UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III
UFR DE PHARMACIE
Année : 2007 N° d’ordre…
THESE
En vue de l’obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE
Délivré par l’Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline : Chimie
Spécialité: Chimie – Biologie – Santé
Présentée et soutenue publiquement le 19 Octobre 2007 par
Bénédicte PORTET
RECHERCHE BIOGUIDEE DE MOLECULES
ANTIPALUDIQUES D’UNE PLANTE GUYANAISE
Piper hostmannianum var. berbicense
Directeur de thèse : Professeur Claude MOULIS
Co-directeur de thèse : Professeur Isabelle FOURASTE
JURY
M. A. LATTES Professeur à l’Université de Toulouse III Président
M. L. ANGENOT Professeur à l’Université de Liège Rapporteur
M. F. TILLEQUIN Professeur à l’Université de Paris V Rapporteur
Mme E. T. GOMES Professeur à l’Université de Lisbonne Examinateur
M. G. MASSIOT Directeur de Recherche CNRS-Pierre Fabre, UMS 2597 Examinateur
M. C. MOULIS Professeur à l’Université de Toulouse III Directeur de thèse
Mme. I. FOURASTE Professeur émérite à l’Université de Toulouse III Membre invité
Laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox – UMR -152
Faculté de pharmacie, Université Paul Sabatier, 35 chemin des maraîchers, 31062 Toulouse Cedex 9
A notre Président de Thèse,
Monsieur le Professeur Armand LATTES
Professeur de chimie, à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.
Qu’il nous soit ici permis de vous remercier très sincèrement pour avoir jugé ce
travail malgré vos nombreuses obligations.
Nous sommes particulièrement honorés de vous avoir vu assurer la Présidence de ce
Jury de Thèse.
A notre Jury de Thèse,
Monsieur le Professeur Luc ANGENOT
Professeur de pharmacognoise, à l’Université de Liège.
Nous vous remercions vivement d’avoir accepté de juger ce travail.
Nous sommes très sensible à l’honneur que vous nous faites d’en être le rapporteur.
Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficié de vos remarques éclairées et tenons à
vous assurer de notre grande estime et de notre profonde gratitude.
Monsieur le Professeur François TILLEQUIN
Professeur de pharmacognosie, à l’Université de Paris V.
Qu’il nous soit ainsi permis de vous remercier très sincèrement pour avoir
spontanément accepté de juger ce travail et d’en être le rapporteur.
Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficier de vos conseils et tenons à vous
assurer de notre considération la plus respectueuse.
Madame le Professeur Elsa Teixera GOMES
Professeur de pharmacognosie, à l’Université de Lisbonne.
Nous vous remercions vivement d’avoir accepté de juger ce travail.
Nous avons été touché par votre gentillesse et par l’intérêt porté sur nos travaux de
recherche.
Monsieur le Docteur Georges MASSIOT
Directeur de recherche CNRS-Pierre Fabre
Vous avez, malgré vos obligations, accepté de juger ce travail.
Nous sommes très heureux d’avoir pu bénéficié de vos remarques et de vos conseils.
Nous sommes particulièrement honorés de votre présence à notre Jury de Thèse.
Monsieur le Professeur Claude MOULIS
Professeur de pharmacognosie à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.
Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficié de vos remarques et de vos
compétences tout au long de ces trois années de thèse.
Nous tenons à vous présenter notre profonde reconnaissance et notre respect.
Nous garderons en mémoire vos grandes qualités, tant humaines, qu’intellectuelles,
votre gentillesse et votre humour.
Madame le Professeur Isabelle FOURASTE
Professeur de pharmacognosie à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.
Vous nous avez accueilli dans votre laboratoire avec la plus grande bienveillance.
Vos encouragements et votre confiance nous ont guidé tout au long de ce travail.
En témoignage de notre profonde gratitude, veuillez trouvez ici nos remerciements les
plus sincères.
Un grand merci à tous les membres de l’UMR-152 et plus particulièrement à Nicolas, Momo,
Karine, Valérie et Séverine pour leur conseils avisés et à tous les doctorants dont Lucia,
Amélie, et Vincent pour leur soutien tout le long de ces trois années de thèse.
i
Table des matières
Abréviations p1
Lexique de botanique p4
I. Introduction p6
II. Synthèse bibliographique p8
A. Description de la plante étudiée p8
A. I. Données botaniques p8
A. I. 1 Les Piperaceae p8
Position systématique des Piperaceae p8
Caractères morphologiques généraux des Piperaceae p9
Quelques Piperaceae célèbres p10
A. I. 2 Piper hostmannianum var. berbicense p11
Le genre Piper p11
Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC p12
Utilisation en médecine traditionnelle p13
Description anatomique p13
A. II. Données phytochimiques p16
A. II. 1 Données phytochimiques sur le genre Piper p16
Généralités p16
Les alcaloïdes p16
Les flavonoïdes p16
Les kawapyrones p16
Les stéroïdes p16
Les lignanes p17
Molécules antipaludiques isolées dans le genre Piper p18
A. II. 2 Données phytochimiques sur Piper hostmannianum var. berbicense p20
Etude de la composition de l’écorce p20
Etude de la composition des feuilles p20
ii
B. Flavonoïdes et spectrométrie de masse p22
B. I Généralités p22
B. I. 1 Définition, classification et biosynthèse des flavonoïdes p22
Définition p22
Classification p22
Biosynthèse p23
B. I. 2 Les chalcones et les dihydrochalcones p25
Définition p25
Activités biologiques p26
B. I. 3 Les flavanones p27
Définition p27
Activités biologiques p27
B. II Application de la spectrométrie de masse à l’étude de la fragmentation des
flavonoïdes minoritaires p29
B. II. 1 Travaux réalisés en ionisation électronique p29
B. II. 2 Ionisation par electrospray et ionisation chimique à pression atmosphérique (ESI
et APCI) p37
Ionisation par electrospray (ESI) p37
Ionisation chimique à pression atmostphérique (APCI) p42
C. Généralités sur le paludisme p45
C. I. Epidémiologie p45
Des chiffres alarmants p45
Répartition géographique p45
C. II. Le parasite et le vecteur p46
C. II. 1 Les parasites du genre Plasmodium p46
Classification p46
Cycle de reproduction p48
C. II. 2 Le vecteur : un moustique femelle du genre Anopheles p50
Classification p50
Les principales espèces p50
La nécessité d’un repas sanguin p50
C. III. Les manifestations cliniques p51
Phase d’incubation p51
Phase d’invasion p51
iii
Phase d’état p51
C. IV. Prévention et traitement du paludisme p52
C. IV. 1. Prévention du paludisme p52
La lutte anti-vectorielle p52
La chimioprophylaxie p52
C. IV. 2 Le traitement du paludisme p53
C. IV .2. 1 Les principaux antipaludiques p53
Les schizonticides p53
Les gamétocytocides p58
Phénomènes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques p59
C. IV. 2. 2 Les remèdes traditionnels : une alternative ? p60
C. V Généralités sur les cibles thérapeutiques p61
III. Résultats et discussion p63
D. Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var. berbicense p63
D. 1 Matériel végétal p63
D. 2 Travaux préliminaires : étude comparative des deux variétés de Piper
hostmannianum Guyanaises p63
D. 3 Extraction p67
D. 4 Purification p68
D. 4. 1 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016 p69
D. 4. 1. 1 Purification de la fraction F1 p70
Purification de la fraction F1.2 p71
Purification de la fraction F1.3 p71
Purification de la fraction F1.4 p72
D. 4. 1. 2 Purification de la fraction F3 p72
D. 4. 2 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016bis p72
D. 4. 2. 1 Purification de la fraction F4’ p73
D.4.2.2 Purification de la fraction F5’ p74
D.4. 3 Purification de l’extrait chloroformique du lot 1016 p74
D. 4. 3. 1 Purification de la fraction G5 p76
D. 4. 3. 2 Purification de la fraction G6 p76
D. 4. 3. 3 Purification de la fraction G7 p77
iv
D. 5 Détermination structurale p78
D. 5. 1 Détermination structurale des composés de type dihydrochalcone p79
D. 5. 1. 1 Détermination structurale du composé Host9 p79
D. 5. 1. 2 Détermination structurale du composé Host7 p82
D. 5. 1. 3 Détermination structurale du composé Host2 p88
D. 5. 1. 4 Détermination structurale du composé Host3 p92
D. 5. 1. 5 Détermination structurale du composé Host4 p94
D. 5. 1. 6 Détermination structurale du composé Host5 p95
D. 5. 1. 7 Bilan des molécules isolées de type dihydrochalcone p98
D. 5. 2 Détermination structurale des composés de type chalcone p100
D. 5. 2. 1 Détermination structurale du composé Host11 p100
D. 5. 2. 2 Détermination structurale du composé Host12 p104
D. 5. 2. 3 Détermination structurale du composé Host6 p106
D. 5. 2. 4 Bilan des molécules isolées de type chalcone p110
D. 5. 3 Détermination structurale des composés de type flavanone p112
D. 5. 3. 1 Détermination structurale du composé Host1 p112
D. 5. 3. 2 Détermination structurale du composé Host8 p117
D. 5. 3. 3 Détermination structurale du composé Host10 p119
D. 5. 3. 4 Détermination structurale du composé Host13 p121
D. 5. 3. 5 Détermination structurale du composé Host14 p124
D. 5. 3. 6 Détermination structurale du composé Host15 p126
D. 5. 3. 7 Détermination structurale du composé Host16 p129
D. 5. 3. 8 Bilan des molécules isolées de type flavanone p131
D. 6 Résultats des tests biologiques p133
D. 6. 1 Activités biologiques in vitro p133
D. 6. 2 Activités biologiques in vivo p135
D. 7 Bilan de l’étude phytochimique bioguidée de P. hostmannianum var. berbicense p137
E. Etude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et flavanones par
spectrométrie de masse p138
E. 1 Travaux préliminaires p138
E. 2 Etude de la fragmentation des chalcones par (-)-APCI p140
E. 2. 1 Fragments A ou B p141
E. 2. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres p142
v
E. 2. 3 Cas particulier de la chalcone Host6 p144
E. 2. 4 Bilan : clé d’identification des composés de type chalcone p144
E. 3 Etude de la fragmentation des dihydrochalcones par (-)-APCI p146
E. 3. 1 Fragments A ou B p148
E. 3. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres p148
E. 3. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type dihydrochalcone p150
E. 4 Etude de la fragmentation des flavanones par (-)-APCI p151
E. 4. 1 Fragments A ou B p152
E. 4. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutre p152
E. 4. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type flavanone p154
E. 5 Comparaison de la fragmentation des dérivés chalcones et dihydrochalcones en APCI en
mode négatif p155
Comparaison des fragments A ou B obtenus p155
Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p155
E. 6 Comparaison de la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones et flavanones par
APCI en mode négatif p156
Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus p156
Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p157
E. 7 Comparaison de la fragmentation des chalcones et des flavones en spectrométrie de
masse (techniques d’ionisation douces) p158
Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus p158
Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p158
E. 8 Conclusion de l’étude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et flavanones
par (-)-APCI p159
F. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MS n de l’extrait acétate d’éthyle de feuilles de Piper
hostmannianum var. berbicense p160
F. 1 Profil chromatographique p160
F. 2 Identification des composés présents dans l’extrait AcOEt p162
� Composé de rapport m/z 271 à Tr 15.34 min p162
� Composé de rapport m/z 283 à Tr 15.73 min p165
� Composé de rapport m/z 283 à Tr 16.87 min p167
� Composé de rapport m/z 297 à Tr 18.61 min p169
� Composé de rapport m/z 301 à Tr 12.48 min p171
vi
� Composé de rapport m/z 311 à Tr 17.14 min p174
� Composé de rapport m/z 311 à Tr 22.52 min p178
� Composé de rapport m/z 327 à Tr 8.92 min p181
� Composé de rapport m/z 327 à Tr 12.14 min p184
� Composé de rapport m/z 341 à Tr 18.01 min p187
� Composé de rapport m/z 341 à Tr 22.76 min p191
F. 3 Bilan de l’analyse par LC/DAD/APCI-MSn p194
IV. Conclusions et perspectives p196
V. Matériels et méthodes p200
G. Matériels et méthodes p200
G. 1 Matériel végétal et extraction p200
Identification de la plante p200
Préparation des échantillons p200
Extraction p200
-Extraction par l’ASE 100 Dionex® p200
-Extraction par lixiviation p201
G. 2 Méthodes chromatographiques analytiques p201
G. 2. 1 Chromatographie sur couche mince (CCM) p201
G. 2. 2 Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV) p202
G. 2. 3 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse p203
G. 3 Méthodes chromatographiques préparatives p203
G. 3.1 Chromatographie sur colonne ouverte (CC) p203
G. 3. 2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) p204
G. 3. 3 Chromatographie SPE sur cartouches de silice C18 (Vac Elut®) p204
G. 3. 4 Chromatographie liquide haute performance semi-préparative (HPLC semi-prep)
p205
G. 4 Méthodes physico-chimiques p205
G. 4. 1 Point de fusion p205
G. 4. 2 Pouvoir rotatoire p205
G. 4. 3 Spectrométrie Ultraviolet (UV) p205
G. 4. 4 Spectrométrie Infra-Rouge (IR) p206
vii
G. 4. 5 Spectrométrie de masse (SM) p206
Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) p206
Spectrométrie de masse haute résolution p206
Ionisation par electrospray (ESI) p207
G. 4. 6 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) p207
G. 4. 7 Diffraction aux rayons p208
G. 5 Tests biologiques p208
G. 5. 1 Tests réalisés sur P. falciparum p208
G. 5. 1.1 La culture in vitro p208
G. 5. 1. 2 La synchronisation p209
Principe p209
Mode opératoire p209
G. 5. 1. 3 Evaluation de l’activité antiplasmodiale p210
Principe p210
Mode opératoire p220
Détermination de la CI50 p210
G. 5. 2 Tests de cytotoxicité réalisés sur des cellule MCF-7 p211
Principe p211
Mode opératoire p211
G. 5. 3 Tests in vivo sur souris p211
VI. Références bibliographiques p213
VII. Annexes p222
Données spectroscopiques des composés étudiées p222
Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host9 (dihydrochalcone) p238
Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host12 (chalcone) p242
Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host10 (flavanone) p246
Publication p250
1
Abréviations
(1), (2), (3) etc. :désignation des composés mentionnés dans la synthèse
bibliographique.
[α]D : pouvoir rotatoire.
ACT : Artemisinin Combination Therapy.
AcOEt : acétate d’éthyle.
APCI : ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric pressure
chemical ionization).
APG : Angiosperm Phylogeny Group.
ADN : Acide désoxyribonucléique.
ARN : Acide ribonucléique.
ASE : Automatic Sampler Extractor.
br s : singulet élargi (broad singulet).
CC : Chromatographie sur Colonne ouverte.
CCM : Chromatographie sur Couche Mince.
CNRMI : Centre National de Références pour les Maladies d’Importation.
CoA : Coenzyme A.
CDCl3 : chloroforme deutéré.
CHCl3 : chloroforme.
CH2Cl2 : dichlorométhane.
CI50 : Concentration Inhibitrice à 50%, concentration nécessaire pour avoir
50% d’inhibition de croissance du parasite.
COSY : Correlated SpectroscopY.
CQ : Chloroquine.
δC : déplacement chimique du carbone.
δH : déplacement chimique du proton.
DE50 : Dose Efficace à 50%. Si on mesure la parasitémie, il s’agit de la
concentration qui permet de diminuer la parasitémie des souris de 50%
par rapport aux souris témoins.
DHFR : Dihydrofolate reductase.
DHPS : Dihydroptéroate synthétase.
DMEM : Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium.
DMSO-d6 : diméthylsulfoxyde deutéré.
2
Dox : Doxorubicine.
DTT : Dithiothréitol.
d : doublet.
dd : doublet dédoublé.
ddd : doublet de doublet dédoublé.
EI : ionisation électronique (electronic ionization).
ESI : ionisation par électrospray (electrospray ionization).
FAB : ionisation par bombardement d’atomes rapides
(Fast atom bombardment).
H2O : eau distillée.
Host1, Host2, etc : Désignation des composés isolés.
Hex : Hexane.
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation.
HPLC : High Pressure Liquid Chromatography.
HRMS : Spectrométrie de masse haute résolution (High Resolution Mass
spectrometry).
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence.
Hz : Hertz.
IR : Infra-Rouge.
J : constante de couplage.
LC/MS :chromatographie liquide à haute performance couplée à la
spectrométrie de masse (Liquid chromatography/Mass Spectrometry).
m : multiplet.
m/z : rapport masse/charge atomique.
MDR : Multiple Drug Resistant.
MeOD : Méthanol deutéré.
MeOH : Méthanol.
MPLC : Chromatographie liquide moyenne pression (Medium Pressure Liquid
chromatography).
NOESY : Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy.
OMS : Organisation Mondiale de la Santé.
ORTEP :Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot. Il s’agit d’un programme
informatique permettant de dessiner la structure de molécules
cristallines.
3
ppm : partie par millions.
RDA : Rétro Diels-Alder.
RMN 1H : Résonance magnétique nucléaire du proton.
RMN 13C : Résonance magnétique nucléaire du carbone.
s : singulet.
SPE : Solid Phase Extraction.
TIC : Total Ion Current (Courant ionique total).
Tol : toluène.
uma : unité de masse atomique.
UMR : Unité Mixte de Recherche.
UV : Ultra-violet.
WHO : World Health Organization.
XTT : 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tetrazolium-5-
carbonilide de sodium.
4
Lexique de botanique
Actinomorphe : qualifie une corolle ayant plusieurs plans de symétrie (en étoile).
Albumen : tissu de réserve, généralement triploïde, résultant de la croissance de l’embryon
accessoire obtenu lors de la double fécondation des Angiospermes, entre un gamète mâle et
les deux noyaux centraux du sac embryonnaire.
Apex : sommet.
Carpelles : définissent les organes reproducteurs femelles formant le pistil ou gynécée.
Drupe : fruit en partie charnu possédant le plus souvent un seul noyau (ex : cerise).
Epiphyte : qualifie des espèces de végétaux qui vivent sur les troncs, les branches, les feuilles
d’un autre végétal.
Glabre : dépourvu de poils.
Monoaperturé : se dit d’un pollen présentant un seul pore (ou fente de sortie).
Nucelle : tissu de réserve, diploïde, d’origine maternelle, il est en général transitoire et
disparaît lors de la croissance de l’embryon. S’il persiste dans la graine, il est alors appelé
périsperme.
Oppositifolié : inséré du côté opposé d'où naît la feuille.
Ovaire supère : l’ovaire est insérée dans la fleur au dessus des pétales et sépales.
Pennée (nervation) : une nervure principale et des nervures secondaires régulièrement
disposées de chaque côté.
Perianthe : l’ensemble des pétales (corolle) et des sépales (calice).
5
Péricarpe : enveloppe du fruit, provenant du développement des parois du carpelle.
Périsperme : tissu de réserve, diploïde, d’origine maternelle qui est le nucelle.
Placentation : désigne la disposition des ovules à l’intérieur de l’ovaire. Une placentation
basilaire indique que les ovules sont fixés à la base des carpelles.
Pubescent : se dit d’une feuille, d’une tige qui est couverte de poils fins et courts.
Sessile : qualifie une fleur, un fruit ou une feuille sans pédoncule ou pétiole.
Stipules: petites pièces foliacées, à la base du pétiole, au niveau de son insertion sur la tige.
I. Introduction
6
Endémie parasitaire majeure, le paludisme ou malaria sévit dans les régions tropicales
et sub-tropicales de l’hémisphère sud. Plus de deux milliards de personnes sont susceptibles
de contracter la maladie à travers le monde. Actuellement, malgré l’arsenal thérapeutique
existant, peu de médicaments sont disponibles sur le marché et sont accessibles aux
populations concernées. De plus, le développement de phénomènes de résistance du parasite
aux traitements actuels renforce le besoin urgent de trouver de nouveaux antipaludiques.
Dans le monde, près de 80% de la population a recours aux plantes médicinales par
manque d’accès aux médicaments prescrits mais aussi parce que les plantes ont pu démontrer
une réelle efficacité. Deux antipaludiques actuels sont issus de plantes traditionnellement
utilisées dans leur pays d’origine contre les fièvres et le paludisme. Il s’agit de l’écorce d’un
arbre originaire des flancs de la cordillère andine (Cinchona calisaya et autres espèces de
Cinchona) et d’une herbacée originaire de Chine, Artemisia annua. Ces découvertes
encouragent la recherche de nouveaux antipaludiques au sein de la biodiversité végétale.
Le laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox,
sous le label UMR-152 IRD-UPS, concentre une partie de ses recherches sur la découverte de
substances naturelles bioactives et étudie, par leur intermédiaire, les mécanismes redox
impliqués dans l'invasion érythrocytaire de Plasmodium. La sélection des plantes est réalisée
par des chercheurs de l’IRD implantés en Amérique du Sud successivement en Bolivie, en
Guyane et au Perou. Ce Laboratoire résulte de l’association d’une unité propre de l’IRD (UR
043) et d’une unité de l’Université Paul Sabatier (EA 3030).
En 2000, l’unité de recherche (R043) « Pharmacochimie des substances naturelles » s’est
associée avec l’unité de service US 024 Biodival, le centre de recherche sur les substances
naturelles (UMR CNRS/Pierre Fabre) et le laboratoire d’immunologie cellulaire des
infections parasitaires (U511 Inserm) dans l’élaboration d’un projet de recherche intitulé
« Recherche de molécules antipaludiques : criblage à haut débit de la faune et de la flore
tropicale » pour répondre aux finalités du programme VIHPAL (devenu PAL+ en 2001)
[VIHPAL, 1999-2000].
Ce projet consistait notamment à exploiter l’extractothèque de l’IRD constituée d’extraits
marins et végétaux, ces derniers provenant essentiellement de la flore guyanaise, afin de
déterminer leur activité sur des cibles liées au paludisme. Ces extraits ont été criblés sur des
I. Introduction
7
cibles pharmacologiques à haut débit au centre de criblage pharmacologique (UMR IPBS-
CNRS/Pierre Fabre) à Toulouse, et sur culture de P. falciparum in vitro au sein de l’UR 043.
Parmi les extraits actifs testés sur une cible spécifique de P. falciparum (test d’activité sur une
protéine kinase, la Pfnek-1* [Dorin et al., 2001]), l’extrait acétate d’éthyle des feuilles de
Piper hostmannianum var. berbicense s’est avéré potentiellement actif. L’activité a été
confirmée ultérieurement à l’UMR-152 par des tests in vitro sur des souches de P. falciparum
révélant une CI50 de 8 µg/ml.
L’objectif de mon travail de thèse a consisté à rechercher par bioguidage les
substances naturelles antiplasmodiales présentes dans les feuilles d’une Piperaceae, Piper
hostmannianum var. berbicense.
� Dans un premier chapitre, nous résumerons une étude bibliographique sur les
connaissances botaniques et phytochimiques de la famille des Piperaceae et de
l’espèce étudiée. Nous développerons également l’utilisation de la spectrométrie de
masse comme outil d’analyse et d’identification de composés naturels et plus
particulièrement de flavonoïdes (chalcones, dihydrochalcones et flavanones). Une
présentation du paludisme et des remèdes actuels terminera cette synthèse
bibliographique.
� Le second chapitre sera consacré à l’étude phytochimique bioguidée de Piper
hostmannianum var. berbicense. Nous détaillerons les étapes de fractionnement et
nous décrirons l’identification des composés isolés avant de présenter les résultats des
tests biologiques obtenus in vitro et in vivo.
� Dans le troisième chapitre, nous présenterons le travail au cours d’un stage en
spectrométrie de masse réalisé à l’UCL (Université Catholique de Louvain) à
Bruxelles au sein du laboratoire d’analyse physico chimique des médicaments et
pharmacognosie dirigé par le Pr. Joëlle Quetin-Leclercq. L’étude de la fragmentation
en spectrométrie de masse des composés isolés sera présentée avant l’application de la
LC/MSn dans l’étude approfondie d’un extrait brut de Piper hostmannianum var.
berbicense.
* La Pfnek est une kinase spécifique de P. falciparum dont l’inhibition bloque le developpement du cycle cellulaire. Cette enzyme phosphoryle une Pfmap-2 qui est une MAP kinase (Microtubules Associated Protein) spécifique de P. falciparum.
II. Synthèse bibliographique
8
A. Description de la plante étudiée
A. I. Données botaniques
A. I. 1 Les Piperaceae
Position systématique des Piperaceae
La famille des Piperaceae comprend entre 1400 et 3000 espèces réparties en une dizaine de
genres dont les deux principaux représentants sont le genre Piper et le genre Peperomia
[Spichiger, 2000]. Ce sont des herbes, arbustes (Piper) ou arbres parfois grimpants ou
épiphytes, aromatiques présents dans les régions tropicales et sub-tropicales de l’hémisphère
sud et plus particulièrement en Amérique du Sud (voir Fig. 1).
