Le rôle de la sphingosine-1-phosphate et impact des analogues de … · 2020. 8. 7. · La voie de signalisat ion de la sphingosine -1-phosphate (S1P) est reconnu e non seulement

© David Gendron, 2019

Le rôle de la sphingosine-1-phosphate et impact des analogues de la sphingosine dans le remodelage

pulmonaire

Thèse

David Gendron

Doctorat en médecine expérimentale

Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

Le rôle de la voie de la sphingosine-1-phosphate et

impact des analogues de la sphingosine dans le

remodelage pulmonaire

Thèse

David Gendron

Sous la direction de :

David Marsolais, directeur de recherche

iii

Résumé

Le remodelage pulmonaire cause une altération de la structure du poumon et peut mener à la

diminution de la fonction respiratoire. Ce remodelage peut aussi bien affecter les voies respiratoires

en obstruant le flot de l’air, comme il est observé dans l’asthme, que la compliance du parenchyme

pulmonaire, tel qu’observé dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI). Dans le cas de l’asthme

allergique, la forme la plus commune d’asthme, une inflammation chronique de type allergique induit

le remodelage bronchique, dont l’épaississement du muscle lisse bronchique. Ces deux composantes

contribuent directement à l’hyperréactivité bronchique. Dans le cas de la FPI, les dommages

tissulaires et l’inflammation semblent être impliqués dans l’induction de la maladie, mais la

progression de la FPI est maintenue même en absence d’inflammation. Tant en asthme qu’en FPI, le

remodelage est persistant et les options thérapeutiques sont partiellement efficaces, limitées ou

absentes.

La voie de signalisation de la sphingosine-1-phosphate (S1P) est reconnue non seulement pour son

rôle dans la régulation de l’immunité et de l’inflammation, mais aussi pour ses impacts majeurs dans

les phénomènes de prolifération et de survie cellulaire. Ces effets sont souvent associés à l’activation

de cinq récepteurs membranaires, nommés S1P1 à S1P5. D’ailleurs, ces récepteurs peuvent être activés

par les composés pharmacologiques analogues à la S1P. Bien que ces analogues répliquent ou

modifient la plupart des effets de la S1P, ils possèdent aussi des activités intracellulaires

indépendantes des récepteurs qui sont plutôt associées à la modulation de la survie cellulaire.

Ainsi, les sphingolipides et leurs analogues sont susceptibles de moduler plusieurs mécanismes

impliqués dans le remodelage pulmonaire. Le but de cette thèse était donc d’explorer l’impact des

sphingolipides et leurs analogues sur divers aspects impliqués dans le remodelage pulmonaire.

Dans une première étude, nous avons déterminé l’effet de l’analogue de la sphingosine AAL-R sur

l’inflammation observée dans un modèle murin d’asthme allergique. AAL-R diminue l’accumulation

pulmonaire des lymphocytes et induit leur apoptose au poumon. La réduction du nombre de

lymphocytes pulmonaires est associée à une diminution importante de l’éosinophilie et de

l’hyperréactivité bronchique. Ainsi, nous résultats montrent qu’AAL-R interfère avec

l’inflammation et l’hyperréactivité bronchique dans un modèle d’asthme allergique aigu par

un mécanisme impliquant l’apoptose des lymphocytes.

iv

Dans un second chapitre, l’impact d’AAL-R sur l’épaississement du muscle lisse bronchique a été

évalué dans un modèle murin d’asthme chronique. AAL-R réduit l’épaisseur du muscle lisse

bronchique dans le tissu remodelé, ce qui est associé à une diminution de l’hyperréactivité

bronchique. Nous montrons d’ailleurs que AAL-R interfère avec la prolifération des cellules

musculaires lisses, in vitro. Cette étude montre que des analogues de la sphingosine, tel qu’AAL-

R, pourraient contrecarrer le remodelage tissulaire tel qu’observé en asthme, ce qui ouvre de

nouvelles pistes précliniques pour cette maladie incurable.

Troisièmement, nous avons étudié l’influence de l’analogue de la sphingosine FTY720 sur la phase

inflammatoire ou la phase fibrotique d’un modèle murin de fibrose pulmonaire induit par une blessure

cellulaire aiguë. En concordance avec la littérature, l’administration de FTY720 en phase

inflammatoire diminue la fibrose pulmonaire. Toutefois, lorsqu’administré en phase fibrotique,

FTY720 exacerbe cette dernière. Cette exacerbation ne semble pas impliquer l’augmentation de la

perméabilité vasculaire, mais plutôt l’augmentation de la transcription du connective tissue growth

factor (CTGF). Similairement, FTY720 stimule la transcription du CTGF par les fibroblastes in vitro.

Contrairement au dogme actuel, notre étude montre que FTY720 promeut la fibrose pulmonaire ce

qui serait médié, du moins en partie, par la transcription accrue du CTGF.

Dans une dernière étude, nous avons exploré le lien entre la voie de signalisation de la S1P, le CTGF

et les dérégulations des fibroblastes issus de patients atteints de FPI. Ces fibroblastes expriment plus

de CTGF que des fibroblastes de patients ne souffrant pas de FPI, ce qui est exacerbé par la S1P. De

plus, un antagoniste de S1P3 renverse partiellement cette augmentation. Nous postulons donc que la

S1P et le S1P3 pourraient être impliqués dans la pathogenèse de la FPI.

Dans son ensemble, cette thèse démontre que les sphingolipides et leurs analogues influencent des

mécanismes du remodelage pulmonaire pathologique. Nos résultats suggèrent que certains acteurs de

la voie de signalisation de la S1P pourraient être modulés de manière bénéfique dans le contexte de

l’asthme et de la fibrose pulmonaire.

v

Abstract

Pulmonary remodelling causes the alteration of the lung structure and can lead to reduced respiratory

function. Remodelling can affect the lung airways by obstructing the airflow, as observed in asthma,

as well as the lung parenchyma by reducing lung compliance, as observed in idiopathic pulmonary

fibrosis (IPF). In the most widespread form of asthma, allergic asthma, chronic allergic inflammation

induces lung remodelling, including airway smooth muscle thickening. Both components directly

contribute to airway hyperresponsiveness. In IPF, acute lung injury and inflammation seem to be

involved in its pathogenesis, yet the progression of the disease is maintained even in the absence of

inflammation. Both in asthma and IPF, lung remodeling is persistent and therapeutic treatments are

either partially effective, limited or simply unavailable.

The sphingosine-1-phosphate (S1P) pathway is recognized not only for its role in the regulation of

immunity and inflammation, but also for its major involvement in the events of cellular proliferation

and survival. These effects are often associated with the activation of five G protein-coupled

receptors, termed S1P1 to S1P5. Furthermore, these receptors can be activated by pharmacological

compounds analogous to S1P. Although these analogs replicate or modify most S1P effects, they also

possess intracellular activities independent of S1P receptors that are rather associated with the

modulation of cell survival.

Therefore, sphingolipids and their analogs likely modulate several mechanisms involved in

pulmonary remodelling. The aim of this thesis was thus to explore the impact of sphingolipids

and their analogs on various aspects of pulmonary remodelling.

In a first study, we determined the effect of the sphingosine analog AAL-R on the inflammation

observed in a murine model of allergic asthma. AAL-R reduces pulmonary accumulation of

lymphocytes and induces their apoptosis specifically in the lung. The reduction of pulmonary

lymphocytes number is associated with reduced lung eosinophilia and airway hyperresponsiveness.

Our results show that AAL-R interferes with allergic inflammation and airway

hyperresponsiveness in an acute allergic asthma model by a mechanism involving the apoptosis

of pulmonary lymphocytes.

vi

In a second chapter, we evaluated the impact of AAL-R on airway smooth muscle thickening using a

murine model of chronic asthma. AAL-R reduces the thickness of the airway smooth muscle in

remodelled bronchi, which is associated with diminished airway hyperresponsiveness. Furthermore,

we show that AAL-R interferes with airway smooth muscle cells proliferation in vitro. This study

shows that sphingosines analogs, such as AAL-R, could reverse tissue remodelling as observed

in asthma, offering new preclinical targets for this incurable disease.

Thirdly, we studied the influence of the sphingosine analog FTY720 on the inflammatory phase or

the fibrotic phase of a murine model of pulmonary fibrosis induced by an acute injury. In concordance

with literature, FTY720 administration during the inflammatory phase reduce lung fibrosis. However,

when administered during the fibrotic phase, FTY720 exacerbates fibrosis. This exacerbation does

not involve increased vascular permeability, but rather increased connective tissue growth factor

(CTGF) transcription. Similarly, FTY720 stimulates CTGF transcription by fibroblasts in vitro.

Contrarily to the actual dogma, our study shows that FTY720 promotes pulmonary fibrosis which

is mediated, at least in part, by increased CTGF transcription.

Finally, we explored the link between the S1P signalling pathway, the transcription of CTGF and the

deregulations observed in lung fibroblasts isolated from IPF patients. These fibroblasts express more

CTGF than lung fibroblasts from patient without IPF, which is exacerbated by S1P. Moreover, a

specific S1P3 antagonist partially reverses this exacerbation. We postulate that S1P and S1P3 could

be involved in idiopathic lung fibrosis pathogenesis.

As a whole, this thesis demonstrates that sphingolipids and their analogs influence mechanisms

underlying pathological pulmonary remodelling. Our results suggest that certain components of the

S1P signalling pathway could prove beneficial in the context of asthma and lung fibrosis.

These results support the hypothesis that phosphorylatable sphingosine analogs interfere with

inflammation and ASM thickening observed in allergic asthma. However, they also stimulate CTGF

transcription by fibroblasts, thus possibly exacerbating pathologies involving these cells, such as IPF.

Identification of the mechanisms modulated by S1P analogs could provide insights regarding putative

targets in the context of pulmonary remodelling.

vii

Table des Matières

RÉSUMÉ .......................................................................................................................................... III

ABSTRACT ...................................................................................................................................... V

TABLE DES MATIÈRES ............................................................................................................ VII

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................ X

LISTE DES FIGURES ................................................................................................................... XI

LISTE DES ABBRÉVIATIONS ................................................................................................. XIII

REMERCIEMENTS ......................................................................................................................XV

AVANT-PROPOS ...................................................................................................................... XVII

1. CHAPITRE I : INTRODUCTION .......................................................................................... 1 1.1 LE REMODELAGE PULMONAIRE ........................................................................................ 1 1.2 L’ASTHME ........................................................................................................................... 3

1.2.1 La physiopathologie de l’asthme ................................................................................. 6 1.2.2 La sensibilisation ......................................................................................................... 8 1.2.3 La cascade inflammatoire ......................................................................................... 10 1.2.4 Le remodelage bronchique ........................................................................................ 13 1.2.5 Les modèles expérimentaux ....................................................................................... 15

1.3 LA FIBROSE PULMONAIRE ............................................................................................... 18 1.3.1 La physiopathologie de la fibrose pulmonaire .......................................................... 19 1.3.2 Les mécanismes de la fibrose pulmonaire ................................................................. 20 1.3.3 Les modèles expérimentaux ....................................................................................... 30

1.4 LES SPHINGOLIPIDES ....................................................................................................... 33 1.4.1 Les analogues de la sphingosine ............................................................................... 39 1.4.2 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans l’asthme ............................... 41 1.4.3 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans la fibrose pulmonaire .......... 43

2. CHAPITRE II : PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS ........................ 46 2.1 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE III ............... 46 2.2 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE IV ............... 47 2.3 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE V ................. 48 2.4 PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS RELATIFS AU CHAPITRE VI ............... 49

3. CHAPITRE III : TREATMENT WITH A SPHINGOSINE ANALOG AFTER THE

INCEPTION OF HOUSE DUST MITE-INDUCED AIRWAY INFLAMMATION

ALLEVIATES KEY FEATURES OF EXPERIMENTAL ASTHMA....................................... 51 3.1 RÉSUMÉ ............................................................................................................................ 51 3.2 ABSTRACT ........................................................................................................................ 52 3.3 BACKGROUND .................................................................................................................. 53 3.4 METHODS ......................................................................................................................... 54

3.4.1 Murine Model of Asthma ........................................................................................... 54 3.4.2 Immunoglobulin Titration ......................................................................................... 54 3.4.3 Experimental Treatments .......................................................................................... 55 3.4.4 Differential Counts, Flow Cytometric Analyses and Quantification of Cytokines .... 55 3.4.5 Histology ................................................................................................................... 55 3.4.6 Measurement of Airway Responsiveness ................................................................... 56 3.4.7 Statistical Analyses .................................................................................................... 56

viii

3.5 RESULTS ........................................................................................................................... 56 3.5.1 Onset of allergic airway inflammation in response to daily exposure to HDM ........ 56 3.5.2 AAL-R alleviates airway responsiveness induced by HDM ...................................... 57 3.5.3 AAL-R interferes with lung accumulation of cells that drive inflammation induced by

HDM ................................................................................................................................... 57 3.5.4 AAL-R enhances apoptosis/necrosis of lymphocytes in the lung ............................... 58 3.5.5 Effect of intra-tracheal delivery of AAL-R on lymphocytes and DC in the draining

lymph nodes. .............................................................................................................................. 59 3.6 DISCUSSION ...................................................................................................................... 59 3.7 CONCLUSION AND DECLARATIONS ................................................................................. 62

3.7.1 Competing interests ................................................................................................... 63 3.7.2 Author contribution ................................................................................................... 63 3.7.3 Acknowledgements .................................................................................................... 63

3.8 REFERENCES .................................................................................................................... 64 3.9 FIGURES ............................................................................................................................ 67 3.10 TABLEAUX ........................................................................................................................ 74

4. CHAPITRE IV : A PHOSPHORYLATABLE SPHINGOSINE ANALOG INDUCES

AIRWAY SMOOTH MUSCLE CYTOSTASIS AND REVERSES AIRWAY

HYPERRESPONSIVENESS IN EXPERIMENTAL ASTHMA ................................................ 75 4.1 RÉSUMÉ ............................................................................................................................ 75 4.2 ABSTRACT ........................................................................................................................ 76 4.3 INTRODUCTION ................................................................................................................ 77 4.4 METHODS ......................................................................................................................... 78

4.4.1. Murine model and experimental treatments .............................................................. 78 4.4.2. Histological analyses ................................................................................................ 78 4.4.3. Cell Culture ............................................................................................................... 79 4.4.4. Quantification of sphingolipids. ................................................................................ 79 4.4.5. Statistics .................................................................................................................... 79

4.5 RESULTS ........................................................................................................................... 80 4.5.1. AAL-R reverses airway hyperresponsiveness and airway smooth muscle thickening. .

................................................................................................................................... 80 4.5.2. AAL-R favours an anti-proliferative balance in ASM cells. ...................................... 80 4.5.3. Modulation of S1P levels does not resolve the potent anti-proliferative effect of AAL-

R. ................................................................................................................................... 81 4.5.4. AAL- R incubation leads to massive accumulation of intracellular AFD-R in ASM

cells ................................................................................................................................... 82 4.5.5. AAL-R but not AAL-S efficiently reverses AHR ......................................................... 82

4.6 DISCUSSION ...................................................................................................................... 83 4.7 CONCLUSION AND DECLARATIONS ................................................................................. 86

4.7.1. Conflict of Interest Statement .................................................................................... 87 4.7.2. Author Contribution .................................................................................................. 87 4.7.3. Funding ..................................................................................................................... 87 4.7.4. Acknowledgements .................................................................................................... 87

4.8 REFERENCES .................................................................................................................... 88 4.9 FIGURES ............................................................................................................................ 91 4.10 SUPPLEMENTARY MATERIAL ........................................................................................ 100

4.10.1. LC MS/MS Analysis ................................................................................................. 100 4.10.2. Supplementary Figures and Tables ......................................................................... 100

ix

5. CHAPITRE V : FTY720 PROMOTES PULMONARY FIBROSIS WHEN

ADMINISTERED DURING THE REMODELING PHASE FOLLOWING A BLEOMYCIN-

INDUCED LUNG INJURY.......................................................................................................... 104 5.1 RÉSUMÉ .......................................................................................................................... 104 5.2 ABSTRACT ...................................................................................................................... 105 5.3 INTRODUCTION .............................................................................................................. 106 5.4 METHODS ....................................................................................................................... 107

5.4.1. Murine model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis and FTY720 treatment ... 107 5.4.2. Measurements of lung function ............................................................................... 107 5.4.3. Histology and immunohistochemistry ..................................................................... 108 5.4.4. Assessment of vascular leakage .............................................................................. 108 5.4.5. Cell culture .............................................................................................................. 108 5.4.6. Real-time quantitative polymerase chain reaction .................................................. 109 5.4.7. Statistical analyses .................................................................................................. 109

5.5 RESULTS ......................................................................................................................... 110 5.5.1. The remodeling phase following bleomycin injury is initiated on day 14 ............... 110 5.5.2. FTY720 exerts opposite effects on fibrosis depending on its period of delivery ..... 110 5.5.3. A low dose regimen of FTY720 does not enhance vascular leakage into the lung . 111 5.5.4. FTY720 increases Ctgf expression in vivo and in vitro ........................................... 112

5.6 DISCUSSION .................................................................................................................... 113 5.7 CONCLUSION AND DECLARATIONS ............................................................................... 115

5.7.1. Acknowledgements .................................................................................................. 115 5.8 REFERENCES .................................................................................................................. 116 5.9 FIGURES .......................................................................................................................... 118

6. CHAPITRE VI : UN RÔLE POUR S1P2 ET S1P3 DANS LE PHÉNOTYPE ALTÉRÉ

DES FIBROBLASTES DE PATIENTS ATTEINTS DE LA FPI ............................................ 124 6.1 RÉSUMÉ .......................................................................................................................... 124 6.3 MATÉRIEL ET MÉTHODES ............................................................................................. 127

6.3.1 Isolation, culture et stimulation des fibroblastes pulmonaires humains primaires 127 6.3.2 Réaction en chaine par polymérase quantitative en temps réel .............................. 128 6.3.3 Analyses statistiques ................................................................................................ 128

6.4 RÉSULTATS ..................................................................................................................... 129 6.5 DISCUSSION .................................................................................................................... 130 6.6 CONCLUSION .................................................................................................................. 132 6.7 RÉFÉRENCES .................................................................................................................. 133 6.8 FIGURES .......................................................................................................................... 135

7. CHAPITRE VII : DISCUSSION GÉNÉRALE .................................................................. 139 7.1 LES EFFETS DES ANALOGUES DE LA SPHINGOSINE SUR L’INFLAMMATION ALLERGIQUE

DANS L’ASTHME. ........................................................................................................................ 139 7.2 LES EFFETS DES ANALOGUES DE LA SPHINGOSINE SUR LE REMODELAGE BRONCHIQUE

DANS L’ASTHME ......................................................................................................................... 143 7.3 LES EFFETS DES ANALOGUES DE LA SPHINGOSINE SUR LA FIBROSE PULMONAIRE. .. 147

CHAPITRE VIII : CONCLUSION ET PERSPECTIVES ....................................................... 152

8. CHAPITRE IX : BIBLIOGRAPHIE .................................................................................. 153

x

Liste des Tableaux

Tableau 1.1 : Modulation des mécanismes profibrotiques des fibroblastes ............................... 28

Table 3.1: Histopathological alterations of mice lungs exposed to HDM ................................... 74

Supplementary Table 4.1: Details of the mass spectrometer parameters ................................ 100

xi

Liste des Figures

Chapitre I

Figure 1.1: Comparaison des présentations histologiques du remodelage pulmonaire .............. 2

Figure 1.2: Suite chronologique des étapes de la sensibilisation et des interactions entre les

cellules immunitaires et leurs médiateurs dans le développement de l’asthme allergique. ........ 7

Figure 1.3: Les étapes de l’inflammation allergique et du remodelage bronchique ................. 12

Figure 1.4: Étapes de la guérison tissulaire .................................................................................. 24

Figure 1.5: Les deux phases du modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine ...... 32

Figure 1.6: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine .... 35

Figure 1.7: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine .... 38

Figure 1.8: Propriétés physiques des analogues de la sphingosine ............................................. 40

Chapitre III

Figure 3.1: The onset of allergic inflammation is established at day 7 ....................................... 67

Figure 3.2: Experimental design .................................................................................................... 68

Figure 3.3: AAL-R interferes with hallmarks of asthma induced by HDM .............................. 70

Figure 3.4: AAL-R inhibits allergic airway inflammation .......................................................... 71

Figure 3.5: AAL-R increases lymphocyte apoptosis/necrosis in the lungs ................................. 72

Figure 3.6: Effects of non- or pre-phosphorylated analogs in draining lymph nodes............... 73

Chapitre IV

Figure 4.1: Sphingosine analogs and their targets ....................................................................... 91

Figure 4.2: Experimental model .................................................................................................... 92

Figure 4.3: AAL-R reverses airway hyperresponsiveness elicited by chronic HDM exposure 93

Figure 4.4: AAL-R reverses ASM thickening ............................................................................... 94

Figure 4.5: AAL-R inhibits the proliferation of ASM cells ......................................................... 95

Figure 4.6: Endogenous sphingolipid modulation in response to sphingolipid modifiers ........ 96

Figure 4.7: An S1P1/S1P3 antagonist does not induce cytostasis ................................................. 97

Figure 4.8: AAL-R-induced cytostasis depends on intracellular accumulation of AFD-R ...... 98

Figure 4.9: Reversal of airway hyperresponsiveness induced by chronic HDM exposure

requires a phosphorylatable sphingosine analog .......................................................................... 99

Supplementary Figure 4.1: AAL-R retains its ability to alleviate inflammation in the

remodelled airways ....................................................................................................................... 101

Supplementary Figure 4.2: ASM primary human cells express S1P receptors 1 to 3, both

sphingosine kinases and S1P lyase ............................................................................................... 102

Supplementary Figure 4.3: Sphingosine analogs do not negatively affect non-asthmatic lung

responsiveness to methacholine .................................................................................................... 103

xii

Chapitre V

Figure 5.1: Effects of bleomycin-induced injury on markers of inflammation and lung

function........................................................................................................................................... 118

Figure 5.2: Protocol outlining the days at which FTY720 was administered. ......................... 119

Figure 5.3: FTY720 either decreases or increases lung fibrosis depending on its period of

delivery. .......................................................................................................................................... 120

Figure 5.4: FTY720 enhances lung stiffness only when administered during the remodeling

phase. .............................................................................................................................................. 121

Figure 5.5: A low dose (0.1mg /kg) of FTY720 does not enhance vascular leakage in the lung.

......................................................................................................................................................... 122

Figure 5.6: FTY720 increases the expression of CTGF. ............................................................ 123

Chapitre VI

Figure 6.1 : Niveaux de transcrits de médiateurs fibrotiques et des composantes de la voie de

la S1P par des fibroblastes pulmonaires humains provenant de patients atteints de la FPI ou

non .................................................................................................................................................. 136

Figure 6.2 : La S1P module les niveaux de trasncripts de certains médiateurs fibrotiques ... 137

Figure 6. 3 : Un antagoniste de S1P3, TY-52156, diminue la surexpression du CTGF induite

par la S1P ....................................................................................................................................... 138

xiii

Liste des Abbréviations

α-SMA α-actine du muscle lisse; α-smooth muscle actin

AA-Mac Macrophage alternativement activé; Alternatively activated macrophages

ABC ATP-binding cassette transporters

AC Adenylyl cyclase-cyclic AMP

AF Autofluorescence

Alum Aluminum hydroxide adjuvant

AHR Hyperréactivité bronchique; Airway hyperresponsiveness

ANOVA Analyse de la variance; Analysis of variance

ASM Muscle lisse bronchique; airway smooth muscle

BALF Fluide du lavage bronchoalvéolaire; Bronchoalveolar lavage fluid

BrdU Bromodeoxyuridine

CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2

CD Classe de différenciation; Cluster of differentiation

CDase Ceramidase

COL1A1 Collagène type I, chaine α-1

COL3A1 Collagène type III, chaine α-1

COX Cytochrome c oxidase

CTFG Connective tissue growth factor

DC Cellules dendritiques; Dendritic cells

Delta-ct Différence de limite de cycle; difference of threshold cycle

dH2O Eau distillée

cDNA Acide désoxyribonucléique complémentaire; Complementary deoxyribonucleic

acid

ECM Matrice extracellulaire; Extracellular matrix

EDA-FN Fibronectine contenant des domaines A supplémentaires; extra-domain-A-

containing fibronectin

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

EMT Transition épithélio-mésenchymateuse; Epithelial–mesenchymal transition

ERK Extracellular signal-regulated kinase

FcεRI Récepteur 1 à haute affinité liant la partie Fc des IgE

FPI (IPF) Fibrose pulmonaire idiopathique; Idiopathic pulmonary fibrosis

FRQS Fonds de recherche du Québec – Santé

FTY720-P Forme phosphorylée de FTY720

Gnb2L1 Guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-Like 1

H&E Coloration à l'hématoxyline-éosine; Hematoxylin and eosin stain

HDAC Histone desacetylase

HDM Extrait d’acarien domestique (D.pteronyssinus); House dust mite extract

HPRT Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransfrase

IF-γ Interféron-γ

IgE Immunoglobuline de classe E

IgG1 Immunoglobuline de classe G1

IL Interleukine

i.n Intranasale

i.p Intrapéritonéale

IRSC Instituts de recherche en santé du Canada

i.t Intratrachéale

JNK Jun amino terminal kinase

MCh Méthacholine

xiv

MHC-II Complexe majeur d'histocompatibilité de classe 2; Class 2 major histocompatibility

complex

MLN Mediastinal lymph nodes

MMP Métalloprotéinase matricielle; Matrix metalloproteinase

mRNA Acide ribonucléique messager; Messenger ribonucleic acid

OVA Ovalbumine

PAI Inhibiteurs de l'activateur du plasminogène 1 et 2

PAS Periodic acid–Schiff

PBS Solution saline tamponnée au phosphate; Phosphate buffered saline

PDGF Platelet-derived growth factor

PE Phosphoéthanolamine

PHB2 Prohibitin 2

Rho Petites GTPases de la famile Rho

PI3K-AKT Phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B

PLC Phospholipase C

PP2A Protein phosphatase 2A

Rplp0 Ribosomal protein, large, p0

Rrs Respiratory system resistance

RSR Réseau en Santé Respiratoire du Québec

RT-PCR Real-time quantitative polymerase chain reaction

S1P Sphingosine-1-phosphate

S1P1-5 Récepteurs de la S1P 1 à 5

S1PP1-2 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 and 2 (aussi nommé SGPP)

S1PR1-5 Gènes des récepteurs de la S1P 1 à 5

SAL Saline

SEM Standard error of mean

Ser + PalCoA Sérine + palmitoyl-coenzyme A

SGPL1 Sphingosine-1-phosphate lyase

SMase Sphingomyelinase

SphK1-2 Sphingosine kinase 1 and 2

SPNS2 Spinster homolog 2

SSC Side scatter

TBP Protéine liant la boite TATA; TATA-box-binding protein

TF Tissue factor

TIMP Inhibiteur tissulaire des MMP; Tissue inhibitor of MMP

TGF-β Transforming growth factor-β

Th1 Lymphocytes T auxiliaries de type 1 effecteurs

Th2 Lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs

Th2M Lymphocytes T auxiliaires de type 2 mémoires

TNF Tumor necrosis factor

TSLP Thymic stromal lymphopoietin

VEH Véhicule

xv

Remerciements

Après toutes ces années arrive la fin de mon doctorat. Ce fut un temps rempli de déceptions et de

succès, à la fois éprouvant et gratifiant, mais duquel je sors grandi et fier. Je n’aurais pas pu accomplir

celui-ci sans le soutien de nombreuses personnes.

Tout d’abord, je voudrais remercier mon directeur de recherche David Marsolais de m’avoir accepté

au sein de son équipe naissante et de son support tout au long de ma maitrise et de mon doctorat.

Merci d’avoir continué à m’encourager à travers les moments difficiles et de tes efforts pour m’aider

à gérer ma désorganisation et mon penchant à m’étaler. Bien que je ne continue pas dans la voie de

la recherche, le savoir et l’expertise que tu m’as inculqués resteront toujours précieusement avec moi.

Merci de m’avoir encouragé dans mes projets futurs.

Je veux aussi remercier Marie-Renée Blanchet, Ynuk Bossé et Élise Bissonnette pour leur support et

celui des membres de leurs équipes. Les rencontres de laboratoire de la famille élargie ont toujours

été bonifiées par votre présence, sans oublier toutes vos contributions aux publications qui ont résulté

en cette thèse.

J’aimerais aussi remercier tous les assistants/associés de recherche qui ont participé de proche ou de

loin à mes projets. Je pense, sans ordre particulier, à Anne-Marie, Pascale, Marie-Josée, Sophie, Dany,

Sylvie, Anick et Marc. Merci de votre aide et de votre support qui se sont avérés inestimables, aussi

bien dans le laboratoire que dans la vie. Je n’aurais pas accompli tout ce travail sans vous.

Merci à tous mes collègues pour les discussions (scientifiques ou non) sans fin et les sorties bières.

Vous avez été une grande partie de ma vie pendant toutes ces années et j’en garde des souvenirs

précieux. Je voudrais remercier en particulier Michel, pour temps et la patience de former la personne

sans réelles expériences de laboratoire que j’étais, et Émilie, pour son aide précieuse au temps où nos

équipes respectives partageaient encore un U.

Merci à ma famille qui m’a toujours supporté dans mes études, même s’ils n’ont jamais compris ce

que je fais. Un merci particulier à mon frère Samuel d’avoir été là autant dans les bons que les mauvais

moments. Merci à mes parents d’avoir fait en sorte que je sois la personne que je suis et des sacrifices

que vous avez faits pour éduquer trois enfants.

Finalement, je veux remercier l’amour de ma vie, ma belle Vevi. Je ne sais pas ce que je ferais sans

toi à mes côtés. Merci de ta patience, je sais que ça en prend beaucoup pour vivre avec moi. Merci de

ton amour, à travers les bons et les mauvais moments. Merci de ton support dans le choix de mon

xvi

futur. Les plus belles années de ma vie ont été avec toi et je souhaite que le futur nous réserve encore

du bonheur ensemble. Je t’aime mon amour.

xvii

Avant-propos

Le manuscrit présenté au chapitre III intitulé « Treatment with a sphingosine analog after the

inception of house dust mite-induced airway inflammation alleviates key features of experimental

asthma » a été publié dans le journal Respiratory Research en février 2015. J’en suis l’auteur principal

et il est coécrit avec Anne-Marie Lemay, Claudine Tremblay, Laetitia JA Lai, Anick Langlois, Émilie

Bernatchez, Nicolas Flamand, Marie-Renée Blanchet, Anthony S. Don, Ynuk Bossé, Élyse

Bissonnette et David Marsolais. J’ai effectué les expériences, l’analyse et l’interprétation des résultats

et la révision de ce manuscrit, en collaboration avec les co-auteurs. Serge Simard, Marc Veillette et

Marie-Josée Beaulieu ont été remerciés pour leur aide et leur expertise. Hugh Rosen a été remercié

pour avoir fournir AAL-R et Daniel Guay pour la synthèse des analogues de la sphingosine. J’ai reçu

une bourse du Réseau en Santé Respiratoire du Québec (RSR) durant ce projet. Ce projet de recherche

a été supporté par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (#274357), le RSR et la

fondation canadienne pour l’innovation. Les expérimentations, l’hébergement et les soins ont été

approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université Laval en concordance avec les

recommandations du Conseil Canadien de Protection des Animaux (protocole 2011164). Des

modifications mineures du format ont été effectuées dans le manuscrit et la numérotation des figures

a été adaptée. DOI : 10.1186/s12931-015-0180-z

Le manuscrit présenté au chapitre IV intitulé « A phosphorylatable sphingosine analog induces airway

smooth muscle cytostasis and reverses airway hyperresponsiveness in experimental asthma » a été

publié dans le journal Frontiers in Pharmacology en février 2017. J’en suis l’auteur principal et il est

coécrit par Pascale B. Lecours, Anne-Marie Lemay, Marie-Josée Beaulieu, Carole-Ann Huppé,

Audrey Lee-Gosselin, Nicolas Flamand, Anthony S. Don, Élyse Bissonnette, Marie-Renée Blanchet,

Mathieu Laplante, Sylvain G. Bourgoin, Ynuk Bossé et David Marsolais. J’ai effectué les

expérimentations, l’analyse et l’interprétation des résultats et l’écriture et la révision du manuscrit, en

collaboration avec les coauteurs. Serge Simard, Marc Veillette et Dany Patoine ont été remerciés pour

leur aide et leur expertise. J’ai reçu une bourse du RSR et du Fonds de recherche du Québec – Santé

(FRQS). Ce projet de recherche a été supporté par les IRSC (#274357) et le RSR. Les

expérimentations, l’hébergement et les soins ont été approuvés par le Comité de protection des

animaux de l’Université Laval en concordance avec les recommandations du Conseil Canadien de

Protection des Animaux (protocole 2013037). Des modifications mineures du format ont été

effectuées dans le manuscrit et la numérotation des figures a été adaptée. DOI :

10.3389/fphar.2017.00078

xviii

Le manuscrit présenté au chapitre V intitulé « FTY720 promotes pulmonary fibrosis when

administered during the remodeling phase following a bleomycin-induced lung injury » a été publié

dans le journal Pulmonary Pharmacology & Therapeutics en mars 2017. J’en suis l’auteur principal

et il est coécrit avec Anne-Marie Lemay, Pascale Blais Lecours, Valérie Perreault-Vallières, Carole-

Ann Huppé, Ynuk Bossé, Marie-Renée Blanchet, Geneviève Dion et David Marsolais. J’ai effectué

les expérimentations, l’analyse et l’interprétation des résultats et l’écriture et la révision du manuscrit,

en collaboration avec les coauteurs. Serge Simard et Natacha LeBrasseur ont été remerciés pour leur

aide et leur expertise. J’ai reçu une bourse du RSR et du FRQS. Ce projet de recherche a été supporté

la Fondation de l’IUCPQ, les Fonds sur les maladies respiratoires J.-D.-Bégin - P.-H.-Lavoie et les

Fonds Alphonse L’Espérance. Les expérimentations, l’hébergement et les soins ont été approuvés par

le Comité de protection des animaux de l’Université Laval en concordance avec les recommandations

du Conseil Canadien de Protection des Animaux (protocole 2014122). Des modifications mineures

du format ont été effectuées dans le manuscrit et la numérotation des figures a été adaptée. DOI :

10.1016/j.pupt.2017.03.010

Candidats à la maitrise : Audrey Lee-Gosselin, Valérie Perreault-Vallières

Candidats au Ph.D. : Carole-Ann Huppé, Émilie Bernatchez ,Laetitia JA Lai

Professionnels de recherche : Anick Langlois, Anne-Marie Lemay, Marie-Josée Beaulieu, Pascale

B. Lecours

Chercheurs associés l’Université Laval : Nicolas Flamand, Marie-Renée Blanchet, Ynuk Bossé,

Élyse Bissonnette, Mathieu Laplante, Sylvain G. Bourgoin, David Marsolais

Chercheurs à l’Université de Sydney : Anthony S. Don

Pneumologue à l’IUCPQ : Geneviève Dion

Vétérinaire à Charles River Laboratories : Claudine Tremblay

1

1. Chapitre I : Introduction

1.1 Le remodelage pulmonaire

La réparation tissulaire est cruciale à la survie de l’organisme. Elle implique des mécanismes

complexes et interreliés qui varient en fonction de l’organe atteint et du type de blessure [1]. La

réparation tissulaire peut soit permettre de retrouver l’état original de l’organe, ce qu’on appelle la

régénération, soit altérer sa structure, ce qui réfère au processus de cicatrisation [2].

Malheureusement, peu d’organes, comme le foie, l’endomètre et les os, sont capables de régénération

chez l’humain. Ainsi, la plupart des blessures entrainent en la formation de tissus cicatriciels, ce qui

est souvent associée à une dégradation de la fonction de l’organe atteint. Le contrôle optimal des

mécanismes de la cicatrisation est donc nécessaire au maintien de la fonction de l’organe au fil du

temps.

Le poumon est un organe complexe qui assure les échanges gazeux. Étant à l’interface du système

sanguin et de l’air, il agit à titre de barrière tant physique qu’immunologique [3]. En ce sens, il est

constamment exposé à des irritants, à des organismes infectieux (bactéries, virus et, plus rarement,

parasites) et à des particules organiques ou non, incluant des allergènes. Cependant, comme une

réaction inflammatoire contre chaque particule étrangère risquerait d’interférer avec le bon

fonctionnement du poumon, celui-ci est dit «immuno-privilégié», c’est-à-dire que la surveillance

immunologique y est optimisée pour minimiser l’inflammation [4].

Plusieurs causes d’inflammation pulmonaire chronique sont connues, incluant certains agents

infectieux (p. ex. la tuberculose), les irritants inhalés (p. ex. la fumée de cigarette), les particules

inorganiques (p. ex. la micropoussière de silice) et les allergènes (p. ex. les antigènes d’acariens

domestiques; D.pteronyssinus) [5]. L’inflammation pulmonaire induit plusieurs altérations

réversibles au poumon, dont l’infiltration de cellules inflammatoires dans le parenchyme pulmonaire

et les voies aériennes ainsi que l’œdème pulmonaire et l’accumulation de mucus dans la lumière

bronchique [5]. Cependant, l’inflammation chronique peut aussi induire des altérations non

réversibles de l’architecture du poumon, ce que l’on appelle le remodelage pulmonaire [2, 6]. Bien

que l’inflammation pulmonaire chronique soit un facteur important dans le remodelage pulmonaire,

elle ne semble pas obligatoire pour sa progression, comme il est actuellement postulé dans le cas de

la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) [7].

2

Le remodelage pulmonaire regroupe plusieurs présentations (Figure 1.1) et mécanismes, selon la

pathologie sous-jacente. Le remodelage bronchique cause une diminution de la lumière bronchique,

diminuant le flot de l’air (syndrome obstructif). Il inclut l’hypertrophie/hyperplasie de l’épithélium

et du muscle lisse bronchique, la prolifération des cellules caliciformes et leur production de mucus

ainsi que la déposition de matrice extracellulaire sous-épithéliale [8]. Le remodelage alvéolaire inclut

aussi bien l’emphysème que la fibrose pulmonaire. Le premier est causé par la disparition des parois

alvéolaires, diminuant la capacité élastique du poumon et limitant le flot expiratoire [9]. Le second

est causé par le remplacement de la structure alvéolaire par du tissu cicatriciel, impliquant

l’infiltration et la prolifération des fibroblastes et la déposition de matrice extracellulaire dans le

parenchyme pulmonaire, menant ainsi à la perte de compliance et de volume pulmonaire (syndrome

restrictif) [2]. Dans les deux cas, ces altérations augmentent l’effort respiratoire et interfèrent avec les

échanges gazeux. Bien que le remodelage emphysémateux soit une conséquence importante de

certaines conditions pulmonaires, comme la maladie pulmonaire obstructive chronique, cette thèse se

concentrera sur le remodelage bronchique observé dans l’asthme et le remodelage alvéolaire observé

dans la fibrose pulmonaire.

Figure 1.1: Comparaison des présentations histologiques du remodelage pulmonaire

Selon la pathologie sous-jacente, le remodelage peut affecter différentes zones du poumon. L’asthme

induit principalement le rétrécissement de la lumière bronchique (lumen) par l’épaississement des

composantes de la paroi bronchique. Comparativement, la fibrose pulmonaire (fibrosis) affecte le

parenchyme pulmonaire avec un remplacement des alvéoles par des fibroblastes et de la matrice

extracellulaire. Au contraire, l’emphysème (emphysema) est causé par la destruction du tissu

alvéolaire. Ep : Épithélium; Bv : Vaisseau sanguin; Sm : Muscle lisse bronchique, Bm : Membrane

basale. Figures adaptées avec permission à partir de Wadsworth et al., 2011 [10], Lynch and Jaffe,

2006 [11], Nephron, 2009 [12] et Smith, 2009 [13].

