4 mois était similaire et se traduisait par une

augmentation significative des forces. Ce déploiement de forces est lié au phénomène de

croissance du muscle qui se traduit par une hypertrophie des fibres musculaires et une

augmentation du contenu de collagène. A partir de 4 mois, les forces dynamiques et statiques

développées par les fibres ont tendance à diminuer vers l’âge de 12 mois. Cette tendance s’est

révélée significative à l’échelle du muscle. Les structures intrinsèques à la fibre (myofibrille,

espace intermyofibrillaire) et au muscle (contenu d’hydroxyproline) vont influencer les

propriétés mécaniques passives de manière différente.

I - 4 Analyse morphologique

L’évolution du nombre de fibres suivant l’âge a été étudiée en 1990 par Timson et

Dudenhoeffer sur des soleus de rats âgés de 1, 6 et 12 mois. Ces travaux ont utilisé une

méthode de dissolution des tissus conjonctifs afin de pouvoir isoler et compter les fibres sous

microscope optique. Cette étude a conclu que le nombre de fibres ne variait pas suivant l’âge

(environ 3000 fibres) et il a été mesuré une augmentation de 34 fibres entre 1 et 6 mois ainsi

qu’une augmentation de 104 fibres entre 6 et 12 mois. L’étude de Ansved et Edström 1991qui

a effectué des analyses histochimiques sur des muscles soleus de rats âgés de 5-6 et 21-25

mois a montré une diminution significative du nombre de fibres (367 fibres) entre ces deux

populations. De plus le nombre total de fibres mesurées à 6 mois est de l’ordre de 2672 ± 263

fibres comparé à l’étude précédente qui pour un même âge contient 3069 ± 123 fibres. Cet

écart de 397 fibres peut s’expliquer selon Timson et Dudenhoeffer par une diminution de

l’angle fait entre les fibres et l’axe long du muscle pendant la croissance du muscle. Ceci

implique une présence plus ou moins importante des fibres au sein de la section. L’analyse

histologique réalisée sur des rats de 1, 4 et 12 mois au cours de cette étude a montré un

nombre total de fibres de l’ordre de 2000 fibres. Ce résultat est inférieur aux précédentes

études mais présente une augmentation significative du nombre de fibres entre 1 et 12 mois

(214 fibres) et entre 4 et 12 mois (209 fibres).

L’inhomogénéité de la taille des fibres au sein d’un muscle a été confirmée par de nombreuses

études (Polgar et coll., 1973 et Punkt et coll., 1998). Ces études n’ont trouvé aucune

corrélation entre la taille des fibres et la fonction du muscle. L’intervalle de valeurs mesuré

par Polgar et coll., concernant la répartition des diamètres de fibres lentes extraites de soleus

177

Humain varie entre 47µm et 87µm en surface du muscle et entre 56µm et 82µm dans la partie

profonde du muscle. La base de données obtenue par Polgar et coll., 1973 a permis de

conclure qu’une seule région du muscle ne pouvait pas représenter le muscle en entier. Cette

observation est en accord avec les mesures de diamètres effectuées dans cette étude qui

varient de 35µm, 60µm et 100µm pour les fibres de 1, 4 et 12 mois.

Le muscle soleus est par définition un muscle qui est principalement composé de fibres lentes

(type I). Cette étude ainsi que des précédentes (Maltin et coll., 1989) ont montré que le muscle

soleus devient de plus en plus lent avec l’âge. En effet une augmentation significative (10%)

du nombre de fibres lentes apparaît entre 1 et 4 mois. Ce résultat est en accord avec l’étude de

Maltin et coll., 1989 qui explique que le changement de type de fibres apparaît dans la période

de 0 à 76 jours pendant laquelle la surface des fibres de type I a triplé de dimension. Notre

étude montre que la surface des fibres lentes a doublé sur une période de 1 à 120 jours. Le

facteur de croissance diminue ensuite de 25% pour les fibres de 12 mois. L’étude de Punkt et

coll., 1998 a obtenu une surface du muscle soleus pour un âge de 2,5 mois de l’ordre de

1146µm² et une surface de 3220µm² pour 18 mois. Ce résultat est dans la même gamme de

valeurs que notre étude pour un jeune âge mais diffère de celle de Maltin et coll., 1989 qui

pour les mêmes âges a trouvé des surfaces de l’ordre de 2215 ± 373 µm² (2,5 mois) et 3567 ±

1073 µm² (18 mois).