Fig. 1 : Répartition mondiale des Piperaceae [Stevens, 2001].
Selon les classifications classiques pré-moléculaires [Cronquist, 1988], les Piperaceae sont
des dicotylédones appartenant à l’ordre des Pipérales, ordre qui comprend également les
Chlorantaceae et les Saururaceae (voir Tableau 1).
Classification Classique (Cronquist, 1988)
Règne PlantaeSous-règne Tracheobionta (plantes vasculaires)Embranchement Spermaphytes (plantes à graines)Sous-embranchement Angiospermae (plantes à fleurs)Classe Magnoliopsida (Dicotylédones)Sous-classe MagnoliidaeOrdre PipéralesFamille Piperaceae
Tableau 1 : Place des Piperaceae selon
la classification classique de Cronquist [1988].
II. Synthèse bibliographique
9
Parmi les classifications basées essentiellement sur des critères morphologiques et
anatomiques, celle de Cronquist est la plus utilisée.
En 1998, un groupe de chercheurs (Angiosperm Phylogeny Group, APG) élabore un nouveau
système de classification basé sur des critères phylogénétiques. Il prend en compte tous les
caractères héritables, depuis ce qui est visible (base des classifications traditionnelles)
jusqu’aux séquences d’ADN, en passant par les protéines et les données de la paléontologie.
Le séquençage de certaines parties du génome comme l’ADN des mitochondries ou l’ARN
des ribosomes a permis au cours des dernières années de faire des progrès importants
[Spichiger, 2000]. Aujourd’hui, il s’agit de la classification la plus utilisée : APG I 1998.
Ainsi, au sein des Angiospermes, les Piperaceae sont des dicotylédones à pollen uni-aperturé
présentées sous le terme de paléoherbes car elles partagent de nombreuses plésimorphies avec
les Monocotylédones (voir Tableau 2)
Classification selon APG I Classification selon APG IIDivision Angiospermes AngiospermesClasse Angiospermes monoaperturés Angiospermes monoaperturésSuper-ordre / MagnoliidesOrdre Pipérales PipéralesFamille Piperaceae Piperaceae
Tableau 2 : Place des Piperaceae selon les classifications phylogénétiques
APG I et APG II .
Cependant cette classification a été révisée en 2003 : APG II 2003 [Password, 2003]. Cela
traduit les efforts faits en systématique pour tenir compte des dernières avancées en matière
de biologie moléculaire.
Selon de nouvelles considérations phylogénétiques [Graham et Olmstead, 2000; Lee et al.,
1999] le super-ordre des Magnoliides a été créé comprenant l’ordre des Laurales, des
Magnoliades, des Pipérales et un nouvel ordre, les Canellales, regroupant deux familles, les
Canellaceae et les Winteraceae. La place des Piperaceae selon ces nouveaux critères est
présenté dans le Tableau 2.
Caractères morphologiques généraux des Piperaceae
Ce sont des plantes herbacées ou arbustes parfois épiphytes, présentant des nœuds enflés ou
articulés. Les poils tecteurs sont simples et les feuilles sont généralement entières, simples,
alternes à nervation palmée ou pennée. Elles dégagent souvent par froissement une odeur
II. Synthèse bibliographique
10
forte et piquante. Les stipules sont absentes ou soudées au pétiole (parfois engainées dans le
pétiole). Les inflorescences indéterminées sont des épis épais densément couverts de petites
fleurs, terminales ou axillaires, souvent déplacées en position oppositifoliée suite au
développement du rameau axillaire. Les fleurs actinomorphes, hermaphrodites ou unisexuées
(plantes monoïques ou dioïques) sont minuscules, chacune à l’aisselle d’une bractée peltée
largement triangulaire. Le périanthe est absent. Les étamines entre une et dix, souvent six, à
filet généralement libre. Les grains de pollen sont monosulqués ou monoaperturés. Les
carpelles, entre une et quatre, sont soudées. L’ovaire supère est à placentation basilaire. Les
stigmates entre un et quatre sont capités, lobés ou plumeux. Il y a un ovule par ovaire. Les
fruits sont habituellement des drupes, l’albumen est peu développé et complété par un
périsperme. Les faisceaux conducteurs des tiges sont disposés en plusieurs anneaux
concentriques ou dispersés dans un parenchyme comprenant des cellules sécrétrices à huile
essentielle [Campbell et al., 2001].
Quelques Piperaceae célèbres
Au sein de la famille des Piperaceae, les plantes du genre Piper sont les plus célèbres et les
plus utilisées. Plusieurs d’entre elles possèdent un intérêt alimentaire, médicinal et certaines
sont devenues indispensables à l’homme.
- La plus connue est le poivrier commun ou Piper nigrum L. (Fig. 2). C’est l’une des épices
les plus anciennement connues. Il est originaire du sud-ouest de l’Inde (côte de Malabar) et
cultivé maintenant en Inde (Kerala), en Malaisie, au Sri Lanka mais aussi en Amérique du
Sud (Brésil). Le fruit est une drupe de 4-8 mm de diamètre, passant du vert au rouge au cours
de la maturation. Le poivre doit son odeur à la présence de 10 à 35 ml/kg d’huile essentielle
riche en carbures terpéniques et sa saveur brulante à des amides (5-10%) [Bruneton, 1999].
- Nous pouvons aussi citer le betle ou Piper betle L. dont les feuilles sont utilisées comme
stimulant, antiseptique et pour rafraîchir l'haleine. Elles sont également utilisées en infusion
pour traiter l'indigestion, comme onguent ou en inhalation contre les maux de tête, comme
traitement contre la constipation, comme décongestionnant et aide à la lactation. Dans la
médecine ayurvédique, elles sont employées comme aphrodisiaque. En Malaisie, elles sont
utilisées pour traiter les maux de tête, l'arthrite et les rhumatismes.
En Inde, les feuilles sont mâchées avec de la chaux (oxyde de calcium) et de la noix d'arec
dans une préparation qui prend le nom de bétel. La chaux agit comme alcalin, l'arec libère
II. Synthèse bibliographique
11
alors l'alcaloïde, arécoline, qui favorise la salivation, la salive devenant teintée de rouge. On
ajoute parfois du tabac à la préparation [Duke, 2002; Duriyaprapan, 2003].
- Le kava ou Piper methysticum Forst. est une Piperaceae originaire du Pacifique occidental.
Il ne pousse que dans les îles du Vanuatu et quelques îles avoisinantes. Il est largement utilisé
en médecine traditionnelle pour ses propriétés anesthésiantes. En Occident, le kava est utilisé
en infusion pour lutter contre les symptômes du stress, de l'anxiété et de la dépression [Duke,
2002].
Fig. 2: Piper nigrum (http://mobot.mobot.org/cgi-bin/search_vast).
A. I. 2 Piper hostmannianum var. berbicense
Le genre Piper
Le genre Piper comprend plus de 1000 espèces réparties dans les régions tropicales et sub-
tropicales (Fig. 3). Ce sont des arbres ou arbustes, rarement des lianes, fréquemment
rencontrés dans les forêts humides des régions de l’hémisphère sud [Jaramillo et Manos,
1988].
Fig. 3: Distribution géographique des espèces du genre Piper [Jaramillo et Manos, 1988].
II. Synthèse bibliographique
12
Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC
Piper hostmannianum var. berbicense est une plante originaire d’Amérique du Sud et plus
particulièrement de Bolivie, Colombie, Brésil, Equateur, mais surtout du Venezuela et en
Guyane (www.mobot.org). Il possède un autre synonyme : Arthante berbicensis (Miq) C.DC
(International plant names index : www.ipni.org).
Quatre variétés de cette espèce sont signalées (www.mobot.org). Ainsi, nous distinguons :
- Piper hostmannianum var. hostmannianum.
- Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC, 1869 (Fig. 4).
- Piper hostmannianum var. glabrirameum Trel. & Yunck, 1950.
- Piper hostmannianum var. ramiflorum C.DC, 1869.
En Guyane, les deux premières variétés sont présentes.
(a) (b)
Fig. 4 : (a) P. hostmannianum var. berbicense, photo prise en Guyane.
(b) Récolte de P. hostmannianum var. berbicense dans la forêt guyanaise.
Description morphologique des deux variétés de Piper hostmannianum guyanaises
Piper hostmannianum (Miq.) C.DC (1869)
Arbuste rameux de 3 m de haut, ou liane rampante. Tiges pubescentes. Feuilles sans glandes,
pétioles de 5 - 10 mm de long. Feuilles elliptiques ou ovales 13-22×6×10 cm. Présence de
poils le long des nervures, surtout sur la face inférieure de la feuille. Base des feuilles oblique,
avec un coté légèrement plus long que l’autre de 3-5 mm, obtus ou aigu, apex acuminé.
Nervation pennée, les nervures secondaires arrangées en 3-4 paires à partir de la nervure
II. Synthèse bibliographique
13
centrale, partant de la nervure centrale à angle ouvert, ensuite se recourbant brutalement pour
s’orienter presque parallèlement à la marge.
Epis dressés, 10-12 cm de long, de blanc verdâtre à jaune. Pédoncules de 10 mm de long,
pileux, les bractées florales sont très découpées. Les fleurs présentent des stigmates sessiles.
Les fruits (baies) oblongs ou en forme de trigone ont un apex glabre ou pubérulent. Floraison
mai, août septembre, octobre. Fructification entre mai et septembre. Commun en zone lisière
de forêt, en zones non inondées [Candolle, 1869; Mori et al., 2002].
Piper hostmannianum var. berbicense (Miq.) C. DC
Cette variété présente les mêmes caractéristiques morphologiques que la variété précédente
mais le jeune bourgeon foliaire terminal présente une pubescence plus dense que P.
hostmaniannum. De plus, on peut distinguer la présence de poils hirsutes de taille supérieure à
1 mm. Sommet des fruits (baies) velues [Candolle, 1869; Mori et al., 2002].
La distinction de ces deux variétés sur le terrain a été permise grâce aux descriptions
précédentes.
Utilisation en médecine traditionnelle
En Guyane, la décoction des feuilles est utilisée comme anti-venin. Les feuilles peuvent être
directement appliquées sur les morsures de serpents [Van Andel, 2000].
Description anatomique de Piper hostmannianum var. berbicense
Feuille : la section transversale de la feuille de Piper hosmannianum var. berbicense (Fig. 5)
présente une nervure médiane légèrement incurvée à la face supérieure et fortement bombée à
la face inférieure, plus ou moins marquée de côtes.
Nervure médiane : Colorée par le réactif carmino-vert aluné , la section transversale présente
de la face supérieure à la face inférieure :
- L’ épiderme supérieur,
- Le parenchyme palissadique (une seule assise cellulaire),
- Le parenchyme lacuneux de part et d’autre du système conducteur constitué de
cellules arrondies dont certaines isolées sont sclérifiées et des cellules à huile
essentielle (40 µm de diamètre).
II. Synthèse bibliographique
14
- Le système conducteur formé de faisceaux libéro-ligneux est disposé en arc (liber
déchiré lors de la dessication).
- Des amas de collenchyme prés de l’épiderme inférieur font face à chaque faisceau
libéro-ligneux. Ils sont délimités par une assise de cellules lignifiées.
Epiderme inférieur
Parenchyme palissadique
Cellule sclérifiée Cellules
à huile essentielle
Vaisseau de bois
Espace correspondant au liber
Epiderme supérieur
Poil tecteur
Collenchyme
Cellules fibreuses
Epiderme inférieur
Parenchyme palissadique
Cellule sclérifiée Cellules
à huile essentielle
Vaisseau de bois
Espace correspondant au liber
Epiderme supérieur
Poil tecteur
Collenchyme
Cellules fibreuses
Fig. 5 : Section transversale de la feuille
(grossissement × 40 et pour les agrandissements ×400)
- L’épiderme inférieur (Fig. 6) présente des poils tecteurs et des poils sécréteurs. La
cuticule s’interrompt au niveau des stomates. Au niveau des poils tecteurs, il y a
interruption de la cuticule ce qui n’est pas le cas pour les poils sécréteurs.
Cuticule
Epiderme inférieur
Chambre sous-stomatiquePoil sécréteur
(Face inférieure)
Poil tecteur
(Face inférieure)Cuticule
Epiderme inférieur
Chambre sous-stomatiquePoil sécréteur
(Face inférieure)
Poil tecteur
(Face inférieure)
Fig. 6 : Face inférieure, section transversale de la feuille
(grossissement × 400)
II. Synthèse bibliographique
15
En passant en lumière polarisée, nous pouvons voir des cristaux en forme d’aiguilles (Fig. 7)
d’oxalate de calcium [Souza L.A., 2004] dans les cellules du parenchyme à proximité des
faisceaux libéro-ligneux.
A BA B
Fig. 7: Cristaux en aiguilles d’oxalate de calcium. A : en lumière normale, B : en lumière
polarisée (grossissement × 400)
Limbe : (Fig. 8) de la face supérieure à la face inférieure se distinguent :
- L’ épiderme supérieur constitué de cellules allongées,
- L’ hypoderme supérieur constitué d’une assise de cellules allongées à parois
cellulosiques,
- Le mésophylle hétérogène asymétrique constitué de parenchyme palissadique et de
parenchyme lacuneux . Il renferme des cellules à huiles essentielle,
- L’ hypoderme inférieur constitué d’une à deux assises de cellules allongées à parois
cellulosiques,
- L’ épiderme inférieur possédant des poils tecteurs.
Epiderme inférieur
Hypoderme
Hypoderme
Epiderme supérieur
Parenchyme palissadiqueParenchyme lacuneux
Cellule à huile essentielle
Poil tecteur
Vaisseaux-nervations secondaires
Fig. 8: Section transversale de la feuille : le limbe.
(grossissement × 40 et pour les agrandissements ×400)
II. Synthèse bibliographique
16
A. II. Données phytochimiques
A. II. 1 Données phytochimiques sur le genre Piper
Généralités L’étude phytochimique des plantes du genre Piper a largement été étudié ces dernières années
faisant l’objet de revues générales [Parmer et al., 1997, 1998; Sengupta et Ray, 1987].
L’ensemble des composés isolés et identifiés est très hétérogène. Ainsi, Les constituants les
plus rencontrés sont des alcaloïdes, des flavonoïdes, des kawapyrones, des stéroïdes et des
lignanes dont nous allons donner quelques exemples de structures (Fig. 9).
Les alcaloïdes
Ce sont des alcaloïdes de type amides. Ces composés sont les plus rencontrés dans le genre
Piper. Parmi les amides, nous pouvons distinguer des isobutylamides et des amides de type
pyrrolidine ou pipéridine. Le plus connu est la pipérine (1) (Fig. 9) isolée des feuilles de Piper
nigrum reconnue pour ces propriétés antipyrétique et antiinflammatoire [Lee et al., 1984;
Tunmann, 1918].
Les flavonoïdes
Les flavonoïdes rencontrés sont essentiellement des chalcones, des dihydrochalcones, des
flavanones et quelques flavones. Les chalcones et dihydrochalcones isolées ont généralement
le cycle B non substitué sauf dans le cas de l’asébogénine 2 et des flavokawaïnes A (3) et C
(4) (Fig. 9) respectivement identifiées dans les feuilles de Piper aduncum [Orjala et al., 1994]
et Piper methysticum [Som, 1983].
Les kawapyrones
Ce sont des δ-lactones possédant un substituant styryle ou dihydrostyryle. La majorité des
composés a été isolé dans P. methysticum dont le plus connu est la methysticine (5) (Fig. 9).
Ces composés sont des antagonistes de la strychnine [Kretzschmar et al., 1970].
Les stéroïdes
Les stéroïdes isolés sont relativement peu nombreux. Nous distinguons essentiellement des
stérols (sitostérol, stigmastérol, daucostérol) et des acides ursoliques.
II. Synthèse bibliographique
17
Les lignanes
Ce sont des composés dont le squelette résulte de l’établissement d’une liaison entre les
carbones β des chaînes latérales de deux unités dérivées du 1-phénylpropane. La sésamine (7)
a été le premier lignane isolé du genre Piper. Quelques néolignanes (ce sont également les
produits de condensation d’unités phénylpropaniques mais la liaison variable n’implique au
maximun qu’un seul carbone β) ont également été identifiés dont la kadsurénone (6) (Fig. 9)
isolée de Piper futokadsura.
O
O
N
O
1
OOH
OHO OH
2
OO
OHO R2
R1
3 R1=H; R2=OCH34 R1=H; R2=OH
O
O
O
O
O
5
O O
OO
O
6
Fig. 9 : Quelques molécules isolées du genre Piper.
Les plantes du genre Piper et plus généralement les Piperaceae sont des plantes à huile
essentielle. L’huile essentielle est généralement stockée dans les feuilles (présence de poils
sécréteurs et de cellules sécrétrices) ou dans le péricarpe des fruits ou des graines [Bruneton,
1999]. Elles sont riches en terpènes et plus particulièrement en sesquiterpenes (hydrocarbonés
ou oxygénés) [Dos Santos et al., 2001; Mundina et al., 1998; Vila et al., 2001]. La Fig. 10
présente quelques structures de sesquiterpènes rencontrés dans les huiles essentielles de
plantes du genre Piper.
O
O
O
OHH
7
II. Synthèse bibliographique
18
Fig. 10 : Exemple de sesquiterpènes présents dans les huiles essentielles du genre Piper.
Molécules antipaludiques isolées dans le genre Piper
Quatre espèces de Piper ont été étudiées pour leurs propriétés antipaludiques. Il s’agit de :
- P. hispidum Sw.
- P. sarmentosum Roxb.
- P. chaba Hunter.
- P. polysyphonum C.DC .
Jenett-Siems et al. [1999] ont étudié l’activité antipaludique de quatorze plantes d’Amérique
du Sud utilisées en médecine traditionnelle. Les extraits lipophiles de cinq d’entre elles dont
P. hispidum s’avèrent être actifs suite à des tests in vitro sur deux souches de P. falciparum
(PoW : souche chloroquino-sensible et Dd2 : souche chloroquino-résistance). Le
fractionnement bioguidé de l’extrait lipophile des feuilles de P. hispidum a conduit à
l’identification de trois composés (Fig. 11).
O
O
O
O
OOH
OHO
OH
OOH
OHHO
DillapiolInactif
AsebogénineCI50= 16.9 µg/ml sur PoWCI50= 10.4 µg/ml sur Dd2
2', 4', 6'-trihydroxydihydrochalconeInactif
Fig. 11 : Molécules isolées des feuilles de P. hispidum.
II. Synthèse bibliographique
19
Le fractionnement bioguidé des extraits hexanique et méthanolique des feuilles de P.
sarmentosum a permis l’identification de deux alcaloïdes de type amides (Fig. 12) avec des
activités respectives de CI50= 18.9 µg/ml et 6.5 µg/ml sur la souche chloroquino-résistante K1
de P. falciparum.
N
O
N
O
O
O
NO NO
Fig. 12
Rukachaisirikul et al. [2002] ont isolé des racines de Piper chaba Hunter un alcaloïde de type
amide présentant une structure dimérique (Fig. 13) avec une CI50 de 2.7 µg/ml sur la souche
chloroquino-résistante K1 de P. falciparum.
O N
O
O
N
O
O
O
Fig. 13
Un néolignane, la polysiphorine (Fig. 14) déjà isolée de P. polysiphonum [Ma et al., 1991], a
été identifiée dans les feuilles de Rhapidophora decursiva (Araceae) [Zhang et al., 2001] suite
à un fractionnement antiplasmodial bioguidé. Elle présente une CI50 de 4.04 µg/ml et de 3.68
µg/ml respectivement sur les souches D6 (souche chloroquino-sensible) et W2 (souche
chloroquino-résistante) de P. falciparum.
O
O
O
O
O
O
H
Fig. 14
II. Synthèse bibliographique
20
A. II. 2 Données phytochimiques sur Piper hostmannianum var. berbicense
Bien que cette variété n’a fait l’objet d’aucune publication à ce jour, nous vous présenterons
ici les travaux phytochimiques réalisés sur P. hostmannianum C. DC.
� Etude de la composition de l’écorce
La composition de l’écorce a été étudié par Diaz et al. [1987] et a fait l’objet d’une
publication. En plus du linalol et du sitostérol, deux chromènes ((8) et (9), Fig. 27), deux
esters benzoïques ((10) et (11), Fig. 15) et trois flavanones ((12), (13) et (14), Fig. 15) ont été
isolés et identifiés de l’extrait hexanique.
O
O
O
O
O
O
8 9
O
O
R1O
OR2
10 R1=R2=H11 R1=R2=Ac
O
OOR1
R2
R3O
R4
12 R1=H R2=Me R3=Me R4=Me13 R1=Ac R2=Me R3=Me R4=Me14 R1=H R2=Me R3=H R4=H
Fig. 15 : Composés isolées de l’écorce de P. hostmannianum C.DC.
Les molécules nouvelles sont le chromène (8) et l’ester benzoïque (10). C’est la première fois
que des flavanones C-méthylées ((12) et (13) Fig. 15) sont isolées dans le genre Piper.
� Etude de la composition des feuilles
L’étude phytochimique des feuilles a fait récemment l’objet d’une publication en 2004 [Lago
et al., 2004]. La purification de l’extrait CH2Cl2/MeOH (2/1) a permis l’identification de
quatre nouveaux dérivés d’acide benzoïque (15), (16), (17) et (18) (Fig. 16) ainsi que les
molécules (8), (10), (14) (Fig . 15) préalablement identifiées dans les racines [Diaz et al.,
1987].
II. Synthèse bibliographique
21
O
OH
RO
O
O
O
=R
=R
=R
15
16
17
O O
OH
OH
OH
18
Fig. 16
Les auteurs ont également étudié l’activité anti-fongique des molécules isolées sur
Cladosporium cladosporioides et C. sphaerospermum. La quantité totale nécessaire pour
inhiber à 100% la croissance de ces champignons est de 5 µg et de 0.5 µg sur CCM pour le
chromène (8) et l’ester benzoïque (18), les autres molécules étant inactives.
Après cette première partie consacrée à la description de la plante étudiée en terme de
caractères botaniques et phytochimiques, la seconde partie traite des flavonoïdes (et plus
particulièrement des chalcones, dihydrochalcones et flavanones) et des critères
d’identification établis pour les identifier en spectrométrie de masse.
II. Synthèse bibliographique
22
B. Flavonoïdes et spectrométrie de masse
B. I Généralités
B. I. 1 Définition, classification et biosynthèse des flavonoïdes
Définition
Le terme « flavonoïde » désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la
famille des polyphénols. Ils sont considérés comme les pigments quasiment universels des
végétaux. Tous les flavonoïdes (plus de 4000) possèdent le même élément structural de base,
à savoir l’enchaînement 2-phénylchromane (Fig. 17) [Bruneton, 1999].
O
A
B
C
Fig. 17 : 2-phénylchromane.
C’est chez les Angiospermes que la diversité structurale des flavonoïdes est maximale. Ils
sont de façon très générale localisés dans les feuilles (dans l’épiderme ou entre l’épiderme et
le mésophylle), dans les fleurs (cellules épidermiques) ou encore dans les fruits (tégument
externe) [Bruneton, 1999].
Classification
Ils peuvent être regroupés en une douzaine de classes selon le degré d’oxydation du noyau
pyranique central, lequel peut-être ouvert et recyclisé en un motif furanique
(dihydrofuranone). La Fig. 18 illustre les principales classes de flavonoïdes.
II. Synthèse bibliographique
23
O
O
O
O
OH
O
O
O
O
OH
O
OH
OH
O
O
OH
Flavones Flavonols
FlavanonesDihydroflavonols Flavan-3,4-diols
Chalcones Aurones Anthocyanidols
O
O
OH
Flavan-3-ols
1
2
3
45
6
7
81'
2'
3'
4'
5'
6'
12
3
4
56
1'
2'
3'
4'
5'
6'
α
β
O
Fig. 18 : Les principales classes de flavonoides [Bruneton, 1999].
De façon générale, les flavonoïdes peuvent être hydroxylés en position 3, 5, 7, 3’, 4’, 5’et/ou
6’ (suivant la numérotation présentée pour les flavones, Fig. 18). Un ou plusieurs de ces
groupes hydroxyles sont fréquemment méthylés, acétylés, prénylés ou sulfatés. Dans les
plantes, les flavonoïdes peuvent être présents sous forme C-ou O-glycosylés. Les formes
libres, sans sucres attachés sont appelés les génines ou aglycones [Bruneton, 1999].
Les « flavonoïdes minoritaires » sont représentés par les chalcones , les dihydrochalcones, les
aurones, les flavanones, les dihydroflavonols et les anthocyanidols (structures encadrées dans
la Fig. 18) [Harborne, 1993].