3

1.2 L’asthme

L’asthme est une maladie pulmonaire chronique affectant 235 millions de personnes dans le monde

et, vraisemblablement, 100 millions de personnes supplémentaires seront touchées d’ici 2025 [14].

Malgré la disponibilité des traitements, 250 000 personnes par année en décèderont [14]. En

Amérique du Nord, l’asthme affecte environ 8% des adultes et jusqu’à 13 % des enfants [15, 16],

dont 70% resteront asthmatiques à l’âge adulte, mais ces nombres varient grandement selon les

régions du monde [17]. Bien que l’asthme affecte aussi bien les hommes que les femmes, il est plus

commun chez les enfants mâles et cette situation s’inverse à l’âge adulte [18]. Au Canada et aux

États-Unis, les coûts directs et indirects de l’asthme totalisent respectivement 12 milliards de dollars

canadiens [15] et 56 milliards de dollars américains. De plus, une fraction importante de ces coûts est

attribuable aux patients atteints d’asthme sévère et réfractaire aux traitements actuels [19], bien qu’ils

représentent moins de 10% de la population souffrante d’asthme [20]. L’asthme est ainsi une maladie

en croissance, et démontre un coût social et économique important.

Plusieurs facteurs de risque de l’asthme ont été identifiés et regroupés en deux grandes catégories :

les prédispositions génétiques et l’environnement [21]. Bien qu’un historique familial d’asthme et/ou

d’allergies soit un prédicteur puissant du développement de l’asthme [22], les études génétiques ne

permettent d’expliquer qu’une faible partie de l’héritabilité de l’asthme [23] et ce malgré plus de 120

gènes de susceptibilités identifiés [24]. Comparativement, les facteurs environnementaux sont mieux

identifiés et l’importance de leur rôle est supportée par la rapide augmentation de la prévalence de

l’asthme, corrélant avec l’urbanisation et les changements dans le style de vie [25]. Les facteurs de

l’environnement peuvent être de nature allergénique ou non. Ces derniers incluent la fumée de

cigarette, les infections virales, la pollution de l’air et les irritants chimiques [15]. Chez les enfants,

les facteurs allergéniques déclenchent souvent un asthme plus sévère. Les enfants avec un asthme

allergique sont plus sujets à rester asthmatiques à l’âge adulte [26]. D’ailleurs, chez les adultes,

l’asthme allergique est le plus fréquent, touchant 70% des patients asthmatiques [14]. L’asthme

allergique implique des allergènes communs et ubiquitaires comme les antigènes d’acariens

domestiques, le pollen, les moisissures et les antigènes de nature animale [27]. Bien que les causes

exactes de l’asthme ne soient pas identifiées, les facteurs de risque favorisent son développement et

contribuent aux symptômes et aux exacerbations.

Les symptômes de l’asthme incluent une dyspnée, une toux, une respiration sifflante et une oppression

thoracique [15]. Ces symptômes sont principalement causés par une obstruction bronchique induite

par une augmentation du volume du tissu bronchique, une présence de mucus ainsi qu’un

rétrécissement du muscle lisse bronchique (c.-à-d. la bronchoconstriction), réduisant le calibre des

4

voies aériennes. Dans l’asthme, la bronchoconstriction est conséquente à l’hyperréactivité bronchique

induite par l’inhalation d’allergènes, d’irritants ou même simplement d’un air sec ou froid. Un effort

physique important peut aussi suffire à induire un bronchospasme chez les personnes atteintes

d’asthme [28]. Ces stimuli peuvent induire une inflammation réversible des voies aériennes via le

recrutement et l’activation de cellules inflammatoires. L’inflammation, quant à elle, augmente

l’œdème de la paroi bronchique et favorise la production de mucus, augmentant ainsi l’obstruction

bronchique. Il est bien accepté que l’inflammation pulmonaire chronique contribue au remodelage

permanent des voies aériennes [8]. Le diagnostic de l’asthme inclut donc la mesure de l’obstruction

bronchique et la réversibilité (bronchodilatateur) de la contraction par un bronchodilatateur avec à

l’aide d’un appareil de spirométrie [29]. L’analyse des expectorations induites afin de déterminer la

présence et la quantité de cellules inflammatoires (principalement les éosinophiles) dans le sputum

peut aussi être effectuée [30]. Par conséquent, l’inflammation bronchique et la bronchoconstriction

contribuent aux symptômes de l’asthme et sont les principaux mécanismes visés par les agents

thérapeutiques actuels.

Les traitements de l’asthme visent à contrôler les symptômes afin que ces derniers n’interfèrent pas

avec les activités quotidiennes et que les patients ne nécessitent pas de médications de secours. Il est

important de noter que ces traitements sont palliatifs, et non curatifs, et ne permettent que de diminuer

les symptômes et ralentir la progression de la maladie [31]. Actuellement, les traitements couramment

utilisés dans l’asthme sont les bronchodilatateurs et les anti-inflammatoires. Les bronchodilatateurs

ciblent directement la contraction du muscle lisse bronchique par plusieurs mécanismes. Les β-

agonistes activent les récepteurs adrénergiques, induisant la relaxation de du muscle lisse bronchique

[32]. À l’inverse, les anticholinergiques sont des antagonistes des récepteurs de l’acétylcholine, un

neurotransmetteur ayant un effet bronchoconstricteur sur le muscle lisse bronchique [33]. Les

bronchodilatateurs peuvent être à courte ou longue action. Les premiers visent un soulagement

immédiat de la bronchoconstriction, par exemple suite à un effort physique important, et les seconds

visent à contrôler les symptômes de l’asthme au repos [31].

Les anti-inflammatoires, comme les corticostéroïdes inhalés, sont le traitement de première ligne pour

diminuer l’inflammation bronchique chronique observée dans l’asthme. Si une dose plus élevée est

nécessaire afin de réduire l’inflammation, les corticostéroïdes peuvent aussi être donnés par voie

orale. Les mécanismes affectés par les corticostéroïdes sont multiples : ils inhibent le recrutement et

l’activation de plusieurs cellules inflammatoires, diminuent l’expression de gènes pro-

inflammatoires, favorisent l’expression de gènes anti-inflammatoires et potentialisent l’effet des β-

agonistes en augmentant l’expression et l’activité de leurs récepteurs [34]. Si l’utilisation de

5

corticostéroïdes est insuffisante pour contrôler l’asthme, d’autres options thérapeutiques sont

disponibles. Administrés seuls ou en combinaison avec les corticostéroïdes, les anti-leucotriènes

inhibent le recrutement des éosinophiles [35]. Les anticorps monoclonaux contre les

immunoglobulines de classe E (IgE) lient ces derniers et inhibent l’activation des mastocytes et des

lymphocytes [36]. Cependant, ces traitements visent un phénotype particulier de l’asthme (anti-

leucotriène) ou doivent être administrés par un professionnel de la santé (anticorps monoclonaux

contre les IgE). Malgré l’efficacité et la disponibilité des traitements actuels, environ 50% des patients

asthmatiques sont résilients aux corticostéroïdes inhalés [37]. De plus, bien que ces traitements

permettent de ralentir ou arrêter le remodelage bronchique observé dans l’asthme, ils sont inefficaces

pour atténuer le remodelage déjà établi chez l’humain [38]. Il faut noter que les corticostéroïdes

diminuent le remodelage bronchique observé dans l’obstruction bronchique récurrente des chevaux,

un syndrome similaire à l’asthme, soulignant le manque de connaissance des mécanismes supportant

le remodelage pulmonaire [39]. L’une des thérapies émergentes de l’asthme sévère est la

bronchothermoplastie qui permet de réduire la masse du muscle lisse bronchique dans les voies

centrales. Toutefois, les bénéfices sont limités, ou même absents, chez certains patients atteints

d’asthme. Il y a donc un besoin criant de développer de nouvelles thérapies ciblant les asthmes sévères

et résilients impliquant du remodelage bronchique.

6

1.2.1 La physiopathologie de l’asthme

Bien que l’asthme soit souvent perçu comme une condition unique, il s’agit plutôt d’un regroupement

hétérogène de maladies ayant des présentations cliniques similaires. Selon le Global Initiative for

Asthma [40], les phénotypes les plus fréquents sont l’asthme allergique, l’asthme non allergique,

l’asthme tardif, l’asthme avec limitation du flot de l’air fixe et l’asthme avec obésité. L’étiologie de

ces phénotypes varie grandement quant à l’âge d’apparition, les facteurs exacerbant l’asthme, la

prévalence selon le sexe, la résistance aux corticostéroïdes et la présence de certains types de cellules

inflammatoires, comme les neutrophiles et les éosinophiles [41]. Comme discuté précédemment,

l’asthme allergique affecte la majorité des patients atteints d’asthme et sera donc le phénotype étudié

au cours de cette thèse.

Les patients souffrant d’asthme allergique sont dits « sensibilisés », c’est-à-dire qu’ils ont développé

une réponse immunitaire adaptative anormale suite à l’exposition répétée à un allergène. Une fois

sensibilisée, l’exposition à cet allergène induit une réponse inflammatoire allergique immédiate (une

période en secondes ou minutes), impliquant l’activation des mastocytes et induisant un

bronchospasme [21, 42]. Cette réponse immédiate enclenche aussi le recrutement et l’activation de

nombreuses cellules immunitaires, dont les éosinophiles et les lymphocytes T auxiliaires. Cette

accumulation de cellules inflammatoires activées contribue à l’inflammation et la

bronchoconstriction lors de la réaction tardive [21, 43]. Les médiateurs inflammatoires impliqués,

ainsi que l’expression de facteurs de croissance, induisent le remodelage des voies aériennes,

particulièrement l’épaississement du muscle lisse bronchique [44]. L’inflammation allergique est

donc centrale au maintien de l’asthme et à son exacerbation, mais aussi au remodelage bronchique.

7

Figure 1.2: Suite chronologique des étapes de la sensibilisation et des interactions entre les

cellules immunitaires et leurs médiateurs dans le développement de l’asthme allergique.

Suite à l’exposition à un allergène par inhalation, celui-ci est capturé par les cellules dendritiques

(DC) à l’épithélium bronchique. La présence de facteurs inflammatoires, comme le thymic stromal

lymphopoietin (TSLP), l’interleukine (IL)-25 et l’IL-33, favorisent la sensibilisation allergique. Aux

ganglions lymphatiques, les DC activeront les cellules T naïves (Th0) en lymphocytes T auxiliaires

de type 2 effecteurs (Th2). Ces Th2 induiront la production d’immunoglobuline de classe E (IgE)

par les lymphocytes B et migreront au poumon afin d’effectuer la surveillance immunitaire. Les

mastocytes, déjà dans les muqueuses pulmonaires, lieront les IgE en circulation afin de participer à

la surveillance immunitaire. Figure adaptée avec permission à partir d’Islam et Luster, 2012 [45].

8

1.2.2 La sensibilisation

Plusieurs étapes immunologiques sont nécessaires à la sensibilisation à un allergène et à la

surveillance immunitaire subséquente (Figure 1.2). Normalement, l’inhalation d’un allergène

potentiel est inoffensive et ne déclenche pas de réaction inflammatoire [46]. L’allergène doit faire

face à la barrière physique du poumon où il peut être éliminé de manière physique (aussi nommée

élimination silencieuse) par expulsion du système respiratoire grâce à l’action des ciliations des

cellules épithéliales bronchiques et de la toux. Il peut aussi être éliminé suite à sa phagocytose par les

macrophages alvéolaires [5, 47]. Cependant, il a été observé que, chez les patients atteints d’asthme,

la fonction des cils épithéliaux est diminuée et que les macrophages alvéolaires, qui normalement ont

un phénotype régulateur, acquièrent plutôt un phénotype pro-inflammatoire [48]. De plus, plusieurs

allergènes, dont les antigènes d’acariens domestiques, possèdent une activité protéase, ce qui

endommage les jonctions épithéliales et stimule le relargage de thymic stromal lymphopoietin,

d’interleukine (IL)-25 et d’IL-33 [49, 50]. Cela permet aussi à l’allergène de passer dans le milieu

sous-épithélial. Par conséquent, l’altération des défenses de la barrière épithéliale favorise la

sensibilisation allergique.

Des cellules présentatrices d’antigènes spécialisées, les cellules dendritiques, situées sous cet

épithélium participent aussi à la sensibilisation allergique. Elles peuvent capter aussi bien les

allergènes à la surface de l’épithélium, à l’aide de longs dendrites s’infiltrant entre les jonctions

épithéliales, que les antigènes dans le milieu sous-épithélial [51]. Des récepteurs de reconnaissance

de motifs moléculaires favorisent l’adhésion et la phagocytose de l’allergène, permettant ainsi

l’activation des cellules dendritiques. L’allergène est ensuite fragmenté par hydrolyse et les peptides

résultants sont présentés au système immunitaire par le complexe majeur d'histocompatibilité de

classe II [51]. Cependant, en présence de thymic stromal lymphopoietin, d’IL-25 et/ou d’IL-33, les

cellules dendritiques acquièrent un phénotype promouvant une réponse allergique [52]. Suite à la

migration des cellules dendritiques aux ganglions lymphatiques secondaires afférents, ceux-ci vont

présenter des peptides de l’allergène aux lymphocytes T auxiliaires naïf par l’entremise des récepteurs

spécialisés de ces derniers. L’activation des cellules dendritiques et leur polarisation vers un

phénotype favorisant la sensibilisation allergique sont une étape centrale au développement de

l’asthme.

9

Le type de réponse immune est déterminant dans le développement de l’asthme. Chez les individus

non allergiques, la présentation d’un allergène inoffensif déclenchera une réaction tolérogène

impliquant la polarisation des lymphocytes T auxiliaires naïfs en lymphocytes T auxiliaires

régulateurs. Ces lymphocytes produisent des médiateurs régulateurs, dont l’IL-10, empêchant une

subséquente activation de la cascade inflammatoire par le même antigène [53]. Cependant, chez les

individus sensibilisés, la présence de médiateurs comme l’IL-4 et l’IL-13 vont promouvoir la

polarisation des lymphocytes T auxiliaires naïfs en lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs

(Th2) et leur subséquente prolifération. Comme cette polarisation est centrale à la réponse immune

allergique, celle-ci est souvent nommée réponse immune Th2, alors que la réponse immune classique

est nommée Th1. La source initiale d’IL-4 reste encore non résolue [51], mais plusieurs évidences

suggèrent que les basophiles et/ou les mastocytes en sont responsables [21]. De plus, les cellules

lymphoïdes innées de type 2, n’ayant pas de TCR, répondent à la présence d’IL-25 [54] et seraient

nécessaires au développement d’une réponse inflammatoire de type Th2 [55]. De plus, ceux-ci

seraient nécessaires au maintien de l’inflammation allergique pulmonaire en participant à la

production continue d’IL-13 [56]. Cependant, la production subséquente d’IL-4 provient

principalement des lymphocytes Th2 [21]. La polarisation des lymphocytes T auxiliaires naïfs en

lymphocytes Th2 est une caractéristique clé du développement de l’asthme allergique.

Les lymphocytes Th2 stimulent les lymphocytes B et induisent leur maturation en cellules

plasmatiques et la transition de la production d’immunoglobuline de classe M à celle d’IgE [57]. Ces

IgE passent dans la circulation sanguine pour atteindre les mastocytes résidents dans les tissus. Les

mastocytes sont particulièrement regroupés dans les muqueuses, dont le nez et les intestins, ainsi que

la peau et le parenchyme pulmonaire. Ils sont aussi retrouvés à proximité du muscle lisse bronchique.

Les IgE se lient aux récepteurs 1 à haute affinité liant la partie Fc des IgE (FcεRI) exprimés à la

surface des mastocytes, augmentant leur survie et les préparant à répondre à une exposition à

l’allergène ciblé [42]. Les basophiles expriment aussi des FcεRI et possèdent des fonctions similaires

aux mastocytes, mais ils sont comparativement rares et leur rôle est encore mal compris [21]. La

production d’IgE spécifiques à l’antigène par les lymphocytes B contribue ainsi à la sensibilisation

dans l’asthme allergique. Suite à leur activation, les lymphocytes Th2 peuvent aussi sortir des organes

lymphoïdes secondaires et migrer jusqu’au poumon pour se localiser dans le parenchyme pulmonaire.

Ils se différentient alors en Th2 mémoires et effectuent la surveillance immunitaire, afin de pouvoir

répondre rapidement à une nouvelle exposition à l’allergène [58]. Par conséquent, la sensibilisation

allergique dans l’asthme induit la présence de Th2 mémoires et d’IgE dans le tissu pulmonaire,

favorisant la réactivation d’une réponse immune de type Th2.

10

1.2.3 La cascade inflammatoire

Suite à la sensibilisation à un allergène, plusieurs cellules immunitaires spécifiques à cet antigène

sont situées à proximité de l’épithélium bronchique et effectuent la surveillance pulmonaire (Figure

1.3). Par conséquent, une nouvelle exposition à cet antigène induit une réponse inflammatoire rapide

et importante. Les IgE associées aux FcεRI sur les mastocytes lient l’allergène et se multiplexent, ce

qui induit leur dégranulation ainsi que le relargage d’histamine et de protéases. De plus, les

mastocytes produisent plusieurs médiateurs inflammatoires lipidiques, comme les leucotriènes et les

prostaglandines ainsi que les cytokines IL-4, IL-5 et tumor necrosis factor (TNF) [21]. L’histamine

et les médiateurs inflammatoires lipidiques induisent la constriction du muscle lisse bronchique, la

production de mucus et la vasodilatation des capillaires, cette dernière facilitant le recrutement des

cellules inflammatoires. Les protéases et les médiateurs inflammatoires lipidiques endommagent

aussi l’épithélium, augmentant la réponse inflammatoire. De plus, ces médiateurs inflammatoires

lipidiques sont aussi des chimioattractants pour les mastocytes eux-mêmes [59, 60]. Suite à

l’exposition à un allergène, les mastocytes participent ainsi à la bronchoconstriction rapide et à la

propagation de la réponse inflammatoire.

En parallèle à l’activation des mastocytes, les cellules dendritiques captent de nouveau l’allergène.

Ils peuvent ainsi réactiver les lymphocytes Th2 mémoires résidant dans le parenchyme pulmonaire

[61]. Suite à la migration des cellules dendritiques aux organes lymphoïdes secondaires, ils peuvent

polariser de nouveaux lymphocytes T auxiliaires naïfs en lymphocytes Th2, similairement au

processus de la sensibilisation. Le recrutement et l’activation des lymphocytes Th2 est accentué par

l’IL-4 produit par les mastocytes. Les lymphocytes Th2 activés produisent de grandes quantités d’IL-

4, d’IL-5 et d’IL-13, contribuant au recrutement et à l’activation de plusieurs cellules inflammatoires,

incluant elles-mêmes. De plus, la stimulation des cellules épithéliales par l’IL-5 et l’IL-13 favorise la

production d’éotaxine, un chimioattractant puissant permettant le recrutement des éosinophiles

sanguins aux voies aériennes [21]. Les médiateurs inflammatoires secrétés par les lymphocytes Th2

sont aussi des bronchoconstricteurs et contribuent fortement à une bronchoconstriction soutenue. La

réactivation des lymphocytes Th2 mémoire et la polarisation de nouveaux lymphocytes en

lymphocytes Th2 permet donc de maintenir l’inflammation allergique et les symptômes de l’asthme.

11

Les éosinophiles sont des cellules granulocytaires caractéristiques de l’asthme allergique et leur

nombre corrèle fortement avec la sévérité de la maladie [62]. Ils sont recrutés et activés par plusieurs

médiateurs produits par les mastocytes, les lymphocytes Th2 et les cellules épithéliales alvéolaires.

En plus de produire de l’IL-5, contribuant à leur propre recrutement, les éosinophiles possèdent des

granules contenant des facteurs toxiques, des protéines basiques, des médiateurs lipidiques et des

cytokines, dont le transforming growth factor-β (TGF-β) [21]. La dégranulation des éosinophiles

introduit de grandes quantités de ces facteurs complémentant et exacerbant l’inflammation. De plus,

la production TGF-β, favorise le remodelage pulmonaire [44]. L’accumulation des éosinophiles dans

le tissu pulmonaire contribue non seulement à la propagation de l’inflammation dans l’asthme, mais

aussi au remodelage bronchique.

Bien que la cascade inflammatoire allergique classique implique principalement les cellules

précédemment présentées, les macrophages et les neutrophiles peuvent aussi moduler la réponse

inflammatoire. De plus, chez certaines personnes atteintes d’asthme, les lymphocytes peuvent aussi

être polarisés pour produire de l’IL-17, favorisant le recrutement des neutrophiles. Ce phénotype est

d’ailleurs associé à l’asthme sévère résistant aux glucocorticstéroides [63]. Les macrophages

effectuent la phagocytose des cellules inflammatoires apoptotiques, favorisant la diminution de la

charge de médiateurs pro-inflammatoires [48]. Cependant, en présence d’IL-4 et/ou d’IL-13, ils

acquièrent une activation alternative profibrotique et expriment entre autres du TGF-β, favorisant le

remodelage [64]. Les neutrophiles produisent une grande variété de médiateurs inflammatoires et

d’enzymes dégradant la matrice extracellulaire, contribuant au remodelage bronchique. Bien que les

macrophages et les neutrophiles soient impliqués dans l’asthme, ils ne font pas l’objet d’une analyse

approfondie dans cette thèse.

En somme, dans l’asthme allergique, la réexposition à un allergène induit une inflammation rapide,

soutenue et importante. L’activation des cellules inflammatoires permet la propagation de la réponse

inflammatoire. Ces cellules produisent aussi des médiateurs stimulant leur propre activation. Ces

boucles de rétroactions positives et la redondance des signaux inflammatoires participent à la

chronicité de l’inflammation et sont démontrées par la présence d’inflammation en absence de

stimulation allergénique [21]. Cette inflammation chronique serait la source principale de facteurs

stimulant le remodelage bronchique.

12

Figure 1.3: Les étapes de l’inflammation allergique et du remodelage bronchique

La réexposition à un allergène active les mastocytes, induisant le relargage de plusieurs facteurs

inflammatoires permettant le recrutement et l’activation des lymphocytes Th2, avec l’aide des cellules

dendritiques. Les médiateurs inflammatoires produits par les mastocytes, les lymphocytes Th2 et les

cellules épithéliales bronchiques induisent le recrutement et l’activation des éosinophiles. Les

éosinophiles maintiennent l’inflammation et leur production de médiateurs profibrotiques favorise le

remodelage bronchique. IL : Interleukine; IgE : Immunoglobuline de classe E; Lymphocytes Th2 :

Lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs; TNF : Tumor necrosis factor; TGF-β : Transforming

growth factor-β.; Figure inspirée de Possa et al., 2013 [65].

13

1.2.4 Le remodelage bronchique

L’obstruction bronchique dans l’asthme allergique est causée par la bronchoconstriction induite par

les médiateurs inflammatoires, mais aussi par le remodelage de la paroi bronchique. Chez les

personnes souffrant d’asthme, l’épaisseur de la paroi bronchique peut être augmentée de 25 à 230%,

comparativement à des personnes non asthmatiques. Cet épaississement contribue fortement à la

sévérité de la maladie [44]. Le remodelage bronchique altère irréversiblement plusieurs composantes

de la paroi bronchique, dont l’épithélium, la membrane basale et le muscle lisse bronchique.

Étant la barrière physique entre le soi et l’environnement, l’épithélium bronchique est

particulièrement affecté dans l’asthme allergique. Les allergènes et l’inflammation endommagent les

cellules épithéliales et induisent leur desquamation [8, 51]. En absence de régénération épithéliale

suffisante, il peut y avoir un dénudement de la membrane basale, facilitant ainsi le passage des

allergènes à l’espace sous-épithélial [8]. La perte de ces cellules ciliées interfère avec l’élimination

silencieuse des allergènes [8, 66]. De plus, les cellules caliciformes parsemant l’épithélium prolifèrent

et augmentent leur production totale de mucus [67]. Les altérations de l’épithélium diminuent donc

la capacité de la barrière physique du poumon à contrer les allergènes et contribuent directement à

l’obstruction bronchique.

L’une des deux parties de la membrane basale, la lamina reticularis, est plus épaisse dans l’asthme.

Elle est constituée d’un réseau de matrice extracellulaire et son épaississement est principalement

causé par la déposition de matrice supplémentaire par les fibroblastes [8]. Les fibroblastes sont en

partie recrutés par les médiateurs profibrotiques, comme le TGF-β, exprimés par les éosinophiles

[68]. Bien que les mécanismes permettant la production et le maintien de la fibrose au niveau de la

membrane basale soient importants dans l’asthme, les détails de ces mécanismes seront discutés plus

profondément à la section 1.3. Il a été suggéré que la fibrose sous-épithéliale puisse être un mécanisme

permettant de contrer la bronchoconstriction en rigidifiant le tissu bronchique [8]. Malgré que

l’épaississement de la membrane basale soit une caractéristique de l’asthme contribuant à

l’obstruction bronchique, la fibrose sous-jacente est souvent désorganisée et fragmentée. Ces

altérations mènent à une perte d’élasticité et de support des bronches et pouvant occasionner la

fermeture des voies aériennes, comme observée dans les cas d’asthme fatal [51]. Le rôle de la fibrose

de la membrane basale est encore mal compris, mais son épaississement contribue néanmoins à la

diminution du calibre des voies aériennes.

14

Le muscle lisse bronchique est la composante de voies aériennes qui contrôle activement le calibre

des voies aériennes et son épaississement corrèle fortement avec la sévérité de la maladie [69]. De

fait, la thermoplastie bronchique, une technique endoscopique visant à réduire l’épaississement du

muscle lisse bronchique, permet de réduire les exacerbations et les visites à l’urgence des patients

avec un asthme sévère incontrôlé [70]. Il est important de noter que le muscle lisse bronchique des

personnes atteintes d’asthme n’est pas intrinsèquement plus fort que celui de personnes non

asthmatiques. La force générée par le muscle lisse bronchique ne dépend que de sa masse [71].

L’augmentation de la masse du muscle lisse bronchique est causée par l’augmentation du nombre de

cellules (hyperplasie) et par l’augmentation du volume cellulaire (hypertrophie) [72]. L’hyperplasie

peut être causée par la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques et le recrutement de

cellules précurseures transformées en myofibroblastes. Ces précurseurs peuvent être des fibrocytes,

des cellules épithéliales, des cellules endothéliales et des péricytes [73, 74]. Toutefois, l’implication

de plusieurs de ces précurseurs dans le l’hyperplasie du muscle lisse bronchique est contestée.

Plusieurs médiateurs promouvant l’hyperplasie et l’hypertrophie du muscle lisse bronchique

proviennent des cellules inflammatoires, dont les mastocytes (protéases, leucotriènes, histamine) et

les éosinophiles (TGF-β, leucotriènes, cytokines) [44]. En plus de participer à l’épaississement de la

paroi bronchique, l’augmentation de la masse du muscle lisse bronchique exacerbe l’obstruction

bronchique induite par les bronchospamogènes.

Le remodelage bronchique est directement relié à l’inflammation chronique de l’asthme allergique.

De fait, l’administration de corticostéroïdes en présence d’inflammation atténue cette dernière et la

progression du remodelage dans les modèles expérimentaux [39, 75] et chez l’humain [38]. De plus,

les corticostéroïdes semblent diminuer la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques

humaines in vitro [76]. Les anti-leucotriènes diminuent le remodelage dans un modèle murin résistant

aux corticostéroïdes [77] et diminuent la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques

humaines in vitro [78]. Cependant, les corticostéroïdes sont inefficaces pour diminuer le remodelage

préétabli chez l’humain alors que l’effet des anti-leucotriènes sur le remodelage préétabli n’a pas

encore été déterminé [38]. Le remodelage bronchique chez l’humain est, à priori, insensible aux

traitements actuels et augmente de manière irréversible l’obstruction bronchique [44]. Ces

observations confirment le besoin criant de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques ciblées sur le

remodelage.

15

1.2.5 Les modèles expérimentaux

L’asthme est une maladie complexe et hétérogène, impliquant un large éventail de types cellulaires

et de processus. Bien que les études impliquant des patients asthmatiques soient considérées comme

étant les plus pertinentes, celles-ci sont souvent limitées par les considérations légitimes d’éthique et

doivent être le moins invasives possible. Elles n’impliquent normalement que des questionnaires, des

analyses des fonctions pulmonaires, comme la spirométrie, et des liquides biologiques comme le

sputum et le sang, même si des études impliquant des biopsies bronchiques sont de plus en plus

utilisées. De plus, les variations génétiques entre les humains apportent des facteurs confondants qui

peuvent être difficiles à identifier lors de l’étude de mécanismes précis. Les modèles expérimentaux

demeurent donc essentiels pour l’avancement de la compréhension de l’asthme et de ses traitements.

Bien que les modèles animaux ne récapitulent pas la totalité des caractéristiques de l’asthme, ils

permettent d’étudier plus finement les mécanismes sous-jacents. Malgré les différences dans

l’architecture pulmonaire entre les humains et les modèles animaux, l’épaississement du muscle lisse

bronchique contribue ubiquitairement à l’hyperréactivité bronchique. Les modèles d’asthme

expérimentaux ont été développés chez plusieurs espèces, dont Mus musculus (souris), Rattus

norvegicus (rat), Cavia porcellusm (cobaye; [79]) et Macaca mulatta (macaque rhésus; [80])

Cependant, ce dernier est limité quant à son accessibilité et la disponibilité des réactifs de laboratoires

applicables. Les cobayes et les rats développent des signes d’asthme incluant une réponse immune

immédiate et une réponse immune tardive [81]. Étant de plus gros animaux que les souris, les rats et

les cobayes facilitent l’étude histologique des voies aériennes. Pour leur part, les modèles de souris

sont peu coûteux, reproductibles et démontrent plusieurs des caractéristiques de l’asthme [81].

Cependant, la présence d’une phase immune tardive est controversée [81] et les signes de l’asthme

semblent se résorber après l’arrêt de l’exposition à l’antigène [82]. La disponibilité d’un nombre

toujours croissant de mutants génétiques murins permet aussi de décortiquer l’implication spécifique

de plusieurs gènes et types cellulaires [83]. Deux lignées murines sont couramment utilisées dans les

modèles d’asthme : C57Bl/6 et BALB/c [84]. Les souris C56Bl/6 développent une inflammation plus

importante que les BALB/c. De plus, la plupart des modifications génétiques sont effectuées dans les

souris C57B/6 [85]. Toutefois, les souris BALB/c développent une inflammation naturellement

polarisée vers la réponse Th2, comparativement à une inflammation Th1 chez les C57B/6. En outre,

les souris BALB/c développent une hyperréactivité bronchique plus importante [81]. Pour ces raisons,

la lignée murine BALB/c est couramment utilisée pour étudier l’asthme allergique.

16

Plusieurs modèles sont utilisés pour induire un asthme murin expérimental. Classiquement,

l’administration intrapéritonéale d’ovalbumine en présence d’un adjuvant permet d’induire une

sensibilisation rapide à cet allergène [82]. Une réexposition des voies aériennes à l’ovalbumine

stimule une réponse inflammatoire de type Th2, dont le recrutement d’éosinophiles, et une

hyperréactivité bronchique [82]. De plus, une administration chronique d’ovalbumine permet

d’induire un remodelage bronchique persistant même après l’arrêt de l’exposition à l’allergène [86].

Bien que les caractéristiques inflammatoires soient similaires à celles observées chez l’humain, ce

modèle nécessite un adjuvant pour obtenir une sensibilisation [83]. Elle est donc fondamentalement

différente des mécanismes naturels de sensibilisation chez l’humain, limitant son applicabilité [81].

De plus, l’administration d’ovalbumine induit éventuellement la tolérance immunitaire [87]. Malgré

les limitations importantes du modèle d’asthme induit par l’ovalbumine, celui-ci reste le modèle le

mieux caractérisé et plus utilisé.

L’utilisation d’allergènes naturels reliés au développement de l’asthme chez l’humain a donc gagné

en popularité. Ces allergènes, dont les antigènes d’acariens domestiques, peuvent induire une

sensibilisation lorsqu’administrés par inhalation et ne nécessitent pas d’adjuvant additionnel. Les

antigènes d’acariens domestiques possèdent une activité protéase favorisant l’activation des cellules

épithéliales [88] et la polarisation de l’inflammation en Th2. L’administration quotidienne de cet

antigène induit une sensibilisation rapide avec production d’anticorps spécifiques et d’IgE totaux. De

plus, cette production d’anticorps est suivie de l’expression pulmonaire d’IL-4 et d’IL-5.

Conséquemment, ce modèle permet le développement d’une forte éosinophilie et d’hyperréactivité

bronchique [89]. Cependant, il y a aussi un recrutement de neutrophiles proportionnel au niveau de

contamination en lipopolysaccharides des antigènes d’acariens domestiques. Notamment, ces

antigènes, comparativement à l’ovalbumine, ne semblent pas induire de tolérance, facilitant les études

d’asthme chronique avec remodelage [83]. L’administration chronique d’antigènes d’acariens

domestiques pour une période minimale de 5 semaines induit un épaississement significatif du muscle

lisse bronchique [90]. La bonne caractérisation temporelle de ce modèle permet de délimiter la phase

de sensibilisation de la phase inflammatoire [89] et donc de cibler les phases et mécanismes pertinents

cliniquement.

Des cellules isolées, humaines ou animales, sont aussi couramment utilisées pour étudier les

mécanismes de l’asthme in vitro. Bien que les cellules isolées ne répliquent pas la complexité de

l’asthme, elles permettent l’étude de types cellulaires spécifiques, de leurs interactions et d’isoler les

effets de médiateurs et de traitements. L’étude de la prolifération et de l’apoptose des cellules

musculaires lisses bronchiques in vivo est ardue, car ces cellules sont peu nombreuses et les cellules

17

apoptotiques sont rapidement éliminées dans le poumon [91]. Par conséquent, les études

pharmacologiques ciblant la capacité proliférative ou la survie cellulaire des cellules musculaires

lisses bronchiques s’effectuent majoritairement sur des cellules isolées. Des lignées de cellules

musculaires lisses bronchiques murines et humaines sont toutes deux disponibles. Les lignées

primaires humaines peuvent être isolées à partir de tissus bronchiques sains ou de patients

asthmatiques. Les cellules musculaires lisses bronchiques issues de patients atteints d’asthme sont

hyperprolifératives comparativement à celles issues de patients non asthmatiques [92]. Toutefois, les

comparaisons entre ces lignées sont remises en question. D’une part, les cellules musculaires lisses

bronchiques normales proviennent principalement de la marge saine de résections pulmonaires et les

cellules musculaires lisses bronchiques asthmatiques proviennent de biopsies bronchiques. D’une

autre part, ces lignées sont pratiquement toujours contaminées par des myofibroblastes qui sont

difficilement différenciés des cellules musculaires lisses bronchiques [93]. La prolifération des

cellules musculaires lisses bronchiques est souvent induite expérimentalement par du sérum fœtal

bovin. Cependant, plusieurs autres facteurs mitotiques peuvent induire leur prolifération, dont

certains médiateurs inflammatoires comme le TNF [94], les leucotriènes [78], l’histamine [95] et la

thrombine [76], et certains médiateurs fibrotique, comme le platelet-derived growth factor, le TGF-

B et le fibroblast growth factor [94, 96]. La présence de matrice extracellulaire stimule aussi la

prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques [97]. Bien que les médiateurs Th2, IL-4 [98]

et IL-13 [99], diminuent la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques, ceux-ci induisent

la production d’éotaxine [100] et donc le recrutement d’éosinophiles produisant des médiateurs

mitotiques. La modulation de la prolifération des cellules musculaires lisses bronchiques par des

agents pharmacologiques varie d’ailleurs selon le mitogène utilisé. Bien que la culture in vitro ne

réplique pas la complexité et l’organisation cellulaire du muscle lisse in vivo, l’utilisation de cellules

musculaires lisses bronchiques isolées permet d’étudier les effets antiprolifératifs de nouveaux agents

pharmacologiques.

En somme, le remodelage des voies aériennes observé dans l’asthme est principalement induit par

une inflammation chronique induisant la persistance de médiateurs cytotoxiques, inflammatoires et

anaboliques. Cet environnement est donc propice au remodelage bronchique. L’épaississement du

muscle lisse bronchique corrèle fortement avec la sévérité et sa contraction contribue directement aux

exacerbations de l’asthme. La découverte de cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer ou de

renverser l’épaississement et l’hypersensibilité du muscle lisse bronchique dans l’asthme ouvrirait la

porte au développement d’outils pharmacologiques potentiellement curatifs.

18

1.3 La fibrose pulmonaire

La fibrose pulmonaire constitue également un phénomène où une accumulation exagérée de cellules

et de tissu cicatriciel cause préjudice à la fonction pulmonaire. Les maladies pulmonaires

interstitielles sont un regroupement de plus de 200 maladies pouvant causer une cicatrisation

irréversible du parenchyme pulmonaire. La maladie pulmonaire interstitielle la plus commune et la

plus sévère est la FPI, représentant 17% à 86% de ces maladies [101]. Elle a une prévalence générale

de 14 par 100 000 habitants aux États-Unis [102]. Cette dernière affecte principalement les hommes,

avec une moyenne d’âge de 66 ans. Sa prévalence ainsi que la mortalité qui y est associée augmente

en fonction du vieillissement [103]. Après le diagnostic, la survie médiane est 2.5 à 3.5 ans, avec plus

de 75% des décès reliés à une défaillance pulmonaire [104]. Les coûts reliés à la FPI aux États-Unis

représentent environ 60 000 de dollars américains par patient [105] pour un total de 2 milliards par

année [106]. Les principaux symptômes des maladies pulmonaires interstitielles sont une dyspnée et

une toux importante. Cependant, ces symptômes sont non spécifiques, ce qui retarde le diagnostic

définitif de FPI de 6 mois à 2 ans [107], contribuant au mauvais pronostic de la maladie. La dyspnée

débute souvent à l’effort, mais elle progresse rapidement et interfère avec les activités quotidiennes

[108]. Bien que la fibrose pulmonaire soit relativement rare et affecte principalement une population

plus âgée, les coûts socioéconomiques qui y sont associés sont considérables.

Plusieurs facteurs peuvent induire ou favoriser le développement de la fibrose pulmonaire. D’une

part, il y a les prédispositions génétiques, comme les mutations de la telomerase reverse transcriptase,

de la telomerase RNA component, de la surfactant protein C et de la surfactant protein A2, qui

peuvent expliquer jusqu’à 15% de la fibrose pulmonaire familiale [109]. D’une autre part, la plupart

des maladies pulmonaires interstitielles non idiopathiques sont associées à un facteur

environnemental et/ou occupationnel. Plusieurs poussières inorganiques inhalées peuvent contribuer

au développement de la fibrose pulmonaire, comme la silice cristalline (silicose), l’amiante

(amiantose) et le charbon (pneumoconiose des mineurs de charbon). Pour leur part, les poussières

organiques d’origines animales, bactériennes ou fongiques peuvent induire une alvéolite allergique

extrinsèque pouvant progresser jusqu’au développement de fibrose pulmonaire [110]. De plus,

plusieurs médicaments, dont les agents chimiothérapeutiques, peuvent induire de la fibrose

pulmonaire. Le mieux connu est la bléomycine, extrait de la bactérie Streptomyces verticillus, qui

peut induire de la fibrose pulmonaire dans 46% des patients traités, et qui s’avère mortelle dans 3%

des cas [111]. Il est important de noter que l’exposition à ces facteurs ne garantit pas de développer

de la fibrose pulmonaire, soulignant l’importance de l’interaction de la génétique, de l’environnement

et de la fréquence des expositions. De plus, le retrait de l’exposition ne permet que de ralentir la

19

progression de la fibrose pulmonaire, car, lorsque la fibrose est établie, elle est irréversible [112]. Les

maladies pulmonaires interstitielles sont un regroupement de pathologies ayant diverses causes

pouvant induire ou promouvoir le développement irréversible de la fibrose pulmonaire.