Les fibres de type IIc ne représentent que 3% de l’ensemble des fibres à l’âge de 1 mois puis

diminuent significativement jusqu’à 12 mois. Ce résultat est en accord avec l’étude de Ansved

et Edström, 1991 qui trouve un pourcentage de fibres IIc de l’ordre de 1% pour des muscles

soleus âgés de 5-6 mois et 21-25 mois. L’étude de Maltin et coll., 1989 a un pourcentage de

fibre IIc qui diminue de 5% à 0,2% depuis 25 jours jusqu’à 360 jours. La surface des fibres IIc

mesurées dans cette étude a doublé jusqu'à l’âge de 4 mois puis se stabilise jusqu'à l’âge de 12

mois.

Les fibres de type IIa sont majoritaires comparées aux fibres intermédiaires (IIc) et elles

disparaissent significativement suivant l’avancée de l’âge. L’étude de Ansved et Edström,

1991 a un pourcentage de l’ordre de 6 ± 4% (IIa) pour un âge de 5-6 mois (soleus) comparé à

3.19 ± 4.81% de fibres IIa mesurées dans notre étude. Les fibres rapides ont de très grandes

surfaces comparées aux autres fibres dès l’âge de 1 mois (993 ± 218µm²) et ce résultat est en

accord avec l’étude de Maltin et coll., 1989 qui a mesuré des surfaces rapides de l’ordre de

972µm². De plus nos analyses morphologiques ont montré dans ces surfaces un grand facteur

de croissance (facteur 2) entre 1 (993 ± 218µm²) et 4 mois (2253 ± 441µm²) qui continuent de

178

croître jusqu’à 12 mois (2989 ± 1208µm²), le même phénomène est observé dans l’étude

Maltin et coll., 1989 (1mois : 972µm² à 12 mois : 3331± 1230µm²).

Notre étude histochimique a de plus démontré que la surface des différents types de fibres (I,

IIa et IIc) était à l’âge de 4 mois dans la même gamme de valeurs. Il semblerait donc que cet

âge corresponde à un palier au niveau des paramètres morphologiques.

L’évolution longitudinale des fibres de type I, IIc et IIa au sein de soleus âgés de 4 et 12 mois

n’a révélé aucune variation significative du pourcentage de fibres. Par contre, l’analyse des

muscles de 1mois a montré une augmentation significative du pourcentage de fibres lentes

(type I) de la partie ventrale vers les parties distale et proximale. Une diminution significative

du pourcentage de types IIc et IIa est observée de la partie ventrale du muscle soleus vers les

parties distale et proximale. Ce résultat indique les futurs lieux de transformation des types IIc

et IIa en type I. A notre connaissance, une seule autre étude menée par Punkt et coll., 1998 a

étudié l’évolution longitudinale des fibres sur des muscles soleus âgés de 18 mois. Il a alors

été trouvé une augmentation significative (30%) du pourcentage de type I depuis l’origine du

muscle (partie proximale) vers l’insertion (partie distale).

179

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192

193

SYNTHESE

&

CONCLUSION

194

Os spongieux

Ostéon

Lamelle Os cortical

Schémas des différentes étapes réalisées au cours de ce travail de thèse :

OS CORTICAL HUMAIN MUSCLE HUMAIN


(échantillons cubique, parallélépipédique,sections fémorales)


(lamelles osseuses)

• Détermination des propriétés acoustiques et mécaniques

• Détermination des propriétés morphologiques

♦ Corrélation des propriétés mécaniques et morphologiques

♦ Influence, répercussion des propriétés mesurées à l’échelle macroscopique sur l’échelle microscopique et vice versa


(muscle squelettique soleus)


(fibre soleus) • Détermination des propriétés mécaniques passives

• Détermination des propriétés morphologiques

• Analyses biochimiques

♦ Corrélation des propriétés mécaniques et morphologiques / biochimiques

♦ Influence, répercussion des propriétés mesurées à l’échelle macroscopique sur l’échelle microscopique et vice versa

RECAPITULATIF

195

SYNTHESE DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU TISSU MUSCULO-SQUELETTIQUE

I PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU TISSU OSSEUX Echelle macroscopique

Le principal objectif de cette étude a été de corréler la distribution spatiale et locale des

propriétés élastiques et acoustiques de l’os cortical Humain avec la répartition de la

microarchitecture.

