Proposition d'un sujet de thèse 2016

Apport d’un biomarqueur lipidique pour diagnostiquer l’impact toxique de pesticides sur le compartiment des diatomées benthiques des cours d’eau.

Application sur un bassin viticole-test du Blayais (33)

Mots clés : diatomées benthiques – cours d’eau – pollution - pesticides – descripteurs d’impact - impact toxique –- biomarqueur lipidique -

RésuméLes travaux de la présente thèse prennent place dans le cadre du projet LIPID, financé par le LabEx COTE (A.O. 2015). Ce programme écotoxicologique intervient en complément du projet PHYTOCOTE pré-existant, qui diagnostique l’impact des pratiques viticoles sur les milieux naturels d’un site-atelier viti-vinicole du Blayais (bassin versant de Marcillac, 33), et étudie les possibilités d’actions correctives pour une meilleure durabilité environnementale de cette activité. Par cette thèse, leprogramme LIPID vise notamment à améliorer le diagnostic d’écotoxicité des pollutions viticoles sur des cours d’eau-tests (Ruisseau des Souches et Livenne), à partir des réponses procurées par les diatomées aquatiques benthiques.Le compartiment diatomique est utilisé de longue date dans les réseaux de surveillance nationaux pour diagnostiquer la qualité des cours d’eau. Des indices diatomiques calculés à partir de la composition spécifique des communautés en place (IPS, IBD…) permettent un diagnostic fiable de la qualité des eaux vis-à-vis de pollutions physico-chimiques générales et de l’enrichissement anthropique des cours d’eau (altération organique et eutrophisation). Pour différentes raisons, ces indices ne permettent pas de procurer un diagnostic suffisamment robuste de l’altération toxique in situ. Dans le but d’obtenir un diagnostic plus précoce, plus sensible et plus fiable de ce type de pollution, il a été nécessaire de développer d’autres techniques issues du domaine de l’écotoxicologie. Il a ainsi été possible de mettre en évidence les effets de molécules toxiques sur la croissance des peuplements, sur la biométrie des taxons et l’apparition de formes anormales, sur les atteintes au système photosynthétique et, à partir d’approches de biologie moléculaire, sur l’induction ou l’inhibition transcriptomique de fonctions ou de biosynthèses cellulaires.Cette dernière approche qui s’appuie sur les ARN totaux, déjà utilisée avec succès sur différents organismes modèles animaux, a récemment permis de révéler de façon précoce et sensible les effets toxiques d’un micropolluant métallique (Cd) et de molécules phytosanitaires sur diatomées d’eau douce.

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Cependant, par rapport à ces inductions d’ARN, des objections sont émises du fait de l’existence de régulations cellulaires post-transcriptomiques capables de moduler les réponses et biosynthèses cellulaires en fonction du niveau réel de l’atteinte toxique. Il apparaît donc intéressant d’étudier plus directement le niveau réel des biosynthèses ou des blocages de biosynthèses qui interviennent en réponse à une exposition toxique.Les profils lipidiques ont déjà été utilisés avec succès sur des organismes végétaux, tenant lieu de proxys permettant de résumer le fonctionnement cellulaire et ses altérations. A partir d’expérimentations d’exposition à des produits toxiques utilisés en viticulture (cuivre, pesticides organiques de synthèse) qui seront réalisées en conditions contrôlées de laboratoire et in situ, le présent projet de thèse vise à transposer sur le compartiment diatomique un principe de biomarqueur lipidomique mis au point sur végétaux terrestres, et à en valider la pertinence et l’intérêt par rapport aux descripteurs d’impact toxique précités.

I- Contexte général, état de l'art et enjeux

L’évolution des activités humaines mises en jeu dans le cadre du développement économique, industriel et commercial intervenu au cours du 20ème siècle a conduit à un accroissement conséquent de la pollution des écosystèmes aquatiques, du fait du transport de la contamination suivant l’écoulement des eaux et la voie atmosphérique. Si la pollution organique et trophique à l’origine de l’eutrophisation des hydrosystèmes était le problème dominant des années 1960-70, un effort très conséquent a été réalisé dans ce domaine avec l’augmentation et l’amélioration du parc de STEPs urbaines et industrielles, avec un important soutien financier des agences de l’Eau. Une source de nutriments qui échappait le plus à ce type de stratégie, la pollution diffuse agricole, a dû faire l’objet d’autres types de mesures plus territorialisées et plutôt moins efficaces, mais les principaux points noirs d’eutrophisation des eaux douces ont cependant pu être progressivement résolus.

Un problème très actuel qui persiste réside dans la détection de différents types de micropolluants toxiques dans notre environnement naturel (métaux lourds, pesticides, assortiment sans cesse accru de substances dites « émergentes » à la toxicité et aux effets environnementaux mal évalués, du type médicaments, hormones synthétiques, retardateurs de flammes etc…), qui sont régulièrement détectées et quantifiées dans la plupart des hydrosystèmes français d’eau douce via les résultats des réseaux de surveillance. A titre d'exemple, la France est le 1er pays européen en termes de Surface Agricole Utile (SAU) et serait avec une consommation annuelle de 30 214 tonnes (Ref 1 : Eurostat 2013), l’un des 2 plus grands consommateurs européens de pesticides juste derrière l'Espagne (31 832 tonnes), ce classement étant susceptible de s’inverser selon les années.

Les biocides sont utilisés partout, de l'agriculture aux collectivités publiques, aux opérateurs privés, aux jardiniers amateurs... Concernant l'agriculture, les cultures pérennes comme les vergers et les vignobles sont les plus grands consommateurs par unité de surface, en fonction du nombre élevé d’interventions pouvant atteindre une quinzaine, voire une vingtaine de traitements par an, et exercent de ce fait une pression importante sur les milieux naturels. Conséquence de cette pression polluante presque ubiquiste, selon le SOES (Réf. 2), en 2012, les pesticides ont été détectés sur 89 % des 2555 sites de surveillance concernant les cours d’eau, plus de 20 molécules en mélange ont pu être trouvées dans au moins 26% des sites, et 25% des sites dépassaient 0,5 µg/l de pesticides cumulés (plafond pour la potabilisation de l’eau brute sans pré-traitement). D’autres catégories de micropolluants toxiques constituent aussi un sérieux problème général, ayant conduit l'Union Européenne à adopter le règlement REACH en 2006 (Réf. 3) et à publier une liste des micropolluants interdits d'utilisation et (ou) à déclaration obligatoire de production ou d’utilisation au niveau Européen (Ref 4).

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Cette liste a été régulièrement complétée et comprend actuellement 41 substances (nombre sans cesse en augmentation). L’ampleur environnementale de ces pollutions chimiques est bien illustrée par les données de surveillance des hydrosystèmes, qui sont à la fois un réceptacle naturel et une voie de circulation des flux polluants. D’après l’OIEAU, (Ref 5 : Eaufrance), pour l’année 2009, sur les 11 529 masses d'eau de surface des réseaux de surveillance français, 21% étaient classés en rouge (mauvais état chimique) et 34% étaient dans un état chimique encore indéterminé. Pour les eaux souterraines, sur les 574 masses d'eau de notre territoire, 41% sont classées rouge (mauvais état chimique). Vu que les pesticides agricoles contribuent largement à ce constat, un premier programme national Ecophyto 2009 -2018 (Réf. 6) se fixait comme objectif une diminution de 50% de la consommation de pesticides, mais a fourni peu de résultats en termes de diminution de vente et de consommation jusqu'à présent. Une nouvelle initiative ECOPHYTO II (Ref. 7) a donc été mise en place fin 2015, qui met davantage l'accent sur l'agriculture biologique, l'agroécologie et d'autres méthodes de culture alternatives.Un enjeu actuel important pour la durabilité des activités sociétales dans le respect de l’environnement est de mieux diagnostiquer et préserver la qualité des ressources naturelles. Au niveau de l’Union Européenne, la Directive Cadre sur l’Eau 2000/60/EC (Ref. 8) fixe un objectif de maintien ou de restauration de la qualité des eaux et des milieux aquatiques, sur la base des résultats des réseaux de surveillance institutionnels. Dans ce cadre, les diatomées benthiques sont l’un des compartiments biologiques-clés utilisés par les pays européens pour évaluer l’état écologique de leurs écosystèmes aquatiques.En France, l’IBD, mis au point par l’équipe proposante d’Irstea en 1996 et qui a fait l’objet d’améliorations régulières depuis cette date (Ref. 9 : Coste et al, 2009) est l’outil indiciel diatomique de référence normalisé (Ref. 10 : AFNOR 2007) qui est utilisé en routine dans les réseaux de surveillance nationaux pour évaluer la qualité générale des cours d’eau.Cette méthode biocénotique basée sur la composition spécifique des assemblages diatomiques diagnostique efficacement l’enrichissement ou l’altération générale des cours d’eau en liaison avec les activités humaines (eutrophisation, pollution organique, pollution chimique industrielle, etc…). Cependant, dans l’état, elle ne donne pas satisfaction pour diagnostiquer finement des effets de micropolluants toxiques. En effet, en fonction de la faible disponibilité de ce type de données à l’époque, elle n’a pas été calée sur les gradients de pollution toxique. De plus, selon le degré d’exposition in situ, des phénomènes d’adaptation peuvent se mettre en place (ex : Ref. 11 : Pesce et al, 2010), y compris sur des espèces réputées assez sensibles (ex : Ref. 12 : Roubeix et al, 2011 et Ref. 13 : Roubeix et al, 2012a), faisant perdre à la composition spécifique (espèces sensibles / vs tolérantes) une partie de son intérêt pour rendre fidèlement compte d’un niveau d’exposition toxique in situ.Si la piste de mise au point d’une méthode de bio-indication d’impact toxique basée sur la composition biocénotique n’est pas complètement abandonnée, les approches écotoxicologiques constituent une voie a priori plus porteuse et plus pertinente à court ou moyen terme pour l’évaluation judicieuse d’effets toxiques. En effet, elles offrent l’intérêt d’aborder la spécificité des phénomènes toxiques à l’espèce chimique et à l’espèce biologique, elles présentent une plus grande sensibilité et précocité de diagnostic, elles peuvent permettre une mise en relation plus étroite cause-effet en fonction de la spécificité des cibles cellulaires ou génomiques visées, etc…Cependant, certains auteurs (par exemple, Ref. 14 : Carafa et al, 2010) soulignent qu’il reste un besoin important de développements méthodologiques de ce type sur certains éléments clés de la qualité biologique de la DCE (c’est en particulier le cas sur les diatomées benthiques des rivières, où les développements en matière de biomarqueurs moléculaires, notamment, sont très récents), afin que ces techniques puissent être utilisées en routine dans les réseaux de surveillance.

