© David Gendron, 2019
Le rôle de la sphingosine-1-phosphate et impact des analogues de la sphingosine dans le remodelage
pulmonaire
Thèse
David Gendron
Doctorat en médecine expérimentale
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
Le rôle de la voie de la sphingosine-1-phosphate et
impact des analogues de la sphingosine dans le
remodelage pulmonaire
Thèse
David Gendron
Sous la direction de :
David Marsolais, directeur de recherche
iii
Résumé
Le remodelage pulmonaire cause une altération de la structure du poumon et peut mener à la
diminution de la fonction respiratoire. Ce remodelage peut aussi bien affecter les voies respiratoires
en obstruant le flot de l’air, comme il est observé dans l’asthme, que la compliance du parenchyme
pulmonaire, tel qu’observé dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI). Dans le cas de l’asthme
allergique, la forme la plus commune d’asthme, une inflammation chronique de type allergique induit
le remodelage bronchique, dont l’épaississement du muscle lisse bronchique. Ces deux composantes
contribuent directement à l’hyperréactivité bronchique. Dans le cas de la FPI, les dommages
tissulaires et l’inflammation semblent être impliqués dans l’induction de la maladie, mais la
progression de la FPI est maintenue même en absence d’inflammation. Tant en asthme qu’en FPI, le
remodelage est persistant et les options thérapeutiques sont partiellement efficaces, limitées ou
absentes.
La voie de signalisation de la sphingosine-1-phosphate (S1P) est reconnue non seulement pour son
rôle dans la régulation de l’immunité et de l’inflammation, mais aussi pour ses impacts majeurs dans
les phénomènes de prolifération et de survie cellulaire. Ces effets sont souvent associés à l’activation
de cinq récepteurs membranaires, nommés S1P1 à S1P5. D’ailleurs, ces récepteurs peuvent être activés
par les composés pharmacologiques analogues à la S1P. Bien que ces analogues répliquent ou
modifient la plupart des effets de la S1P, ils possèdent aussi des activités intracellulaires
indépendantes des récepteurs qui sont plutôt associées à la modulation de la survie cellulaire.
Ainsi, les sphingolipides et leurs analogues sont susceptibles de moduler plusieurs mécanismes
impliqués dans le remodelage pulmonaire. Le but de cette thèse était donc d’explorer l’impact des
sphingolipides et leurs analogues sur divers aspects impliqués dans le remodelage pulmonaire.
Dans une première étude, nous avons déterminé l’effet de l’analogue de la sphingosine AAL-R sur
l’inflammation observée dans un modèle murin d’asthme allergique. AAL-R diminue l’accumulation
pulmonaire des lymphocytes et induit leur apoptose au poumon. La réduction du nombre de
lymphocytes pulmonaires est associée à une diminution importante de l’éosinophilie et de
l’hyperréactivité bronchique. Ainsi, nous résultats montrent qu’AAL-R interfère avec
l’inflammation et l’hyperréactivité bronchique dans un modèle d’asthme allergique aigu par
un mécanisme impliquant l’apoptose des lymphocytes.
iv
Dans un second chapitre, l’impact d’AAL-R sur l’épaississement du muscle lisse bronchique a été
évalué dans un modèle murin d’asthme chronique. AAL-R réduit l’épaisseur du muscle lisse
bronchique dans le tissu remodelé, ce qui est associé à une diminution de l’hyperréactivité
bronchique. Nous montrons d’ailleurs que AAL-R interfère avec la prolifération des cellules
musculaires lisses, in vitro. Cette étude montre que des analogues de la sphingosine, tel qu’AAL-
R, pourraient contrecarrer le remodelage tissulaire tel qu’observé en asthme, ce qui ouvre de
nouvelles pistes précliniques pour cette maladie incurable.
Troisièmement, nous avons étudié l’influence de l’analogue de la sphingosine FTY720 sur la phase
inflammatoire ou la phase fibrotique d’un modèle murin de fibrose pulmonaire induit par une blessure
cellulaire aiguë. En concordance avec la littérature, l’administration de FTY720 en phase
inflammatoire diminue la fibrose pulmonaire. Toutefois, lorsqu’administré en phase fibrotique,
FTY720 exacerbe cette dernière. Cette exacerbation ne semble pas impliquer l’augmentation de la
perméabilité vasculaire, mais plutôt l’augmentation de la transcription du connective tissue growth
factor (CTGF). Similairement, FTY720 stimule la transcription du CTGF par les fibroblastes in vitro.
Contrairement au dogme actuel, notre étude montre que FTY720 promeut la fibrose pulmonaire ce
qui serait médié, du moins en partie, par la transcription accrue du CTGF.
Dans une dernière étude, nous avons exploré le lien entre la voie de signalisation de la S1P, le CTGF
et les dérégulations des fibroblastes issus de patients atteints de FPI. Ces fibroblastes expriment plus
de CTGF que des fibroblastes de patients ne souffrant pas de FPI, ce qui est exacerbé par la S1P. De
plus, un antagoniste de S1P3 renverse partiellement cette augmentation. Nous postulons donc que la
S1P et le S1P3 pourraient être impliqués dans la pathogenèse de la FPI.
Dans son ensemble, cette thèse démontre que les sphingolipides et leurs analogues influencent des
mécanismes du remodelage pulmonaire pathologique. Nos résultats suggèrent que certains acteurs de
la voie de signalisation de la S1P pourraient être modulés de manière bénéfique dans le contexte de
l’asthme et de la fibrose pulmonaire.
v
Abstract
Pulmonary remodelling causes the alteration of the lung structure and can lead to reduced respiratory
function. Remodelling can affect the lung airways by obstructing the airflow, as observed in asthma,
as well as the lung parenchyma by reducing lung compliance, as observed in idiopathic pulmonary
fibrosis (IPF). In the most widespread form of asthma, allergic asthma, chronic allergic inflammation
induces lung remodelling, including airway smooth muscle thickening. Both components directly
contribute to airway hyperresponsiveness. In IPF, acute lung injury and inflammation seem to be
involved in its pathogenesis, yet the progression of the disease is maintained even in the absence of
inflammation. Both in asthma and IPF, lung remodeling is persistent and therapeutic treatments are
either partially effective, limited or simply unavailable.
The sphingosine-1-phosphate (S1P) pathway is recognized not only for its role in the regulation of
immunity and inflammation, but also for its major involvement in the events of cellular proliferation
and survival. These effects are often associated with the activation of five G protein-coupled
receptors, termed S1P1 to S1P5. Furthermore, these receptors can be activated by pharmacological
compounds analogous to S1P. Although these analogs replicate or modify most S1P effects, they also
possess intracellular activities independent of S1P receptors that are rather associated with the
modulation of cell survival.
Therefore, sphingolipids and their analogs likely modulate several mechanisms involved in
pulmonary remodelling. The aim of this thesis was thus to explore the impact of sphingolipids
and their analogs on various aspects of pulmonary remodelling.
In a first study, we determined the effect of the sphingosine analog AAL-R on the inflammation
observed in a murine model of allergic asthma. AAL-R reduces pulmonary accumulation of
lymphocytes and induces their apoptosis specifically in the lung. The reduction of pulmonary
lymphocytes number is associated with reduced lung eosinophilia and airway hyperresponsiveness.
Our results show that AAL-R interferes with allergic inflammation and airway
hyperresponsiveness in an acute allergic asthma model by a mechanism involving the apoptosis
of pulmonary lymphocytes.
vi
In a second chapter, we evaluated the impact of AAL-R on airway smooth muscle thickening using a
murine model of chronic asthma. AAL-R reduces the thickness of the airway smooth muscle in
remodelled bronchi, which is associated with diminished airway hyperresponsiveness. Furthermore,
we show that AAL-R interferes with airway smooth muscle cells proliferation in vitro. This study
shows that sphingosines analogs, such as AAL-R, could reverse tissue remodelling as observed
in asthma, offering new preclinical targets for this incurable disease.
Thirdly, we studied the influence of the sphingosine analog FTY720 on the inflammatory phase or
the fibrotic phase of a murine model of pulmonary fibrosis induced by an acute injury. In concordance
with literature, FTY720 administration during the inflammatory phase reduce lung fibrosis. However,
when administered during the fibrotic phase, FTY720 exacerbates fibrosis. This exacerbation does
not involve increased vascular permeability, but rather increased connective tissue growth factor
(CTGF) transcription. Similarly, FTY720 stimulates CTGF transcription by fibroblasts in vitro.
Contrarily to the actual dogma, our study shows that FTY720 promotes pulmonary fibrosis which
is mediated, at least in part, by increased CTGF transcription.
Finally, we explored the link between the S1P signalling pathway, the transcription of CTGF and the
deregulations observed in lung fibroblasts isolated from IPF patients. These fibroblasts express more
CTGF than lung fibroblasts from patient without IPF, which is exacerbated by S1P. Moreover, a
specific S1P3 antagonist partially reverses this exacerbation. We postulate that S1P and S1P3 could
be involved in idiopathic lung fibrosis pathogenesis.
As a whole, this thesis demonstrates that sphingolipids and their analogs influence mechanisms
underlying pathological pulmonary remodelling. Our results suggest that certain components of the
S1P signalling pathway could prove beneficial in the context of asthma and lung fibrosis.
These results support the hypothesis that phosphorylatable sphingosine analogs interfere with
inflammation and ASM thickening observed in allergic asthma. However, they also stimulate CTGF
transcription by fibroblasts, thus possibly exacerbating pathologies involving these cells, such as IPF.
Identification of the mechanisms modulated by S1P analogs could provide insights regarding putative
targets in the context of pulmonary remodelling.
vii
Table des Matières
RÉSUMÉ .......................................................................................................................................... III
ABSTRACT ...................................................................................................................................... V
TABLE DES MATIÈRES ............................................................................................................ VII
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................ X
LISTE DES FIGURES ................................................................................................................... XI
LISTE DES ABBRÉVIATIONS ................................................................................................. XIII
REMERCIEMENTS ......................................................................................................................XV
AVANT-PROPOS ...................................................................................................................... XVII
1. CHAPITRE I : INTRODUCTION .......................................................................................... 1 1.1 LE REMODELAGE PULMONAIRE ........................................................................................ 1 1.2 L’ASTHME ........................................................................................................................... 3
1.2.1 La physiopathologie de l’asthme ................................................................................. 6 1.2.2 La sensibilisation ......................................................................................................... 8 1.2.3 La cascade inflammatoire ......................................................................................... 10 1.2.4 Le remodelage bronchique ........................................................................................ 13 1.2.5 Les modèles expérimentaux ....................................................................................... 15
1.3 LA FIBROSE PULMONAIRE ............................................................................................... 18 1.3.1 La physiopathologie de la fibrose pulmonaire .......................................................... 19 1.3.2 Les mécanismes de la fibrose pulmonaire ................................................................. 20 1.3.3 Les modèles expérimentaux ....................................................................................... 30
1.4 LES SPHINGOLIPIDES ....................................................................................................... 33 1.4.1 Les analogues de la sphingosine ............................................................................... 39 1.4.2 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans l’asthme ............................... 41 1.4.3 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans la fibrose pulmonaire .......... 43
2. CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS ........................ 46 2.1 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE III ............... 46 2.2 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE IV ............... 47 2.3 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE V ................. 48 2.4 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE VI ............... 49
3. CHAPITRE III : TREATMENT WITH A SPHINGOSINE ANALOG AFTER THE
INCEPTION OF HOUSE DUST MITE-INDUCED AIRWAY INFLAMMATION
ALLEVIATES KEY FEATURES OF EXPERIMENTAL ASTHMA....................................... 51 3.1 RÉSUMÉ ............................................................................................................................ 51 3.2 ABSTRACT ........................................................................................................................ 52 3.3 BACKGROUND .................................................................................................................. 53 3.4 METHODS ......................................................................................................................... 54
3.4.1 Murine Model of Asthma ........................................................................................... 54 3.4.2 Immunoglobulin Titration ......................................................................................... 54 3.4.3 Experimental Treatments .......................................................................................... 55 3.4.4 Differential Counts, Flow Cytometric Analyses and Quantification of Cytokines .... 55 3.4.5 Histology ................................................................................................................... 55 3.4.6 Measurement of Airway Responsiveness ................................................................... 56 3.4.7 Statistical Analyses .................................................................................................... 56
viii
3.5 RESULTS ........................................................................................................................... 56 3.5.1 Onset of allergic airway inflammation in response to daily exposure to HDM ........ 56 3.5.2 AAL-R alleviates airway responsiveness induced by HDM ...................................... 57 3.5.3 AAL-R interferes with lung accumulation of cells that drive inflammation induced by
HDM ................................................................................................................................... 57 3.5.4 AAL-R enhances apoptosis/necrosis of lymphocytes in the lung ............................... 58 3.5.5 Effect of intra-tracheal delivery of AAL-R on lymphocytes and DC in the draining
lymph nodes. .............................................................................................................................. 59 3.6 DISCUSSION ...................................................................................................................... 59 3.7 CONCLUSION AND DECLARATIONS ................................................................................. 62
3.7.1 Competing interests ................................................................................................... 63 3.7.2 Author contribution ................................................................................................... 63 3.7.3 Acknowledgements .................................................................................................... 63
3.8 REFERENCES .................................................................................................................... 64 3.9 FIGURES ............................................................................................................................ 67 3.10 TABLEAUX ........................................................................................................................ 74
4. CHAPITRE IV : A PHOSPHORYLATABLE SPHINGOSINE ANALOG INDUCES
AIRWAY SMOOTH MUSCLE CYTOSTASIS AND REVERSES AIRWAY
HYPERRESPONSIVENESS IN EXPERIMENTAL ASTHMA ................................................ 75 4.1 RÉSUMÉ ............................................................................................................................ 75 4.2 ABSTRACT ........................................................................................................................ 76 4.3 INTRODUCTION ................................................................................................................ 77 4.4 METHODS ......................................................................................................................... 78
4.4.1. Murine model and experimental treatments .............................................................. 78 4.4.2. Histological analyses ................................................................................................ 78 4.4.3. Cell Culture ............................................................................................................... 79 4.4.4. Quantification of sphingolipids. ................................................................................ 79 4.4.5. Statistics .................................................................................................................... 79
4.5 RESULTS ........................................................................................................................... 80 4.5.1. AAL-R reverses airway hyperresponsiveness and airway smooth muscle thickening. .
................................................................................................................................... 80 4.5.2. AAL-R favours an anti-proliferative balance in ASM cells. ...................................... 80 4.5.3. Modulation of S1P levels does not resolve the potent anti-proliferative effect of AAL-
R. ................................................................................................................................... 81 4.5.4. AAL- R incubation leads to massive accumulation of intracellular AFD-R in ASM
cells ................................................................................................................................... 82 4.5.5. AAL-R but not AAL-S efficiently reverses AHR ......................................................... 82
4.6 DISCUSSION ...................................................................................................................... 83 4.7 CONCLUSION AND DECLARATIONS ................................................................................. 86
4.7.1. Conflict of Interest Statement .................................................................................... 87 4.7.2. Author Contribution .................................................................................................. 87 4.7.3. Funding ..................................................................................................................... 87 4.7.4. Acknowledgements .................................................................................................... 87
4.8 REFERENCES .................................................................................................................... 88 4.9 FIGURES ............................................................................................................................ 91 4.10 SUPPLEMENTARY MATERIAL ........................................................................................ 100
4.10.1. LC MS/MS Analysis ................................................................................................. 100 4.10.2. Supplementary Figures and Tables ......................................................................... 100
ix
5. CHAPITRE V : FTY720 PROMOTES PULMONARY FIBROSIS WHEN
ADMINISTERED DURING THE REMODELING PHASE FOLLOWING A BLEOMYCIN-
INDUCED LUNG INJURY.......................................................................................................... 104 5.1 RÉSUMÉ .......................................................................................................................... 104 5.2 ABSTRACT ...................................................................................................................... 105 5.3 INTRODUCTION .............................................................................................................. 106 5.4 METHODS ....................................................................................................................... 107
5.4.1. Murine model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis and FTY720 treatment ... 107 5.4.2. Measurements of lung function ............................................................................... 107 5.4.3. Histology and immunohistochemistry ..................................................................... 108 5.4.4. Assessment of vascular leakage .............................................................................. 108 5.4.5. Cell culture .............................................................................................................. 108 5.4.6. Real-time quantitative polymerase chain reaction .................................................. 109 5.4.7. Statistical analyses .................................................................................................. 109
5.5 RESULTS ......................................................................................................................... 110 5.5.1. The remodeling phase following bleomycin injury is initiated on day 14 ............... 110 5.5.2. FTY720 exerts opposite effects on fibrosis depending on its period of delivery ..... 110 5.5.3. A low dose regimen of FTY720 does not enhance vascular leakage into the lung . 111 5.5.4. FTY720 increases Ctgf expression in vivo and in vitro ........................................... 112
5.6 DISCUSSION .................................................................................................................... 113 5.7 CONCLUSION AND DECLARATIONS ............................................................................... 115
5.7.1. Acknowledgements .................................................................................................. 115 5.8 REFERENCES .................................................................................................................. 116 5.9 FIGURES .......................................................................................................................... 118
6. CHAPITRE VI : UN RÔLE POUR S1P2 ET S1P3 DANS LE PHÉNOTYPE ALTÉRÉ
DES FIBROBLASTES DE PATIENTS ATTEINTS DE LA FPI ............................................ 124 6.1 RÉSUMÉ .......................................................................................................................... 124 6.3 MATÉRIEL ET MÉTHODES ............................................................................................. 127
6.3.1 Isolation, culture et stimulation des fibroblastes pulmonaires humains primaires 127 6.3.2 Réaction en chaine par polymérase quantitative en temps réel .............................. 128 6.3.3 Analyses statistiques ................................................................................................ 128
6.4 RÉSULTATS ..................................................................................................................... 129 6.5 DISCUSSION .................................................................................................................... 130 6.6 CONCLUSION .................................................................................................................. 132 6.7 RÉFÉRENCES .................................................................................................................. 133 6.8 FIGURES .......................................................................................................................... 135
7. CHAPITRE VII : DISCUSSION GÉNÉRALE .................................................................. 139 7.1 LES EFFETS DES ANALOGUES DE LA SPHINGOSINE SUR L’INFLAMMATION ALLERGIQUE
DANS L’ASTHME. ........................................................................................................................ 139 7.2 LES EFFETS DES ANALOGUES DE LA SPHINGOSINE SUR LE REMODELAGE BRONCHIQUE
DANS L’ASTHME ......................................................................................................................... 143 7.3 LES EFFETS DES ANALOGUES DE LA SPHINGOSINE SUR LA FIBROSE PULMONAIRE. .. 147
CHAPITRE VIII : CONCLUSION ET PERSPECTIVES ....................................................... 152
8. CHAPITRE IX : BIBLIOGRAPHIE .................................................................................. 153
x
Liste des Tableaux
Tableau 1.1 : Modulation des mécanismes profibrotiques des fibroblastes ............................... 28
Table 3.1: Histopathological alterations of mice lungs exposed to HDM ................................... 74
Supplementary Table 4.1: Details of the mass spectrometer parameters ................................ 100
xi
Liste des Figures
Chapitre I
Figure 1.1: Comparaison des présentations histologiques du remodelage pulmonaire .............. 2
Figure 1.2: Suite chronologique des étapes de la sensibilisation et des interactions entre les
cellules immunitaires et leurs médiateurs dans le développement de l’asthme allergique. ........ 7
Figure 1.3: Les étapes de l’inflammation allergique et du remodelage bronchique ................. 12
Figure 1.4: Étapes de la guérison tissulaire .................................................................................. 24
Figure 1.5: Les deux phases du modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine ...... 32
Figure 1.6: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine .... 35
Figure 1.7: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine .... 38
Figure 1.8: Propriétés physiques des analogues de la sphingosine ............................................. 40
Chapitre III
Figure 3.1: The onset of allergic inflammation is established at day 7 ....................................... 67
Figure 3.2: Experimental design .................................................................................................... 68
Figure 3.3: AAL-R interferes with hallmarks of asthma induced by HDM .............................. 70
Figure 3.4: AAL-R inhibits allergic airway inflammation .......................................................... 71
Figure 3.5: AAL-R increases lymphocyte apoptosis/necrosis in the lungs ................................. 72
Figure 3.6: Effects of non- or pre-phosphorylated analogs in draining lymph nodes............... 73
Chapitre IV
Figure 4.1: Sphingosine analogs and their targets ....................................................................... 91
Figure 4.2: Experimental model .................................................................................................... 92
Figure 4.3: AAL-R reverses airway hyperresponsiveness elicited by chronic HDM exposure 93
Figure 4.4: AAL-R reverses ASM thickening ............................................................................... 94
Figure 4.5: AAL-R inhibits the proliferation of ASM cells ......................................................... 95
Figure 4.6: Endogenous sphingolipid modulation in response to sphingolipid modifiers ........ 96
Figure 4.7: An S1P1/S1P3 antagonist does not induce cytostasis ................................................. 97
Figure 4.8: AAL-R-induced cytostasis depends on intracellular accumulation of AFD-R ...... 98
Figure 4.9: Reversal of airway hyperresponsiveness induced by chronic HDM exposure
requires a phosphorylatable sphingosine analog .......................................................................... 99
Supplementary Figure 4.1: AAL-R retains its ability to alleviate inflammation in the
remodelled airways ....................................................................................................................... 101
Supplementary Figure 4.2: ASM primary human cells express S1P receptors 1 to 3, both
sphingosine kinases and S1P lyase ............................................................................................... 102
Supplementary Figure 4.3: Sphingosine analogs do not negatively affect non-asthmatic lung
responsiveness to methacholine .................................................................................................... 103
xii
Chapitre V
Figure 5.1: Effects of bleomycin-induced injury on markers of inflammation and lung
function........................................................................................................................................... 118
Figure 5.2: Protocol outlining the days at which FTY720 was administered. ......................... 119
Figure 5.3: FTY720 either decreases or increases lung fibrosis depending on its period of
delivery. .......................................................................................................................................... 120
Figure 5.4: FTY720 enhances lung stiffness only when administered during the remodeling
phase. .............................................................................................................................................. 121
Figure 5.5: A low dose (0.1mg /kg) of FTY720 does not enhance vascular leakage in the lung.
......................................................................................................................................................... 122
Figure 5.6: FTY720 increases the expression of CTGF. ............................................................ 123
Chapitre VI
Figure 6.1 : Niveaux de transcrits de médiateurs fibrotiques et des composantes de la voie de
la S1P par des fibroblastes pulmonaires humains provenant de patients atteints de la FPI ou
non .................................................................................................................................................. 136
Figure 6.2 : La S1P module les niveaux de trasncripts de certains médiateurs fibrotiques ... 137
Figure 6. 3 : Un antagoniste de S1P3, TY-52156, diminue la surexpression du CTGF induite
par la S1P ....................................................................................................................................... 138
xiii
Liste des Abbréviations
α-SMA α-actine du muscle lisse; α-smooth muscle actin
AA-Mac Macrophage alternativement activé; Alternatively activated macrophages
ABC ATP-binding cassette transporters
AC Adenylyl cyclase-cyclic AMP
AF Autofluorescence
Alum Aluminum hydroxide adjuvant
AHR Hyperréactivité bronchique; Airway hyperresponsiveness
ANOVA Analyse de la variance; Analysis of variance
ASM Muscle lisse bronchique; airway smooth muscle
BALF Fluide du lavage bronchoalvéolaire; Bronchoalveolar lavage fluid
BrdU Bromodeoxyuridine
CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2
CD Classe de différenciation; Cluster of differentiation
CDase Ceramidase
COL1A1 Collagène type I, chaine α-1
COL3A1 Collagène type III, chaine α-1
COX Cytochrome c oxidase
CTFG Connective tissue growth factor
DC Cellules dendritiques; Dendritic cells
Delta-ct Différence de limite de cycle; difference of threshold cycle
dH2O Eau distillée
cDNA Acide désoxyribonucléique complémentaire; Complementary deoxyribonucleic
acid
ECM Matrice extracellulaire; Extracellular matrix
EDA-FN Fibronectine contenant des domaines A supplémentaires; extra-domain-A-
containing fibronectin
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
EMT Transition épithélio-mésenchymateuse; Epithelial–mesenchymal transition
ERK Extracellular signal-regulated kinase
FcεRI Récepteur 1 à haute affinité liant la partie Fc des IgE
FPI (IPF) Fibrose pulmonaire idiopathique; Idiopathic pulmonary fibrosis
FRQS Fonds de recherche du Québec – Santé
FTY720-P Forme phosphorylée de FTY720
Gnb2L1 Guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-Like 1
H&E Coloration à l'hématoxyline-éosine; Hematoxylin and eosin stain
HDAC Histone desacetylase
HDM Extrait d’acarien domestique (D.pteronyssinus); House dust mite extract
HPRT Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransfrase
IF-γ Interféron-γ
IgE Immunoglobuline de classe E
IgG1 Immunoglobuline de classe G1
IL Interleukine
i.n Intranasale
i.p Intrapéritonéale
IRSC Instituts de recherche en santé du Canada
i.t Intratrachéale
JNK Jun amino terminal kinase
MCh Méthacholine
xiv
MHC-II Complexe majeur d'histocompatibilité de classe 2; Class 2 major histocompatibility
complex
MLN Mediastinal lymph nodes
MMP Métalloprotéinase matricielle; Matrix metalloproteinase
mRNA Acide ribonucléique messager; Messenger ribonucleic acid
OVA Ovalbumine
PAI Inhibiteurs de l'activateur du plasminogène 1 et 2
PAS Periodic acid–Schiff
PBS Solution saline tamponnée au phosphate; Phosphate buffered saline
PDGF Platelet-derived growth factor
PE Phosphoéthanolamine
PHB2 Prohibitin 2
Rho Petites GTPases de la famile Rho
PI3K-AKT Phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B
PLC Phospholipase C
PP2A Protein phosphatase 2A
Rplp0 Ribosomal protein, large, p0
Rrs Respiratory system resistance
RSR Réseau en Santé Respiratoire du Québec
RT-PCR Real-time quantitative polymerase chain reaction
S1P Sphingosine-1-phosphate
S1P1-5 Récepteurs de la S1P 1 à 5
S1PP1-2 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 and 2 (aussi nommé SGPP)
S1PR1-5 Gènes des récepteurs de la S1P 1 à 5
SAL Saline
SEM Standard error of mean
Ser + PalCoA Sérine + palmitoyl-coenzyme A
SGPL1 Sphingosine-1-phosphate lyase
SMase Sphingomyelinase
SphK1-2 Sphingosine kinase 1 and 2
SPNS2 Spinster homolog 2
SSC Side scatter
TBP Protéine liant la boite TATA; TATA-box-binding protein
TF Tissue factor
TIMP Inhibiteur tissulaire des MMP; Tissue inhibitor of MMP
TGF-β Transforming growth factor-β
Th1 Lymphocytes T auxiliaries de type 1 effecteurs
Th2 Lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs
Th2M Lymphocytes T auxiliaires de type 2 mémoires
TNF Tumor necrosis factor
TSLP Thymic stromal lymphopoietin
VEH Véhicule
xv
Remerciements
Après toutes ces années arrive la fin de mon doctorat. Ce fut un temps rempli de déceptions et de
succès, à la fois éprouvant et gratifiant, mais duquel je sors grandi et fier. Je n’aurais pas pu accomplir
celui-ci sans le soutien de nombreuses personnes.
Tout d’abord, je voudrais remercier mon directeur de recherche David Marsolais de m’avoir accepté
au sein de son équipe naissante et de son support tout au long de ma maitrise et de mon doctorat.
Merci d’avoir continué à m’encourager à travers les moments difficiles et de tes efforts pour m’aider
à gérer ma désorganisation et mon penchant à m’étaler. Bien que je ne continue pas dans la voie de
la recherche, le savoir et l’expertise que tu m’as inculqués resteront toujours précieusement avec moi.
Merci de m’avoir encouragé dans mes projets futurs.
Je veux aussi remercier Marie-Renée Blanchet, Ynuk Bossé et Élise Bissonnette pour leur support et
celui des membres de leurs équipes. Les rencontres de laboratoire de la famille élargie ont toujours
été bonifiées par votre présence, sans oublier toutes vos contributions aux publications qui ont résulté
en cette thèse.
J’aimerais aussi remercier tous les assistants/associés de recherche qui ont participé de proche ou de
loin à mes projets. Je pense, sans ordre particulier, à Anne-Marie, Pascale, Marie-Josée, Sophie, Dany,
Sylvie, Anick et Marc. Merci de votre aide et de votre support qui se sont avérés inestimables, aussi
bien dans le laboratoire que dans la vie. Je n’aurais pas accompli tout ce travail sans vous.
Merci à tous mes collègues pour les discussions (scientifiques ou non) sans fin et les sorties bières.
Vous avez été une grande partie de ma vie pendant toutes ces années et j’en garde des souvenirs
précieux. Je voudrais remercier en particulier Michel, pour temps et la patience de former la personne
sans réelles expériences de laboratoire que j’étais, et Émilie, pour son aide précieuse au temps où nos
équipes respectives partageaient encore un U.
Merci à ma famille qui m’a toujours supporté dans mes études, même s’ils n’ont jamais compris ce
que je fais. Un merci particulier à mon frère Samuel d’avoir été là autant dans les bons que les mauvais
moments. Merci à mes parents d’avoir fait en sorte que je sois la personne que je suis et des sacrifices
que vous avez faits pour éduquer trois enfants.
Finalement, je veux remercier l’amour de ma vie, ma belle Vevi. Je ne sais pas ce que je ferais sans
toi à mes côtés. Merci de ta patience, je sais que ça en prend beaucoup pour vivre avec moi. Merci de
ton amour, à travers les bons et les mauvais moments. Merci de ton support dans le choix de mon
xvi
futur. Les plus belles années de ma vie ont été avec toi et je souhaite que le futur nous réserve encore
du bonheur ensemble. Je t’aime mon amour.
xvii
Avant-propos
Le manuscrit présenté au chapitre III intitulé « Treatment with a sphingosine analog after the
inception of house dust mite-induced airway inflammation alleviates key features of experimental
asthma » a été publié dans le journal Respiratory Research en février 2015. J’en suis l’auteur principal
et il est coécrit avec Anne-Marie Lemay, Claudine Tremblay, Laetitia JA Lai, Anick Langlois, Émilie
Bernatchez, Nicolas Flamand, Marie-Renée Blanchet, Anthony S. Don, Ynuk Bossé, Élyse
Bissonnette et David Marsolais. J’ai effectué les expériences, l’analyse et l’interprétation des résultats
et la révision de ce manuscrit, en collaboration avec les co-auteurs. Serge Simard, Marc Veillette et
Marie-Josée Beaulieu ont été remerciés pour leur aide et leur expertise. Hugh Rosen a été remercié
pour avoir fournir AAL-R et Daniel Guay pour la synthèse des analogues de la sphingosine. J’ai reçu
une bourse du Réseau en Santé Respiratoire du Québec (RSR) durant ce projet. Ce projet de recherche
a été supporté par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (#274357), le RSR et la
fondation canadienne pour l’innovation. Les expérimentations, l’hébergement et les soins ont été
approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université Laval en concordance avec les
recommandations du Conseil Canadien de Protection des Animaux (protocole 2011164). Des
modifications mineures du format ont été effectuées dans le manuscrit et la numérotation des figures
a été adaptée. DOI : 10.1186/s12931-015-0180-z
Le manuscrit présenté au chapitre IV intitulé « A phosphorylatable sphingosine analog induces airway
smooth muscle cytostasis and reverses airway hyperresponsiveness in experimental asthma » a été
publié dans le journal Frontiers in Pharmacology en février 2017. J’en suis l’auteur principal et il est
coécrit par Pascale B. Lecours, Anne-Marie Lemay, Marie-Josée Beaulieu, Carole-Ann Huppé,
Audrey Lee-Gosselin, Nicolas Flamand, Anthony S. Don, Élyse Bissonnette, Marie-Renée Blanchet,
Mathieu Laplante, Sylvain G. Bourgoin, Ynuk Bossé et David Marsolais. J’ai effectué les
expérimentations, l’analyse et l’interprétation des résultats et l’écriture et la révision du manuscrit, en
collaboration avec les coauteurs. Serge Simard, Marc Veillette et Dany Patoine ont été remerciés pour
leur aide et leur expertise. J’ai reçu une bourse du RSR et du Fonds de recherche du Québec – Santé
(FRQS). Ce projet de recherche a été supporté par les IRSC (#274357) et le RSR. Les
expérimentations, l’hébergement et les soins ont été approuvés par le Comité de protection des
animaux de l’Université Laval en concordance avec les recommandations du Conseil Canadien de
Protection des Animaux (protocole 2013037). Des modifications mineures du format ont été
effectuées dans le manuscrit et la numérotation des figures a été adaptée. DOI :
10.3389/fphar.2017.00078
xviii
Le manuscrit présenté au chapitre V intitulé « FTY720 promotes pulmonary fibrosis when
administered during the remodeling phase following a bleomycin-induced lung injury » a été publié
dans le journal Pulmonary Pharmacology & Therapeutics en mars 2017. J’en suis l’auteur principal
et il est coécrit avec Anne-Marie Lemay, Pascale Blais Lecours, Valérie Perreault-Vallières, Carole-
Ann Huppé, Ynuk Bossé, Marie-Renée Blanchet, Geneviève Dion et David Marsolais. J’ai effectué
les expérimentations, l’analyse et l’interprétation des résultats et l’écriture et la révision du manuscrit,
en collaboration avec les coauteurs. Serge Simard et Natacha LeBrasseur ont été remerciés pour leur
aide et leur expertise. J’ai reçu une bourse du RSR et du FRQS. Ce projet de recherche a été supporté
la Fondation de l’IUCPQ, les Fonds sur les maladies respiratoires J.-D.-Bégin - P.-H.-Lavoie et les
Fonds Alphonse L’Espérance. Les expérimentations, l’hébergement et les soins ont été approuvés par
le Comité de protection des animaux de l’Université Laval en concordance avec les recommandations
du Conseil Canadien de Protection des Animaux (protocole 2014122). Des modifications mineures
du format ont été effectuées dans le manuscrit et la numérotation des figures a été adaptée. DOI :
10.1016/j.pupt.2017.03.010
Candidats à la maitrise : Audrey Lee-Gosselin, Valérie Perreault-Vallières
Candidats au Ph.D. : Carole-Ann Huppé, Émilie Bernatchez ,Laetitia JA Lai
Professionnels de recherche : Anick Langlois, Anne-Marie Lemay, Marie-Josée Beaulieu, Pascale
B. Lecours
Chercheurs associés l’Université Laval : Nicolas Flamand, Marie-Renée Blanchet, Ynuk Bossé,
Élyse Bissonnette, Mathieu Laplante, Sylvain G. Bourgoin, David Marsolais
Chercheurs à l’Université de Sydney : Anthony S. Don
Pneumologue à l’IUCPQ : Geneviève Dion
Vétérinaire à Charles River Laboratories : Claudine Tremblay
1
1. Chapitre I : Introduction
1.1 Le remodelage pulmonaire
La réparation tissulaire est cruciale à la survie de l’organisme. Elle implique des mécanismes
complexes et interreliés qui varient en fonction de l’organe atteint et du type de blessure [1]. La
réparation tissulaire peut soit permettre de retrouver l’état original de l’organe, ce qu’on appelle la
régénération, soit altérer sa structure, ce qui réfère au processus de cicatrisation [2].
Malheureusement, peu d’organes, comme le foie, l’endomètre et les os, sont capables de régénération
chez l’humain. Ainsi, la plupart des blessures entrainent en la formation de tissus cicatriciels, ce qui
est souvent associée à une dégradation de la fonction de l’organe atteint. Le contrôle optimal des
mécanismes de la cicatrisation est donc nécessaire au maintien de la fonction de l’organe au fil du
temps.
Le poumon est un organe complexe qui assure les échanges gazeux. Étant à l’interface du système
sanguin et de l’air, il agit à titre de barrière tant physique qu’immunologique [3]. En ce sens, il est
constamment exposé à des irritants, à des organismes infectieux (bactéries, virus et, plus rarement,
parasites) et à des particules organiques ou non, incluant des allergènes. Cependant, comme une
réaction inflammatoire contre chaque particule étrangère risquerait d’interférer avec le bon
fonctionnement du poumon, celui-ci est dit «immuno-privilégié», c’est-à-dire que la surveillance
immunologique y est optimisée pour minimiser l’inflammation [4].
Plusieurs causes d’inflammation pulmonaire chronique sont connues, incluant certains agents
infectieux (p. ex. la tuberculose), les irritants inhalés (p. ex. la fumée de cigarette), les particules
inorganiques (p. ex. la micropoussière de silice) et les allergènes (p. ex. les antigènes d’acariens
domestiques; D.pteronyssinus) [5]. L’inflammation pulmonaire induit plusieurs altérations
réversibles au poumon, dont l’infiltration de cellules inflammatoires dans le parenchyme pulmonaire
et les voies aériennes ainsi que l’œdème pulmonaire et l’accumulation de mucus dans la lumière
bronchique [5]. Cependant, l’inflammation chronique peut aussi induire des altérations non
réversibles de l’architecture du poumon, ce que l’on appelle le remodelage pulmonaire [2, 6]. Bien
que l’inflammation pulmonaire chronique soit un facteur important dans le remodelage pulmonaire,
elle ne semble pas obligatoire pour sa progression, comme il est actuellement postulé dans le cas de
la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) [7].
2
Le remodelage pulmonaire regroupe plusieurs présentations (Figure 1.1) et mécanismes, selon la
pathologie sous-jacente. Le remodelage bronchique cause une diminution de la lumière bronchique,
diminuant le flot de l’air (syndrome obstructif). Il inclut l’hypertrophie/hyperplasie de l’épithélium
et du muscle lisse bronchique, la prolifération des cellules caliciformes et leur production de mucus
ainsi que la déposition de matrice extracellulaire sous-épithéliale [8]. Le remodelage alvéolaire inclut
aussi bien l’emphysème que la fibrose pulmonaire. Le premier est causé par la disparition des parois
alvéolaires, diminuant la capacité élastique du poumon et limitant le flot expiratoire [9]. Le second
est causé par le remplacement de la structure alvéolaire par du tissu cicatriciel, impliquant
l’infiltration et la prolifération des fibroblastes et la déposition de matrice extracellulaire dans le
parenchyme pulmonaire, menant ainsi à la perte de compliance et de volume pulmonaire (syndrome
restrictif) [2]. Dans les deux cas, ces altérations augmentent l’effort respiratoire et interfèrent avec les
échanges gazeux. Bien que le remodelage emphysémateux soit une conséquence importante de
certaines conditions pulmonaires, comme la maladie pulmonaire obstructive chronique, cette thèse se
concentrera sur le remodelage bronchique observé dans l’asthme et le remodelage alvéolaire observé
dans la fibrose pulmonaire.
Figure 1.1: Comparaison des présentations histologiques du remodelage pulmonaire
Selon la pathologie sous-jacente, le remodelage peut affecter différentes zones du poumon. L’asthme
induit principalement le rétrécissement de la lumière bronchique (lumen) par l’épaississement des
composantes de la paroi bronchique. Comparativement, la fibrose pulmonaire (fibrosis) affecte le
parenchyme pulmonaire avec un remplacement des alvéoles par des fibroblastes et de la matrice
extracellulaire. Au contraire, l’emphysème (emphysema) est causé par la destruction du tissu
alvéolaire. Ep : Épithélium; Bv : Vaisseau sanguin; Sm : Muscle lisse bronchique, Bm : Membrane
basale. Figures adaptées avec permission à partir de Wadsworth et al., 2011 [10], Lynch and Jaffe,
2006 [11], Nephron, 2009 [12] et Smith, 2009 [13].
