Les Puces a ADN
République Algérienne Démocratique et PopulaireMINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERGHE
SCIENTIFIQUE UNIVERSITE HASSIBA BEN BOUALI CHLEF
Biotechnologie Microbienne L3 Module :Biologie Moléculaire
Présenté par:-BOUREZAK RABIAA-NAWEL-HADJ BEN ELEZAAR ASMA
Dirigé par:-Mm . NAHAL
2015/2016
Introduction
Historique
Définition des puces à ADN
Les différents types de puces à ADN
Principe
Notre plan de présentation
Les étapes de construction
Fonctionnement des puces a ADN
Domaines d’utilisation
Les avantages et les inconvénient
Conclusion
Notre plan de présentation
Le concept de puce à ADN repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio-informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes simultanément et les applications sont en plein essor dans un grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la médecine ou l’environnement.
INTRODUCTION
Historique
leur concept date de 1987 « suite logique aux anciennes méthodes de northern blotting.
La technologie des puces à ADN est basée sur le principe d’hybridation développé par southern (1974).
Les premières puces à ADN sont apparues en 1993.
Schena et al 1995
Définition des puces à ADN
Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface
qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.
Ploy-lysin
puces à gènes
micromatrice d'ADN
puce à ADN
Une biopuce
biochip
Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange
complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.
Microarray:lame en verre
-plus miniaturisé-utilise les
produit PCR-200-400 microns-cibles marquées par fluorescence
Macroarray:-utilise des clones
d’ ADNc .
-disposés sur une membrane de
nylon.
-associés avec des cibles
Radioactives.
Oligonucléotides:Affimetrix-synthèse chimique
d’oligonucléotides In-situ
-sur surface solide
- un procédé de photolithographi
e
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Les différents types de puces à ADN
Source : The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc
Fabrication de la puce
.
Préparation de la cible
Hybridation
Lecture
Analyse des données
Regroupement des profils d’expression
Les étapes de construction
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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La Fabrication
Les fragments d'ADNc amplifiés par la technique de PCR sont déposés sur une lame de verre par adressage mécanique.
L’accrochage de la molécule d’ADNc se fait grâce à (la poly-lysine).
L’ADN est lié de manière covalente au support par une exposition aux UV.
Un Support idéal, c’est lui qui permet : L’immobilisation efficace des sondes sur la surface. L’hybridation robuste de la sonde avec la cible.
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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Préparation de la cible
-Les ARNm sont extraits des deux cultures dont on veut comparer leurs expressions.
-Les ARNm sont ensuite transformés en ADNc monocaténaires par transcription inverse RT-PCR.
-L’ADN de la première culture est marqué avec un fluorochrome vert, et l'ADN de la seconde culture estmarqué en rouge.
-Mélange des deux ADNc (vert et rouge) : c’est la cible.
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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L’Hybridation
1-Le mélange est placé sur la matrice d'ADNc monocaténaire
(la sonde).
2-La puce est alors incubée une nuit à 60 degrés. A
cette température, un brin d'ADN qui rencontre son
complémentaire s'apparie pour donner de l'ADN
double brin.
65c° PENDANT UNE NUIT
MODE DE FIXATION des sondes:séchage 12H /fixation des ADN par
cuisson à 80c° / lavage
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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La lecture
1-La puce est placée sous un
scanner éléctronique.
2-Des résultats obtenus par des logiciels
informatiques
3-Superposition des images vertes et rouges : le vert , c’est seulement l'ADN de la
première condition qui est fixé ; le rouge c’est seulement l'ADN de la seconde
condition qui est fixé)*Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306Microarrays: biotechnology’s discovery platform for functional genomics
Domaine d’utilisation
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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Analyse des données
*On calcule le ratio des intensités= fluorescence rouge / fluorescence verte.
Si ce ratio > 1 (la couleur estrouge), le gène est plus exprimé, si ce ratio < 1 (la couleur est verte), le gène
est moins exprimé.
*On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d’ARNm correspondante dans la
cellule de départ
*On mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome (vert et rouge)
pour chacun des spots
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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ARNm présent seulement dans les cellules normales
ARNm présent seulement dans les cellules cancéreuses
ARNm présent en quantité égale dans les cellules normales et dans les cellules cancéreuses
Microarrays
Macroarrays
Puces à oligonucléotides
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Regroupement des profils d’expression
2- On représente ensuite les ratios grâce à une échelle de couleur du vert (gènes
réprimés) au rouge(gènes induits).
1-Dans cette étape ,on essaye de regrouper des gènes ayant le même
profil d'expression sur plusieursexpériences ayant un rapport biologiques
On réalise une synthèse chimique d’oligonucléotides représentative des génes de l’organisme étudié,directement sur une lame de verre, par un procédé photolithographique .
1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à fixer des nucléotides.
2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard.
3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème .
4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place.
5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème place.
3-Réseaux d’oligonucléotides : synthèse d’oligonucléotides in situ (sur une surfase)
Généralement, quand la limite d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on considère qu’un gène est respectivement sur exprimé ou sous- exprimé, dans une des cibles par rapport à l’autre.
Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS)
Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) = f(intensités dans le vertCY3).
Domaine d’utilisation parallèlement à l’analyse des profils d’expression, les puces à ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses.
- La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis d’améliorer la classification des tumeurs.
-Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de molécules.
-L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques, principalement des agents pathogènes dilués dans l’environnement.-Les applications dans le domaine de la guerre bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques.
Domaine d’utilisation Avantages Inconvénients
Étude simultanée des profilsd’expression de plusieurs millierde gènes.
Les données sont cumulables.
Les groupes de gènes affichent des comportements identiques dans une situation biologique donnée.
La technique est assez lourde à mettre en place.
L’équipement de départ est d’un coût relativement élevé.
Le grand nombre de résultats obtenu très rapidement nécessite un traitement informatique et statistique non négligeable.
conclusion
-Les biopuces se présentent comme une réelle révolution autant au point de vue technologique qu’applicatif. En effet, les procédés de fabrication et d’exploitation nécessitent la participation de sciences à vocations différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un côté des technologies relevant des télécommunications telles que l’électronique, l’optique et l’informatique, et d’autre la biologie.
Merci