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De nombreux travaux ont été conduits et publiés sur le développement de biomarqueurs et leur capacité à révéler des effets toxiques sur les organismes vivants de l'environnement, certains d'entre eux émanant des équipes de recherche impliquées dans le programme LIPID et dans l’encadrement de la présente thèse.S’ilsbiomarqueurs permettent de diagnostiquer de façon relativement fiable l’existence d’une altération toxique par comparaison avec une modalité-témoin (ex : amont-aval d’un rejet ponctuel, tests écotoxicologiques de laboratoire) ou par comparaison avec une situation naturelle non-impactée (site de référence), certains d’entre eux étant considérés comme des biomarqueurs génériques de stress (ex : biomarqueur EROD sur poisson), d’autres étant considérés comme plus spécifiques de certaines catégories de toxiques, leur niveau de réponse reste cependant variable en fonction du matériel biologique et des conditions environnementales (ex : sexe, taille, saison par rapport au cycle reproducteur, gamme de températures …) et du niveau de principe toxique présent dans l’environnement.Pour l’instant, ils sont donc surtout passés en application de routine via l’utilisation de tests standardisés en conditions contrôlées de laboratoire permettant d’évaluer le risque toxique lié à certaines substances.Afin d’être utilisés dans les réseaux de surveillance de routine pour une évaluation générale d’état écologique rendant plus spécifiquement compte du stress toxique, il faudrait à terme qu’il puisse être proposé une batterie assez complète de biomarqueurs permettant de situer la nature de toute une gamme d’effets toxiques potentiellement rencontrés dans les milieux aquatiques, ainsi qu’un cadre interprétatif prédéfini et normalisé servant de base à la mise en place de marchés publics de prestations de surveillance avec le secteur privé, ce qui n’est pas encore le cas à l’heure actuelle. C’est notamment pour ces raisons que ces biomarqueurs ne sont pas encore suffisamment passés dans l’application routinière normée des réseaux de surveillance (diagnostic in situ dans les hydrosystèmes) et c’est dans ce sens qu’il serait très utile d’approfondir les travaux pour que leur utilisation puisse venir appuyer et enrichir l’Evaluation d’Etat Ecologique mise en place dans le cadre de la DCE.

En ce qui concerne les écosystèmes terrestres, le LBM a mis au point des méthodes permettant une évaluation sensible des effets de substances toxiques (ex : métaux lourds, micro-polluants organiques de synthèse du type produits chimiques industriels, pesticides, ...) dans les sols pollués, à partir de l’interprétation de la composition en acides gras des feuilles des plantes terrestres. En application de ce nouveau champ de connaissances, deux types de méthodes de diagnostic ont été testés avec succès et sont proposés à une application de routine :

1) Des essais de toxicité ex-situ réalisées avec une plante modèle (Lactuca sativa) cultivées en conditions contrôlées sur des échantillons de sols pollués en comparaison à un témoin. Ce test a été normalisé AFNOR-(Ref. 15 : NF-T standard X31 233, 2012, Ed AFNOR); voir aussi (Ref 16 : Le Guédard et al 2008) ;2) L’analyse comparative de la composition en acides gras des feuilles de différentes espèces de plantes sauvages (par exemple Populus nigra, Lactuca seriola ...) directement échantillonnées dans les zones polluées (Ref 17: Le Guédard et al 2012a, Réf 18: Le Guédard et al 2012b, Ref 19: Le Guédard et Bessoule 2013). Ce test entre maintenant dans un processus de normalisation internationale ISO.

Compte-tenu de l’intérêt et de l’opérationnalité de ces résultats obtenus sur végétaux terrestres, une première approche exploratoire a été lancée en 2012 en collaboration entre le LBM et l'équipe CARMA d’Irstea, afin de tester si ce type de biomarqueur basé sur des profils lipidomiques de végétaux terrestres avait de bonnes chances d’être transférable sur le compartiment des diatomées des rivières.

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CONTROL ACETOCHLOR

Figure 1 :Profils lipidiques obtenus lors d’une expérimentation exploratoire d’exposition de la diatomée Surirella angusta

à l’Acétochlore (CARMA-LBM, 2012)

Les résultats préliminaires acquis sur l’espèce Surirella angusta (cf ci-dessus) ont montré une modification significative des profils d'acides gras après seulement 3 jours d'exposition à des concentrations réalistes d’acétochlore, les effets les plus évidents étant visibles sur des acides gras à longue chaîne intervenant dans les structures membranaires (diminution significative des C20 : 5, lipides de type Oméga 3).

Ce résultat n’est pas surprenant compte tenu du mode d’action connu de cette famille d’herbicides, les chloroacétanilides, qui perturbe les biosynthèses d’acides gras longues chaînes en liaison avec l’inhibition enzymatique des élongases. Ces premiers tests ont aussi permis d’observer un autre type de réponse significative au glyphosate, probablement basé sur la perturbation d’autres processus mais moins évident à interpréter d’emblée.

Ces résultats significatifs ont été obtenus alors que d’autres descripteurs généraux de toxicité classiquement employés pour traduire des effets sur la croissance végétale (par exemple biomasse, Chl.a, densité cellulaire...) n’étaient pas encore modifiés. Ces premiers résultats sont donc prometteurs en termes de chances de succès du transfert d’un tel biomarqueur, qui semble présenter le double intérêt de précocité et de sensibilité, et permettent aussi d’espérer une certaine spécificité de réponse de ce maillon diatomique à différentes catégories de substances toxiques.

S’agissant cette fois des écosystèmes aquatiques, l’examen des références scientifiques concernant l’évaluation des effets de la pollution toxique révèle que de nombreux biomarqueurs d'exposition ou d'impact toxique ont été testés et publiés depuis 20 ans, la plupart d’entre eux ayant été obtenus sur diverses espèces animales appartenant à des maillons biologiques-clés recommandés par la DCE (poissons, macro-invertébrés benthiques…).

Par ces approches, la détermination du niveau de transcription de gènes-clés impliqués dans des fonctions et voies métaboliques essentielles pour le fonctionnement cellulaire (biologie moléculaire transcriptomique) a largement démontré son intérêt pour évaluer les impacts moléculaires des micropolluants environnementaux.

Aussi, ce type d’approche a été utilisé avec succès pour évaluer les impacts toxiques des métaux lourds comme le cadmium ou le mercure, mais aussi de composés organiques tels que des molécules herbicides ou des HAP, sur plusieurs espèces de poissons-modèles (par exemple Ref 20 : Cambier et al, 2010 ; Ref 21 : Arini et al, 2015 ; Réf 22 : Dupuy et al, 2014), mais aussi sur bivalves d'eau douce Corbicula fluminea et Dreissena polymorpha (Ref 23 : Arini et al, 2014 ; Ref 24 : Santos et Martinez, 2014 ; Ref 25 : Châtel et al, 2014). Il convient de souligner que l'équipe EPOC-EA, qui participe au projet LIPID et à l’encadrement de la présente thèse, a été très impliquée dans ces nouveaux développements.

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Cependant, beaucoup moins de travaux ont été publiés vis-à-vis du développement de biomarqueurs sur le compartiment végétal des hydrosystèmes. Même si les génomes complets de 4 diatomées marines (Thalassiosira pseudonana, Phaeodactylum tricornutum, Pseudo-nitzschia multiseries et Fragilariopsis cylindrus) ont pu être séquencés ces dernières années (Ref 26 : JGI genome Portal), à notre connaissance, jusqu’à un passé très récent, aucun travail publié n’avait conduit au développement opérationnel de biomarqueurs d’effets toxiques sur les diatomées benthiques d'eau douce.