Biosynthèse des flavonoïdes (Fig. 19)
L’étape clé de la formation des flavonoïdes est la condensation de trois molécules de malonyl-
CoA avec un ester du coenzyme A et d’un acide hydroxycinnamique, en règle générale le 4-
coumaroyl-CoA, pour obtenir la 4, 2, 4’, 6’-tetrahydroxychalcone (réaction catalysée par la
chalcone synthase). Dans les conditions physiologiques normales, cette chalcone tend à
s’isomériser en flavanone sous l’action de la chalcone isomérase qui induit une fermeture
stéréospécifique du cycle conduisant à la seule (2S)-flavanone. Cette chalcone peut également
se cycliser en aurone. Il est le précurseur de toutes les classes de flavonoides comme le
montre la Fig. 21 [Bruneton, 1999].
II. Synthèse bibliographique
24
HO
O
OCoAS
3
+
OH
O
CoAS
malonylCoA 4-coumaroylCoA
OOH
HO OH
OH
Chalcone
CS
OOH
HO
OH
Aurones
CI
O
O
OH
OH
HO
Flavanones
O
O
OH
OH
HO
Flavones
F3H
O
O
OH
OH
HO
3-OH-FlavanonesOH
R
R
O
OOH
HO
Isoflavones
OH
R
R
IFS
O
OH
OH
OH
HO
Flavan-3,4-diolsOH
R
R
DFR
O
O
OH
OH
HO
FlavonolsOH
R
R
O
OH
OH
HO
OH
R
R
3-OH-Anthocyanidines
Flavan-4-ols
3-déoxycyanidines
O
OG
OG
HO
OH
R'''
R'''
Anthocyanines
Flavan-3-ols
polymérisation
Proanthocyanines
(tannins condensés)
Fig. 19 : Biosynthèse des flavonoïdes.
CS : chalcone synthase ;CI : chalcone isomérase ; F3H : Flavanone 3-hydroxylase ; IFS :
isoflavone synthase ; DRF : dihydroflavonol reductase ; FS : flavonol synthase ; AS :
anthocyanin synthase. R=-H, -OH ou -OCH3 et OG= -O-sucre [Shirley, 1996].
II. Synthèse bibliographique
25
Remarque : cas particulier des flavonoides C-méthylés
D’après Vederas et al. [Vederas et Leeper, 2000], la biosynthèse des chalcones C-méthylés
s’expliquerait par la présence d’ une méthylchalcone synthase qui catalyserait la réaction de
condensation entre un méthymalonylCoA et le 4-coumaroyl-CoA pour donner la chalcone
méthylée correspondante qui par suite des réactions présentées Fig. 19 conduirait aux autres
flavonoides C-méthylés. L’existence d’une telle enzyme constitue un des thèmes de recherche
de Schröder et al. [1998]. Néanmoins en septembre 2007, ce groupe de chercheurs n’a pas
encore isolé cette enzyme.
B. I. 2 Les chalcones et les dihydrochalcones
Définition
Les chalcones et par défaut les dihydrochalcones sont uniques au sein de la famille des
flavonoïdes. Dépourvus du cycle C central, les deux cycles A et B sont reliés par une chaîne
tricarbonée cétonique α, β insaturée (saturée dans le cas des dihydrochalcones). Les cycles A
et B sont équivalents aux cycles A et B des autres flavonoïdes mais leurs numérotations sont
inversées (Fig. 20).
O
1'
2'
3'
4'
5'
12
3
4
5
6
α
β
6'
A B
O
O
6'5'
1'2'
3'
4'
2
3
45
6
78
9
10
A
B
C
Fig. 20 : Numérotation du squelette chalcone (a) et flavanone (b).
La présence d’une double liaison conjuguée confère aux chalcones une couleur jaune. En
conséquence, les dihydrochalcones sont généralement incolores. La configuration de la
double liaison est généralement E dans les chalcones naturelles [Harborne, 1993]. Ces
composés sont rarement substitués sur le cycle B.
De manière équivalente aux autres flavonoïdes, les positions 2’, 4’ et 6’ du cycle A peuvent
être hydroxylées ou méthoxylées. Des dérivés glycosylés existent mais essentiellement O-
glycosylés (une seul chalcone C-glycosylée : 3’-glucosylisoliquiritigénine isolée de Cladrastis
platycarpa (Fabaceae) [Ohashi H., 1977]). Il existe de nombreux composés C-alkylés avec
(a) (b)
II. Synthèse bibliographique
26
des substituants méthyles, prényles ou géranyles (Fig. 21) [Harborne, 1993]. Les flavonoïdes
C-alkylés sont présents au niveau de la cuticule foliaire et cela concerne surtout les plantes
des régions arides ou semi-arides, souvent pourvues de structures sécrétrices comme les
Piperaceae [Bruneton, 1999].
OOH
O O
O
HO
O
OHOH
O
OH
HOHO
OH
O
O
O
OHOH
O
OH
HOHO
OH
OOH
OHO
OH
Fig. 21 : Exemples de structures de chalcones et dihydrochalcones
glycosylées ou alkylées .
Activités biologiques des chalcones et dihydrochalcones
Les chalcones et les dihydrochalcones ont été étudiées pour leurs propriétés anticancéreuses
[Anto et al., 1995; Go et al., 2005], antiinflammatoires [Go et al., 2005; Nowakowska, 2006],
antioxydantes [Anto et al., 1995], antimicrobiennes [Nowakowska, 2006] et antiparasitaires
[Nowakowska, 2006].
Parmi les chalcones naturelles antipaludiques, la licochalcone A est la plus célèbre. Isolée de
la réglisse (Glycyrrhiza glabra), elle est particulièrement active in vitro avec une CI50 de 0.5
µg/ml sur les deux souches chloroquino-sensible (3D7) et résistante (Dd2) de P. falciparum
[Chen et al., 1994]. De plus, une étude in vivo sur des souris infectées par P. yoeii montre que
100% d’inhibition de parasitémie est obtenue après 3 à 6 jours de traitement [Kharazmi,
1997]. En ce qui concerne les dihydrochalcones, la plus connue est la Phloridzine (Fig. 22)
qui est une dihydrochalcone glycosylée isolée de Micromelum tephrocarpum (Rutaceae),
utilisée en médecine traditionnelle dans le traitement du paludisme. D’après Kutner et al.
[1987] qui se sont intétéssés à son mode d’action, le composé agirait au niveau de la
membrane cytoplasmique des globules rouges [Kutner et al., 1987].
II. Synthèse bibliographique
27
Fig. 22 : La licochalcone A et la phloridzine.
B. I. 3 Les flavanones
Définition
Ces molécules sont caractérisées par l’absence de double liaison en 2, 3 et par la présence
d’un centre d’asymétrie en 2. Chez les flavanones naturelles, le carbone 2 est normalement de
configuration S. Elles existent sous forme libre ou sous formes glycosylées. Sous forme libre,
les carbones en position 5 et 7 sur le cycle A peuvent être hydroxylées ou méthoxylées. Le
cycle B peut aussi être substitué en position 3’, 4’, 5’ et 6’. Les dérivés C-alkylés sont
relativement courants, surtout les dérivés C-prénylés ou C-géranylés (Fig. 23). Les dérivés C-
méthylés sont fréquemment rencontrés chez les Myrtaceae [Wollenweber et al., 2000]. Ce
type de composé a déjà été isolé des racines de P. hostmannianum [Diaz et al., 1987] (Fig.
15).
O
O
HO
OH4 R=OH 5 R=OCH3
R
OH
O
OOH
O
Fig. 23 : Exemples de flavanones C-alkylées.
Activités biologiques des flavanones
Les flavanones étant plus répandues dans le règne végétal que les chalcones et
dihydrochalcones, leurs activités biologiques ont particulièrement été étudiées. Ainsi on leur
attribue des propriétés antioxydantes [Stevens et al., 2003], antimicrobiennes, anticancéreuses
[Kofujita et al., 2004] et antipaludiques avec un intérêt particulier pour les dérivés C-alkylés.
II. Synthèse bibliographique
28
Parmi les flavanones naturelles antiplasmodiales les plus actives, Kim et al. [2004] ont isolé
des flavanones prénylées relativement actives des feuilles d’Artemisia indica avec des CI50
comprises entre 4 et 7 µM sur la souche K1 chloroquino-résistante de P. falciparum (Fig. 24).
O
O
OH
HO
OR1
R2O
1 : R1=R2=CH32 : R1=R2=H3: R1=H, R2= CH34: R1=CH3, R2=H
O
O
RO
OH
HO
5 : R=CH36 : R=H
OH
Fig. 24 : Flavanones prénylées isolées des feuilles d’Artemisia indica.
II. Synthèse bibliographique
29
B. II Application de la spectrométrie de masse à l’étude de la fragmentation
des flavonoïdes minoritaires
La spectrométrie de masse reste la technique privilégiée pour la détermination de la masse des
molécules. Différentes techniques d’ionisation existent dont les plus récentes sont les
techniques d’ionisation douces que sont l’électrospray (ESI : electrospray ionization) et
l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI : atmospheric pressure chemical
ionization). Les flavonoïdes ont été largement étudiés en spectrométrie de masse en particulier
les dérivés glycosylés [Hvattum et Ekeberg, 2003; Stobiecki, 2000]. Ces études ont permis
d’établir des schémas de fragmentation de ces composés dans le but de pouvoir les identifier
dans un extrait brut sans avoir à les isoler [Lee et al., 2005; Ye et al., 2005; Zhou et al., 2006].
Ainsi, l’introduction de la LC/MSn dans l’analyse des extraits de plante représente une étape
importante dans l’identification des produits naturels [Justesen et al., 1998; Lee et al., 2005;
Wolfender et al., 2000]. C’est la technique de choix pour caractériser rapidement sans
séparation chimique les éléments d’un mélange de composés naturels pour savoir s’ils sont
connus ou non.
Cette partie sera consacrée à la synthèse bibliographique des principales études en
spectrométrie de masse des chalcones, dihydrochalcones et flavanones en EI (ionisation
électronique), ESI et APCI. Cette synthèse nous permettra de comprendre précisément les
fragmentations de ces composés dans le but d’étudier et d’identifier par LC/MSn des
molécules de même génine dans l’extrait acétate d’éthyle de P. hostmannianum var.
berbicense (ce travail vous sera présenté dans la partie résultats de ce manuscrit).
B. II. 1 Travaux réalisés en ionisation électronique (EI)
Le premier spectre de masse de chalcones a été enregistré par Beynon en 1960 [Beynon,
1960]. En 1966, Audier [1966] montre pour la première fois que les 2’-hydroxychalcones
présentent une fragmentation spécifique dont le spectre de masse est identique à celui des
flavanones isomères. Cette isomérisation entre la forme 2’-hydroxychalcone et flavanone
(Fig. 25) a lieu dans la chambre d’ionisation du spectromètre sous l’effet de la température
II. Synthèse bibliographique
30
[Itagaki et al., 1966; Van De Sande et al., 1972]. Cet équilibre existe aussi en solution en
milieu acide ou basique [Arcus et al., 1992; Old et Main, 1982].
O
OH
O
O
H
O
O
2'-hydroxychalcone flavanone
H
H
Fig. 25: Mécanisme possible d’isomérisation entre
2’hydroxychalcone ↔ flavanone dans la source d’ionisation du spectromètre
[Van De Sande et al., 1972].
Van De Sande et al. [1972] ont comparé pour la première fois la fragmentation des chalcones
et des flavanones. Dans le cas de la génine chalcone, les ions fragments majoritaires sont les
ions m/z 130, m/z 104 et m/z 78 qui proviennent respectivement du clivage entre le cycle A et
la fonction carbonyle, la fonction carbonyle et le carbone α, et entre le carbone β et le cycle B
comme illustré sur la Fig. 26. Ainsi, différents fragments sont obtenus suivant s’il y a perte du
cycle A ou du cycle B (remarque : un fragment de type A correspond à « la perte » du cycle
B).
Pour l’ion m/z 130, Van De Sande et al. [1972] ont ainsi proposé une structure cyclique (Fig.
26) provenant d’un réarrangement avec un proton en position ortho sur le cycle A, les auteurs
parlent d’« ortho effect ».
II. Synthèse bibliographique
31
O
A
B
α
βH
O
A
m/z 130
B
m/z 104
A
m/z 78
Fig. 26 : Schéma de fragmentation du squelette chalcone par EI proposé par
Van de Sande et al. [1972].
En présence de substituants sur les cycles (Fig. 27), des ions fragments additionnels sont
obtenus, par exemple dans le cas d’une substitution par un groupement méthyle ou un
groupement méthoxyle :
O
A
B
α
βCH2
H
C
O
m/z 118
- CO C7H6
m/z 90
2'-methylchalcone
O
A
B
α
βO O
C
O
m/z 130
- CO
m/z 92
2'-methoxychalcone
C
O
- CO
C5H4
m/z 118
- C2H2 C9H8 C7H7
+
m/z 92 m/z 91
m/z 64
Fig. 27 : Schémas de fragmentation pour les 2’-méthylchalcone et les 2’-méthoxychalcone
proposés par EI par Van de Sande et al. [1972].
II. Synthèse bibliographique
32
La Fig. 28 représente les fragmentations caractéristiques du squelette flavanone. La 2’-
hydroxychalcone correspondante (représentée Fig. 25) présente les mêmes ions fragments.
O
O
A
B
O
O
A
m/z 145
O
C
O
m/z 130
- CO
m/z 92
C
O
- CO
C5H4m/z 64
B
m/z 104
m/z 78
C4H4 +
m/z 52
-C2H2
-C2H2
Fig. 28 : Schéma de fragmentation du squelette flavanone par EI proposé par
Van de Sande et al. [1972].
Les schémas de fragmentation des chalcones établis jusqu’à présent ont tendance à se
contredire en ce qui concerne la structure des ions fragments. Ainsi, Ardanaz et al. [1991]
s’intéressent plus particulièrement à l’ion m/z 130 (issu du squelette chalcone) dont deux
structures ont été proposées jusqu’à présent. Une structure cyclique proposée par Van de
Sande et al. [1972] et une structure linéaire proposée par Rouvier [1976] (Fig. 29).
O
A
B
O
AO+
B
m/z 130 m/z 130
Fig. 29 : Deux mécanismes de formation de l’ion m/z 130.
II. Synthèse bibliographique
33
En utilisant des dérivés deutérés et des chalcones substituées par des méthyles et des
halogènes, ils montrent que les deux hypothèses sont fausses et ils établissent alors la
structure de l’ion fragment m/z 130 présenté Fig. 30. L’ion ainsi formé provient de la perte du
radical phényl B et d’un radical Hβ•.
O
A
B
O
A
+
m/z 130
Fig. 30 : Structure de l’ion m/z 130 proposé par Ardanaz et al. [1991].
Jusqu’à présent les différents auteurs considèrent que l’identité virtuelle des spectres de masse
des 2’-hydroxychalcones et des flavanones isomères serait due à l’existence d’une espèce
intermédiaire instable de structure incertaine (voir Fig. 31). Ainsi, Guidugli et al. [1992]
étudient plus particulièrement la structure de l’ion moléculaire [M-H]+.Dans ce but, ils
s’intéressent aux ions minoritaires m/z 181 et m/z 152 obtenus pour le squelette flavanone et le
squelette 2’-hydroxychalcone et ils établissent des schémas de fragmentation basés sur des
expériences de marquage au deutérium (Fig. 31).
O
O
A
B
-HO+
O
-C2H2OO+
m/z 181
m/z 152
m/z 223m/z 224
Fig. 31 : Schéma de fragmentation proposé par Guidigli et al. [ 1992] pour l’obtention des
ions fragments m/z 181 et m/z 152 par EI.
II. Synthèse bibliographique
34
Ardanaz et al. [1998] s’associent par la suite et étudient attentivement la fragmentation de la
génine chalcone en utilisant les techniques de MS2 et de marquage au deutérium et au carbone
13 en se focalisant sur la formation et la structure des ions m/z 192 et m/z 193 [Ardanaz et al.,
1998] provenant d’une perte respective de 15 uma (perte du radical CH3•) et de 16 uma (perte
de méthane) par rapport à l’ion moléculaire du squelette chalcone. Pour expliquer ces pertes
inattendues, il proposent les schémas de fragmentation suivant (Fig. 32 et 33).
O
A
B
O Om/z 208 m/z 208
Fig. 32 : Réaction de contraction de cycle de l’ion moléculaire du squelette chalcone par EI
selon Ardanaz et al. [1998].
Ainsi, il proposent un réarrangement de l’ion moléculaire suivant une réaction de contraction
de cycle pour aboutir à un ion moléculaire de structure tricyclique (m/z 208) avec un méthyle
en position α de la fonction carbonyle. A partir de cette structure, ils déduisent aisément la
formation de l’ion fragment m/z 193 en affirmant que celui-ci proviendrait de la perte d’un
radical méthyle (Fig. 33).
Dans le cas de la formation de l’ion m/z 192, le schéma de fragmentation reste très incertain
car il y a perte successive de deux radicaux.
Om/z 208O
O
-CH3 -H
O
-CH3
. . .
m/z 192 m/z 207 m/z 193
Fig. 33 : Schéma de formation des ions m/z 192 et m/z 193 par EI
selon Ardanaz et al. [1998].
II. Synthèse bibliographique
35
L’étude en spectrométrie de masse des flavonoïdes prénylés a fait l’objet d’une revue en 1992
par Takayama et al. [1992]. Ils étudient les schémas de fragmentation dus à la dégradation des
groupements prénylés par EI et FAB/MS. Les spectres obtenus par EI présentent des
fragments caractéristiques dûs à la position du groupement prényle sur les cycles. En effet
pour les flavanones 6 ou 8 prenylées, nous retrouvons généralement les fragments [M-15]+,
[M-43]+et [M-55] + dont les schémas d’obtention sont présentés dans la Fig. 34. Dans le cas
des flavanones et des chalcones isomères, ils obtiennent des spectres similaires dus à
l’isomérisation thermique des flavanones en 2’hydroxychalcones.
O
O
m/z 356
OH
HOO
Om/z 341
R
O
HO
[M-15]+
OH
OH
R
O
Om/z 301
R
OH+
HO
[M-55]+
O
Om/z 337
R
OH+
HO
[M-43]+
RDA
OHO
OH+
O
m/z 165
Fig. 34 : Schémas de fragmentation d’une flavanone prénylée en position 6
(RDA : rétro Diels-Alder).
En 2002, Nowakowska [2002] s’intéresse à la fragmentation des bromoalkoxychalcones et
des morpholinoalkoxychalcones par EI et masse haute résolution. L’ensemble des dérivés de
chaque groupe présentent des fragmentations similaires. Les ions fragments issus de l’étude
des dérivés bromoalkoxychalcones sont présentés Fig. 35.
Suivant la coupure de la chaîne alkyle, il est facile d’identifier la chalcone correspondante.
Nous retrouvons la coupure en α de la double liaison et nous pouvons voir qu’un simple
clivage Csp3-O est à l’origine de la perte du radical (CH2)n-Br.
II. Synthèse bibliographique
36
O
CH
CH
OH2C Brn
O
CH
CH
O+
H2C Brn
++
[M-77]+
+O
m/z 105
-CO
m/z 77
O
CH
CH
m/ z 207
m/z 223
Fig. 35 : Schéma de fragmentation des alkoxyhalogénochalcones.
La dernière publication qui traite de l’étude de la fragmentation par EI date de 2004
[Nowakowska, 2004]. Les auteurs s’intéressent à la fragmentation des chalcones substituées
sur le cycle B par des groupements hydroxyles, thiols ou carbamates. La Fig. 36 présente les
différents ions fragments obtenus quelque soit le substituant. Les clivages préférentiels ont
lieu en position α de la double liaison et au niveau de la liaison reliant le substituant au cycle
B.
O
A B R
m/z 77
-C2H2
C4H3+ m/z 51
O+
m/z 105
-CO Om/z 207
-CO
m/z 179
m/z 102
Fig. 36 : Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B
Nowakowska et al. [2004].
II. Synthèse bibliographique
37
B. II. 2 Ionisation par electrospray et ionisation chimique à pression atmosphérique (ESI
et APCI)
Ionisation par electrospray (ESI)
Deux publications récentes traitent de l’analyse par ESI de flavanones et de dihydrochalcones
glycosylées [Hvattum et Ekeberg, 2003; Zhou et al., 2006]. Zhou et al. [2006] utilisent la
LC/MS pour détecter des flavonoïdes glycosylés dans un extrait par ESI en modes positif et
négatif. Les fragmentations des flavonoïdes glycosylées les plus rencontrés respectent le
schéma présenté Fig. 37. La nomenclature a été établi Ma et al. [1997].
O
O
OH
OO
OO
OH
OH
OHOHOH
OH
OH
0 1
2
34
1,3 B0
1,3 A0
Z0
Y0
B2
O,2 X0
0,2 A2
Z1Y1
B1
0,2 A1
0,2 X1
A
B
Fig. 37 : Nomenclature des ions obtenus après fragmentation en mode positif de flavanones O-diglycosylées.
Dans le spectre de masse enregistré en ESI en mode positif de l’hespéridine (voir structure
Fig. 37, l’ion m/z 303 correspond à la génine [Y0+H]+.
Composé R1 R2 R3 Masse
Naringine Néohespéridose H OH 580
Hespéridine Rutinose OH OCH3 610
Neohespéridine Néohespéridose OH OCH3 610
Isonaringine Rutinose H OH 580
O
O
R2
R3
O
R1
A
B
C
Fig. 38 : Molécules étudiées par Zhou et al. [2006].
II. Synthèse bibliographique
38
Fig. 39 : Schéma de fragmentation en mode positif par ESI de l’hespéridine.
L’expérience MS2 sur ce fragment a permis d’observer les ions suivants : m/z 177, m/z 153,
m/z 285 et m/z 179 dont les schémas d’obtention sont représentés Fig. 39. Les ions
majoritaires sont les ions présents à m/z 177 et m/z 179 qui correspondent respectivement à
une réaction de rétro Diels-Alder et une perte du cycle B. Cette dernière fragmentation a
l’avantage de pouvoir déterminer le type de substituants sur le cycle A. Dans le cas de la
naringine, le même type de spectre de masse est obtenu en mode positif.
En mode négatif, les auteurs obtiennent des différences de fragmentation entre le couple
hespéridine/neohespéridine et naringine/isonaringine qui sont des couples d’isomères qui
diffèrent seulement par la liaison intersucre (Fig. 38). En effet, dans le cas de l’hespéridine,
lorsqu’ils réalisent la MS2 sur l’ion [M-H]+ ils obtiennent seulement l’ion m/z 301
correspondant à la génine, alors que dans le cas de la néohespéridine, des ions
supplémentaires sont obtenus.
II. Synthèse bibliographique
39
Ainsi, le mode négatif a l’avantage d’aboutir à des fragmentations caractéristiques facilitant
leur identification par LC/MS dans un extrait.
Hvattum et Ekeberg [2003] s’intéressent à la fragmentation des flavonoïdes glycosylés
(quelque soit le noyau aglycone) et plus particulièrement au clivage homolytique des liaisons
O-sucres qui génèrent des radicaux aglycones stables en mode négatif. Ils constatent que dans
le cas particulier des flavanones et des dihydrochalcones glycosylées (Fig. 40), aucun ion
résultant de la fragmentation du radical aglycone n’est obtenu après avoir réalisé une
expérience MS2 sur l’ion [M-H]+. Les auteurs concluent que la présence d’une double liaison
entre les carbones 2 et 3 est nécessaire. Cette observation a l’avantage de pouvoir alors
déduire une génine dihydrochalcone ou flavanone dans le cas de l’identification de
flavonoïdes glycosylés inconnus présentant ce type de spectre dans un extrait par LC/MS.
OH
O
OH
HO
OO
HO
HO
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
O
O
O
OH
HO
HO
HO
HO
OH
Fig. 40: Phloridzine et hespéridine.
Fabre et al. [2001] ont étudié précisément la fragmentation des noyaux aglycones des
flavonoïdes de type flavone, flavonol et flavanone par ESI en mode négatif.
De façon générale, les fragments obtenus suivent le schéma de fragmentation présenté Fig.
41. La nomenclature adoptée est celle de Ma et al [1997]. Les notations i,jA- et i,jB- sont
utilisées pour désigner les ions produits contenant les cycles, respectivement A et B et les
notations i,j concernent les liaisons qui ont été scindées.
II. Synthèse bibliographique
40
O
O
OH
HO
OH
A
B
0 1
2
34
1,4 B-
1,2 B-
1,3 B-
0,4 B-
1,4 A-
1,3 A-
Fig. 41 : Nomenclature simplifiée pour désigner les fragments flavonoïdes en mode négatif .
En ce qui concerne les flavanones commerciales étudiées par Fabre et al. [2001], en plus des
fragmentations présentées Fig 41, des pertes de neutre sont observées : perte de CO, CO2 mais
aussi des perte de CH3 dans le cas d’une flavanone méthoxylée. L’étude du spectre de masse
de la génine flavanone permet de confirmer une perte facilitée de CO correspondant à une
réaction de contraction du cycle C.