Les options thérapeutiques pour traiter la fibrose pulmonaire sont limitées. Bien que les traitements

anti-inflammatoires, comme les corticostéroïdes, peuvent diminuer les exacerbations de certaines

maladies pulmonaires interstitielles, comme l’alvéolite allergique extrinsèque et la silicose, ils sont

inefficaces pour ralentir la progression de la fibrose pulmonaire, en plus d’avoir d’importants effets

secondaires [108, 113]. D’ailleurs, la combinaison d’un immunomodulateur, comme l’azathioprine

ou la cyclophosphamide, à un corticostéroïde est controversée, car les effets bénéfiques ne sont pas

plus importants que les effets néfastes [108, 113]. De plus, l’utilisation d’anticorps neutralisant le

TNF, un facteur central à l’inflammation, n’améliore pas la condition des patients atteints de FPI et

augmente même le risque de développer de la fibrose pulmonaire [114]. Les traitements visant les

mécanismes inflammatoires sont donc peu bénéfiques et même potentiellement néfastes dans la

fibrose pulmonaire. Cibler directement les mécanismes fibrotiques a donc gagné en intérêt. De fait,

Nintedanib et Pirfenidone, deux médicaments visant des voies signalétiques impliquées dans la

fibrose [115], ont été récemment approuvés dans plusieurs pays, incluant le Canada, et sont

recommandés par plusieurs regroupements de pneumologues [116]. Ces traitements augmentent le

nombre d’années de vie (ajusté pour la qualité) de six mois, en plus de diminuer significativement la

perte des fonctions respiratoires [117]. Cependant, le rapport coût-efficacité de ces médicaments ne

justifie pas leur utilisation dans plusieurs pays [117, 118]. Présentement, le seul traitement plus

efficace est la transplantation pulmonaire, mais elle n’est normalement offerte qu’à une clientèle plus

jeune (moins de 65 ans). Le temps d’attente médian est d’environ 2 mois et, malheureusement, la

mortalité pendant cette attente varie entre 14 et 67%. Après la transplantation pulmonaire, la médiane

de survie n’est que de 4.5 années [119]. Bien que certains médicaments améliorent légèrement la

survie et la qualité de vie, il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique curatif pour la

fibrose pulmonaire.

1.3.1 La physiopathologie de la fibrose pulmonaire

La fibrose pulmonaire est une condition observée dans plusieurs maladies pulmonaires interstitielles

avec plusieurs étiologies et présentations cliniques. Toutes ces maladies impliquent des altérations

pathologiques des mécanismes de réparation tissulaire interférant avec la bonne fonction du poumon.

Afin de simplifier la discussion, la physiopathologie de la fibrose pulmonaire sera principalement

présentée du point de vue de la FPI, celle-ci représentant la majorité des cas [101].

20

La FPI est caractérisée par une augmentation progressive de l’effort respiratoire impliquant une

diminution du volume pulmonaire, une diminution des échanges gazeux et une perte de compliance

pulmonaire [107]. La FPI est principalement diagnostiquée par tomodensitométrie à haute définition

qui reflète les caractéristiques histologiques. L’épaississement des parois alvéolaires est révélé par

des opacités réticulaires et la destruction des sacs alvéolaires par des arrangements en nids d’abeilles.

Ces altérations sont principalement dans les zones basales et sous-pleurales et sont distribuées de

manière hétérogène [120]. Plus rarement, des opacités en verre dépoli suggérant une infiltration

alvéolaire causée par une inflammation ou une perméabilité vasculaire importante sont observées.

Les biopsies pulmonaires montrent des zones denses de fibrose, possiblement entourées de

myofibroblastes en prolifération (foci fibroblastique) produisant de la matrice extracellulaire [107].

Les altérations fibrotiques hétérogènes du parenchyme pulmonaire causent la diminution de la

fonction pulmonaire dans la FPI.

Bien que la cause exacte de la FPI soit bien sûr inconnue, l’une des principales hypothèses suggère

qu’une injure répétée à l’épithélium pulmonaire induisant une inflammation Th2, couplée à des

prédispositions génétiques, déclenche la maladie. Bien que l’inflammation Th2 permette le

recrutement de cellules inflammatoires favorisant la production de médiateurs profibrotiques [121],

son rôle dans la FPI est encore controversé. Comme la FPI est diagnostiquée tardivement,

l’inflammation est la plupart du temps faible ou même absente [121]. Bien qu’une blessure et

l’inflammation subséquente puissent déclencher une maladie pulmonaire interstitielle , la fibrose

pulmonaire serait maintenue et propagée majoritairement par des mécanismes fibrotiques dérégulés

et découplés de l’inflammation [2].

1.3.2 Les mécanismes de la fibrose pulmonaire

La guérison tissulaire est un mécanisme crucial à la survie de l’organisme, permettant de contrer les

dommages causés par différents traumas, comme les infections bactériennes et virales, les blessures

physiques et les irritants. La guérison implique plusieurs phases (Figure 1.4) se chevauchant plus ou

moins, afin de rétablir la fonction de l’organe : la coagulation, l’inflammation, l’accumulation et

l’activation des fibroblastes ainsi que la résorption de la cicatrice [122]. Si une ou plusieurs de ces

phases devient/deviennent chronique(s), les mécanismes de la guérison deviendraient pathologique.

Ainsi, le modèle actuel planche sur la notion que la fibrose pulmonaire serait le résultat de la

dérégulation de ces mécanismes.

21

Trauma et coagulation

L’agent causal dans la pathogenèse de la FPI, s’il existe, n’a pas été identifié. Cependant, dans

plusieurs autres maladies pulmonaires interstitielles, le facteur causant les dommages pulmonaires est

connu, permettant de tirer des généralisations sur les mécanismes potentiels. Plusieurs types de

dommages peuvent induire de la fibrose pulmonaire et leur récurrence favorise le développement de

la fibrose pulmonaire. La radiation et la chimiothérapie [123] peuvent induire la production d’espèces

réactives de l’oxygène et des altérations du code génétique. Les particules inorganiques peuvent se

rendre dans les alvéoles et produire aussi des espèces réactives de l’oxygène [110]. Les infections

bactériennes et virales peuvent causer des dommages aux alvéoles [124], tout comme l’acide introduit

par un reflux gastro-œsophagien [125]. Ces facteurs endommagent la barrière épithéliale ainsi que

l’endothélium pulmonaire.

La perturbation de la barrière épithéliale contribue au développement de la fibrose pulmonaire. Les

dommages causés aux cellules épithéliales induisent leur apoptose et mènent au dénudement de la

membrane basale [126]. De fait, chez les patients atteints de la FPI, 70 à 80% des cellules épithéliales

alvéolaires de type 2 sont apoptotiques [127], limitant la capacité régénérative de la barrière

alvéolaire. De plus, l’induction de l’apoptose des cellules épithéliales par l’activation de la voie

apoptotique Fas est suffisante pour le développement de la fibrose pulmonaire chez les souris [128].

Les cellules épithéliales alvéolaires de patients souffrants de la FPI surexpriment le tissue factor

catalysant la formation de thrombine à partir de la prothrombine. Ils surexpriment aussi les inhibiteurs

de l'activateur du plasminogène 1 et 2, des anti-fibrinolytiques, favorisant la voie de la coagulation et

la déposition de fibrine [129]. Les cellules épithéliales alvéolaires expriment aussi de grandes

quantités de médiateurs pro-inflammatoires, comme le TNF et l’IL-1β [130], et profibrotiques,

comme le TGF-β, le connective tissue growth factor (CTGF) et le platelet-derived growth factor

[131]. En plus, les cellules épithéliales alvéolaires produisent des médiateurs promouvant une réponse

inflammatoire de type Th2, comme le thymic stromal lymphopoietin, l’IL-25 et l’IL-33 [124].

L’épithélium alvéolaire endommagé induit donc une réponse pro-inflammatoire et pro-fibrotique.

Suite à une blessure, l’étanchéité de la barrière endothéliale est aussi compromise, en partie par

l’altération des cellules endothéliales [132]. Les médiateurs inflammatoires produits en réponse à la

blessure augmentent aussi la perméabilité vasculaire [133]. Cela permet au contenu du sang, incluant

les plaquettes et la prothrombine, de passer dans le parenchyme pulmonaire et l’espace alvéolaire. De

plus, l’augmentation de la perméabilité vasculaire facilite la translocation des cellules immunes en

dehors des vaisseaux sanguins [133]. Le tissue factor produit par les cellules endommagées active la

prothrombine en thrombine, menant à la production de fibrine. D’ailleurs, les facteurs de coagulation

22

VII et X nécessaires pour ce processus sont surexprimés dans la FPI [134]. La fibrine permet d’établir

une matrice temporaire nécessaire à la guérison et sa dégradation est une étape importante de sa

résolution. Cependant, dans la FPI, les anti-fibrinolytiques inhibant la dégradation de la fibrine sont

augmentés [135]. Bien que les anticoagulants inhibent la fibrose pulmonaire expérimentale, les essais

chez l’humain sont non concluants, car les effets secondaires, incluant des défaillances rénales, sont

courants [136]. L’augmentation de la perméabilité vasculaire et des mécanismes de la coagulation

favorise ainsi l’inflammation et la déposition de matrice extracellulaire.

Inflammation

Tel que vu précédemment, l’activation des cellules épithéliales alvéolaires entraine la production de

médiateurs pro-inflammatoires comme le TNF et l’IL-1β (Figure 1.4). L’activation des macrophages

alvéolaires en réponse aux agents irritants ou aux débris cellulaires exacerbe cette production [137].

Ces médiateurs inflammatoires induisent l’expression de chimiokines permettant le recrutement de

cellules immunes, comme les neutrophiles, les lymphocytes T naïfs, les éosinophiles et les

macrophages, qui sont toutes augmentées dans la fibrose pulmonaire [121]. Ces cellules produisent

de grandes quantités de médiateurs pro-inflammatoires et profibrotiques, participant au

développement de la fibrose pulmonaire [121]. Malgré le rôle sans équivoque des médiateurs

inflammatoires dans la guérison tissulaire et le développement de la fibrose pulmonaire, les

traitements anti-inflammatoires sont inefficaces. Bien que l’inflammation semble importante pour le

développement de la fibrose, son impact sur la fibrose avancée demeure contesté.

23

24

Figure 1.4: Étapes de la guérison tissulaire

Suite à un dommage à la barrière alvéolaire, principalement de l’épithélium, il y a passage de

plaquettes et de plasma du sang vers le tissu endommagé ainsi qu’une augmentation de la perméabilité

vasculaire et de la production de médiateurs inflammatoires (Figure 1.4). Ces facteurs combinés

permettent le recrutement et l’activation de plusieurs cellules inflammatoires. Ces cellules

inflammatoires produisent elles-mêmes une panoplie de médiateurs inflammatoires et expriment de

grandes quantités de facteurs profibrotiques. Ces facteurs induisent le recrutement et l’activation des

fibroblastes, incluant leur différentiation en myofibroblastes, ainsi que la production de matrice

extracellulaire (ECM). Normalement, la matrice extracellulaire est dégradée et les cellules impliquées

sont éliminées, menant à la contraction de la plaie. Si une de ces étapes devient chronique, il n’y aura

pas résorption de la matrice extracellulaire et la guérison devient de la fibrose pulmonaire. AA-Mac :

Macrophage alternativement activé; CCL-2 : Chemokine (C-C motif) Ligand 2; CTGF : Connective

tissue growth factor; EMT: Transition épithélio-mésenchymateuse; IL: Interleukine; MMP :

métalloprotéinases matricielles; PAI : Inhibiteurs de l'activateur du plasminogène 1 et 2; PDGF :

Platelet-derived growth factor; TF : Tissue factor; TGF-β: Transforming growth factor-β; Th0 :

Lymphocytes T naïfs; Th2 : Lymphocytes T auxiliaires de type 2 effecteurs; TIMP : Inhibiteur

tissulaire des MMP; TNF : Tumor necrosis factor; Treg : Lymphocytes T auxiliaires régulateurs;

Plusieurs types de cellules immunitaires, et les médiateurs qu’elles produisent, sont impliqués dans

la réponse à un dommage tissulaire (Figure 1.4). Les neutrophiles sont les premières cellules recrutées

et leur rôle primaire est le débridement et l’élimination des pathogènes par dégranulation. Elles

produisent aussi plusieurs cytokines et chimiokines pro-inflammatoires, comme le chemokine (C-C

motif) ligand 2, des élastases et des métalloprotéinases matricielles (MMP)-2 et -9. Ces deux dernières

sont surexprimées dans la FPI [138] et permettent la dégradation de la membrane basale, facilitant le

passage des cellules immunes et l’activation enzymatique du TGF-β latent [139]. Suite à leur

recrutement, les lymphocytes T naïfs sont rapidement polarisés en lymphocytes Th2. Cette

polarisation favorise le développement de la fibrose pulmonaire par plusieurs mécanismes (Figure

1.4). Les lymphocytes Th2 produisent de l’IL-4, de l’IL-5 et de l’IL-13 et ces cytokines sont

surexprimées par les cellules provenant de patients atteints de la FPI [121]. De fait, des inhibiteurs de

l’IL-4 et de l’IL-13 réduisent la fibrose pulmonaire expérimentale [122] et sont présentement en essai

clinique [113]. L’IL-5 promeut le recrutement et l’activation des éosinophiles, ceux-ci produisant des

espèces réactives de l’oxygène, exacerbant le dommage alvéolaire, ainsi que de l’IL-13, du platelet-

derived growth factor et du TGF-β [140]. La présence de TGF-β favorise la différenciation des

25

lymphocytes T en lymphocytes T régulateurs [141] qui produisent de l’IL-10, du TGF-β et du

platelet-derived growth factor. La présence d’IL-13 et d’IL-10 induit la différenciation des

macrophages alvéolaires en macrophages activés alternativement. De fait, les macrophages

alvéolaires des patients atteints de la FPI expriment des marqueurs caractéristiques d’une activation

alternative [142]. Les macrophages activés alternativement produisent du TGF- β, du platelet-derived

growth factor [143] et de l’IL-10 [144]. De plus, ils expriment plusieurs MMP et leurs inhibiteurs

tissulaires, contribuant ainsi à la fibrose pulmonaire. [145]. La polarisation des cellules immunes vers

un phénotype promouvant la réponse allergique participe au développement de la fibrose pulmonaire.

Plusieurs médiateurs inflammatoires ont des effets divergents sur le développement de la fibrose.

Bien que le TNF et l’IL-12 soient pro-inflammatoires, ils diminuent tous deux la fibrose pulmonaire

lorsqu’administrés en phase fibrotique dans les modèles expérimentaux [146, 147]. L’augmentation

de la transcription du TNF inhibe aussi le développement de la fibrose pulmonaire expérimentale, ce

qui est en partie expliqué par l’effet antagonistique du TNF sur la voie du TGF-β [148]. Les

macrophages alvéolaires classiquement activés produisent des médiateurs Th1 [149], comme le TNF.

Des souris recevant un inhibiteur de l’activation alternative des macrophages développement moins

de fibrose pulmonaire [134], supportant un rôle anti-fibrotique des médiateurs Th1. Le rôle du

médiateur anti-inflammatoire et immunosuppresseur IL-10, régulant l’inflammation, est aussi mal

compris. Il est retrouvé en grande quantité dans le fluide du lavage bronchoalvéolaire des patients

souffrant de la FPI [150]. D’une part, la délétion génétique de l’IL-10 exacerbe l’inflammation et la

fibrose induite par la silice [151], l’augmentation de sa transcription systémique par administration

de plasmides intraveineux diminue la fibrose induite par la bléomycine [152] et ses niveaux de

transcrits corrèlent avec la capacité vitale forcée chez les patients atteints de la FPI [153]. D’une autre

part, la transcription accrue de l’IL-10 en absence d’inflammation induit de la fibrose pulmonaire

[154] et sa surtranscription localisée au poumon exacerbe la fibrose induite par la silice [155]. De

fait, il a été montré que les lymphocytes T régulateurs peuvent aussi bien augmenter [156] que

diminuer [157, 158] la fibrose pulmonaire, selon les conditions expérimentales. Bien qu’il soit bien

reconnu que l’inflammation de type Th1 et Th2 ainsi que leur régulation jouent un rôle important

dans le développement de la fibrose pulmonaire, la contribution exacte des médiateurs impliqués

demeure ainsi controversée.

26

Accumulation et activation des fibroblastes

Les fibroblastes sont au cœur de la réparation des tissus conjonctifs et, conséquemment, de la fibrose

pulmonaire (Figure 1.4). Ils proviennent de plusieurs sources, dont les fibroblastes résidents, le

recrutement de précurseurs sanguins, les fibrocytes, ou de la transformation des cellules épithéliales

en fibroblastes [134]. L’accumulation des fibroblastes dépend du recrutement provenant de ces

sources, mais aussi de leur balance proliférative et apoptotique. Plusieurs des médiateurs de la

coagulation et de l’inflammation modulent l’accumulation des fibroblastes (Tableau 1.1). La

thrombine [159] et le facteur de coagulation Xa [160] stimulent la prolifération des fibroblastes. De

plus, la thrombine inhibe leur apoptose [161]. Le platelet-derived growth factor est nécessaire pour

la prolifération des fibroblastes [162] et favorise leur migration [134]. Les médiateurs inflammatoires

de type Th1, comme le TNF et l’IL-1β, et les médiateurs inflammatoires de type Th2, comme l’IL-4

et l’IL-13, contribuent aussi à la prolifération des fibroblastes [163]. Cependant, seuls les médiateurs

Th2 ont un effet anti-apoptotique [164]. Le médiateur anti-inflammatoire IL-10 inhibe la prolifération

des fibroblastes [165], mais augmente la production du chemokine (C-C motif) ligand 2 par les

monocytes, favorisant le recrutement des fibrocytes [154]. Plusieurs médiateurs profibrotiques

favorisent aussi l’accumulation des fibroblastes. Le TGF-β et le CTGF induisent la résistance à

l’apoptose et la prolifération des fibroblastes, respectivement [134]. Le MMP-8 facilite aussi le

recrutement des fibrocytes [139]. Les fibroblastes pulmonaires isolés des lésions fibrotiques de

patients atteints de la FPI (fibroblastes FPI) sont aussi résistants à l’apoptose induite par le ligand Fas

[166], en partie par la modification de histones réduisant la production de Fas [167] et par leur

production de MMP-7 dégradant le ligand Fas [138]. La présence de plusieurs facteurs pro-

inflammatoires et pro-fibrotiques ayant des effets mitotiques, chimiotactiques et anti-apoptotiques,

combinée à un phénotype inhéremment altéré des fibroblastes FPI, favorise l’accumulation anormale

de ces derniers.

L’activation des fibroblastes par divers facteurs de croissance favorise le maintien de la matrice

extracellulaire [168] (Figure 1.4). Le TGF- β (Tableau 1.1) induit la production de la matrice

extracellulaire par les fibroblastes [134]. De plus, il favorise l’accumulation de cette dernière en

diminuant l’expression des MMP et en stimulant la production de leurs inhibiteurs [169]. D’ailleurs,

la surexpression du TGF-β dans les modèles animaux est suffisante pour induire de la fibrose

indépendamment de l’inflammation [170] et le Pirfenidone, un des traitements approuvés pour la FPI,

cible les effets profibrotiques du TGF-β sur les fibroblastes [171]. Le TGF- β induit aussi l’expression

du CTGF qui est nécessaire au maintien de la fibrose [121]. Malgré que son ou ses récepteurs soient

encore inconnus, le CTGF stimule la production de la matrice extracellulaire par les fibroblastes et

27

peut se lier à celle-ci et au TGF-β activé [172]. La surexpression de ce facteur de croissance

spécifiquement dans les fibroblastes est aussi suffisante pour induire une fibrose systémique [173].

Les niveaux de transcrits du CTGF sont d’ailleurs augmentés dans le tissu pulmonaire des patients

atteints de la FPI [174]. L’inhibition du CTGF réduit la fibrose dans plusieurs modèles [172, 175,

176]. Un autre facteur de croissance favorisant la production de la matrice extracellulaire est le

platelet-derived growth factor [177]. Il est important de noter que les récepteurs du platelet-derived

growth factor sont une des cibles du Nintedanib, l’un des traitements les plus prometteurs de la FPI

[178]. Les médiateurs inflammatoires Th1 inhibent plutôt la production de la matrice extracellulaire

[134, 179, 180]. Ces facteurs de croissance contribuent fortement à la déposition aberrante de la

matrice extracellulaire en augmentant sa production et en inhibant sa dégradation.

La régulation quantitative et qualitative de la matrice extracellulaire est aussi un facteur important

dans progression de la fibrose pulmonaire (Tableau 1.1). Bien que la production de matrice

extracellulaire et ses enzymes régulatrices ne soient pas limitées aux fibroblastes, ils en sont les

principaux effecteurs [168]. Les fibroblastes produisent plusieurs MMP, des enzymes dégradant la

matrice extracellulaire, et la plupart des MMP sont surexprimées dans la FPI [138]. Toutefois,

certaines MMP contribuent à fibrose en favorisant la transformation des cellules épithéliales en

fibroblastes (MMP-3; [138]) et l’activation du TGF-β (MMP-2 et MMP-9; [139]). Les fibroblastes

produisent aussi tous les inhibiteurs des MMP (1 à 4) qui sont aussi surexprimés dans les tissus

pulmonaires fibrotiques [181]. Ils inhibent la dégradation de la matrice extracellulaire et leur

surexpression est directement liée son accumulation [181, 182]. La composition de la matrice

extracellulaire est aussi altérée dans la FPI Les fibroblastes pulmonaires de patients atteints de cette

maladie produisent significativement plus d’une forme épissée alternativement de la fibronectine

(Fibronectine contenant des domaines A supplémentaires). Il a été montré que l’expression de cette

forme alternative de la fibronectine est nécessaire au développement de la fibrose pulmonaire dans

les modèles murins [183]. L’inhibition des mécanismes favorisant la dégradation de la matrice

extracellulaire contribue à sa déposition aberrante.

28

Médiateur Prolifération Apoptose Recrutement Production

α-SMA d'ECM

Thrombine ↑ [159] ↓ [161] - - ↑ [184]

Xa ↑ [160] - - - ↑ [184]

CCL2 - - ↑ [154] - -

IL-1β ↑ [163] - - ↓ [179] ↓ [179]

TNF ↑ [163] - - ↓ [180] ↓ [180]

IL-4 ↑ [163] ↓ [164] - ↑ [134] ↑ [2]

IL-5 - - - -

IL-13 ↑ [163] ↓ [164] - ↑ [134] ↑ [2]

IL-10 ↓ [165] - - - -

CTGF ↑ [134] - - ↑ [172] ↑ [185]

PDGF ↑ [162] - ↑ [134] ↑ [177] -

TGF-β - ↓ [134] - ↑ [134] ↑ [172]

Tableau 1.1 : Modulation des mécanismes profibrotiques des fibroblastes

Résumé des effets des médiateurs de la coagulation, inflammatoires et profibrotiques abordées dans

cette thèse sur les mécanismes profibrotiques des fibroblastes. α-SMA : α-smooth muscle actin; CCL2

: Chemokine (C-C motif) ligand 2; CTGF : Connective tissue growth factor; ECM : Matrice

extracellulaire; IL : Interleukine; PDGF : Platelet-derived growth factor; TGF-β : Transforming

growth factor β; TNF : Tumor necrosis factor; Xa : Facteur de coagulation Xa

29

La différenciation des fibroblastes en myofibroblastes est aussi une étape importante dans les

processus de cicatrisations. La différentiation en myofibroblastes est marquée par leur expression de

l’α-smooth muscle actin [112]. Les facteurs de la coagulation induisent la différenciation des

fibroblastes en myofibroblastes [184], tout comme les médiateurs Th2 [2], alors que les médiateurs

Th1 inhibent leur différentiation [134, 179, 180]. Les médiateurs profibrotiques, comme le TGF- β et

le CTGF, induisent aussi fortement l’expression d’α-smooth muscle actin [172, 185] Les

myofibroblastes sont impliqués dans plusieurs mécanismes de la cicatrisation et de la fibrose. Ils

produisent de grandes quantités de matrice extracellulaire et d’inhibiteurs des MMP, favorisant

l’accumulation du premier au dépens de sa résorption [2]. Leur capacité contractile contribue aussi à

l’activation du TGF-β latent [186] en retirant physiquement sa partie inhibitrice. En contexte de

guérison normal, ces mécanismes sont essentiels pour combler rapidement la plaie, mais deviennent

pathologiques lorsque chroniques. La localisation des myofibroblastes est différente des fibroblastes

dans le tissu fibrotique [187]. Les fibroblastes résidant dans les zones fibrotiques denses expriment

le signal transducer and activator of transcription 3 qui est impliqué dans la résistance à l’apoptose

et la production de la matrice extracellulaire. Toutefois, ils ne se différentient pas en myofibroblastes

et prolifèrent peu. Comparativement, les fibroblastes dans les foci fibrotiques (en marge des zones

fibrotiques dense) se différentient en myofibroblastes, produisent aussi de la matrice extracellulaire

et prolifèrent plus vite, mais ils n’expriment pas le signal transducer and activator of transcription

3. Cette différence pourrait participer au maintien de l’environnement profibrotique de ces zones.

Malgré que les myofibroblastes expriment les mêmes médiateurs profibrotiques que les fibroblastes,

leur rôle dans la fibrose a été remis en doute. En effet, il a été montré que l’inhabilité des fibroblastes

à se différentier en myofibroblastes exacerbe la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine [188].

Il a été suggéré que les myofibroblastes sont nécessaires pour la complétion des mécanismes

cicatriciels normaux. L’accumulation et l’activation des fibroblastes et myofibroblastes, ainsi que leur

localisation, affectent profondément la progression et le maintien de la fibrose pulmonaire.

30

1.3.3 Les modèles expérimentaux

L’utilisation de modèles animaux a été essentielle dans l’étude des mécanismes fibrotiques. Ces

modèles peuvent être séparés en deux groupes : les modèles causés par des agents toxiques ou

irritants; et les modèles génétiques.

Les modèles causés par des agents toxiques ou irritants utilisent des agents reconnus pour induire de

la fibrose pulmonaire chez l’humain, comme la silice, l’amiante et la bléomycine. Cette dernière est

la plus étudiée et la mieux caractérisée [189]. Toutefois, ces modèles ne répliquent pas parfaitement

leur pathologie associée, en partie car les méthodes d’administrations utilisées (inhalation,

intratrachéale, intranasale, intraveineuse) affectent fortement la présentation des lésions et de la

fibrose. De plus, le modèle utilisant la bléomycine montre une éventuelle résorption de la fibrose, ce

qui n’est pas observé chez l’humain [189]. Le modèle de fibrose pulmonaire murin induit par la

bléomycine a deux principaux avantages. Premièrement, la bléomycine s’accumule au poumon ce qui

limite les dommages aux autres organes et, deuxièmement, elle est éventuellement éliminée, ce qui

permet la résorption rapide de l’inflammation et une phase fibrotique mieux définie (Figure 1.5)

[189]. Considérant l’inefficacité des traitements anti-inflammatoires, l’isolation de la phase fibrotique

est nécessaire à l’identification de thérapie anti-fibrotiques avec un potentiel chez l’humain [190].

Les modèles de fibrose pulmonaire induite par des agents connus permettent ainsi d’étudier les

mécanismes de la fibrose, mais ne peuvent pas éliminer l’influence des mécanismes d’amplification

et de résolution de l’inflammation aiguë.

Plusieurs modèles ont été développés afin d’éliminer le biais de l’inflammation inhérent à l’utilisation

d’agents toxiques ou irritants. Les modèles génétiques impliquent l’augmentation de médiateurs

profibrotiques (TGF-β et CTGF) et de médiateurs pro-inflammatoires (IL-13, IL-1β et TNF) ou des

mutations liées à la fibrose pulmonaire familiale [189]. Ces modèles ont l’avantage de mieux

caractériser les effets des médiateurs impliqués dans la fibrose pulmonaire. De plus, les modèles de

fibrose induits par l’augmentation du TGF-β ou CTGF permettent de mieux dissocier les effets

inflammatoires des effets fibrotiques. Cependant, ces modèles ne répliquent pas la complexité de la

fibrose pulmonaire humaine [189]. Comme aucun des modèles actuels ne réplique complètement la

présentation et les mécanismes observés dans la FPI, un modèle de fibrose pulmonaire humanisé a

été développé [191]. Le transfert de fibroblastes FPI à des souris ayant une immunodéficience

combinée sévère induit des zones d’accumulation de fibroblastes et de matrice extracellulaire

hétérogènes similaires à la présentation de la FPI [191]. Bien que ce modèle ressemble

histologiquement à la pathologie humaine, l’absence de cellules immunes ne reflète ni

l’environnement pulmonaire normal, ni les traces d’inflammation présentes dans la FPI. Les modèles

31

génétiques ou humanisés permettent de mieux cibler les processus fibrotiques en diminuant l’impact

de l’inflammation, mais par le fait induisent d’autres biais difficiles à évaluer.

Puisque les fibroblastes sont les cellules effectrices centrales dans la fibrose pulmonaire, elles sont

souvent étudiées in vitro. Plusieurs lignées cellulaires sont disponibles, dont les fibroblastes murins

3T3 et des lignées humaines normales ou de patients atteints de la FPI. Toutefois, de notre expérience

ainsi que celle d’autres groupes de recherche [187], les populations de fibroblastes primaires humains

démontrent une variabilité élevée, compliquant l’interprétation des données, et les fibroblastes

primaires isolés de souris requièrent des conditions d’isolation et de croissance spécifiques et

difficilement applicables [192]. Par conséquent, les fibroblastes murins 3T3 restent une lignée

fortement utilisée pour l’étude de la fibrose. Les lignées cellulaires sont souvent utilisées afin

d’identifier les effets des médiateurs endogènes et des outils pharmacologiques sur leur activation et

leur survie. Comme les médiateurs stimulant leur prolifération et leur activation sont nombreux,

l’activité des traitements étudiés peut varier selon le mitogène utilisé. Communément, l’expansion et

la stimulation des cellules sont effectuées en présence de sérum foetal bovin, contenant de grandes

quantités de TGF-β latent [193] et un cocktail complexe de médiateurs lipidiques pro-prolifératifs.

Le choix du modèle de fibrose, in vivo ou in vitro, est donc crucial dans le design et l’interprétation

des résultats des études sur la fibrose pulmonaire.

En somme, le remodelage du parenchyme observé dans la FPI est probablement déclenché par une

blessure tissulaire et l’inflammation subséquente. Toutefois, elle n’est pas nécessaire au maintien de

la fibrose pulmonaire. La progression de la maladie semble plutôt dépendante de l’accumulation de

fibroblastes anormaux et la persistance d’un environnement riche en médiateurs profibrotiques, dont

certains sont produits par les fibroblastes, dont le CTGF. L’identification de cibles thérapeutiques

visant la production de ces médiateurs profibrotiques, l’accumulation des fibroblastes et la déposition

de matrice extracellulaire offrirait de nouvelles alternatives pour la maladie incurable qu’est la FPI.

32

Figure 1.5: Les deux phases du modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine

Ce modèle possède deux phases qui se chevauchent. L’administration d’une dose unique de

bléomycine induit un dommage alvéolaire et une réponse inflammatoire importante. Comme la

bléomycine est éliminée par l’organisme, l’inflammation se résorbe en une ou deux semaines. La

phase inflammatoire est suivie d’une phase fibrotique. La phase fibrotique est caractérisée par une

inflammation limitée, la présence de médiateurs profibrotiques et la déposition de matrice

extracellulaire (ECM). IF-γ : Interféron-γ; IL : Interleukine; TGF-β : Transforming growth factor β;

TNF-α : Tumor necrosis factor-α. Figure utilisée avec permission à partir de Moeller et al. 2008

[190].

33

1.4 Les sphingolipides

Découverts en 1870, les sphingolipides sont une grande famille de lipides (alcools aminés

aliphatiques) fortement conservés évolutivement et partageant des bases communes. Ces bases

sphingoïdes sont la sphingosine, la dihydrosphingosine et la phytosphingosine (présente dans les

levures), mais cette thèse se concentrera sur les sphingolipides à base de sphingosine [194]. Dans la

cellule, les sphingolipides se retrouvent en majorité dans la membrane plasmatique et il a été

longtemps assumé que leur rôle était purement structural. Il a depuis été démontré que plusieurs

sphingolipides possèdent des fonctions signalétiques, certains ayant même des récepteurs

membranaires spécifiques. Les sphingolipides partagent des voies métaboliques et cataboliques

communes, particulièrement la voie de synthèse de novo et la voie de dégradation. Ils peuvent être

séparés en deux groupes : simple et complexe. Bien que les sphingolipides complexes soient abordés,

seuls les sphingolipides simples font l’objet d’une description détaillée dans cette thèse.

Les sphingolipides complexes sont des céramides avec un groupement de tête polaire, comme une

phosphocholine ou une phosphoéthanolamine (sphingomyéline) ou un ou plusieurs résidus de sucres

(glycosphingolipides). La sphingomyéline représente la majorité des sphingolipides [194] et compose

environ 18% de la membrane plasmatique [195]. Ces sphingolipides complexes sont créés dans la

lumière de l’appareil de Golgi et se retrouvent au feuillet extracellulaire de la membrane plasmatique.

Conséquemment, leur groupement de tête polaire limite fortement leur passage au feuillet

intracellulaire [194]. Ces sphingolipides ont un rôle de réserve cellulaire de sphingolipides et un rôle

structurel, modifiant les propriétés physiques de la membrane [196]. Par exemple, ils modifient la

conductivité de la gaine de myéline des neurones (sphingomyéline; [197]) et la barrière hydrophobe

de la peau (glycosphingolipides; [194]). Les glycosphingolipides ont aussi un rôle crucial dans la

gastrulation et l’invalidation de leur production est létale pendant l’embryogenèse [198]. Les

dysfonctions du métabolisme des sphingolipides et de leur réserve, nommées sphingolipidoses,

affectent principalement le système nerveux [199]. Malgré leurs effets biologiques, les sphingolipides

complexes sont majoritairement reconnus pour leur capacité de maintenir une réserve de

sphingolipides.

Les sphingolipides simples incluent la céramide et la sphingosine ainsi que leur dérivé phosphorylé,

la céramide-1-phosphate et sphingosine-1-phosphate (S1P), respectivement. Bien que la céramide-1-

phosphate semble avoir plusieurs effets biologiques [200], nous ne nous intéresserons qu’à la

céramide, la sphingosine et la S1P. Les propriétés physiques et biologiques de ces sphingolipides

simples varient fortement [194]. La céramide est fortement hydrophobe et ne possède pas de

34

groupement de tête, elle se retrouve donc uniquement dans les membranes cellulaires, mais peut

facilement changer de face du feuillet. La sphingosine est amphipathique, possédant une queue

hydrophobe et une tête hydrophile, lui permettant de se retrouver autant dans les membranes que dans

les fluides intracellulaires et extracellulaires. L’absence d’un groupement de tête permet aussi de

librement changer de côtés dans les feuillets membranaires. La sphingosine possède aussi une amine

libre qui favorise son accumulation dans les organelles acides. La phosphorylation de la sphingosine

en S1P la rend relativement hydrophile, mais celle-ci perd la capacité à traverser librement les

membranes et requiert donc un transport actif. Les caractéristiques physiques des sphingolipides

simples permettent la compartimentation de ces molécules dans différentes organelles, comme le

noyau, les lysosomes et le cytosol [201].

Les sphingolipides font partie d’une voie de synthèse complexe. La voie de synthèse (Figure 1.6;

[194, 201]) de novo des sphingolipides commence à la membrane du réticulum endoplasmique, où

une série d’enzymes, incluant la serine C-palmitoyltransferase, permettent la conversion de la sérine

et du palmitoyl-coenzyme A en céramide. Une autre source de sphingolipides simples est la

sphingomyéline qui peut être dégradée par les sphingomyelinases en céramide, principalement dans

les lysosomes. La céramide est le point central entre le reste des sphingolipides simples et les

sphingolipides complexes. La synthèse des sphingolipides complexes requiert le transport de la

céramide dans l’appareil de Golgi, alors que la synthèse des sphingolipides simples s’effectue dans

différentes membranes, dont le réticulum endoplasmique et la membrane plasmatique. La céramide

peut être déacylée par une ceramidase, produisant la base sphingoïde sphingosine. La sphingosine est

phosphorylée en S1P soit par la sphingosine kinase 1 (SphK1), soit par la sphingosine kinase 2

(SphK2). La S1P est une molécule de sortie métabolique pour les sphingolipides, car elle peut être

dégradée de manière irréversible par la S1P lyase en phosphoéthanolamine et hexadecenal. La S1P

peut aussi être déphosphorylée soit par les S1P phosphatase 1 ou 2 [202, 203], soit par les lipid

phosphate phosphatases 1 à 3 [204]. La sphingosine peut être réacylée en céramide par la ceramide

synthase. D’ailleurs, puisque ces lipides sont métaboliquement reliés, il est bien reconnu que des

altérations des niveaux d’une espèce de sphingolipides puissent affecter le niveau d’une autre.

35

Figure 1.6: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine

La sphingosine est produite par une dégradation lysosomale des sphingolipides complexes dans le

réticulum endoplasmique ou par lune dégradation de la sphingomyéline à la membrane plasmique.

La localisation différentielle des sphingosine kinases (SphK) permet l’accumulation sélective de la

sphingosine en sphingosine-1-phosphate (S1P) dans les différents compartiments cellulaires. La

SphK1 peut générer de la S1P à la membrane plasmatique, permettant une signalisation de la S1P

autocrine ou paracrine. La S1P produite par l’une ou l’autre des SphK dans le cytosol peut aussi être

exportée par les ATP-binding cassette (ABC) ou spinster homolog 2 (SPNS2) et contribuer à la

signalisation extracellulaire. La SPHK2 se retrouve dans le noyau et dans les mitochondries et, par sa

production de S1P, interagit avec les histones désacétylases (HDAC) et la prohibitin 2 (PHB2),

respectivement. CMase : Céramidase; COX : Cytochrome c oxidase; PE : Phosphoéthanolamine;

S1PR : Récepteurs de la S1P; Ser + PalCoA : Sérine + Palmitoyl-Coenzyme A; SGPP : S1P

phosphatase; SMase : Sphingomyélinases. Figure adaptée avec permission à partir de Kunkel et al.

2013 [202].

36

La localisation des enzymes de la voie de la S1P et de leur substrat détermine leur activité biologique

(Figure 1.6). Les sphingomyelinases et ceramidases acides sont retrouvées dans les lysosomes [205,

206], les neutres à la membrane plasmatique [207, 208] et à l’appareil de Golgi [209, 210] alors que

les ceramidases alcalines sont présentes au réticulum endoplasmique [211]. La SphK1 est une

enzyme cytosolique et elle peut être activée par sa phosphorylation. L’activation de SphK1 permet sa

translocation à la membrane plasmatique et augmente sa contribution à la production de S1P [212].

De plus, la proximité de la membrane plasmatique augmente l’exportation de la S1P par les ATP-

Binding Cassette transporters [213] et le Spinster homolog 2 [214], permettant une activation

autocrine et paracrine des récepteurs de la S1P. Cette proximité facilite aussi sa liaison au TNF

receptor-associated factor 2, un cofacteur nécessaire à la signalisation du TNF. La SphK2 est aussi

cytosolique, mais sa phosphorylation induit plutôt sa translocation au noyau [215]. Au noyau, la

SphK2 se lie aux histones désacétylases 1 et 2, dont l’activité est fortement inhibée par la S1P produite

[216]. La SphK2 peut aussi s’accumuler dans les mitochondries, où la S1P se lie à la prohibitin 2

[217], régulant l’assemblage et la fonction de l’appareil de respiration mitochondriale. La S1P se

retrouve aussi dans le milieu extracellulaire, mais sa concentration y varie énormément. Alors que la

concentration de la S1P dans le sang se situe entre 0.3 et 1.0 µM [218, 219], sa concentration est 1000

fois moindre dans la plupart des autres tissus [220]. La différence de concentration de la S1P sanguine

et tissulaire induit un gradient de S1P crucial à la migration des lymphocytes vers le sang [221].

Toutefois, la majorité (environ 65%) de la S1P sanguine est liée à l’albumine et les lipoprotéines

[219] et est ainsi non disponible pour ses récepteurs. La S1P sanguine provient principalement des

cellules endothéliales [222], des globules rouges [223] et des plaquettes [224], en plus de la

phosphorylation de la sphingosine sanguine par la SphK1 extracellulaire, exportée par les cellules

endothéliales [225]. Les plaquettes sont aussi une réserve d’une grande quantité de S1P qui est libérée

lorsque de la coagulation. Ainsi, les voies de synthèses et de dégradation de la S1P sont multiples et

tant sa localisation intracellulaire et extracellulaire que sa concentration influencent ses effets

biologiques.

En plus de leur rôle structural, les sphingolipides sont intimement liés à la survie cellulaire [226], le

maintien des fonctions endothéliales [227], la migration cellulaire [201], l’angiogenèse [228] et

l’inflammation [202]. L’administration de céramide et/ou de sphingosine peut induire l’apoptose en

induisant la dépolarisation mitochondriale et en diminuant l’activation de la voie pro-survie

phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B [229]. L’effet de la S1P sur la survie cellulaire dépend

de l’enzyme phosphorylant la sphingosine (SphK1 ou SphK2) et donc de sa localisation. Alors que

la production de S1P par la SphK2 est liée à l’induction de l’apoptose par le relargage de cytochrome

c par les mitochondries [230], la S1P produite par la SphK1 est pro-proliférative [231],

37

potentiellement par son rôle positif dans la fonction autophagique [232]. Les effets extracellulaires

de la S1P sont principalement attribuables aux récepteurs couplés à des protéines G membranaires de

la S1P (Figure 1.7), qui sont au nombre de cinq (S1P1 à S1P5). S1P1 à S1P3 sont exprimés

ubiquitairement, mais S1P4 et S1P5 sont principalement exprimés par les cellules dendritiques et le

système nerveux, respectivement [233, 234]. Les sphingolipides peuvent ainsi affecter plusieurs

mécanismes et types cellulaires.

Les effets de l’activation des récepteurs de la S1P varient selon le type cellulaire et les organes où ils

sont exprimés. L’activation de S1P1 sur les cellules endothéliales augmente l’étanchéité vasculaire,

et son inhibition induit l’extravasation du contenu sanguin dans le parenchyme entourant les

vaisseaux sanguins [235]. Durant le développement fœtal, la délétion génétique du gène de la S1P1

(S1PR1) cause une hémorragie interne causée par une maturation vasculaire incomplète [236]. De

plus, S1P1, et dans une moindre mesure S1P3, participe à l’angiogenèse [237]. S1P1 est aussi

nécessaire pour la migration des lymphocytes hors des tissus lymphoïdes secondaires en réponse au

gradient de la S1P entre le sang et le tissu [201]. La modulation des récepteurs de la S1P sur les

cellules dendritiques inhibe aussi la production de cytokines pro-inflammatoires [238]. Les récepteurs

de la S1P favorisent la migration de plusieurs types cellulaires, comme les cellules dendritiques [239],

les macrophages [240] et les éosinophiles [241]. S1P1 et S1P3 peuvent induire la prolifération

cellulaire [242, 243], alors que S1P2 est principalement antiprolifératif et pro-apoptotique [244].

L’activation des récepteurs de la S1P affecte donc des fonctions physiologiques multiples et variées

dépendamment du type cellulaire stimulé.

38

Figure 1.7: Localisation cellulaire des enzymes et métabolites de la voie de la sphingosine

La sphingosine-1-phosphate (S1P) peut lier cinq récepteurs couplés à des protéines G membranaires

(S1PR1 à 5). Les protéines G (Gi, G12, G13 et Gq) déterminent les réponses cellulaires induites par

l’activation des récepteurs de la S1P. AC : adenylyl cyclase-cyclic AMP; ERK : extracellular signal-

regulated kinase; PLC : phospholipase C; PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase; Rho : Petites

GTPases de la famile Rho; JNK : Jun amino terminal kinase. Figure utilisée avec permission à partir

de Nagahashi et al. [245]

39

1.4.1 Les analogues de la sphingosine

FTY720 a été le premier analogue de la sphingosine synthétisé. Il est un dérivé de la myriocine, un

inhibiteur de la serine C-palmitoyltransferase, qui est produit par certains champignons thermophiles

ayant des effets antifongiques et immunosuppressifs [246]. Malgré la perte de la fonction inhibitrice

de la serine C-palmitoyltransferase, FTY720 conserve sa capacité immunosuppressive. Lorsque

phosphorylé par la SphK2 en FTY720-P [247], FTY720 devient un agoniste de tous les récepteurs de

la S1P, à l’exception de S1P2 [248]. De fait, l’effet immunosuppresseur de FTY720 dépend de son

activité sur S1P1 interférant avec la migration des lymphocytes et induisant la rétention des

lymphocytes dans les organes lymphoïdes secondaires [249]. Cette fonction immunosuppressive a

été mise à profit dans le traitement de la sclérose en plaques, FTY720 étant un traitement approuvé

depuis 2010 [250]. Cependant, le développement d’analogues de FTY720, comme la famille des

AAL, a démontré que les effets des analogues de la sphingosine ne se limitent pas à leur activité sur

les récepteurs de la S1P.

La distribution intracellulaire des analogues de la sphingosine est similaire aux sphingolipides

endogènes et détermine leur activité. Les analogues peuvent être séparés en trois groupes, les

analogues phosphorylables (FTY720 et AAL-R), les analogues préphosphorylés (analogues de la

S1P; FTY720-P et AFD-R) et les analogues non phosphorylable (AAL-S) (Figure 1.8). Les analogues

de la sphingosine non phosphorylés sont amphipathiques et peuvent ainsi être distribués à travers la

totalité des compartiments cellulaires [251]. Comparativement à la sphingosine qui est phosphorylée

autant par la SphK1 que la SphK2, les analogues de la sphingosine phosphorylables sont

préférentiellement phosphorylés par la SphK2 comparativement à la SphK1. SphK2 phosphoryle les

analogues de la sphingosine 30 fois plus vite que SphK1 [252]. La majorité de la phosphorylation de

FTY720 et d’AAL-R est donc effectuée par la SphK2. Il faut noter qu’AAL-R est,

approximativement, phosphorylé 8 fois plus vite et déphosphorylé 2 fois moins vite que FTY720, ce

qui favorise un plus grand ratio d’AFD-R/AAL-R que de FTY720-P/FTY720 [253], du moins chez

la souris. FTY720-P, et probablement AFD-R, ne peut être déphosphorylé que par la S1P phosphatase

1 et la lipid phosphate phosphatase 3 [254]. Les analogues phosphorylés ne peuvent pas passer les

membranes et sont donc restreints aux organelles où ils ont été phosphorylés [255]. Ils peuvent

toutefois être exportés par le spinster homolog 2 et possiblement par les transporteurs ATP-binding

cassette [256]. La principale implication de cette restriction est que l’administration directe

d’analogues préphosphorylés limite préférentiellement leurs effets à la membrane plasmique et aux

récepteurs de la S1P. En somme, l’habileté des analogues de la sphingosine à être phosphorylés

détermine leur distribution et leur disponibilité et conséquemment, leurs effets biologiques.

40

Figure 1.8: Propriétés physiques des analogues de la sphingosine

La propriété amphiphile des analogues phosphorylables de la sphingosine (AAL-R et FTY720) leur

permet de passer à travers la membrane cytoplasmique. Dans le cytoplasme, ils peuvent être

phosphorylés par la SphK2 en AFD-R et FTY720-P, respectivement. Les analogues de la S1P peuvent

soit s’accumuler dans le milieu cytoplasmique, soit être exportés à l’extérieur de la cellule. Dans

l’espace extracellulaire, AFD-R et FTY720-P peuvent tous deux activer quatre des cinq récepteurs

de la S1P, S1P1, S1P3, S1P4 et S1P5. L’analogue non phosphorylable de la sphingosine AAL-S peut

aussi passer la membrane cytoplasmique, mais il ne peut pas être phosphorylé. Il peut toutefois

moduler des cibles intracellulaires comme la protein phosphatase 2A (PP2A). Figure adaptée avec

permission de [257].

41

Les analogues de la sphingosine ont des cibles généralement similaires à celle de la sphingosine

endogène, ils ont donc le potentiel de modifier les mécanismes régulés par cette voie de signalisation.

Alors qu’une activation par la S1P est propice au recyclage des récepteurs à la membrane plasmatique,

les analogues phosphorylés promeuvent leur dégradation de manière dose-dépendante, ce qui peut se

traduire par un phénomène d’antagonisme fonctionnel [258]. La quantité de S1P1 à la surface

cellulaire est particulièrement importante dans le maintien de l’étanchéité vasculaire. En effet, une

concentration physiologique d’analogues de la sphingosine renforce les jonctions endothéliales,

similairement à la S1P endogène, mais une concentration supra-physiologique augmente la

perméabilité vasculaire [259]. Bien que les analogues de la sphingosine ne soient que faiblement

phosphorylés par SphK1, ils lient sa zone catalytique avec une affinité similaire à la sphingosine,

inhibant son fonctionnement [247]. Un mécanisme similaire, quoique moins efficace, est observé

avec la SphK2 [247]. En plus de réduire la phosphorylation de la sphingosine, certains analogues de

la sphingosine inhibent les ceramide synthases [260] et la S1P lyase [261]. Les analogues de la

sphingosine interfèrent ainsi autant avec les voies métaboliques que cataboliques des sphingolipides.

Plusieurs enzymes intracellulaires n’étant pas rattachées au métabolisme des sphingolipides sont

modulées de manière différentielle par la S1P et ses analogues. Par exemple, la protein phosphatase

2A, impliquée dans le contrôle de la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B [262],

est respectivement inhibée et activée par la S1P et ses analogues [263]. À l’inverse, la cytosolic

phospholipase A2, impliquée dans la production de lipides pro-inflammatoires, est activée par la S1P

via S1P3 [264], mais inhibée par FTY720 indépendamment des récepteurs de la S1P [265]. Les effets

biologiques des analogues de la sphingosine ne sont donc pas limités aux mécanismes usuels de la

sphingosine et de la S1P et peuvent avoir des effets divergents à ceux-ci.

1.4.2 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans l’asthme

Dans l’asthme, la balance des sphingolipides endogènes est altérée, ce qui est associé aux mécanismes

de la maladie. De fait, chez les patients atteints d’asthme allergique, la S1P est augmentée dans le

lavage bronchoalvéolaire suite à l’exposition à un allergène [266]. Certaines variantes du gène

orosomucoid like 3 sont fortement associées au développement de l’asthme [267]. Le produit de ce

gène est un inhibiteur de la serine C-palmitoyltransferase nécessaire pour la production de novo des

sphingolipides. Cependant, la relation entre l’orosomucoid like 3 et la régulation des sphingolipides

est mal comprise. Une augmentation mineure des transcrits d’orosomucoid like 3 entraine une

diminution des céramides, alors qu’une augmentation majeure induit l’effet inverse [268]. Toutefois,

l’augmentation de sa transcription chez les souris induit spontanément des signes d’asthme, comme

42

l’hyperréactivité bronchique et le remodelage bronchique [269]. De plus, la transcription

d’orosomucoid like 3 est aussi augmentée dans un modèle murin d’asthme induit par l’ovalbumine

[270]. Toutefois, sa délétion génétique spécifiquement dans les cellules épithéliales exacerbe les

signes d’asthme et implique une augmentation de la S1P [271]. Bien que ces résultats soient

discordants, ils supportent l’importance de la régulation des sphingolipides dans l’asthme.

L’activité de SphK1 et SphK2 influence l’activité des cellules inflammatoires. L’activation des FcεRI

sur les mastocytes par un allergène augmente l’activité de la SphK1 ainsi que la production et

l’exportation de la S1P. Dans un modèle d’asthme expérimental induit par l’ovalbumine,

l’administration d’un inhibiteur spécifique de SphK1 inhibe l’hyperréactivité bronchique,

l’éosinophilie et la production des médiateurs Th2 IL-4, IL-5 et IL-13 [272] ainsi que d’IgE [273].

La production intracellulaire de S1P est liée à l’activation des mastocytes, car cette dernière est

dépendante du ratio S1P/sphingosine cytosolique [274]. De plus, l’activation de S1P1 et S1P2 sur les

mastocytes par la S1P extracellulaire contribue à leur migration et leur dégranulation, respectivement

[275]. L’axe SphK1/S1P est aussi impliqué dans la signalisation du TNF, car la S1P est un cofacteur

essentiel de l’activation du facteur de transcription nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of

activated B cells, impliqué dans la réponse inflammatoire [276]. La S1P peut aussi stimuler des

cellules non inflammatoires. Par exemple, elle sensibilise directement le muscle lisse bronchique à la

contraction induite par la méthacholine [277]. Le métabolisme de la sphingosine et de la S1P est un

mécanisme clé dans la régulation de l’asthme.

Les analogues de la sphingosine sont de puissants immunomodulateurs et affectent plusieurs

mécanismes reliés à l’asthme. L’administration prophylactique d’analogues de la sphingosine, dans

un modèle d’asthme murin induit par l’ovalbumine, inhibe l’inflammation éosinophilique par

plusieurs mécanismes. Par exemple, les analogues de la sphingosine induisent la séquestration des

lymphocytes effecteurs et des lymphocytes naïfs dans certains organes lymphoïdes secondaires. Ils

inhibent aussi la migration des cellules dendritiques aux organes lymphoïdes secondaires par leur

activité sur S1P1 [278]. La présentation de l’antigène est ainsi réduite, inhibant ultimement une

réponse adaptative à l’allergène [279, 280]. Les analogues de la sphingosine peuvent aussi interférer

avec la production de médiateurs inflammatoires comme IL-4, IL-5 et IL-13 [279]. En plus des effets

médiés par les récepteurs de la S1P, les analogues de la sphingosine modulent plusieurs mécanismes

intracellulaires. Les analogues de la sphingosine peuvent activer la protein phosphatase 2A (FTY720

[263]; FTY720-P [281], AAL-S [282]) qui est un suppresseur de tumeur fortement sous-exprimée et

sous-activée dans les cellules mononucléaires sanguines et qui corrèle négativement avec la résistance

aux corticostéroïdes [283]. Dans un modèle d’asthme murin induit par les antigènes d’acariens

43

domestiques, la réactivation de la protein phosphatase 2A par l’administration prophylactique de

AAL-S prévient l’hyperréactivité bronchique, l’éosinophilie, l’infiltration lymphocytaire au poumon

et plusieurs médiateurs inflammatoires [282]. De plus, les analogues de la sphingosine sont de

puissants modulateurs de la survie cellulaire. La phosphorylation intracellulaire d’AAL-R en AFD-R

induit l’apoptose des lymphocytes en induisant un stress important du réticulum endoplasmique, in

vitro [284]. Les analogues de la sphingosine interfèrent avec de nombreux mécanismes promouvant

l’asthme de manière aussi bien dépendante qu’indépendante des récepteurs de la S1P.

1.4.3 Le rôle des sphingolipides et de leurs analogues dans la fibrose pulmonaire

La voie endogène de la S1P est directement impliquée dans le développement de la fibrose

pulmonaire. Dans un modèle de fibrose pulmonaire murin induite par l’irradiation, l’inhibition

pharmacologique de la serine C-palmitoyltransferase, produisant la céramide de novo, diminue le

niveau de la S1P et l’inflammation, retardant le développement de la fibrose [285]. Similairement,

les souris ayant une invalidation génétique de la sphingomyélinase acide sont résistantes au

développement d’inflammation et de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine [286]. De plus,

cette invalidation dans les fibroblastes murins 3T3 interfère avec la production de S1P et du collagène

induit par la bléomycine, in vitro. Il est important de noter qu’une augmentation de la céramide est

observée après une blessure au poumon, comme dans les cas de syndrome respiratoire aigu, et qu’elle

contribue directement à l’œdème pulmonaire [287]. Comme des cycles répétitifs d’injures tissulaires

pulmonaires sont occasionnellement observés dans la FPI, l’augmentation de la céramide pourrait

participer au développement de la fibrose pulmonaire.

L’un des principaux métabolites en aval de la céramide, la S1P, est augmenté dans le sérum et le

lavage bronchoalvéolaire des patients atteints de la FPI [288] et pourrait contribuer à la progression

de la maladie. De plus, la transcription de SphK1 est accrue dans le tissu pulmonaire fibrotique et

corrèle avec les niveaux de transcrits du marqueur des myofibroblastes, l’α-smooth muscle actin, et

la production de collagène. La concentration de S1P dans le lavage bronchoalvéolaire [288] et la

transcription de SphK1 et de SphK2 [289] dans le tissu est négativement associée avec la fonction

pulmonaire et la survie des patients atteints de la FPI. La SphK1 est aussi augmentée dans le tissu

pulmonaire suite à la blessure initiale dans les modèles de fibrose pulmonaire induite par la

bléomycine et la radiation [290] et elle corrèle avec l’augmentation des niveaux de S1P. À l’inverse,

l’invalidation génétique de la SphK1, mais pas SphK2, confère une résistance à la fibrose induite par

la bléomycine, ce qui est répliqué par un inhibiteur combiné de SphK1 et SphK2 [289]. Cette

inhibition réduit la transcription de TGF-β, de fibronectine, de collagène et d’α-smooth muscle actin,

44

culminant par une diminution de la fibrose en général [289]. Dans des fibroblastes murins primaires,

l’exposition à la bléomycine induit une augmentation des niveaux de transcrits de SphK1 dépendante

du TGF-β [289]. De plus, la SphK1 est requise pour la différentiation induite par le TGF-β des

fibroblastes murins et humains en myofibroblastes [291]. La dégradation de la S1P par la S1P lyase

est aussi impliquée dans le contrôle des mécanismes fibrotiques. Contrairement à la SphK1, elle est

inversement corrélée avec la sévérité de la fibrose pulmonaire et sa délétion génétique exacerbe la

fibrose induite par la bléomycine [292]. La S1P lyase est induite par le TGF-β et l’augmentation de

sa transcription diminue la différentiation des fibroblastes en myofibroblastes [292]. Ainsi, plusieurs

études supportent l’hypothèse que la S1P favorise le développement de la fibrose pulmonaire.

Plusieurs études suggèrent cependant que la S1P peut aussi avoir des effets anti-fibrotiques. Chez les

podocytes humains, l’augmentation de la transcription de SphK1 interfère avec celle du CTGF induit

par le TGF-β, réduisant la fibrose [293]. Ce mécanisme n’a cependant pas encore été confirmé dans

d’autres types cellulaires. De plus, la S1P produite par SphK2 pourrait avoir des effets anti-fibrotiques

par l’inhibition des histones désacétylases [216]. De fait, l’expression et l’activité des histones

désacétylases sont augmentées dans la FPI [294]. Leur inhibition interfère avec la signalisation du

TGF-β ainsi que la prolifération des fibroblastes et leur différenciation en myofibroblastes [295]. De

plus, l’activité des histones désacétylases est liée à la résistance à l’apoptose des fibroblastes de

patients atteints de la FPI [167]. La S1P intracellulaire, et en particulier la S1P intranucléaire, aurait

donc des propriétés anti-fibrotiques.

Les analogues de la sphingosine affectent plusieurs mécanismes pro- ou anti-fibrotiques. Dans un

modèle de fibrose pulmonaire induite par le paraquat, FTY720 diminue l’inflammation, la fuite de

fluide vasculaire dans lavage bronchoalvéolaire et ultimement la fibrose [296]. Cet effet est répliqué

dans des modèles de fibrose hépatique [297] et rénale [298]. Toutefois, des doses élevées de FTY720

augmentent la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine en exacerbant la perméabilité vasculaire

dans le poumon [299]. Cette contradiction s’explique par le fait que la modulation de l’étanchéité des

jonctions endothéliales par FTY720 est dose-dépendante [259], qu’une forte concentration de

FTY720 induit la dégradation de S1P1 [300] et que l’augmentation de la perméabilité vasculaire

contribue aux dommages alvéolaires [301]. Toutefois, dans ces études, les analogues ont été

administrés pendant la phase inflammatoire des modèles utilisés, interférant potentiellement avec le

développement du modèle, ce qui ne permet pas de déterminer les effets des analogues sur les

mécanismes fibrotiques en tant que tels.

45

In vitro, les effets des analogues de la sphingosine sont divergents. D’une part, l’activation de S1P2

et S1P3 sur les fibroblastes augmente la production de la matrice extracellulaire, dont le collagène de

type I et la fibronectine, et la transcription du CTGF [302]. De plus, l’activation de ces récepteurs

induit la transformation des cellules épithéliales en fibroblastes [288]. L’activation de S1P3 stimule

la différentiation des fibroblastes en myofibroblastes [303] et inhibe l’apoptose des fibroblastes [304].

D’une autre part, les effets des analogues de la sphingosine indépendants des récepteurs de la S1P

sont principalement anti-fibrotiques. Suite à sa phosphorylation au noyau, FTY720-P, tout comme la

S1P, est un inhibiteur des histones désacétylases de classe I [216]. L’inhibition des histones

désacétylases interfère avec la signalisation du TGF-β et diminue la résistance à l’apoptose des

fibroblastes. Similairement, FTY720 induit l’apoptose des fibroblastes [304]. La voie de signalisation

de la S1P et les analogues de la sphingosine tendent ainsi à avoir des effets profibrotiques par leur

activité sur les récepteurs de la sphingosine, et des effets anti-fibrotiques par leur activité

intracellulaire.

46

2. Chapitre II : Problématique, hypothèses et objectifs

Le poumon est un organe complexe agissant comme barrière avec l’environnement et permettant les

échanges gazeux avec ce dernier. Son fonctionnement optimal est donc d’une importance capitale.

Toutefois, plusieurs pathologies peuvent induire des changements transitoires ou permanents de la

structure du poumon, comme il est en le cas dans l’asthme et la fibrose pulmonaire. Les paragraphes

subséquents résument les raisons pour lesquelles cette thèse a été dédiée à comprendre comment les

sphingolipides et leurs analogues influencent divers aspects du remodelage pulmonaire.

2.1 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre III :

Treatment with a sphingosine analog after the inception of house dust mite-

induced airway inflammation alleviates key features of experimental asthma

L’asthme est une maladie affectant 300 millions de personnes dans le monde [14], dont 10% sont

sévères et résistants aux traitements actuels [20]. Bien que plusieurs types d’asthmes existent, la plus

commune est l’asthme allergique. Ce dernier est la conséquence du développement d’une réaction

immunitaire inappropriée (sensibilisation) contre des particules allergéniques retrouvées

naturellement dans l’air, comme le pollen ou les antigènes d’acariens domestiques [14]. L’exposition

aiguë à ces allergènes induit une inflammation bronchique et une bronchoconstriction importante.

Cependant, plusieurs patients sont résistants aux traitements pharmacologiques actuels [31]. Il est

donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.

Les analogues de la sphingosine sont de puissants immunomodulateurs et l’un d’entre eux, FTY720,

est présentement utilisé avec succès pour le traitement de la sclérose en plaques, une maladie auto-

immune [250]. Dans un modèle d’asthme expérimental murin induit par l’ovalbumine, AAL-R, un

analogue de FTY720, interfère avec la sensibilisation nécessaire au développement de l’asthme [280].

De plus, la forme phosphorylée de ces analogues peut se lier à S1P1 pour séquestrer les lymphocytes

dans les organes lymphoïdes secondaires, diminuant ainsi leur disponibilité [249]. Toutefois, la

sensibilisation à l’ovalbumine avec un adjuvant par voie intrapéritonéale ne représente pas un

phénomène observé chez l’humain. De plus, le traitement en prophylaxie de l’asthme a peu

d’application clinique. Par conséquent, la capacité des analogues de la sphingosine à diminuer

l’inflammation allergique préétablie induite à l’aide des antigènes naturels d’acariens

domestiques a été étudiée. Sur la base des effets immunomodulateurs des analogues de la

sphingosine, nous avons posé l’hypothèse que :

47

L’analogue phosphorylable de la sphingosine AAL-R diminue les signes caractéristiques de

l’asthme aigu.

Afin de tester cette hypothèse, les objectifs suivants ont été poursuivis :

• Définir la cinétique de la réponse inflammatoire allergique induite par les antigènes

d’acariens domestiques.

• Évaluer la capacité d’AAL-R à réduire l’hyperréactivité bronchique et l’inflammation

allergique pulmonaire.

• Déterminer l’impact de AAL-R comparativement à sa forme préphosphorylée AFD-R sur

les populations de cellules inflammatoires au poumon et aux ganglions drainants.

2.2 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre IV :

A Phosphorylatable Sphingosine Analog Induces Airway Smooth Muscle

Cytostasis and Reverses Airway Hyperresponsiveness in Experimental Asthma

Chez les patients atteints d’asthme allergique, une exposition récurrente à un antigène inhalé induit

le remodelage des voies aériennes, dont l’épaississement du muscle lisse bronchique, qui est

fortement impliqué dans la sévérité de l’asthme [51]. Cet épaississement exacerbe l’hyperréactivité

bronchique et d’autres symptômes de l’asthme. Cependant, il n’existe présentement pas de traitement

pharmacologique visant spécifiquement à réduire l’épaississement du muscle lisse bronchique [37].

Bien que les analogues de la sphingosine soient principalement connus pour leurs effets

immunomodulateurs, ceux-ci peuvent moduler des mécanismes impliqués dans la survie cellulaire,

en fonction de leur statut de phosphorylation. L’analogue phosphorylable AAL-R interfère avec la

prolifération cellulaire par l’accumulation intracellulaire de sa forme phosphorylée [284], alors que

l’analogue non phosphorylable AAL-S active un régulateur négatif de la prolifération, la protein

phosphatase 2A [282]. De plus, les analogues de la sphingosine modulent le métabolisme des

sphingolipides, dont la céramide [229] et la S1P [230] qui sont respectivement liées à l’apoptose et à

l’autophagie. À l’aide d’un modèle murin d’asthme chronique et d’études in vitro, le potentiel

d’analogues de la sphingosine à interférer avec la survie des cellules musculaires lisses

bronchiques et à renverser l’épaississement du muscle lisse bronchique a été étudié. En vue des

impacts potentiellement cataboliques des analogues de la sphingosine, nous avons posé

l’hypothèse suivante :

48

AAL-R diminue l’épaississement du muscle lisse bronchique dans l’asthme, et de ce fait, renverse

l’hyperréactivité bronchique préétablie.


• Évaluer l’efficacité d’AAL-R à réduire l’hyperréactivité bronchique et l’épaississement du

muscle lisse bronchique dans un modèle d’asthme chronique montrant du remodelage

bronchique.

• Caractériser l’effet des analogues de la sphingosine selon leur phosphorylation sur la

balance proliférative et apoptotique des cellules musculaires lisses bronchiques in vitro.

• Déterminer le mécanisme cellulaire par lequel AAL-R induit un effet cytostatique.

2.3 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre V

Plusieurs maladies pulmonaires interstitielles peuvent engendrer un processus de cicatrisation

anormal nommé fibrose pulmonaire. Certaines de ces maladies sont causées par un agent connu dont

l’exposition peut être réduite ou éliminée, mais ce n’est pas toujours le cas, comme pour la FPI [7].

Le retrait de l’agent causal permet de ralentir la maladie, mais ne permet pas de rétablir les dommages

déjà encourus [110]. Malheureusement, il n’existe aucun traitement curatif, ce qui explique en partie

l’espérance de vie moyenne de 2 à 3 ans des cas les plus sévères de fibrose pulmonaire, comme la

FPI [104]. La fibrose pulmonaire est caractérisée par une augmentation de la rigidité du poumon, une

réduction du volume pulmonaire et finalement par une diminution des échanges gazeux [107]. Ces

caractéristiques sont causées par l’accumulation de matrice extracellulaire dans le parenchyme

pulmonaire et les alvéoles, altérant l’architecture du poumon. La surexpression de facteurs de

croissance, l’accumulation de matrice extracellulaire par le débalancement entre sa production et sa

dégradation ainsi que la survie et l’activation anormales des fibroblastes et des myofibroblastes sont

directement impliquées dans le développement de la fibrose pulmonaire [121].

Les effets des analogues de la sphingosine sur la fibrose pulmonaire sont controversés. D’un côté,

FTY720 diminue l’inflammation et la fibrose subséquente dans un modèle de fibrose pulmonaire

murin [296]. Cet effet bénéfique est corroboré par des observations similaires dans des modèles de

fibrose hépatique [297] et rénale [298]. D’un autre côté, des doses élevées de ce même analogue

peuvent augmenter la perméabilité vasculaire et exacerber l’inflammation et la fibrose dans un

modèle de fibrose pulmonaire murin [299]. De plus, des études in vitro suggèrent que les analogues

de la sphingosine ont des effets profibrotiques sur les fibroblastes. Un facteur confondant dans cette

49

controverse est l’implication de l’inflammation dans les modèles in vivo, car bien que celle-ci soit

nécessaire au développement de ces modèles, son inhibition ne se traduit pas par une amélioration de

la fibrose pulmonaire chez l’humain [108]. Puisque les analogues de la sphingosine sont de puissants

anti-inflammatoires, la phase inflammatoire de ces modèles doit être minutieusement considérée.

L’impact d’une faible dose d’un analogue de la sphingosine administré durant la phase

inflammatoire ou la phase fibrotique a donc été déterminé dans le modèle de fibrose pulmonaire

induite par la bléomycine. En raison de la nature des impacts généralement profibrotiques des

analogues de la sphingosine sur les fibroblastes in vitro, nous avons testé l’hypothèse que :

Les analogues de la sphingosine favorisent l’augmentation de la fibrose pulmonaire lorsqu’ils sont

administrés en phase fibrotique du modèle de fibrose induit par la bléomycine.


• Délimiter les phases inflammatoires et fibrotiques dans le modèle de fibrose pulmonaire

murin induit par la bléomycine.

• Comparer les effets des analogues de la sphingosine sur la progression de la fibrose selon

la phase traitée.

• Déterminer la modulation des principaux médiateurs fibrotiques in vivo et in vitro par les

analogues de la sphingosine.

2.4 Problématique, hypothèses et objectifs relatifs au chapitre VI:

FTY720 promotes pulmonary fibrosis when administered during the

remodelling phase following a bleomycin-induced lung injury

Les fibroblastes et les myofibroblastes sont les cellules centrales dans la fibrose pulmonaire. Elles

sont retrouvées au cœur des lésions fibrotiques et expriment la majorité de la matrice extracellulaire,

dont le collagène et la fibronectine [168]. De plus, elles expriment fortement les MMP et leurs

inhibiteurs dont la balance contrôle l’accumulation de cette matrice [168]. Les fibroblastes provenant

de patients atteints de la FPI ont un phénotype profibrotique comparativement aux fibroblastes non-

FPI. Ils sont plus résistants à l’apoptose [166, 305], sont plus différenciés en myofibroblastes [112]

et ont un débalancement de leur production de MMP et de leur inhibiteur favorisant l’accumulation

de la matrice extracellulaire [168]. Ils surexpriment aussi plusieurs facteurs profibrotiques, comme le

TGF-β et le CTGF [121, 134] et produisent une forme altérée de la fibronectine [183].

50

La voie de signalisation de la S1P est associée à plusieurs mécanismes reliés aux dommages

tissulaires et à la cicatrisation. Dans le lavage bronchoalvéolaire et les tissus pulmonaires de patients

atteints de la FPI, le niveau de S1P et d’une des enzymes la produisant, SphK1, est élevé [288]. De

plus, les niveaux de transcrits de SphK1 [288] et de l’enzyme dégradant la S1P, la S1P lyase [292],

sont respectivement positivement et négativement associés à la sévérité de la maladie. La SphK1 est

aussi importante dans la signalisation du TGF-β et son invalidation génétique diminue l’inflammation

et la fibrose dans un modèle murin de fibrose pulmonaire [289]. Sobel et al. [302] ont précédemment

montré que la S1P et FTY720 induisent tous deux un phénotype profibrotique dans des fibroblastes

normaux, incluant la production de matrice extracellulaire et de CTGF, et que cet effet semble médié

par S1P3. Aussi, FTY720 stimule la production de CTGF, mais pas de TGF-β, par des fibroblastes

murins 3T3. Toutefois, ces effets n’ont jamais été démontrés avec des fibroblastes fibrotiques. L’effet

de la S1P, en présence ou non d’un antagoniste de S1P3, sur les niveaux de transcrits des

facteurs profibrotiques par des fibroblastes isolés de biopsies pulmonaires de patients atteints

de la FPI a donc été déterminé. Sur la base des résultats montrés au chapitre précédent, nous

posons l’hypothèse que :

La stimulation avec une concentration physiologique de S1P induira la surexpression des facteurs

fibrotiques par les fibroblastes FPI par son activité sur S1P3.


• Caractériser et comparer les niveaux de transcrits de facteurs fibrotiques et de

composantes de la voie de la sphingosine par des fibroblastes provenant de patients

souffrants, ou non, de FPI.

• Déterminer les facteurs fibrotiques modulés par la stimulation avec la S1P.

• Évaluer la capacité d’un antagoniste de S1P3, TY-52156, à renverser la stimulation

profibrotique de la S1P.

51

3. Chapitre III: Treatment with a sphingosine analog

after the inception of house dust mite-induced airway

inflammation alleviates key features of experimental

asthma

3.1 Résumé

Les analogues de la sphingosine peuvent être phosphorylés in vivo et activer des récepteurs

membranaires spécifiques. Lorsqu’administrés en prophylaxie, ils diminuent les signes de l’asthme

expérimental en interférant avec la sensibilisation à l’antigène en inhibant la migration des cellules

dendritiques aux ganglions drainants. Cependant, leur habileté à inhiber l’inflammation pulmonaire

déjà présente reste à démontrer. L’asthme expérimental a été induit à l’aide de l’antigène naturel

D.pteronyssius dans des souris BALB/c. L’analogue de la sphingosine AAL-R a été administré

pendant la phase post-sensibilisation AAL-R et réduit fortement l’hyperréactivité bronchique et

l’inflammation éosinophilique bronchoalvéolaire. De plus, il induit l’apoptose des lymphocytes T

CD4+ et B pulmonaires, sans affecter la migration des cellules dendritiques. La forme

préphosphorylée d’AAL-R est impuissante à induire l’apoptose des lymphocytes, résultant en des

effets anti-inflammatoires diminués comparativement à AAL-R. AAL-R inhibe l’inflammation

allergique préexistante et diminue l’hyperréactivité bronchique en augmentant l’apoptose des

lymphocytes pulmonaires.

52

3.2 Abstract

Background: In vivo phosphorylation of sphingosine analogs with their ensuing binding and

activation of their cell-surface sphingosine-1-phosphate receptors is regarded as the main

immunomodulatory mechanism of this new class of drugs. Yet, prophylactic treatment with

sphingosine analogs interferes with experimental asthma by impeding the migration of dendritic cells

to draining lymph nodes. However, whether these drugs can also alleviate allergic airway

inflammation after its onset remains to be determined. Herein, we investigated to which extent and

by which mechanisms the sphingosine analog AAL-R interferes with key features of asthma in a

murine model during ongoing allergic inflammation induced by Dermatophagoides pteronyssinus.

Methods: BALB/c mice were exposed to either D. pteronyssinus or saline, intranasally, once-daily

for 10 consecutive days. Mice were treated intratracheally with either AAL-R, its pre-phosphorylated

form AFD-R, or the vehicle before every allergen challenge over the last four days, i.e after the onset

of allergic airway inflammation. On day 11, airway responsiveness to methacholine was measured;

inflammatory cells and cytokines were quantified in the airways; and the numbers and/or viability of

T cells, B cells and dendritic cells were assessed in the lungs and draining lymph nodes.

Results: AAL-R decreased airway hyperresponsiveness induced by D. pteronyssinus by nearly 70%.

This was associated with a strong reduction of IL-5 and IL-13 levels in the airways and with a

decreased eosinophilic response. Notably, the lung CD4+ T cells were almost entirely eliminated by

AAL-R, which concurred with enhanced apoptosis/necrosis in that cell population. This inhibition

occurred in the absence of dendritic cell number modulation in draining lymph nodes. On the other

hand, the pre-phosphorylated form AFD-R, which preferentially acts on cell-surface sphingosine-1-

phosphate receptors, was relatively impotent at enhancing cell death, which led to a less efficient

control of T cell and eosinophil responses in the lungs.

Conclusion: Airway delivery of the non-phosphorylated sphingosine analog, but not its pre-

phosphorylated counterpart, is highly efficient at controlling the local T cell response after the onset

of allergic airway inflammation. The mechanism appears to involve local induction of lymphocyte

apoptosis/necrosis, while mildly affecting dendritic cell and T cell accumulation in draining lymph

nodes.

Keywords FTY720; Fingolimod; Gilenya; Dermatophagoides pteronyssinus; apoptosis; dendritic

cells; CD4+ T cells; asthma; S1P; AAL(R), AAL(S), sphingosine

53

3.3 Background

Asthma is a chronic lung disorder with no cure that affects 235 million people worldwide [1]. Asthma

decreases the quality of life and its yearly cost per country ranges from 10 to 266 billion dollars [2].

Although a myriad of interventions exists to alleviate symptoms, current practices only ensure

adequate control of asthma in less than 50 % of patients [3]. Furthermore, up to 10 percent of patients

suffer from severe forms of asthma that are largely refractory to current therapies [4] and too many

still succumb [1]. Given the health and the economic burden of asthma, identification of new

mechanisms and targets for intervention is required.

Sphingosine analogs emerge as potent immunomodulators with therapeutic efficacy proven in

humans. For instance, the drug FTY720 (Fingolimod, Gilenya) is currently used for patients with

multiple sclerosis [5]. The compound AAL-R is an analog of FTY720 that has been broadly used to

study the mechanisms of action of this class of compounds [6-9]. Sphingosine analogs such as

FTY720 and AAL-R are cell-permeant and become phosphorylated intracellularly to become a

sphingosine-1-phosphate (S1P) analog. They are then actively exported from the cells. Owing to their

phosphorylation, the secreted forms of the drugs are cell-impermeant and their mechanisms of action

become then restricted to extracellular effects, which are mediated by binding on four of the five cell

surface S1P receptors (S1P1,3-5) [8]. The archetypal mechanism of action of sphingosine analogs is

sequestration of lymphocytes in secondary lymphoid organs after activation of S1P1 [10]. However,

it is increasingly recognized that activation of S1P receptors following the intracellular

phosphorylation and secretion of the analogs is not the only mechanism underlying their bioactivity.

These compounds can indeed modulate cellular functions independently of S1P receptor engagement,

including among others cell fate and the activity of both phospholipase and phosphatase subsets [6,

11, 12]. The mechanisms of action of sphingosine analogs are thus complex, misunderstood, and

might vary under different pathophysiological conditions.

When administered in a prophylactic fashion, phosphorylatable sphingosine analogs interfere with

the development of experimental allergic airway inflammation. This was demonstrated in the classical

model induced by systemic sensitization with ovalbumin (OVA) emulsified in aluminum (Alum),

followed by airway challenges with OVA (OVA-Alum model) [13]. The mechanism of action under

these conditions is potent inhibition of dendritic cell (DC) accumulation in draining lymph nodes,

interference with antigen presentation, and failure to launch an efficient antigen-specific T cell

response [13, 14]. However, whether the phosphorylatable sphingosine analogs are salutary when

administered in a therapeutic fashion, i.e. after the onset of allergic airway inflammation, is undefined.

Additionally, the efficacy of phosphorylatable sphingosine analogs to interfere with airway

54

inflammation induced by a natural allergen has never been studied. In contrast with the classical

OVA-Alum model, natural allergens have specific modi operandi – including proteolytic activity and

endogenous adjuvant activity [15]. Importantly, the natural allergens evoke a classical allergic

response by local mechanisms involving pulmonary DC when delivered through natural routes of

exposure, such as the airways [16]. They thus recapitulate more genuinely the mechanisms of allergic

airway inflammation in humans.

Under these premises, we aimed to determine if a sphingosine analog, namely AAL-R, alleviates

experimental asthma elicited by subchronic airway inflammation induced by exposure to a natural

allergen, namely Dermatophagoides pteronyssinus (house dust mite extract; HDM). We hypothesized

that treatment with AAL-R after the onset of HDM-induced airway inflammation interferes with

mechanisms leading to key features of asthma in a murine model.

3.4 Methods

3.4.1 Murine Model of Asthma

Pathogen-free BALB/c female mice (8 weeks old, Charles River) were anesthetized with isoflurane

and instilled intranasally (i.n.) with 50 µl of saline or with saline containing 50 or 75 µg HDM extract

(Greer), once daily, from day 1 to 10. Unless otherwise indicated, all measurements were taken at

day 11. The mice were either euthanized with ketamine-xylazine overdose for collection of the

bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and for tissue sampling; or tested for airway responsiveness to

methacholine (MCh) using documented methods [17]. Experimental, housing and care procedures

were approved by the Committee of Animal Care of Laval University in accordance with the

guidelines of the Canadian Council on Animal Care (protocols 2013037, 2009128).

3.4.2 Immunoglobulin Titration

Plates were coated with 50 μg/mL HDM and incubated with serial dilution of serum (1:200 to

1:145800). Titers were determined by a colorimetric reaction as reported [18].

55

3.4.3 Experimental Treatments

Naïve or HDM-instilled mice were treated intratracheally (i.t.) with either 50 µl of distilled water

(dH2O) containing 2.5 µg of AAL-R, or the vehicle (dH2O) from day 7 to day 10. This dose, which

corresponds to 0.1 mg/kg, was chosen because it does not induce histological alterations per se, and

because it was shown to potently induce immunomodulation in the airways [13, 14]. Treatments were

delivered under isoflurane anesthesia and animals were thereafter placed in standard housing

conditions for 1 h until re-anesthesized with isoflurane prior to HDM instillation. In a second series

of experiments, an additional group was treated with a molar equivalent dose (3.5 µg) of the

phosphorylated sphingosine analog, namely AFD-R. Compounds were either provided by Dr Hugh

Rosen (TSRI) or synthetized using published methods (NuChem Therapeutics) [19, 20].

3.4.4 Differential Counts, Flow Cytometric Analyses and Quantification of Cytokines

BALF as well as single-cell suspensions from both the right and central lobes and from draining

mediastinal lymph nodes (MLN) were obtained as previously reported [21]. Antibodies are anti- CD4

(RM4-5) (eBioscience); CD8a (53-6.7), CD11c (N418), CD19 (6D5), CD90.2 (30-H12), Ki-67

(16A8) (Biolegend); MHC-II (2G9) (BD Biosciences). Viability was assessed using annexin V

(Biolegend) and LIVE/DEAD (Life Technologies). Fluorescence and autofluorescence (AF) were

acquired using a Diva-driven LSRFortessa (Becton Dickinson) and analyzed with the FlowJo

software (Tree Star inc). To compute the total numbers of cell subsets, absolute cell counts obtained

with a hemocytometer were multiplied by cell frequencies obtained either by flow cytometry or

following differential cell counts as previously reported [17, 21]. For cytokine quantification, cell-

free BALF were concentrated with Amicon 3K (Millipore) and incubated with cytometric bead array

Flex Set for interleukin (IL)-5, IL-13 and CCL5 according to the manufacturer’s instructions (BD

Biosciences).

3.4.5 Histology

After BALF were performed, the left caudal lobes were processed as previously described [18] and

stained with either hematoxylin and eosin (H&E) for the evaluation of inflammatory cell infiltrate; or

with Periodic Acid-Schiff (PAS) stain and hematoxylin for the evaluation of mucus-producing cells.

Histological evaluation was performed by an American College of Veterinary Pathologists Board-

certified pathologist (CT). The nomenclature used to describe the lesion and the severity of the lesions

56

(5 grades scale) was based on the guidelines provided by the Society of Toxicological Pathology [22,

23].

3.4.6 Measurement of Airway Responsiveness

Methacholine (MCh) challenge test was performed on tracheotomized mice connected to a flexiVent

apparatus (SCIREQ) as previously reported [17].

3.4.7 Statistical Analyses

Unless otherwise stated, the data shown are means ± SEM. Data were analyzed using one-way

ANOVAs. To fulfill the normality and variance assumptions, variables were log-transformed. An arc

sinus transformation on the square root was applied on BALF measurements that were expressed in

percentage. Homogeneity of covariance parameter assumption among groups was verified. A

posteriori comparisons were performed with Tukey’s comparison technique. All reported P values

are based on these transformations. In addition, the nonparametric Kruskal-Wallis test was performed

on histology data. The results were considered significant with p values 0.05, unless otherwise

stated. All analyses were conducted using the statistical package SAS v9.3 (SAS Institute Inc).

3.5 Results

3.5.1 Onset of allergic airway inflammation in response to daily exposure to HDM

In order to ensure that our experimental treatments were undertaken after the inception of local

allergic inflammation, we assessed the kinetics of the systemic and the local allergic responses in this

subchronic model induced by HDM. Inflammation was evaluated in the BALF at day 4, 7, and 11.

Daily i.n. delivery of saline failed to induce accumulation of leukocytes in the BALF (Figure 3.1). In

contrast, HDM delivery was associated with a mild increase of absolute numbers of lymphocytes

(0.22 ± 0.02 x105, Figure 3.1A) and neutrophils (0.29 ± 0.08 x105, Figure 3.1B) in BALF on day 4.

Instillation of HDM also induced the recruitment of eosinophils in the airways with 0.18 ± 0.07 x105

eosinophils in BALF at day 7 (Figure 3.1C). The number of eosinophils reached 2.0 ± 0.6 x105 at

day 11. The appearance of antigen-specific IgG1 (functional equivalent to human IgE) in serum

(Figure 3.1D) coincided with the onset of eosinophilia, validating that sensitization had occurred at

57

that time-point. These results indicated that the onset of allergic airway inflammation was clearly

established at day 7 and it was thus a proper time for initiating the treatment with the sphingosine

analog (Figure 3.2).

3.5.2 AAL-R alleviates airway responsiveness induced by HDM

In patients with allergic asthma, the sensitization phase has already occurred and exacerbations arise

due to inflammatory flares triggered by allergen exposures. To be physiologically meaningful, a

treatment may thus be able to alleviate pathognomonic features of asthma after its onset. We first

determined whether local delivery of AAL-R after the onset of allergic airway inflammation interferes

with alteration of respiratory function (Figure 3.3A). Mice treated daily with saline showed a weak

increase of respiratory system resistance (Rrs) in response to MCh with a delta of 7.1 ± 1.1

cmH2O/mL/s between baseline (0.4 cmH2O/mL/s) and the 1 mg/kg dose. Mice receiving HDM

showed a dose-dependent increase of Rrs that reached 26.9 ± 4.3 cmH2O/mL/s at the highest MCh

dose. In saline-treated mice, AAL-R did not modulate Rrs in response to MCh. On the other hand,

AAL-R inhibited HDM-induced airway hyperresponsiveness by as much as 70% at doses of 0.25 and

0.5 mg/kg of MCh. The functional advantage provided by AAL-R was associated with amelioration

of histological features. For instance, AAL-R decreased median perivascular and peribronchial

accumulation of mononuclear cells (Figure 3.3B; Table I) as well as HDM-associated alteration of

the epithelium, including PAS reactivity and epithelial layer hypertrophy (Figure 3.3C, Table I).

Thus, treatment with AAL-R inhibits functional and histological alterations caused by HDM

instillation.

3.5.3 AAL-R interferes with lung accumulation of cells that drive inflammation induced by HDM

We then set out to investigate whether and by which mechanisms AAL-R affects the ongoing

inflammatory response to HDM in the lungs. The effect of AAL-R on the leukocyte profile in the

BALF was first investigated (Figure 3.4). AAL-R had no drastic effect on numbers of leukocytes in

the group receiving saline instead of HDM. The absolute number of leukocytes decreased from 5.6 ±

0.8 x 105 in vehicle-treated HDM mice to 2.6 ± 0.4 x 105 in AAL-R-treated HDM mice (Figure

3.4A). In mice receiving saline, AAL-R did not affect the proportion of different cell subsets in the

BALF (Figure 3.4B). No eosinophilia was detected in the saline groups and the percentage of

eosinophils was increased to 43 ± 12 by HDM, which was reduced to 14 ± 3 with AAL-R (Figure

58

3.4B). This resulted in an absolute decrease of eosinophil number in the BALF (Figure 3.4C). In cell

suspensions prepared from the lungs, AAL-R decreased AFneg CD11chi MHCIIhi DC numbers by

more than 50% in mice exposed to HDM (Figure 3.4D), which was accompanied by a 90% decrease

of pulmonary CD4+ T cells (Figure 3.4E) and by a 70% decrease of pulmonary CD19+ B cells (Figure

3.4F), when compared with the vehicle-treated HDM-exposed group. The decrease in lymphocyte

numbers in AAL-R-treated mice also occurs in conjunction with a decrease in lymphocyte-secreted

cytokines IL-5 and IL-13 (Figure 3.4G-H), while having no effect on CCL5, a chemokine

predominantly secreted by epithelial cells (Figure 3.4 I). These results support the efficacy of locally-

delivered AAL-R to interfere with accumulation of cells critically involved in the

immunopathological responses seen in allergic asthma.

3.5.4 AAL-R enhances apoptosis/necrosis of lymphocytes in the lung

Although a rich literature supports sphingosine analogs to induce apoptosis, whether or not this

mechanism is involved in the decrease of leukocyte numbers in the lungs remains undetermined. As

previously reported [24] apoptotic/necrotic lymphocytes were detected in the lungs under basal

conditions (Figure 3.5). The percentage of annexin V+ CD4+ T cells changed from 13.3 ± 1.3 in

vehicle-treated HDM-exposed mice to 24.6 ± 1.6 in HDM-exposed mice treated with AAL-R (Figure

3.5A). Similarly, the proportion of CD19+ B cells positive for annexin V increased by 27.9% in AAL-

R-treated mice (Figure 3.5A). Weak to null apoptosis/necrosis was induced in both CD8+ T cells and

the CD90-CD19-AF-SSCmed-hi granulocyte-enriched fraction, supporting cell type-specific

induction of cell death in the lungs. In contrast, a molar equivalent dose of the phosphorylated AAL-

R analog, AFD-R, failed to induce potent apoptosis/necrosis of CD4+ T cells and CD19+ B cells,

when compared with the vehicle-treated HDM-exposed group. Notably, AFD-R was less efficient

than AAL-R to interfere with the T cell and B cell responses in the airways (Figure 3.5B-C), when

compared with AAL-R. Accordingly, AFD-R was also less efficient than AAL-R to inhibit the

eosinophilic response (Figure 3.5D). Thus, a phosphorylatable sphingosine analog, but not its pre-

phosphorylated form, potently induces death of cell subsets that are central to allergic airway

inflammation.

59

3.5.5 Effect of intra-tracheal delivery of AAL-R on lymphocytes and DC in the draining lymph

nodes.

We next addressed the ability of AAL-R delivered into the lungs to interfere with the biology of

draining MLNs. Compared with vehicle-treated mice with experimental asthma, AAL-R mildly

reduced CD4+ T lymphocyte numbers in the MLNs (Figure 3.6A) and failed to modulate CD19+ B

cell and DC numbers in this compartment (Figure 3.6B-C). This is in agreement with the lack of

effect on the frequency of proliferative Ki67+ CD4+ T cells (Figure 3.6D). AAL-R also failed to

modulate the percentage of annexin V+ CD4+ cells and annexin V+ CD19+ cells in MLNs (Figure

3.6E-F). In contrast, AFD-R increased the numbers of CD4+ T cells in MLNs by 85 %; albeit equally

ineffective as AAL-R to alter DC numbers. Thus, on one hand, it appears that AAL-R acts directly in

the lungs without affecting leukocyte numbers in the draining lymph nodes. On the other hand, the

pre-phosphorylated form (AFD-R) seems to preferentially attenuate cell numbers in the lungs by

sequestering lymphocytes in the draining lymph nodes.

3.6 Discussion

Sphingosine analogs are new therapeutic molecules with potent immunomodulatory properties. Yet,

their potential in the treatment of asthma is misunderstood. The main finding of this study is the

efficacy of a phosphorylatable sphingosine analog to interfere with asthma in a murine model after

the onset of allergic inflammation induced by a natural allergen. We also reveal that lymphocyte and

DC numbers in draining lymph nodes are not modulated by AAL-R, as it was previously observed in

the OVA-Alum model of asthma [14]. Conversely, AAL-R attenuates the accumulation of

eosinophils, DC, CD4+ T cells and CD19+ B cells in the lungs. This was associated with significant

decreases of IL-5 and IL-13 levels in the BALF. We also identify the induction of T cell apoptosis as

a significant mechanism contributing to the alleviation of allergic airway inflammation by AAL-R;

and this phenomenon was not observed using the pre-phosphorylated cell impermeant form of the

drug.

60

Previous studies have addressed the roles of S1P pathway modifiers in the phase of intra peritoneal

sensitization with OVA-Alum [25]. In addition, administration of S1P pathway modifiers prior to, or

concomitantly with, repetitive OVA challenges in peripherally sensitized animals was shown to be

effective in preventing cardinal features of experimental asthma [14]. However, it was heretofore

unknown whether the drugs were able to attenuate key features of established allergic airway

inflammation. The findings of the present study represent the first evidence that a phosphorylatable

sphingosine analog can alleviate experimental asthma after the onset of allergic airway inflammation.

It is becoming clear that the airway mucosa can be a critical site for amplification and maintenance

of allergic disease [26]. Consequently, models using natural allergens that cause signs of experimental

asthma when delivered through natural routes are currently preferred to assess the preclinical potential

of experimental treatments [27]. In the model used herein, airway delivery of HDM was sufficient to

trigger functional impairment of the airways, accumulation of T cells, B cells and eosinophils.

Remarkably, all of which were inhibited by AAL-R. In accordance with our current finding, FTY720

dampens eosinophil accumulation within the mucosa in a model of ongoing allergic rhinitis [28].

Unfortunately, the number of DC in draining lymphoid tissues was not assessed in that latter study

[28]. In our study, both local DC and T cells were severely altered by local treatment with AAL-R,

which is a major interest owing to the predominant role played by these cell subsets in pulmonary

inflammation. This alteration of the local T cell response was also associated with a strong decrease

of IL-5 and IL-13 levels in the airways. Of potential importance is the fact that these interleukins can

by themselves increase the contractile capacity of airway smooth muscle [29]. It is thus likely that

AAL-R interfered with airway hyperresponsiveness, at least in part, by reducing the levels of soluble

factors that potentiate the contractile capacity of airway smooth muscle. On note, airway smooth

muscle enlargement is not observed in this acute model; so impairment of this feature may not be

related to the beneficial effect of AAL-R on airway hyperresponsiveness. The location of T cells has

also recently emerged as a critical mechanism influencing the contractile capacity of airway smooth

muscle. Indeed, T cells in the vicinity of airway muscle cells modify their contractile capacity [30,

31]. It is tempting to speculate that the profound reduction of T cell numbers by AAL-R might have

contributed to alleviate hyperresponsiveness by reducing the number of T cells located proximally to

the contractile apparatus of the airways.

The current work also highlights that the immunomodulatory mechanisms of sphingosine analogs

after the onset of allergic inflammation likely differ from the ones observed in the context of a

prophylactic treatment. When administered prophylactically, i.e. prior to airway OVA challenge,

61

sphingosine analogs strongly inhibit antigen presentation in draining lymph nodes, which is

responsible for the alleviation of experimental allergic airway disease [13, 14]. In agreement with

these results, airway delivery of a single dose of AAL-R soon after influenza virus infection inhibits

both DC accumulation in draining lymph nodes and the ensuing immunopathological responses in

the airways [9, 32]. Conversely, our results show that AAL-R strongly inhibits DC accumulation in

the lungs while having mild effects on DC numbers in MLNs over the course of a 4-day treatment.

These results are in line with the ability of sphingosine analogs to interfere with de novo DC

recruitment from blood to tissues [33], and to blunt the release of chemotactic factors in the lung [9,

13]. While we cannot fully exclude the possibility that antigen presentation was modulated, our results

rather suggest that once DCs have migrated to the lymph node, sphingosine analogs are relatively

impotent at interfering with the chain of events leading to the antigen-triggered amplification of

lymphocytes.

Although several studies used local delivery of sphingosine analogs [9, 13, 14, 21, 34, 35], and

sphingosine analogs are well known inducers of cell death [11], this is the first evidence supporting

the idea that cell death could contribute to alleviate allergic airway disease. Indeed, aminoalcohols

like AAL-R readily penetrate the plasma membrane and become phosphorylated intracellularly to

interfere with cell survival [11]. Accordingly, we show that AAL-R, but not AFD-R, potently induces

lymphocyte apoptosis/necrosis in the lung. This is consistent with AAL-R’s rapid phosphorylation,

low turnover, and potent induction of apoptosis in murine splenocytes through intracellular

accumulation of AFD-R [7]. Interestingly, AAL-R-induced apoptosis/necrosis appears to affect

CD4+ T cells and B cells, which are crucially involved in allergic airway disease, while having no

effect on CD8+ T cells, DCs and the CD90-CD19-AF-SSCmed-hi granulocyte-enriched fraction.

These results certainly argue against a non-specific toxic effect. Of note, FTY720 was associated with

preferential apoptosis of activated T cells in another model [36], while not potently affecting DC

apoptosis in vitro [37] and myeloid leukocyte apoptosis in vivo [38]. In a preclinical perspective,

drugs that are customarily used to treat asthma can induce apoptosis in cells from the airways,

supporting the viability of this drug-related mechanism of action in humans [39, 40].

Lymphopenia has long been associated with the immunomodulatory effects of sphingosine analogs.

Yet, a number of facts challenge the idea that systemic lymphopenia per se is central to

immunomodulation. Indeed, local treatments with sphingosine analogs induce more potent

immunosuppression than systemic delivery [9]. In addition, naïve T cells are more sensitive to

sphingosine analogs-induced lymphopenia than activated T cells [41]. Our results reveal that distinct

mechanisms of action could be associated with the non-phosphorylated and the phosphorylated forms

62

of the compounds. Specifically, our results demonstrated that AAL-R induces a more severe local T

cell inhibition than AFD-R, which correlates with the ability of this AAL-R to induce local death of

lymphocytes. The idea that lymphopenia-independent mechanisms could explain, at least in part, the

local immunosuppression induced by sphingosine analogs is also supported by the observation that

prophylactic treatment with the non-phosphorylatable AAL-S enantiomer, yet at a somewhat superior

dosage than in the current study, inhibits cytokine release as well as T cell and DC accumulation in

the airways in a model of experimental asthma [6]. This effect was associated with activation of

protein phosphatase 2A, but it remains unknown if such mechanism is viable when the treatment is

administered in a non-prophylactic fashion.

3.7 Conclusion and declarations

We conclude that a phosphorylatable sphingosine analog can interfere with allergic airway

inflammation caused by a natural allergen, resulting in improved respiratory function. The

mechanism of action appears to differ from that previously observed in a prophylactic context. Our

results also support that the phosphorylation status of the drug can influence the mechanisms by which

the immune response is modulated, with enhancement of T cell apoptosis being restricted to the non-

phosphorylated form.

63

3.7.1 Competing interests

The authors declare that they have no competing interests. Claudine Tremblay is employed by Charles

River Laboratories. None of the work was supported by Charles River Laboratories.

3.7.2 Author contribution

Conception and design: DM, NF, ASD, MRB, ElB; Acquisition of data : DG, LL, AML, AL, EmB ;

Analysis and interpretation of data: DG, LL, AML, CT, ASD, YB, DM; Drafting the manuscript for

important intellectual content: DM, AML ; substantial involvement in its revision DG, LL, ElB, AL,

EmB, NF, MRB, ASD, YB, CT.

3.7.3 Acknowledgements

We thank Serge Simard for statistical analyses, Marc Veillette and Marie-Josée Beaulieu for their

help and expertise. We thank Hugh Rosen for providing AAL-R and Daniel Guay for technical

support with synthesis of sphingosine analogs.

Supported by CIHR grant # 274357 and funding from the Respiratory Health Network of the FRQS.

DG receives a scholarship from the Training program in respiratory health of Quebec – IRSC. DM,

MRB, NF, EB are members of the FRQS Respiratory Health Network and DM, NF, MRB are FRQS

Junior 1 Scholars.

64

3.8 References

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67

3.9 Figures

Figure 3.1: The onset of allergic inflammation is established at day 7

Mice received HDM (□) or saline (SAL) (◊) i.n. once-daily for 0, 3, 6 or 10 days and were then

euthanized 24 h after the last exposure. BALF were performed and differential cell counts were

determined for A) lymphocytes, B) neutrophils, and C) eosinophils. D) Serum HDM-specific IgG1

titers were also quantified. n = 4 per group and * indicates significant differences in corresponding

days between SAL- and HDM-exposed mice. P <0.05 N.D.: not detected

68

Figure 3.2: Experimental design

Mice were instilled i.n. with HDM or saline (SAL) from day 1 to 10, along which time they were also

treated i.t. with vehicle (dH2O) or dH2O containing 2.5 µg of AAL-R from day 7 to day 10, one hour

before HDM administration. In a subset of experiments, 3.5 µg of AFD-R (molar equivalent of AAL-

R) were used instead of AAL-R. 24 h after the last exposure, mice were either euthanized for the

collection of BALF and tissue sampling or tested to assess their degree of airway responsiveness to

MCh.

69

70

Figure 3.3: AAL-R interferes with hallmarks of asthma induced by HDM

Figure 3.3: AAL-R interferes with hallmarks of asthma induced by HDM. A) The degree of airway

responsiveness was assessed by monitoring the change of respiratory system resistance (Rrs) during

doubling doses of MCh. Paraffin-embedded tissue sections of lung stained with either H&E to assess

B) inflammatory infiltrates in the peribronchial/perivascular regions or C) PAS to label mucus-

producing cells. n = 4-5 mice per group and * indicates significant differences P <0.05. bar = 150 µm

71

Figure 3.4: AAL-R inhibits allergic airway inflammation

BALF was assessed to determine: A) the total number of cells; B) the differential count of cells; and

C) the total number of eosinophils. Inflammation was also assessed in single-cell suspensions derived

from digested lungs to determine: D) The total number of AFneg MHC-IIhi CD11chi DC; E) the

number of lung AFneg SSClow CD90.2+ CD8neg CD4+ T cells; and F) the number of lung AFneg

SSClow CD90.2neg CD19+ B cells. Levels of G) IL-5, H) IL-13, and I) CCL5 were also quantified

in BALF. Shown is representative of two independent experiments . n = 4-5 per group and * signifies

significant differences at P <0.05 (# P ≤ 0.07).

72

Figure 3.5: AAL-R increases lymphocyte apoptosis/necrosis in the lungs

Single-cell suspensions obtained from the lungs to determine: A) the frequency of apoptotic/necrotic

annexin V+ cells in two subpopulations of cells, namely AFneg SSClow CD90.2+ CD8neg CD4+ T

cells (upper panels) and AFneg SSClow CD90.2neg CD19+ B cells (lower panels); B) the number

of CD4+ T cells; and C) the number of CD19+ B cells in the lung. Total number of eosinophils was

also determined in the BALF (D). Shown is representative of two independent experiments. n = 6-8

mice per group and * indicates significant differences versus VEH; § indicates significant differences

versus AAL-R. P <0.05

73

Figure 3.6: Effects of non- or pre-phosphorylated analogs in draining lymph nodes

Single-cell suspensions derived from MLNs were obtained to determine: A) the total number of

AFneg SSClow CD90.2+ CD8neg CD4+ T cells; B) the total number of AFneg SSClow CD90.2neg

CD19+ B cells; C) the total number of MHC-IIhi CD11chi DC; D) the frequency of Ki67+ CD4+ T

cells; E) the frequency of apoptotic/necrotic CD4+ T cells; and F) the frequency of apoptotic/necrotic

CD19+ B cells. Apoptosis and proliferation could not be evaluated in saline mice given the paucity

of cells. n = 6-8 mice per group and * signifies significant differences P <0.05. For panels A to C,

means of all experimental groups are statistically different from SAL. Shown is representative of two

independent experiments.

74

3.10 Tableaux

Table 3.1: Histopathological alterations of mice lungs exposed to HDM

Saline HDM

Treatments: VEH AAL-R VEH AAL-R

Perivascular infiltration of mononuclear cells 0 0 2* 1†

Peribronchial/bronchiolar infiltration of mononuclear cells 0 0 2* 1†

Perivascular infiltration of granulocytes 0 0 2* 1

Hypertrophy/hyperplasia of the bronchial epithelium 0 0 3* 1†

Results are expressed as median scores for each group, graded on a scale from 0 (no alteration) to 5

(severe alterations). 4-5 mice per group were analyzed. * : P < 0.001 between HDM and Saline; † :

P< 0.01 between AAL-R and vehicle

75

4. Chapitre IV: A phosphorylatable sphingosine analog

induces airway smooth muscle cytostasis and reverses

airway hyperresponsiveness in experimental asthma

4.1 Résumé

L’épaississement du muscle lisse bronchique corrèle fortement avec la sévérité des symptômes de

l’asthme. Cependant, les traitements pharmacologiques actuels sont inefficaces pour le réduire. Bien

que les analogues de la sphingosine soient principalement connus pour leurs effets

immunomodulateurs, ils possèdent aussi des effets associés à l’atrophie tissulaire. Les mécanismes

d’action des analogues de la sphingosine varient selon leur statut de phosphorylation. Un modèle

d’asthme chronique a été induit chez des souris BALB/c par l’antigène naturel D.pteronyssius. Les

effets sur l’hyperréactivité bronchique et l’épaississement du muscle lisse bronchique de l’analogue

phosphorylable AAL-R et de l’analogue non phosphorylable AAL-S ont été testés en absence

d’inflammation aiguë. AAL-R, mais pas AAL-S, diminue l’hyperréactivité bronchique et

l’épaississement du muscle lisse bronchique. In vitro, uniquement AAL-R inhibe la prolifération des

cellules musculaires lisses bronchiques humaines. Cet effet semble indépendant de l’activation des

récepteurs de la S1P et implique plutôt l’accumulation intracellulaire de la forme phosphorylée

d’AALR.

76

4.2 Abstract

In asthma, excessive bronchial narrowing associated with thickening of the airway smooth muscle

causes respiratory distress. Numerous pharmacological agents prevent experimental airway

hyperresponsiveness when delivered prophylactically. However, most fail to resolve this feature after

disease is instated. Although sphingosine analogs are primarily perceived as immune modulators with

the ability to prevent experimental asthma, they also influence processes associated with tissue

atrophy, supporting the hypothesis that they could interfere with mechanisms sustaining pre-

established airway hyperresponsiveness. We thus assessed the ability of a sphingosine analog (AAL-

R) to reverse airway hyperresponsiveness in a chronic model of asthma. We dissected the

pharmacological mechanism of this class of agents using the non-phosphorylatable chiral isomer

AAL-S and the pre-phosphorylated form of AAL-R (AFD-R) in vivo and in human airway smooth

muscle cells. We found that a therapeutic course of AAL-R reversed experimental airway

hyperresponsiveness in the methacholine challenge test, which was not replicated by dexamethasone

or the non-phosphorylatable isomer AAL-S. AAL-R efficiently interfered with airway smooth muscle

cell proliferation in vitro, supporting the concept that immunomodulation is not necessary to interfere

with cellular mechanisms sustaining airway hyperresponsiveness. Moreover, the sphingosine-1-

phosphate lyase inhibitor SM4 and the sphingosine-1-phosphate receptor antagonist VPC23019 failed

to inhibit proliferation, indicating that intracellular accumulation of sphingosine-1-phosphate or

interference with cell surface S1P1/S1P3 activation, are not sufficient to induce cytostasis. Potent

AAL-R-induced cytostasis specifically related to its ability to induce intracellular AFD-R

accumulation. Thus, a sphingosine analog that possesses the ability to be phosphorylated in situ

interferes with cellular mechanisms that beget airway hyperresponsiveness.

77

4.3 Introduction

Asthma is a prevalent and complex syndrome [1]. Alarmingly, a significant proportion of asthmatic

patients responds poorly to mainstay therapies, some achieving symptom control only with oral

prednisone; and others remaining refractory to any pharmacological option currently available [2].

There is thus a dire need for new therapeutic options in asthma.

One of the distinctive features of asthma is airway hyperresponsiveness (AHR). Among the multiple

factors that interact to elicit AHR, the increased amount of smooth muscle within the airway wall is

thought to contribute significantly. This paradigm is fuelled by several observations. First, the amount

of airway smooth muscle (ASM) is positively correlated with the severity of asthma [3]. Second, the

capacity to generate stress (force per cross-sectional area) is identical between asthmatic and non-

asthmatic ASM tissues [4], implying that the amount rather that the stress-generating capacity of

ASM is involved in AHR. Third, airway narrowing measured directly ex vivo is determined by the

amount of ASM [5]. Strategies that aim at reducing the amount of ASM should benefit asthmatic

patients by reducing their level of airway responsiveness. In this regard, bronchial thermoplasty, an

interventional procedure proven to reduce ASM volume [6], decreases by nearly 50% the rate of

exacerbations in patients with moderate to severe persistent asthma [7]. However, there is currently

no pharmacological treatment that efficiently reverses ASM thickening.

Classically, sphingosine analogs like FTY720 and AAL-R were recognized as sphingosine-1-

phosphate (S1P) receptor modulators on the basis of their propensity to be phosphorylated in vivo by

sphingosine kinase 2 (SphK2), and to induce S1P receptor-mediated events including lymphopenia

and bradycardia [8, 9]. Yet, an emerging body of evidence now supports the concept that sphingosine

analogs may counteract mechanisms that sustain or promote ASM thickening. For instance the non-

phosphorylatable sphingosine analog AAL-S reverses the inhibition of protein phosphatase 2A

(PP2A) (Figure 4.1) [10, 11] that occurs in allergic airways, which could potentially interfere with

proliferative cascades associated with ASM cell expansion. Other evidence suggests that high doses

of the sphingosine analog FTY720 influence the levels of ceramides [12], which are potent inducers

of apoptosis and modulators of chronic inflammation. In addition, intracellular S1P can cause

autophagy [13] and inhibit proliferation [14], which in turn, could counteract ASM thickening [15].

Importantly, in vitro data show that sphingosine analogs can counteract cell amplification and/or

survival via SphK2-dependent intracellular accumulation of phosphorylated sphingoid bases [16, 17].

In agreement with this growing body of evidence, we tested the concept that this class of agents could

reverse ASM thickening. We show that the sphingosine analog AAL-R efficiently reverses AHR and

the underlying thickening of ASM. We unravel the potential for this class of agents to act directly on

78

ASM cells and to induce cytostasis by a mechanism featuring intracellular conversion of AAL-R to

its phosphorylated form.

4.4 Methods

4.4.1. Murine model and experimental treatments

Pathogen-free BALB/c female mice (8 weeks old, Charles River, Saint-Constant, CAN) randomly

assigned to experimental groups were anesthetized with isoflurane and instilled intranasally with 50

µl of saline or with saline containing 50 µg of house dust mite (HDM) extract (D. pteronyssinus;

Greer, Lenoir, NC), 3 times a week, for 5 weeks. Mice were then left untouched during week 6 (Figure

4.2). Sphingosine analogs (AAL-S or AAL-R; see [18]) or dexamethasone (Sigma Aldrich, Oakville,

CAN) were injected i.p. at a dose of 1 mg/kg once daily from day 7 to day 14 following the last HDM

instillation, and compared with a group receiving an equal volume of the vehicle. Twenty-four hours

following the last injection, mice were anesthetized with ketamine-xylazine and loss of toe-pinch

reflex was verified. Mice were then tracheotomised and connected to the flexiVent apparatus

(SCIREQ, Montreal, CAN) to measure the level of airway responsiveness to methacholine (OMEGA,

Montreal, CAN) as described previously [19]. To avoid artifacts due to spontaneous respiratory

muscle contractions, mice were paralyzed with pancuronium (Sandoz, Boucherville, CAN). Heart

rate was monitored until euthanasia in order to ensure proper anesthesia. Bronchoalveolar lavage fluid

was harvested as described [18] and tissues were then fixed in phosphate buffered saline containing

4% paraformaldehyde for histological analyses. Experiments, housing and care procedures were

approved by the Committee of Animal Care of Université Laval in accordance with the guidelines of

the Canadian Council on Animal Care (protocol 2013037).

4.4.2. Histological analyses

Five micrometers-thick paraffin-embedded transverse lung slices were stained with Masson’s

trichrome for quantification of ASM thickness. Using NDP View (Hamamatsu Photonics,

Hamamatsu city, JP), the length of the basal membrane and the area of ASM for individual circular

bronchi was measured. ASM thickness was defined as area of ASM divided by the length of the basal

membrane. Two to five bronchi were measured blindly per lung and the average size of bronchi did

not differ between groups.

79

4.4.3. Cell Culture

Human primary ASM cells (CC-2576; Lonza, Walkersville, MD) were plated at a density of 104 cells

per cm2 in Dulbecco’s Modified Eagle Medium containing 10% fetal bovine serum (complete

medium) for 24 h, and then incubated with sphingosine analogs, the S1P lyase inhibitor (SM4; [20])

or the dual S1P receptor (S1P1-3) antagonist (VPC23019; Tocris, Burlington, CAN) for 24 to 72 h.

Cells were either incubated with tetrazolium dye (MTT assay; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide; Sigma Aldrich, Oakville, CAN) to determine the viable cell numbers;

or incubated with bromodeoxyuridine (BrdU; 5-Bromo-2'-deoxyuridine; Roche, Laval, CAN)

overnight to assess proliferation. Flow cytometric analyses were performed as described [18].

4.4.4. Quantification of sphingolipids.

Cell pellets were spiked with internal standards (C17-sphingosine Cayman Chemical, Ann Arbor,

MI; C17-S1P, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) and lipids were extracted using a published method

[21]. Liquid chromatography tandem-mass spectrometry was performed at PhenoSwitch Bioscience

Inc (Sherbrooke, CAN). Liquid chromatography gradient was performed using 0.2% v/v formic acid

in water and with 0.2% v/v formic acid with 10 mM ammonium formate in methanol on a reversed

phase Halo PFP column (Advance Materials Technology, Wilmington, DE), which was maintained

at 50°C. Acquisition was performed with an ABSciex TripleTOF 5600 (Sciex, Foster City, CA)

equipped with an electrospray interface. Quantification was done using the area under the curve with

the MuliQuant software (Sciex). See supplementary material for details.

4.4.5. Statistics

Data were expressed using mean ± SEM. Homogeneity of variance and normality of the data were

verified. When appropriate, variables were log-transformed. Rank transformation and the ordinary F

test from ANOVA were used when appropriate. Data from mice were analyzed using ANOVAs or

two-way ANOVAs with an interaction effect. When heteroscedasticity was significant, the statistical

analyses were performed using separate residual variance per group. The Satterthwaite’s degree of

freedom statement was added for unequal variance structure. Posteriori comparisons were performed

using Tukey’s comparison. When appropriate, bi-directional unpaired t-test was employed. The

results were considered significant with p-values 0.05. Data were analyzed in collaboration with a

professional biostatistician at the IUCPQ biostatistics core service using the statistical package

program SAS v9.4 (RRID:SCR_008567; SAS Institute Inc., Cary, NC).

80

4.5 Results

4.5.1. AAL-R reverses airway hyperresponsiveness and airway smooth muscle thickening.

Using a model where persistent ASM thickening and AHR are pre-established using chronic exposure

to HDM (Figure 4.2), we first evaluated the in vivo potential of AAL-R to reverse AHR, when

administered at well-tolerated doses, yet sufficient to induce biological effects. We found that AAL-

R (1 mg/kg/day) reversed HDM-induced AHR to a level 70 % lower than the vehicle treatment

(Figure 4.3). Contrary to AAL-R, corticosteroid intervention (dexamethasone; 1 mg/kg/day) failed to

reverse AHR, furthering the concept of usefulness for sphingosine analogs in the context of asthma.

On that note, we previously showed that AAL-R efficiently interfered with the inflammatory cascade

in response to HDM soon after its instatement in the airways [18]. In face of differing immune

mechanisms occurring in the remodeled airways [22, 23], and since alleviation of eosinophilic

inflammation can interfere with pathogenic mechanisms of asthma, we also confirmed that AAL-R

blunted the antigen rechallenge-induced lymphocyte accumulation in the bronchoalveolar lavage

fluid, which was accompanied by a profound 54% decrease of eosinophil numbers (Supplementary

Figure 4.1).

Since ASM thickening is central to the development of AHR, we performed a new series of

experiments where lungs of mice receiving either AAL-R or vehicle after chronic HDM exposure

were stained with Masson’s trichrome, in order to visualize the ASM layer located between the

epithelium and the parenchyma (Figure 4.4A). Mice receiving saline and vehicle were used as

baseline controls. Planimetry on transverse lung slices revealed an average bronchial smooth muscle

thickness of 4.1 ± 0.6 µm in the group receiving saline and vehicle. In the group receiving HDM and

vehicle, ASM thickness was increased to 5.6 ± 0.5 µm. This 36% increase in ASM thickness (Figure

4.4B) was reduced to a near-baseline level of 4.3 ± 0.3 µm by AAL-R. In agreement with reduced

ASM thickness, AAL-R again robustly reversed AHR caused by chronic exposure to HDM. Thus,

these three series of experiments revealed that AAL-R retains its ability to inhibit TH2 inflammation

in the remodeled airways and efficiently reverses ASM thickening as well as the ensuing AHR.

4.5.2. AAL-R favours an anti-proliferative balance in ASM cells.

Because AAL-R reverses AHR when administered at a phase where acute inflammation is resolved,

we next addressed the idea that AAL-R could act directly on ASM cells to impair underlying features

of ASM thickening. We show that AAL-R, but not its pre-phosphorylated / cell impermeant form

(AFD-R), nor its non-phosphorylatable isomer (AAL-S), efficiently interfered with the proliferation

81

of ASM. For instance, AAL-R induced a 26% inhibition of bromodeoxyuridine incorporation at 1µM

(Figure 4.5A), when compared to the vehicle. We then set out to determine whether apoptosis also

contributed to the inhibition of ASM accumulation under mitogenic conditions. We found that, at

concentrations of 1 µM or lower, AAL-R mildly modulated apoptosis in vitro (Figure 4.5B), while

being a potent cell death inducer at 10 µM with nearly 100% dead cells. On the other hand, AFD-R

failed to induce apoptosis, even at the concentration of 10 µM (Figure 4.5B), and AAL-S only induced

partial apoptosis at 10 µM. Our results thus unravel a clear potential for AAL-R to interfere with

mechanisms that sustain ASM cell proliferation.

4.5.3. Modulation of S1P levels does not resolve the potent anti-proliferative effect of AAL-R.

Given the putative impact of sphingosine analogs on the balance of sphingolipidic species, we tested

the concept that intracellular S1P levels could explain the differential potency of sphingosine analogs

in inducing ASM cytostasis. We first characterized which S1P pathway proteins were expressed in

ASM cells (Supplementary Figure 4.2). We detected the expression of S1PR1 to S1PR3, both

sphingosine kinases and S1P lyase. In agreement with previously-documented sphingosine and S1P

levels in biological tissues, we found approximately 10 times more sphingosine than S1P in our ASM

cultures (Figure 4.6). AAL-R increased absolute levels of intracellular S1P (2.0 ± 0.13 picomoles)

when compared to the vehicle (0.5 ± 0.05 picomoles), to AAL-S (0.6 ± 0.06 picomoles), and to AFD-

R (0.9 ± 0.05 picomoles). This resulted in a significant two-fold increase in the S1P/sphingosine

balance, when compared to the vehicle treatment (Figure 4.6A).

To resolve whether or not increase of intracellular S1P was sufficient to induce cytostatis, cells were

incubated with an inhibitor of S1P lyase [20] (Figure 4.6). The S1P lyase inhibitor SM4 potently

increased intracellular S1P level (2.8 ± 0.08 picomoles), which resulted in a 33% increase of the

S1P/sphingosine ratio compared to the AAL-R-treated cells (Figure 4.6A). This occurred in the

absence of an effect on the C16-ceramide content (Figure 4.6B). Also, we found no evidence that

AAL-R, AAL-S or AFD-R (at the concentration of 1 µM) impacted on cellular levels of C16-

ceramides, arguing against a major role for a shift in the sphingolipid rheostat to justify AAL-R-

induced cytostasis. In spite of potent enhancement of intracellular S1P content, SM4 failed to inhibit

ASM cell proliferation (Figure 4.6A,C), revoking the sufficiency for increased intracellular S1P

content to induce ASM cell cytostasis.

Since intracellular accumulation of S1P might reduce extracellular S1P levels and the subsequent

impairment of S1P1- and S1P3-proliferative effects, ASM cells were incubated with the dual S1P1/3

antagonist (VPC23019; Figure 4.7). Similar to AFD-R and AAL-S, dual inhibition of S1P1 and S1P3

82

failed to significantly affect the accumulation of proliferating ASM cells in vitro, when compared to

the vehicle.

4.5.4. AAL- R incubation leads to massive accumulation of intracellular AFD-R in ASM cells

Since ASM cells express SphK2 (Supplementary Figure 4.2) and because SphK2 activity is required

for efficient phosphorylation of AAL-R to AFD-R, we then addressed the hypothesis that AAL-

induced ASM cell cytostasis could be explained by intracellular accumulation of AFD-R. Our results

show that ASM cells uptake AAL-R and AAL-S preferentially to AFD-R (Figure 4.8). This is

demonstrated by the retrieval of relatively high amounts of AAL species in cells incubated with AAL-

S (263 ± 17 picomoles) and AAL-R (126 ± 15 picomoles), compared to an equimolar concentration

of AFD-R (32 ± 4 picomoles) (Figure 4.8A). Most importantly, in ASM cells, the intracellular balance

between the non-phosphorylated and the phosphorylated form of AAL-R favored the accumulation

of AFD-R by up to two-fold (Figure 4.8A-B). Of note, this AFD-R accumulation (263 ± 16

picomoles) represents more than 100 times the cellular amount of S1P under the same experimental

conditions. Thus, ASM cells express SphK2 and display a massive intracellular accumulation of

AFD-R upon incubation with AAL-R.

4.5.5. AAL-R but not AAL-S efficiently reverses AHR

On the basis that efficient cytostasis of ASM cells relies on in situ phosphorylation of the sphingosine

analog, we ruled out the ability of the non-phosphorylatable sphingosine analog AAL-S to reverse

AHR in our in vivo model. Figure 4.9 depicts normoresponsiveness to graded methacholine doses in

mice receiving saline and vehicle. In this group, peak resistance was recorded at 2.89 ± 0.27

cmH2O/ml/s in response to an aerosolized dose of 30 mg/ml of methacholine. AHR was present in

the group receiving HDM and vehicle, with a 3-fold increase of respiratory system resistance at 30

mg/ml of methacholine, when compared to mice receiving saline and vehicle. AAL-R again inhibited

by more than 70% the HDM-induced AHR at the methacholine dose of 30 mg/ml. In stark contrast,

the non-phosphorylatable AAL-S enantiomer failed to alleviate AHR in HDM-exposed mice. Of note,

neither AAL-R nor AAL-S affected airway responsiveness to methacholine in mice without

experimental asthma (Supplementary Figure 4.3A), indicating that a one week-long exposure to either

of these two sphingosine analogs does not influence ASM contractility per se. In agreement with the

absence of AAL species-induced alterations of lung histology (Supplementary Figure 4.3B), these

83

results confirm the lack of deleterious effects of these compounds on pulmonary functions over a

short period of time.

4.6 Discussion

This is the first evidence supporting sphingosine analogs as proficient molecules to reverse ASM

thickening after its instatement, leading to a nearly full functional recovery of AHR in the

methacholine challenge test. We also deciphered that immunomodulation is not required for AAL-R

to induce a catabolic response in ASM cells, as this effect occurs in vitro and in absence of acute

inflammation in vivo. Still, we also confirmed that the short term AAL-R treatment remained efficient

at inhibiting inflammation in the remodeled airways in response to repeated antigen challenges, and

failed to induce aversive functional alterations in the lung. We further confirmed that mechanisms of

action of this class of agents vary according to their biochemical properties. More specifically, we

defined that the efficacy of sphingosine analogs to reverse ASM thickening relied on the propensity

to be phosphorylated in situ and with the ability to increase intracellular AFD-R levels in ASM cells.

We previously showed that a phosphorylatable sphingosine analog could alleviate hyperreactivity in

an acute model of asthma where inflammation, but not remodeling, was pre-established [18]. The

beneficial effect, similar to what is observed when sphingosine analogs are provided prophylactically,

likely resulted from the interference with inflammation-associated release of pro-

remodeling/spasmogenic factors [10, 24-26]. Yet in asthma, remodeling is already present and its

reversal remains a preclinical challenge as supported by the work of Johnson et al. [27] showing that

3 interventions (corticosteroid, beta-2 agonist, and antigen weaning) are required to reverse AHR in

a chronic HDM-induced asthma model. These findings are in line with the inability of a high

dexamethasone dose (1 mg/kg) to reverse AHR in spite of a significant alleviation of inflammation

[22]. In agreement with the loss of efficacy of prophylactic treatments once remodeling is established

[22, 28], mechanisms that sustain ASM thickening are likely to differ from the ones that initiate its

process.

In this regard, ASM cells found in a proliferative environment become resistant to corticosteroid-

mediated cytostasis [29, 30]. In contradistinction, we show a robust anti-proliferative effect of AAL-

R occurring at a concentration one order of magnitude lower than its pro-apoptotic/cytotoxic effects.

On these bases, it becomes tempting to speculate that the preferential efficacy of AAL-R to inhibit

AHR, when compared with dexamethasone, relates to its potency to induce cytostatic/catabolic

effects in proliferating ASM cells. This theory also agrees with our observation that the AAL isomer

84

that is not a potent cytostatic agent in vitro under mitogenic conditions (AAL-S) fails to reverse AHR

in vivo, despite its documented anti-inflammatory effects [10, 11]. Yet, the presumed absence of effect

of AAL-S on ASM thickening in our model remains to be confirmed.

According to the pulmonary tropism of this class of compounds [31], concentrations of AAL-R likely

to induce cytostasis are attainable in the lung [32], supporting a local effect of the sphingosine analog

on ASM cells, even when delivered systemically. One limitation of this study is that we were not able

to obtain in vivo data on the impact of AAL-R on ASM cell proliferation or apoptosis per se. While

ASM cell proliferation or apoptosis can be successfully assessed in larger mammals [33-35], their

assessment remain a challenge in mice due to the small size of the airways, low nuclei count per

bronchi, and rapid elimination of apoptotic cells by phagocytes in vivo [36]. For these reasons, we

can only conclude that the potency of AAL-R to reverse AHR is linked with its propensity to reverse

ASM thickening in vivo and to induce ASM cytostasis in vitro.

Current literature suggests that likely mechanisms underlying the atrophic effects of sphingosine

analogs include activation of protein phosphatase 2A [10, 37], interference with sphingosine kinase

expression/activity [38], alteration of S1P receptor-driven pro-survival mechanisms [39] and anti-

proliferative/pro-apoptotic effects of intracellular aminophosphate accumulation [14, 16, 40]. Our

results support the last possibility. Indeed, our results revoke the involvement of PP2A reactivation

in AAL-R-induced cytostasis since potent reduction of ASM cell accumulation in vitro was not

reproduced by the non-phosphorylatable enantiomer AAL-S, a molecule shown to favor PP2A

activation in the context of asthma [10]. Yet, the possibility exists that AAL-S could inhibit

inflammation, when present, in the remodeled airways and by doing so, alleviate AHR. This remains

to be investigated. In regards to inhibition of sphingosine kinases, both AAL-R and AAL-S can

interfere with sphingosine kinase activity [16]. Yet, only AAL-R efficiently inhibited ASM

proliferation in vitro (Figure 4.5).

We observed increased intracellular S1P in cells treated with AAL-R. This intracellular S1P likely

resulted from interference with S1P lyase activity and/or inhibition of S1P export [41, 42]. In T cells,

inhibition of proliferation was associated with intracellular S1P acting through activation of nuclear

S1P1 [14]. Alternatively, inhibition of S1P efflux is also likely to interfere with a positive auto-

feedback loop involving S1P receptors [43], and might even contribute to counteract pro-remodeling

events occurring in response to S1P [39]. Still, the fact that neither the S1P lyase inhibitor SM4, nor

the S1P receptor antagonist VPC23019 modulated proliferation of ASM cells argues against these

possibilities to explain AAL-R-induced cytostasis. Further studies will be required to examine the

intracellular pathways modulated by the different sphingosine analogs. This type of study may

provide important insights as to why only AAL-R exerts a cytostatic effect.

85

It remains possible that differential subcellular localization of accumulating S1P between the current

study and previous studies [14, 40, 44] might explain the absence of effect of S1P lyase

pharmacological inhibition on proliferation. Still, quantification of phosphorylated sphingoid bases

in ASM cells show that the intracellular increase of S1P is marginal compared to that of AFD-R in

AAL-R-treated cells, with a difference of at least two orders of magnitude in favor of AFD-R.

Moreover, the AAL-R-induced increase of intracellular S1P appears to be much lower here than in

models where it induces cytotoxic effects [44]. Indeed, we found only a 3-fold increase, while Hagen

et al [44] showed that S1P lyase genetic knock down caused a more than 100-fold change of

intracellular S1P. For these reasons it is more likely that massive accumulation of AFD-R, rather than

mild accumulation of S1P, led to ASM cell cytostasis.

The fact that SphK2-metabolized sphingoid bases preferentially interfere with cell accumulation also

supports the concept that, as described in Jurkat T cells [16], intracellular accumulation of AFD-R is

the cause of ASM cell cystostasis. For instance, AAL-R is mainly phosphorylated by SphK2 and

intracellular AFD-R accumulation is much faster than the accumulation of other sphingosine analogs

(like FTY720). Importantly, this faster conversion relates to the preferential ability of AAL-R to

interfere with Jurkat T cell accumulation in vitro, when compared with FTY720 [17]. In agreement

with these observations, we determined that ASM cells express SphK2 and display a nearly 2:1 AFD-

R to AAL-R ratio. In face of a preferential distribution of SphK2 at the endoplasmic reticulum [45]

and since accumulation of phosphorylated SphK2-derived sphingoid based in that location can

interfere with mechanisms that sustain cell survival and promote proliferation through induction of

endoplasmic reticulum stress [40, 46], we conclude that intracellular AFD-R accumulation is the most

likely event to explain interference with mechanisms that sustain ASM thickening and the ensuing

AHR. Our results do not exclude the possibility that sphingosine analogs not investigated in this

study, such as FTY720, could also interfere with ASM cell proliferation and thereby reverse AHR in

experimental asthma. However, current literature supports the theory that sphingosine analogs

displaying rapid rates of intracellular sphingoid bases accumulation, like AAL-R, are more efficient

to interfere with cellular amplification than analogs featuring slower rates of intracellular

aminophosphate accumulation [17].

It is well documented that a prolonged daily administration of sphingosine analogs at low doses can

increase the risk of pulmonary side effects [47], which likely relates to the immunosuppressive

activities of this class of agents. Over a period of time that exceeds months, FTY720 might even be

associated with asthma exacerbations as exemplified by two case studies [48, 49]. Importantly, such

effect was never reported in clinical trials over a short period of time. Nevertheless sphingosine

analogs can become highly potent cell death inducers at high concentrations, and potentially harmful

86

if administered at high doses during severe inflammatory conditions [50]. Still, short term treatments

with sphingosine analogs were repeatedly documented not to cause pulmonary damage when

administered locally in the airways [18, 24, 51]. In the current study, we confirm the absence of

aversive effects of this type of agents in the airway. In fact, we document that AAL-R remains

efficient at inhibiting allergic airway inflammation in the remodeled lung. Given the likely role of

proinflammatory mediators in the induction of tissue remodeling [52] and because numerous

inflammation-derived mediators can favor a spasmogenic response [53], our findings support the

concept that AAL-R might tackle different asthmatic phenotypes by acting on both airway remodeling

and inflammation.


We found that a punctual treatment with AAL-R resorbs the thickening of ASM in the context of

asthma, while not aversively affecting the airways within a short time window. Moreover, we

determined that AAL-R could directly interfere with ASM cell accumulation in vitro. This effect

depends on the propensity of this sphingosine analog to be phosphorylated in situ and likely results

from an increase of the intracellular aminophosphate content. Given the central role of ASM

thickening in AHR and asthma, this experimental therapeutic strategy needs to be further explored.

87

4.7.1. Conflict of Interest Statement

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial

relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

4.7.2. Author Contribution

Participated in research design: DG, PBL, AML, MJB, NF, ASD, EB, MRB, ML, SGB, YB, DM

Conducted experiments: DG, PBL, AML, CAH, ALG

Contributed new reagents: SGB

Performed data analysis: DG, PBL, AML, CAH, ALG, DM

Wrote or contributed to the writing of the manuscript: DG, PBL, AML, MJB, CAH, ALG, NF,

ASD, EB, MRB, ML, SGB, YB, DM

4.7.3. Funding

This work was supported by CIHR grant # 274357 and funding from the Respiratory Health Network

of the FRQ-S. DG received scholarships from the Training program of the Respiratory Health

Network of the FRQ-S– IRSC and from the FRQ-S. DM, YB, MRB, NF, EB are members of the

FRQ-S Respiratory Health Network and DM, YB, ML and MRB received FRQ-S research scholar

awards.

4.7.4. Acknowledgements

We thank Serge Simard (CRIUCPQ) for statistical analyses, Marc Veillette from the flow cytometry

platform at CRIUCPQ and Dany Patoine for his expertise in small molecule quantification

88

4.8 References

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91

4.9 Figures

Figure 4.1: Sphingosine analogs and their targets

AAL-R ((R)-2-amino-4-(4-heptyloxyphenyl)-2-methylbutanol) and AAL-S ((S)-2-amino-4-(4-

heptyloxyphenyl)-2-methylbutanol) are cell-permeant sphingosine analogs that readily penetrate into

the intracellular space. Inside the cell, AAL-R is rapidly phosphorylated by SphK2 into AFD-R

(phosphorylated (R)-2-amino-4-(4-heptyloxyphenyl)-2-methylbutanol). Although not

phosphorylatable, AAL-S still has biological relevancy, such as positive regulatory effects on

intracellular Protein Phosphatase 2A (PP2A) [10]. The cell-impermeant molecule AFD-R can either

accumulate intracellularly to exert biological effects via unknown targets [17], or be transported into

the extracellular space where it can modulate cell surface S1P receptors.

92

Figure 4.2: Experimental model

Mice received either saline or HDM 3 times a week for 5 consecutive weeks. After 1 week of rest to

allow acute inflammation to resolve, mice were administered pharmacological treatments daily for a

period of 1 week and euthanized 24h after the last dose for analyses.

93

Figure 4.3: AAL-R reverses airway hyperresponsiveness elicited by chronic HDM exposure

Saline- or HDM- treated mice were administered vehicle (VEH), AAL-R (1 mg/kg) or

Dexamethasone (DEXA) (1 mg/kg) and the degree of airway responsiveness was assessed by

measuring the resistance of the airway system (Rrs) in response to graded doses of methacholine. n=8

mice per group except DEXA where n=6. “a” denotes a significant difference vs the SAL – VEH

group, “b”: vs HDM - VEH group, “c”: vs HDM - DEXA group. Significantly different at p < 0.05.

94

Figure 4.4: AAL-R reverses ASM thickening

Mice received HDM or saline (SAL) and underwent VEH or AAL-R treatment as described in Figure

4.2. (A) Histological appearance of the airway wall. The smooth muscle layer is delineated with a

black dotted line. One representative image per group is shown and the numbers represent the average

thickness of the ASM layer ± SEM. (B) The percentage of increase in ASM thickness relatively to

saline-VEH mice (baseline) was computed. Saline: n=4; VEH: n=7; AAL-R: n=7; * significantly

different at p < 0.05.

95

Figure 4.5: AAL-R inhibits the proliferation of ASM cells

ASM cells were incubated in complete medium with the indicated concentrations of AAL-R, AAL-

S, AFD-R or the vehicle (VEH; empty dot) for 72h. (A) Proliferation was assessed by

bromodeoxyuridine incorporation. n=4; *: significantly different at p < 0.05. (B) Annexin V binding

was evaluated after 48 h of incubation. Numbers show drug-induced increase in apoptosis (over

vehicle-treated baseline). n=6 except for VEH: n=9 and AAL-R 10-6: n=8. * shows statistical

significance from VEH group at a p < 0.05. All panels show representative results from 2 independent

experiments.

96

Figure 4.6: Endogenous sphingolipid modulation in response to sphingolipid modifiers

ASM cells were incubated in complete medium. When indicated, AAL-R (1 µM), AAL-S (1 µM),

AFD-R (1 µM), SM4 (3 µM) or the vehicle (VEH) were added for 24h. Mass spectrometry was

performed to quantify S1P, sphingosine and ceramides in ASM cells. Shown is (A) the

S1P/sphingosine ratio and (B) C-16 ceramides. (C) Modulation of cell accumulation in response to

the experimental agents measured using the tetrazolium dye assay. n=6. * shows statistical

significance from the VEH group at a p < 0.05.

97

Figure 4.7: An S1P1/S1P3 antagonist does not induce cytostasis

ASM cells were incubated in complete medium with the AAL-R (1 µM), AAL-S (1 µM), AFD-R (1

µM), VPC23019 (at indicated concentrations) or the vehicle (VEH) for 24h and cell accumulation

was assessed using the tetrazolium dye assay. n=8. * shows statistical significance from the VEH-

treated group at a p < 0.05.

98

Figure 4.8: AAL-R-induced cytostasis depends on intracellular accumulation of AFD-R

ASM cells were incubated in complete medium. When indicated, AAL-R (1 µM), AAL-S (1 µM),

AFD-R (1 µM) or the vehicle (VEH) were added for 24h. Mass spectrometry was performed to

quantify (A) unphosphorylated total AAL species and (B) AFD-R. n=6. * shows statistical

significance from VEH group at a p < 0.05.

99

Figure 4.9: Reversal of airway hyperresponsiveness induced by chronic HDM exposure

requires a phosphorylatable sphingosine analog

Mice received HDM or saline (SAL) and underwent AAL-R (1 mg/kg) or AAL-S (1 mg/kg) treatment

as described in Figure 4.2. The degree of airway responsiveness was assessed by measuring the

resistance of the airway system (Rrs) in response to graded doses of methacholine. Saline: n=11;

VEH: n=15; AAL-R: n=14; AAL-S: n=6. “a” denotes a significant difference vs the SAL – VEH

group, “b”: vs HDM - VEH group, “c”: vs HDM – AAL-S group. Significantly different at p < 0.05.

100

4.10 Supplementary material

4.10.1. LC MS/MS Analysis

Analyses were done on a TripleTOF 5600 (Sciex, Framingham, MA) equipped with an electrospray

interface with a 50 μm iD capillary and coupled to an Eksigent μUHPLC (Eksigent, Redwood City,

CA). Analyst TF 1.6 software was used to control the instrument, for data processing and

acquisition. The source voltage was set to 5.5 kV and maintained at 350°C, curtain gas was set at 25

psi, gas one at 15 psi and gas two at 15 psi. Acquisition was performed in MRM mode. Specific

transitions and voltage parameters for each molecule are reported in supplementary Table 1. The

gradient was the following 0-0.1min hold 50% B, 0.1-0.5 min from 50% B to 90% B, 0.5-2.5 min

from 90% B to 100% B, hold 100% from 2.5-3 min, followed by a 0.5 min post-flush at 35 uL/min

at final condition.

Quantification of S1P and sphingosine was done with a standard curve (R2 = 0.998 and 0.989,

respectively) and corrected by their respective internal standard. For the quantification of C16

ceramide, AAL-S, AAL-R and AFD-R, the ratio over the C17-Sphingosine as the internal standard

was used to calculate absolute amount. To do so, a 5-points standard curve of each molecule was

performed by LC-MS/MS to confirm that the ratio of the AUC of the molecules over that of the

C17-Sphingosine was linear over the range of observed AUC. Once the confirmation was done, the

AUC of the C17-Sphingosine was used to calculate the absolute amount of molecule of interest.

4.10.2. Supplementary Figures and Tables

Supplementary Table 4.1: Details of the mass spectrometer parameters

Molecule Precursor m/z MS/MS ion Declustering potential Collision energy

Sphingosine 300.3 282.28 20 17

C17-Sphingosine 286.3 268.26 20 17

S1P 380.2 264.27 20 23

C17-S1P 366.4 250.27 20 23

AAL-S/AAL-R 294.2 107.04 100 25

C16-ceramide 538.5 264.26 100 39

AFD-R 375.2 260.2 100 20

101

Supplementary Figure 4.1: AAL-R retains its ability to alleviate inflammation in the

remodelled airways

(A) Mice received either saline or HDM 3 times a week for 5 consecutive weeks. After 1 week of rest

to allow acute inflammation to resolve, mice were re-challenged with HDM i.n or saline. A subset of

HDM re-challenged mice were injected i.p. with vehicle (VEH) or AAL-R (1mg/kg) daily for 1 week.

Mice were anesthetized 24 h after the last challenge and BALF was harvested for differential counts

of Macrophages (Macro), Lymphocytes (Lympho), Neutrophils (Neutro), and Eosinophils (Eosino).

(B) Relative frequencies of indicated cell subsets. (C) Absolute numbers of indicated cell subsets.

Mice that were not re-challenged with HDM and received the vehicle were also used as a reference

group (Saline). n=6 mice per group. * denotes a significant difference vs the saline group; † denotes

a significant difference vs the HDM re-challenged - VEH group, significantly different at p < 0.05.

102

Supplementary Figure 4.2: ASM primary human cells express S1P receptors 1 to 3, both

sphingosine kinases and S1P lyase

The expression of S1P receptors 1 to 5 (S1PR1, NM_001400; S1PR2, NM_004230; S1PR3,

NM_005226; S1PR4, NM_003775; S1PR5, NM_001166215), sphingosine kinase 1 (SPHK1,

NM_001142601) and 2 (SPHK2, NM_020126) and sphingosine-1-phosphate lyase (SGPL1,

NM_003901) was assessed using real time quantitative PCR. mRNA from human primary ASM cells

was extracted using the EZ-10 DNAway mRNA mini-preps kit (Biobasic, Markham, CAN) according

to the manufacturer’s instructions. mRNA (1µg) was converted to cDNA using iScript Advanced

cDNA Synthesis and quantified with the Rotor Gene apparatus using Sso Advanced SYBR Green

Supermix (Biorad). Predesigned primer sets (PrimeTime qPCR Assays) were purchased from

Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Efficiency was determined for each set of primers and

absence of contaminating DNA was confirmed using no-RT controls. The delta-ct was calculated for

each target and reported on the geometric mean of the reference Ribosomal protein large p0 (RPLP0,

NM_ 001002) and Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1 (GNB2L1, NM_

006098). n=6.

103

Supplementary Figure 4.3: Sphingosine analogs do not negatively affect non-asthmatic lung

responsiveness to methacholine

Naïve mice were administered daily with vehicle (VEH), AAL-R (1mg/kg) or AAL-S (1mg/kg) for

1 week. (A) The degree of airway responsiveness was assessed by measuring the resistance of the

airway system (Rrs) in response to graded doses of methacholine. (B) Histological appearance of

sagittal lung slices. n=5. * shows statistical significance from VEH group at a p < 0.05.

104

5. Chapitre V: FTY720 promotes pulmonary fibrosis

when administered during the remodeling phase

following a bleomycin-induced lung injury

5.1 Résumé

La fibrose complique plusieurs pathologies incluant les maladies pulmonaires interstitielles. Les

analogues de la sphingosine, comme FTY720, peuvent diminuer la fibrose pulmonaire induite par un

agent toxique dans les modèles murins. Contradictoirement, FTY720 favorise des mécanismes

profibrotiques in vitro et, à doses élevées, augmente la fibrose pulmonaire par l’augmentation de la

perméabilité vasculaire pulmonaire in vivo. Le but de cette étude est donc de déterminer l’effet d’une

faible dose de FTY720 sur la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine dans un modèle murin.

Les phases inflammatoires et fibrotiques de ce modèle ont été temporellement délimitées et

subséquemment traitées avec FTY720. Bien que FTY720 diminue la fibrose pulmonaire

lorsqu’administré pendant la phase inflammatoire, elle l’augmente fortement pendant la phase

fibrotique. Cette augmentation est associée avec l’expression de connective tissue growth factor, mais

pas avec la perméabilité vasculaire. Par conséquent, la période d’administration de FTY720

détermine ses effets anti- ou pro-fibrotiques.

105

5.2 Abstract

Fibrosis complicates numerous pathologies including interstitial lung diseases. Sphingosine analogs

such as FTY720 can alleviate lung injury-induced fibrosis in murine models. Contradictorily,

FTY720 also promotes in vitro processes normally leading to fibrosis and high doses in vivo foster

lung fibrosis by enhancing vascular leakage into the lung. The goal of this study was to determine the

effect of low doses of FTY720 on lung fibrosis triggered by an acute injury in mice. We first defined

the time-boundaries delimiting the inflammatory and remodeling phases of an injury elicited by

bleomycin based on neutrophil counts, total lung capacity and lung stiffness. Thereafter, FTY720 (0.1

mg/kg) was delivered during either the inflammatory or the remodeling phases of bleomycin-induced

injury. While FTY720 decreased fibrosis by 60% and lung stiffness by 28% when administered

during the inflammatory phase, it increased fibrosis (2.1-fold) and lung stiffness (1.7-fold) when

administered during the remodeling phase. FTY720-induced worsening of fibrosis was associated

with an increased expression of connective tissue growth factor, but not with vascular leakage into

the lung. Thus, the timing of FTY720 delivery following a bleomycin-induced lung injury determines

pro- vs anti-fibrotic outcomes.

Keywords: Gilenya®, bleomycin, leakage, inflammation, sphingosine-1-phosphate, fibrosis

106

5.3 Introduction

Fibrosis is a severe and currently untreatable complication of several interstitial pulmonary diseases

[1, 2]. Lung fibrosis impairs quality of life and has a major impact on mortality with a mean survival

of 2-3 years in the most severe, sometimes idiopathic, forms of the disease [3]. Numerous

dysregulated mechanisms can promote fibrosis. At the cellular level, a seminal step involves the

accumulation/activation of fibroblasts and myofibroblasts into the lungs, with their subsequent

release of pro-fibrotic factors and extracellular matrix proteins, including proteoglycans and collagens

[4]. This excessive lung scarring compromises the structure of alveoli, increases lung stiffness,

decreases lung volumes and, ultimately, leads to severe impairment of gas exchange [5]. At the

molecular level, elevated levels of growth factors including transforming growth factor (TGF)-β and

connective tissue growth factor (CTGF) are considered major, sometimes sufficient [6] inducers of

fibrosis [7]. Yet, the mechanisms regulating lung fibrosis are not completely understood and it

remains difficult to predict whether new experimental interventions will alleviate or exacerbate

fibrosis.

Sphingosine analogs can modulate fibrotic mechanisms in vivo and in vitro. However, whether their

effects are anti- or pro-fibrotic is still debated. On one hand, the sphingosine analog FTY720

(Fingolimod/Gilenya®) attenuates acute lung injury induced by toxic agents, thus alleviating the

ensuing fibrosis [8]. In support to these findings, FTY720 alleviates experimental hepatic [9] and

renal fibrosis [10]. On the other hand, higher doses of FTY720 that are sufficient to enhance vascular

leakage into the lung can enhance bleomycin-induced fibrosis [11]. In addition, in vitro studies show

that FTY720 promotes the differentiation of human lung fibroblasts into myofibroblasts [12],

enhances the expression of growth factors and increases extracellular matrix deposition [13].

Furthermore, the phosphorylated form of FTY720, which is generated in vivo, inhibits fibroblast

apoptosis [14], which is involved in resorption of fibrotic patches. Taken together, these data clearly

highlight the controversial effects of sphingosine analogs on the outcome of fibrosis.

So far, few interventions in the mouse model of fibrosis elicited by bleomycin-induced lung injury

translated into an efficient treatment for interstitial lung diseases [15]. This is because the majority of

previous interventions aimed at reducing the early inflammatory phase of the model. It goes without

saying that reducing the severity of the lesion triggered by bleomycin will commensurately reduce

the extent of the later fibrotic response [16]. Focusing on mechanisms occurring after the resolution

of acute inflammation and during the active remodeling phase of the model has greater potential to

translate into findings that are relevant to human fibrosis [17].

107

The aim of this study is thus twofold. First, we delineated the duration of the periods post-injury that

divide the phase of inflammation from the phase of remodeling in the mouse model of fibrosis elicited

by bleomycin-induced lung injury. Secondly, we aimed at determining whether low, yet biologically

active, doses of FTY720 impact fibrosis differently when delivered during the inflammatory phase

versus during the remodeling phase. Since FTY720 promotes fibrotic functions of fibroblasts in vitro,

and because fibroblasts are central actors of fibrosis, we hypothesized that delivery of FTY720 during

the remodeling phase following lung injury enhances fibrosis.

5.4 Methods

5.4.1. Murine model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis and FTY720 treatment

On day 0, C57BL/6J male mice 8-12 weeks old (Jackson Laboratories, USA) were anesthetised using

isoflurane and received one intratracheal (i.t) administration of 1 U/kg of bleomycin. Mice were then

randomly assigned to receive intraperitoneal (i.p.) injections of FTY720 (0.1 mg/kg; Cayman

Chemical, MI) or its vehicle (H2O) during either the inflammatory phase (days 0, 3 and 6) or the

remodeling phase (days 14, 17 and 20). All mice were euthanatized on day 21 for analyses. Mice

were housed with free access to food and water in a temperature-controlled room under a 12-h dark-

light cycle. For animal welfare purposes, experimental death was declared when mice lost 20% or

their bodyweight. Experimental, housing and care procedures were approved by the Committee of

Animal Care of Laval University in accordance with the guidelines of the Canadian Council on

Animal Care (protocol 141222).

5.4.2. Measurements of lung function

Mice were deeply anesthetised with isoflurane and subsequently oro-tracheally intubated using a

blunted 18 gauge needle. Animals were ventilated with air containing isoflurane using the flexiVent

apparatus (SCIREQ, Montréal, QC). After a stabilisation period (3-5 minutes), airway recruitment

was initially ensured by performing 3 to 5 deep inflation manoeuvres. Lung stiffness (i.e., dynamic

elastance) was then assessed three times using a single frequency forced oscillation manoeuvre. Each

oscillation manoeuver was preceded by one deep inflation manoeuvre to maintain recruitment of

small airways and alveoli. Mice immediately regained autonomous respiration and consciousness

when they were removed from the apparatus. Since the procedure is non-surgical, minimally invasive

and non-terminal, it was performed at various time-points to monitor the progression of lung functions

in individual mice

108

5.4.3. Histology and immunohistochemistry

The left lung was harvested, inflated with phosphate buffered saline (PBS), fixed in 4%

paraformaldehyde and embedded in paraffin. Histological analyses were performed on the frontal

plane of Masson’s trichrome-stained lung slices. Using the Image-J software, the lung area and area

occupied by fibrotic patches were measured to determine the percentage of fibrotic area.

Paraffin-embedded lung sections were deparaffinized and rehydrated. Antigen retrieval was

performed using 0.05% protease (Sigma, Oakville, ON) 15 min at 37°C. Tissues were blocked in PBS

containing 3% bovine serum albumin (BSA; Wisent, St-Bruno, QC), 0.2% cold water fish gelatin

(Sigma) and 0.1% tween-20 (Sigma) for 15 min at room temperature followed by avidin/biotin

blocking (Vector Laboratories, Burlingame, CA) as per the manufacturer’s instructions. Biotinylated

anti-CTGF primary antibody (bs-0743R-biotin; Bioss, Woburn, MA) was diluted in PBS buffer

containing 1% BSA and incubated overnight at 4°C. Slides were washed 3 times with 0.1% tween-

PBS and then incubated with streptavidin-coupled horseradish peroxidase (Biolegend, San Diego,

CA) in PBS for 1h at room temperature. Slides were washed 2 times with 0.1% tween-PBS and DAB

was used as the chromogenic substrate. Mayer’s hematoxylin (Agilent Technologies, Santa Clara,

CA) was used as the counterstain.

5.4.4. Assessment of vascular leakage

Bronchoalveolar lavage was performed with 3 x 1 ml of PBS. The cell-free supernatant was used to

determine albumin content by Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA) (Bethyl Laboratories,

Montgomery, TX). Cell pellets were resuspended for differential counts as described [18].

5.4.5. Cell culture

Murine NIH/3T3 fibroblasts (ATCC-CRL-1658TM, ATCC, Manassas, VA) were plated at a density

of 104 cells per cm2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium containing 10% calf serum (complete

medium) for 24 h, and then incubated with 0.1 or 1.0 μM of FTY720 or its vehicle for 2 h.

109

5.4.6. Real-time quantitative polymerase chain reaction

Probes were purchased from Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). The expression of tumor

necrosis factor (Tnf, NM_013693), transforming growth factor-β (Tgf-β, NM_011577), and

connective tissue growth factor (Ctgf, NM_010217) mRNA, along with the expression of reference

genes ribosomal protein, large, p0 (Rplp0, NM_007475) and guanine nucleotide binding protein beta

polypeptide 2-Like 1 (Gnb2L1, NM_008143), was assessed using real-time quantitative polymerase

chain reaction (RT-qPCR). Specificity was confirmed and efficiency was optimized in lung tissue for

every probe set. In the experiments with mice, the whole right lung was pulverized in liquid nitrogen

and RNA was isolated using TRIZol (Thermo Fisher, Waltham, MA). In the experiments with 3T3

murine fibroblasts, total cells RNA was isolated using the EZ-10 DNAway mRNA mini-preps kit

(Biobasic, Markham, ON) according to the manufacturer’s instructions. RNA (1 μg) was converted

to cDNA using iScript Advanced cDNA Synthesis kit and quantified using Sso Advanced SYBR

Green Supermix kit (Biorad, Hercules, CA). The delta-ct was calculated for each mRNA and reported

on the geometric mean of Rplp0 and Gnb2L1.

5.4.7. Statistical analyses

Data were expressed using mean ± SEM. Homogeneity of variance and normality of the data were

verified. When appropriate, variables were log-transformed. Data was analyzed using ANOVAs or

two-way ANOVAs with an interaction effect. The Satterthwaite’s degree of freedom statement was

added for unequal variance structure. The results were considered significant with p-values ≤ 0.05,

unless otherwise stated. Post-hoc analyses were performed using Tukey’s comparison test. All

analyses were conducted using the statistical packages R v3.0.2 (R Foundation for Statistical

Computing, Vienna, Austria.) and SAS v9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

110

5.5 Results

5.5.1. The remodeling phase following bleomycin injury is initiated on day 14

To determine the kinetics of the inflammatory phase, mice were euthanized at day 0, 4, 14, or 21 post-

bleomycin exposure to analyze the amount of neutrophils in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF)

(Figure 5.1). According to our time-points, the inflammatory response peaked on day 4 with an

average absolute number of 6.7 ± 0.9 x 104 neutrophils in the BALF (Figure 5.1A). Neutrophilia then

decreased near the baseline level 14 days post-bleomycin instillation.

To determine the kinetics of fibrosis, parallel experiments were undertaken in which the total lung

capacity and lung stiffness were monitored longitudinally post-bleomycin exposure. Compared to day

0, total lung capacity tended to increase from day 0 to 21 in mice receiving saline. When compared

with the saline group, total lung capacity was significantly decreased in bleomycin-treated mice on

days 14, 17, and 21 post-bleomycin instillation (Figure 5.1B), indicating alveoli replacement by scar

tissue. Similarly, we could determine that stiffness was higher in bleomycin-treated mice, when

compared with mice receiving saline, although we were not able to detect significant progression

between time-points (Figure 5.1C). Together, these results demonstrate that, while the transient

inflammatory phase of injury induced by bleomycin wanes out by day 14, the functional changes

evocative of progressing fibrosis are present at least from day 14 until day 21 post bleomycin

instillation.

5.5.2. FTY720 exerts opposite effects on fibrosis depending on its period of delivery

We then determined whether the period of FTY720 treatment affected its ability to modulate fibrosis.

Mice exposed to bleomycin were treated with either the vehicle or FTY720 on days 0, 3, and 6

(inflammatory phase) or on days 14, 17, and 20 (remodeling phase) (Figure 5.2). While saline-

exposed mice showed normal lung histology on day 21 (Figure 5.3A), fibrotic patches represented

7.1 ± 1.2% of the total lung area in bleomycin-exposed mice treated with the vehicle (Figure 5.3A-

B). Treatment with FTY720 during the inflammatory phase mildly decreased fibrotic area on day 21

when compared with the vehicle-treated group. In contrast, FTY720 administered during the

remodeling phase potentiated the fibrotic area by more than two-fold (Figure 5.3A-B).

The differential effect of FTY720 on fibrotic area (Figure 5.3) translated into differing progression

of lung stiffness from days 14 to 21 between experimental groups (Figure 5.4). As a general

physiological reference, the baseline lung stiffness in control mice is 19.6 cmH2O/ml (Figure 5.4,

111

dotted line). Pointedly, experimental mortality events start to occur above a threshold of 70

cmH2O/ml, providing a range of 50 cmH2O /ml within which fibrotic deterioration can be measured.

As seen in Figure 5.4, none of the experimental treatments significantly modulated stiffness on day

14. In bleomycin-exposed mice receiving the vehicle during either the inflammatory or the

remodeling phase (and consistent with results shown in Figure 5.1) stiffness did not deteriorate

significantly from days 14 to 21. While FTY720 administered during the inflammatory phase caused

a slight reduction in lung stiffness from days 14 to 21 (average decrease of 3.2 ± 1.3 cmH2O/ml),

FTY720 delivered during the remodeling phase strongly enhanced lung stiffness (average increase of

8.4 ± 3.3 cmH2O/ml). When considering the physiological baseline of 19.6 cmH2O/ml, FTY720

delivered during the remodeling phase increased the average lung stiffness by 1.7 fold on day 21,

when compared to the vehicle-treated group. Thus, the period of FTY720 treatment is critical to

determine the outcome on pulmonary fibrosis.

5.5.3. A low dose regimen of FTY720 does not enhance vascular leakage into the lung

Given that pro-fibrotic effects of high FTY720 doses were previously attributed to vascular leakage

into the lung [11], we determined whether such mechanism was in play under the current experimental

conditions. To do so, we measured the effect of the current FTY720 treatment regimen (a low dose

at 3 occasions, 3 days apart) on vascular leakage and compared it to treatment regimens that were

previously shown to promote fibrosis by enhancing vascular leakage (medium or high doses on 4

occasions, 2 days apart) (Figure 5.5A). As described by Shea et al. [11], we observed that both

medium and high regimens administered during the inflammatory phase increased BALF albumin by

up to 6 times (Figure 5.5B) and the number BALF cells by up to 3 times (Figure 5.5C), when

compared to vehicle-treated bleomycin-exposed mice. On the other hand, the current treatment

featuring lower doses of FTY720 failed to increase the albumin content (Figure 5.5B) and the absolute

number of cells (Figure 5.5C) in BALF, when compared to the vehicle-treated group. We extended

this experiment to the remodeling phase of the model (Figure 5.5D). Similarly to that observed in the

acute phase, the low FTY720 regimen failed to enhance albumin content (Figure 5.5E) or cellularity

(Figure 5.5F) in the BALF. In contrast, both mild and high regimens tended to enhance these features,

although non- significantly. Thus, in the current conditions, FTY720 likely acts independently of

enhanced vascular leakage in order to increase fibrosis during the remodeling phase following

bleomycin- induced lung injury.

112

5.5.4. FTY720 increases Ctgf expression in vivo and in vitro

Considering that the current FTY720 treatment regimen unlikely induced fibrosis by causing vascular

leakage, we assessed the impact of FTY720 on the expression of soluble mediators that are sufficient

to enhance pulmonary fibrosis. The relative expression of Tnf and Tgf-β was not affected by the

experimental treatment. However, we observed that Ctgf expression was increased by 42% in the

lung of mice instilled with bleomycin and receiving FTY20 during the remodeling phase, compared

to bleomycin-exposed mice treated with the vehicle (Figure 5.6A). Moreover, we detected CTGF

immunoreactivity throughout fibrotic patches along with occasional rounded or spindle shaped-cells

displaying stronger CTGF immunoreactivity (Figure 5.6B). In line with these observations, we

determined in vitro that FTY720 concentrations likely to be found in the lung [19] enhanced Ctgf

expression in fibroblasts by 35%. Meanwhile, Tgf-β expression was not modulated in vitro (Figure

5.6C). Thus, the enhanced fibrosis induced by the delivery of FTY720 in the remodeling phase is

associated with the increased expression of a potent pro-fibrotic growth factor.

113

5.6 Discussion

Sphingolipids and their analogous molecules are potent modulators of immune mechanisms, cell fate

[20] and physiological responses [21]. In the last decade, their usage as therapeutic compounds

constantly gained interest. Sphingolipids were hypothesized as potential therapeutic compounds in

the context of fibrosis [22]. However, irreconcilable conclusions have been drawn regarding their

pro- vs anti-fibrotic potential [8, 11]. We confirmed the concept that the bleomycin-induced lung

injury caused an initial neutrophil-rich inflammatory response followed by and inflammation-low

fibrotic phase [17, 23]. We also unravelled that the chosen post-injury period during which FTY720

is delivered essentially determines whether the effect is beneficial or detrimental. We found that

FTY720 does not induce vascular leakage and fails to promote fibrosis when administered during the

inflammatory phase at a low, yet biologically-active dose [24]. Importantly, we demonstrated that the

enhanced fibrosis induced by low FTY720 doses during the remodeling phase does not require

increased vascular leakage, but is rather associated with the promotion of fibrotic mechanisms.

Moreover, these findings were enabled by a sensitive longitudinal approach to monitor functional

alterations during the remodeling phase of the bleomycin-induced fibrosis model.

Stiffness often correlates with connective tissue content [25] and is a key functional surrogate in the

context of fibrotic disorders. In agreement with the observations of Phillips et al [26], we found that

the variability of endpoint measurement of airway stiffness was unsuitably high to appreciate the

effect of experimentally-induced lung function. For instance, lung stiffness ranged on nearly 40

percent of the physiological range in mice receiving bleomycin and vehicle on day 21 (Figure 5.4).

Yet, lung stiffness on day 21 correlated strongly with stiffness on day 14 in bleomycin mice receiving

the vehicle, supporting the concept that measuring progression within a same animal would likely

isolate treatment effects. Our results show that longitudinal assessment of lung stiffness using a short

forced oscillation manoeuvre in mice oro- tracheally cannulated circumvents the intrinsic variability

of disease severity often seen in response to bleomycin, and enables sensitive detection of airway

function modifications in response to experimental agents.

Sphingosine analogs act on multiple biological mechanisms in a dose-dependent fashion. Notably,

the protective effects on lung permeability occur at 0.1 mg/kg [27], which likely corresponds to low

micromolar or lower concentrations of the drug in tissues [28]. Within that concentration range,

FTY720 also enhances barrier integrity in vitro [29]. Accordingly, low doses of sphingosine analogs

during the acute phase of a pulmonary insult displayed a protective effect

114

[8, 29], or at least do not enhance inflammation or lung injury. In contradistinction, concentrations of

FTY720 that are of one order of magnitude higher impair endothelial barrier integrity in vitro by a

mechanism involving S1P receptor 1 degradation [27]. In fact, such concentrations of sphingosine

analogs were also proved to induce cell death under various experimental conditions [20, 27]. Our

results showing that low FTY720 doses administered during the inflammatory phase fail to enhance

vascular leakage and subsequent fibrosis are thus in agreement with the documented effects of this

class of drugs when they are used within a range sufficient to exert biological activities, while not

triggering S1P receptor degradation-related mechanisms [27, 30], or cytotoxic effects [20].

Considering that fibrosis is directly proportional to the extent of the inflammatory response to toxic

agents [17], it is not surprising that the pro-inflammatory effect of high FTY720 doses were

previously shown to enhance bleomycin-induced fibrosis [11]. Inversely, it is also not surprising that

strategies inhibiting the bleomycin-induced inflammatory response were most of the time correlated

with a reduction of subsequent fibrosis [17]. However, and in contrast to pre-clinical models, anti-

inflammatory drugs have failed in clinical trials for idiopathic pulmonary fibrosis. This supports the

idea that agents targeting the inflammatory phase of this model will unlikely benefit this type of

disease. In fact, treating the inflammatory phase is only tenable in cases where fibrosis occurs in

response to a known cytotoxic stressor, as suggested by the work of Quian et al. [8]. Overall, these

studies suggest that the time-window during which the treatment is delivered post-injury needs to be

considered.

We show that FTY720 enhances fibrosis when administered during the remodeling phase. This effect

occurs in the absence of enhanced vascular leakage, which suggests that FTY720 pro- fibrotic effects

are not limited to its leakage-enhancing capacity. Instead, our observations suggest that FTY720

likely acted by promoting pro-fibrotic mechanisms, as evidenced by increased Ctgf expression in the

lung. Importantly, this growth factor was shown to be sufficient to drive fibrosis in vivo [6], and its

blockade potently interferes with fibrosis [31]. Moreover, in agreement with results obtained in renal

stromal cells [32], we found that enhancement of Ctgf expression by FTY720 can be replicated in

vitro in a fibroblast cell line. Together, these results argue that FTY720 could act directly on

fibroblasts in order to enhance fibrosis, but they do not exclude the possibility that indirect

mechanisms, including immunomodulation, could be in play. Yet, FTY720 failed to reduce the

infiltration of inflammatory cells into the airway tissues during the remodeling phase of the model.

We also found no alteration of Tnf expression between bleomycin-exposed mice receiving the vehicle

or FTY720 (Figure 5.6), arguing against the possibility that FTY720 interfered with the protective

effect of TNF in this model [33]. As a whole, our results thus suggest that enhancement of fibrosis by

115

FTY720 during the remodeling phase does not rely on enhancement of vascular leakage into the lung

but likely results from the promotion of pro-fibrotic mechanisms.

S1P pathway-modulating agents are currently used in clinics and have raised a number of safety issues

including induction of bradycardia, atrio-ventricular block [34], susceptibility to viral infections [35]

and case reports of asthma exacerbations [36, 37]. In addition, pre-clinical events of subpleural

fibrosis have been detected at very high doses of FTY720 in normal rats [38]. Our study raises the

possibility that FTY720 could also promote fibrotic processes in the remodeling lung.


Sphingosine analogs possess the ability to modulate mechanisms that underlie fibrosis. Herein, we

showed that doses of FTY720 that fail to enhance vascular leakage and inflammation alleviate

bleomycin-induced fibrosis when administered during the acute inflammatory phase. On the other

hand, we revealed that FTY720 treatment during the remodeling phase following bleomycin injury

enhances fibrotic mechanisms as exemplified by the increased expression of Ctgf. As a whole, we

demonstrated that the period of FTY720 delivery is paramount on the outcome of fibrosis following

bleomycin exposure. Inasmuch as this model relates to human interstitial lung diseases, our results

support the idea that FTY720 can potentially worsen fibrosis. Our results also confirm the paradigm

that drugs in development should be investigated during a proper time-window in this pre-clinical

lung fibrosis model prior to enunciate their likelihood of success in human diseases.

5.7.1. Acknowledgements

This work was funded by the Fondation de l'IUCPQ; by the Fonds sur les maladies respiratoires J-D-

Bégin P-H-Lavoie; and by the Fonds Alphonse L'Espérance. DG received a scholarship from the

Training program of the Respiratory Health Network of FRQS and from the FRQS. DM, YB and

MRB are members of the FRQS Respiratory Health Network and are FRQS Junior 1 Scholars. GD is

a consultant for Roche (Intermune) and for Boehringer-Ingelheim as an interstitial lung disease

expert. None of these companies contributed to this work in any way. We also thank Serge Simard

for statistical analyses and Natacha LeBrasseur for technical expertise in histology.

116

5.8 References

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118

5.9 Figures

Figure 5.1: Effects of bleomycin-induced injury on markers of inflammation and lung

function.

A) Neutrophils were quantified in BALF on days 0 (naive mice), 4, 14 or 21 post- bleomycin

instillation (ANOVA) * P<0.05. B-C) Pulmonary functions were assessed on days 5, 14, 17 and 21

post-bleomycin instillation. B) Total lung volume (* : P<0.05 when compared to the saline-treated

group at the same time point); C) Lung stiffness (Two-way ANOVA with interaction * : P<0.05). In

panels B-C, for each mouse, the value recorded on day 0 was subtracted from every following time

point to depict the changes over time. N=4 mice per group.

119

Figure 5.2: Protocol outlining the days at which FTY720 was administered.

All mice received bleomycin i.t on day 0. Mice were then treated with 0.1 mg/kg FTY720 or vehicle

(VEH) during either the inflammatory phase on days 0, 3 and 6 or the fibrotic phase on days 14, 17

and 20. Mice were euthanatized on day 21 for analyses. In some series of experiments, respiratory

function was also assessed longitudinally on days 14 and 21. Scale bars = 500 µM

120

Figure 5.3: FTY720 either decreases or increases lung fibrosis depending on its period of

delivery.

A) Representative images of Masson’s trichrome lung slices derived from naïve mice (upper-left

panel) and from bleomycin-injured mice co-treated with the VEH (upper-right panel), with FTY720

during either the inflammatory phase (lower-left panel) or the remodeling phase (lower-right panel).

Black bars represent a length of 500μm. B) Lung fibrosis was quantified, and fibrotic area was

expressed as the percentage of total lung area. VEH: N=9, Inflammatory: N=5, Remodelling: N=8;

ANOVA; * : p<0.05.

121

Figure 5.4: FTY720 enhances lung stiffness only when administered during the remodeling

phase.

Lung stiffness was assessed on day 14 (circles) and day 21 (squares) in each mouse. Dotted line shows

physiological baseline defined as the average stiffness of 18 control mice (8-10 weeks of age) never

exposed to bleomycin minus 3 standard deviations to encompass more than 98% of the population.

Inflammatory-VEH: N=8, Inflammatory-FTY720: N=7, Remodelling-VEH: N=10, Remodelling-

FTY720: N=10; Two-way ANOVA with interaction was performed; * : p <0.05.

122

Figure 5.5: A low dose (0.1mg /kg) of FTY720 does not enhance vascular leakage in the lung.

A) Mice were instilled with bleomycin on day 0. For the low treatment regimen they received FTY720

at 0.1mg/kg every third day from day 0 to day 6. The medium and high treatment regimens consisted

in injecting FTY720 at 0.5 mg/kg or 5.0 mg/kg, respectively, every second day from day 0 to day 6.

Upon euthanasia on day 7, BALF was collected and processed for B) quantification of albumin and

C) differential cell counts. D) Mice were submitted to the low, medium or high FTY720 treatment

regimen from day 14 to day 20 post-bleomycin instillation. E) Albumin quantification and F)

differential cell counts were performed on day 21. N=4-5 mice per group. ANOVA; * : p<0.05 vs

VEH.

123

Figure 5.6: FTY720 increases the expression of CTGF.

A) Mice received bleomycin on day 0 and FTY720 was administered during the remodeling phase

as described in Figure 5.2. Mice were euthanized on day 21 and lung expression of TNF, TGF-β and

CTGF mRNA was quantified by RT- qPCR. N=10 for all groups B) Immunohistochemical detection

of CTGF in fibrotic tissues. i) primary antibody omission control; ii) tissue incubated with anti-CTGF

antibody as described in methods. CTGF signal is shown in brown and nuclei were mildly

counterstained with hematoxylin (Blue). Representative of 7 samples. Scale bars = 50 µM C) Mouse

fibroblasts were stimulated with vehicle (VEH) or with the indicated concentrations of FTY720 for 2

h. TGF-β and CTGF mRNA expression was then quantified by RT-qPCR. Results are expressed

relative to VEH. N=6 independent experiments; ANOVA; * : p<0.05 vs VEH.

124

6. Chapitre VI : Un rôle pour S1P2 et S1P3 dans le

phénotype altéré des fibroblastes de patients atteints

de la FPI

6.1 Résumé

Les fibroblastes sont les principales cellules effectrices dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI).

De plus, les fibroblastes provenant de tissus pulmonaires fibrotiques de patients atteints de FPI

(fibroblastes FPI) surexpriment plusieurs facteurs profibrotiques, dont le connective tissu growth

factor (CTGF). Chez les fibroblastes pulmonaires normaux, la sphignosine-1-phosphate (S1P) peut

stimuler un profil fibrotique qui est partiellement renversé par un antagoniste du récepteur 3 de la

S1P (S1P3). Les objectifs sont donc de déterminer si les fibroblastes FPI répondent à la S1P

similairement aux fibroblastes normaux, et si les effets de la S1P peuvent aussi être renversés par un

antagoniste de S1P3. Nos résultats montrent que les fibroblastes FPI ont un phénotype profibrotique,

dont l’augmentation de la transcription du CTGF, qui est exacerbée par la S1P. Cette exacerbation

est atténuée par un antagoniste de S1P3. La voie de la S1P pourrait donc être une cible thérapeutique

potentielle dans la fibrose pulmonaire.

125

6.2 Introduction

La fibrose est une complication de plusieurs maladies pulmonaires interstitielles, dont la plus

commune et la plus sévère est la FPI. Elles impliquent une augmentation de la rigidité du parenchyme

pulmonaire, augmentant l’effort respiratoire et diminuant fortement la qualité de vie. De plus, elles

sont souvent diagnostiquées tardivement et, dans le cas de la FPI, la survie médiane est de 3.0 ± 0.5

ans au moment du diagnostic [1]. Malheureusement, quoique de nouveaux traitements permettent

d’augmenter la survie d’environ six mois [2], leur rapport coût-efficacité est très faible [2, 3] et ils

sont accompagnés d’effets secondaires très importants [4, 5]. Puisque la seule option curative est la

transplantation pulmonaire, de nouvelles cibles thérapeutiques sont nécessaires.

Bien que plusieurs types cellulaires et mécanismes soient impliqués dans les maladies pulmonaires

interstitielles [6], la dérégulation des fibroblastes et des myofibroblastes est au cœur de ces maladies

[7]. Ces cellules ont une activation et une survie aberrante et surexpriment plusieurs facteurs

profibrotiques, comme le TGF-β et le CTGF. Elles produisent aussi une grande quantité de protéines

constituant la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine, les enzymes dégradants

celle-ci, les MMP, ainsi que leurs inhibiteurs (TIMP) [8]. La surexpression de CTGF est centrale à la

fibrose pulmonaire, car ce médiateur est nécessaire et suffisant [9, 10] pour induire de la fibrose. De

plus, une forme épissée alternativement de la fibronectine est surexprimée par les fibroblastes FPI

[11]. Ces mécanismes dérégulés maintiennent la cicatrisation pathologique du tissu pulmonaire

menant à une augmentation de sa rigidité et la diminution des échanges gazeux [12].

Plusieurs de ces mécanismes peuvent être modulés par la voie de la S1P. La sphingosine est

phosphorylée en S1P par une ou l’autre de deux kinases, SphK1 et SphK2. La S1P peut soit être

déphosphorylée par les S1P phosphatase 1 et 2 ou les lipid phosphate phosphatases 1 à 3, soit être

irréversiblement dégradée par la S1P lyase. Il est important de noter que la SphK1 et la S1P sont

toutes deux surreprésentées dans le lavage bronchoalvéolaire et le tissu pulmonaire des patients

atteints de la FPI [13], comparativement aux tissus de sujets sains. Les niveaux de transcrits de la S1P

lyase dans les leucocytes circulants est négativement corrélée avec la sévérité la FPI [14]. De plus,

l’invalidation génétique de la SphK1 [15], ainsi que celle de S1P3 [16], diminue la fibrose pulmonaire

induite par la bléomycine dans un modèle murin. Comparativement, l’invalidation de la S1P lyase

dans le même modèle exacerbe plutôt la fibrose pulmonaire [14]. L’analogue de la sphingosine

FTY720 exacerbe la fibrose pulmonaire dans un modèle murin induit par la bléomycine, ce qui est

associée à l’augmentation des niveaux de transcrits du CTGF (section V). La voie de la S1P est donc

impliquée dans la fibrose pulmonaire in vivo. Ainsi, une accumulation d’évidences incluant nos

126

propres résultats supporte le concept que les sphingolipides, et les enzymes et les récepteurs qui s’y

rattachent, sont impliqués dans les mécanismes de fibrose in vivo.

In vitro, la stimulation de fibroblastes normaux avec la S1P ou FTY720-P, la forme phosphorylée de

FTY720, augmente la production de protéines de la matrice extracellulaire, dont le collagène de type

I, mais pas du collagène de type III, ni de la fibronectine [17]. Cette augmentation peut être atténuée

par l’administration d’antagonistes de S1P2 ou S1P3 [17], ce qui suggère que ces récepteurs pourraient

être impliqués dans les mécanismes d’amplification de la fibrose. Bien que les niveaux de transcrits

pour la fibronectine soient aussi augmentés par la S1P et FTY720-P, ceux du collagène de type I,

chaine α-1 tendent à être diminués [17], démontrant que l’impact potentiellement profibrotique des

agonistes des récepteurs de la S1P s’effectue par la modulation de médiateurs précis. À ce sujet, la

S1P et le FTY720-P augmentent l’expression de facteurs profibrotiques, dont le CTGF, en plus de

stimuler l’expression de SphK1, offrant possiblement une boucle de rétroaction positive [17].

D’ailleurs, la voie de la S1P serait reliée au contrôle de l’expression du CTGF induit par le TGF- β

[18, 19], car le TGF-β et le CTGF induisent l’expression de SphK1 dont l’augmentation réduit la

transcription du CTGF.

Malgré la notion que les agonistes de la S1P auraient des impacts profibrotiques, il demeure que

l’impact de la S1P et du FTY720-P sur la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes est

controversé [17, 20]. Ces deux études ont évalué l’effet d’une stimulation de 72H avec FTY720 sur

l’expression de fibres d’α-smooth muscle actin par des fibroblastes pulmonaires humains, en

immunofluorescence. À une concentration de 1 µM, FTY720 augmente la différentiation des

fibroblastes en myofibroblastes, mais pas à 5 µM. Il est connu qu’une concentration de FTY720

supérieur à 1 µM peut induire des effets non observés à des doses inférieures, dont la forte induction

de l’apoptose. Il est donc possible que les effets rapportés par ces études impliquent des mécanismes

divergents, et des études supplémentaires sont nécessaires afin d’élucider cette controverse.

Toutefois, il a été montré que S1P3 est nécessaire pour la différenciation des fibroblastes normaux en

myofibroblastes par FTY720 [20]. Puisque les fibroblastes FPI sont fondamentalement différents des

fibroblastes pulmonaires normaux [21], que les niveaux de transcrits pour plusieurs acteurs impliqués

dans la voie de signalisation de la S1P sont altérés en condition fibrotique in vivo [13, 14], et que les

récepteurs de la S1P pourraient influencer des cascades fibrotiques [17], le but de ce dernier chapitre

expérimental était d’évaluer si l’altération phénotypique des fibroblastes FPI se traduisait par des

altérations fonctionnelles associées à la voie de signalisation de la S1P.

127

Cette étude a pour but de répondre à ces caveas et est séparée en trois objectifs. Premièrement, les

niveaux des transcrits pour des médiateurs fibrotiques et des composantes de la voie de signalisation

de la S1P ont été caractérisés et comparés entre des fibroblastes pulmonaires primaires de patients

avec et sans FPI. Deuxièmement, nous avons évalué si la S1P module différentiellement les niveaux

de transcrits pour des médiateurs fibrotiques entre ces deux classes de fibroblastes. Finalement, nous

avons sondé le rôle du récepteur S1P3 sur les effets de la S1P par une approche pharmacologique.

6.3 Matériel et méthodes

6.3.1 Isolement, culture et stimulation des fibroblastes pulmonaires humains primaires

Pour cette étude, nous avons recruté des patients atteints de FPI cela ces critères : un diagnostic de

FPI en accord avec les recommandations de l’ATS/ERS [22], la disponibilité des tissus suites à une

biopsie, une autopsie ou une transplantation pulmonaire et ne pas être associée une fibrose secondaire

à une autre pathologie. Les tissus non-FPI proviennent de la marge saine de résections pulmonaires

de patients ayant un cancer pulmonaire ou de tissus excédentaires suite à une transplantation

pulmonaire. Ces tissus ne doivent pas présenter d’emphysème ou de fibrose associés au cancer

pulmonaire. Les expérimentations ont été approuvées par le comité d’éthique à la recherche avec des

êtres humains de l’Université Laval (protocole 21033).

Les explants de parenchyme pulmonaire ont été coupés en morceaux d’environ 1 mm2. Ces morceaux

ont été déposés et espacés dans des T-25 (Sarstedt, Nümbrecht, DE) contenant un milieu complet

(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1% d’acides aminés essentiels, 1% de L-glutamine et 1% de

pénicilline/streptomycine (Wisent Bioproducts, St-Bruno, QC, CAN) avec 10% de sérum fœtal bovin

(Hyclone; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Lorsque le tapis de fibroblastes était

suffisamment étendu, les explants ont été retirés et les fibroblastes décollés avec de la

trypsine/éthylène diamine tétra-acétique (Wisent). Les passages subséquents ont été effectués à

confluence dans le même milieu. L’identité des cellules isolées est basée sur leurs caractéristiques

d’adhésion, prolifératives et morphologiques.

Pour les expériences et analyses subséquentes, les lignées ont été ensemencées dans des plaques 6

puits, à raison de 250 000 cellules par puit, dans 2 mL de milieu complet contenant 10% de sérum

foetal bovin et utilisées après 24H. Pour les analyses des niveaux de mRNA, le milieu a été remplacé

par du milieu complet sans sérum fœtal bovin pour 24H. Afin d’étudier l’impact pharmacologique

d’un inhibiteur de S1P3, le milieu a été remplacé par 2 mL de milieu complet contenant 1% de sérum

fœtal bovin sans lipides avec 1 µM de TY-52156 (antagoniste de S1P3; Cayman Chemicals, Ann

128

Arbor, MI, USA) ou son VEH pour 1H30. Ensuite, 20 µL d’une solution de 1 mM de S1P (Tocris,

Avonmouth, Bristol, UK) solubilisé dans du milieu complet contenant 4 mg/mL d’albumine sérique

bovine (Wisent) sans lipides a été ajoutée pour obtenir une concentration finale de 1 µM de S1P. Les

cellules ont été récoltées 2H plus tard pour analyses.

6.3.2 Réaction en chaine par polymérase quantitative en temps réel

Les sondes ont été achetées de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA). Les niveaux de

mRNA de TGF-β (NM_000660), CTGF (NM_001901), α-smooth muscle actin (α-SMA;

NM_001613), collagène de type I, chaine α-1 (COL1A1; NM_000088), collagène de type III, chaine

α-1 (COL3A1; NM_000090), forme épissée alternativement de la fibronectine (EDA-FN; sens : 5’ -

CCC TAA AGG ACT GGC ATT CA – 3’; antisens : 5’ – CAT CCT CAG GGC TCG AGT AG –

3’), TIMP1 (NM_003254), TIMP2 (NM_003255), S1PR1 (NM_001400.4), S1PR2 (NM_004230.3),

S1PR3 (NM_005226.3), SphK1 (NM_001142601), SphK2 (NM_020126.4), S1P lyase (SGPL1;

NM_003901.3) ont étés mesurés. La normalisation a été effectuée avec ribosomal protein, large, p0

(RPLP0; NM_001002.3), guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-Like 1 (GNB2L1;

NM_006098.4), la hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT; NM_000194.2) et la

TATA-box-binding protein (TBP; NM_003194). Les mRNA des fibroblastes ont été isolés avec la

trousse EZ-10 DNaway mRNA miniprep (Biobasic, Markham, ON, CAN) tel qu’indiqué par le

fabricant. Avec la trousse iScript Advanced cDNA Synthesis (Biorad, Hercules, CA, USA), 1 µg de

mRNA a été converti en acide désoxyribonucléique complémentaire (cDNA). La quantification a été

effectuée avec la trousse Sso Advanced SYBR Green Supermix (Biorad) sur un Rotor Gene 6000

(Corbett Life Science, Sydney, New South Wales, AUS). La différence de limite de cycle (delta-ct)

a été calculée pour chaque gène et rapportée sur la moyenne géométrique de RPLP0, GNB2L1 et

HPRT ou TBP.

6.3.3 Analyses statistiques

Les données sont exprimées avec la moyenne ± erreur type. L’homogénéité de la variance et la

normalité des résidus ont été vérifiées. Lorsqu’approprié, les variables ont été transformées en

logarithme. Les données ont été analysées avec un t-test par pairs. Les corrélations ont été

effectuées avec une régression linéaire. Les résultats sont considérés significatifs lorsque la valeur

de p < 0.05. Les analyses ont été effectuées avec Prism (V6; GraphPad, La Jolla, CA, USA.

129

6.4 Résultats

Malgré la nature hétérogène inhérente aux cultures cellulaires primaires, nos observations supportent

que les fibroblastes FPI démontrent un profile pro-fibrotique, comparativement aux fibroblastes

obtenus de la marge saine des patients atteints de cancer. Parmi les cibles investiguées, les fibroblastes

FPI expriment en moyenne significativement plus de CTGF (2.26 fois), d’α-smooth muscle actin

(2.10 fois) et la forme épissée alternativement de la fibronectine (1.24 fois) que les fibroblastes-non

FPI (Figure 6.1A). Les fibroblastes FPI montrent donc un phénotype promouvant les mécanismes

fibrotiques.

Bien que le faible nombre de lignées cellulaires ne nous ait pas permis de comparer directement les

lignées de fibroblastes FPI et non-FPI, les niveaux de mRNA des récepteurs de la S1P (S1PR1 et

S1PR3) semblent plus élevés dans 2 lignées de fibroblastes FPI. Notamment, lors de l’analyse des

groupes combinés, le niveau de transcrits de S1PR2 (Figure 6.1C) ainsi que S1PR3 (Figure 6.1D)

corrèle positivement avec ceux du CTGF, qui est surexprimé par ces cellules. Le niveau de transcrits

en mRNA de S1PR3 a aussi une association positive avec celui du TGF-β, le plus important médiateur

pro-fibrotique. Les récepteurs S1PR2 et S1PR3 pourraient donc être impliqués dans les altérations

pro-fibrotiques des fibroblastes FPI.

En regard des expériences dédiées à évaluer l’impact de la S1P sur la fonction des fibroblastes

pulmonaires primaires, nous avons observé que la S1P augmente les transcrits du CTGF (188% du

véhicule), mais diminue significativement ceux du TGF-β, du collagène de type I, chaine α-1 et du

collagène de type III, chaine α-1 (respectivement 89%, 83% et 77% du véhicule). La S1P n’affecte

pas la transcription de la forme épissée alternativement de la fibronectine (Figure 6.2). À cet effet,

nous démontrons également que l’antagoniste spécifique de S1P3, TY-52156, diminue

significativement les niveaux de transcrits du CTGF (89 % du VEH) induite par la S1P, ce qui n’a

pas été observé pour le TGF-β, le collagène de type I, chaine α-1 et le collagène de type III, chaine

α-1 (Figure 6.3A). De manière intéressante, et en accord avec la corrélation entre les niveaux de

transcrits de S1PR3 et du CTGF, nos résultats tendent à supporter que la magnitude de l’inhibition de

l’expression du CTGF induite par la S1P par l’antagoniste TY-52156 serait associée à une forte

expression de S1PR3.

130

6.5 Discussion

La S1P est un lipide signalétique augmenté dans le poumon des patients atteints de la FPI [13] qui est

impliqué dans plusieurs processus profibrotiques, dont la survie cellulaire [23], l’expression de

facteurs profibrotiques [17, 24] et la production de matrice extracellulaire [17]. In vivo, FTY720, un

analogue phosphorylable de la sphingosine, exacerbe la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine

dans un modèle murin (section V). In vitro, la S1P et le FTY720-P stimulent tous deux une réponse

profibrotique dans des fibroblastes pulmonaires normaux, ce qui peut être renversé par des

antagonistes de S1P2 ou S1P3 [17]. Nous avons montré un effet similaire sur des fibroblastes murins

3T3 par FTY720 (section V). Bien que les fibroblastes FPI soient intrinsèquement différents des

fibroblastes sains [21], ces données publiées laissaient croire que d’interférer avec la signalisation des

récepteurs de la S1P pourrait produire des effets utiles dans le contexte de la fibrose pulmonaire.

Nous avons confirmé que nos fibroblastes FPI ont un profil de transcription pro-fibrotique

comparativement aux fibroblastes primaires non-FPI [11, 25] (Figure 6.1A), tel que montré par

Ramos et al. [21]. Cependant, nous n’avons pas observé de différences significatives de la

transcription en mRNA des composantes de la voie de la S1P (Figure 6.1B), ce qui est peut-être dû à

un nombre de sujets insuffisant. Toutefois, l’analyse combinée de ces deux groupes montre une

corrélation positive des niveaux de transcrits entre S1P2 et CTGF (Figure 6.1C), entre S1P3 et CTGF

(Figure 6.1D) ainsi qu’entre S1P3 et TGF-β (Figure 6.1E). Considérant les effets profibrotiques de

S1P2 et S1P3 sur des fibroblastes normaux [17] et d’autres types cellulaires, comme les cellules

mésangiales rénales [26], la surexpression de ces deux récepteurs est possiblement liée à l’expression

de facteurs profibrotiques par les fibroblastes FPI. Malgré l’absence d’une modulation significative

de l’expression des récepteurs de la S1P, nous montrons qu’ils sont fortement exprimés sur les

fibroblastes FPI et non FPI, qu’ils pourraient moduler des cascades fibrotiques et que leur impact

pourrait dépendre de leur niveau d’expression. Ces observations sont donc partiellement compatibles

avec une approche de nature pharmacogénétique pour le traitement de la FPI.

Nous avons donc étudié l’effet de la stimulation de ces récepteurs avec leur ligand naturel, la S1P.

Similairement aux fibroblastes normaux [17], la stimulation des fibroblastes FPI avec la S1P

augmente les niveaux de mRNA du CTGF et diminue ceux du collagène de type I, chaine α-1. Les

niveaux de transcrits du collagène de type I, chaine α-1 sont aussi réduits par la S1P (Figure 6.2).

Aucun effet sur la transcription de la forme épissée alternativement de la fibronectine n’a été observé,

bien que l’augmentation observée dans la littérature puisse être spécifique à la forme normalement

épissée [17]. Toutefois, il a été observé que la S1P augmente l’accumulation de la matrice

extracellulaire produite par les fibroblastes en absence de modulation de la transcription collagène

131

[17]. Étonnamment, bien que le CTGF soit directement induit par le TGF-β [27], la S1P augmente

l’expression du premier tout en diminuant celle du second, suggérant que la S1P stimule directement

l’expression du CTGF. Toutefois, l’analyse des transcrits limite notre interprétation puisque nous ne

connaissons pas l’impact de la S1P sur la production des médiateurs étudiés et sur l’activité du TGF-

β. Il demeure aussi possible que l’augmentation du CTGF, en absence de celle du TGF-β, favorise

chez les fibroblastes un phénotype prolifératif [6], ce qui pourrait contribuer à expliquer la faible

capacité de la S1P à simultanément induire l’expression de protéines de la matrice extracellulaire

[28]. Considérant que les phénotypes invasifs et proliférateurs des fibroblastes semblent associés à la

sévérité de la pathologie [29] et que les anticorps contre le CTGF semblent efficacement contrer la

fibrose [27], nos résultats suggèrent qu’altérer la signalisation de la S1P pourrait être une avenue à

investiguer davantage.

À cet effet, l’administration de TY-52156, un antagoniste de S1P3, préalablement à celle de la S1P,

inhibe partiellement l’augmentation de la transcription du CTGF (Figure 6.3). Cette augmentation

implique donc l’activation de S1P3 par la S1P. Puisque les niveaux de transcrits du CTGF sont

associés à ceux de S1P3 (Figure 6.1D), nous spéculons qu’une thérapie anti-fibrotique inhibant S1P3

pourrait éventuellement s’appliquer chez les patients atteints de la FPI, et dont les fibroblastes

pulmonaires surexpriment ce récepteur de la S1P. Le rôle des autres récepteurs n’a pas été déterminé,

mais l’activation de S1P2 a un effet similaire et complémentaire à celui de S1P3 chez les fibroblastes

normaux [17]. L’inhibition combinée de S1P2 et S1P3 pourrait peut-être diminuer davantage la

surexpression du CTGF par la S1P, ce qui reste à être étudié. Malgré que la S1P diminue les niveaux

en mRNA du TGF-β, du collagène de type I, chaine α-1 et du collagène de type III, chaine α-1, TY-

52156 ne rétablit pas cette diminution, ce qui pourrait s’expliquer par le fait que leur modulation

s’effectue par un autre récepteur, ou qu’elle en est indépendante.

132

6.6 Conclusion

En accord avec la littérature, les fibroblastes FPI ont des niveaux de transcrits élevés pour plusieurs

médiateurs profibrotiques comparativement à des fibroblastes non-FPI. Les fibroblastes FPI

transcrivent davantage de CTFG, ce qui peut être exacerbé par la présence de S1P. Cet effet est, au

moins en partie, accompli par S1P3 et est partiellement réversible par l’administration d’un

antagoniste spécifique. L’activation de ce récepteur pourrait donc contribuer aux mécanismes sous-

jacents à la FPI chez les patients présentant des lésions où la surexpression des récepteurs de la S1P

est présente.

6.6.1 Financement

J’ai reçu une bourse du RSR et du FRQS. Ce projet de recherche a été supporté la Fondation de

l’IUCPQ, les Fonds sur les maladies respiratoires J.-D.-Bégin - P.-H.-Lavoie et les Fonds Alphonse

L’Espérance.

133

6.7 Références

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135

6.8 Figures

136

Figure 6.1 : Niveaux de transcrits de médiateurs fibrotiques et des composantes de la voie de la

S1P par des fibroblastes pulmonaires humains provenant de patients atteints de la FPI ou non

Les fibroblastes pulmonaires primaires ont été incubés pendant 24H dans du milieu sans sérum fœtal

bovin. Les données ont été normalisées selon les niveaux en mRNA de la ribosomal protein, large,

p0, la guanine nucleotide binding protein beta et la hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase. α-SMA : α-smooth muscle actin; COL1A1 : collagène de type I, chaine

α-1; COL3A1 : collagène de type III, chaine α-1; CTGF : Connective tissue growth factor; EDA-FN :

la forme épissée alternativement de la fibronectine; FPI : Fibrose pulmonaire idiopathique; S1PR1-

3 : Gènes des récepteurs 1 à 3 de la sphingosine-1-phosphate; SGPL1 : S1P lyase; SphK1-2 :

Sphingosine kinase 1 et 2; TIMP1-2 : Inhibiteurs des métalloprotéinases matricielles 1 et 2; TGF- β :

Transforming growth factor-β Carte thermique d’expression relative en mRNA exprimée en

logarithme de A) médiateurs fibrotiques et B) composantes de la voie de la sphingosine. L’échelle

représente le delta entre la lignée et la moyenne des transcrits des fibroblastes non-FPI, la couleur

verte étant une surreprésentation et la couleur rouge une sous-représentation. Corrélation linéaire de

l’expression en mRNA C) entre S1PR2 et CTGF, D) entre S1PR3 et CTGF et E) entre S1PR3 et TGF-

β.; * : p<0.05; n=3.

137

Figure 6.2 : La S1P module les niveaux de transcripts de certains médiateurs fibrotiques

Plusieurs lignées de fibroblastes pulmonaires primaires provenant de patients atteints de la FPI ont

été préincubées pendant 1H30 dans du milieu complet contenant 1% de sérum fœtal bovin sans

lipides. Puis, ces cellules ont été incubées avec le même milieu contenant 1 µM de S1P pendant 2H.

La normalisation a été effectuée sur la moyenne géométrique des niveaux en mRNA de la ribosomal

protein, large, p0, la guanine nucleotide binding protein beta et la TATA-box-binding protein. Les

statistiques ont été effectuées avec un test de Student pairé. 5 lignées cellulaires, 1-2 puits par lignée.

* : p<0.05. COL1A1 : collagène de type I, chaine α-1; COL3A1 : collagène de type III, chaine α-1;

CTGF : Connective tissue growth factor; EDA-FN : la forme épissée alternativement de la

fibronectine; FPI : Fibrose pulmonaire idiopathique; TGF- β : Transforming growth factor-β;

138

Figure 6. 3 : Un antagoniste de S1P3, TY-52156, diminue la surexpression du CTGF induite

par la S1P

Plusieurs lignées de fibroblastes pulmonaires primaires provenant de patients atteints de la FPI ont

été préincubées pendant 1H30 dans du milieu complet contenant 1% de sérum fœtal bovin sans lipides

et 1 µM de TY-52156 (TY). Puis, ces cellules ont été incubées avec le même milieu contenant 1 µM

de sphingosine-1-phosphate (S1P). La normalisation a été effectuée sur la moyenne géométrique des

niveaux en mRNA de la ribosomal protein, large, p0, la guanine nucleotide binding protein beta et

la TATA-box-binding protein. COL1A1 : collagène de type I, chaine α-1; COL3A1 : collagène de

type III, chaine α-1; CTGF : Connective tissue growth factor; FPI : Fibrose pulmonaire idiopathique;

S1P3 : Récepteur 3 de la sphingosine-1-phosphate; TGF- β : Transforming growth factor-β; 5 lignées

cellulaires, 1-2 puits par lignée. * : p<0.05.

139

7. Chapitre VII : Discussion générale

Le poumon assure les échanges gazeux. Constamment exposé aux contaminants de l’air, il assure

aussi la fonction de barrière physique et immunologique. Le maintien de ces fonctions est largement

en fonction de la structure du poumon. Le remodelage pulmonaire est donc une composante

fondamentale de l’asthme allergique et de la fibrose pulmonaire. Cependant, le contrôle et la

résorption du remodelage pulmonaire constituent des défis thérapeutiques de taille et les options sont

couramment limitées [6, 37]. Plusieurs des mécanismes sous-jacents au remodelage, comme

l’inflammation, la prolifération/apoptose et l’expression de médiateurs inflammatoires et fibrotiques

[38, 306], peuvent être modulés par la voie de signalisation de la S1P et par les analogues de la

sphingosine [280, 284, 302]. D’ailleurs, la S1P est augmentée aussi bien dans l’asthme allergique

[266] que dans l’IPF [288]. De plus, l’analogue de la sphingosine FTY720 est déjà utilisé pour le

traitement d’une maladie auto-immune, la sclérose en plaques [250]. En raison de l’implication

potentielle de ces médiateurs dans les mécanismes de remodelage tissulaire, et puisqu’un éventail de

composés pharmacologiques de plus en plus élargi pour moduler les sphingolipides et leurs récepteurs

est disponible, cette thèse a donc examiné les effets des sphingolipides et de leurs analogues sur

les mécanismes de remodelage pulmonaire observés dans l’asthme allergique et la FPI.

7.1 Les effets des analogues de la sphingosine sur l’inflammation allergique dans l’asthme.

L’une des caractéristiques cardinales de l’asthme allergique, l’asthme le plus commun, est une

inflammation du type Th2. En plus de contribuer directement aux symptômes de l’asthme, elle est

une précurseure majeure du remodelage pulmonaire [38]. Il a été montré que l’administration

d’analogues de la sphingosine en prophylaxie inhibe l’inflammation Th2 en interférant avec la

sensibilisation en interférant avec la migration des cellules dendritiques aux ganglions lymphatiques

drainants, la présentation subséquente de l’antigène et la prolifération des lymphocytes [279].

Cependant, le traitement de l’asthme allergique en prophylaxie n’est pas applicable en pratique et

offre ainsi un potentiel thérapeutique limité. Conséquemment, l’étude présentée au chapitre III avait

pour but de déterminer la capacité des analogues de la sphingosine à réduire l’inflammation préétablie

dans un modèle d’asthme aigu.

Pour cette étude, un modèle d’asthme allergique induit par l’administration intranasale d’un

homogénat d’acariens domestiques a été préféré au modèle classique impliquant une sensibilisation

intrapéritonéale à l’ovalbumine. Le modèle utilisant les antigènes d’acariens domestiques,

140

naturellement allergéniques, réplique mieux les caractéristiques d’expositions et de sensibilisations

observées dans le développement de l’asthme allergique chez l’humain. En effet, et contrairement à

l’ovalbumine, les antigènes d’acariens induisent une réponse allergique de polarité Th2 lorsqu’ils

sont administrés directement dans les voies aériennes. Il est important de noter que plusieurs facteurs

supportent que le développement de la réponse acquise dans le tissu pulmonaire puisse influencer les

mécanismes de régulation et de persistance de l’asthme [307]. Il est ainsi important de se rallier aux

recommandations de nos pairs [89] et d’investiguer l’impact de la modulation des sphingolipides dans

un modèle d’asthme qui réplique de manière plus fidèle les étapes de sensibilisation et d’exacerbation

qui sont présumées chez l’humain. La caractérisation de ce modèle a permis de définir la délimitation

temporelle de la sensibilisation et du développement d’une inflammation de type Th2 au poumon.

Cette approche a permis de déterminer le potentiel thérapeutique des analogues de la sphingosine

spécifiquement sur l’inflammation allergique post-sensibilisation.

Nous avons montré que l’analogue phosphorylable de la sphingosine AAL-R inhibe fortement les

signes de l’asthme allergique. AAL-R diminue l’hyperréactivité bronchique chez les souris ayant reçu

des antigènes d’acariens domestiques, sans affecter négativement les souris naïves. L’accumulation

des éosinophiles et des facteurs pro-inflammatoires IL-5 et IL-13 dans le lavage bronchoalvéolaire

est aussi réduite. Contrairement à l’administration d’analogue de la sphingosine en prophylaxie,

l’administration de AAL-R après la sensibilisation affecte peu ou pas les populations cellulaires des

ganglions lymphatiques drainants. Seuls les lymphocytes T CD4+ sont significativement diminués,

quoique cette diminution est minimale. La prolifération et l’apoptose des lymphocytes ne sont pas

affectées dans ce tissu. En somme, ces résultats suggèrent que le mécanisme par lequel les analogues

de la sphingosine diminuent l’inflammation préétablie est différent du mécanisme observé pendant la

sensibilisation.

Toutefois, et tel qu’observé lorsque les analogues de la sphingosine sont administrés en prophylaxie,

nous avons observé qu’AAL-R diminue l’accumulation des lymphocytes T CD4+ et B, ainsi que des

cellules dendritiques, dans le tissu pulmonaire. Cette diminution est accompagnée de l’augmentation

spécifique de l’apoptose des lymphocytes T CD4+ et B. Malheureusement, nous n’avons a été en

mesure de déterminer l’impact d’AAL-R sur l’apoptose des cellules dendritiques et des éosinophiles,

bien que nos résultats n’indiquent pas que l’apoptose des granulocytes en général soit affectée.

Étonnamment, le potentiel anti-inflammatoire et pro-apoptotique d’AFD-R, la forme

préphosphorylée d’AAL-R, est inférieur à ce dernier. Cette observation est compatible avec les

travaux de Don et al. [284] montrant qu’AAL-R, mais pas AFD-R, est en mesure d’induire l’apoptose

des lymphocytes T Jurkat. Cet effet pro-apoptotique est en fonction de la phosphorylation

141

intracellulaire d’AAL-R et la subséquente accumulation d’AFD-R dans le réticulum endoplasmique.

L’administration exogène d’AFD-R ne permet pas son accumulation intracellulaire, car sa polarité

lui empêche de traverser la membrane cellulaire efficacement [255]. Bien que nos résultats suggèrent

un mécanisme similaire, d’autres expérimentations seraient requises afin d’éliminer des hypothèses

alternatives, comme l’accumulation d’AFD-R dans les mitochondries ou l’interférence avec la

synthétisation ou la dégradation de sphingolipides.

L’administration prophylactique d’AAL-S, l’analogue non phosphorylable d’AAL-R, diminue aussi

l’inflammation éosinophilique et l’accumulation pulmonaire de lymphocytes pulmonaires dans un

modèle similairement induit par les antigènes d’acariens [282]. Même s’il est largement moins

efficace qu’AAL-R, AAL-S peut aussi induire l’apoptose des lymphocytes T Jurkat [284]. De plus,

AAL-R et AAL-S sont tous deux des inhibiteurs de la SphK1 dont l’inhibition augmente l’apoptose

de certaines cellules, comme les cellules cancéreuses de la leucémie [308]. Comme une proportion

des effets observés d’AAL-R pourrait être attribuable à des mécanismes indépendants de sa

phosphorylation, il est nécessaire de comparer les effets d’AAL-S à ceux d’AAL-R dans notre modèle

d’asthme allergique. De plus, la déphosphorylation d’AFD-R in vivo ne permet pas d’apprécier à sa

juste valeur la différence entre les analogues phosphorylables et préphosphorylés. La stimulation de

lymphocytes isolés du poumon avec les différents analogues permettrait de mieux différencier leurs

effets individuels sur la survie cellulaire. Ces expérimentations éclairciraient le rôle du statut

phosphorylatoire des analogues de la sphingosine sur l’induction de l’apoptose des lymphocytes

pulmonaires.

L’étude présentée au chapitre III possède toutefois certaines limitations, attribuables soit au modèle,

soit aux composés pharmacologiques utilisés. Bien que la phase post-sensibilisation ait été ciblée

avec soin, il n’est pas possible d’exclure complètement l’effet des analogues de la sphingosine sur la

migration et la présentation antigénique des cellules dendritiques. De plus, les analogues de la

sphingosine peuvent induire la séquestration des lymphocytes dans les organes lymphoïdes

secondaires [309]. Cette séquestration pourrait être évaluée par la mesure de l’accumulation des

lymphocytes dans les ganglions lymphatiques non drainants. Toutefois, comme la séquestration des

lymphocytes est médiée par S1P1 et que son agoniste AFD-R diminue l’inflammation allergique

moins efficacement qu’AAL-R, cette séquestration ne semble pas être le principal mécanisme

d’action d’AAL-R dans notre modèle. Comme la S1P peut directement induire la contraction du

muscle lisse bronchique [310], un analogue de la sphingosine pourrait aussi directement la moduler.

Bien que les analogues de la sphingosine diminuent l’hyperréactivité bronchique in vivo, l’effet direct

d’AAL-R sur le muscle lisse bronchique n’a pas été exploré. Il n’est donc pas possible de dissocier

142

le rôle d’AAL-R sur la contraction directe et indirecte du muscle lisse bronchique. Finalement, notre

étude ne permet pas de déterminer la proportion de l’effet anti-inflammatoire d’AAL-R attribuable à

l’apoptose des lymphocytes pulmonaires contre ses effets directs sur l’activité et l’accumulation des

autres cellules immunitaires, comme les granulocytes et les cellules dendritiques.

En somme, le chapitre III suggère qu’un analogue phosphorylable de la sphingosine interfère avec

l’inflammation allergique par des mécanismes différents entre la phase de sensibilisation et la phase

allergique. Bien que la comparaison avec le modèle d’ovalbumine et d’antigènes d’acariens

domestiques soit imparfaite, je spécule que l’impact des analogues de la sphingosine donnés en

prophylaxie interfère préférentiellement avec la présentation de l’antigène, tandis qu’ils induisent

l’apoptose locale des lymphocytes accumulés au poumon dans le cas où l’inflammation est déjà

présente. Puisque la lymphopénie induite par les analogues de la sphingosine affecte

préférentiellement les lymphocytes naïfs [311], nous avons tenté de déterminer si l’impact pro-

apoptotique des analogues de la sphingosine était dépendant de l’état d’activation de ces derniers.

Bien qu’il ait été rapporté par Enosawa et al. [312] que FTY720 induit l’apoptose préférentielle des

lymphocytes activés, la sélectivité exacte de l’effet pro-apoptotique de FTY720 demeure mal connue.

Il sera primordial de déterminer si les analogues de la sphingosine induisent l’apoptose des

lymphocytes naïfs, car cela pourrait affecter la diversité des lymphocytes, et donc la capacité générale

du système immunitaire à répondre à de nouveaux pathogènes.

La capacité d’AAL-R à interférer avec l’inflammation allergique dans un modèle chronique a été

abordée dans la publication présentée au chapitre IV. Similairement aux observations faites au

chapitre III, AAL-R diminue fortement l’inflammation éosinophilique chronique. Malheureusement,

les effets du statut phosphorylatoire des analogues de la sphingosine sur l’hyperréactivité bronchique

et l’apoptose des lymphocytes n’ont pas été investigués. Bien qu’il soit probable que AAL-R

augmente aussi l’apoptose des lymphocytes dans un modèle chronique, cette démonstration

augmenterait l’intérêt thérapeutique des analogues phosphorylables de la sphingosine dans l’asthme

allergique. Nous pouvons cependant affirmer qu’AAL-R conserve son potentiel anti-inflammatoire

même dans un modèle d’asthme chronique allergique accompagné de remodelage bronchique.

143

7.2 Les effets des analogues de la sphingosine sur le remodelage bronchique dans l’asthme

Le remodelage bronchique est promu par l’exposition aux antigènes et l’inflammation chronique dans

l’asthme allergique [38], dont l’épaississement du muscle lisse bronchique, et contribue à la sévérité

de l’asthme [44]. Les traitements anti-inflammatoires interfèrent avec la progression du remodelage

chez l’humain et il a été montré que les corticostéroïdes peuvent diminuer le remodelage bronchique

dans l’obstruction bronchique récurrente chevaline [39], un syndrome similaire à l’asthme. Toutefois,

les anti-inflammatoires ne permettent pas la résorption de cet épaississement chez l’humain [37],

supportant que chez l’humain, l’inflammation ne soit la seule cause du maintien du remodelage

bronchique. De plus, les cibles thérapeutiques visant directement les mécanismes favorisant le

maintien du muscle lisse bronchique remodelé, comme la balance proliférative et apoptotique, sont

accablement limitées [38]. La voie de la S1P est intrinsèquement liée à la prolifération et à l’apoptose

[313]. En contrepartie, les analogues de la sphingosine peuvent interférer avec plusieurs mécanismes

promouvant la prolifération et directement induire l’apoptose de certains types cellulaires [284]. La

capacité des analogues de la sphingosine à réduire l’épaisseur du muscle lisse bronchique dans un

modèle d’asthme chronique a donc été étudiée au chapitre IV.

Nous avons utilisé un modèle d’asthme allergique chronique induit par l’administration d’un

homogénat d’acariens domestiques sur une période de cinq semaines, ce qui est suffisant pour induire

l’épaississement du muscle lisse bronchique. L’exposition à l’allergène a été interrompue une

semaine avant l’administration des traitements pharmacologiques afin de permettre à l’inflammation

aiguë de se résorber. Cette approche permet de réduire profondément l’influence de l’inflammation

et de mieux cibler les processus maintenant le remodelage du muscle lisse bronchique

indépendamment de l’inflammation aiguë. Nous avons ainsi montré que l’analogue phosphorylable

de la sphingosine AAL-R diminue fortement l’hyperréactivité bronchique dans ces conditions, ce qui

n’est répliqué ni par AAL-S, ni par la dexaméthasone. AAL-R réduit aussi l’épaisseur du muscle lisse

bronchique et diminue l’hyperréactivité bronchique. Puisque la dexaméthasone est un anti-

inflammatoire puissant et n’a pas eu d’effet bénéfique dans notre modèle, les résultats indiquent que

l’impact d’AAL-R n’est pas, ou du moins totalement, attribuable au contrôle de l’inflammation.

L’inefficacité d’AAL-S écarte l’hypothèse de la modulation de la protein phosphatase 2A [282] et

suggère que les effets de AAL-R dépendent plutôt de sa phosphorylation en AFD-R. Ainsi, nos

résultats suggèrent qu’AAL-R réduit l’hyperactivité bronchique en favorisant directement la

résorption de l’épaississement du muscle lisse bronchique. Il est toutefois important de noter que la

mesure de l’épaisseur du muscle lisse demeure un défi dans la souris, en raison de sa faible quantité

et de l’hétérogénéité de l’enroulement des muscles autour des bronches, ce qui a certainement

144

contribué à la grande variabilité de cette mesure dans notre étude. Une méthode plus fiable pouvant

être utilisée à grande échelle aurait certainement contribué à améliorer le lien potentiel entre les effets

spectaculaires d’AALR sur la fonction pulmonaire et son impact sur le muscle lisse bronchique.

Pour pallier à cette contrainte, nous avons étudié l’effet des analogues de la sphingosine sur la

prolifération et l’apoptose de cellules musculaires lisses bronchiques humaines in vitro en réponse au

sérum fœtal bovin, un agent mitotique puissant. Dans un environnement non inflammatoire,

l’administration d’une concentration atteignable in vivo (1 µM) d’AAL-R réduit la prolifération des

cellules musculaires lisses, mais pas AAL-S ou AFD-R. Il est important de souligner que

l’administration d’une dose supérieure (10 µM) d’AAL-R induit l’apoptose presque totale des cellules

musculaires lisses bronchiques. L’administration de 1 µM d’AAL-R augmente aussi l’apoptose de

ces cellules, mais la magnitude de l’effet est minime et ne permet pas d’expliquer la diminution de la

prolifération mesurée par l’incorporation de bromodeoxyuridine. Malgré que l’effet d’AAL-R semble

être relié à sa capacité à être phosphorylé, AFD-R n’interfère pas avec la prolifération des cellules

musculaires lisses. À priori, ces résultats semblent contradictoires, mais il a été montré qu’AFD-R ne

pénètre que faiblement les membranes cellulaires en accord avec sa nature polaire. Puisque d’AFD-

R est peu susceptible à la déphosphorylation, qui pourrait permettre son internalisation sous la forme

AAL-R, ses effets demeurent majoritairement extracellulaires in vitro.

Ces résultats suggèrent que la phosphorylation intracellulaire des analogues de la sphingosine est

nécessaire à leur effet cytostatique. Cette hypothèse est compatible avec le fait que les analogues de

la sphingosine sont connus pour interférer avec le métabolisme des sphingolipides [314]. D’une part,

nous avons observé qu’AAL-R, mais pas AAL-S ni AFD-R, augmente la S1P intracellulaire.

Toutefois, l’augmentation de la S1P intracellulaire par l’inhibition de l’enzyme la dégradant, la S1P

lyase, ne permet pas de répliquer les effets anti-proliférateurs d’AAL-R. D’un autre côté, aucun des

analogues de la sphingosine ne module la quantité de céramides pro-apoptotiques [315]. Par

conséquent, la modulation de la voie de la S1P ne semble pas impliquée dans les effets d’AAL-R.

Par elle-même, l’accumulation intracellulaire d’AFD-R peut interférer avec les mécanismes de la

survie cellulaire [284] et, de fait, seule l’administration d’AAL-R résulte en l’accumulation d’AFD-

R intracellulaire. AAL-R interfère donc avec la prolifération des cellules musculaires lisses

bronchiques humaines par sa phosphorylation intracellulaire et la subséquente accumulation de sa

forme phosphorylée, AFD-R.

Certaines limites de l’étude présentée au chapitre IV doivent toutefois être soulignées. La mesure

histologique de l’épaisseur, de l’hyperplasie et de l’hypertrophie du muscle lisse bronchique chez les

145

souris est particulièrement ardue au point de vue technique. Premièrement, seules les premières

divisions bronchiques peuvent être réalistement mesurées et seules les bronches coupées

transversalement sont valides. Deuxièmement, le nombre de cellules contenues dans les anneaux de

muscle lisse est faible et ne permet pas d’obtenir des mesures d’hyperplasie et d’hypertrophie

reproductibles et robustes. L’absence de mesure de l’épaisseur du muscle lisse bronchique en

présence d’AAL-S et de dexaméthasone est reliée à ces problèmes techniques. La comparaison de la

réduction de l’épaisseur du muscle lisse bronchique par AAL-R, AAL-S et la dexaméthasone aurait

permis de supporter notre hypothèse que AAL-R diminue directement cet épaississement in vivo.

Répliquer ces expérimentations dans un modèle animal de plus grosse taille, comme le rat, permettrait

de directement déterminer l’effet de AAL-R sur la prolifération et l’apoptose des cellules du muscle

lisse bronchique.

Les expérimentations in vitro ont aussi certaines limites. Bien que l’accumulation intracellulaire de

S1P ait été exclue pour expliquer l’effet cytostatique de AAL-R, l’hypothèse de l’inhibition de

l’export de la S1P dans le milieu extracellulaire n’a été que partiellement adressée. Les cellules

musculaires lisses bronchiques humaines expriment trois des récepteurs membranaires de la S1P,

S1P1, S1P2 et S1P3, qui peuvent tous être activés par la S1P extracellulaire. Toutefois, seul l’effet

d’un antagoniste de S1P1 et S1P3 a été étudié, ce qui ne permet pas d’éliminer l’implication de S1P2

dans l’effet de AAL-R. Il faut toutefois noter que l’activation de S1P2 est généralement associée à des

effets antiprolifératifs. De plus, l’antagoniste de S1P1 et S1P3 utilisé, VPC-23019, a une affinité avec

S1P1 environ 100 fois supérieure à S1P3. Il est possible que l’inhibition de ce dernier soit trop faible

pour détecter une différence appréciable expérimentalement. D’autres outils pharmacologiques

spécifiques avec une affinité supérieure sont disponibles, comme l’antagoniste de S1P1 W146 et

l’antagoniste de S1P3 TY-51256. Le rôle de S1P2 pourrait être évalué à l’aide de l’antagoniste

spécifique JTE-013 et de l’agoniste CYM-5520. Ces expérimentations confirmeraient que la S1P

extracellulaire n’est pas impliquée dans l’effet cytostatique d’AAL-R, via son impact sur les niveaux

de S1P.

Le mécanisme antiprolifératif de l’accumulation de AFD-R intracellulaire est inconnu. L’hypothèse

de l’augmentation du stress du réticulum endoplasmique a été avancée pour expliquer les effets pro-

apoptotiques d’AAL-R sur les cellules Jurkat [284]. Toutefois la mesure du stress du réticulum était

indirecte et nous ne sommes pas en mesure actuellement d’observer cette augmentation dans les

cellules musculaires lisses en culture. D’autres mécanismes pouvant être impliqués devront être

investigués, incluant l’altération des fonctions mitochondriales [217]. En effet, la SphK2 est aussi

localisée dans les mitochondries et se lie à PHB2, une protéine reliée à fonction des mitochondries

146

[316]. La production d’ATP par les mitochondries est une composante importante du cycle cellulaire

et l’inhibition de cette production ralentit l’entrée des cellules dans la phase S [317]. Les effets

cytostatiques d’AAL-R pourraient aussi être expliqués par l’expression différentielle de la principale

enzyme phosphorylant les analogues de la sphingosine, SphK2. Des données récemment générées au

laboratoire de Dr Marsolais montrent que l’immunoréactivité de la SphK2 est augmentée en condition

proliférative ce qui pourrait favoriser l’accumulation d’AFD-R dans les cellules en prolifération. De

plus, la quantification des céramides effectuée au chapitre IV ne permet pas de déterminer la nature

des espèces de la céramide et leur possible modulation qualitative et non quantitative. Ce détail est

important, car les diverses espèces de la céramide ont des effets différentiels sur les mécanismes de

la survie cellulaire [318-320] et les analogues de la sphingosine modulent inégalement les niveaux

ces espèces [260]. En somme, plusieurs mécanismes pourraient être impliqués dans les effets

cytostatiques de AAL-R et devront être explorés afin de mieux comprendre l’impact de cette classe

d’agent sur la biologie cellulaire du muscle lisse bronchique.

En plus de l’épaississement du muscle lisse bronchique, le remodelage bronchique dans l’asthme

implique aussi la déposition de fibrose sous-épithéliale, l’accumulation des cellules caliciformes et

les altérations à l’épithélium bronchique. La déposition de collagène sous-épithélial est augmentée

dans un modèle similaire d’asthme chronique induit par les antigènes d’acariens [82]. Au chapitre III,

nous avons aussi montré qu’AAL-R diminue l’accumulation des cellules à mucus ainsi que

l’hypertrophie épithéliale dans un modèle d’asthme aigu. Cependant, ces derniers n’ont pas été

approfondis dans notre modèle d’asthme chronique, car ces altérations sont majoritairement résorbées

deux semaines après la dernière exposition à l’antigène. Ces analyses requéraient d’effectuer des

modifications à notre modèle chronique afin de déterminer l’impact d’AAL-R sur ces paramètres.

Nous pouvons toutefois affirmer que AAL-R n’a pas induit d’altérations épithéliales appréciables

suivant le protocole chronique.

Sur la base des données du chapitre V, montrant que les analogues phosphorylables de la sphingosine

augmentent la fibrose dans un modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, AAL-R

devrait hypothétiquement augmenter la fibrose dans le contexte d’asthme chronique. En effet, la S1P

stimule aussi la production de matrice extracellulaire par les fibroblastes [302] et l’expression de

médiateurs profibrotiques par les cellules musculaires lisses bronchiques [321]. À priori, nous

n’avons pas obtenu de résultats compatibles avec cette notion dans le contexte de l’asthme. D’un côté,

AAL-R améliore les fonctions pulmonaires et, d’un autre côté, nous n’avons pas noté de lésions

fibrotiques appréciables en réponse à AAL-R dans nos conditions expérimentales. Cette hypothèse

serait plus adéquatement testée par une approche expérimentale adaptée, incluant des mesures

147

spécifiquement conçues pour évaluer le contenu en collagène des bronches, ainsi que des modèles

impliquant des animaux de plus grandes tailles. Malgré les effets d’AAL-R sur ces composantes du

remodelage bronchique observés dans d’autres modèles, ils sont incertains dans un modèle d’asthme

chronique. Considérant les différences des mécanismes sous-jacents au remodelage dans l’asthme et

la fibrose pulmonaire, il est possible que les mécanismes fibrotiques de la fibrose dans l’asthme soient

insensibles aux analogues de la sphingosine.

7.3 Les effets des analogues de la sphingosine sur la fibrose pulmonaire.

La fibrose pulmonaire est une conséquence importante de plusieurs maladies pulmonaires

interstitielles. Bien que l’inflammation soit impliquée dans la progression de plusieurs de ces

maladies, elle n’est généralement pas nécessaire au maintien de la fibrose [7], comme dans le cas de

la FPI. De fait, les traitements anti-inflammatoires sont inefficaces et les traitements visant les

processus fibrotiques sont très limités [116]. Il y a donc un besoin criant d’explorer de nouvelles

cibles thérapeutiques. La S1P, ainsi que la SphK1, est augmentée dans le poumon des patients atteints

de la FPI [288]. Dans les modèles expérimentaux, la diminution de la S1P est associée à une

diminution de la fibrose pulmonaire [289, 292]. Cependant, les effets des analogues de la sphingosine

sont controversés, car des effets bénéfiques aussi bien que néfastes ont été observés dans différents

modèles de fibrose pulmonaire murine [296, 299]. Comme les analogues de la sphingosine sont des

anti-inflammatoires puissants, nous avons déterminé leurs effets sur l’inflammation et les processus

fibrotiques afin d’élucider cette contradiction.

Nous avons confirmé les limites temporelles des phases d’inflammation et de fibrose dans un modèle

de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine. Tel que montré par Moeller et al. [190], nous avons

confirmé que la phase inflammatoire se situe entre les jours 0 et 7 après l’administration d’une dose

de bléomycine et la phase fibrotique évolue entre les jours 14 et 21. Nous avons ensuite comparé les

effets d’une faible dose de FTY720 entre ces deux phases. La période de transition entre les jours 7

et 14 a été évitée afin de réduire le chevauchement de l’inflammation et de la fibrose. Ainsi nous

avons montré que, lorsqu’administré pendant la phase inflammatoire, FTY720 réduit fortement l’aire

fibrotique du poumon en plus de diminuer la rigidité pulmonaire. Cette observation concorde avec

les résultats similaires observés dans un autre modèle de blessure pulmonaire. Toutefois, nous avons

révélé qu’au contraire, l’administration de FTY720 en phase fibrotique augmente la rigidité du

poumon et la proportion du poumon atteint par la fibrose pulmonaire. Nos résultats renforcent le

potentiel thérapeutique de FTY720 pour le traitement des blessures pulmonaires aiguës comme

148

suggéré par Quian et al. [296] et autres [322] et supportent que l’utilisation du FTY720 dans cette

optique bénéficierait de son arrêt après la résorption de l’inflammation aiguë et avant la phase de

remodelage. Toutefois, les effets d’un traitement en continu avec FTY720 restent à être évalués afin

de confirmer cette hypothèse.

Plusieurs mécanismes reliés à la fibrose pulmonaire sont modulés par la S1P et les analogues de la

sphingosine. Premièrement, la S1P diminue la perméabilité vasculaire pulmonaire, tout comme des

faibles doses des analogues de la sphingosine [259]. À l’inverse, à fortes doses, FTY720 augmente la

perméabilité vasculaire et exacerbe la fibrose pulmonaire [259, 299], ce qui serait en partie causé par

un phénomène d’antagonisme fonctionnel sur S1P1 [299]. Toutefois, les concentrations d’analogues

de la sphingosine utilisées sont de plusieurs fois supérieures à ce qui est normalement accepté et ne

représente ainsi pas une situation représentative de son leur utilisation expérimentale et clinique.

Puisque qu’il est bien connu que des doses supra-physiologiques des analogues de la sphingosine

induisent des effets pro-apoptotiques, et même cytotoxiques, l’augmentation apparente de la

perméabilité vasculaire au poumon observée dans cette étude, ainsi que l’exactitude de la conclusion,

est remise en question.

Ainsi, nous avons donc déterminé l’effet d’une dose plus physiologique de FTY720 sur

l’extravasation du contenu sanguin dans le lavage bronchoalvéolaire, comparativement à des doses

connues pour augmenter la perméabilité vasculaire [299]. Tel qu’attendu, nous avons répliqué les

fortes accumulations d’albumine dans les lavages bronchoalvéolaires en réponse à des concentrations

toxiques de FTY720, reflétant l’exacerbation de la blessure pulmonaire sévère. Toutefois, à des doses

fréquemment utilisées pour induire une immunomodulation [280], nous démontrons que la

perméabilité vasculaire induite par la bléomycine tend à être diminuée par FTY720. Par conséquent,

nous stipulons que l’augmentation de la perméabilité vasculaire n’est probablement pas un facteur

impliqué dans l’augmentation de la fibrose pulmonaire lorsque FTY720 est administré en phase

fibrotique et à une dose non toxique.

Ce résultat nous a redirigés vers l’étude de la modulation des médiateurs profibrotiques par FTY720.

In vivo, l’administration de FTY720 pendant la phase fibrotique augmente les niveaux de mRNA du

CTGF, qui est fortement impliqué dans la progression et le maintien de la fibrose [121]. Étonnement,

bien que le TGF-β soit un médiateur central de la fibrose et induit directement l’expression du CTGF,

ses niveaux de transcrits ne sont pas modifié par FTY720. Cette observation est compatible avec les

résultats de Sobel et al. [302] montrant que FTY720 induit la transcription du CTGF par les

fibroblastes, in vitro. En somme, les analogues de la sphingosine exacerbent la fibrose pulmonaire,

non pas via l’augmentation de la perméabilité vasculaire au poumon, mais probablement en favorisant

149

des mécanismes profibrotiques à l’échelle locale, incluant l’augmentation de la transcription du

CTGF par les fibroblastes.

D’ailleurs, il est reconnu que les fibroblastes FPI ont un phénotype différent des fibroblastes non-FPI.

La S1P et les analogues de la sphingosine favorisent l’expression de la matrice extracellulaire et de

facteurs profibrotiques par les fibroblastes non-FPI in vitro [323] et dans le poumon fibrotique in vivo

[290], mais leurs effets sur les fibroblastes FPI sont inconnus. Afin d’étudier l’impact des modulateurs

de la voie signalétique de la S1P en contexte de fibrose chez l’humain, nous avons isolé des

fibroblastes FPI et non-FPI. Nous avons premièrement confirmé que les fibroblastes FPI isolés ont

une augmentation des niveaux de transcrits du CTGF, de la forme épissée alternativement de la

fibronectine et de l’α-smooth muscle actin, le marqueur de différentiation des fibroblastes en

myofibroblastes. L’altération des niveaux des composantes de la voie de signalisation n’a pas pu être

déterminée en partie par le faible nombre des lignées de fibroblastes accessible. Toutefois, nous avons

observés que les niveaux de transcrits de S1PR2 et S1PR3 corrèlent positivement avec ceux du CTGF.

Bien que nous ne puissions pas nous prononcer sur profil d’expression de la voie de la S1P des

fibroblastes FPI, il semble qu’elle est impliquée dans leur régulation de mécanismes profibrotiques.

D’ailleurs, nous avons montré que la S1P augmente les niveaux de transcrits du CTGF, mais diminue

ceux du collagène. L’augmentation de la transcription du CTGF est partiellement réversible par

l’administration d’un antagoniste spécifique de S1P3. Ainsi, nos résultats suggèrent que la S1P

favorise un phénotype profibrotique en partie par l’activation de S1P3, ce qui pourrait amplifier la

fibrose pulmonaire dans la FPI si la surexpression de ce récepteur est confirmée chez une proportion

significative des patients atteints de cette maladie.

Certains mécanismes inexplorés des analogues de la sphingosine pourraient aussi être impliqués dans

leurs effets profibrotiques. L’accumulation des fibroblastes pulmonaires est l’un des principaux

facteurs aggravant la fibrose pulmonaire, en partie par l’augmentation de leur résistance à l’apoptose

[166, 323]. Tel que montré précédemment, les analogues de la sphingosine altèrent profondément la

balance proliférative et apoptotique de plusieurs types cellulaires [284]. Des résultats préliminaires

suggèrent que les fibroblastes normaux sont susceptibles aux effets cytostatiques d’AAL-R, mais

cette observation n’a pas été confirmée avec des fibroblastes FPI. Il serait nécessaire de déterminer

les effets des analogues de la sphingosine sur l’accumulation des fibroblastes fibrotiques in vivo et in

vitro. Bien que la diminution de la prolifération des fibroblastes soit à priori bénéfique, la capacité

proliférative de ces derniers est hétérogène [187]. Les fibroblastes au cœur des lésions fibrotiques

prolifèrent très peu, mais produisent de grandes quantités de matrices extracellulaires, alors que ceux

en périphérie prolifèrent davantage et se différentient en myofibroblastes. Puisque les

150

myofibroblastes sont nécessaires pour la résorption de la fibrose [188], l’inhibition de leur

prolifération pourrait ralentir la guérison. Malgré les évidences contradictoires dans la littérature, les

analogues de la sphingosine favorisent potentiellement la différentiation des fibroblastes en

myofibroblastes [303]. Considérant le rôle des myofibroblastes dans la production de la matrice

extracellulaire et la contraction des lésions fibrotiques, déterminer les effets des analogues de la

sphingosine sur leur nombre et de leur localisation dans les zones fibrotiques ajouterait à la

compréhension des mécanismes de la fibrose.

Certaines expérimentations complémenteraient les résultats obtenus au dernier chapitre expérimental.

Par exemple, les analogues de la sphingosine affectent plusieurs mécanismes différents selon leur

statut phosphorylatoire. In vitro, la comparaison d’AAL-R, AFD-R et AAL-S permettrait de

déterminer la proportion des effets fibrotiques attribuables aux cibles intracellulaires, à

l’accumulation d’AFD-R intracellulaire et à la signalisation des récepteurs de la S1P, respectivement.

La nécessité de la phosphorylation pourrait aussi être déterminée dans la phase fibrotique du modèle

de fibrose pulmonaire induit par la bléomycine en comparant AAL-R et AAL-S.

À cet effet, nous montrons qu’au moins S1P3 est impliqué dans les effets profibrotiques de la voie de

la S1P. Puisque l’activation de S1P2 induit l’expression de facteurs fibrotiques par les fibroblastes

normaux [302], son inhibition pourrait avoir un effet similaire chez les fibroblastes FPI. De plus, une

approche agonistique permettrait de confirmer l’effet de l’activation de ces récepteurs

indépendamment des autres récepteurs et des effets de la S1P indépendants des récepteurs, comme

l’altération des niveaux des sphingolipides. Des analyses supplémentaires ajouteraient à la

compréhension des mécanismes profibrotiques ciblés par la S1P. Par exemple, puisque la S1P

augmente la production de matrice extracellulaire sans augmenter la transcription du collagène [302],

la production du collagène ne peut être déterminée que par une mesure plus directe, comme la

quantification de l’hydroxyproline dans le milieu de culture. La différenciation des fibroblastes en

myofibroblastes pourrait être mesurée en cytométrie de flux ou en immunofluorescence par un

marquage de l’α-smooth muscle actin. Ces études permettraient de révéler les principaux mécanismes

profibrotiques augmentés par les analogues de la sphingosine.

Cette thèse a également mené au développement de stratégies expérimentales afin de contrecarrer

l’hétérogénéité inhérente au modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine. Le

développement de la fibrose dans ce modèle est fortement dépendant de l’intensité de l’inflammation

de la phase inflammatoire. Les différences mineures dans cette dernière peuvent se révéler

exponentielles dans la phase fibrotique. Par conséquent, l’étude des effets d’outils pharmacologiques

sur la phase fibrotique est un défi, car l’étendue de la fibrose peut être variable entre les individus.

151

Nous avons donc développé une approche expérimentale impliquant la mesure longitudinale des

fonctions pulmonaires à l’aide de l’appareil flexiVent. Elle consiste à déterminer le niveau de

remodelage par la mesure de la compliance pulmonaire avant l’administration des composées

pharmacologiques. Une nouvelle mesure à la fin du protocole permet d’isoler l’effet des composés

sur la progression de la fibrose pulmonaire indépendamment de son niveau de base. Cependant, cette

méthode est non terminale et nécessite une anesthésie à l’isoflurane qui n’est pas optimale pour

certaines analyses du flexiVent. L’une de ces analyses est le PV-Loop, qui permet de déterminer la

compliance indépendamment de la fréquence et d’évaluer l’atélectasie causée par les lésions

fibrotiques. Une anesthésie avec la kétamine/xylazine permettrait d’effectuer ces analyses, mais

risque d’augmenter la mortalité. Malgré cela, l’approche développée répond à l’une des principales

critiques du modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine.

En somme, nous montrons que les analogues de la sphingosine peuvent potentiellement exacerber la

fibrose pulmonaire, malgré leurs effets anti-inflammatoires importants. L’augmentation de la fibrose

semble impliquer l’expression du CTGF. Nous montrons aussi que la S1P stimule la transcription du

CTFG par les fibroblastes en partie par l’activation de S1P3. De plus, les niveaux de mRNA du CTGF

corrèlent avec ceux de S1PR2 et S1PR3. Ces récepteurs de la S1P ont potentiellement un rôle dans le

développement de la FPI et pourraient être une cible thérapeutique potentielle.

152

Chapitre VIII : Conclusion et Perspectives

Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse montrent que les analogues phosphorylables de la

sphingosine, comme AAL-R, ont un potentiel préclinique dans l’asthme allergique. D’une part, AAL-

R diminue profondément l’inflammation éosinophilique caractéristique de l’asthme allergique, ce qui

est associé à l’augmentation de l’apoptose des lymphocytes T CD4+ et B pulmonaires. D’une autre

part, AAL-R réduit l’hyperréactivité bronchique dans un modèle d’asthme chronique avec

remodelage bronchique. Cette diminution est possiblement causée par la diminution de l’épaisseur

du muscle lisse bronchique et cette hypothèse est supportée par l’effet cytostatique d’AAL-R sur les

cellules musculaires lisses bronchiques humaines. Dans ces deux cas, les effets des analogues de la

sphingosine ne semblent pas dépendre de leur signalisation par les récepteurs extracellulaires de la

S1P, le mécanisme d’action classique des analogues de la sphingosine [249]. Au contraire, la

modulation de la prolifération et de la survie cellulaire requiert un analogue phosphorylable pouvant

s’accumuler dans le milieu intracellulaire. Toutefois, nous avons aussi montré que les analogues de

la sphingosine peuvent exacerber la fibrose pulmonaire en promouvant l’expression de facteurs

profibrotiques. L’administration prolongée d’analogues de la sphingosine dans un modèle d’asthme

chronique pourrait ainsi exacerber la fibrose sous-épithéliale. Des études plus poussées sur les effets

des analogues de la sphingosine sur le remodelage pulmonaire sont donc requises.

Les analogues de la sphingosine et la voie de la S1P affectent une panoplie de types cellulaires. Ils

modulent les mécanismes inflammatoires et fibrotiques aussi bien que la balance proliférative et

apoptotique. Toutefois, leurs mécanismes d’actions sont complexes, mal définis et mal compris. Une

étape importante est l’identification des mécanismes favorisant un effet cytostatique

comparativement à un effet pro-apoptotique de l’accumulation intracellulaire des analogues de la

sphingosines phosphorylables. Plusieurs avantages découleraient de cette identification.

Premièrement, il serait possible de prédire les types cellulaires sensibles à l’effet cytostatique et donc

les pathologies où les analogues de la sphingosine pourraient être bénéfiques. Deuxièmement, il serait

possible de diminuer les effets secondaires des analogues de la sphingosine en favorisant ce

mécanisme. La meilleure compréhension des mécanismes des analogues de la sphingosine

accentuerait ainsi indéniablement leur potentiel thérapeutique.

153

8. Chapitre IX : Bibliographie

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Le rôle de la sphingosine-1-phosphate et impact des analogues de … · 2020. 8. 7. · La voie de signalisat ion de la sphingosine -1-phosphate (S1P) est reconnu e non seulement