Une difficulté méthodologique pour l'extraction des ARN, qui nécessitait une rupture ménagée des parois des frustules siliceux en respectant le contenu intracellulaire, a été résolue par Kim-Tiam et al, 2012 (Ref 27). Une fois cette étape préalable maîtrisée et dans le cadre du même travail, une approche transcriptomique s’appuyant sur l'ARN total a permis à cette équipe EPOC-EA, d'identifier 9 gènes d'intérêt pour la détection des effets toxiques d'un métal lourd (Cd) sur l'espèce Eolimna minima, et de conforter le repérage de ces gènes sur d’autres espèces d'eau douce en culture. Puis, dans le cadre partenarial inter-équipes EA-CARMA, Moisset et al, 2015 (Ref. 28) ont utilisé avec succès ces gènes pour évaluer la toxicité du diuron (herbicide, famille des urées substituées) sur 3 espèces de diatomées de cours d’eau.

D'autres descripteurs plus généraux de toxicité ont été utilisés sur les diatomées d'eau douce depuis les années 1995 jusqu’à maintenant, afin d'évaluer les gradients de pollution toxiques, de démontrer des effets in situ et en laboratoire, d’évaluer des dispositifs de remédiation des cours d'eau pollués... (voir en Réf. 29, la large revue de Morin et al 2016).

Selon le cas, les descripteurs utilisés étaient des paramètres structuraux (taille et/ou biovolumes des cellules), des descripteurs de croissance (matière sèche des biofilms, quantité de chlorophylle a produite…), la composition des communautés, le nombre de frustules portant des déformations tératologiques etc...Les produits toxiques abordés ont principalement été : 1) des métaux lourds (par exemple, Ref 30 : Gold et al, 2002 ; Ref 31 :Gold et al, 2003 ; Ref 32 : Feurtet-Mazel et al, 2003 ; Ref. 33 : Morin et al, 2008 ; Ref 34 : Duong et al, 2010 ; Ref 35 et 36 : Arini et al, 2012a et 2012b ; Réf. 37 : Herlory et al, 2013, sur le cas spécifique des radionucléides ...); 2) des pesticides (par exemple Ref 38 : Peres et al, 1997; Ref 39 : Duong et al, 2006; Réf. 40 : Duong et al, 2007; Ref 41 : Debenest et al, 2009; Ref 42 : Morin et al, 2009; Ref 43 : Roubeix et al, 2011a; Ref 44 : Roubeix et al, 2011b, ...). Plus récemment, les biomarqueurs fonctionnels ont aussi pu être testés avec succès et utilisés, par exemple des changements dans les activités enzymatiques antioxydantes (Ref 45 : Bonnineau et al, 2013; Ref 46: Kim-Tiam et al, 2015a)., sur l'efficacité photosynthétique et les taux de transfert d'électrons dans les photosystèmes (Ref 47 : Kim Tiam et al., 2015b)...Un bon nombre des travaux pré-cités (cf références soulignées de la liste de références plus complètes, consultable à partir de la page 15 du présent document) ont été produits par des équipes du consortium LIPID et attestent de leur expérience en ce domaine, les rendant tout-à-fait aptes à réaliser le programme proposé et à encadrer avec succès la présente thèse.

II- Problématique et objectifs de la thèseComme indiqué dans le descriptif de contexte de l’Etat de l’Art, le compartiment des diatomées benthiques a été utilisé depuis plus de 20 ans dans les réseaux de surveillance nationaux pour diagnostiquer la qualité des cours d’eau et a depuis été logiquement recommandé par la DCE (Ref. 8 : WFD, 2000) comme l’un des maillons biologiques-clés pour l’évaluation de l’Etat Ecologique des cours d’eau.

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Les indices diatomiques basés sur la composition spécifique des communautés (de type IPS, IBD…) permettent une évaluation fiable de la qualité des eaux vis-à-vis de pollutions physico-chimiques générales et de l’enrichissement anthropique des cours d’eau (altération organique et eutrophisation) et sont passés dans la pratique courante des réseaux de surveillance. Par contre, pour différentes raisons, ils ne permettent pas de procurer un diagnostic correct d’altération toxique in situ.

Dans cet objectif, il apparaît plus porteur pour l’avenir d’aborder l’évaluation des pollutions toxiques à partir d’approches expérimentales dérivées de l’écotoxicologie, qui devraient permettre une évaluation plus spécifique, plus précoce et plus sensible de ce type d’effets.

Dans notre contexte national, les réseaux de surveillance ont bien montré le niveau général important de pression et de pollution pesticide lié à différentes activités anthropiques (notamment agriculture, jardins privés, entretien de zones périurbaines par les collectivités publiques, sociétés gestionnaires d’infrastructures de transport de type SNCF, compagnies autoroutières etc…). Ils ont aussi permis de pointer le niveau particulièrement élevé de pression lié à certains types d’activités agricoles intensives, comme les cultures de vergers fruitiers et la viticulture, en fonction de la nature et du nombre important des interventions phytosanitaires qui y sont réalisées annuellement.

C’est dans ce contexte que, dans le sillage et en renforcement du programme PHYTOCOTE accepté au 1er semestre 2015 par le LabEx COTE, le programme LIPID et la présente thèse s’intéressent à l’évaluation de l’effet environnemental des pollutions toxiques anthropiques sur les milieux naturels d’un écosystème-atelier situé en contexte viti-vinicole (bassin-atelier situé dans le vignoble du Blayais, dans le secteur de Marcillac - 33 - ).

Comme mentionné en première moitié de page 6, des démarches expérimentales basées sur le compartiment diatomique benthique ont déjà été menées depuis une vingtaine d’années dans l’objectif de mieux diagnostiquer l’impact de pollutions toxiques (métaux lourds, pesticides agricoles etc…) sur la microflore des cours d’eau. Même si des changements significatifs de composition des communautés diatomiques multispécifiques des cours d’eau ont pu être mis en relation avec des contaminations toxiques, en conditions naturelles in situ (ex : Ref. 48, Roubeix et al, 2010) comme en microcosmes de laboratoire (ex : Ref. 44, Roubeix et al, 2011b), il est difficile d’attribuer exclusivement ces changements de composition des communautés à l’effet de molécules toxiques, dans un contexte d’influences souvent multifactorielles pouvant agir conjointement sur la croissance et la compétition des différentes espèces de producteurs primaires phototrophes (conditions de milieu dont vitesse de courant, température, éclairement, niveau d’enrichissement des cours d’eau en nutriments etc…).De plus, l’acquisition de tolérance est également susceptible de venir moduler la réponse des espèces composant une communauté multispécifique et d’influer sur la composition de l’assemblage.

Afin de maîtriser l’effet des variables confondantes, les approches publiées ayant donné les résultats les plus incontestables en termes de démonstration d’effets toxiques sur diatomées benthiques (cf plusieurs références sur le maillon diatomique citées dans l’Etat des Lieux bibliographique) ont souvent été menées en conditions contrôlées d’exposition au laboratoire, et aussi très souvent à partir de peuplements monospécifiques issus de cultures diatomiques préalablement isolées à l’espèce et remultipliées. Elles ont permis d’obtenir des réponses plus ciblées sur certains end-points, moins bruitées et au final, plus interprétables vis-à-vis du gradient d’exposition aux molécules toxiques d’intérêt. Ce type d’approche simplifiée en conditions contrôlées, qui garantit le mieux l’exploitabilité des résultats obtenus, occupera une place importante dans le programme expérimental de la thèse LIPID.

En résumé synthétique, des impacts de substances toxiques sur des flores diatomiques ont pu être démontrés à partir :

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1) de descripteurs globaux de croissance et de biomasse des biofilms phototrophes (MS, MSSC, densités cellulaires, teneur en pigments chlorophylliens…) ;

2) de descripteurs morphométriques et morphologiques des diatomées (dimensions des frustules, biovolumes, dénombrements de déformations tératologiques…) ;

3) de l’altération de la fonction photosynthétique, via diverses modalités de mesure d’impact physiologique permises par l’utilisation d’un fluorimètre PAM ;

4) enfin, sur la base des compétences maîtrisées sur d’autres maillons biologiques par l’Equipe EPOC/EA et nouvellement adaptées à ce maillon diatomique, par l’utilisation d’approches de biologie moléculaire mettant en œuvre des biomarqueurs transcriptomiques.

Par ailleurs, un biomarqueur lipidomique mis au point depuis quelques années pour l’évaluation de la pollution toxique des sols à l’aide de végétaux terrestres (laboratoire LBM) et d’ores et déjà transféré (norme AFNOR, norme ISO en préparation…), avait fait l’objet en 2012, en collaboration avec CARMA, d’un test exploratoire prometteur sur diatomées, montrant des effets très significatifs et attendus vis-à-vis de l’Acétochlore (action de réduction de biosynthèse d’acides gras de structure à longues chaînes, de type Oméga 3) et d’autres effets, significatifs mais dont la localisation dans les profils est différente et dont les mécanismes restent largement à éclaircir, vis-à-vis du Glyphosate.

La composition lipidique des micro-organismes phototrophes, et notamment de certaines diatomées marines, suscite un intérêt important sur le plan économique et sociétal. En effet, la production en masse de certaines espèces d’intérêt est susceptible de constituer une matière première intéressante pour des usages alimentaires animaux ou humains (ex : les spirulines), ou cosmétiques, ou pour la production de biofuels de 3ème génération. Aussi, des démarches visant à préciser l’intérêt comparé de différentes espèces comme ressource lipidique donc été publiées (ex : Ref. 49 : Cadoret et al, 2008), et font aussi état de conditions particulières d’élevage permettant d’amplifier la production de lipides de réserve (notamment, recours à un stress azoté, utilisation de souches génétiquement modifiées…).

Les analyses chimiques auxquelles il est fait référence dans ce cadre visent principalement à quantifier très globalement les lipides neutres de réserve, les plus intéressants vis-à-vis de ces usages biotechnologiques. Afin de permettre un screening plus rapide et moins coûteux des quantités de lipides neutres produits, une alternative aux méthodes analytiques classiques (extraction liquide-liquide utilisant des solvants organiques lipophiles, souvent toxiques pour l’homme et l’environnement, suivie d’une mise en œuvre de méthodes chromatographiques en phase gazeuse ou liquide, selon thermo-sensibilité des gammes de composés-cibles, souvent couplées avec spectromètre(s) de masse) a été publiée, qui met en œuvre des fluorochromes à forte affinité avec les lipides neutres (Ref. 50 : Rumin et al, 2015). Cette référence indique les conditions optimisées de mise en œuvre de la méthode et fait état de conditions particulières de mise en œuvre en vue d’interprétation quantitative, ainsi que vis-à-vis de certains lipides plus problématiques.

Quoi qu’il en soit, ces méthodes de quantification globale à finalité biotechnologique ne sont pas adéquates pour la réalisation de profils lipidomiques détaillés qui visent à passer en revue tous les lipides cellulaires susceptibles de renseigner sur l’impact d’une pollution toxique, qu’il s’agisse de lipides de réserve ou de lipides de structure constitutifs des membranes végétales. De telles analyses de screening lipidique détaillé sont maîtrisées de longue date par notre partenaire LBM sur des matrices végétales terrestres et leur applicabilité sur diatomées des eaux douces selon le même principe a déjà pu être testée avec succès lors des premières expérimentations exploratoires de 2012 (cf Figure 1), suivies d’autres réalisations expérimentales datant de 2014.

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De plus, afin d’approfondir l’étude des modifications observées sur le spectre lipidique, il sera possible en s’appuyant sur la plateforme lipidomique de Bordeaux et la cellule de transfert LEB, de caractériser des molécules lipidiques d’intérêt spécifique pour le diagnostic d’effets toxiques sur diatomées, via des analyses structurales détaillées.

Même si l’intérêt de la biologie moléculaire a encore été très peu prospecté pour l’instant pour la révélation d’effets toxiques sur micro-algues (dont diatomées), contrairement aux maillons animaux (poissons, bivalves etc…), l’accès aux données génomiques et protéomiques de ces micro-organismes phototrophes suscite un intérêt croissant et ouvre de nouvelles perspectives (par exemple : REF 51 : Cadoret et al, 2014), dans une finalité très souvent orientée usages biotechnologiques, centrée sur la caractérisation de gènes d’intérêt et des protéines correspondantes intervenant dans une fonction intéressante, par exemple (REF 52 : Garnier et al, 2014) la production accrue de lipides neutres de réserve de Tisochrysis lutea sous l’action d’un stress de carence azotée. L’intérêt de ces approches est d’arriver à mieux comprendre les éléments de fonctionnement cellulaire conduisant au résultat intéressant sur le plan biotechnologique, afin d’en tirer parti pour l’optimisation des conditions d’élevage, ou même d’utiliser les gènes d’intérêt après introduction dans un organisme génétiquement modifié plus approprié aux conditions de production.

Concernant l’utilisation des lipides au service du diagnostic de toxicité sur le compartiment micro-algal aquatique, la bibliographie ne fait pas encore état de mises au point méthodologiques du type de celles développées sur végétaux terrestres par Bessoule et al. au LBM (ex : Refs 15 à 19 précitées). Une publication relativement ancienne (Ref. 53 : Perrein-Ettajani et al, 1999) examinait les réponses d’une batterie de descripteurs (divers indicateurs de croissance, composition métabolique etc…) pour rendre compte des effets de l’Ag, du Cd et du Cu sur 2 micro-algues marines Skeletonema costatum et Tetraselmis sueica. l’intérêt sociétal particulier attaché à ces espèces était qu’elles sont cultivées et très utilisées en ressource alimentaire pour des élevages de bivalves marins. Alors que plusieurs descripteurs de croissance étaient affectés à la baisse par ces métaux lourds, les résultats de composition métabolique (teneur globale en glucides, protides, lipides) étaient moins univoques et peu interprétables. Pour les lipides, notamment, toutes les cultures contaminées de l’algue verte T. suecica présentaient des teneurs supérieures aux témoins mais non significatives sauf pour le Cd (p < 0,01), alors qu’aucune influence significative des métaux n’était constatée chez la diatomée S. costatum. Cela est révélateur de l’aspect inapproprié d’analyses trop globales pour pouvoir en tirer des informations précises sur les mécanismes toxiques mis en cause dans l’altération d’un fonctionnement cellulaire.

Une autre publication très récente (Ref. 54 : Pandey et al, 2016) s’appuie sur divers descripteurs d’effet toxique sur diatomées dont l’intérêt était ressorti de publications antérieures (notamment : 1) effets sur la structure de communautés via l’indice de Shannon, la richesse spécifique l’evenness… ; 2) taille et déformations de frustules ; 3) ratio caroténoïdes / Chl.a ; 4) effets sur la motilité des diatomées ; et 5), ce qui rejoint quelque part notre sujet, nombre et taille des corps lipidiques) pour révéler l’effet toxique chronique du Cu et du Zn dans les hydrosystèmes d’eau douce. Le propos de l’auteur est de mettre en avant des descripteurs non taxonomiques, plus rapides, économiques et efficients à collecter selon lui que d’autres descripteurs révélateurs d’effets toxiques. Le ratio caroténoïdes / Chl.a, les descripteurs nombre et taille des corps lipidiques, feraient partie de ces descripteurs d’intérêt.

La philosophie d’appréhension des effets toxiques est très différente entre cet article (ratio chimique très global, comptage et mesure d’organites de stockage intracellulaire de lipides neutres de réserve) et ce qui est envisagé dans ce sujet de thèse (établissement de profils lipidomiques détaillés à partir du contenu cellulaire diatomique, permettant de repérer les fonctions de biosynthèses altérées par les expositions toxiques dans un bassin versant viticole).

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Cependant, les résultats obtenus au moyen de ces descripteurs assez globaux (effets morphologiques quantitatifs sur les corps lipidiques, ratio caroténoïdes / pigments chlorophylliens) suggèrent aussi que des métabolismes impliquant des substances lipidiques ont pu été affectés par l’effet toxique de 2 métaux lourds (Cu, Zn) sur les espèces de diatomées d’eau douce étudiées par cet auteur. Cela conforte l’intérêt potentiel du lipidome comme témoin pertinent d’effets toxiques sur le métabolisme des diatomées, comme cela a déjà été le cas sur végétaux terrestres.

Dans ce contexte, en se basant sur l’expérience pré-existante du LBM-LEB sur végétaux supérieurs terrestres, et sur celles de l’Equipe CARMA et de l’Equipe EPOC-EA sur les divers marqueurs de toxicité dont ils détiennent la pratique qui ont déjà permis d’illustrer des impacts toxiques sur diatomées, le présent projet de thèse, très exploratoires sur un nouveau maillon biologique mais à perspectives réelles de retombées appliquées à terme, vise à étudier et à situer l’intérêt d’un nouveau biomarqueur lipidomique utilisant les réponses des diatomées benthiques des cours d’eau pour procurer un diagnostic environnemental judicieux d’effet toxique des produits phytosanitaires.

L’organigramme synthétique du programme de thèse est présenté en Figure 2 ci-dessous.

Figure 2 : Organigramme résumé de la démarche de thèse LIPID (en relation avec le projet Phytocote)

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Faisant partie intégrante du projet LIPID, ce programme de thèse s’appuiera notamment sur les informations contextuelles de terrain (pratiques agricoles, nature et niveau de pollution des cours d’eau par des molécules phytosanitaires) procurées par le programme PHYTOCOTE sur le bassin versant viticole-cible (bassin atelier de Marcillac – 33- ).

Les principaux objectifs de ce travail de thèse sont les suivants :

1) Confirmer, démontrer statistiquement et comprendre les mécanismes sous-jacents aux changements significatifs de profils lipidiques cellulaires occasionnés sur diatomées par une exposition expérimentale à des concentrations connues de produits phytosanitaires en conditions contrôlées de laboratoire, afin de prospecter l’intérêt général et l’éventuelle généricité de cette nouvelle piste méthodologique pour la diagnose d’effets toxiques ;

2) Participer au diagnostic environnemental d’impact des pratiques phytosanitaires au niveau du bassin versant viticole cible, par un couplage étroit entre démarches expérimentales d’exposition de diatomées in situ (via un dispositif d’encagement en cours de mise au point) et reproduction d’expositions réalistes en conditions contrôlées de laboratoire visant à confirmer le niveau de risque écotoxicologique encouru ;

3) En s’aidant de la bibliographie scientifique disponible et des résultats qui seront obtenus conjointement par d’autres descripteurs d’effet dans le cadre du même programme expérimental, formuler les hypothèses (métaboliques, physiologiques…) ou formaliser les mécanismes susceptibles de sous-tendre les effets observés au niveau du lipidome,

4) Après adaptation du cadre interprétatif des profils lipidiques au cas spécifique des diatomées benthiques, qui doit différer assez sensiblement par rapport à celui déjà connu du maillon des végétaux terrestres supérieurs (monocellulaires aquatiques isolés ou coloniaux versus organismes pluricellulaires terrestres différenciés en tissus spécialisés), cadrer et valider la transférabilité de ce biomarqueur lipidomique à ce nouveau maillon, et situer son intérêt par rapport aux autres descripteurs d’effets toxiques testés sur diatomées.

Les travaux se baseront sur un petit nombre de molécules phytosanitaires d’intérêt dont le choix final sera arrêté suite aux premiers constats des niveaux effectifs de contamination des cours d’eau observés au niveau du bassin-atelier de la Livenne, situé dans le vignoble du Blayais (Marcillac, 33).

Les suivis de contamination chimique des hydrosystèmes du bassin vont prochainement débuter dans le cadre du programme PHYTOCOTE (2ème semestre 2016). Les 3 ou 4 molécules à sélectionner devront :

1) être utilisées et suffisamment retrouvées dans l’écosystème aquatique de ce BV,2) présenter une toxicité connue et effective sur le maillon diatomique et sur l’environnement,3) présenter un intérêt théorique au titre de substance-modèle et/ou de mode d’action,4) être analysables en routine et ne pas poser de problème particulier générant des difficultés inutiles sur le déroulement du programme expérimental.

Compte-tenu de l’intérêt théorique de ce métal lourd et de son omniprésence en zones de vignoble, le cuivre, fongicide organo-minéral très utilisé pour la lutte contre le mildiou de la vigne, devrait logiquement faire partie de cette sélection.

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S’y ajouteront probablement 2 à 3 molécules herbicides de familles et/ou modes d’action différents (les diatomées, qui appartiennent au règne végétal, ont de plus fortes chances de subir des impacts de molécules toxiques herbicides…) et/ou (à voir selon contexte et intérêt) une molécule-modèle faisant partie des fongicides organiques de synthèse.

Le programme de travail de cette thèse comporte 2 volets expérimentaux basés sur une approche différente :

Volet 1 : Expositions contrôlées de laboratoire : Afin de favoriser l’obtention de résultats reproductibles et interprétables, une partie importante des réalisations expérimentales seront conduites en conditions contrôlées et simplifiées d’exposition au laboratoire, s’appuyant sur une liste courte de substances-modèles sélectionnées à partir de la réalité terrain (cf éléments préalables de choix ci-dessus) et sur des souches pures de diatomées isolées et cultivées en laboratoire. Il s’agit dans un premier temps de vérifier l’effectivité et la reproductibilité de la réponse lipidique des espèces de diatomées testées à l’exposition toxique dans un contexte simplifié (exposition mono-espèce et mono-substance), de situer la zone des concentrations efficaces et de vérifier conjointement les réponses obtenues vis-à-vis d’autres descripteurs d’effet déjà maîtrisés par les équipes participantes.

En fonction de la qualité des premiers résultats obtenus et d’informations complémentaires de suivi émanant du bassin versant viticole, il sera possible par la suite d’évoluer vers une complexification modérée des modalités expérimentales apportant plus de réalisme environnemental (par exemple, types de réponses de plusieurs espèces à sensibilité différente, intervention conjointe de plusieurs substances, ce qui est presque toujours le cas dans les hydrosystèmes réels…). Le choix des modalités à tester, forcément limitées en nombre compte-tenu de la lourdeur de tels programmes, devra être judicieux afin de ménager les possibilités d’interprétation des résultats sur le plan théorique. En particulier, il pourra être statué sur la logique interne des différents descripteurs suivis pour chaque modalité expérimentale et sur les hypothèses explicatives (génomiques, métaboliques, physiologiques). Un autre aspect intéressant à éclairer concerne les principes de cumul d’effets toxiques des substances testées en mélange, dimension pas du tout pris en compte à l’heure actuelle pour la fixation des NOEC et pour l’interprétation des résultats des réseaux de surveillance. Volet 2 : Diagnostic direct d’impact toxique in situ. Il est prévu de l’aborder à l’aide d’un dispositif d’encagement de diatomées dérivé de la connaissance acquise sur le POCIS et dont le développement méthodologique, actuellement en cours, sera finalisé durant la première année de la thèse. Une fois au point, ce dispositif offrira l’avantage de pouvoir ensuite être exposé de façon standardisée dans les conditions réelles du terrain, à différents endroits stratégiques du bassin versant expérimental, et permettre un diagnostic direct d’effets toxiques occasionnés sur les diatomées encagées par l’assortiment de molécules toxiques réellement présentes dans le cours d’eau à la station. Parallèlement, l’exposition réellement subie par les diatomées à l’intérieur des dispositifs devrait être approchée par l’analyse concomitante du contenu de capteurs passifs POCIS, dotés des mêmes membranes en PES (PolyEtherSulfone), dans le cadre des synergies entre les 2 programmes PHYTOCOTE et LIPID.

L’exploitation des résultats de ce programme et des investigations complémentaires éventuellement nécessaires pour approfondir la compréhension des mécanismes (par exemple, structure exacte de lipides diatomiques métabolisés à terme, ou s’accumulant suite à l’inhibition d’une biosynthèse du fait d’un mécanisme toxique, repérage de l’activité enzymatique perturbée, remontée si possible à la séquence génique mise en jeu) permettra :

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- de statuer, avec un maillon environnemental sensible, sur l’intensité des phénomènes toxiques ressentis dans l’écosystème aquatique en fonction d’effets non intentionnels des pratiques phytosanitaires réalisées sur la vigne. Vis-à-vis d’objectifs plus généraux des 2 programmes PHYTOCOTE et LIPID, ces résultats de thèse seront intéressants à connaître et à intégrer dans le sens d’une meilleure durabilité environnementale des pratiques viticoles,- de confronter les résultats et de situer le niveau de performance du biomarqueur lipidomique par rapport à d’autres types de descripteurs écotoxicologiques déjà maîtrisés par les équipes, en termes de de précocité, de sensibilité, de reproductibilité et de robustesse.- en fonction de l’intérêt des résultats obtenus au sens de la détection et /ou de la quantification des impacts toxiques, d’initier un volet plus finalisé de ce travail de thèse, qui vise à valider le transfert de ce type de biomarqueur vers cette nouvelle application diatomique et à en préfigurer le processus de diffusion, en faisant ressortir les spécificités et particularités par rapport aux végétaux supérieurs terrestres, les clés de compréhension sur le plan physiologique ou du fonctionnement cellulaire des principaux types de réponses lipidomiques observées en cours de programme, et en commençant à formaliser un prototype de cadre interprétatif standardisé des résultats.

III- Aspects innovants de cette thèse

- Cette piste d’utilisation des profils lipidiques des diatomées pour le diagnostic d’impact toxique en systèmes aquatiques est à notre connaissance complètement inédite et innovante. Par ailleurs, même si elle a déjà fait l’objet par le LBM de 2 développements opérationnels sur végétaux supérieurs terrestres, déjà normalisés, transférés et mis en œuvre pour le diagnostic de toxicité en sols pollués, il est fortement vraisemblable que ce maillon biologique très différent (unicellulaire, aquatique, d’un embranchement phylogénétique très ancien…) présente ses propres spécificités qu’il faudra apprendre à connaître, à analyser et à interpréter. Le parallèle apparent de la démarche n’exclut pas une acquisition importante de connaissances nouvelles, en fonction des grandes différences biologiques et écologiques de ces 2 types de maillons.

- Même si la quantité de matériel végétal analysable par réplicat de modalité expérimentale présentera nécessairement des limites en termes de descripteurs d’effets qu’il sera possible de caractériser de façon concomitante, pour cause de quantité limitée de biomasse disponible à terme, la complémentarité des approches et descripteurs qui pourront acquis au cours de ce programme, en fonction des spécificités de positionnement des 3 équipes participantes, devrait être très riche d’enseignements concernant les processus toxiques en jeu et les mécanismes mis en place par les diatomées en conséquence de, ou en réponse à ces effets toxiques. En effet, selon les cas, le doctorant devrait pouvoir confronter :

+ des descripteurs globaux plutôt représentatifs de la croissance, très intégrateurs (densités cellulaires de diatomées, MS, teneur en Chla etc…),+ des mesures directes d’une fonction, rendant compte de processus d’activation ou d’altération d’un mécanisme cellulaire de base pour un organisme phototrophe (photosynthèse),+ des résultats du repérage d’activation ou d’inhibition transcriptomique de certaines fonctions cellulaires et/ou physiologique sous l’effet toxique des molécules phytosanitaires testées, les gènes observés correspondant à des fonctions cellulaires-cibles donnant des informations particulièrement intéressantes sur les mécanismes toxiques en cause (ex : affectation du métabolisme énergétique, stress oxydatif - très probable dans le cas du Cu - etc…),

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+ des résultats de profils lipidiques de diatomées très intégrateurs, mais aussi probablement très spécifiques, en réponse métabolique aux phénomènes toxiques résultant de la nature (et de l’intensité ?) de l’exposition subie.

- la biologie moléculaire transcriptomique est une voie prometteuse faisant l’objet de nombreux développements en écotoxicologie depuis une bonne dizaine d’années, du fait de sa spécificité et de sa précocité qui permettent de bien mettre en correspondance la présence d’un toxique et les mécanismes cellulaires impactés (lien assez direct et précis entre nature de l’exposition et type d’effet). Cependant, il est quelquefois objecté que la mesure d’une induction transcriptomique ne donnerait pas forcément une vision suffisamment fidèle du niveau d’exposition ou de l’effet toxique réellement subis. En effet, les cinétiques d’induction peuvent dépendre assez sensiblement de l’organisme-modèle utilisé, elles peuvent être très rapides et fugaces dans le temps, ou plus durables. Dans un réseau de contrainte sur le coût des expérimentations et analyses, le choix d’un temps expérimental de contrôle est donc quelque part un compromis qui ne tombe pas forcément au mieux par rapport à l’induction ou à la répression mise en jeu. De plus, l’adaptation de l’organisme à une exposition préalable peut moduler l’induction à une nouvelle exposition. Enfin, l’intervention rapide de mécanismes d’induction en réaction à la présence d’un toxique ne serait pas forcément proportionnée vis-à-vis de l’intensité réelle du polluant et de sa durée de présence dans l’environnement. La réponse transcriptomique (production d’ARN suite à l’action de transcriptases, qui intervient en amont des biosynthèses) peut ensuite être modulée en fonction des besoins réels de la cellule, qui est équipée pour pouvoir lancer des processus de régulation par rétro-action.

De son côté, le nouveau biomarqueur lipidique se situe à un autre niveau du métabolisme (en aval des biosynthèses ou blocages enzymatiques résultant des processus toxiques) et serait susceptible de donner une réponse plus intégrative du résultat des inductions, puis du feed-back intra-cellulaire de régulation. Les premiers tests pratiqués ont révélé son intérêt en termes de sensibilité et de précocité (à comparer plus directement avec celles des biomarqueurs transcriptomiques). Il reste à voir si ce positionnement différent et plus aval dans le fonctionnement cellulaire lui donne un avantage en termes de fidélité par rapport au niveau d’exposition toxique appliqué.

Quoi qu’il en soit, cette comparaison et mise en perspective de différents biomarqueurs d’effets toxiques sur diatomées des eaux douces, qui se situent à différents niveaux d’intégration biologique ou physiologique des processus, n’a jamais été faite. Elle donnera certainement une vision différente et complémentaire des effets toxiques s’exerçant sur ce maillon biologique, et les résultats à différents niveaux du fonctionnement cellulaire permettront probablement d’émettre des hypothèses explicatives plus riches et mieux renseignées vis-à-vis des processus d’effet toxique et des réponses cellulaires en jeu. Elle devrait produire des résultats très innovants et très riches, et devrait notamment permettre d’amener des éléments inédits de mise en perspective du positionnement et de l’intérêt relatif de ces différentes catégories de descripteurs.

En écotoxicologie, il est souvent fait recours à l’encagement d’organismes-modèles, souvent issus de conditions non contaminées, pour évaluer l’impact d’effets toxiques in situ. Jusqu’à présent, en raison de la difficulté liée à la très petite taille de ces organismes, ce type d’évaluation in situ n’a pas été développé sur diatomées benthiques ou planctoniques, sur cyanobactéries, sur micro-algues vertes, ne laissant que le recours à des tests ex-situ ou à l’analyse directe des communautés multispécifiques exposées dans le milieu naturel pour y évaluer des effets toxiques.

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Une innovation potentiellement importante de ce sujet de thèse, si l’approche méthodologique est couronnée de succès, va être de finir de développer, puis d’utiliser sur le terrain un dispositif d’encagement des diatomées dont la philosophie de confinement et de mise en contact entre toxique et micro-algues s’appuie sur des membranes semi-perméables en PES déjà utilisées pour le capteur passif POCIS. Le contenu biologique du dispositif sera constitué d’une culture pure monospécifique de diatomées (on peut aussi imaginer à terme un mix d’une espèce sensible et d’une espèce tolérante), et les résultats d’exposition toxique obtenus dans le dispositif de confinement pourront être assez directement estimés au moyen de POCIS (partenariat entre les projets PHYTOCOTE et LIPID) permettant dans le même temps l’échantillonnage intégratif de l’eau écoulée au même site.

Jusqu’à présent, qu’il s’agisse de végétaux terrestres supérieurs ou du principal essai exploratoire déjà réalisé sur diatomées avec l’acétochlore, les interprétations de changement sur le lipidome occasionnés par des micropolluants toxiques ont souvent été constatés par rapport aux biosynthèses d’acides gras longue chaîne (lipides de structure intervenant dans les constructions membranaires), et les 2 indices terrestres proposés étaient construits à partir de la proportion d’Omégas 3 par rapport aux lipides totaux. L’altération de la fonction de production d’Omégas 3 du fait de l’action de produits toxiques dans l’environnement représente un problème en soi car les organismes végétaux photosynthétiques, du phytoplancton marin aux végétaux arborescents terrestres, sont les seuls êtres vivants à la base de tout l’édifice trophique à produire ces lipides, qui sont une part obligatoire de la ressource alimentaire dans l’alimentation de l’édifice trophique animal (les animaux ne sont pas capables de les synthétiser). Il est probable que les résultats de cette thèse fassent largement état d’effets toxiques sur le lipidome affectant notamment la production d’Omégas 3, comme déjà observé pour l’Acétochlore lors du premier test exploratoire. Cependant, il n’est pas exclu aussi que d’autres molécules toxiques, comme le cuivre ou certains désherbants agissant sur d’autres métabolismes (ex : glyphosate…) provoquent des altérations de lipidome au niveau d’autres types d’acides gras (dont lipides de réserve). Il conviendra de ne pas négliger cette possibilité d’effets, dont le constat serait novateur et témoignerait d’une aptitude encore plus intéressante qu’attendu du lipidome à révéler et à résumer une très large gamme d’effets toxiques.

Un dernier aspect qui pourrait amener des résultats très intéressants et novateurs sera de tester, en complément de l’application de substances pures, l’effet de mélange, en combinaisons doubles et triples, de plusieurs matières actives déjà entrées dans leur zone de toxicité, afin d’étudier les principes de cumul des toxicités. Cette connaissance, insuffisante à l’heure actuelle, serait utile en vue de raisonner plus judicieusement l’évaluation des risques provoqués par un cumul de matières actives toxiques. En effet, la contamination multiple est le cas de figure dominant dans nos hydrosystèmes nationaux et pour l’instant, l’évaluation du risque toxique à partir des résultats de nos réseaux de surveillance se fait en regardant si la NOEC substance par substance est dépassée ou non, de façon indépendante et sans aucun principe de cumul d’effet des faibles doses rencontrées, au-delà de la protection censée être assurée par les facteurs de sécurité intervenant dans le calcul des NOEC. Il est possible que cette façon de faire ne se révèle pas suffisamment protectrice, par exemple en cas de constat d’effets toxiques synergiques.

IV- Echéancier de déroulement des travaux

Les travaux s'échelonneront sur trois années, selon le calendrier suivant :

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Première année :- Bibliographie

- Mise en culture de souches pures de diatomées présentes dans les hydrosystèmes-cibles

- Prise de connaissance des conditions de contamination de terrain (cf PHYTOCOTE), sélection finale des molécules phytosanitaires d'intérêt

- Volet 1   : Réalisation d’expérimentations pour situer la toxicité des molécules sélectionnées en conditions d’exposition contrôlée de laboratoire avec un assortiment de descripteurs écotoxicologiques incluant le biomarqueur lipidomique, en commençant par les molécules simples.

- Volet 2   : Mises au point méthodologiques et tests d’utilisabilité du dispositif d’encagement des diatomées, d’abord en conditions contrôlées de laboratoire puis premiers essais d’exposition in situ dans les cours d’eau du Blayais.

Deuxième année : - Volet 1 : Suite des expérimentations d’exposition des molécules sélectionnées en conditions contrôlées de laboratoire, avec complexification des modalités d’exposition (combinaison de produits, diversification des espèces de culture)

- Volet 2 : exposition de diatomées encagées in situ en recherchant le couplage avec les suivis PHYTOCOTE, caractérisation des conditions d’exposition dans les cours d’eau et des effets écotoxicologiques (biomarqueur lipidomique comparé à d’autres descripteurs)

- premières valorisations scientifiques (communications colloque, préparation d’un premier article, par exemple un article méthodologique sur le dispositif d’encagement).

Troisième année : - Fin des expérimentations écotoxicologiques des 2 volets laboratoire et in situ, en fonction des questionnements et informations complémentaires nécessaires au vu des résultats,

- Analyse des données

- Comparaison et mise en perspective des résultats, atouts et complémentarités des différents descripteurs utilisés, synthèse sur la transférabilité et rédaction d’un premier prototype de cadre interprétatif du biomarqueur lipidomique sur diatomées,

- Communication scientifique (colloques, articles)

- Rédaction et soumission du manuscrit, soutenance avant la fin d’année.

V- Aspects liés aux conditions de réalisation de la thèse

L'encadrement et le déroulement de cette thèse s'inscrivent dans une stratégie partenariale prioritaire du LabEx COTE en termes d'école doctorale cible ("Sciences et Environnements ", Université de Bordeaux) et de laboratoires partenaires (Irstea, EPOC-EA), ainsi que dans une stratégie spécifique d’intensification de partenariat avec le LBM (développement du biomarqueur lipidomique sur diatomées benthiques d’eau douce).

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Ce projet de thèse est financé par le LabEx COTE. Le doctorant sera affilié à l'Unité de Recherche Réseaux, Epuration et Qualité des Eaux d'Irstea Bordeaux, avec des partenariats et accueils dans les 2 laboratoires partenaires (EPOC-EA Arcachon et LBM Pont de la Maye) dont les modalités seront précisées par convention d’accueil.

Il sera co-encadré par les 3 partenaires et jouera un rôle central et interactif avec les trois équipes. Des moments réguliers d'échange entre les équipes auront lieu périodiquement (tous les 6 mois) et plus souvent chaque fois que nécessaire pour le suivi, la ré-orientation et l’adaptation du programme expérimental. Le (la) doctorant(e) participera à la mise en culture des différentes espèces, aux expérimentations d’exposition aux toxiques en conditions contrôlées de laboratoire, à la mise au point puis au déploiement du dispositif d’encagement des diatomées, aux réalisations de terrain, à la collecte des descripteurs d’effet toxique et aux observations à sa charge. . Il (elle) exploitera les résultats obtenus sur l'ensemble des paramètres considérés (chimiques, biologiques et écotoxicologiques).

Schéma envisagé :

Accueil en thèse d’un étudiant obligatoirement inscrit à l'Ecole Doctorale "Sciences et Environnements" de l'Université de Bordeaux (c’est une obligation assortie au financement de la thèse LIPID par le LabEx Côte), à partir de l'année universitaire 2016-2017 (date de début de contrat prévu : Novembre ou Décembre 2016).

Co-direction de thèse :

- François DELMAS (Irstea Bordeaux - CARMA), Patrice GONZALEZ (EPOC-EA)

Autres partenaires scientifiques :

- Internes à l'équipe CARMA / UR EABX :Soizic MORIN, Nicolas MAZZELLA

- Externes à l'équipe : UMR EPOC-EA : Agnès FEURTET-MAZELUMR 5200 - LBM, Université Bordeaux : Jean-jacques BESSOULELEB : Marina Le GUEDARD

Comité de pilotage prévu :

- les scientifiques précités- Chloé BONNINEAU (Irstea Lyon – UR MALY / Equipe EMHA)- Martin LAVIALE (Université de Metz / LIEC - UMR 7360))- Marie VAGNER (LIENNS La Rochelle - UMR 7266-), en renforcement des liens avec le futur OASUE dans la grande région Aquitaine.

Matériel, équipement auxquels le doctorant aura accès:

- Laboratoire de chimie des eaux d’Irstea Bordeaux- Laboratoire d'hydrobiologie d’Irstea Bordeaux, microcosmes et canaux dynamiques, - PhytoPAM- Chaîne optique, capture d'images diatomées, banques d'images ; - Logiciels scientifiques d'analyse des données ; - Appareillages de mesure et d'acquisition de données de terrain ; - Accès au LBM (Site de Pont de la Maye)- Accès à la Station Marine d’Arcachon de l’Université de Bordeaux (EPOC-EA)

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- Sites d'étude faisant l'objet du programme LIPID en cours (bassin versant expérimental de Marcillac -33- + hydrosystèmes reliés) ;- Véhicules administratifs d'Irstea …

Financement :

Part salariale : - financée à 100% par le LabEx COTE.

Investissement et fonctionnement : - Une partie des moyens d'ores et déjà financés par le LabEx COTE, - Ressources contractuelles propres de l'UR,- Dépôt de projet complémentaire afin de soutenir notamment les frais de fonctionnement de ce travail de thèse et l’intervention du LBM et du LEB (non-éligibles aux financements du LabEx Côte).

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VI- Bibliographie

Ref. 1 : Eurostat 2013 - Pesticide sales (from 2009 onwards) - Reg. 1185/2009 (Last update: 16-07-2015) <http://appsso.eurostat.ec.europa.eu/nui/show.do>.

Ref. 2 : SOES 2012, Service Statistique du Ministère de l’Ecologie, du Développement Durable et de l’Energie. <http://www.statistiques.developpement-durable.gouv.fr/lessentiel/ar/246/211/contamination-globale-cours-deau-pesticides.html > .

Ref. 3 : REACH - Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (Entry in force : 1st June 2007). <ec.europa.eu/enterprise/sectors/chemicals/reach/index_fr.htm>.

Ref. 4 : Décision n° 2455/2001/CE du Parlement Européen et du Conseil du 20 novembre 2001 établissant la liste des substances prioritaires dans le domaine de l’eau et modifiant la Directive 2000/60/CE.

Ref. 5 : Portail EauFrance service Public d’Information sur l’Eau (ONEMA-OIEAU), données 2009. <http://www.eaufrance.fr/observer-et-evaluer/etat-des-milieux/rivieres-et-lacs/etat-chimique > .

Ref. 6 : MAP 2008: Plan Ecophyto de réduction des usages de pesticides 2008-2016 , 21 pages <http://agriculture.gouv.fr/ecophyto>; https://fr.wikipedia.org/wiki/Ecophyto_2018.

Ref. 7 : Projet de Plan Ecophyto II du 06-06-2015 (actuellement en procédure de Consultation Publique) <http://agriculture.gouv.fr/file/20150606-projet-de-plan-ecophyto-iicle0987b1pdf>.

Ref. 8 : EC (2000) Directive 2000/60 / EC of the European Parliament and of the Council of 23 October 2000 establishing a framework for Community action in the field of water policy, OJ L 327, 22/12/2000, Brussels, 72 p.

Ref. 9 : Coste, M., Boutry, S., Tison-Rosebery, J. & Delmas, F., 2009 - Improvements of the Biological Diatom Index (BDI): Description and efficiency of the new version (BDI-2006). Ecological Indicators, 9, no 4: 621-50.

Ref. 10 : AFNOR, 2007 (Coste, M., Boutry, S., Tison-Rosebery, J., Delmas, F.). Qualité de l'eau. Détermination de l'indice biologique diatomées (IBD) - Norme NF T90-354 -, 63p.

Ref 11 : Pesce, S., Lissalde, S., Lavieille, D., Margoum, C., Mazzella, N., Roubeix, V., Montuelle, B. - 2010. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquatic Toxicology, vol. 99, p. 492-499.

Ref. 12 : Roubeix, V., Mazzella, N., Schouler, L., Fauvelle, V., Morin, S., Coste, M., Delmas, F., MARGOUM, C. - 2011. Variations of periphytic diatom sensitivity to the herbicide diuron and relation to species distribution in a contamination gradient: implications for biomonitoring. Journal of Environmental Monitoring, vol. 13, p. 1768-1774.

Ref. 13 : Roubeix V, Pesce S, Mazzella N, Coste M, Delmas F. - 2012a. Variations in periphytic diatom tolerance to agricultural pesticides in a contaminated river: An analysis at different diversity levels. Fresenius Environmental Bulletin 21: 2090-2094.

Ref. 14 : Carafa, R., Real,M, Munné, A. Ginebreda, A., Guasch, H. and Tirapu, L.- 2010. Recommendations for water monitoring programs of priority and emerging pollutants. Contributions from newly developed methods. In “KEYBIOEFFECTS project” : Cause-effect relations of key pollutants on the biodiversity of European rivers, 57p.

page 19

Ref. 15 : AFNOR, 2012 (Le Guédard M, Bessoule JJ, ) Détermination des effets des polluants sur la flore du sol - Effets des sols contaminés sur la composition en acides gras foliaires de Lactuca sativa - Norme XP_X31-233. Recueil de normes Française – Qualité du sol (Ed. AFNOR).

Ref. 16 : Le Guédard M, Schraauwers B, Larrieu I, Bessoule JJ, 2008 - Development of a biomarker for metal bioavailability: the lettuce fatty acid composition. Environ Toxicol Chem., 27, 1147-51.

Ref. 17 : Le Guédard M, Faure O, Bessoule JJ, 2012a - Early changes in the fatty acid composition of photosynthetic membrane lipids from Populus nigra grown on a metallurgical landfill. Chemosphere. 88, 693-698.

Ref. 18 : Le Guédard M, Faure O, Bessoule JJ, 2012b - Soundness of in situ lipid biomarker analysis: Early effect of heavy metals on leaf fatty acid composition of Lactuca serriola. Environ. Exp. Botany, 76, 54-59.

Ref. 19 : Le Guédard M, Bessoule JJ, 2013 - A self-evaluation method to attribute sound bio-values based on in situ ecotoxicological monitoring. Ecological indicators. 30, 100-105.

Ref. 20 : Cambier S., Gonzalez P., Durrieu G., Maury-Brachet R., Boudou A., Bourdineaud J.P. (2010). Cadmium-induced genotoxicity in zebrafish at environmentally relevant doses. Ecotoxicology and Environmental Safety. 73; 312-319.

Ref. 21 : Arini A., Gourves P-Y., Gonzalez P., Feurtet-Mazel A. and Baudrimont M. (2015). Metal detoxification and gene expression regulation after a Cd and Zn contamination: an experimental study on Danio rerio. Chemosphere. 128: 125-133.

Ref. 22 : Dupuy C, Galland C, Devaux A, Bony S, Loizeau V, Danion M, Pichereau V, Fournier M, Laroche J. (2014). Responses of the European flounder (Platichthys flesus) to a mixture of PAHs and PCBs in experimental conditions. Environ Sci Pollut Res Int. 21:13789-13803.

Ref. 23 : Arini A., Daffe G., Gonzalez P., Feurtet-Mazel A. and Baudrimont M. (2014). Detoxification and recovery capacities of Corbicula fluminea after an industrial metal contamination (Cd and Zn) : a one-year depuration experiment. Environmental Pollution. 192C:74-82.

Ref. 24 : Dos Santos KC, Martinez CB. (2014). Genotoxic and biochemical effects of atrazine and Roundup(®), alone and in combination, on the Asian clam Corbicula fluminea. Ecotoxicol Environ Saf. 100: 7 – 14.

Ref. 25 : Châtel A, Faucet-Marquis V, Pfohl-Leszkowicz A, Gourlay-Francé C, Vincent-Hubert F. (2014). DNA adduct formation and induction of detoxification mechanisms in Dreissena polymorpha exposed to nitro-PAHs. Mutagenesis. 29:457-465.

Ref. 26 : JGI genome portal, Joint genome Institute, University of California. <http://genome.jgi.doe.gov/Fracy1/Fracy1.home.html>

Ref. 27 : Kim-Tiam, S., Feurtet-Mazel, A., Delmas, F., Mazzella, N., Morin, S., Daffe, G., Gonzalez, P. - 2012. Development of q-PCR approaches to assess water quality: Effects of cadmium on gene expression of the diatom Eolimna minima. Water Research, vol. 46, n° 4, p. 934-942.

Ref. 28 : Moisset, S., Kim-Tiam, S., Feurtet-Mazel, A., Morin, S., Delmas, F., Mazzella, N., Gonzalez, P. - 2015. Genetic and physiological responses of three freshwater diatoms to realistic diuron exposures. Environmental Science and Pollution Research, vol. 22, p. 4046-4055.

Ref. 29 : Morin, S., N. Gómez, E. Tornés, M. Licursi and J. Rosebery. 2016. Benthic diatom monitoring and assessment of freshwater environments: Standard methods and future challenges. In “Aquatic biofilms: Ecology, water quality and wastewater treatment”, eds Romaní, AM, Guasch, H and Balaguer, MD: Caister Academic Press.

page 20

Ref. 30 : Gold C., Feurtet-Mazel A., Coste M., Boudou A. (2002) Field transfer of periphytic diatom communities to assess short-term structural effects of metals (Cd, Zn) in rivers. Water Research, 36, 3654-3664.

Ref. 31 : Gold C., Feurtet-Mazel A., Coste M., Boudou A. (2003). Impacts of Cd and Zn on the development of periphytic diatom communities in artificial streams located along a river pollution gradient. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 44 (2), pp. 189-197.

Ref. 32 : Feurtet-Mazel, A., Gold C., Coste M., Boudou A. (2003). Study of periphytic diatoms communities exposed to metallic contamination through complementary field and laboratory experiments. Journal de Physique. IV: JP – 107 - (I), pp.467-470.

Ref. 33 : Morin S., Duong T.T., Herlory O., Feurtet-Mazel A., Coste M. (2008). Cadmium toxicity and bioaccumulation in freshwater biofilms. Arch Environ Contam Toxicol, 54, 173-186.

Ref. 34 : Duong T. T., Morin S., Coste M., Herlory O., Feurtet-Mazel A. and Boudou A. (2010). Experimental toxicity and bioaccumulation of cadmium in freshwater periphytic diatoms in relation with biofilm maturity. Science of the Total Environment. 408, 3 : 552-562.

Ref. 35 : Arini, A., Feurtet-Mazel, A., Morin, S., Maury-Brachet, R., Coste, M., Delmas, F. (2012a). Remediation of a watershed contaminated by heavy metals : a 2-year field biomonitoring of periphytic biofilms. Sciences of the Total Environment 425: 242-253.

Ref. 36 : Arini, A., Feurtet-Mazel, A., Maury-Brachet, R., Pokrovsky, O., Coste, M., Delmas, F. (2012b). Recovery potential of periphytic biofilms translocated in artificial streams after industrial contamination (Cd and Zn). Ecotoxicology 21:1403-1414.

Ref. 37 : Herlory, O., Bonzom, J.M., Gilbin, R., Frelon, S., Fayolle, S., Delmas, F., Coste, M. (2013). Use of diatom assemblages as biomonitor of the impact of treated uranium mining effluent discharge on a stream: case study of the Ritord watershed (Center-West France). Ecotoxicology, vol. 22, p. 1186-1199.

Ref. 38 : Pérès, F., Florin, D., Coste, M., Grollier, T., Feurtet-Mazel, A., Ribeyre, F., Ricard, M. and Boudou, A. (1997). Effects of the phenylurea herbicide Isoproturon on periphytic diatom communities in freshwater indoor microcosms. Environmental Pollution 94, (2), 141-152.

Ref. 39 : Duong T. T., Coste M., Feurtet-Mazel A., Dang D. K., Gold C., Park, Y. S., Boudou A. (2006). Impact of urban pollution from the Hanoi area on benthic diatom communities collected from the Red, Nhue and Tolich rivers (Vietnam). Hydrobiologia 563: 201-216.

Ref. 40 : Duong, T. T., Feurtet-Mazel, A., Coste, M., Dinh, K. D., Boudou, A. (2007). Dynamics of diatom colonization process in some rivers influenced by urban pollution (Hanoi, Vietnam). Ecological Indicators. 7, 4: 839-851.Ref. 41 : Debenest, T., Pinelli, E., Coste, M., Silvestre, J., Mazella, N., Madigou, C., Delmas, F. (2009). Sensitivity of freshwater periphytic diatoms to agricultural herbicides. Aquatic Toxicology, vol. 93, p. 11-17.Ref. 42 : Morin, S., Bottin, M., Mazzella, N., Macary, F., Delmas, F., Winterton, P., Coste, M. (2009). Linking diatom community structure to pesticide input as evaluated through a spatial contamination potential (Phytopixal): a case study in the Neste river system (South-West France). Aquatic Toxicology, vol. 94, n° 1, p. 28-39.Ref. 43 : Roubeix, V., Mazzella, N., Schouler, L., Fauvelle, V., Morin, S., Coste, M., Delmas, F., Margoum, C. ( 2011a). Variations of periphytic diatom sensitivity to the herbicide diuron and relation to species distribution in a contamination gradient: implications for biomonitoring. Journal of Environmental Monitoring, vol. 13, p. 1768-1774.Ref. 44 : Roubeix, V., Mazzella, N., Mechin, B., Coste, M., Delmas, F. (2011b). Impact of the herbicide metolachlor on river periphytic diatoms: experimental comparison of descriptors at different biological organization levels. International Journal of Limnology, vol. 47, n° 3, p. 239-249.Ref. 45 : Bonnineau, C., A. Tlili, L. Faggiano, B. Montuelle and H. Guasch. (2013). The use of antioxidant enzymes in freshwater biofilms: Temporal variability vs. Toxicological responses. Aquatic Toxicology 136–137, no 0: 60-71.

page 21

Ref. 46 : Kim Tiam, S., S. Morin, B. Bonet, H. Guasch, A. Feurtet-Mazel, M. Eon, P. Gonzalez and N. Mazzella. (2015a). Is the toxicity of pesticide mixtures on river biofilms accounted for solely by the major compounds identified? Environmental Science and Pollution Research, Vol. 22, p 4009-4024.

Ref. 47 : Kim Tiam, S., M. Laviale, A. Feurtet-Mazel, G. Jan, P. Gonzalez, N. Mazzella and S. Morin. (2015b). Herbicide toxicity on river biofilms assessed by pulse amplitude modulated (PAM) fluorometry. Aquatic Toxicology 165: 160-71.

Ref. 48 : Roubeix, V., Mazzella, N., Delmas, F., Coste, M. - 2010. In situ evaluation of herbicide effects on the composition of river periphytic diatom communities in a region of intensive agriculture. Vie et Milieu-Life and Environment, vol. 60, n° 3, p. 233-241

Ref. 49 : Cadoret, J-P & Bernard, O. (2008). La production de biocarburant lipidique avec des microalgues : promesses et défis. Journal de la Société de Biologie, 202(3), 201-211.

Ref. 50 : Rumin, J., Bonnefond, H., Saint-Jean, B., Rouxel, C., Sciandra, A., Bernard, O., Cadoret J-P., Bougaran, G. (2015). The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology For Biofuels, 8(42), 1-16.

Ref. 51 : Cadoret, J-P., Garnier, M., Saint-Jean, B. (2012). Microalgae, Functional Genomics and Biotechnology. Advances in Botanical Research, 64, 285-341.

Ref. 52 : Garnier, M., Carrier, G., Rogniaux, H., Nicolau, E., Bougaran, G., Saint-Jean, B., Cadoret, J-P. (2014). Comparative proteomics reveals proteins impacted by nitrogen deprivation in wild-type and high lipid-accumulating mutant strains of Tisochrysis lutea. Journal Of Proteomics, 105, 107-120. http://doi.org/10.1016/j.jprot.2014.02.022

Ref. 53 : Perrein-Ettajani, H., Amiard, J-C. Haure, J. & Renaud, C. (1999). Effets des métaux (Ag, Cd, Cu) sur la composition biochimique et compartimentation de ces métaux chez deux microalgues Skeletonema costatum et Tetraselmis suecica. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56: 1757–1765.

Ref. 54 : Pandey, L-K., Bergey, E-A (2016). Exploring the status of motility, lipid bodies, deformities and size reduction in periphytic diatom community from chronically metal(Cu, Zn) polluted waterbodies as a biomonitoring tool. STOTEN, 550, 372–381.

page 22