3
1.2 L’asthme
L’asthme est une maladie pulmonaire chronique affectant 235 millions de personnes dans le monde
et, vraisemblablement, 100 millions de personnes supplémentaires seront touchées d’ici 2025 [14].
Malgré la disponibilité des traitements, 250 000 personnes par année en décèderont [14]. En
Amérique du Nord, l’asthme affecte environ 8% des adultes et jusqu’à 13 % des enfants [15, 16],
dont 70% resteront asthmatiques à l’âge adulte, mais ces nombres varient grandement selon les
régions du monde [17]. Bien que l’asthme affecte aussi bien les hommes que les femmes, il est plus
commun chez les enfants mâles et cette situation s’inverse à l’âge adulte [18]. Au Canada et aux
États-Unis, les coûts directs et indirects de l’asthme totalisent respectivement 12 milliards de dollars
canadiens [15] et 56 milliards de dollars américains. De plus, une fraction importante de ces coûts est
attribuable aux patients atteints d’asthme sévère et réfractaire aux traitements actuels [19], bien qu’ils
représentent moins de 10% de la population souffrante d’asthme [20]. L’asthme est ainsi une maladie
en croissance, et démontre un coût social et économique important.
Plusieurs facteurs de risque de l’asthme ont été identifiés et regroupés en deux grandes catégories :
les prédispositions génétiques et l’environnement [21]. Bien qu’un historique familial d’asthme et/ou
d’allergies soit un prédicteur puissant du développement de l’asthme [22], les études génétiques ne
permettent d’expliquer qu’une faible partie de l’héritabilité de l’asthme [23] et ce malgré plus de 120
gènes de susceptibilités identifiés [24]. Comparativement, les facteurs environnementaux sont mieux
identifiés et l’importance de leur rôle est supportée par la rapide augmentation de la prévalence de
l’asthme, corrélant avec l’urbanisation et les changements dans le style de vie [25]. Les facteurs de
l’environnement peuvent être de nature allergénique ou non. Ces derniers incluent la fumée de
cigarette, les infections virales, la pollution de l’air et les irritants chimiques [15]. Chez les enfants,
les facteurs allergéniques déclenchent souvent un asthme plus sévère. Les enfants avec un asthme
allergique sont plus sujets à rester asthmatiques à l’âge adulte [26]. D’ailleurs, chez les adultes,
l’asthme allergique est le plus fréquent, touchant 70% des patients asthmatiques [14]. L’asthme
allergique implique des allergènes communs et ubiquitaires comme les antigènes d’acariens
domestiques, le pollen, les moisissures et les antigènes de nature animale [27]. Bien que les causes
exactes de l’asthme ne soient pas identifiées, les facteurs de risque favorisent son développement et
contribuent aux symptômes et aux exacerbations.
Les symptômes de l’asthme incluent une dyspnée, une toux, une respiration sifflante et une oppression
thoracique [15]. Ces symptômes sont principalement causés par une obstruction bronchique induite
par une augmentation du volume du tissu bronchique, une présence de mucus ainsi qu’un
rétrécissement du muscle lisse bronchique (c.-à-d. la bronchoconstriction), réduisant le calibre des
4
voies aériennes. Dans l’asthme, la bronchoconstriction est conséquente à l’hyperréactivité bronchique
induite par l’inhalation d’allergènes, d’irritants ou même simplement d’un air sec ou froid. Un effort
physique important peut aussi suffire à induire un bronchospasme chez les personnes atteintes
d’asthme [28]. Ces stimuli peuvent induire une inflammation réversible des voies aériennes via le
recrutement et l’activation de cellules inflammatoires. L’inflammation, quant à elle, augmente
l’œdème de la paroi bronchique et favorise la production de mucus, augmentant ainsi l’obstruction
bronchique. Il est bien accepté que l’inflammation pulmonaire chronique contribue au remodelage
permanent des voies aériennes [8]. Le diagnostic de l’asthme inclut donc la mesure de l’obstruction
bronchique et la réversibilité (bronchodilatateur) de la contraction par un bronchodilatateur avec à
l’aide d’un appareil de spirométrie [29]. L’analyse des expectorations induites afin de déterminer la
présence et la quantité de cellules inflammatoires (principalement les éosinophiles) dans le sputum
peut aussi être effectuée [30]. Par conséquent, l’inflammation bronchique et la bronchoconstriction
contribuent aux symptômes de l’asthme et sont les principaux mécanismes visés par les agents
thérapeutiques actuels.
Les traitements de l’asthme visent à contrôler les symptômes afin que ces derniers n’interfèrent pas
avec les activités quotidiennes et que les patients ne nécessitent pas de médications de secours. Il est
important de noter que ces traitements sont palliatifs, et non curatifs, et ne permettent que de diminuer
les symptômes et ralentir la progression de la maladie [31]. Actuellement, les traitements couramment
utilisés dans l’asthme sont les bronchodilatateurs et les anti-inflammatoires. Les bronchodilatateurs
ciblent directement la contraction du muscle lisse bronchique par plusieurs mécanismes. Les β-
agonistes activent les récepteurs adrénergiques, induisant la relaxation de du muscle lisse bronchique
[32]. À l’inverse, les anticholinergiques sont des antagonistes des récepteurs de l’acétylcholine, un
neurotransmetteur ayant un effet bronchoconstricteur sur le muscle lisse bronchique [33]. Les
bronchodilatateurs peuvent être à courte ou longue action. Les premiers visent un soulagement
immédiat de la bronchoconstriction, par exemple suite à un effort physique important, et les seconds
visent à contrôler les symptômes de l’asthme au repos [31].
Les anti-inflammatoires, comme les corticostéroïdes inhalés, sont le traitement de première ligne pour
diminuer l’inflammation bronchique chronique observée dans l’asthme. Si une dose plus élevée est
nécessaire afin de réduire l’inflammation, les corticostéroïdes peuvent aussi être donnés par voie
orale. Les mécanismes affectés par les corticostéroïdes sont multiples : ils inhibent le recrutement et
l’activation de plusieurs cellules inflammatoires, diminuent l’expression de gènes pro-
inflammatoires, favorisent l’expression de gènes anti-inflammatoires et potentialisent l’effet des β-
agonistes en augmentant l’expression et l’activité de leurs récepteurs [34]. Si l’utilisation de
5
corticostéroïdes est insuffisante pour contrôler l’asthme, d’autres options thérapeutiques sont
disponibles. Administrés seuls ou en combinaison avec les corticostéroïdes, les anti-leucotriènes
inhibent le recrutement des éosinophiles [35]. Les anticorps monoclonaux contre les
immunoglobulines de classe E (IgE) lient ces derniers et inhibent l’activation des mastocytes et des
lymphocytes [36]. Cependant, ces traitements visent un phénotype particulier de l’asthme (anti-
leucotriène) ou doivent être administrés par un professionnel de la santé (anticorps monoclonaux
contre les IgE). Malgré l’efficacité et la disponibilité des traitements actuels, environ 50% des patients
asthmatiques sont résilients aux corticostéroïdes inhalés [37]. De plus, bien que ces traitements
permettent de ralentir ou arrêter le remodelage bronchique observé dans l’asthme, ils sont inefficaces
pour atténuer le remodelage déjà établi chez l’humain [38]. Il faut noter que les corticostéroïdes
diminuent le remodelage bronchique observé dans l’obstruction bronchique récurrente des chevaux,
un syndrome similaire à l’asthme, soulignant le manque de connaissance des mécanismes supportant
le remodelage pulmonaire [39]. L’une des thérapies émergentes de l’asthme sévère est la
bronchothermoplastie qui permet de réduire la masse du muscle lisse bronchique dans les voies
centrales. Toutefois, les bénéfices sont limités, ou même absents, chez certains patients atteints
d’asthme. Il y a donc un besoin criant de développer de nouvelles thérapies ciblant les asthmes sévères
et résilients impliquant du remodelage bronchique.
6
1.2.1 La physiopathologie de l’asthme
Bien que l’asthme soit souvent perçu comme une condition unique, il s’agit plutôt d’un regroupement
hétérogène de maladies ayant des présentations cliniques similaires. Selon le Global Initiative for
Asthma [40], les phénotypes les plus fréquents sont l’asthme allergique, l’asthme non allergique,
l’asthme tardif, l’asthme avec limitation du flot de l’air fixe et l’asthme avec obésité. L’étiologie de
ces phénotypes varie grandement quant à l’âge d’apparition, les facteurs exacerbant l’asthme, la
prévalence selon le sexe, la résistance aux corticostéroïdes et la présence de certains types de cellules
inflammatoires, comme les neutrophiles et les éosinophiles [41]. Comme discuté précédemment,
l’asthme allergique affecte la majorité des patients atteints d’asthme et sera donc le phénotype étudié
au cours de cette thèse.
Les patients souffrant d’asthme allergique sont dits « sensibilisés », c’est-à-dire qu’ils ont développé
une réponse immunitaire adaptative anormale suite à l’exposition répétée à un allergène. Une fois
sensibilisée, l’exposition à cet allergène induit une réponse inflammatoire allergique immédiate (une
période en secondes ou minutes), impliquant l’activation des mastocytes et induisant un
bronchospasme [21, 42]. Cette réponse immédiate enclenche aussi le recrutement et l’activation de
nombreuses cellules immunitaires, dont les éosinophiles et les lymphocytes T auxiliaires. Cette
accumulation de cellules inflammatoires activées contribue à l’inflammation et la
bronchoconstriction lors de la réaction tardive [21, 43]. Les médiateurs inflammatoires impliqués,
ainsi que l’expression de facteurs de croissance, induisent le remodelage des voies aériennes,
particulièrement l’épaississement du muscle lisse bronchique [44]. L’inflammation allergique est
donc centrale au maintien de l’asthme et à son exacerbation, mais aussi au remodelage bronchique.
7
Figure 1.2: Suite chronologique des étapes de la sensibilisation et des interactions entre les
cellules immunitaires et leurs médiateurs dans le développement de l’asthme allergique.
Suite à l’exposition à un allergène par inhalation, celui-ci est capturé par les cellules dendritiques
(DC) à l’épithélium bronchique. La présence de facteurs inflammatoires, comme le thymic stromal
lymphopoietin (TSLP), l’interleukine (IL)-25 et l’IL-33, favorisent la sensibilisation allergique. Aux
ganglions lymphatiques, les DC activeront les cellules T naïves (Th0) en lymphocytes T auxiliaires
de type 2 effecteurs (Th2). Ces Th2 induiront la production d’immunoglobuline de classe E (IgE)
par les lymphocytes B et migreront au poumon afin d’effectuer la surveillance immunitaire. Les
mastocytes, déjà dans les muqueuses pulmonaires, lieront les IgE en circulation afin de participer à
la surveillance immunitaire. Figure adaptée avec permission à partir d’Islam et Luster, 2012 [45].
8
1.2.2 La sensibilisation
Plusieurs étapes immunologiques sont nécessaires à la sensibilisation à un allergène et à la
surveillance immunitaire subséquente (Figure 1.2). Normalement, l’inhalation d’un allergène
potentiel est inoffensive et ne déclenche pas de réaction inflammatoire [46]. L’allergène doit faire
face à la barrière physique du poumon où il peut être éliminé de manière physique (aussi nommée
élimination silencieuse) par expulsion du système respiratoire grâce à l’action des ciliations des
cellules épithéliales bronchiques et de la toux. Il peut aussi être éliminé suite à sa phagocytose par les
macrophages alvéolaires [5, 47]. Cependant, il a été observé que, chez les patients atteints d’asthme,
la fonction des cils épithéliaux est diminuée et que les macrophages alvéolaires, qui normalement ont
un phénotype régulateur, acquièrent plutôt un phénotype pro-inflammatoire [48]. De plus, plusieurs
allergènes, dont les antigènes d’acariens domestiques, possèdent une activité protéase, ce qui
endommage les jonctions épithéliales et stimule le relargage de thymic stromal lymphopoietin,
d’interleukine (IL)-25 et d’IL-33 [49, 50]. Cela permet aussi à l’allergène de passer dans le milieu
sous-épithélial. Par conséquent, l’altération des défenses de la barrière épithéliale favorise la
sensibilisation allergique.
Des cellules présentatrices d’antigènes spécialisées, les cellules dendritiques, situées sous cet
épithélium participent aussi à la sensibilisation allergique. Elles peuvent capter aussi bien les
allergènes à la surface de l’épithélium, à l’aide de longs dendrites s’infiltrant entre les jonctions
épithéliales, que les antigènes dans le milieu sous-épithélial [51]. Des récepteurs de reconnaissance
de motifs moléculaires favorisent l’adhésion et la phagocytose de l’allergène, permettant ainsi
l’activation des cellules dendritiques. L’allergène est ensuite fragmenté par hydrolyse et les peptides
résultants sont présentés au système immunitaire par le complexe majeur d'histocompatibilité de
classe II [51]. Cependant, en présence de thymic stromal lymphopoietin, d’IL-25 et/ou d’IL-33, les
cellules dendritiques acquièrent un phénotype promouvant une réponse allergique [52]. Suite à la
migration des cellules dendritiques aux ganglions lymphatiques secondaires afférents, ceux-ci vont
présenter des peptides de l’allergène aux lymphocytes T auxiliaires naïf par l’entremise des récepteurs
spécialisés de ces derniers. L’activation des cellules dendritiques et leur polarisation vers un
phénotype favorisant la sensibilisation allergique sont une étape centrale au développement de
l’asthme.
9
Le type de réponse immune est déterminant dans le développement de l’asthme. Chez les individus
non allergiques, la présentation d’un allergène inoffensif déclenchera une réaction tolérogène
impliquant la polarisation des lymphocytes T auxiliaires naïfs en lymphocytes T auxiliaires
régulateurs. Ces lymphocytes produisent des médiateurs régulateurs, dont l’IL-10, empêchant une
subséquente activation de la cascade inflammatoire par le même antigène [53]. Cependant, chez les
individus sensibilisés, la présence de médiateurs comme l’IL-4 et l’IL-13 vont promouvoir la
polarisation des lymphocytes T auxiliaires naïfs en lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs
(Th2) et leur subséquente prolifération. Comme cette polarisation est centrale à la réponse immune
allergique, celle-ci est souvent nommée réponse immune Th2, alors que la réponse immune classique
est nommée Th1. La source initiale d’IL-4 reste encore non résolue [51], mais plusieurs évidences
suggèrent que les basophiles et/ou les mastocytes en sont responsables [21]. De plus, les cellules
lymphoïdes innées de type 2, n’ayant pas de TCR, répondent à la présence d’IL-25 [54] et seraient
nécessaires au développement d’une réponse inflammatoire de type Th2 [55]. De plus, ceux-ci
seraient nécessaires au maintien de l’inflammation allergique pulmonaire en participant à la
production continue d’IL-13 [56]. Cependant, la production subséquente d’IL-4 provient
principalement des lymphocytes Th2 [21]. La polarisation des lymphocytes T auxiliaires naïfs en
lymphocytes Th2 est une caractéristique clé du développement de l’asthme allergique.
Les lymphocytes Th2 stimulent les lymphocytes B et induisent leur maturation en cellules
plasmatiques et la transition de la production d’immunoglobuline de classe M à celle d’IgE [57]. Ces
IgE passent dans la circulation sanguine pour atteindre les mastocytes résidents dans les tissus. Les
mastocytes sont particulièrement regroupés dans les muqueuses, dont le nez et les intestins, ainsi que
la peau et le parenchyme pulmonaire. Ils sont aussi retrouvés à proximité du muscle lisse bronchique.
Les IgE se lient aux récepteurs 1 à haute affinité liant la partie Fc des IgE (FcεRI) exprimés à la
surface des mastocytes, augmentant leur survie et les préparant à répondre à une exposition à
l’allergène ciblé [42]. Les basophiles expriment aussi des FcεRI et possèdent des fonctions similaires
aux mastocytes, mais ils sont comparativement rares et leur rôle est encore mal compris [21]. La
production d’IgE spécifiques à l’antigène par les lymphocytes B contribue ainsi à la sensibilisation
dans l’asthme allergique. Suite à leur activation, les lymphocytes Th2 peuvent aussi sortir des organes
lymphoïdes secondaires et migrer jusqu’au poumon pour se localiser dans le parenchyme pulmonaire.
Ils se différentient alors en Th2 mémoires et effectuent la surveillance immunitaire, afin de pouvoir
répondre rapidement à une nouvelle exposition à l’allergène [58]. Par conséquent, la sensibilisation
allergique dans l’asthme induit la présence de Th2 mémoires et d’IgE dans le tissu pulmonaire,
favorisant la réactivation d’une réponse immune de type Th2.
10
1.2.3 La cascade inflammatoire
Suite à la sensibilisation à un allergène, plusieurs cellules immunitaires spécifiques à cet antigène
sont situées à proximité de l’épithélium bronchique et effectuent la surveillance pulmonaire (Figure
1.3). Par conséquent, une nouvelle exposition à cet antigène induit une réponse inflammatoire rapide
et importante. Les IgE associées aux FcεRI sur les mastocytes lient l’allergène et se multiplexent, ce
qui induit leur dégranulation ainsi que le relargage d’histamine et de protéases. De plus, les
mastocytes produisent plusieurs médiateurs inflammatoires lipidiques, comme les leucotriènes et les
prostaglandines ainsi que les cytokines IL-4, IL-5 et tumor necrosis factor (TNF) [21]. L’histamine
et les médiateurs inflammatoires lipidiques induisent la constriction du muscle lisse bronchique, la
production de mucus et la vasodilatation des capillaires, cette dernière facilitant le recrutement des
cellules inflammatoires. Les protéases et les médiateurs inflammatoires lipidiques endommagent
aussi l’épithélium, augmentant la réponse inflammatoire. De plus, ces médiateurs inflammatoires
lipidiques sont aussi des chimioattractants pour les mastocytes eux-mêmes [59, 60]. Suite à
l’exposition à un allergène, les mastocytes participent ainsi à la bronchoconstriction rapide et à la
propagation de la réponse inflammatoire.
En parallèle à l’activation des mastocytes, les cellules dendritiques captent de nouveau l’allergène.
Ils peuvent ainsi réactiver les lymphocytes Th2 mémoires résidant dans le parenchyme pulmonaire
[61]. Suite à la migration des cellules dendritiques aux organes lymphoïdes secondaires, ils peuvent
polariser de nouveaux lymphocytes T auxiliaires naïfs en lymphocytes Th2, similairement au
processus de la sensibilisation. Le recrutement et l’activation des lymphocytes Th2 est accentué par
l’IL-4 produit par les mastocytes. Les lymphocytes Th2 activés produisent de grandes quantités d’IL-
4, d’IL-5 et d’IL-13, contribuant au recrutement et à l’activation de plusieurs cellules inflammatoires,
incluant elles-mêmes. De plus, la stimulation des cellules épithéliales par l’IL-5 et l’IL-13 favorise la
production d’éotaxine, un chimioattractant puissant permettant le recrutement des éosinophiles
sanguins aux voies aériennes [21]. Les médiateurs inflammatoires secrétés par les lymphocytes Th2
sont aussi des bronchoconstricteurs et contribuent fortement à une bronchoconstriction soutenue. La
réactivation des lymphocytes Th2 mémoire et la polarisation de nouveaux lymphocytes en
lymphocytes Th2 permet donc de maintenir l’inflammation allergique et les symptômes de l’asthme.
11
Les éosinophiles sont des cellules granulocytaires caractéristiques de l’asthme allergique et leur
nombre corrèle fortement avec la sévérité de la maladie [62]. Ils sont recrutés et activés par plusieurs
médiateurs produits par les mastocytes, les lymphocytes Th2 et les cellules épithéliales alvéolaires.
En plus de produire de l’IL-5, contribuant à leur propre recrutement, les éosinophiles possèdent des
granules contenant des facteurs toxiques, des protéines basiques, des médiateurs lipidiques et des
cytokines, dont le transforming growth factor-β (TGF-β) [21]. La dégranulation des éosinophiles
introduit de grandes quantités de ces facteurs complémentant et exacerbant l’inflammation. De plus,
la production TGF-β, favorise le remodelage pulmonaire [44]. L’accumulation des éosinophiles dans
le tissu pulmonaire contribue non seulement à la propagation de l’inflammation dans l’asthme, mais
aussi au remodelage bronchique.
Bien que la cascade inflammatoire allergique classique implique principalement les cellules
précédemment présentées, les macrophages et les neutrophiles peuvent aussi moduler la réponse
inflammatoire. De plus, chez certaines personnes atteintes d’asthme, les lymphocytes peuvent aussi
être polarisés pour produire de l’IL-17, favorisant le recrutement des neutrophiles. Ce phénotype est
d’ailleurs associé à l’asthme sévère résistant aux glucocorticstéroides [63]. Les macrophages
effectuent la phagocytose des cellules inflammatoires apoptotiques, favorisant la diminution de la
charge de médiateurs pro-inflammatoires [48]. Cependant, en présence d’IL-4 et/ou d’IL-13, ils
acquièrent une activation alternative profibrotique et expriment entre autres du TGF-β, favorisant le
remodelage [64]. Les neutrophiles produisent une grande variété de médiateurs inflammatoires et
d’enzymes dégradant la matrice extracellulaire, contribuant au remodelage bronchique. Bien que les
macrophages et les neutrophiles soient impliqués dans l’asthme, ils ne font pas l’objet d’une analyse
approfondie dans cette thèse.
En somme, dans l’asthme allergique, la réexposition à un allergène induit une inflammation rapide,
soutenue et importante. L’activation des cellules inflammatoires permet la propagation de la réponse
inflammatoire. Ces cellules produisent aussi des médiateurs stimulant leur propre activation. Ces
boucles de rétroactions positives et la redondance des signaux inflammatoires participent à la
chronicité de l’inflammation et sont démontrées par la présence d’inflammation en absence de
stimulation allergénique [21]. Cette inflammation chronique serait la source principale de facteurs
stimulant le remodelage bronchique.
12
Figure 1.3: Les étapes de l’inflammation allergique et du remodelage bronchique
La réexposition à un allergène active les mastocytes, induisant le relargage de plusieurs facteurs
inflammatoires permettant le recrutement et l’activation des lymphocytes Th2, avec l’aide des cellules
dendritiques. Les médiateurs inflammatoires produits par les mastocytes, les lymphocytes Th2 et les
cellules épithéliales bronchiques induisent le recrutement et l’activation des éosinophiles. Les
éosinophiles maintiennent l’inflammation et leur production de médiateurs profibrotiques favorise le
remodelage bronchique. IL : Interleukine; IgE : Immunoglobuline de classe E; Lymphocytes Th2 :
Lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs; TNF : Tumor necrosis factor; TGF-β : Transforming
growth factor-β.; Figure inspirée de Possa et al., 2013 [65].
13
1.2.4 Le remodelage bronchique
L’obstruction bronchique dans l’asthme allergique est causée par la bronchoconstriction induite par
les médiateurs inflammatoires, mais aussi par le remodelage de la paroi bronchique. Chez les
personnes souffrant d’asthme, l’épaisseur de la paroi bronchique peut être augmentée de 25 à 230%,
comparativement à des personnes non asthmatiques. Cet épaississement contribue fortement à la
sévérité de la maladie [44]. Le remodelage bronchique altère irréversiblement plusieurs composantes
de la paroi bronchique, dont l’épithélium, la membrane basale et le muscle lisse bronchique.
Étant la barrière physique entre le soi et l’environnement, l’épithélium bronchique est
particulièrement affecté dans l’asthme allergique. Les allergènes et l’inflammation endommagent les
cellules épithéliales et induisent leur desquamation [8, 51]. En absence de régénération épithéliale
suffisante, il peut y avoir un dénudement de la membrane basale, facilitant ainsi le passage des
allergènes à l’espace sous-épithélial [8]. La perte de ces cellules ciliées interfère avec l’élimination
silencieuse des allergènes [8, 66]. De plus, les cellules caliciformes parsemant l’épithélium prolifèrent
et augmentent leur production totale de mucus [67]. Les altérations de l’épithélium diminuent donc
la capacité de la barrière physique du poumon à contrer les allergènes et contribuent directement à
l’obstruction bronchique.
L’une des deux parties de la membrane basale, la lamina reticularis, est plus épaisse dans l’asthme.
Elle est constituée d’un réseau de matrice extracellulaire et son épaississement est principalement
causé par la déposition de matrice supplémentaire par les fibroblastes [8]. Les fibroblastes sont en
partie recrutés par les médiateurs profibrotiques, comme le TGF-β, exprimés par les éosinophiles
[68]. Bien que les mécanismes permettant la production et le maintien de la fibrose au niveau de la
membrane basale soient importants dans l’asthme, les détails de ces mécanismes seront discutés plus
profondément à la section 1.3. Il a été suggéré que la fibrose sous-épithéliale puisse être un mécanisme
permettant de contrer la bronchoconstriction en rigidifiant le tissu bronchique [8]. Malgré que
l’épaississement de la membrane basale soit une caractéristique de l’asthme contribuant à
l’obstruction bronchique, la fibrose sous-jacente est souvent désorganisée et fragmentée. Ces
altérations mènent à une perte d’élasticité et de support des bronches et pouvant occasionner la
fermeture des voies aériennes, comme observée dans les cas d’asthme fatal [51]. Le rôle de la fibrose
de la membrane basale est encore mal compris, mais son épaississement contribue néanmoins à la
diminution du calibre des voies aériennes.
14
Le muscle lisse bronchique est la composante de voies aériennes qui contrôle activement le calibre
des voies aériennes et son épaississement corrèle fortement avec la sévérité de la maladie [69]. De
fait, la thermoplastie bronchique, une technique endoscopique visant à réduire l’épaississement du
muscle lisse bronchique, permet de réduire les exacerbations et les visites à l’urgence des patients
avec un asthme sévère incontrôlé [70]. Il est important de noter que le muscle lisse bronchique des
personnes atteintes d’asthme n’est pas intrinsèquement plus fort que celui de personnes non
asthmatiques. La force générée par le muscle lisse bronchique ne dépend que de sa masse [71].
L’augmentation de la masse du muscle lisse bronchique est causée par l’augmentation du nombre de
cellules (hyperplasie) et par l’augmentation du volume cellulaire (hypertrophie) [72]. L’hyperplasie
peut être causée par la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques et le recrutement de
cellules précurseures transformées en myofibroblastes. Ces précurseurs peuvent être des fibrocytes,
des cellules épithéliales, des cellules endothéliales et des péricytes [73, 74]. Toutefois, l’implication
de plusieurs de ces précurseurs dans le l’hyperplasie du muscle lisse bronchique est contestée.
Plusieurs médiateurs promouvant l’hyperplasie et l’hypertrophie du muscle lisse bronchique
proviennent des cellules inflammatoires, dont les mastocytes (protéases, leucotriènes, histamine) et
les éosinophiles (TGF-β, leucotriènes, cytokines) [44]. En plus de participer à l’épaississement de la
paroi bronchique, l’augmentation de la masse du muscle lisse bronchique exacerbe l’obstruction
bronchique induite par les bronchospamogènes.
Le remodelage bronchique est directement relié à l’inflammation chronique de l’asthme allergique.
De fait, l’administration de corticostéroïdes en présence d’inflammation atténue cette dernière et la
progression du remodelage dans les modèles expérimentaux [39, 75] et chez l’humain [38]. De plus,
les corticostéroïdes semblent diminuer la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques
humaines in vitro [76]. Les anti-leucotriènes diminuent le remodelage dans un modèle murin résistant
aux corticostéroïdes [77] et diminuent la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques
humaines in vitro [78]. Cependant, les corticostéroïdes sont inefficaces pour diminuer le remodelage
préétabli chez l’humain alors que l’effet des anti-leucotriènes sur le remodelage préétabli n’a pas
encore été déterminé [38]. Le remodelage bronchique chez l’humain est, à priori, insensible aux
traitements actuels et augmente de manière irréversible l’obstruction bronchique [44]. Ces
observations confirment le besoin criant de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques ciblées sur le
remodelage.
15
1.2.5 Les modèles expérimentaux
L’asthme est une maladie complexe et hétérogène, impliquant un large éventail de types cellulaires
et de processus. Bien que les études impliquant des patients asthmatiques soient considérées comme
étant les plus pertinentes, celles-ci sont souvent limitées par les considérations légitimes d’éthique et
doivent être le moins invasives possible. Elles n’impliquent normalement que des questionnaires, des
analyses des fonctions pulmonaires, comme la spirométrie, et des liquides biologiques comme le
sputum et le sang, même si des études impliquant des biopsies bronchiques sont de plus en plus
utilisées. De plus, les variations génétiques entre les humains apportent des facteurs confondants qui
peuvent être difficiles à identifier lors de l’étude de mécanismes précis. Les modèles expérimentaux
demeurent donc essentiels pour l’avancement de la compréhension de l’asthme et de ses traitements.
Bien que les modèles animaux ne récapitulent pas la totalité des caractéristiques de l’asthme, ils
permettent d’étudier plus finement les mécanismes sous-jacents. Malgré les différences dans
l’architecture pulmonaire entre les humains et les modèles animaux, l’épaississement du muscle lisse
bronchique contribue ubiquitairement à l’hyperréactivité bronchique. Les modèles d’asthme
expérimentaux ont été développés chez plusieurs espèces, dont Mus musculus (souris), Rattus
norvegicus (rat), Cavia porcellusm (cobaye; [79]) et Macaca mulatta (macaque rhésus; [80])
Cependant, ce dernier est limité quant à son accessibilité et la disponibilité des réactifs de laboratoires
applicables. Les cobayes et les rats développent des signes d’asthme incluant une réponse immune
immédiate et une réponse immune tardive [81]. Étant de plus gros animaux que les souris, les rats et
les cobayes facilitent l’étude histologique des voies aériennes. Pour leur part, les modèles de souris
sont peu coûteux, reproductibles et démontrent plusieurs des caractéristiques de l’asthme [81].
Cependant, la présence d’une phase immune tardive est controversée [81] et les signes de l’asthme
semblent se résorber après l’arrêt de l’exposition à l’antigène [82]. La disponibilité d’un nombre
toujours croissant de mutants génétiques murins permet aussi de décortiquer l’implication spécifique
de plusieurs gènes et types cellulaires [83]. Deux lignées murines sont couramment utilisées dans les
modèles d’asthme : C57Bl/6 et BALB/c [84]. Les souris C56Bl/6 développent une inflammation plus
importante que les BALB/c. De plus, la plupart des modifications génétiques sont effectuées dans les
souris C57B/6 [85]. Toutefois, les souris BALB/c développent une inflammation naturellement
polarisée vers la réponse Th2, comparativement à une inflammation Th1 chez les C57B/6. En outre,
les souris BALB/c développent une hyperréactivité bronchique plus importante [81]. Pour ces raisons,
la lignée murine BALB/c est couramment utilisée pour étudier l’asthme allergique.
16
Plusieurs modèles sont utilisés pour induire un asthme murin expérimental. Classiquement,
l’administration intrapéritonéale d’ovalbumine en présence d’un adjuvant permet d’induire une
sensibilisation rapide à cet allergène [82]. Une réexposition des voies aériennes à l’ovalbumine
stimule une réponse inflammatoire de type Th2, dont le recrutement d’éosinophiles, et une
hyperréactivité bronchique [82]. De plus, une administration chronique d’ovalbumine permet
d’induire un remodelage bronchique persistant même après l’arrêt de l’exposition à l’allergène [86].
Bien que les caractéristiques inflammatoires soient similaires à celles observées chez l’humain, ce
modèle nécessite un adjuvant pour obtenir une sensibilisation [83]. Elle est donc fondamentalement
différente des mécanismes naturels de sensibilisation chez l’humain, limitant son applicabilité [81].
De plus, l’administration d’ovalbumine induit éventuellement la tolérance immunitaire [87]. Malgré
les limitations importantes du modèle d’asthme induit par l’ovalbumine, celui-ci reste le modèle le
mieux caractérisé et plus utilisé.
L’utilisation d’allergènes naturels reliés au développement de l’asthme chez l’humain a donc gagné
en popularité. Ces allergènes, dont les antigènes d’acariens domestiques, peuvent induire une
sensibilisation lorsqu’administrés par inhalation et ne nécessitent pas d’adjuvant additionnel. Les
antigènes d’acariens domestiques possèdent une activité protéase favorisant l’activation des cellules
épithéliales [88] et la polarisation de l’inflammation en Th2. L’administration quotidienne de cet
antigène induit une sensibilisation rapide avec production d’anticorps spécifiques et d’IgE totaux. De
plus, cette production d’anticorps est suivie de l’expression pulmonaire d’IL-4 et d’IL-5.
Conséquemment, ce modèle permet le développement d’une forte éosinophilie et d’hyperréactivité
bronchique [89]. Cependant, il y a aussi un recrutement de neutrophiles proportionnel au niveau de
contamination en lipopolysaccharides des antigènes d’acariens domestiques. Notamment, ces
antigènes, comparativement à l’ovalbumine, ne semblent pas induire de tolérance, facilitant les études
d’asthme chronique avec remodelage [83]. L’administration chronique d’antigènes d’acariens
domestiques pour une période minimale de 5 semaines induit un épaississement significatif du muscle
lisse bronchique [90]. La bonne caractérisation temporelle de ce modèle permet de délimiter la phase
de sensibilisation de la phase inflammatoire [89] et donc de cibler les phases et mécanismes pertinents
cliniquement.
Des cellules isolées, humaines ou animales, sont aussi couramment utilisées pour étudier les
mécanismes de l’asthme in vitro. Bien que les cellules isolées ne répliquent pas la complexité de
l’asthme, elles permettent l’étude de types cellulaires spécifiques, de leurs interactions et d’isoler les
effets de médiateurs et de traitements. L’étude de la prolifération et de l’apoptose des cellules
musculaires lisses bronchiques in vivo est ardue, car ces cellules sont peu nombreuses et les cellules
17
apoptotiques sont rapidement éliminées dans le poumon [91]. Par conséquent, les études
pharmacologiques ciblant la capacité proliférative ou la survie cellulaire des cellules musculaires
lisses bronchiques s’effectuent majoritairement sur des cellules isolées. Des lignées de cellules
musculaires lisses bronchiques murines et humaines sont toutes deux disponibles. Les lignées
primaires humaines peuvent être isolées à partir de tissus bronchiques sains ou de patients
asthmatiques. Les cellules musculaires lisses bronchiques issues de patients atteints d’asthme sont
hyperprolifératives comparativement à celles issues de patients non asthmatiques [92]. Toutefois, les
comparaisons entre ces lignées sont remises en question. D’une part, les cellules musculaires lisses
bronchiques normales proviennent principalement de la marge saine de résections pulmonaires et les
cellules musculaires lisses bronchiques asthmatiques proviennent de biopsies bronchiques. D’une
autre part, ces lignées sont pratiquement toujours contaminées par des myofibroblastes qui sont
difficilement différenciés des cellules musculaires lisses bronchiques [93]. La prolifération des
cellules musculaires lisses bronchiques est souvent induite expérimentalement par du sérum fœtal
bovin. Cependant, plusieurs autres facteurs mitotiques peuvent induire leur prolifération, dont
certains médiateurs inflammatoires comme le TNF [94], les leucotriènes [78], l’histamine [95] et la
thrombine [76], et certains médiateurs fibrotique, comme le platelet-derived growth factor, le TGF-
B et le fibroblast growth factor [94, 96]. La présence de matrice extracellulaire stimule aussi la
prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques [97]. Bien que les médiateurs Th2, IL-4 [98]
et IL-13 [99], diminuent la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques, ceux-ci induisent
la production d’éotaxine [100] et donc le recrutement d’éosinophiles produisant des médiateurs
mitotiques. La modulation de la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques par des
agents pharmacologiques varie d’ailleurs selon le mitogène utilisé. Bien que la culture in vitro ne
réplique pas la complexité et l’organisation cellulaire du muscle lisse in vivo, l’utilisation de cellules
musculaires lisses bronchiques isolées permet d’étudier les effets antiprolifératifs de nouveaux agents
pharmacologiques.
En somme, le remodelage des voies aériennes observé dans l’asthme est principalement induit par
une inflammation chronique induisant la persistance de médiateurs cytotoxiques, inflammatoires et
anaboliques. Cet environnement est donc propice au remodelage bronchique. L’épaississement du
muscle lisse bronchique corrèle fortement avec la sévérité et sa contraction contribue directement aux
exacerbations de l’asthme. La découverte de cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer ou de
renverser l’épaississement et l’hypersensibilité du muscle lisse bronchique dans l’asthme ouvrirait la
porte au développement d’outils pharmacologiques potentiellement curatifs.
18
1.3 La fibrose pulmonaire
La fibrose pulmonaire constitue également un phénomène où une accumulation exagérée de cellules
et de tissu cicatriciel cause préjudice à la fonction pulmonaire. Les maladies pulmonaires
interstitielles sont un regroupement de plus de 200 maladies pouvant causer une cicatrisation
irréversible du parenchyme pulmonaire. La maladie pulmonaire interstitielle la plus commune et la
plus sévère est la FPI, représentant 17% à 86% de ces maladies [101]. Elle a une prévalence générale
de 14 par 100 000 habitants aux États-Unis [102]. Cette dernière affecte principalement les hommes,
avec une moyenne d’âge de 66 ans. Sa prévalence ainsi que la mortalité qui y est associée augmente
en fonction du vieillissement [103]. Après le diagnostic, la survie médiane est 2.5 à 3.5 ans, avec plus
de 75% des décès reliés à une défaillance pulmonaire [104]. Les coûts reliés à la FPI aux États-Unis
représentent environ 60 000 de dollars américains par patient [105] pour un total de 2 milliards par
année [106]. Les principaux symptômes des maladies pulmonaires interstitielles sont une dyspnée et
une toux importante. Cependant, ces symptômes sont non spécifiques, ce qui retarde le diagnostic
définitif de FPI de 6 mois à 2 ans [107], contribuant au mauvais pronostic de la maladie. La dyspnée
débute souvent à l’effort, mais elle progresse rapidement et interfère avec les activités quotidiennes
[108]. Bien que la fibrose pulmonaire soit relativement rare et affecte principalement une population
plus âgée, les coûts socioéconomiques qui y sont associés sont considérables.
Plusieurs facteurs peuvent induire ou favoriser le développement de la fibrose pulmonaire. D’une
part, il y a les prédispositions génétiques, comme les mutations de la telomerase reverse transcriptase,
de la telomerase RNA component, de la surfactant protein C et de la surfactant protein A2, qui
peuvent expliquer jusqu’à 15% de la fibrose pulmonaire familiale [109]. D’une autre part, la plupart
des maladies pulmonaires interstitielles non idiopathiques sont associées à un facteur
environnemental et/ou occupationnel. Plusieurs poussières inorganiques inhalées peuvent contribuer
au développement de la fibrose pulmonaire, comme la silice cristalline (silicose), l’amiante
(amiantose) et le charbon (pneumoconiose des mineurs de charbon). Pour leur part, les poussières
organiques d’origines animales, bactériennes ou fongiques peuvent induire une alvéolite allergique
extrinsèque pouvant progresser jusqu’au développement de fibrose pulmonaire [110]. De plus,
plusieurs médicaments, dont les agents chimiothérapeutiques, peuvent induire de la fibrose
pulmonaire. Le mieux connu est la bléomycine, extrait de la bactérie Streptomyces verticillus, qui
peut induire de la fibrose pulmonaire dans 46% des patients traités, et qui s’avère mortelle dans 3%
des cas [111]. Il est important de noter que l’exposition à ces facteurs ne garantit pas de développer
de la fibrose pulmonaire, soulignant l’importance de l’interaction de la génétique, de l’environnement
et de la fréquence des expositions. De plus, le retrait de l’exposition ne permet que de ralentir la
19
progression de la fibrose pulmonaire, car, lorsque la fibrose est établie, elle est irréversible [112]. Les
maladies pulmonaires interstitielles sont un regroupement de pathologies ayant diverses causes
pouvant induire ou promouvoir le développement irréversible de la fibrose pulmonaire.
Les options thérapeutiques pour traiter la fibrose pulmonaire sont limitées. Bien que les traitements
anti-inflammatoires, comme les corticostéroïdes, peuvent diminuer les exacerbations de certaines
maladies pulmonaires interstitielles, comme l’alvéolite allergique extrinsèque et la silicose, ils sont
inefficaces pour ralentir la progression de la fibrose pulmonaire, en plus d’avoir d’importants effets
secondaires [108, 113]. D’ailleurs, la combinaison d’un immunomodulateur, comme l’azathioprine
ou la cyclophosphamide, à un corticostéroïde est controversée, car les effets bénéfiques ne sont pas
plus importants que les effets néfastes [108, 113]. De plus, l’utilisation d’anticorps neutralisant le
TNF, un facteur central à l’inflammation, n’améliore pas la condition des patients atteints de FPI et
augmente même le risque de développer de la fibrose pulmonaire [114]. Les traitements visant les
mécanismes inflammatoires sont donc peu bénéfiques et même potentiellement néfastes dans la
fibrose pulmonaire. Cibler directement les mécanismes fibrotiques a donc gagné en intérêt. De fait,
Nintedanib et Pirfenidone, deux médicaments visant des voies signalétiques impliquées dans la
fibrose [115], ont été récemment approuvés dans plusieurs pays, incluant le Canada, et sont
recommandés par plusieurs regroupements de pneumologues [116]. Ces traitements augmentent le
nombre d’années de vie (ajusté pour la qualité) de six mois, en plus de diminuer significativement la
perte des fonctions respiratoires [117]. Cependant, le rapport coût-efficacité de ces médicaments ne
justifie pas leur utilisation dans plusieurs pays [117, 118]. Présentement, le seul traitement plus
efficace est la transplantation pulmonaire, mais elle n’est normalement offerte qu’à une clientèle plus
jeune (moins de 65 ans). Le temps d’attente médian est d’environ 2 mois et, malheureusement, la
mortalité pendant cette attente varie entre 14 et 67%. Après la transplantation pulmonaire, la médiane
de survie n’est que de 4.5 années [119]. Bien que certains médicaments améliorent légèrement la
survie et la qualité de vie, il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique curatif pour la
fibrose pulmonaire.
1.3.1 La physiopathologie de la fibrose pulmonaire
La fibrose pulmonaire est une condition observée dans plusieurs maladies pulmonaires interstitielles
avec plusieurs étiologies et présentations cliniques. Toutes ces maladies impliquent des altérations
pathologiques des mécanismes de réparation tissulaire interférant avec la bonne fonction du poumon.
Afin de simplifier la discussion, la physiopathologie de la fibrose pulmonaire sera principalement
présentée du point de vue de la FPI, celle-ci représentant la majorité des cas [101].
20
La FPI est caractérisée par une augmentation progressive de l’effort respiratoire impliquant une
diminution du volume pulmonaire, une diminution des échanges gazeux et une perte de compliance
pulmonaire [107]. La FPI est principalement diagnostiquée par tomodensitométrie à haute définition
qui reflète les caractéristiques histologiques. L’épaississement des parois alvéolaires est révélé par
des opacités réticulaires et la destruction des sacs alvéolaires par des arrangements en nids d’abeilles.
Ces altérations sont principalement dans les zones basales et sous-pleurales et sont distribuées de
manière hétérogène [120]. Plus rarement, des opacités en verre dépoli suggérant une infiltration
alvéolaire causée par une inflammation ou une perméabilité vasculaire importante sont observées.
Les biopsies pulmonaires montrent des zones denses de fibrose, possiblement entourées de
myofibroblastes en prolifération (foci fibroblastique) produisant de la matrice extracellulaire [107].
Les altérations fibrotiques hétérogènes du parenchyme pulmonaire causent la diminution de la
fonction pulmonaire dans la FPI.
Bien que la cause exacte de la FPI soit bien sûr inconnue, l’une des principales hypothèses suggère
qu’une injure répétée à l’épithélium pulmonaire induisant une inflammation Th2, couplée à des
prédispositions génétiques, déclenche la maladie. Bien que l’inflammation Th2 permette le
recrutement de cellules inflammatoires favorisant la production de médiateurs profibrotiques [121],
son rôle dans la FPI est encore controversé. Comme la FPI est diagnostiquée tardivement,
l’inflammation est la plupart du temps faible ou même absente [121]. Bien qu’une blessure et
l’inflammation subséquente puissent déclencher une maladie pulmonaire interstitielle , la fibrose
pulmonaire serait maintenue et propagée majoritairement par des mécanismes fibrotiques dérégulés
et découplés de l’inflammation [2].
1.3.2 Les mécanismes de la fibrose pulmonaire
La guérison tissulaire est un mécanisme crucial à la survie de l’organisme, permettant de contrer les
dommages causés par différents traumas, comme les infections bactériennes et virales, les blessures
physiques et les irritants. La guérison implique plusieurs phases (Figure 1.4) se chevauchant plus ou
moins, afin de rétablir la fonction de l’organe : la coagulation, l’inflammation, l’accumulation et
l’activation des fibroblastes ainsi que la résorption de la cicatrice [122]. Si une ou plusieurs de ces
phases devient/deviennent chronique(s), les mécanismes de la guérison deviendraient pathologique.
Ainsi, le modèle actuel planche sur la notion que la fibrose pulmonaire serait le résultat de la
dérégulation de ces mécanismes.
21
Trauma et coagulation
L’agent causal dans la pathogenèse de la FPI, s’il existe, n’a pas été identifié. Cependant, dans
plusieurs autres maladies pulmonaires interstitielles, le facteur causant les dommages pulmonaires est
connu, permettant de tirer des généralisations sur les mécanismes potentiels. Plusieurs types de
dommages peuvent induire de la fibrose pulmonaire et leur récurrence favorise le développement de
la fibrose pulmonaire. La radiation et la chimiothérapie [123] peuvent induire la production d’espèces
réactives de l’oxygène et des altérations du code génétique. Les particules inorganiques peuvent se
rendre dans les alvéoles et produire aussi des espèces réactives de l’oxygène [110]. Les infections
bactériennes et virales peuvent causer des dommages aux alvéoles [124], tout comme l’acide introduit
par un reflux gastro-œsophagien [125]. Ces facteurs endommagent la barrière épithéliale ainsi que
l’endothélium pulmonaire.
La perturbation de la barrière épithéliale contribue au développement de la fibrose pulmonaire. Les
dommages causés aux cellules épithéliales induisent leur apoptose et mènent au dénudement de la
membrane basale [126]. De fait, chez les patients atteints de la FPI, 70 à 80% des cellules épithéliales
alvéolaires de type 2 sont apoptotiques [127], limitant la capacité régénérative de la barrière
alvéolaire. De plus, l’induction de l’apoptose des cellules épithéliales par l’activation de la voie
apoptotique Fas est suffisante pour le développement de la fibrose pulmonaire chez les souris [128].
Les cellules épithéliales alvéolaires de patients souffrants de la FPI surexpriment le tissue factor
catalysant la formation de thrombine à partir de la prothrombine. Ils surexpriment aussi les inhibiteurs
de l'activateur du plasminogène 1 et 2, des anti-fibrinolytiques, favorisant la voie de la coagulation et
la déposition de fibrine [129]. Les cellules épithéliales alvéolaires expriment aussi de grandes
quantités de médiateurs pro-inflammatoires, comme le TNF et l’IL-1β [130], et profibrotiques,
comme le TGF-β, le connective tissue growth factor (CTGF) et le platelet-derived growth factor
[131]. En plus, les cellules épithéliales alvéolaires produisent des médiateurs promouvant une réponse
inflammatoire de type Th2, comme le thymic stromal lymphopoietin, l’IL-25 et l’IL-33 [124].
L’épithélium alvéolaire endommagé induit donc une réponse pro-inflammatoire et pro-fibrotique.
Suite à une blessure, l’étanchéité de la barrière endothéliale est aussi compromise, en partie par
l’altération des cellules endothéliales [132]. Les médiateurs inflammatoires produits en réponse à la
blessure augmentent aussi la perméabilité vasculaire [133]. Cela permet au contenu du sang, incluant
les plaquettes et la prothrombine, de passer dans le parenchyme pulmonaire et l’espace alvéolaire. De
plus, l’augmentation de la perméabilité vasculaire facilite la translocation des cellules immunes en
dehors des vaisseaux sanguins [133]. Le tissue factor produit par les cellules endommagées active la
prothrombine en thrombine, menant à la production de fibrine. D’ailleurs, les facteurs de coagulation
22
VII et X nécessaires pour ce processus sont surexprimés dans la FPI [134]. La fibrine permet d’établir
une matrice temporaire nécessaire à la guérison et sa dégradation est une étape importante de sa
résolution. Cependant, dans la FPI, les anti-fibrinolytiques inhibant la dégradation de la fibrine sont
augmentés [135]. Bien que les anticoagulants inhibent la fibrose pulmonaire expérimentale, les essais
chez l’humain sont non concluants, car les effets secondaires, incluant des défaillances rénales, sont
courants [136]. L’augmentation de la perméabilité vasculaire et des mécanismes de la coagulation
favorise ainsi l’inflammation et la déposition de matrice extracellulaire.
Inflammation
Tel que vu précédemment, l’activation des cellules épithéliales alvéolaires entraine la production de
médiateurs pro-inflammatoires comme le TNF et l’IL-1β (Figure 1.4). L’activation des macrophages
alvéolaires en réponse aux agents irritants ou aux débris cellulaires exacerbe cette production [137].
Ces médiateurs inflammatoires induisent l’expression de chimiokines permettant le recrutement de
cellules immunes, comme les neutrophiles, les lymphocytes T naïfs, les éosinophiles et les
macrophages, qui sont toutes augmentées dans la fibrose pulmonaire [121]. Ces cellules produisent
de grandes quantités de médiateurs pro-inflammatoires et profibrotiques, participant au
développement de la fibrose pulmonaire [121]. Malgré le rôle sans équivoque des médiateurs
inflammatoires dans la guérison tissulaire et le développement de la fibrose pulmonaire, les
traitements anti-inflammatoires sont inefficaces. Bien que l’inflammation semble importante pour le
développement de la fibrose, son impact sur la fibrose avancée demeure contesté.
23
24
Figure 1.4: Étapes de la guérison tissulaire
Suite à un dommage à la barrière alvéolaire, principalement de l’épithélium, il y a passage de
plaquettes et de plasma du sang vers le tissu endommagé ainsi qu’une augmentation de la perméabilité
vasculaire et de la production de médiateurs inflammatoires (Figure 1.4). Ces facteurs combinés
permettent le recrutement et l’activation de plusieurs cellules inflammatoires. Ces cellules
inflammatoires produisent elles-mêmes une panoplie de médiateurs inflammatoires et expriment de
grandes quantités de facteurs profibrotiques. Ces facteurs induisent le recrutement et l’activation des
fibroblastes, incluant leur différentiation en myofibroblastes, ainsi que la production de matrice
extracellulaire (ECM). Normalement, la matrice extracellulaire est dégradée et les cellules impliquées
sont éliminées, menant à la contraction de la plaie. Si une de ces étapes devient chronique, il n’y aura
pas résorption de la matrice extracellulaire et la guérison devient de la fibrose pulmonaire. AA-Mac :
Macrophage alternativement activé; CCL-2 : Chemokine (C-C motif) Ligand 2; CTGF : Connective
tissue growth factor; EMT: Transition épithélio-mésenchymateuse; IL: Interleukine; MMP :
métalloprotéinases matricielles; PAI : Inhibiteurs de l'activateur du plasminogène 1 et 2; PDGF :
Platelet-derived growth factor; TF : Tissue factor; TGF-β: Transforming growth factor-β; Th0 :
Lymphocytes T naïfs; Th2 : Lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs; TIMP : Inhibiteur
tissulaire des MMP; TNF : Tumor necrosis factor; Treg : Lymphocytes T auxiliaires régulateurs;
Plusieurs types de cellules immunitaires, et les médiateurs qu’elles produisent, sont impliqués dans
la réponse à un dommage tissulaire (Figure 1.4). Les neutrophiles sont les premières cellules recrutées
et leur rôle primaire est le débridement et l’élimination des pathogènes par dégranulation. Elles
produisent aussi plusieurs cytokines et chimiokines pro-inflammatoires, comme le chemokine (C-C
motif) ligand 2, des élastases et des métalloprotéinases matricielles (MMP)-2 et -9. Ces deux dernières
sont surexprimées dans la FPI [138] et permettent la dégradation de la membrane basale, facilitant le
passage des cellules immunes et l’activation enzymatique du TGF-β latent [139]. Suite à leur
recrutement, les lymphocytes T naïfs sont rapidement polarisés en lymphocytes Th2. Cette
polarisation favorise le développement de la fibrose pulmonaire par plusieurs mécanismes (Figure
1.4). Les lymphocytes Th2 produisent de l’IL-4, de l’IL-5 et de l’IL-13 et ces cytokines sont
surexprimées par les cellules provenant de patients atteints de la FPI [121]. De fait, des inhibiteurs de
l’IL-4 et de l’IL-13 réduisent la fibrose pulmonaire expérimentale [122] et sont présentement en essai
clinique [113]. L’IL-5 promeut le recrutement et l’activation des éosinophiles, ceux-ci produisant des
espèces réactives de l’oxygène, exacerbant le dommage alvéolaire, ainsi que de l’IL-13, du platelet-
derived growth factor et du TGF-β [140]. La présence de TGF-β favorise la différenciation des
25
lymphocytes T en lymphocytes T régulateurs [141] qui produisent de l’IL-10, du TGF-β et du
platelet-derived growth factor. La présence d’IL-13 et d’IL-10 induit la différenciation des
macrophages alvéolaires en macrophages activés alternativement. De fait, les macrophages
alvéolaires des patients atteints de la FPI expriment des marqueurs caractéristiques d’une activation
alternative [142]. Les macrophages activés alternativement produisent du TGF- β, du platelet-derived
growth factor [143] et de l’IL-10 [144]. De plus, ils expriment plusieurs MMP et leurs inhibiteurs
tissulaires, contribuant ainsi à la fibrose pulmonaire. [145]. La polarisation des cellules immunes vers
un phénotype promouvant la réponse allergique participe au développement de la fibrose pulmonaire.
Plusieurs médiateurs inflammatoires ont des effets divergents sur le développement de la fibrose.
Bien que le TNF et l’IL-12 soient pro-inflammatoires, ils diminuent tous deux la fibrose pulmonaire
lorsqu’administrés en phase fibrotique dans les modèles expérimentaux [146, 147]. L’augmentation
de la transcription du TNF inhibe aussi le développement de la fibrose pulmonaire expérimentale, ce
qui est en partie expliqué par l’effet antagonistique du TNF sur la voie du TGF-β [148]. Les
macrophages alvéolaires classiquement activés produisent des médiateurs Th1 [149], comme le TNF.
Des souris recevant un inhibiteur de l’activation alternative des macrophages développement moins
de fibrose pulmonaire [134], supportant un rôle anti-fibrotique des médiateurs Th1. Le rôle du
médiateur anti-inflammatoire et immunosuppresseur IL-10, régulant l’inflammation, est aussi mal
compris. Il est retrouvé en grande quantité dans le fluide du lavage bronchoalvéolaire des patients
souffrant de la FPI [150]. D’une part, la délétion génétique de l’IL-10 exacerbe l’inflammation et la
fibrose induite par la silice [151], l’augmentation de sa transcription systémique par administration
de plasmides intraveineux diminue la fibrose induite par la bléomycine [152] et ses niveaux de
transcrits corrèlent avec la capacité vitale forcée chez les patients atteints de la FPI [153]. D’une autre
part, la transcription accrue de l’IL-10 en absence d’inflammation induit de la fibrose pulmonaire
[154] et sa surtranscription localisée au poumon exacerbe la fibrose induite par la silice [155]. De
fait, il a été montré que les lymphocytes T régulateurs peuvent aussi bien augmenter [156] que
diminuer [157, 158] la fibrose pulmonaire, selon les conditions expérimentales. Bien qu’il soit bien
reconnu que l’inflammation de type Th1 et Th2 ainsi que leur régulation jouent un rôle important
dans le développement de la fibrose pulmonaire, la contribution exacte des médiateurs impliqués
demeure ainsi controversée.
26
Accumulation et activation des fibroblastes
Les fibroblastes sont au cœur de la réparation des tissus conjonctifs et, conséquemment, de la fibrose
pulmonaire (Figure 1.4). Ils proviennent de plusieurs sources, dont les fibroblastes résidents, le
recrutement de précurseurs sanguins, les fibrocytes, ou de la transformation des cellules épithéliales
en fibroblastes [134]. L’accumulation des fibroblastes dépend du recrutement provenant de ces
sources, mais aussi de leur balance proliférative et apoptotique. Plusieurs des médiateurs de la
coagulation et de l’inflammation modulent l’accumulation des fibroblastes (Tableau 1.1). La
thrombine [159] et le facteur de coagulation Xa [160] stimulent la prolifération des fibroblastes. De
plus, la thrombine inhibe leur apoptose [161]. Le platelet-derived growth factor est nécessaire pour
la prolifération des fibroblastes [162] et favorise leur migration [134]. Les médiateurs inflammatoires
de type Th1, comme le TNF et l’IL-1β, et les médiateurs inflammatoires de type Th2, comme l’IL-4
et l’IL-13, contribuent aussi à la prolifération des fibroblastes [163]. Cependant, seuls les médiateurs
Th2 ont un effet anti-apoptotique [164]. Le médiateur anti-inflammatoire IL-10 inhibe la prolifération
des fibroblastes [165], mais augmente la production du chemokine (C-C motif) ligand 2 par les
monocytes, favorisant le recrutement des fibrocytes [154]. Plusieurs médiateurs profibrotiques
favorisent aussi l’accumulation des fibroblastes. Le TGF-β et le CTGF induisent la résistance à
l’apoptose et la prolifération des fibroblastes, respectivement [134]. Le MMP-8 facilite aussi le
recrutement des fibrocytes [139]. Les fibroblastes pulmonaires isolés des lésions fibrotiques de
patients atteints de la FPI (fibroblastes FPI) sont aussi résistants à l’apoptose induite par le ligand Fas
[166], en partie par la modification de histones réduisant la production de Fas [167] et par leur
production de MMP-7 dégradant le ligand Fas [138]. La présence de plusieurs facteurs pro-
inflammatoires et pro-fibrotiques ayant des effets mitotiques, chimiotactiques et anti-apoptotiques,
combinée à un phénotype inhéremment altéré des fibroblastes FPI, favorise l’accumulation anormale
de ces derniers.
L’activation des fibroblastes par divers facteurs de croissance favorise le maintien de la matrice
extracellulaire [168] (Figure 1.4). Le TGF- β (Tableau 1.1) induit la production de la matrice
extracellulaire par les fibroblastes [134]. De plus, il favorise l’accumulation de cette dernière en
diminuant l’expression des MMP et en stimulant la production de leurs inhibiteurs [169]. D’ailleurs,
la surexpression du TGF-β dans les modèles animaux est suffisante pour induire de la fibrose
indépendamment de l’inflammation [170] et le Pirfenidone, un des traitements approuvés pour la FPI,
cible les effets profibrotiques du TGF-β sur les fibroblastes [171]. Le TGF- β induit aussi l’expression
du CTGF qui est nécessaire au maintien de la fibrose [121]. Malgré que son ou ses récepteurs soient
encore inconnus, le CTGF stimule la production de la matrice extracellulaire par les fibroblastes et
27
peut se lier à celle-ci et au TGF-β activé [172]. La surexpression de ce facteur de croissance
spécifiquement dans les fibroblastes est aussi suffisante pour induire une fibrose systémique [173].
Les niveaux de transcrits du CTGF sont d’ailleurs augmentés dans le tissu pulmonaire des patients
atteints de la FPI [174]. L’inhibition du CTGF réduit la fibrose dans plusieurs modèles [172, 175,
176]. Un autre facteur de croissance favorisant la production de la matrice extracellulaire est le
platelet-derived growth factor [177]. Il est important de noter que les récepteurs du platelet-derived
growth factor sont une des cibles du Nintedanib, l’un des traitements les plus prometteurs de la FPI
[178]. Les médiateurs inflammatoires Th1 inhibent plutôt la production de la matrice extracellulaire
[134, 179, 180]. Ces facteurs de croissance contribuent fortement à la déposition aberrante de la
matrice extracellulaire en augmentant sa production et en inhibant sa dégradation.
La régulation quantitative et qualitative de la matrice extracellulaire est aussi un facteur important
dans progression de la fibrose pulmonaire (Tableau 1.1). Bien que la production de matrice
extracellulaire et ses enzymes régulatrices ne soient pas limitées aux fibroblastes, ils en sont les
principaux effecteurs [168]. Les fibroblastes produisent plusieurs MMP, des enzymes dégradant la
matrice extracellulaire, et la plupart des MMP sont surexprimées dans la FPI [138]. Toutefois,
certaines MMP contribuent à fibrose en favorisant la transformation des cellules épithéliales en
fibroblastes (MMP-3; [138]) et l’activation du TGF-β (MMP-2 et MMP-9; [139]). Les fibroblastes
produisent aussi tous les inhibiteurs des MMP (1 à 4) qui sont aussi surexprimés dans les tissus
pulmonaires fibrotiques [181]. Ils inhibent la dégradation de la matrice extracellulaire et leur
surexpression est directement liée son accumulation [181, 182]. La composition de la matrice
extracellulaire est aussi altérée dans la FPI Les fibroblastes pulmonaires de patients atteints de cette
maladie produisent significativement plus d’une forme épissée alternativement de la fibronectine
(Fibronectine contenant des domaines A supplémentaires). Il a été montré que l’expression de cette
forme alternative de la fibronectine est nécessaire au développement de la fibrose pulmonaire dans
les modèles murins [183]. L’inhibition des mécanismes favorisant la dégradation de la matrice
extracellulaire contribue à sa déposition aberrante.
28
Médiateur Prolifération Apoptose Recrutement Production
α-SMA d'ECM
Thrombine ↑ [159] ↓ [161] - - ↑ [184]
Xa ↑ [160] - - - ↑ [184]
CCL2 - - ↑ [154] - -
IL-1β ↑ [163] - - ↓ [179] ↓ [179]
TNF ↑ [163] - - ↓ [180] ↓ [180]
IL-4 ↑ [163] ↓ [164] - ↑ [134] ↑ [2]
IL-5 - - - -
IL-13 ↑ [163] ↓ [164] - ↑ [134] ↑ [2]
IL-10 ↓ [165] - - - -
CTGF ↑ [134] - - ↑ [172] ↑ [185]
PDGF ↑ [162] - ↑ [134] ↑ [177] -
TGF-β - ↓ [134] - ↑ [134] ↑ [172]
Tableau 1.1 : Modulation des mécanismes profibrotiques des fibroblastes
Résumé des effets des médiateurs de la coagulation, inflammatoires et profibrotiques abordées dans
cette thèse sur les mécanismes profibrotiques des fibroblastes. α-SMA : α-smooth muscle actin; CCL2
: Chemokine (C-C motif) ligand 2; CTGF : Connective tissue growth factor; ECM : Matrice
extracellulaire; IL : Interleukine; PDGF : Platelet-derived growth factor; TGF-β : Transforming
growth factor β; TNF : Tumor necrosis factor; Xa : Facteur de coagulation Xa
29
La différenciation des fibroblastes en myofibroblastes est aussi une étape importante dans les
processus de cicatrisations. La différentiation en myofibroblastes est marquée par leur expression de
l’α-smooth muscle actin [112]. Les facteurs de la coagulation induisent la différenciation des
fibroblastes en myofibroblastes [184], tout comme les médiateurs Th2 [2], alors que les médiateurs
Th1 inhibent leur différentiation [134, 179, 180]. Les médiateurs profibrotiques, comme le TGF- β et
le CTGF, induisent aussi fortement l’expression d’α-smooth muscle actin [172, 185] Les
myofibroblastes sont impliqués dans plusieurs mécanismes de la cicatrisation et de la fibrose. Ils
produisent de grandes quantités de matrice extracellulaire et d’inhibiteurs des MMP, favorisant
l’accumulation du premier au dépens de sa résorption [2]. Leur capacité contractile contribue aussi à
l’activation du TGF-β latent [186] en retirant physiquement sa partie inhibitrice. En contexte de
guérison normal, ces mécanismes sont essentiels pour combler rapidement la plaie, mais deviennent
pathologiques lorsque chroniques. La localisation des myofibroblastes est différente des fibroblastes
dans le tissu fibrotique [187]. Les fibroblastes résidant dans les zones fibrotiques denses expriment
le signal transducer and activator of transcription 3 qui est impliqué dans la résistance à l’apoptose
et la production de la matrice extracellulaire. Toutefois, ils ne se différentient pas en myofibroblastes
et prolifèrent peu. Comparativement, les fibroblastes dans les foci fibrotiques (en marge des zones
fibrotiques dense) se différentient en myofibroblastes, produisent aussi de la matrice extracellulaire
et prolifèrent plus vite, mais ils n’expriment pas le signal transducer and activator of transcription
3. Cette différence pourrait participer au maintien de l’environnement profibrotique de ces zones.
Malgré que les myofibroblastes expriment les mêmes médiateurs profibrotiques que les fibroblastes,
leur rôle dans la fibrose a été remis en doute. En effet, il a été montré que l’inhabilité des fibroblastes
à se différentier en myofibroblastes exacerbe la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine [188].
Il a été suggéré que les myofibroblastes sont nécessaires pour la complétion des mécanismes
cicatriciels normaux. L’accumulation et l’activation des fibroblastes et myofibroblastes, ainsi que leur
localisation, affectent profondément la progression et le maintien de la fibrose pulmonaire.
30
1.3.3 Les modèles expérimentaux
L’utilisation de modèles animaux a été essentielle dans l’étude des mécanismes fibrotiques. Ces
modèles peuvent être séparés en deux groupes : les modèles causés par des agents toxiques ou
irritants; et les modèles génétiques.
Les modèles causés par des agents toxiques ou irritants utilisent des agents reconnus pour induire de
la fibrose pulmonaire chez l’humain, comme la silice, l’amiante et la bléomycine. Cette dernière est
la plus étudiée et la mieux caractérisée [189]. Toutefois, ces modèles ne répliquent pas parfaitement
leur pathologie associée, en partie car les méthodes d’administrations utilisées (inhalation,
intratrachéale, intranasale, intraveineuse) affectent fortement la présentation des lésions et de la
fibrose. De plus, le modèle utilisant la bléomycine montre une éventuelle résorption de la fibrose, ce
qui n’est pas observé chez l’humain [189]. Le modèle de fibrose pulmonaire murin induit par la
bléomycine a deux principaux avantages. Premièrement, la bléomycine s’accumule au poumon ce qui
limite les dommages aux autres organes et, deuxièmement, elle est éventuellement éliminée, ce qui
permet la résorption rapide de l’inflammation et une phase fibrotique mieux définie (Figure 1.5)
[189]. Considérant l’inefficacité des traitements anti-inflammatoires, l’isolation de la phase fibrotique
est nécessaire à l’identification de thérapie anti-fibrotiques avec un potentiel chez l’humain [190].
Les modèles de fibrose pulmonaire induite par des agents connus permettent ainsi d’étudier les
mécanismes de la fibrose, mais ne peuvent pas éliminer l’influence des mécanismes d’amplification
et de résolution de l’inflammation aiguë.
Plusieurs modèles ont été développés afin d’éliminer le biais de l’inflammation inhérent à l’utilisation
d’agents toxiques ou irritants. Les modèles génétiques impliquent l’augmentation de médiateurs
profibrotiques (TGF-β et CTGF) et de médiateurs pro-inflammatoires (IL-13, IL-1β et TNF) ou des
mutations liées à la fibrose pulmonaire familiale [189]. Ces modèles ont l’avantage de mieux
caractériser les effets des médiateurs impliqués dans la fibrose pulmonaire. De plus, les modèles de
fibrose induits par l’augmentation du TGF-β ou CTGF permettent de mieux dissocier les effets
inflammatoires des effets fibrotiques. Cependant, ces modèles ne répliquent pas la complexité de la
fibrose pulmonaire humaine [189]. Comme aucun des modèles actuels ne réplique complètement la
présentation et les mécanismes observés dans la FPI, un modèle de fibrose pulmonaire humanisé a
été développé [191]. Le transfert de fibroblastes FPI à des souris ayant une immunodéficience
combinée sévère induit des zones d’accumulation de fibroblastes et de matrice extracellulaire
hétérogènes similaires à la présentation de la FPI [191]. Bien que ce modèle ressemble
histologiquement à la pathologie humaine, l’absence de cellules immunes ne reflète ni
l’environnement pulmonaire normal, ni les traces d’inflammation présentes dans la FPI. Les modèles
31
génétiques ou humanisés permettent de mieux cibler les processus fibrotiques en diminuant l’impact
de l’inflammation, mais par le fait induisent d’autres biais difficiles à évaluer.
Puisque les fibroblastes sont les cellules effectrices centrales dans la fibrose pulmonaire, elles sont
souvent étudiées in vitro. Plusieurs lignées cellulaires sont disponibles, dont les fibroblastes murins
3T3 et des lignées humaines normales ou de patients atteints de la FPI. Toutefois, de notre expérience
ainsi que celle d’autres groupes de recherche [187], les populations de fibroblastes primaires humains
démontrent une variabilité élevée, compliquant l’interprétation des données, et les fibroblastes
primaires isolés de souris requièrent des conditions d’isolation et de croissance spécifiques et
difficilement applicables [192]. Par conséquent, les fibroblastes murins 3T3 restent une lignée
fortement utilisée pour l’étude de la fibrose. Les lignées cellulaires sont souvent utilisées afin
d’identifier les effets des médiateurs endogènes et des outils pharmacologiques sur leur activation et
leur survie. Comme les médiateurs stimulant leur prolifération et leur activation sont nombreux,
l’activité des traitements étudiés peut varier selon le mitogène utilisé. Communément, l’expansion et
la stimulation des cellules sont effectuées en présence de sérum foetal bovin, contenant de grandes
quantités de TGF-β latent [193] et un cocktail complexe de médiateurs lipidiques pro-prolifératifs.
Le choix du modèle de fibrose, in vivo ou in vitro, est donc crucial dans le design et l’interprétation
des résultats des études sur la fibrose pulmonaire.
En somme, le remodelage du parenchyme observé dans la FPI est probablement déclenché par une
blessure tissulaire et l’inflammation subséquente. Toutefois, elle n’est pas nécessaire au maintien de
la fibrose pulmonaire. La progression de la maladie semble plutôt dépendante de l’accumulation de
fibroblastes anormaux et la persistance d’un environnement riche en médiateurs profibrotiques, dont
certains sont produits par les fibroblastes, dont le CTGF. L’identification de cibles thérapeutiques
visant la production de ces médiateurs profibrotiques, l’accumulation des fibroblastes et la déposition
de matrice extracellulaire offrirait de nouvelles alternatives pour la maladie incurable qu’est la FPI.
32
Figure 1.5: Les deux phases du modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine
Ce modèle possède deux phases qui se chevauchent. L’administration d’une dose unique de
bléomycine induit un dommage alvéolaire et une réponse inflammatoire importante. Comme la
bléomycine est éliminée par l’organisme, l’inflammation se résorbe en une ou deux semaines. La
phase inflammatoire est suivie d’une phase fibrotique. La phase fibrotique est caractérisée par une
inflammation limitée, la présence de médiateurs profibrotiques et la déposition de matrice
extracellulaire (ECM). IF-γ : Interféron-γ; IL : Interleukine; TGF-β : Transforming growth factor β;
TNF-α : Tumor necrosis factor-α. Figure utilisée avec permission à partir de Moeller et al. 2008
[190].
33
1.4 Les sphingolipides
Découverts en 1870, les sphingolipides sont une grande famille de lipides (alcools aminés
aliphatiques) fortement conservés évolutivement et partageant des bases communes. Ces bases
sphingoïdes sont la sphingosine, la dihydrosphingosine et la phytosphingosine (présente dans les
levures), mais cette thèse se concentrera sur les sphingolipides à base de sphingosine [194]. Dans la
cellule, les sphingolipides se retrouvent en majorité dans la membrane plasmatique et il a été
longtemps assumé que leur rôle était purement structural. Il a depuis été démontré que plusieurs
sphingolipides possèdent des fonctions signalétiques, certains ayant même des récepteurs
membranaires spécifiques. Les sphingolipides partagent des voies métaboliques et cataboliques
communes, particulièrement la voie de synthèse de novo et la voie de dégradation. Ils peuvent être
séparés en deux groupes : simple et complexe. Bien que les sphingolipides complexes soient abordés,
seuls les sphingolipides simples font l’objet d’une description détaillée dans cette thèse.
Les sphingolipides complexes sont des céramides avec un groupement de tête polaire, comme une
phosphocholine ou une phosphoéthanolamine (sphingomyéline) ou un ou plusieurs résidus de sucres
(glycosphingolipides). La sphingomyéline représente la majorité des sphingolipides [194] et compose
environ 18% de la membrane plasmatique [195]. Ces sphingolipides complexes sont créés dans la
lumière de l’appareil de Golgi et se retrouvent au feuillet extracellulaire de la membrane plasmatique.
Conséquemment, leur groupement de tête polaire limite fortement leur passage au feuillet
intracellulaire [194]. Ces sphingolipides ont un rôle de réserve cellulaire de sphingolipides et un rôle
structurel, modifiant les propriétés physiques de la membrane [196]. Par exemple, ils modifient la
conductivité de la gaine de myéline des neurones (sphingomyéline; [197]) et la barrière hydrophobe
de la peau (glycosphingolipides; [194]). Les glycosphingolipides ont aussi un rôle crucial dans la
gastrulation et l’invalidation de leur production est létale pendant l’embryogenèse [198]. Les
dysfonctions du métabolisme des sphingolipides et de leur réserve, nommées sphingolipidoses,
affectent principalement le système nerveux [199]. Malgré leurs effets biologiques, les sphingolipides
complexes sont majoritairement reconnus pour leur capacité de maintenir une réserve de
sphingolipides.
Les sphingolipides simples incluent la céramide et la sphingosine ainsi que leur dérivé phosphorylé,
la céramide-1-phosphate et sphingosine-1-phosphate (S1P), respectivement. Bien que la céramide-1-
phosphate semble avoir plusieurs effets biologiques [200], nous ne nous intéresserons qu’à la
céramide, la sphingosine et la S1P. Les propriétés physiques et biologiques de ces sphingolipides
simples varient fortement [194]. La céramide est fortement hydrophobe et ne possède pas de
34
groupement de tête, elle se retrouve donc uniquement dans les membranes cellulaires, mais peut
facilement changer de face du feuillet. La sphingosine est amphipathique, possédant une queue
hydrophobe et une tête hydrophile, lui permettant de se retrouver autant dans les membranes que dans
les fluides intracellulaires et extracellulaires. L’absence d’un groupement de tête permet aussi de
librement changer de côtés dans les feuillets membranaires. La sphingosine possède aussi une amine
libre qui favorise son accumulation dans les organelles acides. La phosphorylation de la sphingosine
en S1P la rend relativement hydrophile, mais celle-ci perd la capacité à traverser librement les
membranes et requiert donc un transport actif. Les caractéristiques physiques des sphingolipides
simples permettent la compartimentation de ces molécules dans différentes organelles, comme le
noyau, les lysosomes et le cytosol [201].
Les sphingolipides font partie d’une voie de synthèse complexe. La voie de synthèse (Figure 1.6;
[194, 201]) de novo des sphingolipides commence à la membrane du réticulum endoplasmique, où
une série d’enzymes, incluant la serine C-palmitoyltransferase, permettent la conversion de la sérine
et du palmitoyl-coenzyme A en céramide. Une autre source de sphingolipides simples est la
sphingomyéline qui peut être dégradée par les sphingomyelinases en céramide, principalement dans
les lysosomes. La céramide est le point central entre le reste des sphingolipides simples et les
sphingolipides complexes. La synthèse des sphingolipides complexes requiert le transport de la
céramide dans l’appareil de Golgi, alors que la synthèse des sphingolipides simples s’effectue dans
différentes membranes, dont le réticulum endoplasmique et la membrane plasmatique. La céramide
peut être déacylée par une ceramidase, produisant la base sphingoïde sphingosine. La sphingosine est
phosphorylée en S1P soit par la sphingosine kinase 1 (SphK1), soit par la sphingosine kinase 2
(SphK2). La S1P est une molécule de sortie métabolique pour les sphingolipides, car elle peut être
dégradée de manière irréversible par la S1P lyase en phosphoéthanolamine et hexadecenal. La S1P
peut aussi être déphosphorylée soit par les S1P phosphatase 1 ou 2 [202, 203], soit par les lipid
phosphate phosphatases 1 à 3 [204]. La sphingosine peut être réacylée en céramide par la ceramide
synthase. D’ailleurs, puisque ces lipides sont métaboliquement reliés, il est bien reconnu que des
altérations des niveaux d’une espèce de sphingolipides puissent affecter le niveau d’une autre.
35
Figure 1.6: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine
La sphingosine est produite par une dégradation lysosomale des sphingolipides complexes dans le
réticulum endoplasmique ou par lune dégradation de la sphingomyéline à la membrane plasmique.
La localisation différentielle des sphingosine kinases (SphK) permet l’accumulation sélective de la
sphingosine en sphingosine-1-phosphate (S1P) dans les différents compartiments cellulaires. La
SphK1 peut générer de la S1P à la membrane plasmatique, permettant une signalisation de la S1P
autocrine ou paracrine. La S1P produite par l’une ou l’autre des SphK dans le cytosol peut aussi être
exportée par les ATP-binding cassette (ABC) ou spinster homolog 2 (SPNS2) et contribuer à la
signalisation extracellulaire. La SPHK2 se retrouve dans le noyau et dans les mitochondries et, par sa
production de S1P, interagit avec les histones désacétylases (HDAC) et la prohibitin 2 (PHB2),
respectivement. CMase : Céramidase; COX : Cytochrome c oxidase; PE : Phosphoéthanolamine;
S1PR : Récepteurs de la S1P; Ser + PalCoA : Sérine + Palmitoyl-Coenzyme A; SGPP : S1P
phosphatase; SMase : Sphingomyélinases. Figure adaptée avec permission à partir de Kunkel et al.
2013 [202].
36
La localisation des enzymes de la voie de la S1P et de leur substrat détermine leur activité biologique
(Figure 1.6). Les sphingomyelinases et ceramidases acides sont retrouvées dans les lysosomes [205,
206], les neutres à la membrane plasmatique [207, 208] et à l’appareil de Golgi [209, 210] alors que
les ceramidases alcalines sont présentes au réticulum endoplasmique [211]. La SphK1 est une
enzyme cytosolique et elle peut être activée par sa phosphorylation. L’activation de SphK1 permet sa
translocation à la membrane plasmatique et augmente sa contribution à la production de S1P [212].
De plus, la proximité de la membrane plasmatique augmente l’exportation de la S1P par les ATP-
Binding Cassette transporters [213] et le Spinster homolog 2 [214], permettant une activation
autocrine et paracrine des récepteurs de la S1P. Cette proximité facilite aussi sa liaison au TNF
receptor-associated factor 2, un cofacteur nécessaire à la signalisation du TNF. La SphK2 est aussi
cytosolique, mais sa phosphorylation induit plutôt sa translocation au noyau [215]. Au noyau, la
SphK2 se lie aux histones désacétylases 1 et 2, dont l’activité est fortement inhibée par la S1P produite
[216]. La SphK2 peut aussi s’accumuler dans les mitochondries, où la S1P se lie à la prohibitin 2
[217], régulant l’assemblage et la fonction de l’appareil de respiration mitochondriale. La S1P se
retrouve aussi dans le milieu extracellulaire, mais sa concentration y varie énormément. Alors que la
concentration de la S1P dans le sang se situe entre 0.3 et 1.0 µM [218, 219], sa concentration est 1000
fois moindre dans la plupart des autres tissus [220]. La différence de concentration de la S1P sanguine
et tissulaire induit un gradient de S1P crucial à la migration des lymphocytes vers le sang [221].