Deux techniques ultrasonores en transmission ont été utilisées : la première est installée au

Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical (UTC). Cette technique utilise des

capteurs plans en contact à 75KHz et 2,25MHz permettant de caractériser les propriétés

élastiques (modules d’Young (E33) et coefficients élastiques (C33)) sur des échantillons

cubiques et parallélépipédiques ; la deuxième technique localisée au Laboratoire Roberval

(UTC) fonctionne en mode écho avec des capteurs focalisés à 5MHz. Elle permet d’obtenir

une cartographie des propriétés acoustiques (vitesse de propagation) sur des sections

fémorales.

Deux techniques d’analyse de la microarchitecture ont été utilisées : la première fait appel à

un microscope électronique environnemental (SEM) (SAPC, UTC) afin de visualiser la

répartition de la microarchitecture sur les sections fémorales. La deuxième technique utilisée

est un micro scanner (IPROS) qui permet de visualiser la microarchitecture des échantillons

cubiques et parallélépipédiques.

Les résultats ont démontré une forte corrélation entre les propriétés acoustiques - élastiques et

celles de la microstructure.

En effet, les propriétés élastiques mesurées sur les échantillons parallélépipédiques du fémur 3

(E33 = 10 ± 4GPa et C33 = 11 ± 4GPa) sont plus faibles que celles du fémur 1 (E33 = 21 ±

2GPa et C33 = 31 ± 2GPa) et du fémur 2 (E33 = 20 ± 5GPa et C33 = 24 ± 5GPa) car les

échantillons du fémur 3 contiennent une porosité plus importante (35% - 72%) comparé aux

autres fémurs ( fémur 1 : 4%-10%, fémur 2 : 7%-54%).

L’étude sur les sections fémorales d’un même fémur (fémur 2) confirme également cette

corrélation entre les propriétés acoustiques et morphologiques. En effet, des variations

périphériques de vitesse (20% = 800m/s) correspondent à une variation du diamètre des pores

196

de l’ordre d’un facteur 5 (de 47µm à 253µm) et à une variation de la porosité d’un facteur 15

(de 3,1% à 47%).


L’objectif de cette partie a été de déterminer les propriétés mécaniques (module d’Young et

dureté) de lamelles osseuses appartenant à des ostéons blancs, gris et noirs sélectionnés au

moyen d’un microscope électronique environnemental.

Les résultats des propriétés mécaniques ont démontré que les ostéons blancs (E = 21,3 ±

3GPa, H = 0,55 ± 0,15) avaient des propriétés mécaniques supérieures aux ostéons gris (E =

19,27 ± 1,78GPa, H = 0,41 ± 0,09) et noirs (E = 12,95 ± 2,66GPa, H = 0,30 ± 0,10).

Cette étude a montré que l’échelle microscopique contenait des ostéons avec différents degrés

de minéralisation qui participent au remodelage osseux.

II PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE Echelle macroscopique

L’objectif de cette étude a été de corréler les propriétés mécaniques du muscle soleus avec sa

microstructure et ses composants physiologiques.

Une technique ergométrique (Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical, UTC) a

permis d’imposer différents tests mécaniques (test de relaxation, étirement en rampe, test de

relaxation incrémental) à des muscles isolés âgés de 1, 4 et 12 mois. L’utilisation de différents

âges permet d’avoir des modifications de propriétés morphologiques. Les paramètres

mécaniques enregistrés sont les forces et tensions statiques et dynamiques ainsi que le module

d’Young.

L’analyse des propriétés morphologiques a été réalisée via des coupes histologiques qui ont

permis de mesurer la surface et la répartition des différents types de fibres.