En ce qui concerne les chalcones, Zhang et Brodbelt [2003] ont étudié par ESI leur
fragmentation en comparant trois modes d’ionisation : protonation, déprotonation et
complexation avec un métal (nickel, cuivre ou cobalt). Le mode positif (protonation) ne
convient pas dans le cas des chalcones, aucun adduit n’est visible (adduits protonés, sodés ou
potassés). En mode négatif, les auteurs ont réalisé des fragmentations sur des chalcones avec
des substituants hydroxyles et méthoxyles (mono- ou poly-) sur les deux cycles. Il obtiennent
de façon générale deux types de fragmentation suivant que le noyau A ou B est « perdu »
comme pour l’étude de la fragmentation en impact électronique (Fig. 26).
Sur l’ensemble des fragmentations obtenues, des fragmentations générales peuvent être
déduites (Fig. 42). Nous retrouvons les clivages déjà établis par impact électronique mais
avec des fragments supplémentaires.
II. Synthèse bibliographique
41
O
A BFragments de type A (cycle B perdu) Fragments de type B (cycle A perdu)
-H
O
-H
-H
O
-H
-H
-H
O
-H
(avec des substituants OH obligatoirement)
CH2Pas de fragments
m/z 77m/z 129
m/z 77 m/z 129
m/z 103
m/z 91
Fig. 42 : Schémas généraux de fragmentation du squelette chalcone par ESI en mode
négatif selon Zhang et Brodbelt [2003].
Ces fragmentations sont proposées suite à des expériences de MSn qui conduisent à des pertes
de neutres : CO, CO2, CH≡CH, H2O. Ces pertes confirment s’il s’agit d’un fragment de type
A ou B. Les pertes de CO et CO2 sont communément observées et sont très présentes pour les
chalcones avec des substituants hydroxyles.
Pour les chalcones substituées sur le cycle B en méta ou para par des hydroxyles, les auteurs
observent des pertes de C2H2O (- 42 uma). Pour les chalcones avec des substituants
hydroxyles ou méthoxyles, les pertes de radical méthyle et de méthane sont fréquentes. Ces
pertes avaient déjà été observées en EI par Ardanaz et al. [1998]. Ils ont également comparé
la fragmentation des 2’-hydroxychalcones et des flavanones isomères. Les mêmes ions sont
observés mais l’abondance des fragments est différente. Enfin, le mode par complexation
s’avère être une alternative pour caractériser les chalcones isomères.
II. Synthèse bibliographique
42
Ionisation chimique à pression atmostphérique (APCI)
En ce qui concerne les flavanones, la méthode d’ionisation par APCI a été largement utilisée
notamment en ce qui concerne les dérivés glycosylés [Stobiecki, 2000; Wolfender et al.,
2000] et l’analyse d’extrait de plantes [Justesen, 2001; Justesen et al., 1998].
Justesen et al. [2000] ont étudié la composition en flavonoïdes d’extraits d’herbes
aromatiques par LC/MS en APCI en mode négatif. Parmi les témoins utilisés, deux sont
communs avec ceux utilisés par Fabre et al. [2001]. Il s’agit de l’ériodictyol et de la
naringénine. En comparant les spectres de masse selon les deux méthodes d’ionisation, les
spectres sont identiques.
Dans une revue sur l’application de la LC/MS en phytochimie, Wolfender et al. [2000]
rapportent les spectres de masse de différentes génines de flavonoïdes dont les flavanones. En
mode positif, les ions fragments majoritairement obtenus sont présentés Fig. 43.
O
O
OH
HO
OH
A
B
0 1
2
34
1,3 B+
1,4 B+-2H
1,3 A+
1,4 B+-2H-CO-CO
Fig. 43 : Principaux ions fragments obtenus en APCI en mode positif pour les
flavanones selon Wolfender et al. [2000].
L’étude de la fragmentation des chalcones en APCI en mode positif a fait l’objet d’une
publication récente en 2006 par Tai et al. [2006]. De nombreuses chalcones substituées par
des hydroxyles, méthoxyles, nitros et des halogènes ont été étudiées. Les auteurs ont constaté
que les différents composés obéissent aux mêmes règles de fragmentation (Fig. 44) excepté
pour les dérivés nitro où aucune perte de CO n’est observée.
II. Synthèse bibliographique
43
O
A B R2R1AR1
O+
AR1
-CO
AR1O
O+
B R2
-CO
B R2
+ H
Fig. 44 : Schéma de fragmentation général des chalcones substituées en APCI en mode positif
selon Tai et al. [2006].
Le mécanisme de fragmentation proposé pour expliquer la perte de CO est présenté Fig. 45.
Comme le montre cette figure, la molécule de CO peut être éliminée suite à un réarrangement
du squelette avec formation d’une nouvelle liaison carbone-carbone pour donner l’ion d.
OH+
A B R2R1
H OH
A B R2R1
H
O
-CO
R1 R2B R2
AR1
AR1
BR2
a b
c
d
Fig. 45 : Schéma de fragmentation expliquant la perte de CO en APCI en mode positif selon
Tai et al. [2006].
Parmi les autres pertes de neutre, l’élimination d’H2O est obtenue pour tous les composés. Le
schéma de fragmentation proposé (Fig. 46) fait intervenir une réaction de formation de cycle à
sept carbones.
II. Synthèse bibliographique
44
OH+
A B R2R1
H
R1
+HO
R2
R2R1
HOH
R2
R1
-C2H2R1
R2
-H2O
Fig. 46 : Schéma de fragmentation expliquant la perte d’H2O en APCI en mode positif selon
Tai et al. [2006].
Ainsi, d’après Tail et al [2006], l’élimination d’H2O impliquerait la fonction cétone et un
hydrogène du cycle B.
Après ces deux premières parties consacrées à la description de la plante, aux flavonoïdes et à
la spectrométrie de masse, cette troisième et dernière partie présente quelques généralités sur
le paludisme.
II. Synthèse bibliographique
45
C. Généralités sur le paludisme
Endémie parasitaire majeure, le paludisme ou malaria est une érythrocytopathie due à un
hématozoaire du genre Plasmodium, transmis par la piqûre d’un moustique, une anophèle
femelle.
C. I. Epidémiologie
Des chiffres alarmants
Selon les estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé [WHO, 2005], cette maladie
parasitaire tue un enfant toutes les trente secondes en Afrique et est responsable d’un à trois
millions de décès par an dans le monde. Le nombre de personnes contaminées est estimé
entre 300 et 600 millions, dont la grande majorité se trouve en Afrique (90% des cas)
[Rinaldi, 2004].
Répartition géographique
Cette parasitose pose aujourd’hui un problème de santé publique pour plus de 100 pays,
représentant un total de plus de 2,4 milliards de personnes, soit environ 40% de la population
mondiale [WHO, 2005]. Ces pays sont essentiellement des pays en développement situés en
Afrique, Asie et Amérique latine (Fig. 47).
Fig. 47 : Répartition mondiale des cas de paludisme dans le monde selon l’OMS
[WHO, 2005].
II. Synthèse bibliographique
46
L'Afrique est le continent le plus touché par le paludisme. Le danger est quasi nul en Afrique
du Nord, mais majeur en Afrique de l'Est, en Afrique subsaharienne et en Afrique équatoriale.
En Asie, le paludisme est absent des grandes villes et plutôt rare dans les plaines côtières. Le
danger est majeur dans les zones rurales du Cambodge, de l'Indonésie, du Laos, de la
Malaisie, des Philippines, de la Thaïlande, du Vietnam et en Chine dans le Yunnan ainsi qu’ à
Hainan. Dans les Antilles, le paludisme sévit à Haïti et près de la frontière de la République
Dominicaine. En Amérique centrale, il existe quelques micro-zones, mais le risque est
relativement faible. En Amérique du Sud, le risque est faible dans les grandes villes, mais réel
dans les zones rurales en Bolivie, en Colombie, en Équateur, au Pérou et au Venezuela, et
majeur dans toute la zone amazonienne.
Outre ces zones à risques, le paludisme peut se propager de différentes manières :
� Le paludisme d’importation ou des voyageurs : déclaration au CNRMI (Centre
National de Références pour les Maladies d’Importation) ; 3000 à 5000 cas annuels en
France dont 90% en provenance d’Afrique.
� Le paludisme des aéroports : la transmission par des anophèles voyageuses peut se
faire lors d’étés chauds autour des grands aéroports internationaux (cas de Roissy en
1994, 7 cas)
� Le paludisme autochtone : c’est la transmission en France chez un sujet n’ayant pas
voyagé en pays d’endémie depuis un an. Cependant, les départements d’Outre-Mer
font partie de la France (la Guyane faisant partie des zones d’endémie palustre, tous
les cas sont donc considérés comme autochtones).
C. II. Le parasite et le vecteur
C. II. 1 Les parasites du genre Plasmodium
Classification
Selon la dernière classification de Levine [1988] amendée par Cox [1991], le genre
Plasmodium appartient à l’embranchement des Apicomplexa (Sporozoaires), à la classe des
Haemosporida, à l’ordre des Haemosporida et à la famille des Plasmodiidae.
II. Synthèse bibliographique
47
Les Plasmodium sont des parasites des hématies ils sont parfois nommés hématozoaires (Fig.
48).
Fig. 48 : Globules rouges infectés par P. falciparum (coloration au Giemsa).
Quatre espèces sont responsables de la maladie chez l’Homme [Mendis et al., 2001].
� P. falciparum Welch
Essentiellement rencontré en Afrique tropicale, en Amérique centrale et du Sud et en Asie du
Sud Est, il s’agit de l’espèce la plus pathogène car responsable de cas mortels. De plus, P.
falciparum développe aujourd’hui une résistance contre la chloroquine dans de nombreux
pays, posant ainsi le problème de la prévention médicamenteuse de la maladie.
� P. vivax Grassi et Feletti
C’est la deuxième espèce rencontrée en Afrique et surtout en Asie, en Amérique latine et, à un
moindre degré, en Afrique de l’Est. Environ 10 à 20% des cas d’infection par P. vivax dans le
monde se produisent en Afrique, au sud du Sahara. En Afrique australe et orientale, P. vivax
représente autour de 10% de cas de malaria mais dans moins de 1% de cas en Afrique centrale
occidentale [Mendis et al., 2001].
� P. malariae Grassi et Feletti
Cette espèce a une distribution mondiale très inégale. Elle n'est pas meurtrière mais peut
entraîner des rechutes jusqu'à 20 ans après la primo-infection.
� P. ovale Stephens
Principalement rencontrée en Afrique de l'ouest, cette espèce ne tue pas mais peut entraîner
des rechutes 4 à 5 ans après la primo-infection. Elle infecte préférentiellement les globules
rouges non matures, ce qui limite la parasitémie.
II. Synthèse bibliographique
48
Cycle de reproduction (Fig. 49)
Le cycle de reproduction des Plasmodium est complexe et comporte deux étapes essentielles :
une phase asexuée qui se déroule chez l’Homme et une phase sexuée qui débute chez
l’Homme et qui se termine chez le moustique (Anopheles).
Fig. 49 : Cycle de reproduction des Plasmodium.
(http://membres.lycos.fr/lfinot/images/Affiche.jpg)
� Phase asexuée chez l’Homme [Mouchet, 2004]
Le cycle du Plasmodium chez l’Homme débute par l’inoculation, lors de la piqûre du
moustique, du parasite sous forme de sporozoïte qui en une heure via la circulation sanguine,
passe dans le foie. Après une phase de division dans les hépatocytes, il produit des schizontes
hépatiques : c’est la phase pré-erythrocytaire (avant l’invasion du globule rouge) ou exo-
erythrocytaire (hors globule rouge). Arrivé à maturité, après huit à dix jours, le schizonte
éclate, libérant plusieurs milliers de mérozoïtes (40 000 pour P. falciparum).
II. Synthèse bibliographique
49
Ces mérozoïtes pénètrent dans les hématies où ils se transforment en trophozoïtes puis en
schizontes érythrocytaires dont chacun comporte seize ou trente-deux noyaux fils. Chaque
noyau donne un mérozoïte lorque le globule rouge éclate. Ce mérozoïte va ensuite parasiter
une hématie saine et le cycle schizogonique recommence. C’est la phase érythrocytaire du
cycle.
Spécificités de P. falciparum : Dans le cas de P. falciparum, seul le début du cycle se déroule
dans le sang périphérique : la phase de division du schizonte érythrocytaire se produit dans les
organes profonds. Le développement de tous les parasites est synchrone chez un même sujet
et ce cycle érythrocytaire dure 48 heures, d’où le nom de fièvre tierce maligne qui lui était
donné bien avant que ne fut découvert le parasite. L’éclatement des globules rouges
correspond à l’épisode fébrile qui caractérise le paroxysme de l’accès. Après plusieurs cycles
asexués de P. falciparum, le malade, s’il a survécu, guérit spontanément.
Après neuf à onze jours, apparaissent dans le sang des formes sexuées non pathogènes, les
gamétocytes mâles et femelles. Ces gamétocytes n’évoluent pas chez l’Homme et ne peuvent
poursuivre leur évolution que lorsqu’ils sont ingérés par des Anopheles, assurant ainsi la
pérennisation de l’espèce.
� Phase sexuée chez l’anophèle [Mouchet, 2004]
Lors de son repas sanguin, l’anophèle avale des gamétocytes mâles et femelles. Dans son
estomac, ils se transforment en gamètes. Leur fécondation engendre un œuf (ookinète) qui se
différencie en sporozoïtes dans les glandes salivaires du moustique. Lorsque le moustique ira
piquer une personne pour prendre un repas de sang, les sporozoïtes seront introduits dans cette
personne via la salive. Un nouveau cycle peut alors commencer.
II. Synthèse bibliographique
50
C. II. 2 Le vecteur : un moustique femelle du genre Anopheles
Classification
Le vecteur (Fig. 50) est un moustique (ordre des diptères) appartenant au genre Anopheles, de
la famille des Culicidae, sous famille des Anophelinae. Plus de 450 espèces d'Anopheles ont
été à ce jour décrites mais seulement une soixantaine sont des espèces vectrices responsables
de la transmission du parasite à l'Homme (source : http://www.pasteur.fr).
Fig. 50 : Un moustique vecteur du paludisme (Anopheles freeborni) prenant son repas de sang
(http://www.pasteur.fr).
Les principales espèces
Les principaux vecteurs du paludisme en Afrique sont: Anopheles gambiae, A. arabiensis
(indifférenciable morphologiquement du précédent), A. funestus, A. nili et A. moucheti. En
Amérique, quatres espèces sont particulièrement impliquées : A. darlingi, A. albimanus, A.
pseudopunctipennis et A. quadrimaculatus. Enfin en Asie, nous pouvons citer A. stephensi (un
moustique "urbain"), A. farauti, A. sinensis, A. tellessarus et A.minimus.
La nécessité d’un repas sanguin
Pour chaque production d'œufs (100 ou plus), c'est à dire tous les 2 ou 3 jours, la femelle doit
prendre un repas de sang : elle peut se nourrir, comme le fait le mâle, de nectar ou du jus des
fruits, mais le sang est indispensable pour la production des œufs. La ponte a lieu 3 jours
après le repas. En période de température élevée, le potentiel reproductif de la femelle
anophèle est considérable : ceci constitue un des facteurs majeurs à l'origine du "succès" du
parasite du paludisme. La femelle anophèle doit cependant avoir survécu 4 à 5 cycles de
production d'œufs avant de pouvoir devenir infectante. Sa durée de vie (variable selon les
conditions, notamment climatiques) est d'environ un mois.
Les moustiques mâles ne piquent pas et ne transmettent donc jamais le paludisme.
II. Synthèse bibliographique
51
C. III. Les manifestations cliniques
Phase d’incubation
L’incubation dure en principe une à deux semaines, période nécessaire à la formation des
schizontes intra-erythrocytaires. Elle peut être beaucoup plus longue et les symptomes
n’apparaissent que plusieurs semaines voire plusieurs mois plus tard.
Phase d’invasion
Les premières manifestations cliniques du paludisme d’invasion sont souvent très banales et
réalisent un état infectieux fébrile de type grippal ou typhoïdique. Elle s’accompagne de
myalgies, céphalées parfois vomissements et diarrhées. A ce stade, la maladie risque fort
d’être méconnue si on n’y pense pas spécialement.
Phase d’état
Elle correspond aux schizogonies érythrocytaires. Au bout de quelques jours, le malade
semble guérir mais apparaissent alors de grands accès fébriles intermittents caractéristiques,
en principe rythmé par l’éclatement des schizontes mûrs et le déversement du pigment
palustre dans le sang. L’accès palustre dure quelques heures et se déroule en trois phases très
suggestives avec la séquence « frissons-chaleur-sueur », d’abord de grands frissons avec froid
intense généralisé ensuite un pic thermique à 40-41°C de deux à trois heures avec faciès
congestif et peau brûlante et enfin sueurs profuses laissant le malade épuisé. Dans le cas de
l’espèce P. falciparum, on parle de fièvre tierce avec accès palustre les 1er, 3ème et 5ème jours
etc suivant un rythme de 48 heures.
A ce stade de la maladie, deux éventualités sont à distinguer : si le malade reste en terre
palustre, l’affection pourra durer fort longtemps, entretenue par des contaminations itératives
avec tous les dangers des complications viscérales du paludisme chronique ; si le malade
quitte la région impaludée, il ne court plus le risque de nouvelles infestations et la maladie
s’éteint généralement d’elle-même en quelques mois pour P. falciparum. Cependant des
rechutes sont possibles pendant les deux ans qui suivent dues aux hypnozoïtes hépatiques
(phase de dormance de schizontes hépatiques) [Houngnikpo, 2004; Mouchet, 2004].
II. Synthèse bibliographique
52
C. IV. Prévention et traitement du paludisme
C. IV. 1. Prévention du paludisme
La lutte anti-vectorielle
La prévention est l’un des piliers de la stratégie mondiale contre le paludisme. En l’absence
de vaccin efficace disponible, elle repose sur la lutte contre les vecteurs et sur la
chimioprophylaxie limitée par la résistance aux médicaments.
Le principal objectif de la lutte anti-vectorielle contre le paludisme consiste à réduire
considérablement à la fois le nombre d’infections et le taux d’infection par le parasite ainsi
que les épisodes cliniques en luttant contre le moustique vecteur et en réduisant et/ou en
interrompant la transmission. Les principales interventions opérationnelles consistent en des
pulvérisations d’insecticide à effet rémanent à l’intérieur des habitations ainsi que l’utilisation
de moustiquaires à imprégnation durable. Suite à des effets irritants et toxiques, le DTT a été
remplacé par des pyréthrinoïdes.
Ces interventions essentielles peuvent être complétées localement par d’autres méthodes (lutte
larvaire ou aménagement de l’environnement, par exemple) dans le contexte de la gestion
intégrée des vecteurs. La mise en œuvre efficace et soutenue de ces interventions de lutte
antivectorielle exige une volonté politique et un engagement clair des autorités nationales
ainsi qu’un soutien à long terme des partenaires financiers [WHO, 2005].
Malgré tous les efforts mis en œuvre pour lutter contre le vecteur, celui-ci développe une
résistance aux insecticides actuels et, la mise au point de nouveaux insecticides est une
entreprise longue et coûteuse.
La chimioprophylaxie
Les médicaments utilisés en prophylaxie (prévention lors d’un voyage en pays endémique)
seront développés dans le paragraphe concernant le traitement du paludisme.
II. Synthèse bibliographique
53
C. IV. 2 Le traitement du paludisme
Le traitement du paludisme dépend de plusieurs facteurs notamment de l’espèce de parasite en
cause, de la gravité de l’infection, de l’âge de la personne atteinte et du profil de résistance
aux médicaments antipaludéens suivant la région où le malade a contracté la maladie.
C. IV . 2. 1 Les principaux antipaludiques
Il existe plusieurs médicaments antipaludiques [Basco et al., 1994] et nous nous limiterons ici
aux principaux utilisés. Ces médicaments peuvent être utilisés soit en prophylaxie, soit en
thérapeutique (après le diagnostic d'une infection). Nous pouvons distinguer deux grandes
classes d’antipaludéens, les schizonticides (les plus nombreux) et les gamétocytocides.
Les schizonticides
Il existe des produits utilisés en monothérapie ou en associations médicamenteuses [Mouchet,
2004].
� Molécules utilisés en monothérapie
• Les dérivés quinoléiques
Les antipaludiques contenant un noyau quinoléine se répartissent en deux groupes : les
quinoléines de type I représentées essentiellement par les amino-4-quinoléines (chloroquine et
amodiaquine) et les quinoléines de type II représentées par les amino-alcools (quinine,
méfloquine, halofantrine) [Touze et al., 2002].
� Quinoléine de type I
Il s’agit d’amino-4-quinoléines de synthèse qui sont essentiellement la chloroquine
(Nivaquine) et l’amodiaquine (Flavoquine) (Fig. 51).
II. Synthèse bibliographique
54
N
HN
OH
N
ClAmodiaquine
N
HN
Cl
N
Chloroquine
Fig. 51 : L’amodiaquine et la chloroquine.
- La chloroquine
La chloroquine, premier dérivé de synthèse de la quinine a été pendant plus de cinquante ans
le médicament idéal tant pour le traitement des accès que pour la prophylaxie. Son champ
d’utilisation ne cesse de se rétrécir avec le développement de résistances [Mouchet, 2004].
- L’amodiaquine
Elle a été rejetée de la prophylaxie en raison de rares troubles hépatiques et hématologiques.
Bien que les résistances à ce produit soient fréquentes, elles sont en général de faible niveau et
n’entraînent pas d’échec thérapeutique. Plusieurs états (Kenya, Tanzanie par exemple…)
placent ce produit en première ligne en cas de développement trop important de résistances à
la chloroquine [Mouchet, 2004].
L’utilisation de ces composés (quinine, amodiaquine) se trouve confrontée au problème
majeur de l’extension des souches de P. falciparum résistantes à ces médicaments.
� Quinoléines de type II
- La quinine (Quinimax, Quinine Lafran, Quinoforme, Surquina)
La quinine (Fig. 52) est le plus ancien des antipaludiques. Elle a été découverte en 1820 et a
constitué jusqu’aux années 1930, le seul médicament contre le paludisme. Il s’agit d’un
alcaloïde naturel extrait des écorces de Quinquina (Cinchona sp., Rubiaceae).
II. Synthèse bibliographique
55
N
O
N
H
H
OH
Fig. 52 : La quinine.
Ses propriétés pharmacologiques et en particulier la possibilité de l’administrer par voie
intraveineuse en font le médicament de choix lors du traitement du paludisme grave, d’autant
qu’il existe peu de résistances à ce produit (surtout en Asie).
Cette molécule est principalement utilisée pour le traitement curatif des accès palustres
pernicieux (neuropaludisme), en traitement curatif et en prophylaxie en cas de résistance aux
autres quinoléines de synthèse (chloroquine). Cependant, les effets indésirables sont
nombreux dont les plus graves sont le cinchonisme (se traduisant par une atteinte de la 8ème
paire de nerfs craniens, bourdonnement d’oreilles), des troubles cardio-vasculaires, de la vue
mais aussi des troubles digestifs.
- Les dérivés de synthèse de type aryl-amino-alcools
Nous pouvons citer, L’halofantrine (Halfan), la méfloquine (Lariam) (Fig. 53).
Cl
Cl
CF3
HO
N
Halofantrine
N
NH
HO
CF3
CF3 Méfloquine
Fig. 53 : L’halofantrine et la méfloquine.
II. Synthèse bibliographique
56
- La méfloquine
La méfloquine est active sur les quatre espèces de Plasmodium et malgré quelques résistances
très localisées en Thaïlande et au Vietnam, elle reste très utilisée en Asie contre les souches
multi-résistantes. Nous verrons par la suite qu’elle est très souvent associée avec des dérivés
de l’artémisinine [Mouchet, 2004].
La méfloquine est en général plutôt bien tolérée, les effets secondaires sont relativement
faibles (nausées, vertiges, vomissements).
- l’halofantrine
L’halofantrine était réservée, dans l’esprit de ses concepteurs, au traitement des souches
résistantes. Le produit est cher (plus de 4 euros la cure, soit 130 fois le prix de la chloroquine).
Ses effets cardiotoxiques limitent son utilisation sans contrôle. Elle se prescrit uniquement par
voie orale pour des accès simples.
• Les antifolates
Le principal représentant est le Fansidar qui est l’association d’un sulfamide antibiotique, la
sulfadoxine et d’une diaminopyrimidine antifolinique, la pyriméthamine (Fig. 54).
Fig. 54 : La sulfadoxine-pyriméthamine.
L’association des deux composés n’engendre pas de contre-indications ou d’interactions
spécifiques. Ce médicament est utilisé en cas de résistance aux 4-aminoquinoléines ou en cas
de contre-indication aux autres antipaludiques. Malheureusement, des cas de résistances sont
également apparus dans certains pays.
II. Synthèse bibliographique
57
Les antifolates agissent au niveau de la voie de synthèse des folates, qui sont essentiels à la
biosynthèse des acides nucléiques du parasite. Les antifoliques inhibent la dihydroptéroate
synthétase (DHPS) qui produit l’acide folique, les antifoliniques inhibent la dihydrofolate
réductase (DHFR) qui produit l’acide folinique.
• Artémisinine et dérivés
L’artémisinine (Fig. 55) est extraite d’une armoise chinoise, Artemisia annua (Qinghaosu). Il
s’agit d’un antipaludique de la pharmacopée chinoise utilisé depuis plus de 2000 ans. C’est
une lactone sesquiterpénique présentant un pont endoperoxide. Ces principaux dérivés
d’hémisynthèse sont l’artésunate (Arsunax, Rectocap) et l’artéméther (Paluther) (Fig. 55).
O
OO
O
H
H
H
O
OO
H
H
H
H OCH3
O
OO
H
H
H
O
O
HO
Artémisinine ArtémétherArtésunate
Fig. 55 : Artémisinine et dérivés.
Ils sont efficaces, agissent très rapidement et sont très bien tolérés. En raison de leur courte
durée de vie, il est recommandé de les utiliser en association ce qui permet de réduire la durée
du traitement et la probabilité d’apparition de résistances.
� Associations médicamenteuses
La combinaison thérapeutique consiste à associer au moins deux médicaments schizonticides
dont les modes d’action sont indépendants et dont les cibles biochimiques sont différentes afin
d’améliorer leur efficacité et de retarder le développement et la résistance à chacun des
constituants [Mouchet, 2004].
II. Synthèse bibliographique
58
Les associations médicamenteuses recommandées par l’OMS sont celles à base
d’artémisinine (ou dérivés), on les appelle les ACT : Artemisinin-based Combination
Therapy.
En effet, depuis 2001, l’OMS recommande aux pays où le paludisme est devenu résistant aux
traitements traditionnels, comme la chloroquine, de passer à ces associations. Quatre ACT
sont recommandés par l’OMS : artémether-lumefantrine, artésunate-méfloquine, artésunate-
amodiaquine et artésunate-sulfadoxyne/pyriméthamine (OMS, communiqués de presse).
Depuis 2001, 40 pays (dont 20 en Afrique) ont officiellement adopté ces médicaments pour
traiter le paludisme. En 2004 seulement 18 pays ont pris cette mesure. Quatorze pays ont
retenu l'association artémether-luméfantrine pour les traitements antipaludiques de première
intention. En 2001, l'OMS a passé avec Novartis Pharma AG un accord aux termes duquel
Novartis fournit à l'OMS sa spécialité à base d'artémether-luméfantrine (Coartem®) à prix
coûtant pour approvisionner les secteurs publics des pays en développement où le paludisme
est endémique.
Les combinaisons à base d’artémisinine sont les meilleurs médicaments disponibles
actuellement pour le traitement de la malaria à P. falciparum.
Les gamétocytocides
Ils détruisent les formes sexuées du parasite permettant ainsi d’interrompre la transmission de
l’infection au moustique. Les plus connus sont les 8-aminoquinoléines dont le principal
représentant est la primaquine (Fig. 56). Ce produit ne doit pas être administré aux sujets
déficients en G6PD (Glucose-6-Phosphate Deshydrogénase) car cela peut entraîner des
accidents hémolytiques. Dans certains pays, ils peuvent représenter plus de 30% de la
population.
II. Synthèse bibliographique
59
N
HN
NH2
O
Primaquine
Fig. 56 : La primaquine.
La quinine et la chloroquine présentent aussi une activité gamétocytocidale sur P. malariae et
P. vivax mais pas sur P. falciparum [Vangapandu S., 2007].
Phénomènes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques [Anglaret, 2003]
� Résistance à la chloroquine
C’est la résistance la plus répandue qui s’étend régulièrement dans le monde depuis les années
soixante. Actuellement, plus de 50% des souches isolées en France au cours d’accès palustre
d’importation sont chloroquino-résistantes.
� Résistance aux autres antipaludiques
- Fansidar (pyriméthamine-sufadoxine) : la résistance se développe actuellement en Asie et
en Afrique de l’est.
- Lariam (méfloquine) et Halfan (Halofantrine) : des cas de résistance ont commencé à
apparaître récemment, mais sont encore très rares.
- Quinimax (Quinine) : On constate des cas de diminution de la sensibilité à la quinine dans
la région où la chloro-résistance est fréquente, en particulier en Asie. Ceci a conduit à
augmenter la posologie dans les accès graves survenant chez des patients venant de ces
régions.
II. Synthèse bibliographique
60
La carte (Fig. 57) présentée dans le dernier rapport de l’OMS [WHO, 2005], illustre les
différentes zones de résistance dans le monde.
Fig. 57 : Répartition géographique des cas de résistance de P. falciparum aux molécules
antipaludiques (données de 2004) [WHO, 2005].
C. IV. 2. 2 Les remèdes traditionnels : une alternative ?
L’utilisation de remèdes traditionnels implique l’usage à des fins médicales de plantes, (voir
de parties d’animaux et de minéraux ) pour soigner, diagnostiquer ou préserver la santé. En
Afrique, en Asie et en Amérique latine, différents pays font appel aux remèdes traditionnels.
En Afrique, jusqu’à 80% de la population a recours à la médecine traditionnelle. Au Ghana,
au Mali, au Nigéria et en Zambie, le traitement de première intention pour 60% des enfants
atteints de forte fièvre due au paludisme fait appel aux plantes médicinales, administrées à
domicile [OMS, 2000].
Cependant, il est nécessaire de faire une évaluation de ces plantes dans le but de veiller à leur
réelle efficacité et à leur non-toxicité. Ainsi, les plantes du genre Quassia et Simarouba
d’Amérique du Sud semblent renfermer des composés toxiques [Mouchet, 2004].
Néannmoins, les succès en clinique de la quinine et de l’artémisine, molécules naturelles
isolées respectivement de Cinchona sp. et Artemisia sp. encouragent la recherche de nouvelles
molécules antipaludiques issues de la biodiversité végétale.
II. Synthèse bibliographique
61
C. V Généralités sur les cibles thérapeutiques
Le Plasmodium dispose pour son développement intraérythrocytaire d’un métabolisme et de
moyens de défense spécifiques qui constituent autant de cibles aux antipaludiques [Touze et
al., 2002]. On distingue ainsi :
� La vacuole digestive : elle est le siège de la digestion de l’hémoglobine, de la
cristallisation de l’hème et où l’on retrouve des moyens de défense contre le stress
oxydant.
� Le cytoplasme comportant deux organites essentiels :1) le système mitochondrial où
se déroulent le tranfert d’électrons et les processus enzymatiques indispensables à la
glycolyse et à la production d’énergie ; 2) l’apicoplaste qui est un reliquat d’ancien
chloroplaste.
� La membrane constituée de phospholipides et de canaux calciques. Elle est le siège
d’un trafic nutritionnel et dispose de protéines kinases intervenant dans la transduction
du signal.
Le tableau suivant résume le mode d’action et les molécules cibles des médicaments
antipaludéens [Genton B., 2007] (Fig. 58) :
Classe médicament Membre Localisation-cible Molécule-cible
Antifolates PYR, PG Cytosol DHFRSDX, DAP DHPS
Quinolines CQ, AQ, QUIN, Vacuole digestive Hème, autres?MEF, HALLUM, PRIM
Artémisinines Dihydroartémisinines Vacuole digestive Pf ATP6, Hèmeet dérivés cytosol
Naphtoquinones ATQ Mitochondire Cytochrome bc
Antibiotiques DOX, TET Apicoplate Apicoplates, ribosome PYR= pyriméthamine, PG= proguanil, SDX= sulphadoxine, DAP= dapsone, DHFR= dihydrofolate réductase,
DHPS= dihydroptéroate synthase, CQ= chloroquine, AQ= amodiaquine, QUIN= quinine, MEF= méfloquine,
HAL= halofantrine, LUM= luméfantrine, PRIM= primaquine, PfATP6= P. falciparum ATPase6, ATQ=
atovaquone, DOX=doxycycline, TET= tétracycline.
Fig. 58 : Mode d’actions et molécules cibles des médicaments antipaludéens
[Genton B., 2007].
II. Synthèse bibliographique
62
Les deux principales classes d’antipaludiques représentées par les quinolines et les dérivés de
l’artémisinine agiraient au niveau de la vacuole digestive du parasite dont nous allons
développer les trois principales voies métaboliques [Touze et al., 2002].
- La digestion de l’hémoglobine
Elle est effectuée par des protéinases vacuolaires (aspartiques protéases, plasmapepsines I, II
II et IV , cystéine protéases etc..). Elles assurent le clivage de l’hémoglobine. Ce sont des
cibles thérapeutiques prometteuses.
- La cristallisation de l’hème
Les plasmodies ingèrent et dégradent l’hémoglobine pour obtenir des acides aminés
indispensables à leur survie. La ferriprotoporphyrine IX qui est un produit de cette
dégradation est un hème oxydé qui se dimérise et ces dimères se polymérisent en un pigment
inerte appelé hémozoïne. L’hème étant toxique pour le parasite, des molécules capables
d’empêcher cette polymérisation sont des molécules potentiellement antipaludiques.
- Le stress oxydant
Comme la plupart des microorganismes, les plasmodies sont capables de déclencher une
cascade de réactions oxydatives au sein des macrophages et des polynucléaires. Elles font
intervenir une peroxydase, de l’eau oxygénée et différentes enzymes. Les réactions de
peroxydations qui en découlent aboutissent à la production de radicaux libres toxiques pour le
parasite. On parle alors de stress oxydatif. La voie du stress oxydatif est utilisée en
thérapeutique en ayant recours à des composés oxydo-réducteurs pouvant catalyser la
production d’oxydants et de radicaux libres dans l’hématie parasitée.La principale source de
stress oxydant résulte de la dégradation de l’hémoglobine en acides aminés nécessaires au
développement du parasite. Cette dégradation se produit au sein de la vacuole digestive du
parasite et engendre la production d’hème libre toxique (FerIIprotoporphyrin-IX : FP)
induisant la production d’espèces radicalaires oxygénées (O2•-, OH•, H2O2), source d’un stress
oxydant. Pour se protéger, le parasite sous l’action de protéases de la vacuole, séquestre
l’hème sous une forme crystalline appelée hémozoïne ou pigment malarique.
III. Résultats et discussion
63
D. Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var.
berbicense
D. 1 Matériel végétal
Le matériel végétal a été récolté en Guyane française et un échantillon de chaque lot récolté a
été déposé à l’herbier de l’IRD de Cayenne (les numéros d’herbiers sont énumérés au
paragraphe D. 2). Après avoir été récoltées, les feuilles ont été séchées, puis envoyées par
colis à l’UMR-152 à Toulouse.
Plusieurs lots de feuilles ont été récoltés entre juillet 2003 et février 2006. L’authentification
de la drogue a été permise suite à une étude comparative des lots selon des critères
botaniques, phytochimiques et biologiques. Cette étude nous a permis de distinguer les deux
variétés de Piper hostmannianum présentes en Guyane :
- Piper hostmannianum var. hostmannianum (Miq) C.DC.
- Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC.
Comme nous avons pu le décrire précédemment, ces deux variétés présentent des
caractéristiques morphologiques très proches entraînant une difficulté à les distinguer sur le
terrain.
D. 2 Travaux préliminaires : étude comparative des deux variétés de Piper
hostmannianum Guyanaises
Le matériel végétal
Les différents lots de feuilles de Piper hostmannianum sont les suivants :
- le premier lot : le lot 1016 a été récolté en juillet 2003, il présente une activité modérée
(extrait à l’acétate d’éthyle, CI50= 10 µg/ml) sur P. falciparum suite à un criblage
réalisé par les laboratoires Pierre Fabre. Ce résultat a été validé par des tests in vitro au
sein de notre laboratoire.
III. Résultats et discussion
64
- Le second lot : le lot 1032 a été récolté en juin 2005.
- Première série de lots récoltés en juillet 2005 : GB3141, GB3142, GB3143, GB3144,
GB3145.
- Seconde série de lots récoltés en novembre 2005 : GB3162, GB3163, GB3164,
GB3165, GB3166, GB3167, GB3168.
- Troisième série de lots récoltés en décembre 2005 : GB3169, GB3169bis, GB3171,
GB3172, GB3174, GB3175, GB3176, GB3177, GB3178, GB3179, GB3180,
GB3181, GB3182, GB3183, GB3184, GB3185 et odonne /delnatte6.
Un partie de l’étude phytochimique bioguidée a été réalisée sur le premier lot, le lot 1016 (lot
actif in vitro sur P. falciparum). Néanmoins, il a été nécessaire d’être réapprovisionner en
matière première pour pouvoir continuer notre étude.
Extraction
Environ 2 g de chaque lot a été broyé et extrait par l’acétate d’éthyle à l’aide d’un extracteur
ASE 100 Dionex (voir partie Matériels et méthodes).
Remarque : l’acétate d’éthyle a été choisi, car ce solvant avait déjà été utilisé lors d’un
premier criblage in vitro de plantes guyanaises sur P. falciparum au sein des laboratoires
Pierre Fabre, cf introduction).
Comparaison des lots 1016, 1032 et de la première série de lots récoltés en juillet 2005
Profils des extraits en CCM
La Fig. 59 suivante représente les profils en CCM (de gauche à droite) des lots 1016, 1032,
GB3141, GB3142, GB3143, GB3144, GB3145 sous UV à 254 nm et à 365 nm, après
pulvérisation du réactif à la vanilline sulfurique et à 365 nm après pulvérisation du réactif de
Neu.
III. Résultats et discussion
65
A
B
C
D
Fig. 59 : CCM réalisées dans un mélange Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2), A : révélation à 254
nm, B : révélation à 365 nm, C : révélation après vaporisation de vanilline sulfurique, D :
révélation à 365 nm après pulvérisation du réactif de Neu.
Ainsi, nous pouvons constater qu’il y a deux types de profils phytochimiques :
- Un profil regroupant les lots 1016, GB3141 et GB3144.
- Un second profil regroupant les lots 1032, GB3142, GB3143 et GB3145.
Activités in vitro sur P. falciparum
Les extraits AcOEt des 7 lots sont testés in vitro sur P .falciparum et les résultats sont
présentés dans le Tableau 3 suivant :
Lots CI 50 en µg/mL
1016 10 1032 30
GB3141 9.2 GB3142 28 GB3143 32 GB3144 10 GB3145 32
Tableau 3 : Résultats des tests in vitro sur P .falciparum des extraits AcOEt des différents
lots de P. hostmannianum.
III. Résultats et discussion
66
Etude botanique
Les différents lots sont envoyés au Pr. Ricardo Callejas-Posada en Colombie, spécialiste des
plantes de la famille des Piperaceae.
Bilan de l’étude comparative
Le Tableau 4 suivant récapitule les différents résultats concernant la comparaison des profils
CCM des différents lots avec ceux des lots 1016 et 1032, les activités biologiques et l’étude
botanique.
Lots herbiers Profils CCM identique au lot :
1016 ou1032
Actif ou inactif sur P.falciparum
Résultats de l’étude botanique
GB3141 1016 actif P. hostmannianum var. berbicense GB3142 1032 inactif P. hostmannianum
var. hostmannianum GB3143 1032 inactif P. hostmannianum
var. hostmannianum GB3144 1016 actif P. hostmannianum var. berbicense
GB3145 1032 inactif P. hostmannianum var. hostmannianum
Tableau 4: Récapitulatif de l’étude comparative des lots de Piper GB3141, GB3142,
GB3143, GB3144, GB3145.
Le Tableau 4 permet d’identifier deux variétés de Piper hostmannianum. Ainsi, les lots dont
les profils CCM sont identiques au lot 1016 (lot actif) sont identifiés comme P.
hostmannianum var. berbicense et ceux dont les profils CCM sont identiques au lot 1032 (lot
inactif) sont identifiés comme P. hostmannianum.
Les autres lots ont été extraits de la même façon et leurs profils CCM ont été comparés aux
lots 1016 (lot actif) et 1032 (lot inactif). Les lots dont le profil CCM était identique au lot
1016 ont été testés in vitro sur P. falciparum pour confirmation.
- Tous les lots de la seconde série récoltés en novembre 2005 avec un profil CCM
identique au lot 1032 sont inactifs, il s’agit donc de Piper hostmannianum.
III. Résultats et discussion
67
- Parmi les lots de la troisième série, récoltés en décembre 2005, les lots avec un profil
CCM identique au lot 1016 actif sont : GB3169, GB3169bis, GB3171, GB3174,
GB3179, GB3186, GB3187, GB3193 et odonne/delnatte6. Il s’agit donc de P.
hostmannianum var. berbicense.
Conclusion
Cette étude nous a permis de distinguer les deux variétés de Piper hostmannianum guyanaises
grâce à une étude comparative en botanique, en phytochimie (étude des profils CCM) et en
biologie (évaluation de l’activité antiplasmodiale). Ainsi, nous avons constaté que seulement
une des deux variétés est active in vitro sur P. falciparum. Il s’agit de la variété berbicense.
Notre étude phytochimique bioguidée a été tout d’abord réalisé sur le lot 1016 (500 g de
poudre de feuilles) et sur les autres lots actifs qui ont été rassemblés par la suite (au total : 988
g de poudre de feuilles). Ce nouveau lot reconstitué a été nommé 1016bis.
D. 3 Extraction
Après avoir pulvérisé les feuilles de P. hostmannianum var. berbicense, la poudre a été
lixiviée à froid successivement par du n-hexane, du chloroforme et du méthanol. Les résultats
des tests in vitro sur P. falciparum sont présentés dans le Tableau 5 :
Extrait Masse extrait en g (rendement en %)
CI 50 en µµµµg/mL
n-hexane 15 (3) 8 Chloroforme 15 (3) 22
Méthanol 25 (5) 50 Tableau 5 :Résultats in vitro sur P. falciparum des extraits bruts
de P. hostmannianum var. berbicense.
L’extrait le plus actif est l’extrait hexanique. Les molécules les plus actives sont donc très
certainement des molécules apolaires.
Les profils CCM des extraits hexanique (H) et chloroformique (Ch) sont présentés Fig. 60.
III. Résultats et discussion
68
A B C D E
Fig. 60 : Profils CCM des extraits hexanique et chloroformique. A : 254 nm, B :365
nm, C : 365 nm après pulvérisation du réactif de Neu, D : Visible après pulvérisation
du réactif à la vanilline sulfurique, E : Visible après pulvérisation du réactif de
Dragendoorf.
Nous avons pu voir dans la partie bibliographique que les plantes du genre Piper sont connues
pour renfermer des alcaloïdes de type amide. Ainsi, nous avons révélé les CCM avec du
réactif de Dragendorff et aucune coloration brune n’est apparue. Par contre certains composés
réagissent positivement au réactif de Neu. Nous sommes donc en présence de polyphénols et
très certainement de flavonoïdes.
D’après la synthèse bibliographique, il doit très certainement s’agir de dérivés chalcones,
dihydrochalcones ou flavanones [Parmer et al., 1997].
Nous décidons donc de réaliser la purification de l’extrait hexanique puis de l’extrait
chloroformique par ordre d’activité décroissante.
D. 4 Purification
Plusieurs procédés de purification ont été employés concernant essentiellement des techniques
chromatographiques qui seront détaillées dans la partie Matériels et méthodes (colonne
ouverte, colonne moyenne pression, colonne haute pression etc..). Les fractions présentant des
profils identiques en CCM sont réunies et sont ensuite testées in vitro sur P. falciparum. Les
fractions qui se révèlent les plus actives sont ensuite purifiées.
H H Ch H H Ch Ch Ch H Ch
III. Résultats et discussion
69
D. 4. 1 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016
L’extrait hexanique étant le plus actif, nous avons réalisé sa purification en vue d’isoler la ou
les molécules responsables de cette activité. Pour un extrait brut, une CI50 de 8 µg/ml
démontre une activité tout à fait encourageante pour les principes actifs qu’il contient,
d’autant plus qu’ils sont dilués parmi des centaines d’autres molécules inactives.
L’extrait hexanique recueilli est concentré à sec sous pression réduite (15 g), puis fractionné
grossièrement par chromatographie sur colonne ouverte de silice, éluée successivement par un
mélange Hex/AcOEt (de 100% Hex à 100% AcOEt) puis par 100% de MeOH. Onze
fractions sont obtenues, notées F1 à F11 (Fig. 61).
UV à 365 nm après pulvérisation du réactif de
Neu. Eluant : Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)
Visible après pulvérisation du réactif à la
vanilline sulfurique. Eluant :
Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)
Fig. 61 : CCM bilan des 11 fractions obtenus suite au premier fractionnement sur l’extrait
hexanique (la première fraction correspond à l’extrait hexanique).
Les molécules les plus apolaires sont éluées en premier puis viennent les molécules les plus
polaires. Les composés présents dans les dernières fractions (F10 et F11) ne migrent pas car
elles sont trop polaires pour ce système de solvant (Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)).
Chacune des fractions est évaluée in vitro sur P. falciparum et les résultats sont présentés dans
le Tableau 6 suivant :
ExtH F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11
III. Résultats et discussion
70
Fractions Masse en g des fractions CI50 en µg/ml
F1 4.9 9
F2 0.42 12.2
F3 2.03 10.1
F4 1.12 17
F5 0.49 20
F6 0.89 25
F7 2.74 20
F8 0.37 16
F9 0.91 17
F10 0.67 17
F11 0.56 27
Tableau 6: Résultats des tests in vitro sur P. falciparum pour les fractions F1 à F11. Les
valeurs d’CI50 sont relatives à la souche chloroquino-résistante FcB1.
Nous décidons de purifier :
- Dans un premier temps les fractions F1 et F3 car il s’agit des fractions les plus actives
et elles sont parmi les plus importantes en quantité. Il semble que les composés actifs
soient apolaires. Leur réaction positive au réactif de Neu en CCM nous permet
d’envisager la présence de flavonoïdes antiplasmodiaux.
- Dans un second temps, les fractions F4’ et F5’ (équivalente en CCM aux fractions F4
et F5) obtenues après purification de l’extrait hexanique du lot 1016bis..
D. 4. 1. 1 Purification de la fraction F1 (Fig. 62)
A partir de la fraction F1 (CI50= 9 µg/ml), nous réalisons une colonne moyenne pression de
silice normale que nous éluons successivement par un mélange Hex/AcOEt (de 100% Hex à
100 % AcOEt) puis par 100% de MeOH. Treize fractions sont obtenues dont les plus actives
sont les fractions F1.2 (1350 mg, CI50= 3.8 µg/ml), F1.3 (92 mg, CI50= 3.3 µg/ml) et F1.4
(167 mg, CI50= 4.2 µg/ml).
III. Résultats et discussion
71
Purification de la fraction F1.2
Deux composés purs ont été isolés, Host1 (10 mg, CI50=5.9 µg/ml) et Host2 (20 mg,
IC50=51.5 µg/ml) après avoir réalisé successivement deux purifications sur des cartouches
greffées C18 (Vac elut) éluées par un mélange MeOH/H2O.
F1 4900 mg
F1.1 27 mg
F1.2 1350 mg
F1.4 167 mg
F1.3 92 mg
F1.5 104 mg
F1.6 99 mg
F1.8 402 mg
F1.10 210 mg
F1.9 115 mg
F1.11 112 mg
F1.13 128 mg
F1.12 590 mg
F1.3.4 20 mg
F1.3.3 12 mg
F1.3.2 20 mg
F1. 3.1 17 mg
Host3 1.7 mg
Host4 1.8 mg
Host5 1.5 mg
F1. 4.3 26 mg
F1.4.1 18 mg Host7
30 mg
F1. 2.8 36 mg
F1. 2.7 13 mg
F1.2.6 26 mg
F1. 2.5 12 mg
F1. 2.3 38 mg
F1. 3.4 159 mg
F1. 2.1 5 mg
Host1 10 mg
Host2 20 mg
F1. 2.3.1 5 mg
F1. 2.3.3 6 mg
F1. 2.3.2 2 mg
Vac elut C18 MeOH/H2O (85/15)
Vac elut C18 MeOH/H2O (85/15)
Vac elut C18 MeOH/H2O (80/20)
Host6 1.5 mg
HPLC semi-préparative MeOH/H2O
F1.7 106 mg
100 % Hex 98/2 98/2 97/3 97/3 97/3 90/10 90/10 80/20 80/20 50/50100 % AcOEt
100 % MeOH
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
80/20 85/15 90/1085/15 90/10 93/7 98/2 100 % MeOH
Vac elut C18 MeOH/H2O
F1 4900 mg
F1.1 27 mg
F1.2 1350 mg
F1.4 167 mg
F1.3 92 mg
F1.5 104 mg
F1.6 99 mg
F1.8 402 mg
F1.10 210 mg
F1.9 115 mg
F1.11 112 mg
F1.13 128 mg
F1.12 590 mg
F1.3.4 20 mg
F1.3.3 12 mg
F1.3.2 20 mg
F1. 3.1 17 mg
Host3 1.7 mg
Host4 1.8 mg
Host5 1.5 mg
F1. 4.3 26 mg
F1.4.1 18 mg Host7
30 mg
F1. 2.8 36 mg
F1. 2.7 13 mg
F1.2.6 26 mg
F1. 2.5 12 mg
F1. 2.3 38 mg
F1. 3.4 159 mg
F1. 2.1 5 mg
Host1 10 mg
Host2 20 mg
F1. 2.3.1 5 mg
F1. 2.3.3 6 mg
F1. 2.3.2 2 mg
Vac elut C18 MeOH/H2O (85/15)
Vac elut C18 MeOH/H2O (85/15)
Vac elut C18 MeOH/H2O (80/20)
Host6 1.5 mg
HPLC semi-préparative MeOH/H2O
F1.7 106 mg
100 % Hex 98/2 98/2 97/3 97/3 97/3 90/10 90/10 80/20 80/20 50/50100 % AcOEt
100 % MeOH
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
80/20 85/15 90/1085/15 90/10 93/7 98/2 100 % MeOH
Vac elut C18 MeOH/H2O
Fig. 62 : Schéma de purification de la fraction F1.
Purification de la fraction F1.3
Quatre composés ont été isolés Host3 (1.7 mg, CI50= 33.5 µg/ml), Host4 (1,8 mg, CI50= 100
µg/ml, Host5 (1.5 mg, CI50= 97.5 µg/ml) et Host6 (1.5 mg, CI50= 29 µg/ml) suite à une
purification sur une cartouche C18 Vac elut éluée en mode isocratique par un mélange
MeOH/H2O (85/15) suivie d’une HPLC semi-préparative (RP-18, débit : 3 ml/min ; t=0 min
80% MeOH ; t=10 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux conditions initiales).
III. Résultats et discussion
72
Purification de la fraction F1.4
Un composé a été isolé, Host7 (30 mg, CI50= 3.0 µg/ml) après une purification sur une
cartouche C18 Vac elut® éluée en mode isocratique par un mélange MeOH/H2O (85/15).
D. 4. 1. 2 Purification de la fraction F3 (Fig. 63)
F3 2030 mg
F3.1 1100 mg
F3.2 800 mg
F3. 2..2 500 mg
F3.2.1 108 mg
F3. 2.1..1 32 mg
F3. 2.1..2 8 mg
F3. 2.1.3 12 mg
Host8 4 mg
Host9 10 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
Colonne sephadex LH20 100 % CHCl3
MPLC silicé gréfée C18 MeOH/H2O (60/40)
HPLC semi-préparative MeOH/H2O
F3 2030 mg
F3.1 1100 mg
F3.2 800 mg
F3. 2..2 500 mg
F3.2.1 108 mg
F3. 2.1..1 32 mg
F3. 2.1..2 8 mg
F3. 2.1.3 12 mg
Host8 4 mg
Host9 10 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
Colonne sephadex LH20 100 % CHCl3
MPLC silicé gréfée C18 MeOH/H2O (60/40)
HPLC semi-préparative MeOH/H2O
Fig. 63 : Schéma de purification de la fraction F3.
La fraction F3 (2.03 g, CI50=10.1 µg/ml) est purifiée par chromatographie d’exclusion en
utilisant du Sephadex (LH20) éluée par 100% de CHCl3. La fraction F3.2 est purifiée de la
même façon pour éliminer les traces de pigments résiduels. Après une purification sur
colonne moyenne pression de silice greffée C18 et une HPLC semi-préparative (RP-18, débit :
3 ml/min, mode isocratique MeOH/H2O 60/40), les deux composés Host8 (4 mg, CI50= 100
µg/ml) et Host9 (10 mg, CI50= 3.4 µg/ml) sont isolés.
D. 4. 2 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016bis
Nous travaillons les fractions F4’ (3.05 g) et F5’ (2.17 g), (équivalentes en CCM aux fractions
F4 et F5) moins actives mais qui présentent des composés majoritaires. Ces deux fractions
III. Résultats et discussion
73
sont issues de la purification du lot 1016bis dont le protocole d’extraction est identique au lot
1016.
Remarque : masse poudre de feuilles : 988 g ; obtention de 30 g d’extrait hexanique.
D. 4. 2. 1 Purification de la fraction F4’ (Fig. 64)
F4’ 3050 mg
F4.1 1800 mg
F4.4 93 mg
F4.4 135 mg
F4.2 975 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
F4.1.2 215 mg
F 4.1.1 638 mg
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
F4.1.2.1 3 mg
F4.1.2.2 7 mg
F4.1.2.3 110 mg
F4.1.2.4 17 mg
F4.1.2.5 28 mg
F4.1.2.6 9 mg
F4.1.2.7 30 mg
Vac elut C18 MeOH/H2O (70/30)
Host11 20 mg
Host10 20 mg
Colonne sephadex
LH20 100 % CHCl3
98/2 96/4 90/10 80/20 50/50 100 % Ae 100 % MeOH
F4’ 3050 mg
F4.1 1800 mg
F4.4 93 mg
F4.4 135 mg
F4.2 975 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
F4.1.2 215 mg
F 4.1.1 638 mg
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
F4.1.2.1 3 mg
F4.1.2.2 7 mg
F4.1.2.3 110 mg
F4.1.2.4 17 mg
F4.1.2.5 28 mg
F4.1.2.6 9 mg
F4.1.2.7 30 mg
Vac elut C18 MeOH/H2O (70/30)
Host11 20 mg
Host10 20 mg
Colonne sephadex
LH20 100 % CHCl3
98/2 96/4 90/10 80/20 50/50 100 % Ae 100 % MeOH
Fig. 64 : Schéma de purification de la fraction F4’.
La fraction F4’ (3.05 g, CI50=17 µg/ml) est purifiée par chromatographie d’exclusion en
utilisant du Sephadex® (LH20) éluée par 100% de CHCl3. la fraction F4.1 obtenue est à
nouveau purifiée sur LH20. Les deux fractions F.4.1.2 et F.4.2 sont réunies car elle présentent
le même profil en CCM. Après une purification sur colonne moyenne pression de silice
normale (élution par un mélange Hex/AcOEt), et une purification sur une cartouche greffée
C18 (élution par un mélange MeOH/H2O 70/30), deux composés Host10 (20 mg, CI50=12
µg/ml) et Host11 (20 mg, CI50=4.7 µg/ml) sont isolés.
III. Résultats et discussion
74
D.4.2.2 Purification de la fraction F5’ (Fig. 65)
F5’ 2170 mg
F5.1 1600 mg
F5.2 218 mg
F5. 1.2 315 mg
F 5.1.1 608 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
Colonne sephadex LH20 100 % CHCl3
F4.4 7.7 mg
Host12 50 mg
F4.2 86 mg
50/50 50/50 75/25
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
(50/50 puis 25/75)
F5’ 2170 mg
F5.1 1600 mg
F5.2 218 mg
F5. 1.2 315 mg
F 5.1.1 608 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
Colonne sephadex LH20 100 % CHCl3
F4.4 7.7 mg
Host12 50 mg
F4.2 86 mg
50/50 50/50 75/25
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
(50/50 puis 25/75)
Fig. 65 : Schéma de purification de la fraction F5.
La fraction F5’ (2.17 g, CI50=20 µg/ml) est purifiée par chromatographie d’exclusion en
utilisant du Sephadex® (LH20) éluée par 100% de CHCl3. la fraction F5.1 obtenue (riche en
pigments) est à nouveau purifiée sur LH20. Les deux fractions F.5.1.2 et F.5.2 sont réunies
car elle présentent le même profil en CCM. Après une purification sur colonne moyenne
pression de silice normale (élution Hex/AcOEt 50/50 puis 25/75), le composé Host12 (50 mg,
CI50=4.6 µg/ml) est isolé.
D.4.3 Purification de l’extrait chloroformique du lot 1016
Ce travail a été effectué avec la collaboration d’un stagiaire de Master II Recherche, Mickaël
Meyniel. Pour cet extrait, nous n’avons pas pu faire de bioguidage pour cause d’engorgement
à la plateforme de biologie.
L’extrait chloroformique recueilli est concentré à sec sous pression réduite (15 g), puis
fractionné grossièrement par chromatographie sur colonne ouverte de silice, éluée
successivement par un mélange Hex/CHCl3, de 100% Hex à 100% CHCl3, puis 50/50
CHCl3/MeOH puis 100% MeOH. Dix fractions sont obtenues, notées G1 à G10 (Fig. 66).
III. Résultats et discussion
75
UV à 365 nm après pulvérisation du réactif de
Neu. Eluant : Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)
Visible après pulvérisation du réactif à la
vanilline sulfurique. Eluant :
Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)
Fig. 66 : CCM bilan des 10 fractions obtenues (la première fraction correspond à l’extrait
chloroformique brut)
Nous pouvons constater que nous avons également des composés qui réagissent positivement
au réactif de Neu supposant des molécules de type flavonoïde.
Fractions Masse en g des fractions
G1 0.18
G2 0.05
G3 0.01
G4 0.68
G5 1.09
G6 3.68
G7 0.95
G8 5.32
G9 0.08
G10 0.29
Tableau 7 : Bilan massique des fractions G1 à G10.
D’après le bioguidage réalisé sur l’extrait hexanique, les composés actifs sont de nature
apolaire, nous décidons par conséquent de purifier les fractions G5, G6 et G7.
ExtC G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10
III. Résultats et discussion
76
D. 4. 3. 1 Purification de la fraction G5
Comme le montre la CCM de la Fig. 67, la fraction F5 présente un composé majoritaire. Sa
comparaison en CCM avec les composés isolés de l’extrait hexanique laisse supposer qu’il
s’agit du composé Host9.
Fig. 67 : CCM comparative de F5 et Host9. Eluant Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2).
La fraction est purifiée sur colonne de silice normale avec 100% de CHCl3, et 900 mg du
composé Host9 sont obtenus.
D. 4. 3. 2 Purification de la fraction G6 (Fig. 68)
G6 3.6800 mg
G6.1 2100 mg
G6.2 930 mg
G6.3 350 mg
G6.2.1 410 mg
G6.2.2 370 mg
G6.2.3 150 mg
G6.2.2.1 150 mg
G6.2.2.3 30 mg
Host13 127 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
puis 100 % MeOH
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
puis 100 % MeOH
100 % CHCl3100 % CHCl3
100 % CHCl3100 % CHCl3
100 % CHCl3100 % CHCl3
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
puis 100 % MeOH
100 % MeOH
100 % MeOH
100 % MeOH
G6 3.6800 mg
G6.1 2100 mg
G6.2 930 mg
G6.3 350 mg
G6.2.1 410 mg
G6.2.2 370 mg
G6.2.3 150 mg
G6.2.2.1 150 mg
G6.2.2.3 30 mg
Host13 127 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
puis 100 % MeOH
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
puis 100 % MeOH
100 % CHCl3100 % CHCl3
100 % CHCl3100 % CHCl3
100 % CHCl3100 % CHCl3
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3
puis 100 % MeOH
100 % MeOH
100 % MeOH
100 % MeOH
Fig. 68 : Schéma de purification de la fraction G6.
III. Résultats et discussion
77
La fraction G6 (3.68 g) est purifiée par chromatographie d’exclusion en utilisant du
Sephadex® (LH20) éluée par 100% de CHCl3, puis par 100% de MeOH. Cette purification est
répétée encore deux fois sur les fractions suivantes G.6.2 et G.6.2.2 conduisant à l’isolement
du composé Host13 (127 mg, CI50= 23.5 µg/ml).
D. 4. 3. 3 Purification de la fraction G7 (Fig. 69)
G7 950 mg
G7.1 586 mg
G7.3 257 mg
G7.3.1 135 mg
G7.3.2 110 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3 puis 100 % MeOH
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3 puis 100 % MeOH
G7.3.2.4 25 mg
G7.3.2.3 13 mg
G7.3.2.2 42 mg
G7.3.2.1 15 mg
Host14 9.9 mg
HPLC semi-préparative MeOH/H2O
Host15 2.6 mg
Host16 7.7 mg
100 % CHCl3 100 % MeOH
100 % MeOH100 % CHCl3
75/25 50/50 25/75 100 % Ae
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
G7 950 mg
G7.1 586 mg
G7.3 257 mg
G7.3.1 135 mg
G7.3.2 110 mg
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3 puis 100 % MeOH
Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3 puis 100 % MeOH
G7.3.2.4 25 mg
G7.3.2.3 13 mg
G7.3.2.2 42 mg
G7.3.2.1 15 mg
Host14 9.9 mg
HPLC semi-préparative MeOH/H2O
Host15 2.6 mg
Host16 7.7 mg
100 % CHCl3 100 % MeOH
100 % MeOH100 % CHCl3
75/25 50/50 25/75 100 % Ae
MPLC Silice normale Hex/AcOEt
Fig. 69 : Schéma de purification de la fraction G7.
La fraction G7 (0.95 g) est purifiée par chromatographie d’exclusion en utilisant du
Sephadex (LH20) éluée par 100% de CHCl3, puis par 100% de MeOH. Nous répétons la
même purification pour la fraction G7.3. Trois composés sont isolés Host14 (9.9 mg, CI50=
23 µg/ml) , Host15 (2.6 mg, CI50= 28 µg/ml), Host16 (7.7 mg, CI50= 19 µg/ml) suite à une
purification sur colonne moyenne pression de silice normale (éluée par un mélange
Hex/AcOEt, 100% Hex jusqu’à 100% AcOEt, puis 100% MeOH) et une HPLC semi-
préparative éluée par un mélange MeOH/H2O (RP-18, débit : 3 ml/min ; t=0 min 60%
MeOH ; t=20 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux conditions initiales).
III. Résultats et discussion
78
D. 5 Détermination structurale
Au total, 16 composés (Fig. 70) ont été isolés dont treize proviennent de l’extrait hexanique
(Host1 à Host13) et trois proviennent de l’extrait chloroformique (Host14 à Host16).
Fig. 70 : CCM des composés Host1 à Host16 sous UV à 365 nm après pulvérisation
du réactif de Neu.
Pour faciliter les explications concernant la détermination structurale des composés isolés,
nous présenterons successivement l’identification des molécules de type dihydrochalcones
(dans l’ordre suivant : Host9, Host7, Host2, Host3, Host4 et Host5), chalcones (dans l’ordre
suivant, Host11, Host12 et Host6) et flavanones (dans l’ordre suivant Host1, Host8, Host10,
Host13, Host14, Host15 et Host16).
Remarque : L’élucidation des structures est basée sur les données spectroscopiques (UV, IR,
MS, RMN 1H, RMN 13C, COSY, HSQC, HMBC et NOESY).
III. Résultats et discussion
79
D. 5. 1 Détermination structurale des composés de type dihydrochalcone
D. 5. 1. 1 Détermination structurale du composé Host9
Ce composé se présente sous la forme de cristaux incolores (pf 178 °C, cristallisation dans le
CH2Cl2). Il réagit avec le réactif de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV à 365
nm laissant envisager une structure de type phénolique.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le spectre UV montre deux maxima d’absorption à 230 nm et 290 nm correspondant aux
absorptions des deux cycles A et B de composés de type flavonoïde [Mabry et al., 1970]. Le
spectre infra-rouge indique la présence de groupements : hydroxyle (3264 cm-1), carbonyle
(1646 cm-1) et aromatique (1526 cm-1, 1497 cm-1 et 1466 cm-1) et montre également la
présence de bandes d’absorption des liaisons C-H aromatiques (3022 cm-1) et C-H
aliphatiques (2915 cm-1 et 2850 cm-1).
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Sur le spectre de masse réalisé en APCI en mode négatif, nous observons un ion quasi-
moléculaire à m/z 271 [M-H]- suggérant une masse atomique de 272 uma. Le spectre RMN du 13C (Fig. 71) enregistré en J-modulé indique la présence de 16 atomes de carbone dont 6
carbones quaternaires, 7 groupements CH, 2 méthylènes et un méthyle. L’ensemble de ces
informations nous permet d’attribuer au composé Host9 la formule brute C16H16O4 avec un
degré d’insaturation de 9.
III. Résultats et discussion
80
Fig. 71 : Spectre RMN du 13C en J-modulé du composé Host9 (125 MHz, DMSO-d6).
A ce stade, nous pouvons conclure que nous sommes en présence d’un flavonoïde de type
dihydrochalcone renfermant deux cycles aromatiques, une fonction carbonyle et deux
méthylènes à 45.6 ppm (C-α) et à 30.5 ppm (C-β) (Fig. 71).
De plus, le spectre RMN du 1H présente (Fig. 72):
-Un singulet d’intensité 1H à δH 12.3 ppm attribué à OH-2’ caractéristique d’une liaison
hydrogène intramoléculaire entre un phénol et un groupement carbonyle [Harborne, 1993].
-Un massif compris entre δH 7.25 ppm et 7.27 ppm intégrant pour quatre hydrogènes attribués
à H-2, H-3, H-5 et H-6 et un triplet d’intensité 1H à δH 7.19 ppm attribué à H-4 qui
correspondent à des signaux caractéristiques du cycle B d’un flavonoïde monosubstitué
[Mabry et al., 1970].
-Un singulet d’intensité 3H à δH 3.75 ppm correspondant à un groupement méthoxyle
aromatique.
III. Résultats et discussion
81
Fig. 72 : Spectre RMN du 1H du composé Host9 (500 MHz, DMSO-d6).
Il s’agit donc d’une dihydrochalcone dont le cycle B est non substitué et le cycle A substitué
par deux groupements hydroxyles et un groupement méthoxyle.
L’analyse des spectres RMN 2D HSQC et HMBC nous permet d’identifier le composé Host9
à la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone déjà isolée dans d’autres espèces de Piper
[Burke et Nair, 1986; Orjala et al., 1994] (Fig. 73).
OOH
OHO
2'
4' 6'
2
6 4
α
β
Fig. 73 : Structure de la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone , Host9.
III. Résultats et discussion
82
D. 5. 1. 2 Détermination structurale du composé Host7
Ce composé se présente sous la forme d’une huile incolore et réagit positivement au réactif de
Neu pour donner une fluorescence marron-orangé sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 210 nm et 290 nm. Le spectre IR
présente les mêmes bandes d’absorption que le composé Host9.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse obtenue en APCI en mode négatif présente un ion quasi-moléculaire de
rapport m/z 407 [M-H]- suggérant une masse moléculaire de 408 uma. Le spectre MS/MS de
cet ion présente trois ions fils majoritaires respectivement à m/z 389 (perte de 18 uma), m/z
349 (perte de 58 uma) et m/z 337 (perte de 70 uma) (Fig. 74).
Fig. 74 : Spectre MS/MS du composé Host7 enregistré en APCI en mode négatif.
Le spectre de RMN du 13C en J-modulé (Fig. 75) présente en plus des 15 atomes de carbone
du noyau dihydrochalcone et du groupement -OCH3, 10 atomes de carbone supplémentaires
par rapport au composé Host9 : un carbone quaternaire (δC 141.7 ppm) quatre groupements
CH (δC 124.51 ppm, 43.8 ppm, 34.9 ppm, 28.12 ppm) deux méthylènes (δC 30.8 ppm, 46.4
III. Résultats et discussion
83
ppm) et trois méthyles (δC 24.1 ppm, 21.9 ppm, 16.4 ppm), ce qui nous permet d’envisager
une formule brute de C26H32O4 avec un degré d’insaturation de 11. Ce substituant
supplémentaire présente alors une formule brute équivalente à C10H18 (en rajoutant un atome
d’hydrogène) suggérant une structure de type monoterpène.
Fig. 75 : Spectre de RMN du 13C du composé Host7 (100 MHz, CDCl3).
Le spectre RMN du 1H présente les mêmes signaux que le composé Host9 :
-Un singulet à δH 13.7 ppm attribué à OH-2’.
-Un massif de protons aromatiques entre δH 7.31 et 7.35 ppm attribué aux protons
aromatiques du cycle B.
-Un singulet à δH 6.07 ppm attribué au H-3’.
-Un singulet intégrant pour 3H δH à 3.81 ppm attribué à un groupement méthoxyle
aromatique.
-Un multiplet à δH 3.42 ppm attribué au CH2-α.
III. Résultats et discussion
84
-Un triplet à δH 3.03 ppm attribué au CH2-β.
Ainsi l’ensemble de ces signaux confirment une structure de type 2’,6’-dihydroxy-4’-
méthoxydihydrochalcone [Burke et Nair, 1986] (Fig. 76).
OOH
OHO
2'
4' 6'
2
6 4
α
β
Fig. 76 : 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone.
De plus, le spectre 1H indique :
-Un groupement isopropyle : deux méthyles à δH 0.82 et 0.85 ppm sous forme de doublet (J=
6.7 Hz) et un groupement CH à δH 1.49.
-Un méthyle vinylique à δH 1.8 ppm sous forme de singulet.
-Deux groupements méthylènes sous forme de multiplets entre δH 1.4-1.8 ppm et δH 2.12
ppm.
-Un groupement CH déblindé à δH 3.9 ppm sous forme de « doublet large ».
-Un proton éthylénique à δH 5.5 ppm sous forme de s.
L’ensemble de ces informations associées aux informations déduites de l’analyse du spectre
de RMN du 13C nous confirme la présence d’une sous-unité monoterpénique identifiée
comme étant un p-menthène.
Ainsi la perte de 70 uma observée dans le spectre MS/MS de l’ion moléculaire a été
interprétée comme résultant d’une réaction de type rétro-diels Alder au niveau du p-menthène
[Ichino, 1989] (Fig. 77) :
III. Résultats et discussion
85
+
70 umap-menthène
Fig. 77 : Réaction de type rétro Diels –Alder au niveau du p-menthène.
Ainsi le composé Host7 est une 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxy-dihydrochalcone substituée par
un unité p-menthène. L’étude des spectres HMBC et COSY va nous permettre de déterminer
la manière dont ces deux sous-unités sont liées.
le spectre RMN 2D HMBC (Fig. 78 et 80) montre que les carbones C-6’ (δC 159 ppm) et C-5’
(δC 109 ppm) corrèlent avec le proton à δH 3.9 ppm. Le carbone correspondant (d’après le
spectre HSQC) δC 35 ppm est donc directement relié par liaison C-C au cycle A de la sous-
unité dihydrochalcone. Ce carbone à δC 35 ppm est attribué au carbone C-5’’.
Fig. 78 : Agrandissement spectre HMBC corrélation du H-5’’ (δH 3.9 ppm).
III. Résultats et discussion
86
De la même manière, le H-5’’ corrèle aussi avec deux autres carbones : un carbone
quaternaire éthylénique à 141 ppm (qui porte le méhyle à δH 1.8 ppm) et un groupement CH à
δC 43.7 ppm. Ceci est confirmé grace à l’étude du spectre COSY (Fig. 79) qui démontre que
le H-5’’ corrèle avec trois protons : δH 1.56 ppm (CH à δC 43.7 ppm), δH 1.7 ppm (CH3 porté
par le carbone éthylénique à 141 ppm) et δH 5.5 ppm (proton éthylénique).
Fig. 79 : Agrandissement spectre COSY du composé Host7.
Ainsi, nous pouvons attribuer le carbone à δC 43.7 ppm au C-4’’, le carbone éthylénique à δC
141 ppm au C-1’’, le méthyle à 1.8 ppm au C-7’’ et le CH éthylénique au C-6’’. Il nous reste
à positionner le groupement isopropyle et deux groupements méthyles de l’unité p-menthène.
Les corrélations en HMBC (Fig. 80) nous permettent d’identifier le composé Host7 à la
méthyllinderatine déjà isolée des feuilles de Lindera umbellata (Lauraceae) [Ichino, 1989] et
de Piper aduncum [Orjala et al., 1993]. Cependant, dans ces deux plantes, la molécule ne
présente pas le même pouvoir rotatoire, elle existe sous deux formes énantiomèriques. La
mesure du pouvoir rotatoire (αD= -41°, CHCl3, c=0.1) confirme qu’il s’agit de la (-)-
III. Résultats et discussion
87
méthyllindératine (Fig. 80) (et non de la (+)-méthyllindératine) déjà isolée des feuilles de
Piper aduncum.
OOH
OHO
H
H
6'
2'
4'
5''
7''
6'' 5'' 9''
10''
4'' 8''
α
β
4
Fig. 80 : Structure de la (-)-méthyllindératine et corrélations HMBC du composé Host7.
III. Résultats et discussion
88
D. 5. 1. 3 Détermination structurale du composé Host2
Ce composé a été obtenu sous la forme de cristaux jaunes (pf 58-60°C prismes, cristallisation
dans le MeOH). Il réagit positivement au réactif de Neu pour afficher une fluorescence jaune
en UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 234 nm et 292 nm. Le spectre infra-
rouge présente les mêmes bandes d’absorption que les deux composés précédemment
identifiés Host9 et Host7.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse haute résolution enregistré ESI–Q-TOF-HRMS en mode négatif présente
un ion quasi-moléculaire de m/z 407.2242 (calculé 407.2222) [M-H]- en accord avec la
formule brute C26H32O4. Il s’agit d’un isomère du composé Host7.
Bien que le composé semble être pur en CCM, l’ensemble des signaux des spectres RMN du 1H et du 13C sont dédoublés (Fig. 81) suggérant la présence de deux composés. Après
plusieurs essais de séparation selon différentes techniques chromatographiques, nous n’avons
pas réussi à les séparer.
D’après l’intégration des signaux en RMN du 1H , nous sommes donc en présence d’un
mélange d’isomères dont le rapport est de l’ordre de 55/45 L’élucidation structurale est basée
sur les signaux du composé majoritaire nommé Host2a (par défaut le composé minoritaire
sera nommé Host2b).
III. Résultats et discussion
89
Fig. 81: Spectre de RMN du 13C du composé Host2 (125 MHz, CDCl3).
Le spectre de RMN du 1H présente les signaux caractéristiques d’une 2’,6’-dihydroxy-4’-
méthoxydihydrochalcone [Burke et Nair, 1986]: δH 13.90 (OH-2’, 1H, s), 7.21-7.29 (5H, m,
cycle B), 3.06 (H-β, 2H, t), 3.49 (H-α, 2H, m), 6.02 (H-3’,1H, s), 3.83 (OCH3, 3H, s).
Le spectre de RMN du 13C confirme les signaux de la sous-unité dihydrochalcone et montre
dix signaux supplémentaires: trois méthyles (δC 29.2 ppm, 20.9 ppm et 22.1 ppm), trois
méthylènes (δC 30.1 ppm, 20.5 ppm et 35.3 ppm), trois groupements CH (δC 44 ppm, 27.2
ppm et 26.3 ppm) et un carbone quaternaire (δC 77.9 ppm) déblindé, portant très certainement
un atome d’oxygène.
Comme le composé Host7, le composé Host2 est une dihydrochalcone substituée par une
unité monoterpénée et plus particulièrement par une unité p-menthane et non p-menthène du à
l’absence de signaux éthyléniques.
D’après le nombre d’insaturations et l’absence de doubles liaisons éthyléniques, la sous unité
p-menthane et la sous-unité dihydrochalcone sont reliées entre elles en formant un cycle. Les
III. Résultats et discussion
90
expériences de RMN 2D COSY, HSQC et HMBC vont nous permettre de déterminer les
différents points de liaisons des deux sous-unités.
Fig. 82 : Agrandissement du spectre HMBC du composé Host2.
Comme pour le composé Host7, une corrélation en HMBC est observée entre le carbone δC
106.8 ppm (C-5’) et le proton à δH 3.39 ppm, nous permettant d’attribuer celui-ci au proton H-
5’’. Ainsi la première liaison entre les deux sous-unités est une liaison C-C entre le carbone
C-5’ et le carbone C-5’’. De plus, les protons du groupement méthyle δC 29.2 ppm (δH 1.37
ppm) corrèlent en HMBC (Fig. 82) avec le carbone C-6’ (δC 158.9 ppm) et le carbone
quaternaire à δC 77.9 ppm. Nous pouvons alors conclure que le méthyle à δC 29.2 ppm
correspond au C-7’’ et le carbone quaternaire à δC 77.9 ppm correspond au carbone C-1’’.
Ainsi, l’unité p-menthane est reliée à l’unité dihydrochalcone selon une liaison C-O entre le
carbone C-1’’ et l’oxygène porté par le carbone C-6’. Un cycle à six est alors formé entre la
sous-unité p-menthane et la sous-unité dihydrochalcone.
III. Résultats et discussion
91
Les structures des composés Host2a et Host2b sont confirmées suite à une analyse aux
Rayons X (Fig. 83).
Fig. 83: Diagramme ORTEP de Host2a et Host2b. Les atomes d’oxygène sont représentés en
rouge.
La Fig. 83 montre que le monoterpène adopte une conformation chaise dans laquelle le
groupement méthyle est en position équatoriale pour les deux isomères. Par contre le
groupement isopropyle est en position axiale dans le composé majoritaire Host2a et en
position équatoriale dans le composé minoritaire Host2b. En effet, le spectre NOESY
confirme ces résultats car des corrélations sont observées entre les protons H-5’’ et H-4’’ sur
le spectre du composé Host2a.
Les structures de ces deux composés Host2a et Host2b (Fig. 84) sont nouvelles dans le règne
végétal. Il s’agit respectivement des composés 2’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4β-isopropyl-
1β-méthyl-cyclohexane-1-O-5-yl) dihydrochalcone et 2’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4α-
isopropyl-1β-méthyl-cyclohexane-1-O-5-yl) dihydrochalcone [Portet et al., 2007].
1'
2'3'
4'5'
6'
7"
8"9" 10"
1
23
4
56
1"
2"3"4"
5" 6"
α
β
O
OOH
O
O
OOH
O
Fig. 84 : Structure des composés (a) : Host2a et (b) : Host2b.
(a) (b)
III. Résultats et discussion
92
D. 5. 1. 4 Détermination structurale du composé Host3
Ce composé se présente sous la forme d’une poudre blanche. Il réagit également positivement
au réactif de Neu pour donner une fluorescence orangée sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 232 nm et 292 nm, et le spectre IR
présente les mêmes bandes que le composé Host9.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse enregistré en ESI-Q-TOF-HRMS indique un ion quasi-moléculaire en
mode positif m/z 425.2286 [M+H]+ (calculé 425.2328) en accord avec la formule brute
C26H32O5. Le composé Host3 présente donc un atome d’oxygène supplémentaire par rapport
aux composés Host7 et Host2.
L’étude des spectres de RMN 1H et 13C ainsi que leur comparaison avec les spectres des
composés précédents confirme qu’il s’agit d’un dérivé 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxy-
dihydrochalcone substitué par un monoterpène en position C-5’ : nous pouvons observer des
corrélations en HMBC avec les carbones C-5’ (δC 112.9 ppm) et C-6’ (δC 161.7 ppm) et un
proton à δH 3.07 ppm attribué au H-5’’.
En ce qui concerne la partie monoterpénée, le spectre RMN du 13C révèle deux méthylènes à
δC 30.3 ppm et 19.4 ppm, trois groupements CH à δC 46.8 ppm, 41.1 ppm et 89.2 ppm au lieu
de trois méthylènes (δC 35.3 ppm (C-2’’), 20.5 ppm (C-3’’), 30.1 ppm (δC C-6’’) et deux
groupement CH (δC 44 ppm (C-4’’) et 27.2 ppm (C-5’’)) observés précédemment pour le
composé Host2a. Ainsi, les différences entre les composés Host3 et Host2 concernent la
substitution de l’unité p-menthane sur l’unité dihydrochalcone et la présence d’un atome
d’oxygène supplémentaire.
Le caractère déblindé du groupement CH à δC 89.2 ppm suggère qu’il porte un atome
d’oxygène ou une fonction alcool. De plus l’expérience de RMN 2D COSY révèle que le
III. Résultats et discussion
93
proton H-5’’ (δH 3.07 ppm, t) couple avec le proton δH 4.54 ppm (porté par le carbone δC 89.2
ppm) avec une constante de couplage de J= 5.7 Hz. Ainsi, ce proton peut être attribué au
proton H-6’’. La sous-unité dihydrochalcone est ainsi reliée à la sous-unité p-menthane au
niveau d’une liaison C-C (C-5’/C-5’’) et d’une liaison C-O-C (C6’-O-C6’’) pour former un
cycle à cinq atomes comme l’adunctin E déjà isolé des feuilles de Piper aduncum [Orjala et
al., 1993].
OOH
OO
OHH H
1''
2''3''4''
5'' 6''
7''
8''
9''
10'' H
2'
4' 6'
Fig. 85 : Interactions NOE pour le composé Host3.
De plus, le spectre NOE révèle des intéractions (Fig. 85) entre le proton H-4’’ (δH 1.19
ppm)/H-5’’ (δH 3.07 ppm), H-5’’ (δH 3.07 ppm)/H-6’’ (δH 4.54 ppm) et H-6’’ (δH 4.54
ppm)/H-7’’ (δH 1.41 ppm). Ainsi la configuration relative au niveau des carbones C-4’’/C-5’’
et C-1’’/C-7’’ peut être établie montrant que le groupement isopropyle et le groupement
méthyle sont en position TRANS l’un de l’autre (Fig. 85) (alors que dans l’adunctin E les deux
groupement sont en position CIS).
L’ensemble des données précédentes a permis d’établir la structure du composé Host3 (Fig.
84) . C’est un diastéréoiosomère de l’adunctin E, il s’agit de la rel-(1’’ R,4’’R,5’’S,6’’S)-2’-
hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1-méthyl-cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl)
dihydrochalcone, nouveau composé naturel [Portet et al., 2007].
III. Résultats et discussion
94
D. 5. 1. 5 Détermination structurale du composé Host4
Ce composé présente exactement les mêmes caractéristiques spectrales que le composé
Host3 : même spectre UV, même spectre infra-rouge, même spectre de masse. Néanmoins il
ne présente pas le même Rf en CCM et, en ce qui concerne la spectrométrie de RMN 1H et 13C , les mêmes signaux sont obtenus avec de légères différences au niveau des déplacements
chimiques (Fig. 86).
Fig. 86: Spectre RMN du 1H du composéHost4
(500 MHz, CDCl3).
Dans le cas du composé Host4, le proton H-5’’ apparaît sous la forme d’un doublet dédoublet
avec comme constantes de couplage J= 10.4, 5.7 Hz. Dans ce cas le H-5’’ et le H-4’’ sont en
position TRANS l’un de l’autre alors que le H-5’’ est en position CIS avec le H-6’’. Nous
retrouvons ainsi la configuration de l’adunctine E déjà isolée par Orjala et al. [1993] (Fig.
87).
Ces résultats sont confirmés par le spectre NOESY dans lequel aucune corrélation n’est
observée entre le H-5’’ et le H-4’’.
III. Résultats et discussion
95
Le composé Host4 correspond donc à l’adunctine E (Fig. 87) :
OOH
OO
OHH H
1''
2''3''4''
5'' 6''
7''
8''
9''
10''
2'
4' 6'
Fig. 87: Structure du composé Host4 (aduntine E).
D. 5. 1. 6 Détermination structurale du composé Host5
Ce composé présente les mêmes caractéristiques spectrales que les composés Host3 et Host4
en ce qui concerne la spectroscopie UV , infra-rouge et spectrométrie de masse. Il présente la
même formule brute C26H32O5.
L’étude des données spectrales de RMN 1H et 13C ainsi que leur comparaison avec les
données des composés précédents montre qu’il s’agit d’un dérivé de la 2’,6’-dihydroxy-4’-
méthoxy-dihydrochalcone substituée au niveau du C-5’ par un monoterpène (corrélations
observés en HMBC entre le carbone C-5’ (δC 113.17 ppm) et le proton à δH 3.12 ppm attribué
au H-5’’).
L’étude comparative des deux spectres de RMN du 13C des composés Host5 et Host3 (Fig.
88) révèle deux différences majeures concernant un carbone quaternaire et un groupement
CH. Dans le cas du composé Host3, le carbone quaternaire C-1’’ et le groupement CH C-6’’
présentent respectivement des déplacements chimiques de δC 81.9 ppm et de 89.2 ppm alors
que dans le cas du composé Host5, les carbones équivalents présentent des déplacements
chimiques de δC 69.3 ppm et δC 92.4 ppm (δH 4.16 ppm).
III. Résultats et discussion
96
Fig. 88 : Comparaison des spectres RMN du 13C des composés Host3 et Host5
(125 MHz, CDCl3).
De plus, le spectre RMN du 1H présente deux signaux correspondant à des phénols à 13.26
ppm et 13.59 ppm. Ces deux protons sont attribués au groupements phénoliques OH-2’ et
OH-6’. Ainsi la sous –unité dihydrochalcone est reliée par une seule liaison C-C (C-5’/C-5’’)
et le carbone C-1’’ et le carbone C-6’’ présente un pont époxyde Fig. 89.
OOH
OHO
OH
H
1''
2''3''4''
5'' 6''
7''
8''
9''
10'' H
2'
4'6'
Fig. 89: Structure du composé Host5 et
corrélations observées sur le spectre NOESY.
III. Résultats et discussion
97
Le spectre 2D NOESY présente des corrélations entre le H-5’’ (δH 3.12 ppm)/H-6’’ (δH 4.16
ppm) et H-6’’ (δH 4.16 ppm)/H-7’’ (δH 1.39 ppm). De plus, le H-5’’ présente deux constantes
de couplage à J=5.7 Hz et 11 Hz. Ainsi la configuration relative au niveau des carbones
C-1’’/C-7’’ et C-4’’/C-5’’ peut être établie : le groupement isopropyle et le groupement
méthyle sont donc en position CIS l’un de l’autre (Fig. 88).
L’ensemble des données précédentes nous permet ainsi d’établir la structure du composé
Host6 comme étant la rel-(1’’ R,4’’S,5’’S,6’’R)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-
(4-isopropyl-1,6-epoxy-1-méthyl-cyclohexane-5-yl) dihydrochalcone.
III. Résultats et discussion
98
D. 5. 1. 7 Bilan des molécules isolées de type dihydrochalcone
Au total 7 dihydrochalcones ont été isolées dont six d’entre elles sont substituées par un
monoterpène ce qui en fait leur originalité. Les composés Host2a, Host2b, Host3 et Host 5
sont des molécules nouvelles (en rouge dans les tableaux). Les déplacements chimiques
relatifs aux atomes d’hydrogène et aux atomes de carbone sont rassemblés dans les Tableaux
8 et 9 ci-dessous. Host9 Host7 Host2a Host2b Host3 Host4 Host5
500 MHz, DMSO d6 400 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3DihydrochalconeH-2 to H-6 7.19-7.27 m 7.23-7.31 m 7.21-7.29 m 7.21-7.29 m 7.21-7.31 m 7.21-7.31 m 7.21-7.29 mH- α 3.33 t (7.5) 3.42 ddd (7.3, 4.9, 1.6) 3.49 m 3.49 m 3.41 m 3.37 m 3.37 mH-β 2.91 t (7.5) 3.03 t (7.3) 3.06 t (8.0) 3.06 t (8.0) 3.07 t (7.9) 3.06 t (7.9) 3.05 t (7.5)H-3' 5.97 s 6.07 s 6.02 s 6.01 s 6.09 s 6.07 s 6.06 s H-5' 5.97 s / / / / / /
OH-2' 12.33 s 13.74 s 13.90 s 13.90 s 13.26 s 13.26 s 13.26 s
OCH3-4' 3.75 s 3.81 s 3.83 s 3.80 s 3.84 s 3.84 s 3.84 s
MonoterpeneHa-2" / 2.12 m 1.74 m 1.99 m 1.79 m 2.01 m 1.78 m
Hb-2" / / 1.61 m 1.53 m 1.68 m 1.60 m 1.67 m
Ha-3" / 1.79 m 1.53 m 1.63 m 1.21 m 1.33 m 1.42 m
Hb-3" / 1.4 m / / 1.67 m 1.37 m /
H-4" / 1.56 m 1.21 m 1.24 m 1.11 m 1.08 m 1.08 mH-5" / 3.39 m 3.39 m 3.49 m 3.07 t (5.7) 3.10 dd (11, 5.7) 3.12 dd (11, 5.7)Ha-6" / 5.50 s 1.91 dd (13.4, 3.4) 1.81 m / / /Hb-6" / / 1.51 dd (13.4, 5.3) 1.73 m 4.54 dd (5.7,1.2) 4.52 dd (5.7,1.2) 4.16 dd (5.7,1.2)
CH3-7" / 1.81 s 1.36 s 1.37 s 1.41 s 1.46 s 1.39 s
H-8" / 1.49 m 1.78 m 1.22 m 1.88 m 1.85 m 1.87 mCH3-9" / 0.82 d (6.7) 1.08 d (6.8) 1.09 d (6.6) 0.90 d (7.0) 0.86 d (7.0) 0.92 d (7.0)
CH3-10" / 0.85 d (6.7) 0.97 d (6.8) 0.75 d (6.6) 0.86 d (7.0) 0.83 d (7.0) 0.86 d (7.0)
Tableau 8: Déplacements chimiques en RMN du 1H des protons des composés Host9, Host7,
Host2a, Host2b, Host3, Host4 et Host5.
III. Résultats et discussion
99
Host9 Host7 Host2a Host2b Host3 Host4 Host5125 MHz, DMSO d6 100 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3
Dihydrochalcone1 142.0 142.2 141.8 141.8 141.2 141.3 141.32/6 128.8 128.6 128.3 128.3 128.2 128.4 128.43/5 128.7 128.8 128.4 128.4 128.6 128.3 128.34 126.3 126.1 125.9 125.8 126.3 126.0 126.0α 45.6 46.4 45.5 45.5 44.2 44.7 43.7β 30.5 30.8 30.7 30.7 30.6 30.1 30.2C=O 205.1 205.2 204.9 204.8 203.4 203.3 203.31' 105.0 106.1 104.7 104.9 102.7 102.7 102.72' 164.5 165.2 158.9 159.3 165.5 165.3 165.33' 93.7 92.2 91.2 91.0 92.9 92.9 92.84' 165.9 163.9 162.3 163.2 161.3 161.6 161.95' 93.7 109.1 106.8 103.5 112.9 112.9 113.26' 164.5 158.8 165.4 165.3 161.7 161.8 161.9CH3O 55.8 55.8 55.7 55.1 55.5 55.5 55.5
Monoterpene
1" / 141.7 77.9 76.7 81.9 80.9 69.32" / 30.8 30.1 36.9 30.3 31.8 35.33" / 22.3 27.2 28.4 19.4 17.2 17.24" / 43.8 44.0 49.9 46.8 46.3 46.65" / 34.9 20.5 22.5 41.1 39.8 39.66" / 124.5 35.3 40.2 89.2 87.6 92.47" / 24.1 29.2 28.7 21.2 22.0 28.28" / 28.12 26.3 29.6 26.9 27.2 27.29" / 16.4 20.9 22.4 15.3 15.4 15.4
10" / 21.9 22.1 20.4 21.8 21.8 21.8
Tableau 9: Déplacements chimiques en RMN du 13C des carbones des composés Host9,
Host7, Host2a, Host2b, Host3, Host4 et Host5.
III. Résultats et discussion
100
D. 5. 2 Détermination structurale des composés de type chalcone
D. 5. 2. 1 Détermination structurale du composé Host11
Ce composé a été obtenu sous la forme de cristaux orange (aiguilles, pf 124 °C, cristallisation
dans le MeOH). En CCM, ce composé présente une coloration jaune après révélation au
réactif de Neu en lumière visible, et aucune flurorescence n’est observé à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 300 nm et 340 nm. Ces deux absorptions
correspondent aux absorptions des cycles A et B d’un flavonoïde où le cycle B est conjugué
avec une double liaison C=C.
Le spectre infra-rouge indique la présence de groupements : hydroxyle (3369 cm-1), carbonyle
(1628 cm-1), éthylénique (1606 cm-1) et aromatique (1541 cm-1, 1495 cm-1 et 1450 cm-1). Il
montre également la présence de bandes d’absorption des liaisons C-H éthyléniques (3100
cm-1), aromatiques (3022 cm-1) et C-H aliphatiques (2915 cm-1 et 2850 cm-1).
Ces premières informations indiquent que nous sommes en présence d’un flavonoïde et
certainement d’une chalcone. L’étude des spectres RMN du 1H et du 13C nous permettra de
confirmer cette hypothèse.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif présente un ion quasi-moléculaire m/z
297 [M-H]- suggérant une masse atomique de 298 uma. Le spectre de RMN du 13C (Fig. 90)
enregistré en J-modulé indique la présence de 18 atomes de carbones dont 8 carbones
quaternaires, 7 groupements CH, et trois méthyles. L’ensemble de ces informations nous
permet d’attribuer au composé Host11 la formule brute C18H18O4 avec un degré
d’insaturation de 10.
III. Résultats et discussion
101
Fig. 90 : Spectre RMN du 13C du composé Host11 enregistré en J-modulé
(75 MHz, CDCl3).
A ce stade, nous pouvons confirmer que nous sommes en présence d’un flavonoïde de type
chalcone renfermant deux cycles aromatiques, une fonction carbonyle et deux groupements
CH éthyléniques à 142.9 ppm (C-β) et à 128.8 ppm (C-α) (Fig. 90).
De plus, le spectre de RMN du 1H présente (Fig. 91):
-Un signal singulet à 13.6 ppm d’intensité 1H attribué à OH-2’ caractéristique d’une liaison
hydrogène intramoléculaire entre un groupement phénol et une fonction carbonyle [Harborne,
1993].
-Un doublet dédoublé à δH 8.01 ppm (J= 15.6, 3 Hz) d’intensité 1H attribué à H-α [Harborne,
1993].
-Un doublet dédoublé à δH 7.86 ppm (J= 15.6, 1.5 Hz) d’intensité 1H attribué à H-β
[Harborne, 1993].
III. Résultats et discussion
102
-Un multiplet d’intensité 1H entre δH 7.63 et 7.66 ppm attribué à H-4, un multiplet d’intensité
4H entre 7.39 et 7.70 ppm attribué à H-2, H-3, H-5 et H-6 caractéristique du cycle B d’un
flavonoïde monosubstitué [Mabry et al., 1970].
-Un singulet d’intensité 3H à δH 3.67 ppm caractéristique d’un groupement méthoxyle
aromatique.
- Deux singulets d’intensité 3H à δH 2.16 et 2.18 ppm caractéristique de deux groupements
méthyles substitué sur un cycle aromatique.
Fig. 91 : Spectre RMN du 1H du composé Host11 (300 MHz, CDCl3).
Nous sommes donc en présence d’une chalcone dont le cycle B est non substitué et le cycle A
est substitué par deux méthyles, deux hydroxyles et un méthoxyle. L’étude du spectre de
RMN 2D HMBC va nous permettre de positionner les différents substituants sur le cycle A.
Les corrélations observées en HMBC (Fig. 92) montrent que le proton à δH 13.6 ppm (OH-2’)
corrèle avec le carbone à 162.1 ppm: il s’agit donc du carbone C-2’. De plus, ce carbone ainsi
que les carbones à δC 159.2 ppm et δC 106.7 ppm corrèlent avec les protons du groupement
III. Résultats et discussion
103
méthyle à 2.16 ppm. Ainsi, les carbones à δC 159.2 ppm et δC 106.7 ppm sont respectivement
attribués aux carbones C-4’ et C-3’.
De la même façon, le carbone à δC 159.2 ppm (C-4’) ainsi que les carbones à δC 158.9 ppm et
108.9 ppm corrèlent avec les protons du groupement méthyle à δH 2.18 ppm. Ainsi, les
carbones à δC 158.9 ppm et δC 108.9 ppm sont respectivement attribués aux carbones C-6’ et
C-5’.
De plus, le carbone à δC 158.9 ppm (C-6’) corrèle avec les protons du groupements
méthoxyles à δH 3.67 ppm. Ainsi, le groupement méthoxyle est substitué sur le carbone C-6’
et les deux groupements OH sur les positions C-2’ et C-4’. Les positions C-3’ et C-5 sont
substituées par les deux groupement méthyles.
OOH
OHO
2'
4'6'
α
β 2
46
Fig. 92: Corrélations HMBC du composé Host11 (2’,4’-dihydroxy-3’,5’-diméthyl-6’-
méthoxychalcone).
L’ensemble des données précédentes nous permet ainsi d’établir la structure du composé
Host11 comme étant de la 2’,4’-dihydroxy-3’,5’-diméthyl-6’-méthoxychalcone (Fig. 92). Ce
composé a déjà été isolé des feuilles de Syzygium samarangense (Myrtaceae) [Resurreccion-
Magno et al., 2005] de Psorothamnus polydenius (Fabaceae) [Salem et Werbovetz, 2005] et
des écorces de Cyathocalyx crinatus [Shibata et al., 2000] (Annonaceae). C’est la première
fois que cette chalcone est isolée d’une espèce de la famille des Piperaceae.
III. Résultats et discussion
104
D. 5 .2. 2 Détermination structurale du composé Host12
Ce composé a été obtenu sous la forme de cristaux jaune-orangé (aiguilles, pf 145 °C). En
CCM, il prend une couleur jaune après révélation au réactif de Neu en lumière visible, et
aucune fluorescence n’est observée sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Les données des spectres UV et IR sont identiques à celles du composé Host11.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Nous observons sur le spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif un ion quasi-
moléculaire m/z 283 [M-H]- suggérant une masse molaire de 284 uma. L’étude du spectre de
RMN 13C enregistré en J-modulé (Fig. 93) révèle la présence de 17 carbones dont 6 carbones
quaternaires, 8 groupements CH et deux méthyles. L’ensemble de ces informations permet
d’attribuer au composé Host12 la formule brute C17H16O4 avec un degré d’insaturation de 10.