Toutefois, la majorité (environ 65%) de la S1P sanguine est liée à l’albumine et les lipoprotéines
[219] et est ainsi non disponible pour ses récepteurs. La S1P sanguine provient principalement des
cellules endothéliales [222], des globules rouges [223] et des plaquettes [224], en plus de la
phosphorylation de la sphingosine sanguine par la SphK1 extracellulaire, exportée par les cellules
endothéliales [225]. Les plaquettes sont aussi une réserve d’une grande quantité de S1P qui est libérée
lorsque de la coagulation. Ainsi, les voies de synthèses et de dégradation de la S1P sont multiples et
tant sa localisation intracellulaire et extracellulaire que sa concentration influencent ses effets
biologiques.
En plus de leur rôle structural, les sphingolipides sont intimement liés à la survie cellulaire [226], le
maintien des fonctions endothéliales [227], la migration cellulaire [201], l’angiogenèse [228] et
l’inflammation [202]. L’administration de céramide et/ou de sphingosine peut induire l’apoptose en
induisant la dépolarisation mitochondriale et en diminuant l’activation de la voie pro-survie
phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B [229]. L’effet de la S1P sur la survie cellulaire dépend
de l’enzyme phosphorylant la sphingosine (SphK1 ou SphK2) et donc de sa localisation. Alors que
la production de S1P par la SphK2 est liée à l’induction de l’apoptose par le relargage de cytochrome
c par les mitochondries [230], la S1P produite par la SphK1 est pro-proliférative [231],
37
potentiellement par son rôle positif dans la fonction autophagique [232]. Les effets extracellulaires
de la S1P sont principalement attribuables aux récepteurs couplés à des protéines G membranaires de
la S1P (Figure 1.7), qui sont au nombre de cinq (S1P1 à S1P5). S1P1 à S1P3 sont exprimés
ubiquitairement, mais S1P4 et S1P5 sont principalement exprimés par les cellules dendritiques et le
système nerveux, respectivement [233, 234]. Les sphingolipides peuvent ainsi affecter plusieurs
mécanismes et types cellulaires.
Les effets de l’activation des récepteurs de la S1P varient selon le type cellulaire et les organes où ils
sont exprimés. L’activation de S1P1 sur les cellules endothéliales augmente l’étanchéité vasculaire,
et son inhibition induit l’extravasation du contenu sanguin dans le parenchyme entourant les
vaisseaux sanguins [235]. Durant le développement fœtal, la délétion génétique du gène de la S1P1
(S1PR1) cause une hémorragie interne causée par une maturation vasculaire incomplète [236]. De
plus, S1P1, et dans une moindre mesure S1P3, participe à l’angiogenèse [237]. S1P1 est aussi
nécessaire pour la migration des lymphocytes hors des tissus lymphoïdes secondaires en réponse au
gradient de la S1P entre le sang et le tissu [201]. La modulation des récepteurs de la S1P sur les
cellules dendritiques inhibe aussi la production de cytokines pro-inflammatoires [238]. Les récepteurs
de la S1P favorisent la migration de plusieurs types cellulaires, comme les cellules dendritiques [239],
les macrophages [240] et les éosinophiles [241]. S1P1 et S1P3 peuvent induire la prolifération
cellulaire [242, 243], alors que S1P2 est principalement antiprolifératif et pro-apoptotique [244].
L’activation des récepteurs de la S1P affecte donc des fonctions physiologiques multiples et variées
dépendamment du type cellulaire stimulé.
38
Figure 1.7: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine
La sphingosine-1-phosphate (S1P) peut lier cinq récepteurs couplés à des protéines G membranaires
(S1PR1 à 5). Les protéines G (Gi, G12, G13 et Gq) déterminent les réponses cellulaires induites par
l’activation des récepteurs de la S1P. AC : adenylyl cyclase-cyclic AMP; ERK : extracellular signal-
regulated kinase; PLC : phospholipase C; PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase; Rho : Petites
GTPases de la famile Rho; JNK : Jun amino terminal kinase. Figure utilisée avec permission à partir
de Nagahashi et al. [245]
39
1.4.1 Les analogues de la sphingosine
FTY720 a été le premier analogue de la sphingosine synthétisé. Il est un dérivé de la myriocine, un
inhibiteur de la serine C-palmitoyltransferase, qui est produit par certains champignons thermophiles
ayant des effets antifongiques et immunosuppressifs [246]. Malgré la perte de la fonction inhibitrice
de la serine C-palmitoyltransferase, FTY720 conserve sa capacité immunosuppressive. Lorsque
phosphorylé par la SphK2 en FTY720-P [247], FTY720 devient un agoniste de tous les récepteurs de
la S1P, à l’exception de S1P2 [248]. De fait, l’effet immunosuppresseur de FTY720 dépend de son
activité sur S1P1 interférant avec la migration des lymphocytes et induisant la rétention des
lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires [249]. Cette fonction immunosuppressive a
été mise à profit dans le traitement de la sclérose en plaques, FTY720 étant un traitement approuvé
depuis 2010 [250]. Cependant, le développement d’analogues de FTY720, comme la famille des
AAL, a démontré que les effets des analogues de la sphingosine ne se limitent pas à leur activité sur
les récepteurs de la S1P.
La distribution intracellulaire des analogues de la sphingosine est similaire aux sphingolipides
endogènes et détermine leur activité. Les analogues peuvent être séparés en trois groupes, les
analogues phosphorylables (FTY720 et AAL-R), les analogues préphosphorylés (analogues de la
S1P; FTY720-P et AFD-R) et les analogues non phosphorylable (AAL-S) (Figure 1.8). Les analogues
de la sphingosine non phosphorylés sont amphipathiques et peuvent ainsi être distribués à travers la
totalité des compartiments cellulaires [251]. Comparativement à la sphingosine qui est phosphorylée
autant par la SphK1 que la SphK2, les analogues de la sphingosine phosphorylables sont
préférentiellement phosphorylés par la SphK2 comparativement à la SphK1. SphK2 phosphoryle les
analogues de la sphingosine 30 fois plus vite que SphK1 [252]. La majorité de la phosphorylation de
FTY720 et d’AAL-R est donc effectuée par la SphK2. Il faut noter qu’AAL-R est,
approximativement, phosphorylé 8 fois plus vite et déphosphorylé 2 fois moins vite que FTY720, ce
qui favorise un plus grand ratio d’AFD-R/AAL-R que de FTY720-P/FTY720 [253], du moins chez
la souris. FTY720-P, et probablement AFD-R, ne peut être déphosphorylé que par la S1P phosphatase
1 et la lipid phosphate phosphatase 3 [254]. Les analogues phosphorylés ne peuvent pas passer les
membranes et sont donc restreints aux organelles où ils ont été phosphorylés [255]. Ils peuvent
toutefois être exportés par le spinster homolog 2 et possiblement par les transporteurs ATP-binding
cassette [256]. La principale implication de cette restriction est que l’administration directe
d’analogues préphosphorylés limite préférentiellement leurs effets à la membrane plasmique et aux
récepteurs de la S1P. En somme, l’habileté des analogues de la sphingosine à être phosphorylés
détermine leur distribution et leur disponibilité et conséquemment, leurs effets biologiques.
40
Figure 1.8: Propriétés physiques des analogues de la sphingosine
La propriété amphiphile des analogues phosphorylables de la sphingosine (AAL-R et FTY720) leur
permet de passer à travers la membrane cytoplasmique. Dans le cytoplasme, ils peuvent être
phosphorylés par la SphK2 en AFD-R et FTY720-P, respectivement. Les analogues de la S1P peuvent
soit s’accumuler dans le milieu cytoplasmique, soit être exportés à l’extérieur de la cellule. Dans
l’espace extracellulaire, AFD-R et FTY720-P peuvent tous deux activer quatre des cinq récepteurs
de la S1P, S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5. L’analogue non phosphorylable de la sphingosine AAL-S peut
aussi passer la membrane cytoplasmique, mais il ne peut pas être phosphorylé. Il peut toutefois
moduler des cibles intracellulaires comme la protein phosphatase 2A (PP2A). Figure adaptée avec
permission de [257].
41
Les analogues de la sphingosine ont des cibles généralement similaires à celle de la sphingosine
endogène, ils ont donc le potentiel de modifier les mécanismes régulés par cette voie de signalisation.
Alors qu’une activation par la S1P est propice au recyclage des récepteurs à la membrane plasmatique,
les analogues phosphorylés promeuvent leur dégradation de manière dose-dépendante, ce qui peut se
traduire par un phénomène d’antagonisme fonctionnel [258]. La quantité de S1P1 à la surface
cellulaire est particulièrement importante dans le maintien de l’étanchéité vasculaire. En effet, une
concentration physiologique d’analogues de la sphingosine renforce les jonctions endothéliales,
similairement à la S1P endogène, mais une concentration supra-physiologique augmente la
perméabilité vasculaire [259]. Bien que les analogues de la sphingosine ne soient que faiblement
phosphorylés par SphK1, ils lient sa zone catalytique avec une affinité similaire à la sphingosine,
inhibant son fonctionnement [247]. Un mécanisme similaire, quoique moins efficace, est observé
avec la SphK2 [247]. En plus de réduire la phosphorylation de la sphingosine, certains analogues de
la sphingosine inhibent les ceramide synthases [260] et la S1P lyase [261]. Les analogues de la
sphingosine interfèrent ainsi autant avec les voies métaboliques que cataboliques des sphingolipides.
Plusieurs enzymes intracellulaires n’étant pas rattachées au métabolisme des sphingolipides sont
modulées de manière différentielle par la S1P et ses analogues. Par exemple, la protein phosphatase
2A, impliquée dans le contrôle de la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B [262],
est respectivement inhibée et activée par la S1P et ses analogues [263]. À l’inverse, la cytosolic
phospholipase A2, impliquée dans la production de lipides pro-inflammatoires, est activée par la S1P
via S1P3 [264], mais inhibée par FTY720 indépendamment des récepteurs de la S1P [265]. Les effets
biologiques des analogues de la sphingosine ne sont donc pas limités aux mécanismes usuels de la
sphingosine et de la S1P et peuvent avoir des effets divergents à ceux-ci.
1.4.2 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans l’asthme
Dans l’asthme, la balance des sphingolipides endogènes est altérée, ce qui est associé aux mécanismes
de la maladie. De fait, chez les patients atteints d’asthme allergique, la S1P est augmentée dans le
lavage bronchoalvéolaire suite à l’exposition à un allergène [266]. Certaines variantes du gène
orosomucoid like 3 sont fortement associées au développement de l’asthme [267]. Le produit de ce
gène est un inhibiteur de la serine C-palmitoyltransferase nécessaire pour la production de novo des
sphingolipides. Cependant, la relation entre l’orosomucoid like 3 et la régulation des sphingolipides
est mal comprise. Une augmentation mineure des transcrits d’orosomucoid like 3 entraine une
diminution des céramides, alors qu’une augmentation majeure induit l’effet inverse [268]. Toutefois,
l’augmentation de sa transcription chez les souris induit spontanément des signes d’asthme, comme
42
l’hyperréactivité bronchique et le remodelage bronchique [269]. De plus, la transcription
d’orosomucoid like 3 est aussi augmentée dans un modèle murin d’asthme induit par l’ovalbumine
[270]. Toutefois, sa délétion génétique spécifiquement dans les cellules épithéliales exacerbe les
signes d’asthme et implique une augmentation de la S1P [271]. Bien que ces résultats soient
discordants, ils supportent l’importance de la régulation des sphingolipides dans l’asthme.
L’activité de SphK1 et SphK2 influence l’activité des cellules inflammatoires. L’activation des FcεRI
sur les mastocytes par un allergène augmente l’activité de la SphK1 ainsi que la production et
l’exportation de la S1P. Dans un modèle d’asthme expérimental induit par l’ovalbumine,
l’administration d’un inhibiteur spécifique de SphK1 inhibe l’hyperréactivité bronchique,
l’éosinophilie et la production des médiateurs Th2 IL-4, IL-5 et IL-13 [272] ainsi que d’IgE [273].
La production intracellulaire de S1P est liée à l’activation des mastocytes, car cette dernière est
dépendante du ratio S1P/sphingosine cytosolique [274]. De plus, l’activation de S1P1 et S1P2 sur les
mastocytes par la S1P extracellulaire contribue à leur migration et leur dégranulation, respectivement
[275]. L’axe SphK1/S1P est aussi impliqué dans la signalisation du TNF, car la S1P est un cofacteur
essentiel de l’activation du facteur de transcription nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of
activated B cells, impliqué dans la réponse inflammatoire [276]. La S1P peut aussi stimuler des
cellules non inflammatoires. Par exemple, elle sensibilise directement le muscle lisse bronchique à la
contraction induite par la méthacholine [277]. Le métabolisme de la sphingosine et de la S1P est un
mécanisme clé dans la régulation de l’asthme.
Les analogues de la sphingosine sont de puissants immunomodulateurs et affectent plusieurs
mécanismes reliés à l’asthme. L’administration prophylactique d’analogues de la sphingosine, dans
un modèle d’asthme murin induit par l’ovalbumine, inhibe l’inflammation éosinophilique par
plusieurs mécanismes. Par exemple, les analogues de la sphingosine induisent la séquestration des
lymphocytes effecteurs et des lymphocytes naïfs dans certains organes lymphoïdes secondaires. Ils
inhibent aussi la migration des cellules dendritiques aux organes lymphoïdes secondaires par leur
activité sur S1P1 [278]. La présentation de l’antigène est ainsi réduite, inhibant ultimement une
réponse adaptative à l’allergène [279, 280]. Les analogues de la sphingosine peuvent aussi interférer
avec la production de médiateurs inflammatoires comme IL-4, IL-5 et IL-13 [279]. En plus des effets
médiés par les récepteurs de la S1P, les analogues de la sphingosine modulent plusieurs mécanismes
intracellulaires. Les analogues de la sphingosine peuvent activer la protein phosphatase 2A (FTY720
[263]; FTY720-P [281], AAL-S [282]) qui est un suppresseur de tumeur fortement sous-exprimée et
sous-activée dans les cellules mononucléaires sanguines et qui corrèle négativement avec la résistance
aux corticostéroïdes [283]. Dans un modèle d’asthme murin induit par les antigènes d’acariens
43
domestiques, la réactivation de la protein phosphatase 2A par l’administration prophylactique de
AAL-S prévient l’hyperréactivité bronchique, l’éosinophilie, l’infiltration lymphocytaire au poumon
et plusieurs médiateurs inflammatoires [282]. De plus, les analogues de la sphingosine sont de
puissants modulateurs de la survie cellulaire. La phosphorylation intracellulaire d’AAL-R en AFD-R
induit l’apoptose des lymphocytes en induisant un stress important du réticulum endoplasmique, in
vitro [284]. Les analogues de la sphingosine interfèrent avec de nombreux mécanismes promouvant
l’asthme de manière aussi bien dépendante qu’indépendante des récepteurs de la S1P.
1.4.3 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans la fibrose pulmonaire
La voie endogène de la S1P est directement impliquée dans le développement de la fibrose
pulmonaire. Dans un modèle de fibrose pulmonaire murin induite par l’irradiation, l’inhibition
pharmacologique de la serine C-palmitoyltransferase, produisant la céramide de novo, diminue le
niveau de la S1P et l’inflammation, retardant le développement de la fibrose [285]. Similairement,
les souris ayant une invalidation génétique de la sphingomyélinase acide sont résistantes au
développement d’inflammation et de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine [286]. De plus,
cette invalidation dans les fibroblastes murins 3T3 interfère avec la production de S1P et du collagène
induit par la bléomycine, in vitro. Il est important de noter qu’une augmentation de la céramide est
observée après une blessure au poumon, comme dans les cas de syndrome respiratoire aigu, et qu’elle
contribue directement à l’œdème pulmonaire [287]. Comme des cycles répétitifs d’injures tissulaires
pulmonaires sont occasionnellement observés dans la FPI, l’augmentation de la céramide pourrait
participer au développement de la fibrose pulmonaire.
L’un des principaux métabolites en aval de la céramide, la S1P, est augmenté dans le sérum et le
lavage bronchoalvéolaire des patients atteints de la FPI [288] et pourrait contribuer à la progression
de la maladie. De plus, la transcription de SphK1 est accrue dans le tissu pulmonaire fibrotique et
corrèle avec les niveaux de transcrits du marqueur des myofibroblastes, l’α-smooth muscle actin, et
la production de collagène. La concentration de S1P dans le lavage bronchoalvéolaire [288] et la
transcription de SphK1 et de SphK2 [289] dans le tissu est négativement associée avec la fonction
pulmonaire et la survie des patients atteints de la FPI. La SphK1 est aussi augmentée dans le tissu
pulmonaire suite à la blessure initiale dans les modèles de fibrose pulmonaire induite par la
bléomycine et la radiation [290] et elle corrèle avec l’augmentation des niveaux de S1P. À l’inverse,
l’invalidation génétique de la SphK1, mais pas SphK2, confère une résistance à la fibrose induite par
la bléomycine, ce qui est répliqué par un inhibiteur combiné de SphK1 et SphK2 [289]. Cette
inhibition réduit la transcription de TGF-β, de fibronectine, de collagène et d’α-smooth muscle actin,
44
culminant par une diminution de la fibrose en général [289]. Dans des fibroblastes murins primaires,
l’exposition à la bléomycine induit une augmentation des niveaux de transcrits de SphK1 dépendante
du TGF-β [289]. De plus, la SphK1 est requise pour la différentiation induite par le TGF-β des
fibroblastes murins et humains en myofibroblastes [291]. La dégradation de la S1P par la S1P lyase
est aussi impliquée dans le contrôle des mécanismes fibrotiques. Contrairement à la SphK1, elle est
inversement corrélée avec la sévérité de la fibrose pulmonaire et sa délétion génétique exacerbe la
fibrose induite par la bléomycine [292]. La S1P lyase est induite par le TGF-β et l’augmentation de
sa transcription diminue la différentiation des fibroblastes en myofibroblastes [292]. Ainsi, plusieurs
études supportent l’hypothèse que la S1P favorise le développement de la fibrose pulmonaire.
Plusieurs études suggèrent cependant que la S1P peut aussi avoir des effets anti-fibrotiques. Chez les
podocytes humains, l’augmentation de la transcription de SphK1 interfère avec celle du CTGF induit
par le TGF-β, réduisant la fibrose [293]. Ce mécanisme n’a cependant pas encore été confirmé dans
d’autres types cellulaires. De plus, la S1P produite par SphK2 pourrait avoir des effets anti-fibrotiques
par l’inhibition des histones désacétylases [216]. De fait, l’expression et l’activité des histones
désacétylases sont augmentées dans la FPI [294]. Leur inhibition interfère avec la signalisation du
TGF-β ainsi que la prolifération des fibroblastes et leur différenciation en myofibroblastes [295]. De
plus, l’activité des histones désacétylases est liée à la résistance à l’apoptose des fibroblastes de
patients atteints de la FPI [167]. La S1P intracellulaire, et en particulier la S1P intranucléaire, aurait
donc des propriétés anti-fibrotiques.
Les analogues de la sphingosine affectent plusieurs mécanismes pro- ou anti-fibrotiques. Dans un
modèle de fibrose pulmonaire induite par le paraquat, FTY720 diminue l’inflammation, la fuite de
fluide vasculaire dans lavage bronchoalvéolaire et ultimement la fibrose [296]. Cet effet est répliqué
dans des modèles de fibrose hépatique [297] et rénale [298]. Toutefois, des doses élevées de FTY720
augmentent la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine en exacerbant la perméabilité vasculaire
dans le poumon [299]. Cette contradiction s’explique par le fait que la modulation de l’étanchéité des
jonctions endothéliales par FTY720 est dose-dépendante [259], qu’une forte concentration de
FTY720 induit la dégradation de S1P1 [300] et que l’augmentation de la perméabilité vasculaire
contribue aux dommages alvéolaires [301]. Toutefois, dans ces études, les analogues ont été
administrés pendant la phase inflammatoire des modèles utilisés, interférant potentiellement avec le
développement du modèle, ce qui ne permet pas de déterminer les effets des analogues sur les
mécanismes fibrotiques en tant que tels.
45
In vitro, les effets des analogues de la sphingosine sont divergents. D’une part, l’activation de S1P2
et S1P3 sur les fibroblastes augmente la production de la matrice extracellulaire, dont le collagène de
type I et la fibronectine, et la transcription du CTGF [302]. De plus, l’activation de ces récepteurs
induit la transformation des cellules épithéliales en fibroblastes [288]. L’activation de S1P3 stimule
la différentiation des fibroblastes en myofibroblastes [303] et inhibe l’apoptose des fibroblastes [304].
D’une autre part, les effets des analogues de la sphingosine indépendants des récepteurs de la S1P
sont principalement anti-fibrotiques. Suite à sa phosphorylation au noyau, FTY720-P, tout comme la
S1P, est un inhibiteur des histones désacétylases de classe I [216]. L’inhibition des histones
désacétylases interfère avec la signalisation du TGF-β et diminue la résistance à l’apoptose des
fibroblastes. Similairement, FTY720 induit l’apoptose des fibroblastes [304]. La voie de signalisation
de la S1P et les analogues de la sphingosine tendent ainsi à avoir des effets profibrotiques par leur
activité sur les récepteurs de la sphingosine, et des effets anti-fibrotiques par leur activité
intracellulaire.
46
2. Chapitre II : Problématique, hypothèses et objectifs
Le poumon est un organe complexe agissant comme barrière avec l’environnement et permettant les
échanges gazeux avec ce dernier. Son fonctionnement optimal est donc d’une importance capitale.
Toutefois, plusieurs pathologies peuvent induire des changements transitoires ou permanents de la
structure du poumon, comme il est en le cas dans l’asthme et la fibrose pulmonaire. Les paragraphes
subséquents résument les raisons pour lesquelles cette thèse a été dédiée à comprendre comment les
sphingolipides et leurs analogues influencent divers aspects du remodelage pulmonaire.
2.1 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre III :
Treatment with a sphingosine analog after the inception of house dust mite-
induced airway inflammation alleviates key features of experimental asthma
L’asthme est une maladie affectant 300 millions de personnes dans le monde [14], dont 10% sont
sévères et résistants aux traitements actuels [20]. Bien que plusieurs types d’asthmes existent, la plus
commune est l’asthme allergique. Ce dernier est la conséquence du développement d’une réaction
immunitaire inappropriée (sensibilisation) contre des particules allergéniques retrouvées
naturellement dans l’air, comme le pollen ou les antigènes d’acariens domestiques [14]. L’exposition
aiguë à ces allergènes induit une inflammation bronchique et une bronchoconstriction importante.
Cependant, plusieurs patients sont résistants aux traitements pharmacologiques actuels [31]. Il est
donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
Les analogues de la sphingosine sont de puissants immunomodulateurs et l’un d’entre eux, FTY720,
est présentement utilisé avec succès pour le traitement de la sclérose en plaques, une maladie auto-
immune [250]. Dans un modèle d’asthme expérimental murin induit par l’ovalbumine, AAL-R, un
analogue de FTY720, interfère avec la sensibilisation nécessaire au développement de l’asthme [280].
De plus, la forme phosphorylée de ces analogues peut se lier à S1P1 pour séquestrer les lymphocytes
dans les organes lymphoïdes secondaires, diminuant ainsi leur disponibilité [249]. Toutefois, la
sensibilisation à l’ovalbumine avec un adjuvant par voie intrapéritonéale ne représente pas un
phénomène observé chez l’humain. De plus, le traitement en prophylaxie de l’asthme a peu
d’application clinique. Par conséquent, la capacité des analogues de la sphingosine à diminuer
l’inflammation allergique préétablie induite à l’aide des antigènes naturels d’acariens
domestiques a été étudiée. Sur la base des effets immunomodulateurs des analogues de la
sphingosine, nous avons posé l’hypothèse que :
47
L’analogue phosphorylable de la sphingosine AAL-R diminue les signes caractéristiques de
l’asthme aigu.
Afin de tester cette hypothèse, les objectifs suivants ont été poursuivis :
• Définir la cinétique de la réponse inflammatoire allergique induite par les antigènes
d’acariens domestiques.
• Évaluer la capacité d’AAL-R à réduire l’hyperréactivité bronchique et l’inflammation
allergique pulmonaire.
• Déterminer l’impact de AAL-R comparativement à sa forme préphosphorylée AFD-R sur
les populations de cellules inflammatoires au poumon et aux ganglions drainants.
2.2 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre IV :
A Phosphorylatable Sphingosine Analog Induces Airway Smooth Muscle
Cytostasis and Reverses Airway Hyperresponsiveness in Experimental Asthma
Chez les patients atteints d’asthme allergique, une exposition récurrente à un antigène inhalé induit
le remodelage des voies aériennes, dont l’épaississement du muscle lisse bronchique, qui est
fortement impliqué dans la sévérité de l’asthme [51]. Cet épaississement exacerbe l’hyperréactivité
bronchique et d’autres symptômes de l’asthme. Cependant, il n’existe présentement pas de traitement
pharmacologique visant spécifiquement à réduire l’épaississement du muscle lisse bronchique [37].
Bien que les analogues de la sphingosine soient principalement connus pour leurs effets
immunomodulateurs, ceux-ci peuvent moduler des mécanismes impliqués dans la survie cellulaire,
en fonction de leur statut de phosphorylation. L’analogue phosphorylable AAL-R interfère avec la
prolifération cellulaire par l’accumulation intracellulaire de sa forme phosphorylée [284], alors que
l’analogue non phosphorylable AAL-S active un régulateur négatif de la prolifération, la protein
phosphatase 2A [282]. De plus, les analogues de la sphingosine modulent le métabolisme des
sphingolipides, dont la céramide [229] et la S1P [230] qui sont respectivement liées à l’apoptose et à
l’autophagie. À l’aide d’un modèle murin d’asthme chronique et d’études in vitro, le potentiel
d’analogues de la sphingosine à interférer avec la survie des cellules musculaires lisses
bronchiques et à renverser l’épaississement du muscle lisse bronchique a été étudié. En vue des
impacts potentiellement cataboliques des analogues de la sphingosine, nous avons posé
l’hypothèse suivante :
48
AAL-R diminue l’épaississement du muscle lisse bronchique dans l’asthme, et de ce fait, renverse
l’hyperréactivité bronchique préétablie.
Afin de tester cette hypothèse, les objectifs suivants ont été poursuivis :
• Évaluer l’efficacité d’AAL-R à réduire l’hyperréactivité bronchique et l’épaississement du
muscle lisse bronchique dans un modèle d’asthme chronique montrant du remodelage
bronchique.
• Caractériser l’effet des analogues de la sphingosine selon leur phosphorylation sur la
balance proliférative et apoptotique des cellules musculaires lisses bronchiques in vitro.
• Déterminer le mécanisme cellulaire par lequel AAL-R induit un effet cytostatique.
2.3 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre V
Plusieurs maladies pulmonaires interstitielles peuvent engendrer un processus de cicatrisation
anormal nommé fibrose pulmonaire. Certaines de ces maladies sont causées par un agent connu dont
l’exposition peut être réduite ou éliminée, mais ce n’est pas toujours le cas, comme pour la FPI [7].
Le retrait de l’agent causal permet de ralentir la maladie, mais ne permet pas de rétablir les dommages
déjà encourus [110]. Malheureusement, il n’existe aucun traitement curatif, ce qui explique en partie
l’espérance de vie moyenne de 2 à 3 ans des cas les plus sévères de fibrose pulmonaire, comme la
FPI [104]. La fibrose pulmonaire est caractérisée par une augmentation de la rigidité du poumon, une
réduction du volume pulmonaire et finalement par une diminution des échanges gazeux [107]. Ces
caractéristiques sont causées par l’accumulation de matrice extracellulaire dans le parenchyme
pulmonaire et les alvéoles, altérant l’architecture du poumon. La surexpression de facteurs de
croissance, l’accumulation de matrice extracellulaire par le débalancement entre sa production et sa
dégradation ainsi que la survie et l’activation anormales des fibroblastes et des myofibroblastes sont
directement impliquées dans le développement de la fibrose pulmonaire [121].
Les effets des analogues de la sphingosine sur la fibrose pulmonaire sont controversés. D’un côté,
FTY720 diminue l’inflammation et la fibrose subséquente dans un modèle de fibrose pulmonaire
murin [296]. Cet effet bénéfique est corroboré par des observations similaires dans des modèles de
fibrose hépatique [297] et rénale [298]. D’un autre côté, des doses élevées de ce même analogue
peuvent augmenter la perméabilité vasculaire et exacerber l’inflammation et la fibrose dans un
modèle de fibrose pulmonaire murin [299]. De plus, des études in vitro suggèrent que les analogues
de la sphingosine ont des effets profibrotiques sur les fibroblastes. Un facteur confondant dans cette
49
controverse est l’implication de l’inflammation dans les modèles in vivo, car bien que celle-ci soit
nécessaire au développement de ces modèles, son inhibition ne se traduit pas par une amélioration de
la fibrose pulmonaire chez l’humain [108]. Puisque les analogues de la sphingosine sont de puissants
anti-inflammatoires, la phase inflammatoire de ces modèles doit être minutieusement considérée.
L’impact d’une faible dose d’un analogue de la sphingosine administré durant la phase
inflammatoire ou la phase fibrotique a donc été déterminé dans le modèle de fibrose pulmonaire
induite par la bléomycine. En raison de la nature des impacts généralement profibrotiques des
analogues de la sphingosine sur les fibroblastes in vitro, nous avons testé l’hypothèse que :
Les analogues de la sphingosine favorisent l’augmentation de la fibrose pulmonaire lorsqu’ils sont
administrés en phase fibrotique du modèle de fibrose induit par la bléomycine.
Afin de tester cette hypothèse, les objectifs suivants ont été poursuivis :
• Délimiter les phases inflammatoires et fibrotiques dans le modèle de fibrose pulmonaire
murin induit par la bléomycine.
• Comparer les effets des analogues de la sphingosine sur la progression de la fibrose selon
la phase traitée.
• Déterminer la modulation des principaux médiateurs fibrotiques in vivo et in vitro par les
analogues de la sphingosine.
2.4 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre VI:
FTY720 promotes pulmonary fibrosis when administered during the
remodelling phase following a bleomycin-induced lung injury
Les fibroblastes et les myofibroblastes sont les cellules centrales dans la fibrose pulmonaire. Elles
sont retrouvées au cœur des lésions fibrotiques et expriment la majorité de la matrice extracellulaire,
dont le collagène et la fibronectine [168]. De plus, elles expriment fortement les MMP et leurs
inhibiteurs dont la balance contrôle l’accumulation de cette matrice [168]. Les fibroblastes provenant
de patients atteints de la FPI ont un phénotype profibrotique comparativement aux fibroblastes non-
FPI. Ils sont plus résistants à l’apoptose [166, 305], sont plus différenciés en myofibroblastes [112]
et ont un débalancement de leur production de MMP et de leur inhibiteur favorisant l’accumulation
de la matrice extracellulaire [168]. Ils surexpriment aussi plusieurs facteurs profibrotiques, comme le
TGF-β et le CTGF [121, 134] et produisent une forme altérée de la fibronectine [183].
50
La voie de signalisation de la S1P est associée à plusieurs mécanismes reliés aux dommages
tissulaires et à la cicatrisation. Dans le lavage bronchoalvéolaire et les tissus pulmonaires de patients
atteints de la FPI, le niveau de S1P et d’une des enzymes la produisant, SphK1, est élevé [288]. De
plus, les niveaux de transcrits de SphK1 [288] et de l’enzyme dégradant la S1P, la S1P lyase [292],
sont respectivement positivement et négativement associés à la sévérité de la maladie. La SphK1 est
aussi importante dans la signalisation du TGF-β et son invalidation génétique diminue l’inflammation
et la fibrose dans un modèle murin de fibrose pulmonaire [289]. Sobel et al. [302] ont précédemment
montré que la S1P et FTY720 induisent tous deux un phénotype profibrotique dans des fibroblastes
normaux, incluant la production de matrice extracellulaire et de CTGF, et que cet effet semble médié
par S1P3. Aussi, FTY720 stimule la production de CTGF, mais pas de TGF-β, par des fibroblastes
murins 3T3. Toutefois, ces effets n’ont jamais été démontrés avec des fibroblastes fibrotiques. L’effet
de la S1P, en présence ou non d’un antagoniste de S1P3, sur les niveaux de transcrits des
facteurs profibrotiques par des fibroblastes isolés de biopsies pulmonaires de patients atteints
de la FPI a donc été déterminé. Sur la base des résultats montrés au chapitre précédent, nous
posons l’hypothèse que :
La stimulation avec une concentration physiologique de S1P induira la surexpression des facteurs
fibrotiques par les fibroblastes FPI par son activité sur S1P3.
Afin de tester cette hypothèse, les objectifs suivants ont été poursuivis :
• Caractériser et comparer les niveaux de transcrits de facteurs fibrotiques et de
composantes de la voie de la sphingosine par des fibroblastes provenant de patients
souffrants, ou non, de FPI.
• Déterminer les facteurs fibrotiques modulés par la stimulation avec la S1P.
• Évaluer la capacité d’un antagoniste de S1P3, TY-52156, à renverser la stimulation
profibrotique de la S1P.
51
3. Chapitre III: Treatment with a sphingosine analog
after the inception of house dust mite-induced airway
inflammation alleviates key features of experimental
asthma
3.1 Résumé
Les analogues de la sphingosine peuvent être phosphorylés in vivo et activer des récepteurs
membranaires spécifiques. Lorsqu’administrés en prophylaxie, ils diminuent les signes de l’asthme
expérimental en interférant avec la sensibilisation à l’antigène en inhibant la migration des cellules
dendritiques aux ganglions drainants. Cependant, leur habileté à inhiber l’inflammation pulmonaire
déjà présente reste à démontrer. L’asthme expérimental a été induit à l’aide de l’antigène naturel
D.pteronyssius dans des souris BALB/c. L’analogue de la sphingosine AAL-R a été administré
pendant la phase post-sensibilisation AAL-R et réduit fortement l’hyperréactivité bronchique et
l’inflammation éosinophilique bronchoalvéolaire. De plus, il induit l’apoptose des lymphocytes T
CD4+ et B pulmonaires, sans affecter la migration des cellules dendritiques. La forme
préphosphorylée d’AAL-R est impuissante à induire l’apoptose des lymphocytes, résultant en des
effets anti-inflammatoires diminués comparativement à AAL-R. AAL-R inhibe l’inflammation
allergique préexistante et diminue l’hyperréactivité bronchique en augmentant l’apoptose des
lymphocytes pulmonaires.
52
3.2 Abstract
Background: In vivo phosphorylation of sphingosine analogs with their ensuing binding and
activation of their cell-surface sphingosine-1-phosphate receptors is regarded as the main
immunomodulatory mechanism of this new class of drugs. Yet, prophylactic treatment with
sphingosine analogs interferes with experimental asthma by impeding the migration of dendritic cells
to draining lymph nodes. However, whether these drugs can also alleviate allergic airway
inflammation after its onset remains to be determined. Herein, we investigated to which extent and
by which mechanisms the sphingosine analog AAL-R interferes with key features of asthma in a
murine model during ongoing allergic inflammation induced by Dermatophagoides pteronyssinus.
Methods: BALB/c mice were exposed to either D. pteronyssinus or saline, intranasally, once-daily
for 10 consecutive days. Mice were treated intratracheally with either AAL-R, its pre-phosphorylated
form AFD-R, or the vehicle before every allergen challenge over the last four days, i.e after the onset
of allergic airway inflammation. On day 11, airway responsiveness to methacholine was measured;
inflammatory cells and cytokines were quantified in the airways; and the numbers and/or viability of
T cells, B cells and dendritic cells were assessed in the lungs and draining lymph nodes.
Results: AAL-R decreased airway hyperresponsiveness induced by D. pteronyssinus by nearly 70%.
This was associated with a strong reduction of IL-5 and IL-13 levels in the airways and with a
decreased eosinophilic response. Notably, the lung CD4+ T cells were almost entirely eliminated by
AAL-R, which concurred with enhanced apoptosis/necrosis in that cell population. This inhibition
occurred in the absence of dendritic cell number modulation in draining lymph nodes. On the other
hand, the pre-phosphorylated form AFD-R, which preferentially acts on cell-surface sphingosine-1-
phosphate receptors, was relatively impotent at enhancing cell death, which led to a less efficient
control of T cell and eosinophil responses in the lungs.
Conclusion: Airway delivery of the non-phosphorylated sphingosine analog, but not its pre-
phosphorylated counterpart, is highly efficient at controlling the local T cell response after the onset
of allergic airway inflammation. The mechanism appears to involve local induction of lymphocyte
apoptosis/necrosis, while mildly affecting dendritic cell and T cell accumulation in draining lymph
nodes.
Keywords FTY720; Fingolimod; Gilenya; Dermatophagoides pteronyssinus; apoptosis; dendritic
cells; CD4+ T cells; asthma; S1P; AAL(R), AAL(S), sphingosine
53
3.3 Background
Asthma is a chronic lung disorder with no cure that affects 235 million people worldwide [1]. Asthma
decreases the quality of life and its yearly cost per country ranges from 10 to 266 billion dollars [2].
Although a myriad of interventions exists to alleviate symptoms, current practices only ensure
adequate control of asthma in less than 50 % of patients [3]. Furthermore, up to 10 percent of patients
suffer from severe forms of asthma that are largely refractory to current therapies [4] and too many
still succumb [1]. Given the health and the economic burden of asthma, identification of new
mechanisms and targets for intervention is required.
Sphingosine analogs emerge as potent immunomodulators with therapeutic efficacy proven in
humans. For instance, the drug FTY720 (Fingolimod, Gilenya) is currently used for patients with
multiple sclerosis [5]. The compound AAL-R is an analog of FTY720 that has been broadly used to
study the mechanisms of action of this class of compounds [6-9]. Sphingosine analogs such as
FTY720 and AAL-R are cell-permeant and become phosphorylated intracellularly to become a
sphingosine-1-phosphate (S1P) analog. They are then actively exported from the cells. Owing to their
phosphorylation, the secreted forms of the drugs are cell-impermeant and their mechanisms of action
become then restricted to extracellular effects, which are mediated by binding on four of the five cell
surface S1P receptors (S1P1,3-5) [8]. The archetypal mechanism of action of sphingosine analogs is
sequestration of lymphocytes in secondary lymphoid organs after activation of S1P1 [10]. However,
it is increasingly recognized that activation of S1P receptors following the intracellular
phosphorylation and secretion of the analogs is not the only mechanism underlying their bioactivity.
These compounds can indeed modulate cellular functions independently of S1P receptor engagement,
including among others cell fate and the activity of both phospholipase and phosphatase subsets [6,
11, 12]. The mechanisms of action of sphingosine analogs are thus complex, misunderstood, and
might vary under different pathophysiological conditions.
When administered in a prophylactic fashion, phosphorylatable sphingosine analogs interfere with
the development of experimental allergic airway inflammation. This was demonstrated in the classical
model induced by systemic sensitization with ovalbumin (OVA) emulsified in aluminum (Alum),
followed by airway challenges with OVA (OVA-Alum model) [13]. The mechanism of action under
these conditions is potent inhibition of dendritic cell (DC) accumulation in draining lymph nodes,
interference with antigen presentation, and failure to launch an efficient antigen-specific T cell
response [13, 14]. However, whether the phosphorylatable sphingosine analogs are salutary when
administered in a therapeutic fashion, i.e. after the onset of allergic airway inflammation, is undefined.