Les résultats ont montré une augmentation des forces dynamiques (facteur 2,5) et statiques

(facteur 1,7) entre 1 et 4 mois. Cette résistance à l’étirement est corrélée aux propriétés

morphologiques du muscle puisque la surface des fibres a doublé pendant cette période et aux

propriétés physiologiques car la quantité de collagène a triplé.

197


Une technique ergométrique (Laboratoire de Plasticité Neuromusculaire) similaire à celle

utilisée pour le muscle isolé va être appliquée sur des fibres musculaires issues des précédents

muscles. Les résultats aux tests mécaniques ont montré une augmentation des forces entre 1 et

4 mois qui est liée à l’augmentation du diamètre des fibres qui a doublé pendant cette période.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Ces deux études menées sur l’os et le muscle ont montré qu’il y avait une adaptation des

propriétés mécaniques et morphologiques de l’os et du muscle à la demande fonctionnelle. En

effet, il a clairement été prouvé au cours de ce travail que les propriétés mécaniques étaient

perturbées lors de modifications morphologiques aussi bien pour l’os (variation de porosité)

que pour le muscle (variation de la surface des fibres).

Les études menées à l’échelle microscopique sur l’os (échelle de l’ostéon) et sur le muscle

(échelle de la fibre) ont permis de démontrer que les modifications mécaniques enregistrées à

l’échelle macroscopique sont le résultat plus ou moins moyenné de changements produits à

l’échelle microscopique.

Cette étude fondamentale aura permis de constater une évolution similaire au cours du temps

du comportement de l’os et du muscle. En effet, pendant qu’une diminution des propriétés

mécaniques s’installe avec une augmentation de la porosité, il apparaît en parallèle une

décroissance de la résistance musculaire à l’étirement liée aux variations des propriétés

morphologiques. Ce résultat est en accord avec d’Arcy Thompson 1961 : « l’os et le muscle

sont inséparablement associés et connectés, ils sont moulés l’un avec l’autre… »

Ce travail pluridisciplinaire a associé différents domaines de recherche. Le tendon qui est le

tissu intermédiaire entre l’os et le muscle devra être étudié (propriétés mécaniques et

morphologiques) afin de faire la jonction entre l’os et le muscle. Les perspectives seront

d’étudier les interactions entre l’os, le muscle et le tendon lors d’une pathologie osseuse ou

musculaire. Il sera nécessaire d’évaluer le comportement mécanique de chacun de ces

matériaux afin d’agir sur l’ensemble de ces tissus qui subissent les conséquences d’une

pathologie.

198

199

Résumé : La caractérisation du tissu musculo-squelettique, qui a fait l’objet de très peu d’études au

cours de ces dernières années, fait appel à une connaissance pluridisciplinaire associant les

tissus osseux et musculaires.

Ainsi, des techniques ultrasonores et mécaniques ont été utilisées pour déterminer les

propriétés mécaniques (module d’Young, coefficients élastiques), acoustiques (vitesse de

propagation) et élastiques passives (forces et contraintes) d’échantillons osseux (os cortical

humain) et musculaires (soleus de rat). Ces différents tests ont été réalisés aux échelles

macroscopiques (ostéons, muscles isolés) et microscopiques (lamelles osseuses, fibres

musculaires). Parallèlement une caractérisation des propriétés morphologiques (porosité,

diamètre des pores, surface des fibres) et biochimiques (degré de minéralisation, analyse du

contenu d’hydroxyproline et de titine) de ces deux tissus a été obtenue via l’utilisation de

microscopes optique et environnemental, micro scanner et électrophorèses.

L’analyse des propriétés mécaniques mesurées aux échelles microscopiques a permis

d’expliquer certaines modifications enregistrées aux échelles macroscopiques. Cette étude a

également permis de mettre en évidence de fortes corrélations entre les propriétés mécaniques

et morphologiques pour ces deux tissus.

Mots clés :

Os cortical - Muscle soleus - Ultrasons - Nanoindentation - Titine - Propriétés mécaniques

Propriétés morphologiques

Documents

UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEGNE