UNIVERSITE PARIS XI FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD

Dialogues entre les voies de signalisation de l’AMPc et celles de l’IL-1 dans la régulation de l’expression de l’IL-6 et rôle de l’IL-6 dans les thyrocytes et dans les

cardiomyocytes de rats

Dialogues entre les voies de signalisation de l’AMPc et celles de l’IL-1 dans la régulation de l’expression de l’IL-6 et rôle de l’IL-6 dans les thyrocytes et dans les

cardiomyocytes de rats

UNIVERSITE PARIS XIFACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD

cardiomyocytes de ratscardiomyocytes de rats

Nicolas Szabo-FresnaisNicolas Szabo-Fresnais

14 octobre 200914 octobre 2009INSERM U486 INSERM U769

L’interleukine-6 (IL-6)

� Cytokine pro-inflammatoire

� Clonage du gène humain de l’IL-6 en 1986 (Hirano et coll.)� participe à la réponse immunologique: B cell stimulatory factor-2

� Membre des cytokines de la famille IL-6 qui contient:- LIF (leukaemia inhibitory factor) - LIF (leukaemia inhibitory factor) - IL-11- CT-1 (cardiotrophin 1),- CLC (cardiotrophin-like-cytokine)- OSM (oncostatin M)- CNTF (ciliary neurotrophic factor)

� Homologie séquence: Homme Rat: 68% (ARNm) et 58% (protéine).

� Synthèse dépendante d’autres cytokines (IL-1, TNFαααα, IFNγγγγ).

Effets cellulaires de l’IL-6

Effet Local Effet immun

IL-6IL-6

Lymphocytes T - Prolifération (IL-2)

Lymphocytes B- Cytokines- Différenciation

Macrophages- Cytokines- Prostaglandines

Fibroblastes- Collagénases

Cellules endothéliales- Molécules d’adhésion

Effet systémique

IL-6IL-6

Cerveau(Fièvre)

Hypophyse(ACTH)

Foie(protéines de la phase aigüe)

Effet métabolique

Foie(production glucose)

tissu adipeux(lipolyse)

Adénome folliculaire

Maladie de BasedowThyroïdite de Hashimoto

Carcinome papillaire

L’IL-6 dans les tissus pathologiques thyroïdiens et cardiaques humains

�Tissus thyroïdiens

Carcinome papillaire

Infarctus du myocardeIschémie

Kayser et coll (1995) AutoimmunityKaneko et coll (1997) Res Commun Mol Pathol PharmacolPlenz et coll (2002) JACCGabrielsen et coll (2007) JMCC

�Tissus cardiaques

IFNγγγγ

TSH

IL-6

Les cellules thyroïdiennes et les cardiomyocytesproduisent de l’Interleukine-6

LPS

Ancey et coll., Cytokine (2002)Gwechenberger et coll. Circulation (1990)Briest et coll. Eur J Physiol (2003)

Cardiomyocyte IL-6

Weetman et coll., J Endocrinol (1990)Diamant et coll., Autoimmunity (1991)Kennedy et coll., J Endocrinol (1992)Iwamoto et coll., Cytokine (1991)

ThyrocyteTNFαααα

IL-1

IL-6TNFαααα

IL-1

TSH IL-6

Effet synergique de l’AMPc sur la production de l’IL-6 stimulée par l’IL-1: un nouveau mode de régulation?

StimulationIL-6

??TSH IL-6++

(AMPc)

Iwamoto et coll., Cytokine (1991)

Thyrocyte

IL-1

Stimulationββββ-adrénergique Cardiomyocyte IL-6

??

??

IL-1

La voie de l’AMPc

membranebasale

membraneapicale

dans le thyrocyte dans le cardiomyocyte

NoradrénalineAdrénaline

ISO

TSHColloïde

GsAC

AMPc

Gs

AC

FSKdifférenciation

fonction

proliférationRTSH

AC

AMPc

Rββββ−−−−Ad

contraction

relaxation métabolisme

ISOFSK

Gs

T3,T4

Dérégulation de la voie de l’AMPc

Thyroïde:Production d’AMPc en continu par:. TSAb (maladie de Basedow). Mutations du RTSH. Mutations de Gs. Mutations de Gs

�Hyperthyroïdie

Cœur:Activation chronique des récepteurs β-ad:. Remodelage cardiaque

�insuffisance cardiaque rôle des cytokines pro-inflammatoires?

Objectifs généraux

� Dérégulation de la voie de l’AMPc et dialogue avec les cytokines pro-inflammatoires

�� réponse cellulaire (production d’IL-6)

� Rôle de l’IL-6 dans le remodelage cardiaque�� hypertrophie

Lignée cellulaire de thyrocytes de rats: les cellules FRTL-5

. Cellules non-transformées, non-polarisées

. Expriment des marqueurs de différenciation

du thyrocyte (Tg, NIS, TPO)

. Croissance cellulaire dépendante

Modèles cellulaires

de la TSH et de l’IGF-1/insuline

Cultures primaires de cardiomyocytes ventriculaires de rats adultes

. Cellules hautement différenciées

. Répondent aux catécholamines

Plan de l’exposé

1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6

2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel

3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes

4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque

5) Conclusions-Perspectives

Plan de l’exposé






Dosage ELISA

6

8

6 sécrétée (ng/ml) IL-1+FSK

Cellules FRTL-5

6

6 sécrétée (ng/ml)

Cardiomyocytes

16h de stimulation

Effet d’agents qui stimulent la production de l’AMPc sur la sécrétion d’IL-6 induite par l’IL-1

30201000

2

4

6

IL-6 sécrétée (ng/ml)

Temps (h)

FSK

IL-1

0

2

4

6

0 ISO IL-1 IL-1+ISO


Northern blot

321,510,5

+--++++--++++--++++--+++

+--+++

--

IL-1:FSK:

Temps (h): 0

Cellules FRTL-5

6 / ARNm CyA 16

stimulation:4h

RT-PCRq

Cardiomyocytes

Effet de la production d’AMPc sur l’expression de l’ARNm de l’IL-6 stimulée par l’IL-1

0 1 2 3

ARNm IL-6/

ARNm GAPDH

Temps (h)

40

80

120

0

IL-1+FSKIL-1FSK

ARNmIL-6

- + + - + + - + + - + +- + +-FSK:

ARNm IL-6 / ARNm CyA

(fois d’induction)

0

4

8

12

0 ISO IL-1IL-1+ISO

2

3

#

#

ns


2

3

# #

# ## #


Dosage ELISA

Rôle de la voie Gs/AMPc dans l’effet synergique IL-1/ISO sur la sécrétion de l’IL-6

Cardiomyocytes

0

1

#


CT: toxine cholérique (stimule Gs)PTX: toxine pertussique (inhibe Gi)

0

1


ddFSK: analogue inactif de la FSK IBMX: inhibiteur non-spécifique

des phosphodiéstérases

PTX

Les cibles de l’AMPc

PKA

MB-AMPc

N6- Monobutyryl-AMPc

Me-AMPc

8-CPT-2'-O-Me-cAMP

CPT-AMPc8-Chlorophenylthio-AMPc

ATP AMPc

AC

R R

C C

phosphorylation protéines

R

C C

R

PKA

Rp-cAMPS

H-89

Epac

Rap1GDP

Rap1GTP

Rap GAP

Effets

stimulation 2h

Effet de l’activation des voies de l’AMPc sur la régulation de l’IL-6 par l’IL-1

Cellules FRTL-5

Northern blot


stimulation 16h

Cardiomyocytes

Dosage ELISA

ARNmIL-6

024681012


Effet de l’inhibition de la PKA sur la régulation de l’IL-6 par l’IL-1

Pré-traitement 2hstimulation 2h

Cellules FRTL-5

Northern blot

*

6 sécrétée (ng/ml) 8

Pré-traitement 2hstimulation 16h

Cardiomyocytes

Dosage ELISA

IL-1+FSK0

H89

ARNmIL-6

IL-1+FSK

Rp-cAMPS

*


0

2

4

6

-

Conclusion 1

. La production d’IL-6 par l’IL-1 est augmentée de manière synergique par l’AMPc

. Cet effet synergique implique l’expression de l’ARNm de l’IL-6. Cet effet synergique implique l’expression de l’ARNm de l’IL-6

. L’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA participe à cet effet synergique

Plan de l’exposé






60

80

100

120

6 (% contrôle)

*

* ¶FSK

IL-1+FSK

Milieu changéActinomycine D

+/-stimulations

90 min

Etude de la stabilité de l’ARNm de l’IL-6 dans les cellules FRTL-5

0

20

40

60

0 30 60

Temps (min)ARNm IL-6 (% contrôle)

*IL-1+FSK

IL-1Non-stimulé

(100%)30 min 60 min0 min

90 min

*¶Significatif/non-stimuléSignificatif/FSK

�ARN�Northern blot

Promoteur du gène de l’IL-6 et mesure de l’activité transcriptionnelle

Transfection cellulaire transitoire

Cellules FRTL-5

5 ’ 3 ’AP-1 CRE NFkB Luciférase

TATA

-283-1168 -63

C/EBP

(NF-IL6)

Co-transfectionPlasmide rapporteur luciférasePlasmide contrôle β-galactosidase

Transfection cellulaire transitoire

Déprivation

Stimulations

24h

24h

7h

Activités luciférase et ββββ-galactosidase

Activité transcriptionnelle du promoteur de l’IL-6 dans les cellules FRTL-5

20

Activités LUC / ββ ββ-GAL


* **x 2,8synergie

Significatif par rapport IL-1* **/

0

10

0 TSH FSK IL-1 IL-1+

TSH

IL-1+FSK

Activités LUC /


P1168 wt

Activités LUC / ββββ-GAL (fois d’induction)0 5 10 15 20 25 30

P1168 ∆∆∆∆AP-1x 1,3

P1168 mCRE

x 3,1

synergieLUC

LUC

Effet de l’invalidation des sites du promoteur de l’IL-6 sur l’effet synergique IL-1/FSK

P1168 mCREx 1,5

P1168 mC/EBPx 2.4

P1168 mNFκκκκB

x 4.3

LUC

LUC

LUC

IL-1IL-1+FSK

Effet de la synergie sur la liaison des facteurs de transcription sur les sondes AP-1 et CRE

Cellules FRTL-5. stimulation 1h. extraits nucléaires. Incubation sondes

Retard sur gelEMSA

CRE*+/-CRE

CRE

5’…GGACGTCA…3’

AP-1

AP-1*+/-AP-15’…TGAGTCA…3’

non-spé.

CRE*

CRE

non-spé.

AP-1*

AP-1

Fos:Jun: CREB:

Les facteurs de transcription AP-1 et CREB

. Appartiennent à la superfamille des facteurs de transcription b-ZIP (leucine zipper factor). Forment des homo ou des hétérodimères

c-FosFra1Fra2FosB

c-JunJunB JunD

CREBATF1

Stimulation transcription par les hétérodimères Jun-Fos est plus forte que celle des homodimères Jun-Jun.

Expression et activation des facteurs de transcription AP-1 et CREB

FSK IL1IL1+ FSK

0

c-Fos

FosB

Fra-1

Stimulation 1hExtraits nucléairesWestern-blot

Cellules FRTL-5

ATF-1

CREB

Fra-2

c-Jun

JunD

JunBP-Jun Ser63

P-Jun Ser73

P-CREB Ser133

P-ATF-1 Ser63

FSK IL1IL1+ FSK

0

Conclusion 2

. L’AMPc augmente la stabilité de l’ARNm de l’IL-6

. La TSH/ FSK stimule de manière synergique l’activité du promoteurde l’IL-6 induite par l’IL-1

. Les sites AP-1 et CRE sont la cible de l’effet synergique

. L’expression de c-Fos et Fra-2 est stimulée par l’IL-1/FSK demanière synergique

IL-1

CREBATF-1

Pc-FosFra-2

Jun

P

AMPc

c-FosFra-2

Dialogues entre l’IL-1 et l’AMPc dans l’expression synergique de l’IL-6

NFkB

ARNm IL-6

ATF-1Fra-2

AP-1

ARNm IL-6

Fra-2

Plan de l’exposé






cardiomyocyteventriculaire

cellule T cellule B

IL-6

Action paracrine/autocrine de l’IL-6 dans le tissu cardiaque ventriculaire

?

IL-6IL-6

IL-6

fibroblastes cardiaques

activationclassique

IL-6 IL-6

2 types de récepteurs pour l‘IL-6

Trans-signaling

sIL-6R

sIL-6RIL-6 IL-6

sIL-6R

sIL-6R

Métalloprotéase

sIL-6R

sIL-6R

gp130

gp130IL-6R

IL-6R

gp130

gp130

sIL

sIL

Épissage alternatif

Domaine transmembranaire

ARNm IL-6R

Coupure protéolytique

IL-6R

IL-6R

gp130

JAK

gp130

JAKIL-6R

IL-6R

IL-6 IL-6

Voies de signalisation de l’IL-6

gp130

JAK

gp130

JAKIL-6R

IL-6R

IL-6 IL-6

P P

SHP2

STAT3 PP

SHP2

STAT3

STAT3

STAT3 P

P

PI3KAKT

ERK1/2

P P

100 kDaIL-6RARNm

IL-6R

Etude de la phosphorylation des MAP kinases ERK1/2 et de AKT en réponse à l’IL-6

RT-PCR Western-blot

IL-6R

rIL-6

P-ERK1/2Thr202/Tyr204

Total ERK1/2

0 10 15 60Temps (min) 4530

P-AKTSer473

Total AKT

Temps 0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h

rIL-6

30’

Etude de la phosphorylation de STAT3 en réponse à l’IL-6 dans les cardiomyocytes de rats

hIL-6 + hsIL-6R

0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h30’

Trans-signaling

P-STAT3tyr705

Temps

Total STAT3

0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h30’ 0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h30’

Plan de l’exposé






Morphologie des cardiomyocytes dans l’hypertrophie et l’insuffisance cardiaque

Synthèse

Peptides

Hunter and Chien, 1999

Peptides natriurétiques(BNP)Gène précoce(c-Fos)

protéique

• LIF, CT-1/cardiomyocytes, myocarde�� survie, �� l'hypertrophie cardiaque, �� régénération myocardeNegoro et coll (2001) Circulation Kodoma et coll (1997) Circ Res

Effets cardiaques des cytokines de la famille IL-6

Kodoma et coll (1997) Circ Res Zou et coll (2003) Circulation

• Souris TG surexpression IL-6 + IL-6R :Hypertrophie ventriculaire chez l'adulteHirota et coll (1995) PNAS

140

160]-Leucine

(% du controle)

**

*

Mesure de la synthèse protéique

stimulation 24h

Cardiomyocytes

100

120

0 PE rIL-6 hIL-6 hIL-6+

hsIL-6R

incorporation [3H]-

(% du controle)

0

**

PE: phényléphrine (agoniste alpha-adrénergique)

600

800

Fos/ ARNm CycA

(% du contrôle)

*

Etude de l’induction de gènes associés au processus hypertrophique

stimulation 1h30

Cardiomyocytes

RT-PCRq

Sécrétion du BNP

(% du contrôle) 400

500

*

stimulation 48h

Dosage ELISA

0

200

400

600

ARNm c-Fos/ ARNm CycA

(% du contrôle)

*

Sécrétion du BNP

(% du contrôle)

0

100

200

300 *

gp130

gp130

IL-6 IL-6

JAK JAK

Conclusion 3

SHP2

IL-6R

IL-6R

• Expression du récepteur de l’IL-6

Cardiomyocytes

sIL-6R

sIL-6R

SHP2

STAT3

• Le trans-signaling de l’IL-6 estindispensable:

Synthèse protéique

Expression de c-Fos

Sécrétion du BNP

�� Dans l’expression des marqueursassociés au processus hypertrophique

PI3KAkt

ERK1/2

SHP2

�� Dans l’activation de STAT3

PI3KAkt

ERK1/2

SHP2

STAT3

STAT3

STAT3

Plan de l’exposé






c-FosFra2

ARNm IL-6

Sécrétion IL-6

stabilité

AMPc

IL-1IL-1+ AMPc/PKA

Conclusion générale

Fra2

CREAP1 NFkB IL-6IL-6

IL-6 hypertrophie

Trans-signaling IL-6

hypertrophie

STAT3

sIL-6R

Perspectives

• Etudier le mécanismes du trans-signaling de l’IL-6 dans les cellulesFRTL-5 puis dans thyrocytes humains.

• Etudier les mécanismes qui conduisent à l’activation spécifique deSTAT3 par trans-signaling

� niveau critique d’activation de la gp130� niveau critique d’activation de la gp130

• Montrer l’implication de STAT3 dans la stimulation de l’hypertrophie cellulaire des cardiomyocytes par l’IL-6

• Mettre en évidence l’effet autocrine IL-1+ISO sur l’hypertrophie� Production du récepteur soluble de rat� Étude sur cellules humaines

Remerciements

Martine Pomérance

Jean-Paul Blondeau

Rodolphe Fischmeister

Aurore Germain

Florence Lefebvre

Rodolphe Fischmeister

Françoise Chantoux

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