Additionally, the efficacy of phosphorylatable sphingosine analogs to interfere with airway
54
inflammation induced by a natural allergen has never been studied. In contrast with the classical
OVA-Alum model, natural allergens have specific modi operandi – including proteolytic activity and
endogenous adjuvant activity [15]. Importantly, the natural allergens evoke a classical allergic
response by local mechanisms involving pulmonary DC when delivered through natural routes of
exposure, such as the airways [16]. They thus recapitulate more genuinely the mechanisms of allergic
airway inflammation in humans.
Under these premises, we aimed to determine if a sphingosine analog, namely AAL-R, alleviates
experimental asthma elicited by subchronic airway inflammation induced by exposure to a natural
allergen, namely Dermatophagoides pteronyssinus (house dust mite extract; HDM). We hypothesized
that treatment with AAL-R after the onset of HDM-induced airway inflammation interferes with
mechanisms leading to key features of asthma in a murine model.
3.4 Methods
3.4.1 Murine Model of Asthma
Pathogen-free BALB/c female mice (8 weeks old, Charles River) were anesthetized with isoflurane
and instilled intranasally (i.n.) with 50 µl of saline or with saline containing 50 or 75 µg HDM extract
(Greer), once daily, from day 1 to 10. Unless otherwise indicated, all measurements were taken at
day 11. The mice were either euthanized with ketamine-xylazine overdose for collection of the
bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and for tissue sampling; or tested for airway responsiveness to
methacholine (MCh) using documented methods [17]. Experimental, housing and care procedures
were approved by the Committee of Animal Care of Laval University in accordance with the
guidelines of the Canadian Council on Animal Care (protocols 2013037, 2009128).
3.4.2 Immunoglobulin Titration
Plates were coated with 50 μg/mL HDM and incubated with serial dilution of serum (1:200 to
1:145800). Titers were determined by a colorimetric reaction as reported [18].
55
3.4.3 Experimental Treatments
Naïve or HDM-instilled mice were treated intratracheally (i.t.) with either 50 µl of distilled water
(dH2O) containing 2.5 µg of AAL-R, or the vehicle (dH2O) from day 7 to day 10. This dose, which
corresponds to 0.1 mg/kg, was chosen because it does not induce histological alterations per se, and
because it was shown to potently induce immunomodulation in the airways [13, 14]. Treatments were
delivered under isoflurane anesthesia and animals were thereafter placed in standard housing
conditions for 1 h until re-anesthesized with isoflurane prior to HDM instillation. In a second series
of experiments, an additional group was treated with a molar equivalent dose (3.5 µg) of the
phosphorylated sphingosine analog, namely AFD-R. Compounds were either provided by Dr Hugh
Rosen (TSRI) or synthetized using published methods (NuChem Therapeutics) [19, 20].
3.4.4 Differential Counts, Flow Cytometric Analyses and Quantification of Cytokines
BALF as well as single-cell suspensions from both the right and central lobes and from draining
mediastinal lymph nodes (MLN) were obtained as previously reported [21]. Antibodies are anti- CD4
(RM4-5) (eBioscience); CD8a (53-6.7), CD11c (N418), CD19 (6D5), CD90.2 (30-H12), Ki-67
(16A8) (Biolegend); MHC-II (2G9) (BD Biosciences). Viability was assessed using annexin V
(Biolegend) and LIVE/DEAD (Life Technologies). Fluorescence and autofluorescence (AF) were
acquired using a Diva-driven LSRFortessa (Becton Dickinson) and analyzed with the FlowJo
software (Tree Star inc). To compute the total numbers of cell subsets, absolute cell counts obtained
with a hemocytometer were multiplied by cell frequencies obtained either by flow cytometry or
following differential cell counts as previously reported [17, 21]. For cytokine quantification, cell-
free BALF were concentrated with Amicon 3K (Millipore) and incubated with cytometric bead array
Flex Set for interleukin (IL)-5, IL-13 and CCL5 according to the manufacturer’s instructions (BD
Biosciences).
3.4.5 Histology
After BALF were performed, the left caudal lobes were processed as previously described [18] and
stained with either hematoxylin and eosin (H&E) for the evaluation of inflammatory cell infiltrate; or
with Periodic Acid-Schiff (PAS) stain and hematoxylin for the evaluation of mucus-producing cells.
Histological evaluation was performed by an American College of Veterinary Pathologists Board-
certified pathologist (CT). The nomenclature used to describe the lesion and the severity of the lesions
56
(5 grades scale) was based on the guidelines provided by the Society of Toxicological Pathology [22,
23].
3.4.6 Measurement of Airway Responsiveness
Methacholine (MCh) challenge test was performed on tracheotomized mice connected to a flexiVent
apparatus (SCIREQ) as previously reported [17].
3.4.7 Statistical Analyses
Unless otherwise stated, the data shown are means ± SEM. Data were analyzed using one-way
ANOVAs. To fulfill the normality and variance assumptions, variables were log-transformed. An arc
sinus transformation on the square root was applied on BALF measurements that were expressed in
percentage. Homogeneity of covariance parameter assumption among groups was verified. A
posteriori comparisons were performed with Tukey’s comparison technique. All reported P values
are based on these transformations. In addition, the nonparametric Kruskal-Wallis test was performed
on histology data. The results were considered significant with p values 0.05, unless otherwise
stated. All analyses were conducted using the statistical package SAS v9.3 (SAS Institute Inc).
3.5 Results
3.5.1 Onset of allergic airway inflammation in response to daily exposure to HDM
In order to ensure that our experimental treatments were undertaken after the inception of local
allergic inflammation, we assessed the kinetics of the systemic and the local allergic responses in this
subchronic model induced by HDM. Inflammation was evaluated in the BALF at day 4, 7, and 11.
Daily i.n. delivery of saline failed to induce accumulation of leukocytes in the BALF (Figure 3.1). In
contrast, HDM delivery was associated with a mild increase of absolute numbers of lymphocytes
(0.22 ± 0.02 x105, Figure 3.1A) and neutrophils (0.29 ± 0.08 x105, Figure 3.1B) in BALF on day 4.
Instillation of HDM also induced the recruitment of eosinophils in the airways with 0.18 ± 0.07 x105
eosinophils in BALF at day 7 (Figure 3.1C). The number of eosinophils reached 2.0 ± 0.6 x105 at
day 11. The appearance of antigen-specific IgG1 (functional equivalent to human IgE) in serum
(Figure 3.1D) coincided with the onset of eosinophilia, validating that sensitization had occurred at
57
that time-point. These results indicated that the onset of allergic airway inflammation was clearly
established at day 7 and it was thus a proper time for initiating the treatment with the sphingosine
analog (Figure 3.2).
3.5.2 AAL-R alleviates airway responsiveness induced by HDM
In patients with allergic asthma, the sensitization phase has already occurred and exacerbations arise
due to inflammatory flares triggered by allergen exposures. To be physiologically meaningful, a
treatment may thus be able to alleviate pathognomonic features of asthma after its onset. We first
determined whether local delivery of AAL-R after the onset of allergic airway inflammation interferes
with alteration of respiratory function (Figure 3.3A). Mice treated daily with saline showed a weak
increase of respiratory system resistance (Rrs) in response to MCh with a delta of 7.1 ± 1.1
cmH2O/mL/s between baseline (0.4 cmH2O/mL/s) and the 1 mg/kg dose. Mice receiving HDM
showed a dose-dependent increase of Rrs that reached 26.9 ± 4.3 cmH2O/mL/s at the highest MCh
dose. In saline-treated mice, AAL-R did not modulate Rrs in response to MCh. On the other hand,
AAL-R inhibited HDM-induced airway hyperresponsiveness by as much as 70% at doses of 0.25 and
0.5 mg/kg of MCh. The functional advantage provided by AAL-R was associated with amelioration
of histological features. For instance, AAL-R decreased median perivascular and peribronchial
accumulation of mononuclear cells (Figure 3.3B; Table I) as well as HDM-associated alteration of
the epithelium, including PAS reactivity and epithelial layer hypertrophy (Figure 3.3C, Table I).
Thus, treatment with AAL-R inhibits functional and histological alterations caused by HDM
instillation.
3.5.3 AAL-R interferes with lung accumulation of cells that drive inflammation induced by HDM
We then set out to investigate whether and by which mechanisms AAL-R affects the ongoing
inflammatory response to HDM in the lungs. The effect of AAL-R on the leukocyte profile in the
BALF was first investigated (Figure 3.4). AAL-R had no drastic effect on numbers of leukocytes in
the group receiving saline instead of HDM. The absolute number of leukocytes decreased from 5.6 ±
0.8 x 105 in vehicle-treated HDM mice to 2.6 ± 0.4 x 105 in AAL-R-treated HDM mice (Figure
3.4A). In mice receiving saline, AAL-R did not affect the proportion of different cell subsets in the
BALF (Figure 3.4B). No eosinophilia was detected in the saline groups and the percentage of
eosinophils was increased to 43 ± 12 by HDM, which was reduced to 14 ± 3 with AAL-R (Figure
58
3.4B). This resulted in an absolute decrease of eosinophil number in the BALF (Figure 3.4C). In cell
suspensions prepared from the lungs, AAL-R decreased AFneg CD11chi MHCIIhi DC numbers by
more than 50% in mice exposed to HDM (Figure 3.4D), which was accompanied by a 90% decrease
of pulmonary CD4+ T cells (Figure 3.4E) and by a 70% decrease of pulmonary CD19+ B cells (Figure
3.4F), when compared with the vehicle-treated HDM-exposed group. The decrease in lymphocyte
numbers in AAL-R-treated mice also occurs in conjunction with a decrease in lymphocyte-secreted
cytokines IL-5 and IL-13 (Figure 3.4G-H), while having no effect on CCL5, a chemokine
predominantly secreted by epithelial cells (Figure 3.4 I). These results support the efficacy of locally-
delivered AAL-R to interfere with accumulation of cells critically involved in the
immunopathological responses seen in allergic asthma.
3.5.4 AAL-R enhances apoptosis/necrosis of lymphocytes in the lung
Although a rich literature supports sphingosine analogs to induce apoptosis, whether or not this
mechanism is involved in the decrease of leukocyte numbers in the lungs remains undetermined. As
previously reported [24] apoptotic/necrotic lymphocytes were detected in the lungs under basal
conditions (Figure 3.5). The percentage of annexin V+ CD4+ T cells changed from 13.3 ± 1.3 in
vehicle-treated HDM-exposed mice to 24.6 ± 1.6 in HDM-exposed mice treated with AAL-R (Figure
3.5A). Similarly, the proportion of CD19+ B cells positive for annexin V increased by 27.9% in AAL-
R-treated mice (Figure 3.5A). Weak to null apoptosis/necrosis was induced in both CD8+ T cells and
the CD90-CD19-AF-SSCmed-hi granulocyte-enriched fraction, supporting cell type-specific
induction of cell death in the lungs. In contrast, a molar equivalent dose of the phosphorylated AAL-
R analog, AFD-R, failed to induce potent apoptosis/necrosis of CD4+ T cells and CD19+ B cells,
when compared with the vehicle-treated HDM-exposed group. Notably, AFD-R was less efficient
than AAL-R to interfere with the T cell and B cell responses in the airways (Figure 3.5B-C), when
compared with AAL-R. Accordingly, AFD-R was also less efficient than AAL-R to inhibit the
eosinophilic response (Figure 3.5D). Thus, a phosphorylatable sphingosine analog, but not its pre-
phosphorylated form, potently induces death of cell subsets that are central to allergic airway
inflammation.
59
3.5.5 Effect of intra-tracheal delivery of AAL-R on lymphocytes and DC in the draining lymph
nodes.
We next addressed the ability of AAL-R delivered into the lungs to interfere with the biology of
draining MLNs. Compared with vehicle-treated mice with experimental asthma, AAL-R mildly
reduced CD4+ T lymphocyte numbers in the MLNs (Figure 3.6A) and failed to modulate CD19+ B
cell and DC numbers in this compartment (Figure 3.6B-C). This is in agreement with the lack of
effect on the frequency of proliferative Ki67+ CD4+ T cells (Figure 3.6D). AAL-R also failed to
modulate the percentage of annexin V+ CD4+ cells and annexin V+ CD19+ cells in MLNs (Figure
3.6E-F). In contrast, AFD-R increased the numbers of CD4+ T cells in MLNs by 85 %; albeit equally
ineffective as AAL-R to alter DC numbers. Thus, on one hand, it appears that AAL-R acts directly in
the lungs without affecting leukocyte numbers in the draining lymph nodes. On the other hand, the
pre-phosphorylated form (AFD-R) seems to preferentially attenuate cell numbers in the lungs by
sequestering lymphocytes in the draining lymph nodes.
3.6 Discussion
Sphingosine analogs are new therapeutic molecules with potent immunomodulatory properties. Yet,
their potential in the treatment of asthma is misunderstood. The main finding of this study is the
efficacy of a phosphorylatable sphingosine analog to interfere with asthma in a murine model after
the onset of allergic inflammation induced by a natural allergen. We also reveal that lymphocyte and
DC numbers in draining lymph nodes are not modulated by AAL-R, as it was previously observed in
the OVA-Alum model of asthma [14]. Conversely, AAL-R attenuates the accumulation of
eosinophils, DC, CD4+ T cells and CD19+ B cells in the lungs. This was associated with significant
decreases of IL-5 and IL-13 levels in the BALF. We also identify the induction of T cell apoptosis as
a significant mechanism contributing to the alleviation of allergic airway inflammation by AAL-R;
and this phenomenon was not observed using the pre-phosphorylated cell impermeant form of the
drug.
60
Previous studies have addressed the roles of S1P pathway modifiers in the phase of intra peritoneal
sensitization with OVA-Alum [25]. In addition, administration of S1P pathway modifiers prior to, or
concomitantly with, repetitive OVA challenges in peripherally sensitized animals was shown to be
effective in preventing cardinal features of experimental asthma [14]. However, it was heretofore
unknown whether the drugs were able to attenuate key features of established allergic airway
inflammation. The findings of the present study represent the first evidence that a phosphorylatable
sphingosine analog can alleviate experimental asthma after the onset of allergic airway inflammation.
It is becoming clear that the airway mucosa can be a critical site for amplification and maintenance
of allergic disease [26]. Consequently, models using natural allergens that cause signs of experimental
asthma when delivered through natural routes are currently preferred to assess the preclinical potential
of experimental treatments [27]. In the model used herein, airway delivery of HDM was sufficient to
trigger functional impairment of the airways, accumulation of T cells, B cells and eosinophils.
Remarkably, all of which were inhibited by AAL-R. In accordance with our current finding, FTY720
dampens eosinophil accumulation within the mucosa in a model of ongoing allergic rhinitis [28].
Unfortunately, the number of DC in draining lymphoid tissues was not assessed in that latter study
[28]. In our study, both local DC and T cells were severely altered by local treatment with AAL-R,
which is a major interest owing to the predominant role played by these cell subsets in pulmonary
inflammation. This alteration of the local T cell response was also associated with a strong decrease
of IL-5 and IL-13 levels in the airways. Of potential importance is the fact that these interleukins can
by themselves increase the contractile capacity of airway smooth muscle [29]. It is thus likely that
AAL-R interfered with airway hyperresponsiveness, at least in part, by reducing the levels of soluble
factors that potentiate the contractile capacity of airway smooth muscle. On note, airway smooth
muscle enlargement is not observed in this acute model; so impairment of this feature may not be
related to the beneficial effect of AAL-R on airway hyperresponsiveness. The location of T cells has
also recently emerged as a critical mechanism influencing the contractile capacity of airway smooth
muscle. Indeed, T cells in the vicinity of airway muscle cells modify their contractile capacity [30,
31]. It is tempting to speculate that the profound reduction of T cell numbers by AAL-R might have
contributed to alleviate hyperresponsiveness by reducing the number of T cells located proximally to
the contractile apparatus of the airways.
The current work also highlights that the immunomodulatory mechanisms of sphingosine analogs
after the onset of allergic inflammation likely differ from the ones observed in the context of a
prophylactic treatment. When administered prophylactically, i.e. prior to airway OVA challenge,
61
sphingosine analogs strongly inhibit antigen presentation in draining lymph nodes, which is
responsible for the alleviation of experimental allergic airway disease [13, 14]. In agreement with
these results, airway delivery of a single dose of AAL-R soon after influenza virus infection inhibits
both DC accumulation in draining lymph nodes and the ensuing immunopathological responses in
the airways [9, 32]. Conversely, our results show that AAL-R strongly inhibits DC accumulation in
the lungs while having mild effects on DC numbers in MLNs over the course of a 4-day treatment.
These results are in line with the ability of sphingosine analogs to interfere with de novo DC
recruitment from blood to tissues [33], and to blunt the release of chemotactic factors in the lung [9,
13]. While we cannot fully exclude the possibility that antigen presentation was modulated, our results
rather suggest that once DCs have migrated to the lymph node, sphingosine analogs are relatively
impotent at interfering with the chain of events leading to the antigen-triggered amplification of
lymphocytes.
Although several studies used local delivery of sphingosine analogs [9, 13, 14, 21, 34, 35], and
sphingosine analogs are well known inducers of cell death [11], this is the first evidence supporting
the idea that cell death could contribute to alleviate allergic airway disease. Indeed, aminoalcohols
like AAL-R readily penetrate the plasma membrane and become phosphorylated intracellularly to
interfere with cell survival [11]. Accordingly, we show that AAL-R, but not AFD-R, potently induces
lymphocyte apoptosis/necrosis in the lung. This is consistent with AAL-R’s rapid phosphorylation,
low turnover, and potent induction of apoptosis in murine splenocytes through intracellular
accumulation of AFD-R [7]. Interestingly, AAL-R-induced apoptosis/necrosis appears to affect
CD4+ T cells and B cells, which are crucially involved in allergic airway disease, while having no
effect on CD8+ T cells, DCs and the CD90-CD19-AF-SSCmed-hi granulocyte-enriched fraction.
These results certainly argue against a non-specific toxic effect. Of note, FTY720 was associated with
preferential apoptosis of activated T cells in another model [36], while not potently affecting DC
apoptosis in vitro [37] and myeloid leukocyte apoptosis in vivo [38]. In a preclinical perspective,
drugs that are customarily used to treat asthma can induce apoptosis in cells from the airways,
supporting the viability of this drug-related mechanism of action in humans [39, 40].
Lymphopenia has long been associated with the immunomodulatory effects of sphingosine analogs.
Yet, a number of facts challenge the idea that systemic lymphopenia per se is central to
immunomodulation. Indeed, local treatments with sphingosine analogs induce more potent
immunosuppression than systemic delivery [9]. In addition, naïve T cells are more sensitive to
sphingosine analogs-induced lymphopenia than activated T cells [41]. Our results reveal that distinct
mechanisms of action could be associated with the non-phosphorylated and the phosphorylated forms
62
of the compounds. Specifically, our results demonstrated that AAL-R induces a more severe local T
cell inhibition than AFD-R, which correlates with the ability of this AAL-R to induce local death of
lymphocytes. The idea that lymphopenia-independent mechanisms could explain, at least in part, the
local immunosuppression induced by sphingosine analogs is also supported by the observation that
prophylactic treatment with the non-phosphorylatable AAL-S enantiomer, yet at a somewhat superior
dosage than in the current study, inhibits cytokine release as well as T cell and DC accumulation in
the airways in a model of experimental asthma [6]. This effect was associated with activation of
protein phosphatase 2A, but it remains unknown if such mechanism is viable when the treatment is
administered in a non-prophylactic fashion.
3.7 Conclusion and declarations
We conclude that a phosphorylatable sphingosine analog can interfere with allergic airway
inflammation caused by a natural allergen, resulting in improved respiratory function. The
mechanism of action appears to differ from that previously observed in a prophylactic context. Our
results also support that the phosphorylation status of the drug can influence the mechanisms by which
the immune response is modulated, with enhancement of T cell apoptosis being restricted to the non-
phosphorylated form.
63
3.7.1 Competing interests
The authors declare that they have no competing interests. Claudine Tremblay is employed by Charles
River Laboratories. None of the work was supported by Charles River Laboratories.
3.7.2 Author contribution
Conception and design: DM, NF, ASD, MRB, ElB; Acquisition of data : DG, LL, AML, AL, EmB ;
Analysis and interpretation of data: DG, LL, AML, CT, ASD, YB, DM; Drafting the manuscript for
important intellectual content: DM, AML ; substantial involvement in its revision DG, LL, ElB, AL,
EmB, NF, MRB, ASD, YB, CT.
3.7.3 Acknowledgements
We thank Serge Simard for statistical analyses, Marc Veillette and Marie-Josée Beaulieu for their
help and expertise. We thank Hugh Rosen for providing AAL-R and Daniel Guay for technical
support with synthesis of sphingosine analogs.
Supported by CIHR grant # 274357 and funding from the Respiratory Health Network of the FRQS.
DG receives a scholarship from the Training program in respiratory health of Quebec – IRSC. DM,
MRB, NF, EB are members of the FRQS Respiratory Health Network and DM, NF, MRB are FRQS
Junior 1 Scholars.
64
3.8 References
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67
3.9 Figures
Figure 3.1: The onset of allergic inflammation is established at day 7
Mice received HDM (□) or saline (SAL) (◊) i.n. once-daily for 0, 3, 6 or 10 days and were then
euthanized 24 h after the last exposure. BALF were performed and differential cell counts were
determined for A) lymphocytes, B) neutrophils, and C) eosinophils. D) Serum HDM-specific IgG1
titers were also quantified. n = 4 per group and * indicates significant differences in corresponding
days between SAL- and HDM-exposed mice. P <0.05 N.D.: not detected
68
Figure 3.2: Experimental design
Mice were instilled i.n. with HDM or saline (SAL) from day 1 to 10, along which time they were also
treated i.t. with vehicle (dH2O) or dH2O containing 2.5 µg of AAL-R from day 7 to day 10, one hour
before HDM administration. In a subset of experiments, 3.5 µg of AFD-R (molar equivalent of AAL-
R) were used instead of AAL-R. 24 h after the last exposure, mice were either euthanized for the
collection of BALF and tissue sampling or tested to assess their degree of airway responsiveness to
MCh.
69
70
Figure 3.3: AAL-R interferes with hallmarks of asthma induced by HDM
Figure 3.3: AAL-R interferes with hallmarks of asthma induced by HDM. A) The degree of airway
responsiveness was assessed by monitoring the change of respiratory system resistance (Rrs) during
doubling doses of MCh. Paraffin-embedded tissue sections of lung stained with either H&E to assess
B) inflammatory infiltrates in the peribronchial/perivascular regions or C) PAS to label mucus-
producing cells. n = 4-5 mice per group and * indicates significant differences P <0.05. bar = 150 µm
71
Figure 3.4: AAL-R inhibits allergic airway inflammation
BALF was assessed to determine: A) the total number of cells; B) the differential count of cells; and
C) the total number of eosinophils. Inflammation was also assessed in single-cell suspensions derived
from digested lungs to determine: D) The total number of AFneg MHC-IIhi CD11chi DC; E) the
number of lung AFneg SSClow CD90.2+ CD8neg CD4+ T cells; and F) the number of lung AFneg
SSClow CD90.2neg CD19+ B cells. Levels of G) IL-5, H) IL-13, and I) CCL5 were also quantified
in BALF. Shown is representative of two independent experiments . n = 4-5 per group and * signifies
significant differences at P <0.05 (# P ≤ 0.07).
72
Figure 3.5: AAL-R increases lymphocyte apoptosis/necrosis in the lungs
Single-cell suspensions obtained from the lungs to determine: A) the frequency of apoptotic/necrotic
annexin V+ cells in two subpopulations of cells, namely AFneg SSClow CD90.2+ CD8neg CD4+ T
cells (upper panels) and AFneg SSClow CD90.2neg CD19+ B cells (lower panels); B) the number
of CD4+ T cells; and C) the number of CD19+ B cells in the lung. Total number of eosinophils was
also determined in the BALF (D). Shown is representative of two independent experiments. n = 6-8
mice per group and * indicates significant differences versus VEH; § indicates significant differences
versus AAL-R. P <0.05
73
Figure 3.6: Effects of non- or pre-phosphorylated analogs in draining lymph nodes
Single-cell suspensions derived from MLNs were obtained to determine: A) the total number of
AFneg SSClow CD90.2+ CD8neg CD4+ T cells; B) the total number of AFneg SSClow CD90.2neg
CD19+ B cells; C) the total number of MHC-IIhi CD11chi DC; D) the frequency of Ki67+ CD4+ T
cells; E) the frequency of apoptotic/necrotic CD4+ T cells; and F) the frequency of apoptotic/necrotic
CD19+ B cells. Apoptosis and proliferation could not be evaluated in saline mice given the paucity
of cells. n = 6-8 mice per group and * signifies significant differences P <0.05. For panels A to C,
means of all experimental groups are statistically different from SAL. Shown is representative of two
independent experiments.
74
3.10 Tableaux
Table 3.1: Histopathological alterations of mice lungs exposed to HDM
Saline HDM
Treatments: VEH AAL-R VEH AAL-R
Perivascular infiltration of mononuclear cells 0 0 2* 1†
Peribronchial/bronchiolar infiltration of mononuclear cells 0 0 2* 1†
Perivascular infiltration of granulocytes 0 0 2* 1
Hypertrophy/hyperplasia of the bronchial epithelium 0 0 3* 1†
Results are expressed as median scores for each group, graded on a scale from 0 (no alteration) to 5
(severe alterations). 4-5 mice per group were analyzed. * : P < 0.001 between HDM and Saline; † :
P< 0.01 between AAL-R and vehicle
75
4. Chapitre IV: A phosphorylatable sphingosine analog
induces airway smooth muscle cytostasis and reverses
airway hyperresponsiveness in experimental asthma
4.1 Résumé
L’épaississement du muscle lisse bronchique corrèle fortement avec la sévérité des symptômes de
l’asthme. Cependant, les traitements pharmacologiques actuels sont inefficaces pour le réduire. Bien
que les analogues de la sphingosine soient principalement connus pour leurs effets
immunomodulateurs, ils possèdent aussi des effets associés à l’atrophie tissulaire. Les mécanismes
d’action des analogues de la sphingosine varient selon leur statut de phosphorylation. Un modèle
d’asthme chronique a été induit chez des souris BALB/c par l’antigène naturel D.pteronyssius. Les
effets sur l’hyperréactivité bronchique et l’épaississement du muscle lisse bronchique de l’analogue
phosphorylable AAL-R et de l’analogue non phosphorylable AAL-S ont été testés en absence
d’inflammation aiguë. AAL-R, mais pas AAL-S, diminue l’hyperréactivité bronchique et
l’épaississement du muscle lisse bronchique. In vitro, uniquement AAL-R inhibe la prolifération des
cellules musculaires lisses bronchiques humaines. Cet effet semble indépendant de l’activation des
récepteurs de la S1P et implique plutôt l’accumulation intracellulaire de la forme phosphorylée
d’AALR.
76
4.2 Abstract
In asthma, excessive bronchial narrowing associated with thickening of the airway smooth muscle
causes respiratory distress. Numerous pharmacological agents prevent experimental airway
hyperresponsiveness when delivered prophylactically. However, most fail to resolve this feature after
disease is instated. Although sphingosine analogs are primarily perceived as immune modulators with
the ability to prevent experimental asthma, they also influence processes associated with tissue
atrophy, supporting the hypothesis that they could interfere with mechanisms sustaining pre-
established airway hyperresponsiveness. We thus assessed the ability of a sphingosine analog (AAL-
R) to reverse airway hyperresponsiveness in a chronic model of asthma. We dissected the
pharmacological mechanism of this class of agents using the non-phosphorylatable chiral isomer
AAL-S and the pre-phosphorylated form of AAL-R (AFD-R) in vivo and in human airway smooth
muscle cells. We found that a therapeutic course of AAL-R reversed experimental airway
hyperresponsiveness in the methacholine challenge test, which was not replicated by dexamethasone
or the non-phosphorylatable isomer AAL-S. AAL-R efficiently interfered with airway smooth muscle
cell proliferation in vitro, supporting the concept that immunomodulation is not necessary to interfere
with cellular mechanisms sustaining airway hyperresponsiveness. Moreover, the sphingosine-1-
phosphate lyase inhibitor SM4 and the sphingosine-1-phosphate receptor antagonist VPC23019 failed
to inhibit proliferation, indicating that intracellular accumulation of sphingosine-1-phosphate or
interference with cell surface S1P1/S1P3 activation, are not sufficient to induce cytostasis. Potent
AAL-R-induced cytostasis specifically related to its ability to induce intracellular AFD-R
accumulation. Thus, a sphingosine analog that possesses the ability to be phosphorylated in situ
interferes with cellular mechanisms that beget airway hyperresponsiveness.
77
4.3 Introduction
Asthma is a prevalent and complex syndrome [1]. Alarmingly, a significant proportion of asthmatic
patients responds poorly to mainstay therapies, some achieving symptom control only with oral
prednisone; and others remaining refractory to any pharmacological option currently available [2].
There is thus a dire need for new therapeutic options in asthma.
One of the distinctive features of asthma is airway hyperresponsiveness (AHR). Among the multiple
factors that interact to elicit AHR, the increased amount of smooth muscle within the airway wall is
thought to contribute significantly. This paradigm is fuelled by several observations. First, the amount
of airway smooth muscle (ASM) is positively correlated with the severity of asthma [3]. Second, the
capacity to generate stress (force per cross-sectional area) is identical between asthmatic and non-
asthmatic ASM tissues [4], implying that the amount rather that the stress-generating capacity of
ASM is involved in AHR. Third, airway narrowing measured directly ex vivo is determined by the
amount of ASM [5]. Strategies that aim at reducing the amount of ASM should benefit asthmatic
patients by reducing their level of airway responsiveness. In this regard, bronchial thermoplasty, an
interventional procedure proven to reduce ASM volume [6], decreases by nearly 50% the rate of
exacerbations in patients with moderate to severe persistent asthma [7]. However, there is currently
no pharmacological treatment that efficiently reverses ASM thickening.
Classically, sphingosine analogs like FTY720 and AAL-R were recognized as sphingosine-1-
phosphate (S1P) receptor modulators on the basis of their propensity to be phosphorylated in vivo by
sphingosine kinase 2 (SphK2), and to induce S1P receptor-mediated events including lymphopenia
and bradycardia [8, 9]. Yet, an emerging body of evidence now supports the concept that sphingosine
analogs may counteract mechanisms that sustain or promote ASM thickening. For instance the non-
phosphorylatable sphingosine analog AAL-S reverses the inhibition of protein phosphatase 2A
(PP2A) (Figure 4.1) [10, 11] that occurs in allergic airways, which could potentially interfere with
proliferative cascades associated with ASM cell expansion. Other evidence suggests that high doses
of the sphingosine analog FTY720 influence the levels of ceramides [12], which are potent inducers
of apoptosis and modulators of chronic inflammation. In addition, intracellular S1P can cause
autophagy [13] and inhibit proliferation [14], which in turn, could counteract ASM thickening [15].
Importantly, in vitro data show that sphingosine analogs can counteract cell amplification and/or
survival via SphK2-dependent intracellular accumulation of phosphorylated sphingoid bases [16, 17].
In agreement with this growing body of evidence, we tested the concept that this class of agents could
reverse ASM thickening. We show that the sphingosine analog AAL-R efficiently reverses AHR and
the underlying thickening of ASM. We unravel the potential for this class of agents to act directly on
78
ASM cells and to induce cytostasis by a mechanism featuring intracellular conversion of AAL-R to
its phosphorylated form.
4.4 Methods
4.4.1. Murine model and experimental treatments
Pathogen-free BALB/c female mice (8 weeks old, Charles River, Saint-Constant, CAN) randomly
assigned to experimental groups were anesthetized with isoflurane and instilled intranasally with 50
µl of saline or with saline containing 50 µg of house dust mite (HDM) extract (D. pteronyssinus;
Greer, Lenoir, NC), 3 times a week, for 5 weeks. Mice were then left untouched during week 6 (Figure
4.2). Sphingosine analogs (AAL-S or AAL-R; see [18]) or dexamethasone (Sigma Aldrich, Oakville,
CAN) were injected i.p. at a dose of 1 mg/kg once daily from day 7 to day 14 following the last HDM
instillation, and compared with a group receiving an equal volume of the vehicle. Twenty-four hours
following the last injection, mice were anesthetized with ketamine-xylazine and loss of toe-pinch
reflex was verified. Mice were then tracheotomised and connected to the flexiVent apparatus
(SCIREQ, Montreal, CAN) to measure the level of airway responsiveness to methacholine (OMEGA,
Montreal, CAN) as described previously [19]. To avoid artifacts due to spontaneous respiratory
muscle contractions, mice were paralyzed with pancuronium (Sandoz, Boucherville, CAN). Heart
rate was monitored until euthanasia in order to ensure proper anesthesia. Bronchoalveolar lavage fluid
was harvested as described [18] and tissues were then fixed in phosphate buffered saline containing
4% paraformaldehyde for histological analyses. Experiments, housing and care procedures were
approved by the Committee of Animal Care of Université Laval in accordance with the guidelines of
the Canadian Council on Animal Care (protocol 2013037).
4.4.2. Histological analyses
Five micrometers-thick paraffin-embedded transverse lung slices were stained with Masson’s
trichrome for quantification of ASM thickness. Using NDP View (Hamamatsu Photonics,
Hamamatsu city, JP), the length of the basal membrane and the area of ASM for individual circular
bronchi was measured. ASM thickness was defined as area of ASM divided by the length of the basal
membrane. Two to five bronchi were measured blindly per lung and the average size of bronchi did
not differ between groups.
79
4.4.3. Cell Culture
Human primary ASM cells (CC-2576; Lonza, Walkersville, MD) were plated at a density of 104 cells
per cm2 in Dulbecco’s Modified Eagle Medium containing 10% fetal bovine serum (complete
medium) for 24 h, and then incubated with sphingosine analogs, the S1P lyase inhibitor (SM4; [20])
or the dual S1P receptor (S1P1-3) antagonist (VPC23019; Tocris, Burlington, CAN) for 24 to 72 h.
Cells were either incubated with tetrazolium dye (MTT assay; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide; Sigma Aldrich, Oakville, CAN) to determine the viable cell numbers;
or incubated with bromodeoxyuridine (BrdU; 5-Bromo-2'-deoxyuridine; Roche, Laval, CAN)
overnight to assess proliferation. Flow cytometric analyses were performed as described [18].
4.4.4. Quantification of sphingolipids.
Cell pellets were spiked with internal standards (C17-sphingosine Cayman Chemical, Ann Arbor,
MI; C17-S1P, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) and lipids were extracted using a published method
[21]. Liquid chromatography tandem-mass spectrometry was performed at PhenoSwitch Bioscience
Inc (Sherbrooke, CAN). Liquid chromatography gradient was performed using 0.2% v/v formic acid
in water and with 0.2% v/v formic acid with 10 mM ammonium formate in methanol on a reversed
phase Halo PFP column (Advance Materials Technology, Wilmington, DE), which was maintained
at 50°C. Acquisition was performed with an ABSciex TripleTOF 5600 (Sciex, Foster City, CA)
equipped with an electrospray interface. Quantification was done using the area under the curve with
the MuliQuant software (Sciex). See supplementary material for details.
4.4.5. Statistics
Data were expressed using mean ± SEM. Homogeneity of variance and normality of the data were
verified. When appropriate, variables were log-transformed. Rank transformation and the ordinary F
test from ANOVA were used when appropriate. Data from mice were analyzed using ANOVAs or
two-way ANOVAs with an interaction effect. When heteroscedasticity was significant, the statistical
analyses were performed using separate residual variance per group. The Satterthwaite’s degree of
freedom statement was added for unequal variance structure. Posteriori comparisons were performed
using Tukey’s comparison. When appropriate, bi-directional unpaired t-test was employed. The
results were considered significant with p-values 0.05. Data were analyzed in collaboration with a
professional biostatistician at the IUCPQ biostatistics core service using the statistical package
program SAS v9.4 (RRID:SCR_008567; SAS Institute Inc., Cary, NC).
80
4.5 Results
4.5.1. AAL-R reverses airway hyperresponsiveness and airway smooth muscle thickening.
Using a model where persistent ASM thickening and AHR are pre-established using chronic exposure
to HDM (Figure 4.2), we first evaluated the in vivo potential of AAL-R to reverse AHR, when
administered at well-tolerated doses, yet sufficient to induce biological effects. We found that AAL-
R (1 mg/kg/day) reversed HDM-induced AHR to a level 70 % lower than the vehicle treatment
(Figure 4.3). Contrary to AAL-R, corticosteroid intervention (dexamethasone; 1 mg/kg/day) failed to
reverse AHR, furthering the concept of usefulness for sphingosine analogs in the context of asthma.
On that note, we previously showed that AAL-R efficiently interfered with the inflammatory cascade
in response to HDM soon after its instatement in the airways [18]. In face of differing immune
mechanisms occurring in the remodeled airways [22, 23], and since alleviation of eosinophilic
inflammation can interfere with pathogenic mechanisms of asthma, we also confirmed that AAL-R
blunted the antigen rechallenge-induced lymphocyte accumulation in the bronchoalveolar lavage
fluid, which was accompanied by a profound 54% decrease of eosinophil numbers (Supplementary
Figure 4.1).
Since ASM thickening is central to the development of AHR, we performed a new series of
experiments where lungs of mice receiving either AAL-R or vehicle after chronic HDM exposure
were stained with Masson’s trichrome, in order to visualize the ASM layer located between the
epithelium and the parenchyma (Figure 4.4A). Mice receiving saline and vehicle were used as
baseline controls. Planimetry on transverse lung slices revealed an average bronchial smooth muscle
thickness of 4.1 ± 0.6 µm in the group receiving saline and vehicle. In the group receiving HDM and
vehicle, ASM thickness was increased to 5.6 ± 0.5 µm. This 36% increase in ASM thickness (Figure
4.4B) was reduced to a near-baseline level of 4.3 ± 0.3 µm by AAL-R. In agreement with reduced
ASM thickness, AAL-R again robustly reversed AHR caused by chronic exposure to HDM. Thus,
these three series of experiments revealed that AAL-R retains its ability to inhibit TH2 inflammation
in the remodeled airways and efficiently reverses ASM thickening as well as the ensuing AHR.
4.5.2. AAL-R favours an anti-proliferative balance in ASM cells.
Because AAL-R reverses AHR when administered at a phase where acute inflammation is resolved,
we next addressed the idea that AAL-R could act directly on ASM cells to impair underlying features
of ASM thickening. We show that AAL-R, but not its pre-phosphorylated / cell impermeant form
(AFD-R), nor its non-phosphorylatable isomer (AAL-S), efficiently interfered with the proliferation
81
of ASM. For instance, AAL-R induced a 26% inhibition of bromodeoxyuridine incorporation at 1µM
(Figure 4.5A), when compared to the vehicle. We then set out to determine whether apoptosis also
contributed to the inhibition of ASM accumulation under mitogenic conditions. We found that, at
concentrations of 1 µM or lower, AAL-R mildly modulated apoptosis in vitro (Figure 4.5B), while
being a potent cell death inducer at 10 µM with nearly 100% dead cells. On the other hand, AFD-R
failed to induce apoptosis, even at the concentration of 10 µM (Figure 4.5B), and AAL-S only induced
partial apoptosis at 10 µM. Our results thus unravel a clear potential for AAL-R to interfere with
mechanisms that sustain ASM cell proliferation.
4.5.3. Modulation of S1P levels does not resolve the potent anti-proliferative effect of AAL-R.
Given the putative impact of sphingosine analogs on the balance of sphingolipidic species, we tested
the concept that intracellular S1P levels could explain the differential potency of sphingosine analogs
in inducing ASM cytostasis. We first characterized which S1P pathway proteins were expressed in
ASM cells (Supplementary Figure 4.2). We detected the expression of S1PR1 to S1PR3, both
sphingosine kinases and S1P lyase. In agreement with previously-documented sphingosine and S1P
levels in biological tissues, we found approximately 10 times more sphingosine than S1P in our ASM
cultures (Figure 4.6). AAL-R increased absolute levels of intracellular S1P (2.0 ± 0.13 picomoles)
when compared to the vehicle (0.5 ± 0.05 picomoles), to AAL-S (0.6 ± 0.06 picomoles), and to AFD-
R (0.9 ± 0.05 picomoles). This resulted in a significant two-fold increase in the S1P/sphingosine
balance, when compared to the vehicle treatment (Figure 4.6A).
To resolve whether or not increase of intracellular S1P was sufficient to induce cytostatis, cells were
incubated with an inhibitor of S1P lyase [20] (Figure 4.6). The S1P lyase inhibitor SM4 potently
increased intracellular S1P level (2.8 ± 0.08 picomoles), which resulted in a 33% increase of the
S1P/sphingosine ratio compared to the AAL-R-treated cells (Figure 4.6A). This occurred in the
absence of an effect on the C16-ceramide content (Figure 4.6B). Also, we found no evidence that
AAL-R, AAL-S or AFD-R (at the concentration of 1 µM) impacted on cellular levels of C16-
ceramides, arguing against a major role for a shift in the sphingolipid rheostat to justify AAL-R-
induced cytostasis. In spite of potent enhancement of intracellular S1P content, SM4 failed to inhibit
ASM cell proliferation (Figure 4.6A,C), revoking the sufficiency for increased intracellular S1P
content to induce ASM cell cytostasis.
Since intracellular accumulation of S1P might reduce extracellular S1P levels and the subsequent
impairment of S1P1- and S1P3-proliferative effects, ASM cells were incubated with the dual S1P1/3
antagonist (VPC23019; Figure 4.7). Similar to AFD-R and AAL-S, dual inhibition of S1P1 and S1P3
82
failed to significantly affect the accumulation of proliferating ASM cells in vitro, when compared to
the vehicle.
4.5.4. AAL- R incubation leads to massive accumulation of intracellular AFD-R in ASM cells
Since ASM cells express SphK2 (Supplementary Figure 4.2) and because SphK2 activity is required
for efficient phosphorylation of AAL-R to AFD-R, we then addressed the hypothesis that AAL-
induced ASM cell cytostasis could be explained by intracellular accumulation of AFD-R. Our results
show that ASM cells uptake AAL-R and AAL-S preferentially to AFD-R (Figure 4.8). This is
demonstrated by the retrieval of relatively high amounts of AAL species in cells incubated with AAL-
S (263 ± 17 picomoles) and AAL-R (126 ± 15 picomoles), compared to an equimolar concentration
of AFD-R (32 ± 4 picomoles) (Figure 4.8A). Most importantly, in ASM cells, the intracellular balance
between the non-phosphorylated and the phosphorylated form of AAL-R favored the accumulation
of AFD-R by up to two-fold (Figure 4.8A-B). Of note, this AFD-R accumulation (263 ± 16
picomoles) represents more than 100 times the cellular amount of S1P under the same experimental
conditions. Thus, ASM cells express SphK2 and display a massive intracellular accumulation of
AFD-R upon incubation with AAL-R.
4.5.5. AAL-R but not AAL-S efficiently reverses AHR
On the basis that efficient cytostasis of ASM cells relies on in situ phosphorylation of the sphingosine
analog, we ruled out the ability of the non-phosphorylatable sphingosine analog AAL-S to reverse
AHR in our in vivo model. Figure 4.9 depicts normoresponsiveness to graded methacholine doses in
mice receiving saline and vehicle. In this group, peak resistance was recorded at 2.89 ± 0.27
cmH2O/ml/s in response to an aerosolized dose of 30 mg/ml of methacholine. AHR was present in
the group receiving HDM and vehicle, with a 3-fold increase of respiratory system resistance at 30
mg/ml of methacholine, when compared to mice receiving saline and vehicle. AAL-R again inhibited
by more than 70% the HDM-induced AHR at the methacholine dose of 30 mg/ml. In stark contrast,
the non-phosphorylatable AAL-S enantiomer failed to alleviate AHR in HDM-exposed mice. Of note,
neither AAL-R nor AAL-S affected airway responsiveness to methacholine in mice without
experimental asthma (Supplementary Figure 4.3A), indicating that a one week-long exposure to either
of these two sphingosine analogs does not influence ASM contractility per se. In agreement with the
absence of AAL species-induced alterations of lung histology (Supplementary Figure 4.3B), these
83
results confirm the lack of deleterious effects of these compounds on pulmonary functions over a
short period of time.
4.6 Discussion
This is the first evidence supporting sphingosine analogs as proficient molecules to reverse ASM
thickening after its instatement, leading to a nearly full functional recovery of AHR in the
methacholine challenge test. We also deciphered that immunomodulation is not required for AAL-R
to induce a catabolic response in ASM cells, as this effect occurs in vitro and in absence of acute
inflammation in vivo. Still, we also confirmed that the short term AAL-R treatment remained efficient
at inhibiting inflammation in the remodeled airways in response to repeated antigen challenges, and
failed to induce aversive functional alterations in the lung. We further confirmed that mechanisms of
action of this class of agents vary according to their biochemical properties. More specifically, we
defined that the efficacy of sphingosine analogs to reverse ASM thickening relied on the propensity
to be phosphorylated in situ and with the ability to increase intracellular AFD-R levels in ASM cells.
We previously showed that a phosphorylatable sphingosine analog could alleviate hyperreactivity in
an acute model of asthma where inflammation, but not remodeling, was pre-established [18]. The
beneficial effect, similar to what is observed when sphingosine analogs are provided prophylactically,
likely resulted from the interference with inflammation-associated release of pro-
remodeling/spasmogenic factors [10, 24-26]. Yet in asthma, remodeling is already present and its
reversal remains a preclinical challenge as supported by the work of Johnson et al. [27] showing that
3 interventions (corticosteroid, beta-2 agonist, and antigen weaning) are required to reverse AHR in
a chronic HDM-induced asthma model. These findings are in line with the inability of a high
dexamethasone dose (1 mg/kg) to reverse AHR in spite of a significant alleviation of inflammation
[22]. In agreement with the loss of efficacy of prophylactic treatments once remodeling is established
[22, 28], mechanisms that sustain ASM thickening are likely to differ from the ones that initiate its
process.
In this regard, ASM cells found in a proliferative environment become resistant to corticosteroid-
mediated cytostasis [29, 30]. In contradistinction, we show a robust anti-proliferative effect of AAL-
R occurring at a concentration one order of magnitude lower than its pro-apoptotic/cytotoxic effects.
On these bases, it becomes tempting to speculate that the preferential efficacy of AAL-R to inhibit
AHR, when compared with dexamethasone, relates to its potency to induce cytostatic/catabolic
effects in proliferating ASM cells. This theory also agrees with our observation that the AAL isomer
84
that is not a potent cytostatic agent in vitro under mitogenic conditions (AAL-S) fails to reverse AHR
in vivo, despite its documented anti-inflammatory effects [10, 11]. Yet, the presumed absence of effect
of AAL-S on ASM thickening in our model remains to be confirmed.
According to the pulmonary tropism of this class of compounds [31], concentrations of AAL-R likely
to induce cytostasis are attainable in the lung [32], supporting a local effect of the sphingosine analog
on ASM cells, even when delivered systemically. One limitation of this study is that we were not able
to obtain in vivo data on the impact of AAL-R on ASM cell proliferation or apoptosis per se. While
ASM cell proliferation or apoptosis can be successfully assessed in larger mammals [33-35], their
assessment remain a challenge in mice due to the small size of the airways, low nuclei count per
bronchi, and rapid elimination of apoptotic cells by phagocytes in vivo [36]. For these reasons, we
can only conclude that the potency of AAL-R to reverse AHR is linked with its propensity to reverse
ASM thickening in vivo and to induce ASM cytostasis in vitro.
Current literature suggests that likely mechanisms underlying the atrophic effects of sphingosine
analogs include activation of protein phosphatase 2A [10, 37], interference with sphingosine kinase
expression/activity [38], alteration of S1P receptor-driven pro-survival mechanisms [39] and anti-
proliferative/pro-apoptotic effects of intracellular aminophosphate accumulation [14, 16, 40]. Our
results support the last possibility. Indeed, our results revoke the involvement of PP2A reactivation
in AAL-R-induced cytostasis since potent reduction of ASM cell accumulation in vitro was not
reproduced by the non-phosphorylatable enantiomer AAL-S, a molecule shown to favor PP2A
activation in the context of asthma [10]. Yet, the possibility exists that AAL-S could inhibit
inflammation, when present, in the remodeled airways and by doing so, alleviate AHR. This remains
to be investigated. In regards to inhibition of sphingosine kinases, both AAL-R and AAL-S can
interfere with sphingosine kinase activity [16]. Yet, only AAL-R efficiently inhibited ASM
proliferation in vitro (Figure 4.5).
We observed increased intracellular S1P in cells treated with AAL-R. This intracellular S1P likely
resulted from interference with S1P lyase activity and/or inhibition of S1P export [41, 42]. In T cells,
inhibition of proliferation was associated with intracellular S1P acting through activation of nuclear
S1P1 [14]. Alternatively, inhibition of S1P efflux is also likely to interfere with a positive auto-
feedback loop involving S1P receptors [43], and might even contribute to counteract pro-remodeling
events occurring in response to S1P [39]. Still, the fact that neither the S1P lyase inhibitor SM4, nor
the S1P receptor antagonist VPC23019 modulated proliferation of ASM cells argues against these
possibilities to explain AAL-R-induced cytostasis. Further studies will be required to examine the
intracellular pathways modulated by the different sphingosine analogs. This type of study may
provide important insights as to why only AAL-R exerts a cytostatic effect.
85
It remains possible that differential subcellular localization of accumulating S1P between the current
study and previous studies [14, 40, 44] might explain the absence of effect of S1P lyase
pharmacological inhibition on proliferation. Still, quantification of phosphorylated sphingoid bases
in ASM cells show that the intracellular increase of S1P is marginal compared to that of AFD-R in
AAL-R-treated cells, with a difference of at least two orders of magnitude in favor of AFD-R.
Moreover, the AAL-R-induced increase of intracellular S1P appears to be much lower here than in
models where it induces cytotoxic effects [44]. Indeed, we found only a 3-fold increase, while Hagen
et al [44] showed that S1P lyase genetic knock down caused a more than 100-fold change of
intracellular S1P. For these reasons it is more likely that massive accumulation of AFD-R, rather than
mild accumulation of S1P, led to ASM cell cytostasis.
The fact that SphK2-metabolized sphingoid bases preferentially interfere with cell accumulation also
supports the concept that, as described in Jurkat T cells [16], intracellular accumulation of AFD-R is
the cause of ASM cell cystostasis. For instance, AAL-R is mainly phosphorylated by SphK2 and
intracellular AFD-R accumulation is much faster than the accumulation of other sphingosine analogs
(like FTY720). Importantly, this faster conversion relates to the preferential ability of AAL-R to
interfere with Jurkat T cell accumulation in vitro, when compared with FTY720 [17]. In agreement
with these observations, we determined that ASM cells express SphK2 and display a nearly 2:1 AFD-
R to AAL-R ratio. In face of a preferential distribution of SphK2 at the endoplasmic reticulum [45]
and since accumulation of phosphorylated SphK2-derived sphingoid based in that location can
interfere with mechanisms that sustain cell survival and promote proliferation through induction of
endoplasmic reticulum stress [40, 46], we conclude that intracellular AFD-R accumulation is the most
likely event to explain interference with mechanisms that sustain ASM thickening and the ensuing
AHR. Our results do not exclude the possibility that sphingosine analogs not investigated in this
study, such as FTY720, could also interfere with ASM cell proliferation and thereby reverse AHR in
experimental asthma. However, current literature supports the theory that sphingosine analogs
displaying rapid rates of intracellular sphingoid bases accumulation, like AAL-R, are more efficient
to interfere with cellular amplification than analogs featuring slower rates of intracellular
aminophosphate accumulation [17].
It is well documented that a prolonged daily administration of sphingosine analogs at low doses can
increase the risk of pulmonary side effects [47], which likely relates to the immunosuppressive
activities of this class of agents. Over a period of time that exceeds months, FTY720 might even be
associated with asthma exacerbations as exemplified by two case studies [48, 49]. Importantly, such
effect was never reported in clinical trials over a short period of time. Nevertheless sphingosine
analogs can become highly potent cell death inducers at high concentrations, and potentially harmful
86
if administered at high doses during severe inflammatory conditions [50]. Still, short term treatments
with sphingosine analogs were repeatedly documented not to cause pulmonary damage when
administered locally in the airways [18, 24, 51]. In the current study, we confirm the absence of
aversive effects of this type of agents in the airway. In fact, we document that AAL-R remains
efficient at inhibiting allergic airway inflammation in the remodeled lung. Given the likely role of
proinflammatory mediators in the induction of tissue remodeling [52] and because numerous
inflammation-derived mediators can favor a spasmogenic response [53], our findings support the
concept that AAL-R might tackle different asthmatic phenotypes by acting on both airway remodeling
and inflammation.
4.7 Conclusion and declarations
We found that a punctual treatment with AAL-R resorbs the thickening of ASM in the context of
asthma, while not aversively affecting the airways within a short time window. Moreover, we
determined that AAL-R could directly interfere with ASM cell accumulation in vitro. This effect
depends on the propensity of this sphingosine analog to be phosphorylated in situ and likely results
from an increase of the intracellular aminophosphate content. Given the central role of ASM
thickening in AHR and asthma, this experimental therapeutic strategy needs to be further explored.
87
4.7.1. Conflict of Interest Statement
The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial
relationships that could be construed as a potential conflict of interest.
4.7.2. Author Contribution
Participated in research design: DG, PBL, AML, MJB, NF, ASD, EB, MRB, ML, SGB, YB, DM
Conducted experiments: DG, PBL, AML, CAH, ALG
Contributed new reagents: SGB
Performed data analysis: DG, PBL, AML, CAH, ALG, DM
Wrote or contributed to the writing of the manuscript: DG, PBL, AML, MJB, CAH, ALG, NF,
ASD, EB, MRB, ML, SGB, YB, DM
4.7.3. Funding
This work was supported by CIHR grant # 274357 and funding from the Respiratory Health Network
of the FRQ-S. DG received scholarships from the Training program of the Respiratory Health
Network of the FRQ-S– IRSC and from the FRQ-S. DM, YB, MRB, NF, EB are members of the
FRQ-S Respiratory Health Network and DM, YB, ML and MRB received FRQ-S research scholar
awards.
4.7.4. Acknowledgements
We thank Serge Simard (CRIUCPQ) for statistical analyses, Marc Veillette from the flow cytometry
platform at CRIUCPQ and Dany Patoine for his expertise in small molecule quantification
88
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2012. 18(11): p. 627-33.
91
4.9 Figures
Figure 4.1: Sphingosine analogs and their targets
AAL-R ((R)-2-amino-4-(4-heptyloxyphenyl)-2-methylbutanol) and AAL-S ((S)-2-amino-4-(4-
heptyloxyphenyl)-2-methylbutanol) are cell-permeant sphingosine analogs that readily penetrate into
the intracellular space. Inside the cell, AAL-R is rapidly phosphorylated by SphK2 into AFD-R
(phosphorylated (R)-2-amino-4-(4-heptyloxyphenyl)-2-methylbutanol). Although not
phosphorylatable, AAL-S still has biological relevancy, such as positive regulatory effects on
intracellular Protein Phosphatase 2A (PP2A) [10]. The cell-impermeant molecule AFD-R can either
accumulate intracellularly to exert biological effects via unknown targets [17], or be transported into
the extracellular space where it can modulate cell surface S1P receptors.
92
Figure 4.2: Experimental model
Mice received either saline or HDM 3 times a week for 5 consecutive weeks. After 1 week of rest to
allow acute inflammation to resolve, mice were administered pharmacological treatments daily for a
period of 1 week and euthanized 24h after the last dose for analyses.
93
Figure 4.3: AAL-R reverses airway hyperresponsiveness elicited by chronic HDM exposure
Saline- or HDM- treated mice were administered vehicle (VEH), AAL-R (1 mg/kg) or
Dexamethasone (DEXA) (1 mg/kg) and the degree of airway responsiveness was assessed by
measuring the resistance of the airway system (Rrs) in response to graded doses of methacholine. n=8
mice per group except DEXA where n=6. “a” denotes a significant difference vs the SAL – VEH
group, “b”: vs HDM - VEH group, “c”: vs HDM - DEXA group. Significantly different at p < 0.05.
94
Figure 4.4: AAL-R reverses ASM thickening
Mice received HDM or saline (SAL) and underwent VEH or AAL-R treatment as described in Figure
4.2. (A) Histological appearance of the airway wall. The smooth muscle layer is delineated with a
black dotted line. One representative image per group is shown and the numbers represent the average
thickness of the ASM layer ± SEM. (B) The percentage of increase in ASM thickness relatively to
saline-VEH mice (baseline) was computed. Saline: n=4; VEH: n=7; AAL-R: n=7; * significantly
different at p < 0.05.
95
Figure 4.5: AAL-R inhibits the proliferation of ASM cells
ASM cells were incubated in complete medium with the indicated concentrations of AAL-R, AAL-
S, AFD-R or the vehicle (VEH; empty dot) for 72h. (A) Proliferation was assessed by
bromodeoxyuridine incorporation. n=4; *: significantly different at p < 0.05. (B) Annexin V binding
was evaluated after 48 h of incubation. Numbers show drug-induced increase in apoptosis (over
vehicle-treated baseline). n=6 except for VEH: n=9 and AAL-R 10-6: n=8. * shows statistical
significance from VEH group at a p < 0.05. All panels show representative results from 2 independent
experiments.
96
Figure 4.6: Endogenous sphingolipid modulation in response to sphingolipid modifiers
ASM cells were incubated in complete medium. When indicated, AAL-R (1 µM), AAL-S (1 µM),
AFD-R (1 µM), SM4 (3 µM) or the vehicle (VEH) were added for 24h. Mass spectrometry was
performed to quantify S1P, sphingosine and ceramides in ASM cells. Shown is (A) the
S1P/sphingosine ratio and (B) C-16 ceramides. (C) Modulation of cell accumulation in response to
the experimental agents measured using the tetrazolium dye assay. n=6. * shows statistical
significance from the VEH group at a p < 0.05.
97
Figure 4.7: An S1P1/S1P3 antagonist does not induce cytostasis
ASM cells were incubated in complete medium with the AAL-R (1 µM), AAL-S (1 µM), AFD-R (1
µM), VPC23019 (at indicated concentrations) or the vehicle (VEH) for 24h and cell accumulation
was assessed using the tetrazolium dye assay. n=8. * shows statistical significance from the VEH-
treated group at a p < 0.05.
98
Figure 4.8: AAL-R-induced cytostasis depends on intracellular accumulation of AFD-R
ASM cells were incubated in complete medium. When indicated, AAL-R (1 µM), AAL-S (1 µM),
AFD-R (1 µM) or the vehicle (VEH) were added for 24h. Mass spectrometry was performed to
quantify (A) unphosphorylated total AAL species and (B) AFD-R. n=6. * shows statistical
significance from VEH group at a p < 0.05.
99
Figure 4.9: Reversal of airway hyperresponsiveness induced by chronic HDM exposure
requires a phosphorylatable sphingosine analog
Mice received HDM or saline (SAL) and underwent AAL-R (1 mg/kg) or AAL-S (1 mg/kg) treatment
as described in Figure 4.2. The degree of airway responsiveness was assessed by measuring the
resistance of the airway system (Rrs) in response to graded doses of methacholine. Saline: n=11;
VEH: n=15; AAL-R: n=14; AAL-S: n=6. “a” denotes a significant difference vs the SAL – VEH
group, “b”: vs HDM - VEH group, “c”: vs HDM – AAL-S group. Significantly different at p < 0.05.
100
4.10 Supplementary material
4.10.1. LC MS/MS Analysis
Analyses were done on a TripleTOF 5600 (Sciex, Framingham, MA) equipped with an electrospray
interface with a 50 μm iD capillary and coupled to an Eksigent μUHPLC (Eksigent, Redwood City,
CA). Analyst TF 1.6 software was used to control the instrument, for data processing and
acquisition. The source voltage was set to 5.5 kV and maintained at 350°C, curtain gas was set at 25
psi, gas one at 15 psi and gas two at 15 psi. Acquisition was performed in MRM mode. Specific
transitions and voltage parameters for each molecule are reported in supplementary Table 1. The
gradient was the following 0-0.1min hold 50% B, 0.1-0.5 min from 50% B to 90% B, 0.5-2.5 min
from 90% B to 100% B, hold 100% from 2.5-3 min, followed by a 0.5 min post-flush at 35 uL/min
at final condition.
Quantification of S1P and sphingosine was done with a standard curve (R2 = 0.998 and 0.989,
respectively) and corrected by their respective internal standard. For the quantification of C16
ceramide, AAL-S, AAL-R and AFD-R, the ratio over the C17-Sphingosine as the internal standard
was used to calculate absolute amount. To do so, a 5-points standard curve of each molecule was
performed by LC-MS/MS to confirm that the ratio of the AUC of the molecules over that of the
C17-Sphingosine was linear over the range of observed AUC. Once the confirmation was done, the
AUC of the C17-Sphingosine was used to calculate the absolute amount of molecule of interest.
4.10.2. Supplementary Figures and Tables
Supplementary Table 4.1: Details of the mass spectrometer parameters
Molecule Precursor m/z MS/MS ion Declustering potential Collision energy
Sphingosine 300.3 282.28 20 17
C17-Sphingosine 286.3 268.26 20 17
S1P 380.2 264.27 20 23
C17-S1P 366.4 250.27 20 23
AAL-S/AAL-R 294.2 107.04 100 25
C16-ceramide 538.5 264.26 100 39
AFD-R 375.2 260.2 100 20
101
Supplementary Figure 4.1: AAL-R retains its ability to alleviate inflammation in the
remodelled airways
(A) Mice received either saline or HDM 3 times a week for 5 consecutive weeks. After 1 week of rest
to allow acute inflammation to resolve, mice were re-challenged with HDM i.n or saline. A subset of
HDM re-challenged mice were injected i.p. with vehicle (VEH) or AAL-R (1mg/kg) daily for 1 week.
Mice were anesthetized 24 h after the last challenge and BALF was harvested for differential counts
of Macrophages (Macro), Lymphocytes (Lympho), Neutrophils (Neutro), and Eosinophils (Eosino).
(B) Relative frequencies of indicated cell subsets. (C) Absolute numbers of indicated cell subsets.
Mice that were not re-challenged with HDM and received the vehicle were also used as a reference
group (Saline). n=6 mice per group. * denotes a significant difference vs the saline group; † denotes
a significant difference vs the HDM re-challenged - VEH group, significantly different at p < 0.05.
102
Supplementary Figure 4.2: ASM primary human cells express S1P receptors 1 to 3, both
sphingosine kinases and S1P lyase
The expression of S1P receptors 1 to 5 (S1PR1, NM_001400; S1PR2, NM_004230; S1PR3,
NM_005226; S1PR4, NM_003775; S1PR5, NM_001166215), sphingosine kinase 1 (SPHK1,
NM_001142601) and 2 (SPHK2, NM_020126) and sphingosine-1-phosphate lyase (SGPL1,
NM_003901) was assessed using real time quantitative PCR. mRNA from human primary ASM cells
was extracted using the EZ-10 DNAway mRNA mini-preps kit (Biobasic, Markham, CAN) according
to the manufacturer’s instructions. mRNA (1µg) was converted to cDNA using iScript Advanced
cDNA Synthesis and quantified with the Rotor Gene apparatus using Sso Advanced SYBR Green
Supermix (Biorad). Predesigned primer sets (PrimeTime qPCR Assays) were purchased from
Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Efficiency was determined for each set of primers and
absence of contaminating DNA was confirmed using no-RT controls. The delta-ct was calculated for
each target and reported on the geometric mean of the reference Ribosomal protein large p0 (RPLP0,
NM_ 001002) and Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1 (GNB2L1, NM_
006098). n=6.
103
Supplementary Figure 4.3: Sphingosine analogs do not negatively affect non-asthmatic lung
responsiveness to methacholine
Naïve mice were administered daily with vehicle (VEH), AAL-R (1mg/kg) or AAL-S (1mg/kg) for
1 week. (A) The degree of airway responsiveness was assessed by measuring the resistance of the
airway system (Rrs) in response to graded doses of methacholine. (B) Histological appearance of
sagittal lung slices. n=5. * shows statistical significance from VEH group at a p < 0.05.
104
5. Chapitre V: FTY720 promotes pulmonary fibrosis
when administered during the remodeling phase
following a bleomycin-induced lung injury
5.1 Résumé
La fibrose complique plusieurs pathologies incluant les maladies pulmonaires interstitielles. Les
analogues de la sphingosine, comme FTY720, peuvent diminuer la fibrose pulmonaire induite par un
agent toxique dans les modèles murins. Contradictoirement, FTY720 favorise des mécanismes
profibrotiques in vitro et, à doses élevées, augmente la fibrose pulmonaire par l’augmentation de la
perméabilité vasculaire pulmonaire in vivo. Le but de cette étude est donc de déterminer l’effet d’une
faible dose de FTY720 sur la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine dans un modèle murin.
Les phases inflammatoires et fibrotiques de ce modèle ont été temporellement délimitées et
subséquemment traitées avec FTY720. Bien que FTY720 diminue la fibrose pulmonaire
lorsqu’administré pendant la phase inflammatoire, elle l’augmente fortement pendant la phase
fibrotique. Cette augmentation est associée avec l’expression de connective tissue growth factor, mais
pas avec la perméabilité vasculaire. Par conséquent, la période d’administration de FTY720
détermine ses effets anti- ou pro-fibrotiques.
105
5.2 Abstract
Fibrosis complicates numerous pathologies including interstitial lung diseases. Sphingosine analogs
such as FTY720 can alleviate lung injury-induced fibrosis in murine models. Contradictorily,
FTY720 also promotes in vitro processes normally leading to fibrosis and high doses in vivo foster
lung fibrosis by enhancing vascular leakage into the lung. The goal of this study was to determine the
effect of low doses of FTY720 on lung fibrosis triggered by an acute injury in mice. We first defined
the time-boundaries delimiting the inflammatory and remodeling phases of an injury elicited by
bleomycin based on neutrophil counts, total lung capacity and lung stiffness. Thereafter, FTY720 (0.1
mg/kg) was delivered during either the inflammatory or the remodeling phases of bleomycin-induced
injury. While FTY720 decreased fibrosis by 60% and lung stiffness by 28% when administered
during the inflammatory phase, it increased fibrosis (2.1-fold) and lung stiffness (1.7-fold) when
administered during the remodeling phase. FTY720-induced worsening of fibrosis was associated
with an increased expression of connective tissue growth factor, but not with vascular leakage into
the lung. Thus, the timing of FTY720 delivery following a bleomycin-induced lung injury determines
pro- vs anti-fibrotic outcomes.
Keywords: Gilenya®, bleomycin, leakage, inflammation, sphingosine-1-phosphate, fibrosis
106
5.3 Introduction
Fibrosis is a severe and currently untreatable complication of several interstitial pulmonary diseases
[1, 2]. Lung fibrosis impairs quality of life and has a major impact on mortality with a mean survival
of 2-3 years in the most severe, sometimes idiopathic, forms of the disease [3]. Numerous
dysregulated mechanisms can promote fibrosis. At the cellular level, a seminal step involves the
accumulation/activation of fibroblasts and myofibroblasts into the lungs, with their subsequent
release of pro-fibrotic factors and extracellular matrix proteins, including proteoglycans and collagens
[4]. This excessive lung scarring compromises the structure of alveoli, increases lung stiffness,
decreases lung volumes and, ultimately, leads to severe impairment of gas exchange [5]. At the
molecular level, elevated levels of growth factors including transforming growth factor (TGF)-β and
connective tissue growth factor (CTGF) are considered major, sometimes sufficient [6] inducers of
fibrosis [7]. Yet, the mechanisms regulating lung fibrosis are not completely understood and it
remains difficult to predict whether new experimental interventions will alleviate or exacerbate
fibrosis.
Sphingosine analogs can modulate fibrotic mechanisms in vivo and in vitro. However, whether their
effects are anti- or pro-fibrotic is still debated. On one hand, the sphingosine analog FTY720
(Fingolimod/Gilenya®) attenuates acute lung injury induced by toxic agents, thus alleviating the
ensuing fibrosis [8]. In support to these findings, FTY720 alleviates experimental hepatic [9] and
renal fibrosis [10]. On the other hand, higher doses of FTY720 that are sufficient to enhance vascular
leakage into the lung can enhance bleomycin-induced fibrosis [11]. In addition, in vitro studies show
that FTY720 promotes the differentiation of human lung fibroblasts into myofibroblasts [12],
enhances the expression of growth factors and increases extracellular matrix deposition [13].
Furthermore, the phosphorylated form of FTY720, which is generated in vivo, inhibits fibroblast
apoptosis [14], which is involved in resorption of fibrotic patches. Taken together, these data clearly
highlight the controversial effects of sphingosine analogs on the outcome of fibrosis.
So far, few interventions in the mouse model of fibrosis elicited by bleomycin-induced lung injury
translated into an efficient treatment for interstitial lung diseases [15]. This is because the majority of
previous interventions aimed at reducing the early inflammatory phase of the model. It goes without
saying that reducing the severity of the lesion triggered by bleomycin will commensurately reduce
the extent of the later fibrotic response [16]. Focusing on mechanisms occurring after the resolution
of acute inflammation and during the active remodeling phase of the model has greater potential to
translate into findings that are relevant to human fibrosis [17].
107
The aim of this study is thus twofold. First, we delineated the duration of the periods post-injury that
divide the phase of inflammation from the phase of remodeling in the mouse model of fibrosis elicited
by bleomycin-induced lung injury. Secondly, we aimed at determining whether low, yet biologically
active, doses of FTY720 impact fibrosis differently when delivered during the inflammatory phase
versus during the remodeling phase. Since FTY720 promotes fibrotic functions of fibroblasts in vitro,
and because fibroblasts are central actors of fibrosis, we hypothesized that delivery of FTY720 during
the remodeling phase following lung injury enhances fibrosis.
5.4 Methods
5.4.1. Murine model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis and FTY720 treatment
On day 0, C57BL/6J male mice 8-12 weeks old (Jackson Laboratories, USA) were anesthetised using
isoflurane and received one intratracheal (i.t) administration of 1 U/kg of bleomycin. Mice were then
randomly assigned to receive intraperitoneal (i.p.) injections of FTY720 (0.1 mg/kg; Cayman
Chemical, MI) or its vehicle (H2O) during either the inflammatory phase (days 0, 3 and 6) or the
remodeling phase (days 14, 17 and 20). All mice were euthanatized on day 21 for analyses. Mice
were housed with free access to food and water in a temperature-controlled room under a 12-h dark-
light cycle. For animal welfare purposes, experimental death was declared when mice lost 20% or
their bodyweight. Experimental, housing and care procedures were approved by the Committee of
Animal Care of Laval University in accordance with the guidelines of the Canadian Council on
Animal Care (protocol 141222).
5.4.2. Measurements of lung function
Mice were deeply anesthetised with isoflurane and subsequently oro-tracheally intubated using a
blunted 18 gauge needle. Animals were ventilated with air containing isoflurane using the flexiVent
apparatus (SCIREQ, Montréal, QC). After a stabilisation period (3-5 minutes), airway recruitment
was initially ensured by performing 3 to 5 deep inflation manoeuvres. Lung stiffness (i.e., dynamic
elastance) was then assessed three times using a single frequency forced oscillation manoeuvre. Each
oscillation manoeuver was preceded by one deep inflation manoeuvre to maintain recruitment of
small airways and alveoli. Mice immediately regained autonomous respiration and consciousness
when they were removed from the apparatus. Since the procedure is non-surgical, minimally invasive
and non-terminal, it was performed at various time-points to monitor the progression of lung functions
in individual mice
108
5.4.3. Histology and immunohistochemistry
The left lung was harvested, inflated with phosphate buffered saline (PBS), fixed in 4%
paraformaldehyde and embedded in paraffin. Histological analyses were performed on the frontal
plane of Masson’s trichrome-stained lung slices. Using the Image-J software, the lung area and area
occupied by fibrotic patches were measured to determine the percentage of fibrotic area.
Paraffin-embedded lung sections were deparaffinized and rehydrated. Antigen retrieval was
performed using 0.05% protease (Sigma, Oakville, ON) 15 min at 37°C. Tissues were blocked in PBS
containing 3% bovine serum albumin (BSA; Wisent, St-Bruno, QC), 0.2% cold water fish gelatin
(Sigma) and 0.1% tween-20 (Sigma) for 15 min at room temperature followed by avidin/biotin
blocking (Vector Laboratories, Burlingame, CA) as per the manufacturer’s instructions. Biotinylated
anti-CTGF primary antibody (bs-0743R-biotin; Bioss, Woburn, MA) was diluted in PBS buffer
containing 1% BSA and incubated overnight at 4°C. Slides were washed 3 times with 0.1% tween-
PBS and then incubated with streptavidin-coupled horseradish peroxidase (Biolegend, San Diego,
CA) in PBS for 1h at room temperature. Slides were washed 2 times with 0.1% tween-PBS and DAB
was used as the chromogenic substrate. Mayer’s hematoxylin (Agilent Technologies, Santa Clara,
CA) was used as the counterstain.
5.4.4. Assessment of vascular leakage
Bronchoalveolar lavage was performed with 3 x 1 ml of PBS. The cell-free supernatant was used to
determine albumin content by Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA) (Bethyl Laboratories,
Montgomery, TX). Cell pellets were resuspended for differential counts as described [18].
5.4.5. Cell culture
Murine NIH/3T3 fibroblasts (ATCC-CRL-1658TM, ATCC, Manassas, VA) were plated at a density
of 104 cells per cm2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 10% calf serum (complete
medium) for 24 h, and then incubated with 0.1 or 1.0 μM of FTY720 or its vehicle for 2 h.
109
5.4.6. Real-time quantitative polymerase chain reaction
Probes were purchased from Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). The expression of tumor
necrosis factor (Tnf, NM_013693), transforming growth factor-β (Tgf-β, NM_011577), and
connective tissue growth factor (Ctgf, NM_010217) mRNA, along with the expression of reference
genes ribosomal protein, large, p0 (Rplp0, NM_007475) and guanine nucleotide binding protein beta
polypeptide 2-Like 1 (Gnb2L1, NM_008143), was assessed using real-time quantitative polymerase
chain reaction (RT-qPCR). Specificity was confirmed and efficiency was optimized in lung tissue for
every probe set. In the experiments with mice, the whole right lung was pulverized in liquid nitrogen
and RNA was isolated using TRIZol (Thermo Fisher, Waltham, MA). In the experiments with 3T3
murine fibroblasts, total cells RNA was isolated using the EZ-10 DNAway mRNA mini-preps kit
(Biobasic, Markham, ON) according to the manufacturer’s instructions. RNA (1 μg) was converted
to cDNA using iScript Advanced cDNA Synthesis kit and quantified using Sso Advanced SYBR
Green Supermix kit (Biorad, Hercules, CA). The delta-ct was calculated for each mRNA and reported
on the geometric mean of Rplp0 and Gnb2L1.
5.4.7. Statistical analyses
Data were expressed using mean ± SEM. Homogeneity of variance and normality of the data were
verified. When appropriate, variables were log-transformed. Data was analyzed using ANOVAs or
two-way ANOVAs with an interaction effect. The Satterthwaite’s degree of freedom statement was
added for unequal variance structure. The results were considered significant with p-values ≤ 0.05,
unless otherwise stated. Post-hoc analyses were performed using Tukey’s comparison test. All
analyses were conducted using the statistical packages R v3.0.2 (R Foundation for Statistical
Computing, Vienna, Austria.) and SAS v9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
110
5.5 Results
5.5.1. The remodeling phase following bleomycin injury is initiated on day 14
To determine the kinetics of the inflammatory phase, mice were euthanized at day 0, 4, 14, or 21 post-
bleomycin exposure to analyze the amount of neutrophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF)
(Figure 5.1). According to our time-points, the inflammatory response peaked on day 4 with an
average absolute number of 6.7 ± 0.9 x 104 neutrophils in the BALF (Figure 5.1A). Neutrophilia then
decreased near the baseline level 14 days post-bleomycin instillation.
To determine the kinetics of fibrosis, parallel experiments were undertaken in which the total lung
capacity and lung stiffness were monitored longitudinally post-bleomycin exposure. Compared to day
0, total lung capacity tended to increase from day 0 to 21 in mice receiving saline. When compared
with the saline group, total lung capacity was significantly decreased in bleomycin-treated mice on
days 14, 17, and 21 post-bleomycin instillation (Figure 5.1B), indicating alveoli replacement by scar
tissue. Similarly, we could determine that stiffness was higher in bleomycin-treated mice, when
compared with mice receiving saline, although we were not able to detect significant progression
between time-points (Figure 5.1C). Together, these results demonstrate that, while the transient
inflammatory phase of injury induced by bleomycin wanes out by day 14, the functional changes
evocative of progressing fibrosis are present at least from day 14 until day 21 post bleomycin
instillation.
5.5.2. FTY720 exerts opposite effects on fibrosis depending on its period of delivery
We then determined whether the period of FTY720 treatment affected its ability to modulate fibrosis.
Mice exposed to bleomycin were treated with either the vehicle or FTY720 on days 0, 3, and 6
(inflammatory phase) or on days 14, 17, and 20 (remodeling phase) (Figure 5.2). While saline-
exposed mice showed normal lung histology on day 21 (Figure 5.3A), fibrotic patches represented
7.1 ± 1.2% of the total lung area in bleomycin-exposed mice treated with the vehicle (Figure 5.3A-
B). Treatment with FTY720 during the inflammatory phase mildly decreased fibrotic area on day 21
when compared with the vehicle-treated group. In contrast, FTY720 administered during the
remodeling phase potentiated the fibrotic area by more than two-fold (Figure 5.3A-B).
The differential effect of FTY720 on fibrotic area (Figure 5.3) translated into differing progression
of lung stiffness from days 14 to 21 between experimental groups (Figure 5.4). As a general
physiological reference, the baseline lung stiffness in control mice is 19.6 cmH2O/ml (Figure 5.4,
111
dotted line). Pointedly, experimental mortality events start to occur above a threshold of 70
cmH2O/ml, providing a range of 50 cmH2O /ml within which fibrotic deterioration can be measured.
As seen in Figure 5.4, none of the experimental treatments significantly modulated stiffness on day
14. In bleomycin-exposed mice receiving the vehicle during either the inflammatory or the
remodeling phase (and consistent with results shown in Figure 5.1) stiffness did not deteriorate
significantly from days 14 to 21. While FTY720 administered during the inflammatory phase caused
a slight reduction in lung stiffness from days 14 to 21 (average decrease of 3.2 ± 1.3 cmH2O/ml),
FTY720 delivered during the remodeling phase strongly enhanced lung stiffness (average increase of
8.4 ± 3.3 cmH2O/ml). When considering the physiological baseline of 19.6 cmH2O/ml, FTY720
delivered during the remodeling phase increased the average lung stiffness by 1.7 fold on day 21,
when compared to the vehicle-treated group. Thus, the period of FTY720 treatment is critical to
determine the outcome on pulmonary fibrosis.
5.5.3. A low dose regimen of FTY720 does not enhance vascular leakage into the lung
Given that pro-fibrotic effects of high FTY720 doses were previously attributed to vascular leakage
into the lung [11], we determined whether such mechanism was in play under the current experimental
conditions. To do so, we measured the effect of the current FTY720 treatment regimen (a low dose
at 3 occasions, 3 days apart) on vascular leakage and compared it to treatment regimens that were
previously shown to promote fibrosis by enhancing vascular leakage (medium or high doses on 4
occasions, 2 days apart) (Figure 5.5A). As described by Shea et al. [11], we observed that both
medium and high regimens administered during the inflammatory phase increased BALF albumin by
up to 6 times (Figure 5.5B) and the number BALF cells by up to 3 times (Figure 5.5C), when
compared to vehicle-treated bleomycin-exposed mice. On the other hand, the current treatment
featuring lower doses of FTY720 failed to increase the albumin content (Figure 5.5B) and the absolute
number of cells (Figure 5.5C) in BALF, when compared to the vehicle-treated group. We extended
this experiment to the remodeling phase of the model (Figure 5.5D). Similarly to that observed in the
acute phase, the low FTY720 regimen failed to enhance albumin content (Figure 5.5E) or cellularity
(Figure 5.5F) in the BALF. In contrast, both mild and high regimens tended to enhance these features,
although non- significantly. Thus, in the current conditions, FTY720 likely acts independently of
enhanced vascular leakage in order to increase fibrosis during the remodeling phase following
bleomycin- induced lung injury.
112
5.5.4. FTY720 increases Ctgf expression in vivo and in vitro
Considering that the current FTY720 treatment regimen unlikely induced fibrosis by causing vascular
leakage, we assessed the impact of FTY720 on the expression of soluble mediators that are sufficient
to enhance pulmonary fibrosis. The relative expression of Tnf and Tgf-β was not affected by the
experimental treatment. However, we observed that Ctgf expression was increased by 42% in the
lung of mice instilled with bleomycin and receiving FTY20 during the remodeling phase, compared
to bleomycin-exposed mice treated with the vehicle (Figure 5.6A). Moreover, we detected CTGF
immunoreactivity throughout fibrotic patches along with occasional rounded or spindle shaped-cells
displaying stronger CTGF immunoreactivity (Figure 5.6B). In line with these observations, we
determined in vitro that FTY720 concentrations likely to be found in the lung [19] enhanced Ctgf
expression in fibroblasts by 35%. Meanwhile, Tgf-β expression was not modulated in vitro (Figure
5.6C). Thus, the enhanced fibrosis induced by the delivery of FTY720 in the remodeling phase is
associated with the increased expression of a potent pro-fibrotic growth factor.
113
5.6 Discussion
Sphingolipids and their analogous molecules are potent modulators of immune mechanisms, cell fate
[20] and physiological responses [21]. In the last decade, their usage as therapeutic compounds
constantly gained interest. Sphingolipids were hypothesized as potential therapeutic compounds in
the context of fibrosis [22]. However, irreconcilable conclusions have been drawn regarding their
pro- vs anti-fibrotic potential [8, 11]. We confirmed the concept that the bleomycin-induced lung
injury caused an initial neutrophil-rich inflammatory response followed by and inflammation-low
fibrotic phase [17, 23]. We also unravelled that the chosen post-injury period during which FTY720
is delivered essentially determines whether the effect is beneficial or detrimental. We found that
FTY720 does not induce vascular leakage and fails to promote fibrosis when administered during the
inflammatory phase at a low, yet biologically-active dose [24]. Importantly, we demonstrated that the
enhanced fibrosis induced by low FTY720 doses during the remodeling phase does not require
increased vascular leakage, but is rather associated with the promotion of fibrotic mechanisms.
Moreover, these findings were enabled by a sensitive longitudinal approach to monitor functional
alterations during the remodeling phase of the bleomycin-induced fibrosis model.
Stiffness often correlates with connective tissue content [25] and is a key functional surrogate in the
context of fibrotic disorders. In agreement with the observations of Phillips et al [26], we found that
the variability of endpoint measurement of airway stiffness was unsuitably high to appreciate the
effect of experimentally-induced lung function. For instance, lung stiffness ranged on nearly 40
percent of the physiological range in mice receiving bleomycin and vehicle on day 21 (Figure 5.4).
Yet, lung stiffness on day 21 correlated strongly with stiffness on day 14 in bleomycin mice receiving
the vehicle, supporting the concept that measuring progression within a same animal would likely
isolate treatment effects. Our results show that longitudinal assessment of lung stiffness using a short
forced oscillation manoeuvre in mice oro- tracheally cannulated circumvents the intrinsic variability
of disease severity often seen in response to bleomycin, and enables sensitive detection of airway
function modifications in response to experimental agents.
Sphingosine analogs act on multiple biological mechanisms in a dose-dependent fashion. Notably,
the protective effects on lung permeability occur at 0.1 mg/kg [27], which likely corresponds to low
micromolar or lower concentrations of the drug in tissues [28]. Within that concentration range,
FTY720 also enhances barrier integrity in vitro [29]. Accordingly, low doses of sphingosine analogs
during the acute phase of a pulmonary insult displayed a protective effect
114
[8, 29], or at least do not enhance inflammation or lung injury. In contradistinction, concentrations of
FTY720 that are of one order of magnitude higher impair endothelial barrier integrity in vitro by a
mechanism involving S1P receptor 1 degradation [27]. In fact, such concentrations of sphingosine
analogs were also proved to induce cell death under various experimental conditions [20, 27]. Our
results showing that low FTY720 doses administered during the inflammatory phase fail to enhance
vascular leakage and subsequent fibrosis are thus in agreement with the documented effects of this
class of drugs when they are used within a range sufficient to exert biological activities, while not
triggering S1P receptor degradation-related mechanisms [27, 30], or cytotoxic effects [20].
Considering that fibrosis is directly proportional to the extent of the inflammatory response to toxic
agents [17], it is not surprising that the pro-inflammatory effect of high FTY720 doses were
previously shown to enhance bleomycin-induced fibrosis [11]. Inversely, it is also not surprising that
strategies inhibiting the bleomycin-induced inflammatory response were most of the time correlated
with a reduction of subsequent fibrosis [17]. However, and in contrast to pre-clinical models, anti-
inflammatory drugs have failed in clinical trials for idiopathic pulmonary fibrosis. This supports the
idea that agents targeting the inflammatory phase of this model will unlikely benefit this type of
disease. In fact, treating the inflammatory phase is only tenable in cases where fibrosis occurs in
response to a known cytotoxic stressor, as suggested by the work of Quian et al. [8]. Overall, these
studies suggest that the time-window during which the treatment is delivered post-injury needs to be
considered.
We show that FTY720 enhances fibrosis when administered during the remodeling phase. This effect
occurs in the absence of enhanced vascular leakage, which suggests that FTY720 pro- fibrotic effects
are not limited to its leakage-enhancing capacity. Instead, our observations suggest that FTY720
likely acted by promoting pro-fibrotic mechanisms, as evidenced by increased Ctgf expression in the
lung. Importantly, this growth factor was shown to be sufficient to drive fibrosis in vivo [6], and its
blockade potently interferes with fibrosis [31]. Moreover, in agreement with results obtained in renal
stromal cells [32], we found that enhancement of Ctgf expression by FTY720 can be replicated in
vitro in a fibroblast cell line. Together, these results argue that FTY720 could act directly on
fibroblasts in order to enhance fibrosis, but they do not exclude the possibility that indirect
mechanisms, including immunomodulation, could be in play. Yet, FTY720 failed to reduce the
infiltration of inflammatory cells into the airway tissues during the remodeling phase of the model.
We also found no alteration of Tnf expression between bleomycin-exposed mice receiving the vehicle
or FTY720 (Figure 5.6), arguing against the possibility that FTY720 interfered with the protective
effect of TNF in this model [33]. As a whole, our results thus suggest that enhancement of fibrosis by
115
FTY720 during the remodeling phase does not rely on enhancement of vascular leakage into the lung
but likely results from the promotion of pro-fibrotic mechanisms.
S1P pathway-modulating agents are currently used in clinics and have raised a number of safety issues
including induction of bradycardia, atrio-ventricular block [34], susceptibility to viral infections [35]
and case reports of asthma exacerbations [36, 37]. In addition, pre-clinical events of subpleural
fibrosis have been detected at very high doses of FTY720 in normal rats [38]. Our study raises the
possibility that FTY720 could also promote fibrotic processes in the remodeling lung.
5.7 Conclusion and declarations
Sphingosine analogs possess the ability to modulate mechanisms that underlie fibrosis. Herein, we
showed that doses of FTY720 that fail to enhance vascular leakage and inflammation alleviate
bleomycin-induced fibrosis when administered during the acute inflammatory phase. On the other
hand, we revealed that FTY720 treatment during the remodeling phase following bleomycin injury
enhances fibrotic mechanisms as exemplified by the increased expression of Ctgf. As a whole, we
demonstrated that the period of FTY720 delivery is paramount on the outcome of fibrosis following
bleomycin exposure. Inasmuch as this model relates to human interstitial lung diseases, our results
support the idea that FTY720 can potentially worsen fibrosis. Our results also confirm the paradigm
that drugs in development should be investigated during a proper time-window in this pre-clinical
lung fibrosis model prior to enunciate their likelihood of success in human diseases.
5.7.1. Acknowledgements
This work was funded by the Fondation de l'IUCPQ; by the Fonds sur les maladies respiratoires J-D-
Bégin P-H-Lavoie; and by the Fonds Alphonse L'Espérance. DG received a scholarship from the
Training program of the Respiratory Health Network of FRQS and from the FRQS. DM, YB and
MRB are members of the FRQS Respiratory Health Network and are FRQS Junior 1 Scholars. GD is
a consultant for Roche (Intermune) and for Boehringer-Ingelheim as an interstitial lung disease
expert. None of these companies contributed to this work in any way. We also thank Serge Simard
for statistical analyses and Natacha LeBrasseur for technical expertise in histology.
116
5.8 References
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118
5.9 Figures
Figure 5.1: Effects of bleomycin-induced injury on markers of inflammation and lung
function.
A) Neutrophils were quantified in BALF on days 0 (naive mice), 4, 14 or 21 post- bleomycin
instillation (ANOVA) * P<0.05. B-C) Pulmonary functions were assessed on days 5, 14, 17 and 21
post-bleomycin instillation. B) Total lung volume (* : P<0.05 when compared to the saline-treated
group at the same time point); C) Lung stiffness (Two-way ANOVA with interaction * : P<0.05). In
panels B-C, for each mouse, the value recorded on day 0 was subtracted from every following time
point to depict the changes over time. N=4 mice per group.
119
Figure 5.2: Protocol outlining the days at which FTY720 was administered.
All mice received bleomycin i.t on day 0. Mice were then treated with 0.1 mg/kg FTY720 or vehicle
(VEH) during either the inflammatory phase on days 0, 3 and 6 or the fibrotic phase on days 14, 17
and 20. Mice were euthanatized on day 21 for analyses. In some series of experiments, respiratory
function was also assessed longitudinally on days 14 and 21. Scale bars = 500 µM
120
Figure 5.3: FTY720 either decreases or increases lung fibrosis depending on its period of
delivery.
A) Representative images of Masson’s trichrome lung slices derived from naïve mice (upper-left
panel) and from bleomycin-injured mice co-treated with the VEH (upper-right panel), with FTY720
during either the inflammatory phase (lower-left panel) or the remodeling phase (lower-right panel).
Black bars represent a length of 500μm. B) Lung fibrosis was quantified, and fibrotic area was
expressed as the percentage of total lung area. VEH: N=9, Inflammatory: N=5, Remodelling: N=8;
ANOVA; * : p<0.05.
121
Figure 5.4: FTY720 enhances lung stiffness only when administered during the remodeling
phase.
Lung stiffness was assessed on day 14 (circles) and day 21 (squares) in each mouse. Dotted line shows
physiological baseline defined as the average stiffness of 18 control mice (8-10 weeks of age) never
exposed to bleomycin minus 3 standard deviations to encompass more than 98% of the population.
Inflammatory-VEH: N=8, Inflammatory-FTY720: N=7, Remodelling-VEH: N=10, Remodelling-
FTY720: N=10; Two-way ANOVA with interaction was performed; * : p <0.05.
122
Figure 5.5: A low dose (0.1mg /kg) of FTY720 does not enhance vascular leakage in the lung.
A) Mice were instilled with bleomycin on day 0. For the low treatment regimen they received FTY720
at 0.1mg/kg every third day from day 0 to day 6. The medium and high treatment regimens consisted
in injecting FTY720 at 0.5 mg/kg or 5.0 mg/kg, respectively, every second day from day 0 to day 6.
Upon euthanasia on day 7, BALF was collected and processed for B) quantification of albumin and
C) differential cell counts. D) Mice were submitted to the low, medium or high FTY720 treatment
regimen from day 14 to day 20 post-bleomycin instillation. E) Albumin quantification and F)
differential cell counts were performed on day 21. N=4-5 mice per group. ANOVA; * : p<0.05 vs
VEH.
123
Figure 5.6: FTY720 increases the expression of CTGF.
A) Mice received bleomycin on day 0 and FTY720 was administered during the remodeling phase
as described in Figure 5.2. Mice were euthanized on day 21 and lung expression of TNF, TGF-β and
CTGF mRNA was quantified by RT- qPCR. N=10 for all groups B) Immunohistochemical detection
of CTGF in fibrotic tissues. i) primary antibody omission control; ii) tissue incubated with anti-CTGF
antibody as described in methods. CTGF signal is shown in brown and nuclei were mildly
counterstained with hematoxylin (Blue). Representative of 7 samples. Scale bars = 50 µM C) Mouse
fibroblasts were stimulated with vehicle (VEH) or with the indicated concentrations of FTY720 for 2
h. TGF-β and CTGF mRNA expression was then quantified by RT-qPCR. Results are expressed
relative to VEH. N=6 independent experiments; ANOVA; * : p<0.05 vs VEH.
124
6. Chapitre VI : Un rôle pour S1P2 et S1P3 dans le
phénotype altéré des fibroblastes de patients atteints
de la FPI
6.1 Résumé
Les fibroblastes sont les principales cellules effectrices dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI).
De plus, les fibroblastes provenant de tissus pulmonaires fibrotiques de patients atteints de FPI
(fibroblastes FPI) surexpriment plusieurs facteurs profibrotiques, dont le connective tissu growth
factor (CTGF). Chez les fibroblastes pulmonaires normaux, la sphignosine-1-phosphate (S1P) peut
stimuler un profil fibrotique qui est partiellement renversé par un antagoniste du récepteur 3 de la
S1P (S1P3). Les objectifs sont donc de déterminer si les fibroblastes FPI répondent à la S1P
similairement aux fibroblastes normaux, et si les effets de la S1P peuvent aussi être renversés par un
antagoniste de S1P3. Nos résultats montrent que les fibroblastes FPI ont un phénotype profibrotique,
dont l’augmentation de la transcription du CTGF, qui est exacerbée par la S1P. Cette exacerbation
est atténuée par un antagoniste de S1P3. La voie de la S1P pourrait donc être une cible thérapeutique
potentielle dans la fibrose pulmonaire.
125
6.2 Introduction
La fibrose est une complication de plusieurs maladies pulmonaires interstitielles, dont la plus
commune et la plus sévère est la FPI. Elles impliquent une augmentation de la rigidité du parenchyme
pulmonaire, augmentant l’effort respiratoire et diminuant fortement la qualité de vie. De plus, elles
sont souvent diagnostiquées tardivement et, dans le cas de la FPI, la survie médiane est de 3.0 ± 0.5
ans au moment du diagnostic [1]. Malheureusement, quoique de nouveaux traitements permettent
d’augmenter la survie d’environ six mois [2], leur rapport coût-efficacité est très faible [2, 3] et ils
sont accompagnés d’effets secondaires très importants [4, 5]. Puisque la seule option curative est la
transplantation pulmonaire, de nouvelles cibles thérapeutiques sont nécessaires.
Bien que plusieurs types cellulaires et mécanismes soient impliqués dans les maladies pulmonaires
interstitielles [6], la dérégulation des fibroblastes et des myofibroblastes est au cœur de ces maladies
[7]. Ces cellules ont une activation et une survie aberrante et surexpriment plusieurs facteurs
profibrotiques, comme le TGF-β et le CTGF. Elles produisent aussi une grande quantité de protéines
constituant la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine, les enzymes dégradants
celle-ci, les MMP, ainsi que leurs inhibiteurs (TIMP) [8]. La surexpression de CTGF est centrale à la
fibrose pulmonaire, car ce médiateur est nécessaire et suffisant [9, 10] pour induire de la fibrose. De
plus, une forme épissée alternativement de la fibronectine est surexprimée par les fibroblastes FPI
[11]. Ces mécanismes dérégulés maintiennent la cicatrisation pathologique du tissu pulmonaire
menant à une augmentation de sa rigidité et la diminution des échanges gazeux [12].
Plusieurs de ces mécanismes peuvent être modulés par la voie de la S1P. La sphingosine est
phosphorylée en S1P par une ou l’autre de deux kinases, SphK1 et SphK2. La S1P peut soit être
déphosphorylée par les S1P phosphatase 1 et 2 ou les lipid phosphate phosphatases 1 à 3, soit être
irréversiblement dégradée par la S1P lyase. Il est important de noter que la SphK1 et la S1P sont
toutes deux surreprésentées dans le lavage bronchoalvéolaire et le tissu pulmonaire des patients
atteints de la FPI [13], comparativement aux tissus de sujets sains. Les niveaux de transcrits de la S1P
lyase dans les leucocytes circulants est négativement corrélée avec la sévérité la FPI [14]. De plus,
l’invalidation génétique de la SphK1 [15], ainsi que celle de S1P3 [16], diminue la fibrose pulmonaire
induite par la bléomycine dans un modèle murin. Comparativement, l’invalidation de la S1P lyase
dans le même modèle exacerbe plutôt la fibrose pulmonaire [14]. L’analogue de la sphingosine
FTY720 exacerbe la fibrose pulmonaire dans un modèle murin induit par la bléomycine, ce qui est
associée à l’augmentation des niveaux de transcrits du CTGF (section V). La voie de la S1P est donc
impliquée dans la fibrose pulmonaire in vivo. Ainsi, une accumulation d’évidences incluant nos
126
propres résultats supporte le concept que les sphingolipides, et les enzymes et les récepteurs qui s’y
rattachent, sont impliqués dans les mécanismes de fibrose in vivo.
In vitro, la stimulation de fibroblastes normaux avec la S1P ou FTY720-P, la forme phosphorylée de
FTY720, augmente la production de protéines de la matrice extracellulaire, dont le collagène de type
I, mais pas du collagène de type III, ni de la fibronectine [17]. Cette augmentation peut être atténuée
par l’administration d’antagonistes de S1P2 ou S1P3 [17], ce qui suggère que ces récepteurs pourraient
être impliqués dans les mécanismes d’amplification de la fibrose. Bien que les niveaux de transcrits
pour la fibronectine soient aussi augmentés par la S1P et FTY720-P, ceux du collagène de type I,
chaine α-1 tendent à être diminués [17], démontrant que l’impact potentiellement profibrotique des
agonistes des récepteurs de la S1P s’effectue par la modulation de médiateurs précis. À ce sujet, la
S1P et le FTY720-P augmentent l’expression de facteurs profibrotiques, dont le CTGF, en plus de
stimuler l’expression de SphK1, offrant possiblement une boucle de rétroaction positive [17].
D’ailleurs, la voie de la S1P serait reliée au contrôle de l’expression du CTGF induit par le TGF- β
[18, 19], car le TGF-β et le CTGF induisent l’expression de SphK1 dont l’augmentation réduit la
transcription du CTGF.
Malgré la notion que les agonistes de la S1P auraient des impacts profibrotiques, il demeure que
l’impact de la S1P et du FTY720-P sur la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes est
controversé [17, 20]. Ces deux études ont évalué l’effet d’une stimulation de 72H avec FTY720 sur
l’expression de fibres d’α-smooth muscle actin par des fibroblastes pulmonaires humains, en
immunofluorescence. À une concentration de 1 µM, FTY720 augmente la différentiation des
fibroblastes en myofibroblastes, mais pas à 5 µM. Il est connu qu’une concentration de FTY720
supérieur à 1 µM peut induire des effets non observés à des doses inférieures, dont la forte induction
de l’apoptose. Il est donc possible que les effets rapportés par ces études impliquent des mécanismes
divergents, et des études supplémentaires sont nécessaires afin d’élucider cette controverse.
Toutefois, il a été montré que S1P3 est nécessaire pour la différenciation des fibroblastes normaux en
myofibroblastes par FTY720 [20]. Puisque les fibroblastes FPI sont fondamentalement différents des
fibroblastes pulmonaires normaux [21], que les niveaux de transcrits pour plusieurs acteurs impliqués
dans la voie de signalisation de la S1P sont altérés en condition fibrotique in vivo [13, 14], et que les
récepteurs de la S1P pourraient influencer des cascades fibrotiques [17], le but de ce dernier chapitre
expérimental était d’évaluer si l’altération phénotypique des fibroblastes FPI se traduisait par des
altérations fonctionnelles associées à la voie de signalisation de la S1P.
127
Cette étude a pour but de répondre à ces caveas et est séparée en trois objectifs. Premièrement, les
niveaux des transcrits pour des médiateurs fibrotiques et des composantes de la voie de signalisation
de la S1P ont été caractérisés et comparés entre des fibroblastes pulmonaires primaires de patients
avec et sans FPI. Deuxièmement, nous avons évalué si la S1P module différentiellement les niveaux
de transcrits pour des médiateurs fibrotiques entre ces deux classes de fibroblastes. Finalement, nous
avons sondé le rôle du récepteur S1P3 sur les effets de la S1P par une approche pharmacologique.
6.3 Matériel et méthodes
6.3.1 Isolement, culture et stimulation des fibroblastes pulmonaires humains primaires
Pour cette étude, nous avons recruté des patients atteints de FPI cela ces critères : un diagnostic de
FPI en accord avec les recommandations de l’ATS/ERS [22], la disponibilité des tissus suites à une
biopsie, une autopsie ou une transplantation pulmonaire et ne pas être associée une fibrose secondaire
à une autre pathologie. Les tissus non-FPI proviennent de la marge saine de résections pulmonaires
de patients ayant un cancer pulmonaire ou de tissus excédentaires suite à une transplantation
pulmonaire. Ces tissus ne doivent pas présenter d’emphysème ou de fibrose associés au cancer
pulmonaire. Les expérimentations ont été approuvées par le comité d’éthique à la recherche avec des
êtres humains de l’Université Laval (protocole 21033).
Les explants de parenchyme pulmonaire ont été coupés en morceaux d’environ 1 mm2. Ces morceaux
ont été déposés et espacés dans des T-25 (Sarstedt, Nümbrecht, DE) contenant un milieu complet
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1% d’acides aminés essentiels, 1% de L-glutamine et 1% de
pénicilline/streptomycine (Wisent Bioproducts, St-Bruno, QC, CAN) avec 10% de sérum fœtal bovin
(Hyclone; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Lorsque le tapis de fibroblastes était
suffisamment étendu, les explants ont été retirés et les fibroblastes décollés avec de la
trypsine/éthylène diamine tétra-acétique (Wisent). Les passages subséquents ont été effectués à
confluence dans le même milieu. L’identité des cellules isolées est basée sur leurs caractéristiques
d’adhésion, prolifératives et morphologiques.
Pour les expériences et analyses subséquentes, les lignées ont été ensemencées dans des plaques 6
puits, à raison de 250 000 cellules par puit, dans 2 mL de milieu complet contenant 10% de sérum
foetal bovin et utilisées après 24H. Pour les analyses des niveaux de mRNA, le milieu a été remplacé
par du milieu complet sans sérum fœtal bovin pour 24H. Afin d’étudier l’impact pharmacologique
d’un inhibiteur de S1P3, le milieu a été remplacé par 2 mL de milieu complet contenant 1% de sérum
fœtal bovin sans lipides avec 1 µM de TY-52156 (antagoniste de S1P3; Cayman Chemicals, Ann
128
Arbor, MI, USA) ou son VEH pour 1H30. Ensuite, 20 µL d’une solution de 1 mM de S1P (Tocris,
Avonmouth, Bristol, UK) solubilisé dans du milieu complet contenant 4 mg/mL d’albumine sérique
bovine (Wisent) sans lipides a été ajoutée pour obtenir une concentration finale de 1 µM de S1P. Les
cellules ont été récoltées 2H plus tard pour analyses.
6.3.2 Réaction en chaine par polymérase quantitative en temps réel
Les sondes ont été achetées de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA). Les niveaux de
mRNA de TGF-β (NM_000660), CTGF (NM_001901), α-smooth muscle actin (α-SMA;
NM_001613), collagène de type I, chaine α-1 (COL1A1; NM_000088), collagène de type III, chaine
α-1 (COL3A1; NM_000090), forme épissée alternativement de la fibronectine (EDA-FN; sens : 5’ -
CCC TAA AGG ACT GGC ATT CA – 3’; antisens : 5’ – CAT CCT CAG GGC TCG AGT AG –
3’), TIMP1 (NM_003254), TIMP2 (NM_003255), S1PR1 (NM_001400.4), S1PR2 (NM_004230.3),
S1PR3 (NM_005226.3), SphK1 (NM_001142601), SphK2 (NM_020126.4), S1P lyase (SGPL1;
NM_003901.3) ont étés mesurés. La normalisation a été effectuée avec ribosomal protein, large, p0
(RPLP0; NM_001002.3), guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-Like 1 (GNB2L1;
NM_006098.4), la hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT; NM_000194.2) et la
TATA-box-binding protein (TBP; NM_003194). Les mRNA des fibroblastes ont été isolés avec la
trousse EZ-10 DNaway mRNA miniprep (Biobasic, Markham, ON, CAN) tel qu’indiqué par le
fabricant. Avec la trousse iScript Advanced cDNA Synthesis (Biorad, Hercules, CA, USA), 1 µg de
mRNA a été converti en acide désoxyribonucléique complémentaire (cDNA). La quantification a été
effectuée avec la trousse Sso Advanced SYBR Green Supermix (Biorad) sur un Rotor Gene 6000
(Corbett Life Science, Sydney, New South Wales, AUS). La différence de limite de cycle (delta-ct)
a été calculée pour chaque gène et rapportée sur la moyenne géométrique de RPLP0, GNB2L1 et
HPRT ou TBP.
6.3.3 Analyses statistiques
Les données sont exprimées avec la moyenne ± erreur type. L’homogénéité de la variance et la
normalité des résidus ont été vérifiées. Lorsqu’approprié, les variables ont été transformées en
logarithme. Les données ont été analysées avec un t-test par pairs. Les corrélations ont été
effectuées avec une régression linéaire. Les résultats sont considérés significatifs lorsque la valeur
de p < 0.05. Les analyses ont été effectuées avec Prism (V6; GraphPad, La Jolla, CA, USA.
129
6.4 Résultats
Malgré la nature hétérogène inhérente aux cultures cellulaires primaires, nos observations supportent
que les fibroblastes FPI démontrent un profile pro-fibrotique, comparativement aux fibroblastes
obtenus de la marge saine des patients atteints de cancer. Parmi les cibles investiguées, les fibroblastes
FPI expriment en moyenne significativement plus de CTGF (2.26 fois), d’α-smooth muscle actin
(2.10 fois) et la forme épissée alternativement de la fibronectine (1.24 fois) que les fibroblastes-non
FPI (Figure 6.1A). Les fibroblastes FPI montrent donc un phénotype promouvant les mécanismes
fibrotiques.
Bien que le faible nombre de lignées cellulaires ne nous ait pas permis de comparer directement les
lignées de fibroblastes FPI et non-FPI, les niveaux de mRNA des récepteurs de la S1P (S1PR1 et
S1PR3) semblent plus élevés dans 2 lignées de fibroblastes FPI. Notamment, lors de l’analyse des
groupes combinés, le niveau de transcrits de S1PR2 (Figure 6.1C) ainsi que S1PR3 (Figure 6.1D)
corrèle positivement avec ceux du CTGF, qui est surexprimé par ces cellules. Le niveau de transcrits
en mRNA de S1PR3 a aussi une association positive avec celui du TGF-β, le plus important médiateur
pro-fibrotique. Les récepteurs S1PR2 et S1PR3 pourraient donc être impliqués dans les altérations
pro-fibrotiques des fibroblastes FPI.
En regard des expériences dédiées à évaluer l’impact de la S1P sur la fonction des fibroblastes
pulmonaires primaires, nous avons observé que la S1P augmente les transcrits du CTGF (188% du
véhicule), mais diminue significativement ceux du TGF-β, du collagène de type I, chaine α-1 et du
collagène de type III, chaine α-1 (respectivement 89%, 83% et 77% du véhicule). La S1P n’affecte
pas la transcription de la forme épissée alternativement de la fibronectine (Figure 6.2). À cet effet,
nous démontrons également que l’antagoniste spécifique de S1P3, TY-52156, diminue
significativement les niveaux de transcrits du CTGF (89 % du VEH) induite par la S1P, ce qui n’a
pas été observé pour le TGF-β, le collagène de type I, chaine α-1 et le collagène de type III, chaine
α-1 (Figure 6.3A). De manière intéressante, et en accord avec la corrélation entre les niveaux de
transcrits de S1PR3 et du CTGF, nos résultats tendent à supporter que la magnitude de l’inhibition de
l’expression du CTGF induite par la S1P par l’antagoniste TY-52156 serait associée à une forte
expression de S1PR3.
130
6.5 Discussion
La S1P est un lipide signalétique augmenté dans le poumon des patients atteints de la FPI [13] qui est
impliqué dans plusieurs processus profibrotiques, dont la survie cellulaire [23], l’expression de
facteurs profibrotiques [17, 24] et la production de matrice extracellulaire [17]. In vivo, FTY720, un
analogue phosphorylable de la sphingosine, exacerbe la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine
dans un modèle murin (section V). In vitro, la S1P et le FTY720-P stimulent tous deux une réponse
profibrotique dans des fibroblastes pulmonaires normaux, ce qui peut être renversé par des
antagonistes de S1P2 ou S1P3 [17]. Nous avons montré un effet similaire sur des fibroblastes murins
3T3 par FTY720 (section V). Bien que les fibroblastes FPI soient intrinsèquement différents des
fibroblastes sains [21], ces données publiées laissaient croire que d’interférer avec la signalisation des
récepteurs de la S1P pourrait produire des effets utiles dans le contexte de la fibrose pulmonaire.
Nous avons confirmé que nos fibroblastes FPI ont un profil de transcription pro-fibrotique
comparativement aux fibroblastes primaires non-FPI [11, 25] (Figure 6.1A), tel que montré par
Ramos et al. [21]. Cependant, nous n’avons pas observé de différences significatives de la
transcription en mRNA des composantes de la voie de la S1P (Figure 6.1B), ce qui est peut-être dû à
un nombre de sujets insuffisant. Toutefois, l’analyse combinée de ces deux groupes montre une
corrélation positive des niveaux de transcrits entre S1P2 et CTGF (Figure 6.1C), entre S1P3 et CTGF
(Figure 6.1D) ainsi qu’entre S1P3 et TGF-β (Figure 6.1E). Considérant les effets profibrotiques de
S1P2 et S1P3 sur des fibroblastes normaux [17] et d’autres types cellulaires, comme les cellules
mésangiales rénales [26], la surexpression de ces deux récepteurs est possiblement liée à l’expression
de facteurs profibrotiques par les fibroblastes FPI. Malgré l’absence d’une modulation significative
de l’expression des récepteurs de la S1P, nous montrons qu’ils sont fortement exprimés sur les
fibroblastes FPI et non FPI, qu’ils pourraient moduler des cascades fibrotiques et que leur impact
pourrait dépendre de leur niveau d’expression. Ces observations sont donc partiellement compatibles
avec une approche de nature pharmacogénétique pour le traitement de la FPI.
Nous avons donc étudié l’effet de la stimulation de ces récepteurs avec leur ligand naturel, la S1P.
Similairement aux fibroblastes normaux [17], la stimulation des fibroblastes FPI avec la S1P
augmente les niveaux de mRNA du CTGF et diminue ceux du collagène de type I, chaine α-1. Les
niveaux de transcrits du collagène de type I, chaine α-1 sont aussi réduits par la S1P (Figure 6.2).
Aucun effet sur la transcription de la forme épissée alternativement de la fibronectine n’a été observé,
bien que l’augmentation observée dans la littérature puisse être spécifique à la forme normalement
épissée [17]. Toutefois, il a été observé que la S1P augmente l’accumulation de la matrice
extracellulaire produite par les fibroblastes en absence de modulation de la transcription collagène
131
[17]. Étonnamment, bien que le CTGF soit directement induit par le TGF-β [27], la S1P augmente
l’expression du premier tout en diminuant celle du second, suggérant que la S1P stimule directement
l’expression du CTGF. Toutefois, l’analyse des transcrits limite notre interprétation puisque nous ne
connaissons pas l’impact de la S1P sur la production des médiateurs étudiés et sur l’activité du TGF-
β. Il demeure aussi possible que l’augmentation du CTGF, en absence de celle du TGF-β, favorise
chez les fibroblastes un phénotype prolifératif [6], ce qui pourrait contribuer à expliquer la faible
capacité de la S1P à simultanément induire l’expression de protéines de la matrice extracellulaire
[28]. Considérant que les phénotypes invasifs et proliférateurs des fibroblastes semblent associés à la
sévérité de la pathologie [29] et que les anticorps contre le CTGF semblent efficacement contrer la
fibrose [27], nos résultats suggèrent qu’altérer la signalisation de la S1P pourrait être une avenue à
investiguer davantage.
À cet effet, l’administration de TY-52156, un antagoniste de S1P3, préalablement à celle de la S1P,
inhibe partiellement l’augmentation de la transcription du CTGF (Figure 6.3). Cette augmentation
implique donc l’activation de S1P3 par la S1P. Puisque les niveaux de transcrits du CTGF sont
associés à ceux de S1P3 (Figure 6.1D), nous spéculons qu’une thérapie anti-fibrotique inhibant S1P3
pourrait éventuellement s’appliquer chez les patients atteints de la FPI, et dont les fibroblastes
pulmonaires surexpriment ce récepteur de la S1P. Le rôle des autres récepteurs n’a pas été déterminé,
mais l’activation de S1P2 a un effet similaire et complémentaire à celui de S1P3 chez les fibroblastes
normaux [17]. L’inhibition combinée de S1P2 et S1P3 pourrait peut-être diminuer davantage la
surexpression du CTGF par la S1P, ce qui reste à être étudié. Malgré que la S1P diminue les niveaux
en mRNA du TGF-β, du collagène de type I, chaine α-1 et du collagène de type III, chaine α-1, TY-
52156 ne rétablit pas cette diminution, ce qui pourrait s’expliquer par le fait que leur modulation
s’effectue par un autre récepteur, ou qu’elle en est indépendante.
132
6.6 Conclusion
En accord avec la littérature, les fibroblastes FPI ont des niveaux de transcrits élevés pour plusieurs
médiateurs profibrotiques comparativement à des fibroblastes non-FPI. Les fibroblastes FPI
transcrivent davantage de CTFG, ce qui peut être exacerbé par la présence de S1P. Cet effet est, au
moins en partie, accompli par S1P3 et est partiellement réversible par l’administration d’un
antagoniste spécifique. L’activation de ce récepteur pourrait donc contribuer aux mécanismes sous-
jacents à la FPI chez les patients présentant des lésions où la surexpression des récepteurs de la S1P
est présente.
6.6.1 Financement
J’ai reçu une bourse du RSR et du FRQS. Ce projet de recherche a été supporté la Fondation de
l’IUCPQ, les Fonds sur les maladies respiratoires J.-D.-Bégin - P.-H.-Lavoie et les Fonds Alphonse
L’Espérance.
133
6.7 Références
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135
6.8 Figures
136
Figure 6.1 : Niveaux de transcrits de médiateurs fibrotiques et des composantes de la voie de la
S1P par des fibroblastes pulmonaires humains provenant de patients atteints de la FPI ou non
Les fibroblastes pulmonaires primaires ont été incubés pendant 24H dans du milieu sans sérum fœtal
bovin. Les données ont été normalisées selon les niveaux en mRNA de la ribosomal protein, large,
p0, la guanine nucleotide binding protein beta et la hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase. α-SMA : α-smooth muscle actin; COL1A1 : collagène de type I, chaine
α-1; COL3A1 : collagène de type III, chaine α-1; CTGF : Connective tissue growth factor; EDA-FN :
la forme épissée alternativement de la fibronectine; FPI : Fibrose pulmonaire idiopathique; S1PR1-
3 : Gènes des récepteurs 1 à 3 de la sphingosine-1-phosphate; SGPL1 : S1P lyase; SphK1-2 :
Sphingosine kinase 1 et 2; TIMP1-2 : Inhibiteurs des métalloprotéinases matricielles 1 et 2; TGF- β :
Transforming growth factor-β Carte thermique d’expression relative en mRNA exprimée en
logarithme de A) médiateurs fibrotiques et B) composantes de la voie de la sphingosine. L’échelle
représente le delta entre la lignée et la moyenne des transcrits des fibroblastes non-FPI, la couleur
verte étant une surreprésentation et la couleur rouge une sous-représentation. Corrélation linéaire de
l’expression en mRNA C) entre S1PR2 et CTGF, D) entre S1PR3 et CTGF et E) entre S1PR3 et TGF-
β.; * : p<0.05; n=3.
137
Figure 6.2 : La S1P module les niveaux de transcripts de certains médiateurs fibrotiques
Plusieurs lignées de fibroblastes pulmonaires primaires provenant de patients atteints de la FPI ont
été préincubées pendant 1H30 dans du milieu complet contenant 1% de sérum fœtal bovin sans
lipides. Puis, ces cellules ont été incubées avec le même milieu contenant 1 µM de S1P pendant 2H.
La normalisation a été effectuée sur la moyenne géométrique des niveaux en mRNA de la ribosomal
protein, large, p0, la guanine nucleotide binding protein beta et la TATA-box-binding protein. Les
statistiques ont été effectuées avec un test de Student pairé. 5 lignées cellulaires, 1-2 puits par lignée.
* : p<0.05. COL1A1 : collagène de type I, chaine α-1; COL3A1 : collagène de type III, chaine α-1;
CTGF : Connective tissue growth factor; EDA-FN : la forme épissée alternativement de la
fibronectine; FPI : Fibrose pulmonaire idiopathique; TGF- β : Transforming growth factor-β;
138
Figure 6. 3 : Un antagoniste de S1P3, TY-52156, diminue la surexpression du CTGF induite
par la S1P
Plusieurs lignées de fibroblastes pulmonaires primaires provenant de patients atteints de la FPI ont
été préincubées pendant 1H30 dans du milieu complet contenant 1% de sérum fœtal bovin sans lipides
et 1 µM de TY-52156 (TY). Puis, ces cellules ont été incubées avec le même milieu contenant 1 µM
de sphingosine-1-phosphate (S1P). La normalisation a été effectuée sur la moyenne géométrique des
niveaux en mRNA de la ribosomal protein, large, p0, la guanine nucleotide binding protein beta et
la TATA-box-binding protein. COL1A1 : collagène de type I, chaine α-1; COL3A1 : collagène de
type III, chaine α-1; CTGF : Connective tissue growth factor; FPI : Fibrose pulmonaire idiopathique;
S1P3 : Récepteur 3 de la sphingosine-1-phosphate; TGF- β : Transforming growth factor-β; 5 lignées
cellulaires, 1-2 puits par lignée. * : p<0.05.
139
7. Chapitre VII : Discussion générale
Le poumon assure les échanges gazeux. Constamment exposé aux contaminants de l’air, il assure
aussi la fonction de barrière physique et immunologique. Le maintien de ces fonctions est largement
en fonction de la structure du poumon. Le remodelage pulmonaire est donc une composante
fondamentale de l’asthme allergique et de la fibrose pulmonaire. Cependant, le contrôle et la
résorption du remodelage pulmonaire constituent des défis thérapeutiques de taille et les options sont
couramment limitées [6, 37]. Plusieurs des mécanismes sous-jacents au remodelage, comme
l’inflammation, la prolifération/apoptose et l’expression de médiateurs inflammatoires et fibrotiques
[38, 306], peuvent être modulés par la voie de signalisation de la S1P et par les analogues de la
sphingosine [280, 284, 302]. D’ailleurs, la S1P est augmentée aussi bien dans l’asthme allergique
[266] que dans l’IPF [288]. De plus, l’analogue de la sphingosine FTY720 est déjà utilisé pour le
traitement d’une maladie auto-immune, la sclérose en plaques [250]. En raison de l’implication
potentielle de ces médiateurs dans les mécanismes de remodelage tissulaire, et puisqu’un éventail de
composés pharmacologiques de plus en plus élargi pour moduler les sphingolipides et leurs récepteurs
est disponible, cette thèse a donc examiné les effets des sphingolipides et de leurs analogues sur
les mécanismes de remodelage pulmonaire observés dans l’asthme allergique et la FPI.
7.1 Les effets des analogues de la sphingosine sur l’inflammation allergique dans l’asthme.
L’une des caractéristiques cardinales de l’asthme allergique, l’asthme le plus commun, est une
inflammation du type Th2. En plus de contribuer directement aux symptômes de l’asthme, elle est
une précurseure majeure du remodelage pulmonaire [38]. Il a été montré que l’administration
d’analogues de la sphingosine en prophylaxie inhibe l’inflammation Th2 en interférant avec la
sensibilisation en interférant avec la migration des cellules dendritiques aux ganglions lymphatiques
drainants, la présentation subséquente de l’antigène et la prolifération des lymphocytes [279].
Cependant, le traitement de l’asthme allergique en prophylaxie n’est pas applicable en pratique et
offre ainsi un potentiel thérapeutique limité. Conséquemment, l’étude présentée au chapitre III avait
pour but de déterminer la capacité des analogues de la sphingosine à réduire l’inflammation préétablie
dans un modèle d’asthme aigu.
Pour cette étude, un modèle d’asthme allergique induit par l’administration intranasale d’un
homogénat d’acariens domestiques a été préféré au modèle classique impliquant une sensibilisation
intrapéritonéale à l’ovalbumine. Le modèle utilisant les antigènes d’acariens domestiques,
140
naturellement allergéniques, réplique mieux les caractéristiques d’expositions et de sensibilisations
observées dans le développement de l’asthme allergique chez l’humain. En effet, et contrairement à
l’ovalbumine, les antigènes d’acariens induisent une réponse allergique de polarité Th2 lorsqu’ils
sont administrés directement dans les voies aériennes. Il est important de noter que plusieurs facteurs
supportent que le développement de la réponse acquise dans le tissu pulmonaire puisse influencer les
mécanismes de régulation et de persistance de l’asthme [307]. Il est ainsi important de se rallier aux
recommandations de nos pairs [89] et d’investiguer l’impact de la modulation des sphingolipides dans
un modèle d’asthme qui réplique de manière plus fidèle les étapes de sensibilisation et d’exacerbation
qui sont présumées chez l’humain. La caractérisation de ce modèle a permis de définir la délimitation
temporelle de la sensibilisation et du développement d’une inflammation de type Th2 au poumon.
Cette approche a permis de déterminer le potentiel thérapeutique des analogues de la sphingosine
spécifiquement sur l’inflammation allergique post-sensibilisation.
Nous avons montré que l’analogue phosphorylable de la sphingosine AAL-R inhibe fortement les
signes de l’asthme allergique. AAL-R diminue l’hyperréactivité bronchique chez les souris ayant reçu
des antigènes d’acariens domestiques, sans affecter négativement les souris naïves. L’accumulation
des éosinophiles et des facteurs pro-inflammatoires IL-5 et IL-13 dans le lavage bronchoalvéolaire
est aussi réduite. Contrairement à l’administration d’analogue de la sphingosine en prophylaxie,
l’administration de AAL-R après la sensibilisation affecte peu ou pas les populations cellulaires des
ganglions lymphatiques drainants. Seuls les lymphocytes T CD4+ sont significativement diminués,
quoique cette diminution est minimale. La prolifération et l’apoptose des lymphocytes ne sont pas
affectées dans ce tissu. En somme, ces résultats suggèrent que le mécanisme par lequel les analogues
de la sphingosine diminuent l’inflammation préétablie est différent du mécanisme observé pendant la
sensibilisation.
Toutefois, et tel qu’observé lorsque les analogues de la sphingosine sont administrés en prophylaxie,
nous avons observé qu’AAL-R diminue l’accumulation des lymphocytes T CD4+ et B, ainsi que des
cellules dendritiques, dans le tissu pulmonaire. Cette diminution est accompagnée de l’augmentation
spécifique de l’apoptose des lymphocytes T CD4+ et B. Malheureusement, nous n’avons a été en
mesure de déterminer l’impact d’AAL-R sur l’apoptose des cellules dendritiques et des éosinophiles,
bien que nos résultats n’indiquent pas que l’apoptose des granulocytes en général soit affectée.
Étonnamment, le potentiel anti-inflammatoire et pro-apoptotique d’AFD-R, la forme
préphosphorylée d’AAL-R, est inférieur à ce dernier. Cette observation est compatible avec les
travaux de Don et al. [284] montrant qu’AAL-R, mais pas AFD-R, est en mesure d’induire l’apoptose
des lymphocytes T Jurkat. Cet effet pro-apoptotique est en fonction de la phosphorylation
141
intracellulaire d’AAL-R et la subséquente accumulation d’AFD-R dans le réticulum endoplasmique.
L’administration exogène d’AFD-R ne permet pas son accumulation intracellulaire, car sa polarité
lui empêche de traverser la membrane cellulaire efficacement [255]. Bien que nos résultats suggèrent
un mécanisme similaire, d’autres expérimentations seraient requises afin d’éliminer des hypothèses
alternatives, comme l’accumulation d’AFD-R dans les mitochondries ou l’interférence avec la
synthétisation ou la dégradation de sphingolipides.
L’administration prophylactique d’AAL-S, l’analogue non phosphorylable d’AAL-R, diminue aussi
l’inflammation éosinophilique et l’accumulation pulmonaire de lymphocytes pulmonaires dans un
modèle similairement induit par les antigènes d’acariens [282]. Même s’il est largement moins
efficace qu’AAL-R, AAL-S peut aussi induire l’apoptose des lymphocytes T Jurkat [284]. De plus,
AAL-R et AAL-S sont tous deux des inhibiteurs de la SphK1 dont l’inhibition augmente l’apoptose
de certaines cellules, comme les cellules cancéreuses de la leucémie [308]. Comme une proportion
des effets observés d’AAL-R pourrait être attribuable à des mécanismes indépendants de sa
phosphorylation, il est nécessaire de comparer les effets d’AAL-S à ceux d’AAL-R dans notre modèle
d’asthme allergique. De plus, la déphosphorylation d’AFD-R in vivo ne permet pas d’apprécier à sa
juste valeur la différence entre les analogues phosphorylables et préphosphorylés. La stimulation de
lymphocytes isolés du poumon avec les différents analogues permettrait de mieux différencier leurs
effets individuels sur la survie cellulaire. Ces expérimentations éclairciraient le rôle du statut
phosphorylatoire des analogues de la sphingosine sur l’induction de l’apoptose des lymphocytes
pulmonaires.
L’étude présentée au chapitre III possède toutefois certaines limitations, attribuables soit au modèle,
soit aux composés pharmacologiques utilisés. Bien que la phase post-sensibilisation ait été ciblée
avec soin, il n’est pas possible d’exclure complètement l’effet des analogues de la sphingosine sur la
migration et la présentation antigénique des cellules dendritiques. De plus, les analogues de la
sphingosine peuvent induire la séquestration des lymphocytes dans les organes lymphoïdes
secondaires [309]. Cette séquestration pourrait être évaluée par la mesure de l’accumulation des
lymphocytes dans les ganglions lymphatiques non drainants. Toutefois, comme la séquestration des
lymphocytes est médiée par S1P1 et que son agoniste AFD-R diminue l’inflammation allergique
moins efficacement qu’AAL-R, cette séquestration ne semble pas être le principal mécanisme
d’action d’AAL-R dans notre modèle. Comme la S1P peut directement induire la contraction du
muscle lisse bronchique [310], un analogue de la sphingosine pourrait aussi directement la moduler.
Bien que les analogues de la sphingosine diminuent l’hyperréactivité bronchique in vivo, l’effet direct
d’AAL-R sur le muscle lisse bronchique n’a pas été exploré. Il n’est donc pas possible de dissocier
142
le rôle d’AAL-R sur la contraction directe et indirecte du muscle lisse bronchique. Finalement, notre
étude ne permet pas de déterminer la proportion de l’effet anti-inflammatoire d’AAL-R attribuable à
l’apoptose des lymphocytes pulmonaires contre ses effets directs sur l’activité et l’accumulation des
autres cellules immunitaires, comme les granulocytes et les cellules dendritiques.
En somme, le chapitre III suggère qu’un analogue phosphorylable de la sphingosine interfère avec
l’inflammation allergique par des mécanismes différents entre la phase de sensibilisation et la phase
allergique. Bien que la comparaison avec le modèle d’ovalbumine et d’antigènes d’acariens
domestiques soit imparfaite, je spécule que l’impact des analogues de la sphingosine donnés en
prophylaxie interfère préférentiellement avec la présentation de l’antigène, tandis qu’ils induisent
l’apoptose locale des lymphocytes accumulés au poumon dans le cas où l’inflammation est déjà
présente. Puisque la lymphopénie induite par les analogues de la sphingosine affecte
préférentiellement les lymphocytes naïfs [311], nous avons tenté de déterminer si l’impact pro-
apoptotique des analogues de la sphingosine était dépendant de l’état d’activation de ces derniers.
Bien qu’il ait été rapporté par Enosawa et al. [312] que FTY720 induit l’apoptose préférentielle des
lymphocytes activés, la sélectivité exacte de l’effet pro-apoptotique de FTY720 demeure mal connue.
Il sera primordial de déterminer si les analogues de la sphingosine induisent l’apoptose des
lymphocytes naïfs, car cela pourrait affecter la diversité des lymphocytes, et donc la capacité générale
du système immunitaire à répondre à de nouveaux pathogènes.
La capacité d’AAL-R à interférer avec l’inflammation allergique dans un modèle chronique a été
abordée dans la publication présentée au chapitre IV. Similairement aux observations faites au
chapitre III, AAL-R diminue fortement l’inflammation éosinophilique chronique. Malheureusement,
les effets du statut phosphorylatoire des analogues de la sphingosine sur l’hyperréactivité bronchique
et l’apoptose des lymphocytes n’ont pas été investigués. Bien qu’il soit probable que AAL-R
augmente aussi l’apoptose des lymphocytes dans un modèle chronique, cette démonstration
augmenterait l’intérêt thérapeutique des analogues phosphorylables de la sphingosine dans l’asthme
allergique. Nous pouvons cependant affirmer qu’AAL-R conserve son potentiel anti-inflammatoire
même dans un modèle d’asthme chronique allergique accompagné de remodelage bronchique.
143
7.2 Les effets des analogues de la sphingosine sur le remodelage bronchique dans l’asthme
Le remodelage bronchique est promu par l’exposition aux antigènes et l’inflammation chronique dans
l’asthme allergique [38], dont l’épaississement du muscle lisse bronchique, et contribue à la sévérité
de l’asthme [44]. Les traitements anti-inflammatoires interfèrent avec la progression du remodelage
chez l’humain et il a été montré que les corticostéroïdes peuvent diminuer le remodelage bronchique
dans l’obstruction bronchique récurrente chevaline [39], un syndrome similaire à l’asthme. Toutefois,
les anti-inflammatoires ne permettent pas la résorption de cet épaississement chez l’humain [37],
supportant que chez l’humain, l’inflammation ne soit la seule cause du maintien du remodelage
bronchique. De plus, les cibles thérapeutiques visant directement les mécanismes favorisant le
maintien du muscle lisse bronchique remodelé, comme la balance proliférative et apoptotique, sont
accablement limitées [38]. La voie de la S1P est intrinsèquement liée à la prolifération et à l’apoptose
[313]. En contrepartie, les analogues de la sphingosine peuvent interférer avec plusieurs mécanismes
promouvant la prolifération et directement induire l’apoptose de certains types cellulaires [284]. La
capacité des analogues de la sphingosine à réduire l’épaisseur du muscle lisse bronchique dans un
modèle d’asthme chronique a donc été étudiée au chapitre IV.
Nous avons utilisé un modèle d’asthme allergique chronique induit par l’administration d’un
homogénat d’acariens domestiques sur une période de cinq semaines, ce qui est suffisant pour induire
l’épaississement du muscle lisse bronchique. L’exposition à l’allergène a été interrompue une
semaine avant l’administration des traitements pharmacologiques afin de permettre à l’inflammation
aiguë de se résorber. Cette approche permet de réduire profondément l’influence de l’inflammation
et de mieux cibler les processus maintenant le remodelage du muscle lisse bronchique
indépendamment de l’inflammation aiguë. Nous avons ainsi montré que l’analogue phosphorylable
de la sphingosine AAL-R diminue fortement l’hyperréactivité bronchique dans ces conditions, ce qui
n’est répliqué ni par AAL-S, ni par la dexaméthasone. AAL-R réduit aussi l’épaisseur du muscle lisse
bronchique et diminue l’hyperréactivité bronchique. Puisque la dexaméthasone est un anti-
inflammatoire puissant et n’a pas eu d’effet bénéfique dans notre modèle, les résultats indiquent que
l’impact d’AAL-R n’est pas, ou du moins totalement, attribuable au contrôle de l’inflammation.
L’inefficacité d’AAL-S écarte l’hypothèse de la modulation de la protein phosphatase 2A [282] et
suggère que les effets de AAL-R dépendent plutôt de sa phosphorylation en AFD-R. Ainsi, nos
résultats suggèrent qu’AAL-R réduit l’hyperactivité bronchique en favorisant directement la
résorption de l’épaississement du muscle lisse bronchique. Il est toutefois important de noter que la
mesure de l’épaisseur du muscle lisse demeure un défi dans la souris, en raison de sa faible quantité
et de l’hétérogénéité de l’enroulement des muscles autour des bronches, ce qui a certainement
144
contribué à la grande variabilité de cette mesure dans notre étude. Une méthode plus fiable pouvant
être utilisée à grande échelle aurait certainement contribué à améliorer le lien potentiel entre les effets
spectaculaires d’AALR sur la fonction pulmonaire et son impact sur le muscle lisse bronchique.
Pour pallier à cette contrainte, nous avons étudié l’effet des analogues de la sphingosine sur la
prolifération et l’apoptose de cellules musculaires lisses bronchiques humaines in vitro en réponse au
sérum fœtal bovin, un agent mitotique puissant. Dans un environnement non inflammatoire,
l’administration d’une concentration atteignable in vivo (1 µM) d’AAL-R réduit la prolifération des
cellules musculaires lisses, mais pas AAL-S ou AFD-R. Il est important de souligner que
l’administration d’une dose supérieure (10 µM) d’AAL-R induit l’apoptose presque totale des cellules
musculaires lisses bronchiques. L’administration de 1 µM d’AAL-R augmente aussi l’apoptose de
ces cellules, mais la magnitude de l’effet est minime et ne permet pas d’expliquer la diminution de la
prolifération mesurée par l’incorporation de bromodeoxyuridine. Malgré que l’effet d’AAL-R semble
être relié à sa capacité à être phosphorylé, AFD-R n’interfère pas avec la prolifération des cellules
musculaires lisses. À priori, ces résultats semblent contradictoires, mais il a été montré qu’AFD-R ne
pénètre que faiblement les membranes cellulaires en accord avec sa nature polaire. Puisque d’AFD-
R est peu susceptible à la déphosphorylation, qui pourrait permettre son internalisation sous la forme
AAL-R, ses effets demeurent majoritairement extracellulaires in vitro.
Ces résultats suggèrent que la phosphorylation intracellulaire des analogues de la sphingosine est
nécessaire à leur effet cytostatique. Cette hypothèse est compatible avec le fait que les analogues de
la sphingosine sont connus pour interférer avec le métabolisme des sphingolipides [314]. D’une part,
nous avons observé qu’AAL-R, mais pas AAL-S ni AFD-R, augmente la S1P intracellulaire.
Toutefois, l’augmentation de la S1P intracellulaire par l’inhibition de l’enzyme la dégradant, la S1P
lyase, ne permet pas de répliquer les effets anti-proliférateurs d’AAL-R. D’un autre côté, aucun des
analogues de la sphingosine ne module la quantité de céramides pro-apoptotiques [315]. Par
conséquent, la modulation de la voie de la S1P ne semble pas impliquée dans les effets d’AAL-R.
Par elle-même, l’accumulation intracellulaire d’AFD-R peut interférer avec les mécanismes de la
survie cellulaire [284] et, de fait, seule l’administration d’AAL-R résulte en l’accumulation d’AFD-
R intracellulaire. AAL-R interfère donc avec la prolifération des cellules musculaires lisses
bronchiques humaines par sa phosphorylation intracellulaire et la subséquente accumulation de sa
forme phosphorylée, AFD-R.
Certaines limites de l’étude présentée au chapitre IV doivent toutefois être soulignées. La mesure
histologique de l’épaisseur, de l’hyperplasie et de l’hypertrophie du muscle lisse bronchique chez les
145
souris est particulièrement ardue au point de vue technique. Premièrement, seules les premières
divisions bronchiques peuvent être réalistement mesurées et seules les bronches coupées
transversalement sont valides. Deuxièmement, le nombre de cellules contenues dans les anneaux de
muscle lisse est faible et ne permet pas d’obtenir des mesures d’hyperplasie et d’hypertrophie
reproductibles et robustes. L’absence de mesure de l’épaisseur du muscle lisse bronchique en
présence d’AAL-S et de dexaméthasone est reliée à ces problèmes techniques. La comparaison de la
réduction de l’épaisseur du muscle lisse bronchique par AAL-R, AAL-S et la dexaméthasone aurait
permis de supporter notre hypothèse que AAL-R diminue directement cet épaississement in vivo.
Répliquer ces expérimentations dans un modèle animal de plus grosse taille, comme le rat, permettrait
de directement déterminer l’effet de AAL-R sur la prolifération et l’apoptose des cellules du muscle
lisse bronchique.
Les expérimentations in vitro ont aussi certaines limites. Bien que l’accumulation intracellulaire de
S1P ait été exclue pour expliquer l’effet cytostatique de AAL-R, l’hypothèse de l’inhibition de
l’export de la S1P dans le milieu extracellulaire n’a été que partiellement adressée. Les cellules
musculaires lisses bronchiques humaines expriment trois des récepteurs membranaires de la S1P,
S1P1, S1P2 et S1P3, qui peuvent tous être activés par la S1P extracellulaire. Toutefois, seul l’effet
d’un antagoniste de S1P1 et S1P3 a été étudié, ce qui ne permet pas d’éliminer l’implication de S1P2
dans l’effet de AAL-R. Il faut toutefois noter que l’activation de S1P2 est généralement associée à des
effets antiprolifératifs. De plus, l’antagoniste de S1P1 et S1P3 utilisé, VPC-23019, a une affinité avec
S1P1 environ 100 fois supérieure à S1P3. Il est possible que l’inhibition de ce dernier soit trop faible
pour détecter une différence appréciable expérimentalement. D’autres outils pharmacologiques
spécifiques avec une affinité supérieure sont disponibles, comme l’antagoniste de S1P1 W146 et
l’antagoniste de S1P3 TY-51256. Le rôle de S1P2 pourrait être évalué à l’aide de l’antagoniste
spécifique JTE-013 et de l’agoniste CYM-5520. Ces expérimentations confirmeraient que la S1P
extracellulaire n’est pas impliquée dans l’effet cytostatique d’AAL-R, via son impact sur les niveaux
de S1P.
Le mécanisme antiprolifératif de l’accumulation de AFD-R intracellulaire est inconnu. L’hypothèse
de l’augmentation du stress du réticulum endoplasmique a été avancée pour expliquer les effets pro-
apoptotiques d’AAL-R sur les cellules Jurkat [284]. Toutefois la mesure du stress du réticulum était
indirecte et nous ne sommes pas en mesure actuellement d’observer cette augmentation dans les
cellules musculaires lisses en culture. D’autres mécanismes pouvant être impliqués devront être
investigués, incluant l’altération des fonctions mitochondriales [217]. En effet, la SphK2 est aussi
localisée dans les mitochondries et se lie à PHB2, une protéine reliée à fonction des mitochondries
146
[316]. La production d’ATP par les mitochondries est une composante importante du cycle cellulaire
et l’inhibition de cette production ralentit l’entrée des cellules dans la phase S [317]. Les effets
cytostatiques d’AAL-R pourraient aussi être expliqués par l’expression différentielle de la principale
enzyme phosphorylant les analogues de la sphingosine, SphK2. Des données récemment générées au
laboratoire de Dr Marsolais montrent que l’immunoréactivité de la SphK2 est augmentée en condition
proliférative ce qui pourrait favoriser l’accumulation d’AFD-R dans les cellules en prolifération. De
plus, la quantification des céramides effectuée au chapitre IV ne permet pas de déterminer la nature
des espèces de la céramide et leur possible modulation qualitative et non quantitative. Ce détail est
important, car les diverses espèces de la céramide ont des effets différentiels sur les mécanismes de
la survie cellulaire [318-320] et les analogues de la sphingosine modulent inégalement les niveaux
ces espèces [260]. En somme, plusieurs mécanismes pourraient être impliqués dans les effets
cytostatiques de AAL-R et devront être explorés afin de mieux comprendre l’impact de cette classe
d’agent sur la biologie cellulaire du muscle lisse bronchique.
En plus de l’épaississement du muscle lisse bronchique, le remodelage bronchique dans l’asthme
implique aussi la déposition de fibrose sous-épithéliale, l’accumulation des cellules caliciformes et
les altérations à l’épithélium bronchique. La déposition de collagène sous-épithélial est augmentée
dans un modèle similaire d’asthme chronique induit par les antigènes d’acariens [82]. Au chapitre III,
nous avons aussi montré qu’AAL-R diminue l’accumulation des cellules à mucus ainsi que
l’hypertrophie épithéliale dans un modèle d’asthme aigu. Cependant, ces derniers n’ont pas été
approfondis dans notre modèle d’asthme chronique, car ces altérations sont majoritairement résorbées
deux semaines après la dernière exposition à l’antigène. Ces analyses requéraient d’effectuer des
modifications à notre modèle chronique afin de déterminer l’impact d’AAL-R sur ces paramètres.
Nous pouvons toutefois affirmer que AAL-R n’a pas induit d’altérations épithéliales appréciables
suivant le protocole chronique.
Sur la base des données du chapitre V, montrant que les analogues phosphorylables de la sphingosine
augmentent la fibrose dans un modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, AAL-R
devrait hypothétiquement augmenter la fibrose dans le contexte d’asthme chronique. En effet, la S1P
stimule aussi la production de matrice extracellulaire par les fibroblastes [302] et l’expression de
médiateurs profibrotiques par les cellules musculaires lisses bronchiques [321]. À priori, nous
n’avons pas obtenu de résultats compatibles avec cette notion dans le contexte de l’asthme. D’un côté,
AAL-R améliore les fonctions pulmonaires et, d’un autre côté, nous n’avons pas noté de lésions
fibrotiques appréciables en réponse à AAL-R dans nos conditions expérimentales. Cette hypothèse
serait plus adéquatement testée par une approche expérimentale adaptée, incluant des mesures
147
spécifiquement conçues pour évaluer le contenu en collagène des bronches, ainsi que des modèles
impliquant des animaux de plus grandes tailles. Malgré les effets d’AAL-R sur ces composantes du
remodelage bronchique observés dans d’autres modèles, ils sont incertains dans un modèle d’asthme
chronique. Considérant les différences des mécanismes sous-jacents au remodelage dans l’asthme et
la fibrose pulmonaire, il est possible que les mécanismes fibrotiques de la fibrose dans l’asthme soient
insensibles aux analogues de la sphingosine.
7.3 Les effets des analogues de la sphingosine sur la fibrose pulmonaire.
La fibrose pulmonaire est une conséquence importante de plusieurs maladies pulmonaires
interstitielles. Bien que l’inflammation soit impliquée dans la progression de plusieurs de ces
maladies, elle n’est généralement pas nécessaire au maintien de la fibrose [7], comme dans le cas de
la FPI. De fait, les traitements anti-inflammatoires sont inefficaces et les traitements visant les
processus fibrotiques sont très limités [116]. Il y a donc un besoin criant d’explorer de nouvelles
cibles thérapeutiques. La S1P, ainsi que la SphK1, est augmentée dans le poumon des patients atteints
de la FPI [288]. Dans les modèles expérimentaux, la diminution de la S1P est associée à une
diminution de la fibrose pulmonaire [289, 292]. Cependant, les effets des analogues de la sphingosine
sont controversés, car des effets bénéfiques aussi bien que néfastes ont été observés dans différents
modèles de fibrose pulmonaire murine [296, 299]. Comme les analogues de la sphingosine sont des
anti-inflammatoires puissants, nous avons déterminé leurs effets sur l’inflammation et les processus
fibrotiques afin d’élucider cette contradiction.
Nous avons confirmé les limites temporelles des phases d’inflammation et de fibrose dans un modèle
de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine. Tel que montré par Moeller et al. [190], nous avons
confirmé que la phase inflammatoire se situe entre les jours 0 et 7 après l’administration d’une dose
de bléomycine et la phase fibrotique évolue entre les jours 14 et 21. Nous avons ensuite comparé les
effets d’une faible dose de FTY720 entre ces deux phases. La période de transition entre les jours 7
et 14 a été évitée afin de réduire le chevauchement de l’inflammation et de la fibrose. Ainsi nous
avons montré que, lorsqu’administré pendant la phase inflammatoire, FTY720 réduit fortement l’aire
fibrotique du poumon en plus de diminuer la rigidité pulmonaire. Cette observation concorde avec
les résultats similaires observés dans un autre modèle de blessure pulmonaire. Toutefois, nous avons
révélé qu’au contraire, l’administration de FTY720 en phase fibrotique augmente la rigidité du
poumon et la proportion du poumon atteint par la fibrose pulmonaire. Nos résultats renforcent le
potentiel thérapeutique de FTY720 pour le traitement des blessures pulmonaires aiguës comme
148
suggéré par Quian et al. [296] et autres [322] et supportent que l’utilisation du FTY720 dans cette
optique bénéficierait de son arrêt après la résorption de l’inflammation aiguë et avant la phase de
remodelage. Toutefois, les effets d’un traitement en continu avec FTY720 restent à être évalués afin
de confirmer cette hypothèse.
Plusieurs mécanismes reliés à la fibrose pulmonaire sont modulés par la S1P et les analogues de la
sphingosine. Premièrement, la S1P diminue la perméabilité vasculaire pulmonaire, tout comme des
faibles doses des analogues de la sphingosine [259]. À l’inverse, à fortes doses, FTY720 augmente la
perméabilité vasculaire et exacerbe la fibrose pulmonaire [259, 299], ce qui serait en partie causé par
un phénomène d’antagonisme fonctionnel sur S1P1 [299]. Toutefois, les concentrations d’analogues
de la sphingosine utilisées sont de plusieurs fois supérieures à ce qui est normalement accepté et ne
représente ainsi pas une situation représentative de son leur utilisation expérimentale et clinique.
Puisque qu’il est bien connu que des doses supra-physiologiques des analogues de la sphingosine
induisent des effets pro-apoptotiques, et même cytotoxiques, l’augmentation apparente de la
perméabilité vasculaire au poumon observée dans cette étude, ainsi que l’exactitude de la conclusion,
est remise en question.
Ainsi, nous avons donc déterminé l’effet d’une dose plus physiologique de FTY720 sur
l’extravasation du contenu sanguin dans le lavage bronchoalvéolaire, comparativement à des doses
connues pour augmenter la perméabilité vasculaire [299]. Tel qu’attendu, nous avons répliqué les
fortes accumulations d’albumine dans les lavages bronchoalvéolaires en réponse à des concentrations
toxiques de FTY720, reflétant l’exacerbation de la blessure pulmonaire sévère. Toutefois, à des doses
fréquemment utilisées pour induire une immunomodulation [280], nous démontrons que la
perméabilité vasculaire induite par la bléomycine tend à être diminuée par FTY720. Par conséquent,
nous stipulons que l’augmentation de la perméabilité vasculaire n’est probablement pas un facteur
impliqué dans l’augmentation de la fibrose pulmonaire lorsque FTY720 est administré en phase
fibrotique et à une dose non toxique.
Ce résultat nous a redirigés vers l’étude de la modulation des médiateurs profibrotiques par FTY720.
In vivo, l’administration de FTY720 pendant la phase fibrotique augmente les niveaux de mRNA du
CTGF, qui est fortement impliqué dans la progression et le maintien de la fibrose [121]. Étonnement,
bien que le TGF-β soit un médiateur central de la fibrose et induit directement l’expression du CTGF,
ses niveaux de transcrits ne sont pas modifié par FTY720. Cette observation est compatible avec les
résultats de Sobel et al. [302] montrant que FTY720 induit la transcription du CTGF par les
fibroblastes, in vitro. En somme, les analogues de la sphingosine exacerbent la fibrose pulmonaire,
non pas via l’augmentation de la perméabilité vasculaire au poumon, mais probablement en favorisant
149
des mécanismes profibrotiques à l’échelle locale, incluant l’augmentation de la transcription du
CTGF par les fibroblastes.
D’ailleurs, il est reconnu que les fibroblastes FPI ont un phénotype différent des fibroblastes non-FPI.
La S1P et les analogues de la sphingosine favorisent l’expression de la matrice extracellulaire et de
facteurs profibrotiques par les fibroblastes non-FPI in vitro [323] et dans le poumon fibrotique in vivo
[290], mais leurs effets sur les fibroblastes FPI sont inconnus. Afin d’étudier l’impact des modulateurs
de la voie signalétique de la S1P en contexte de fibrose chez l’humain, nous avons isolé des
fibroblastes FPI et non-FPI. Nous avons premièrement confirmé que les fibroblastes FPI isolés ont
une augmentation des niveaux de transcrits du CTGF, de la forme épissée alternativement de la
fibronectine et de l’α-smooth muscle actin, le marqueur de différentiation des fibroblastes en
myofibroblastes. L’altération des niveaux des composantes de la voie de signalisation n’a pas pu être
déterminée en partie par le faible nombre des lignées de fibroblastes accessible. Toutefois, nous avons
observés que les niveaux de transcrits de S1PR2 et S1PR3 corrèlent positivement avec ceux du CTGF.
Bien que nous ne puissions pas nous prononcer sur profil d’expression de la voie de la S1P des
fibroblastes FPI, il semble qu’elle est impliquée dans leur régulation de mécanismes profibrotiques.
D’ailleurs, nous avons montré que la S1P augmente les niveaux de transcrits du CTGF, mais diminue
ceux du collagène. L’augmentation de la transcription du CTGF est partiellement réversible par
l’administration d’un antagoniste spécifique de S1P3. Ainsi, nos résultats suggèrent que la S1P
favorise un phénotype profibrotique en partie par l’activation de S1P3, ce qui pourrait amplifier la
fibrose pulmonaire dans la FPI si la surexpression de ce récepteur est confirmée chez une proportion
significative des patients atteints de cette maladie.
Certains mécanismes inexplorés des analogues de la sphingosine pourraient aussi être impliqués dans
leurs effets profibrotiques. L’accumulation des fibroblastes pulmonaires est l’un des principaux
facteurs aggravant la fibrose pulmonaire, en partie par l’augmentation de leur résistance à l’apoptose
[166, 323]. Tel que montré précédemment, les analogues de la sphingosine altèrent profondément la
balance proliférative et apoptotique de plusieurs types cellulaires [284]. Des résultats préliminaires
suggèrent que les fibroblastes normaux sont susceptibles aux effets cytostatiques d’AAL-R, mais
cette observation n’a pas été confirmée avec des fibroblastes FPI. Il serait nécessaire de déterminer
les effets des analogues de la sphingosine sur l’accumulation des fibroblastes fibrotiques in vivo et in
vitro. Bien que la diminution de la prolifération des fibroblastes soit à priori bénéfique, la capacité
proliférative de ces derniers est hétérogène [187]. Les fibroblastes au cœur des lésions fibrotiques
prolifèrent très peu, mais produisent de grandes quantités de matrices extracellulaires, alors que ceux
en périphérie prolifèrent davantage et se différentient en myofibroblastes. Puisque les
150
myofibroblastes sont nécessaires pour la résorption de la fibrose [188], l’inhibition de leur
prolifération pourrait ralentir la guérison. Malgré les évidences contradictoires dans la littérature, les
analogues de la sphingosine favorisent potentiellement la différentiation des fibroblastes en
myofibroblastes [303]. Considérant le rôle des myofibroblastes dans la production de la matrice
extracellulaire et la contraction des lésions fibrotiques, déterminer les effets des analogues de la
sphingosine sur leur nombre et de leur localisation dans les zones fibrotiques ajouterait à la
compréhension des mécanismes de la fibrose.
Certaines expérimentations complémenteraient les résultats obtenus au dernier chapitre expérimental.
Par exemple, les analogues de la sphingosine affectent plusieurs mécanismes différents selon leur
statut phosphorylatoire. In vitro, la comparaison d’AAL-R, AFD-R et AAL-S permettrait de
déterminer la proportion des effets fibrotiques attribuables aux cibles intracellulaires, à
l’accumulation d’AFD-R intracellulaire et à la signalisation des récepteurs de la S1P, respectivement.
La nécessité de la phosphorylation pourrait aussi être déterminée dans la phase fibrotique du modèle
de fibrose pulmonaire induit par la bléomycine en comparant AAL-R et AAL-S.
À cet effet, nous montrons qu’au moins S1P3 est impliqué dans les effets profibrotiques de la voie de
la S1P. Puisque l’activation de S1P2 induit l’expression de facteurs fibrotiques par les fibroblastes
normaux [302], son inhibition pourrait avoir un effet similaire chez les fibroblastes FPI. De plus, une
approche agonistique permettrait de confirmer l’effet de l’activation de ces récepteurs
indépendamment des autres récepteurs et des effets de la S1P indépendants des récepteurs, comme
l’altération des niveaux des sphingolipides. Des analyses supplémentaires ajouteraient à la
compréhension des mécanismes profibrotiques ciblés par la S1P. Par exemple, puisque la S1P
augmente la production de matrice extracellulaire sans augmenter la transcription du collagène [302],
la production du collagène ne peut être déterminée que par une mesure plus directe, comme la
quantification de l’hydroxyproline dans le milieu de culture. La différenciation des fibroblastes en
myofibroblastes pourrait être mesurée en cytométrie de flux ou en immunofluorescence par un
marquage de l’α-smooth muscle actin. Ces études permettraient de révéler les principaux mécanismes
profibrotiques augmentés par les analogues de la sphingosine.
Cette thèse a également mené au développement de stratégies expérimentales afin de contrecarrer
l’hétérogénéité inhérente au modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine. Le
développement de la fibrose dans ce modèle est fortement dépendant de l’intensité de l’inflammation
de la phase inflammatoire. Les différences mineures dans cette dernière peuvent se révéler
exponentielles dans la phase fibrotique. Par conséquent, l’étude des effets d’outils pharmacologiques
sur la phase fibrotique est un défi, car l’étendue de la fibrose peut être variable entre les individus.
151
Nous avons donc développé une approche expérimentale impliquant la mesure longitudinale des
fonctions pulmonaires à l’aide de l’appareil flexiVent. Elle consiste à déterminer le niveau de
remodelage par la mesure de la compliance pulmonaire avant l’administration des composées
pharmacologiques. Une nouvelle mesure à la fin du protocole permet d’isoler l’effet des composés
sur la progression de la fibrose pulmonaire indépendamment de son niveau de base. Cependant, cette
méthode est non terminale et nécessite une anesthésie à l’isoflurane qui n’est pas optimale pour
certaines analyses du flexiVent. L’une de ces analyses est le PV-Loop, qui permet de déterminer la
compliance indépendamment de la fréquence et d’évaluer l’atélectasie causée par les lésions
fibrotiques. Une anesthésie avec la kétamine/xylazine permettrait d’effectuer ces analyses, mais
risque d’augmenter la mortalité. Malgré cela, l’approche développée répond à l’une des principales
critiques du modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine.
En somme, nous montrons que les analogues de la sphingosine peuvent potentiellement exacerber la
fibrose pulmonaire, malgré leurs effets anti-inflammatoires importants. L’augmentation de la fibrose
semble impliquer l’expression du CTGF. Nous montrons aussi que la S1P stimule la transcription du
CTFG par les fibroblastes en partie par l’activation de S1P3. De plus, les niveaux de mRNA du CTGF
corrèlent avec ceux de S1PR2 et S1PR3. Ces récepteurs de la S1P ont potentiellement un rôle dans le
développement de la FPI et pourraient être une cible thérapeutique potentielle.
152
Chapitre VIII : Conclusion et Perspectives
Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse montrent que les analogues phosphorylables de la
sphingosine, comme AAL-R, ont un potentiel préclinique dans l’asthme allergique. D’une part, AAL-
R diminue profondément l’inflammation éosinophilique caractéristique de l’asthme allergique, ce qui
est associé à l’augmentation de l’apoptose des lymphocytes T CD4+ et B pulmonaires. D’une autre
part, AAL-R réduit l’hyperréactivité bronchique dans un modèle d’asthme chronique avec
remodelage bronchique. Cette diminution est possiblement causée par la diminution de l’épaisseur
du muscle lisse bronchique et cette hypothèse est supportée par l’effet cytostatique d’AAL-R sur les
cellules musculaires lisses bronchiques humaines. Dans ces deux cas, les effets des analogues de la
sphingosine ne semblent pas dépendre de leur signalisation par les récepteurs extracellulaires de la
S1P, le mécanisme d’action classique des analogues de la sphingosine [249]. Au contraire, la
modulation de la prolifération et de la survie cellulaire requiert un analogue phosphorylable pouvant
s’accumuler dans le milieu intracellulaire. Toutefois, nous avons aussi montré que les analogues de
la sphingosine peuvent exacerber la fibrose pulmonaire en promouvant l’expression de facteurs
profibrotiques. L’administration prolongée d’analogues de la sphingosine dans un modèle d’asthme
chronique pourrait ainsi exacerber la fibrose sous-épithéliale. Des études plus poussées sur les effets
des analogues de la sphingosine sur le remodelage pulmonaire sont donc requises.
Les analogues de la sphingosine et la voie de la S1P affectent une panoplie de types cellulaires. Ils
modulent les mécanismes inflammatoires et fibrotiques aussi bien que la balance proliférative et
apoptotique. Toutefois, leurs mécanismes d’actions sont complexes, mal définis et mal compris. Une
étape importante est l’identification des mécanismes favorisant un effet cytostatique
comparativement à un effet pro-apoptotique de l’accumulation intracellulaire des analogues de la
sphingosines phosphorylables. Plusieurs avantages découleraient de cette identification.
Premièrement, il serait possible de prédire les types cellulaires sensibles à l’effet cytostatique et donc
les pathologies où les analogues de la sphingosine pourraient être bénéfiques. Deuxièmement, il serait
possible de diminuer les effets secondaires des analogues de la sphingosine en favorisant ce
mécanisme. La meilleure compréhension des mécanismes des analogues de la sphingosine
accentuerait ainsi indéniablement leur potentiel thérapeutique.
153
8. Chapitre IX : Bibliographie
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