Ainsi le composé Host12 a un groupement méthyle de moins que le composé Host11.
Fig. 93: Comparaison des spectres RMN du 13C des composés Host12 et Host11 (75 MHz,
CDCl3 et acétone-d6.
III. Résultats et discussion
105
Comme le montre la Fig. 93, la différence majeure entre les deux spectres RMN du 13C des
composés Host11 et Host12 concerne la région des carbones aromatiques entre δC 90 ppm et
110 ppm.
Ainsi, le composé Host12 présente deux carbones quaternaires à δC 103.7 ppm et 105.3 ppm
et un groupement CH aromatique (δC 90.8 ppm) au lieu de trois carbones quaternaires
aromatiques à δC 106.6 ppm (C-3’), 108.9 ppm (C-5’) et 109.1 ppm (C-1’) dans le cas du
composé Host11.
L’ensemble de ces informations suggère que le composé Host12 est une chalcone dont le
cycle B est non substitué et le cycle A substitué par deux groupements hydroxyles, un
groupement méthoxyle et un méthyle.
Les corrélations HMBC (Fig. 94) nous permettent de positionner les différents substituants.
Ainsi le proton à δH 14.5 ppm (OH-2’) corrèle avec le carbone à 165.7 ppm: il s’agit donc du
carbone C-2’. De plus, ce carbone ainsi que les carbones à δC 162.7 ppm et δC 103.7 ppm
corrèlent avec les protons du groupement méthyle à 2.02 ppm. Ainsi, les carbones à δC 162.7
ppm et δC à 103.7 ppm sont respectivement attribués aux carbones C-4’ et C-3’. Les protons
du groupement méthoxyle corrèlent avec le carbone à δC 161 ppm que nous pouvons attribuer
par déduction au carbone C-6’.
OOH
OHO
2'
4'6'
α
β 2
46
Fig. 94: Structure et corrélations HMBC observées pour le composé Host12 :
2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone.
L’ensemble des données précédentes nous permet ainsi d’établir la structure du composé
Host12 comme étant la 2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone (ou stercurensine)
déjà isolée dans des plantes de la famille des Myrtaceae dont Syzygium samarangense
(Myrtaceae) [Mustafa et al., 2005; Resurreccion-Magno et al., 2005]. Comme pour la
chalcone précédente, celle-ci n’avait jamais été isolée des plantes de la famille des Piperaceae.
III. Résultats et discussion
106
D. 5. 2. 3 Détermination structurale du composé Host6
Ce composé se présente sous la forme d’une huile jaune. En CCM, il exhibe une couleur
jaune après révélation au réactif de Neu sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 230 nm et 290 nm. Le spectre IR révèle
la présence de groupements hydroxyles (3500 cm-1), d’une fonction ester (1700 cm-1), d’une
fonction carbonyle (1616 cm-1) et d’un cycle aromatique (1550 cm-1, 1500 cm-1, 1455 cm-1).
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse haute résolution obtenu en ESI-Q-TOF-HRMS en mode positif donne un
ion quasi-moléculaire à m/z 479.2367 (calculé 479.2434) [M+H]+ qui correspond à une masse
moléculaire de 478 uma avec une formule brute de C29H34O6 (degré d’insaturation de 13).
L’étude du spectre de RMN du 1H (Fig 95) révèle la présence de :
-Deux signaux singulets à δH 12.23 ppm et 12.06 ppm caractéristiques de deux protons
phénoliques [Harborne, 1993].
-Un multiplet intégrant pour 5H entre δH 7.06 ppm et 7.12 ppm caractéristique du cycle B
d’un flavonoïde monosubstitué [Mabry et al., 1970].
-Deux signaux intégrant chacun pour 1H à δH 5.13 ppm et 5.55 ppm caractéristiques de deux
protons éthyléniques.
-Un singulet intégrant pour 3H à δH 4.03 ppm caractéristique d’un méthyle en position α
d’une fonction ester.
-Un singulet intégrant pour 3H à δH 3.79 ppm caractéristique d’un groupement méthoxyle
aromatique.
III. Résultats et discussion
107
-Un singulet intégrant pour 3H à δH 1.90 ppm caractéristique d’un méthyle aromatique.
-Deux singulets intégrant pour 3H à δH 1.64 ppm et 1.73 ppm caractéristiques de deux
méthyles vinyliques.
Fig. 95: Spectre de RMN du 1H du composé Host6 (500 MHz, CDCl3).
De plus, le spectre RMN du 13C indique la présence de :
-Quatre méthylènes à δC 37.4 ppm, 37.3 ppm, 30.2 ppm, et 26.4 ppm.
-Deux groupements CH à δC 45.1 ppm et 51.5 ppm.
-Six carbones sp2 aromatiques attestant l’existence d’un second cycle aromatique.
L’ensemble de ces informations suggère que le composé Host6 est une « pseudo-chalcone »
dont le cycle B est non substitué, le cycle A totalement substitué et dont les groupements CH
α et β habituellement oléfiniques sont ici aliphatiques (δC 51.5 ppm et 45.1 ppm) laissant
supposer une substitution par un groupement prénylé (deux méthyles vinyliques, un proton
oléfinique et deux méthylènes). Cette hypothèse est confirmée par la comparaison des
III. Résultats et discussion
108
données spectrales de la partie terpénée du composé Host6 avec les données de la (+-)-
nicolaiodésine C (Fig. 96) isolée des racines de Renealmia nicolaioides (Zingiberaceae) [Gu
et al., 2002].
OOH
OHO
Fig.96 : Structure de la (+-)-nicolaiodesin.
Remarque : la numérotation utilisé dans l’attribution des carbones est la même que celle
adoptée pour la (+-)-nicolaiodesine (nomenclature IUPAC).
Les différences principales concernent le cycle A. Les corrélations HMBC et NOESY vont
nous permettre dans un premier temps de positionner les différents substituants sur le cycle A.
Les corrélations observées en HMBC (Fig. 97) montrent que le carbone à δC 108.6 ppm
corrèlent avec les protons du méthyle aromatique à δH 1.90 ppm et les deux hydrogènes des
groupements phénoliques à δH 12.06 ppm et 12.23 ppm. Ces considérations nous permettent
d’attribuer ce carbone au carbone C-5 et les deux groupements phénols sont ainsi portés
respectivement par les carbones C-4 et C-6. De plus, la présence d’un second proton à δH
12.06 ppm (OH-4) suggère que le proton de ce phénol interagit par liaison hydrogène avec la
fonction ester à δC 170.9 ppm. Nous pouvons alors positionner cette fonction méthyle ester en
position C-3 sur le cycle A. Le dernier substituant : le groupement méthoxyle est donc en
position C-2.
III. Résultats et discussion
109
OOH
HO
O O
O
2
3
4
56
6'
5'A
B
1'
Fig. 97: Corrélations observées en HMBC (ligne continue) et en NOE (ligne discontinue)
pour le composé Host6.
Concernant la position du substituant prénylé, des corrélations NOE sont observées entre les
protons du groupement méthoxyle et les protons H-5’ (δH 2.49 ppm) et H-6’(δH 4.21 ppm). La
chaîne prénylée est donc en position C-3’ comme dans la (+-)-nicolaiodesin.
La valeur de la constante de couplage J= 11 Hz pour H-1’ et H-6’ indique un couplage
TRANS diaxial entre les protons H-1’ et H-6’. La configuration relative du composé Host6 est
présentée Fig. 97.
L’ensemble des données précédentes nous permet d’identifier le composé Host6 comme étant
la (1’R*, 6’R*)-(4,6-dihydroxy-5-méthyl-3-methylester-2-méthoxyphényl)-(3’-isohexenyl-1’-
phénylcyclohex-3’-enyl) méthanone, nouveau composé naturel [Portet et al., 2007] (Fig. 97).
III. Résultats et discussion
110
D. 5. 2. 4 Bilan des molécules isolées de type chalcone
Au total 2 chalcones (Host11 et Host12) et une « pseudochalcone » (Host6) ont été isolées.
L’originalité structurale de ces molécules réside dans la présence de substituants méthyles sur
les cycles aromatiques. Ces trois composés ont été découvertes pour la première fois dans le
genre Piper et le composé Host6 est une molécule nouvelle (en rouge dans les tableaux
suivants). Les déplacements chimiques relatifs aux atomes d’hydrogène et aux atomes de
carbone sont rassemblés dans les Tableaux 10 et 11 ci-dessous.
Host11 Host12 Host6300 MHz, CDCl3 300 MHz, acétone d6 500 MHz, CDCl3
H-2, H-3, H-5, H-6 7.19-7.27 m 7.39-7.44 m 1' 3.11 ddd (6.4, 10.6, 10.6)
H-4 7.63-7.66 m 7.70-7.72 m 2' 2.25 a
H-α 8.01 dd (15.6, 3) 8.03 dd (15.6, 4.1) 4' 5.55 br s
H-β 7.86 dd (15.6, 1.5) 7.76 dd (15.6, 2.4) 5' 2.49 a
(CH3)C-3' 2.16 s 2.05 s 6' 4.21 (5.4, 10.2, 10.2)
(CH3)C-5' 2.18 s / 7'a 2.12 a
H-5' / 6.18 s 7'b 2.03 a
OH-2' 13.61 s 13.5 s 8' 5.13 (6.8)
OCH3-4' 3.67 s 3.94 s 10' 1.64 s
11' 1.73 s
12' 2.05, 2.13 m
2"/6" 7.12 a
3"/5" 7.12 a
4" 7.06 a
OH-6 12.23 s
OH-4 12.06 s
OCH3-2 3.79 s
CH3-5 1.90 s
C=O(CH3)-3 4.03 s
a la mutiplicité n’est pas précisée car les signaux ne sont pas bien définis.
Tableau 10: Déplacements chimiques en RMN du 1H des composés
Host11, Host12 et Host6.
III. Résultats et discussion
111
Host11 Host12 Host675 MHz, CDCl3 75 MHz, acétone d6 125 MHz, CDCl3
1 135.4 135.7 1 111.22/6 128.4 128.3 2 163.83/5 129.0 128.9 3 99.44 130.2 130.0 4 164.8α 128.8 127.8 5 108.6β 142.9 141.5 6 164.2C=O 193.4 192.4 7 210.81' 109.1 105.3 1' 45.12' 162.1 165.7 2' 37.33' 106.6 103.7 3' 137.44' 159.2 162.7 4' 118.95' 108.9 90.8 5' 30.26' 158.9 160.9 6' 51.5
CH3O 62.5 55.4 7' 37.4
(CH3)C-3' 7.6 6.2 8' 124.1
(CH3)C-5' 8.3 / 9' 131.7
10' 17.711' 25.812' 26.41" 143.82"/6" 127.53"/5" 128.14" 126.2
OCH3 65.2
(CH3)C-5 7.3
C=O 210.8OC=O 170.9
Tableau 11: Déplacements chimiques en RMN du 13C des composés
Host11, Host12 et Host6.
III. Résultats et discussion
112
D. 5. 3 Détermination structurale des composés de type flavanone
D. 5. 3. 1 Détermination structurale du composé Host1
Ce composé se présente sous la forme d’une poudre blanche. Il réagit positivement au réactif
de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Son spectre UV présente deux maxima d’absorption à 234 nm et 295 nm correspondant à
l’absorption des cycles A et B d’un flavonoïde [Mabry et al., 1970]. Le spectre IR indique la
présence de groupements : hydroxyle (3435 cm-1), carbonyle (1635 cm-1) et aromatique (1580
cm-1, 1550 cm-1), ainsi que des bandes d’absorptions des liasons C-H aromatiques,
éthyléniques (3050-3100 cm-1) et aliphatiques (2978 cm-1, 2957 cm-1).
Spectrométrie de masse et spectrométrie de RMN
Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif donne un ion m/z 391 [M-H]- qui
correspond à une masse de 392 uma. De plus, le spectre MS/MS (Fig. 98) révèle un ion m/z
321 indiquant une perte de 70 uma comme pour le composé Host7.
Fig 98 : Spectre MS/MS du composé Host1 enregistré en APCI en mode négatif.
III. Résultats et discussion
113
Cette information suggère que le composé Host1 présente une sous-unité p-menthène comme
le composé Host7 (la méthyllindératine).
Le spectre de RMN du 13C (Fig. 98) indique la présence de 25 carbones dont 8 carbones
quaternaires, 11 groupements CH, 3 méthylènes et trois méthyles. Le composé Host1 a donc
une formule brute de C25H28O4 avec un degré d’insaturation de 12.
Parmi les 25 carbones, nous distinguons les 10 carbones de la sous-unité p-menthène (signaux
en rouge sur la Fig. 99) [Ichino et al., 1990]:
-Le groupement isopropyle : deux méthyles à δC 16.4 ppm (C-9’’), 21.7 ppm (C-10’’) et deux
groupements CH à δC 27.9 ppm (C-8’’) et 44.0 (C-4’’).
-Deux méthylènes à δC 22.0 ppm (C-5’’) et 30.6 ppm (C-6’’).
-La double liaison et le méthyle vinylique à δC 23.7 ppm (C-7’’), 141.0 ppm (C-1’’), 124.4
ppm (C-2’’).
-Un groupement CH allylique à δC 34.3 ppm (C-3’’).
III. Résultats et discussion
114
Fig. 99 : Spectre de RMN du 13C du composé Host1 enregistré en J-modulé (100 MHz,
CDCl3).
De plus, le spectre RMN du 1H (Fig. 100) indique :
-Un singulet d’intensité 1H à δH 12.5 ppm caractéristique d’un proton d’un groupement
phénol qui réalise une liaison hydrogène avec une fonction carbonyle.
-Un massif d’intensité 5H entre δH 7.4-7.5 ppm caractéristique du cycle B non substitué d’un
flavonoïde [Mabry et al., 1970].
-Un singulet d’intensité 1H à δH 6.03 ppm caractéristique d’un proton du cycle A d’un
flavonoïde.
-Un doublet dédoublé d’intensité 1H à δH 5.4 ppm (J=12.9, 3.1 Hz).
-Un méthylène formant un système AB de deux dd à δH 3.09 ppm (J= 17.1, 12.9 Hz) et 2.83
ppm (J= 17.1, 3.1 Hz).
III. Résultats et discussion
115
Fig. 100 : Spectre de RMN du 1H du composé Host1 (500 MHz, CDCl3).
Nous sommes donc en présence d’un flavonoïde dont le cycle B est non substitué et le cycle
A est tétrasubstitué. Les déplacements chimiques des groupements CH et CH2 sont identiques
aux déplacements des carbones en position C-2 et C-3 d’une flavanone [Mabry et al., 1970].
Les signaux de RMN du 1H décrits précédemment sont dédoublés (Fig. 100) mais leur
intégration démontre qu’il n’y a qu’un seul composé et que la sous-unité flavanone est sous
forme racémique.
Les spectres enregistrés en RMN 2D (COSY, HSQC et HMBC) confirment la présence d’une
génine flavanone de type pinocembrine [Miyakado et al., 1976] (présence de groupements
hydroxyles en position 5 et 7). Les corrélations observées en HMBC vont nous permettre de
relier la sous-unité flavanone et la sous-unité p-menthène.
Dans le spectre HMBC (Fig. 101), le proton du groupement phénol à δH 12.5 ppm (OH-5)
corrèle avec les carbones à δC 164.7 ppm (C-5), δC 110.3 ppm (C-6) et δC 102.6 ppm (C-10)
et le carbone à δC 110.3 ppm (C-6) corrèle avec le proton à δH 3.9 ppm (H-3’’). De la même
façon, le proton de l’autre groupement phénol à δH 6.92 ppm (OH-7) corrèle avec les carbones
à δC 161.2 ppm (C-7), et δC 110.3 ppm (C-6). Par conséquent, l’unité p-menthène est relié à la
III. Résultats et discussion
116
génine flavanone au niveau du carbone C-6 en réalisant une liaison C-C entre le carbone C-6
de l’unité flavanone et le carbone C-3’’ de l’unité p-menthène.
Fig. 101 : Agrandissement du spectre HMBC du composé Host1.
La mesure du pouvoir rotatoire (αD= -32.5°, CHCl3, c=0.5) ainsi que les données précédentes
confirment que le composé Host1 est identifié comme étant la lindératone (Fig. 102) déjà
isolée des feuilles de deux variétés de Lindera umbellata (Lauraceae) [Ichino et al., 1990].
O
OOH
HO
5
7
1''
3''
5'' 8''
4'
Fig. 102 : Structure de la lindératone : Host1.
III. Résultats et discussion
117
D.5.3.2 Détermination structurale du composé Host8
Ce composé se présente sous la forme d’une poudre blanche. Il réagit positivement au réactif
de Neu en affichant une fluorescence marron-orangé sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Les données spectrales en UV et en IR sont identiques au composé Host1.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif donne un ion quasi-moléculaire m/z
269 [M-H]- suggérant une masse moléculaire de 270 uma. L’étude du spectre de RMN du 13C
enregistré en J-modulé atteste la présence de 16 carbones dont 7 carbones quaternaires, 7
groupements CH, un méthylène et un méthyle. Par déduction, ce composé a une formule brute
de C16H14O4 avec un degré d’insaturation de 10.
Le spectre RMN du 1H révèle :
-Un groupement phénol à δH 12.35 ppm (liaison hydrogène avec une fonction carbonyle
aromatique). La position 5 est donc substituée par un phénol [Harborne, 1993].
-Un cycle aromatique monosubstituée entre δH 7.4-7.5 ppm correspondant au cycle B d’un
flavonoïde [Mabry et al., 1970].
-Un proton aromatique à δH 6.03 ppm correspondant au cycle A d’un flavonoïde
pentasubstitué [Mabry et al., 1970].
-Un groupement CH à δH 5.43 ppm correspondant au H-2 d’une flavanone [Mabry et al.,
1970].
-Un méthyle avec deux protons non équivalents à δH 3.10 ppm et 2.85 ppm correspondant aux
protons H-3 d’une flavanone [Mabry et al., 1970].
III. Résultats et discussion
118
-Un méthyle aromatique à δH 2.09 ppm.
L’ensemble de ces informations indique que le composé Host8 est une flavanone dont le
cycle B est non substitué et le cycle A substitué par deux groupements OH et un méthyle. Les
corrélations observées en HMBC permettent de positionner les substituants sur le cycle A
(Fig. 103).
O
OOH
HO
H
5
7
2
3
Fig. 103 : Corrélations observées en HMBC pour le composé Host8.
Les informations précédentes ainsi que la mesure du pouvoir rotatoire confirme que le
composé Host8 est la 5,7-dihydroxy-6-méthylflavanone ou plus communément appelée
strobopinine déjà isolée des écorces de Piper hostmannianum [Diaz et al., 1987] (Fig. 103).
III. Résultats et discussion
119
D. 5. 3. 3 Détermination structurale du composé Host10
Ce composé se présente sous la forme de cristaux jaunes clairs. Il réagit positivement au
réactif de Neu pour afficher une fluorescence jaune sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Le composé présente les mêmes caractéristiques spectrales que le composé Host1.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif indique un ion m/z 283 [M-H]-
suggérant une masse de 284 uma. Il présente 14 uma de plus que le composé Host8 ce qui
permet d’attribuer au composé Host10 la formule brute C17H16O4 avec un degré
d’insaturation de 10.
La comparaison des spectres de RMN du 13C (Fig. 104) des composés Host10 et Host8
montre que les différences concernent la présence d’un méthyle aromatique et d’un carbone
quaternaire aromatique supplémentaires.
Fig. 104 : Comparaison des spectres du 13C des composés Host8 et Host10
(75 MHz, CDCl3).
III. Résultats et discussion
120
Ainsi la position en C-8 est substituée par un second méthyle aromatique.
L’ensemble des données précédentes nous permet d’identifier le composé Host10 comme
étant la 6,8-diméthyl-pinocembrine (Fig. 105) déjà isolée des écorces de Piper
hostmannianum [Diaz et al., 1987] et de certaines plantes de la famille des Myrtaceae
[Mustafa et al., 2005].
O
OOH
HO
Fig. 105 : Structure de la 6,8-diméthylpinocembrine : Host10.
III. Résultats et discussion
121
D.5.3.4 Détermination structurale du composé Host13
Ce composé se présente sous la forme d’une poudre blanche. Il réagit positivement au réactif
de Neu pour afficher une fluorescence jaune sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Les caractéristiques spectrales en UV et en IR sont identiques aux trois derniers composés. Il
s’agit donc d’un composé de type flavonoïde.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse obtenue en APCI en mode négatif donne un ion m/z 285 [M-H]-
suggérant une masse de 286 uma. Le spectre RMN du 13C enregistré en J-modulé révèle 16
carbones dont 7 carbones quaternaires, 7 groupements CH, un méthylène et un méthyle.
L’ensemble de ces informations confère au composé Host13 la formule brute C16H14O5 avec
un degré d’insaturation de 10.
Le spectre de RMN du 1H présente (Fig. 106):
-Un proton d’un groupement phénol à δH 12.04 ppm (liaison hydrogène avec une fonction
carbonyle aromatique). La position 5 est donc substituée par un phénol [Harborne, 1993].
-Quatre protons du cycle B d’un flavonoïde entre δH 6.9 ppm et 7.4 ppm [Mabry et al., 1970]
qui apparaissent sous la forme de deux doublet intégrant chacun pour 2H à δH 7.36 ppm et δH
6.9 ppm avec une constante de couplage de 8.7 Hz. Le cycle B est donc parasubstitué par un
phénol en C-4’.
-Deux protons du cycle A d’un flavonoïde entre δH 6.0 et 6.5 ppm [Mabry et al., 1970] qui
apparaissent sous la forme de deux doublets dédoublés intégrant chacun pour 1H à δH 6.05
ppm et 6.09 ppm avec des constantes de couplage de 2.3 Hz et 0.7 Hz. Il s’agit respectivement
des protons H-6 et H-8 du cycle A d’un flavonoïde.
III. Résultats et discussion
122
-Un proton à δH 5.37 ppm sous la forme de doublet dédoublé avec des constantes de couplage
de 13 Hz et 3 Hz. Il s’agit du proton H-2 d’une flavanone.
-Trois protons d’un méthoxyle aromatique sous la forme d’un singulet large à δH 3.8 ppm.
Comme le montre la Fig. 106, nous pouvons distinguer un doublet en haut du signal avec une
constante de 0.7 Hz. Ainsi, les protons du groupement méthyle couplent avec les protons H-6
et H-8 ce qui nous permet de positionner le méthoxyle en position 7 sur le cycle A.
Fig. 106 : Spectre RMN du 1H du composé Host13 (300 MHz, CDCl3).
Ainsi, l’ensemble de ces informations nous permet de dire que le composé Host13 est une
flavanone dont le cycle A est subsitué en 5 par un phénol et en 7 par un méthoxyle et dont le
cycle B est subsituée en 4’ par un phénol. L’étude des spectres RMN 2D (COSY, HSQC et
HMBC) confirme notre hypothèse.
III. Résultats et discussion
123
Nous pouvons alors identifier le composé Host13 comme étant la 5,4’-dihydroxy-7-
méthoxyflavanone (Fig. 107) ou plus communément appelée sakuranetine déjà isolée des
feuilles de Piper aduncum [Dutta et Som, 1978].
O
OOH
O
OH
Fig. 107 : Structure de la 5,4’-dihydroxy-7-méthoxyflavanone (sakuranetine, composé
Host13).
III. Résultats et discussion
124
D. 5. 3. 5 Détermination structurale du composé Host14
Ce composé a été obtenu sous la forme d’une poudre jaune pâle. Il réagit positivement au
réactif de Neu pour afficher une fluorescence bleu sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Les caractéristiques spectrales en UV et en IR sont identiques aux quatre flavanones
précédemment décrites.
Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN
Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif donne un ion quasi-moléculaire m/z 299
[M-H] - suggérant un masse de 300 uma. Le spectre RMN du 13C enregistré en J-modulé (Fig.
108) permet de déterminer la formule brute C17H16O5 avec un degré d’insaturation de 10.
La comparaison des spectre RMN du 1H et du 13C (Fig. 108) avec ceux du composé Host13
montre que le composé Host14 est une flavanone.
Fig. 108 : Comparaison des spectres RMN du 13C des composés Host13 (75 MHz, CDCl3) et
Host14 (125 MHz, MeOD).
III. Résultats et discussion
125
Les seules différences concernent l’absence de proton phénolique vers δH 12 ppm et la
présence d’un second méthoxyle aromatique (δH 3.86 ppm, δC 54.9 ppm) pour le composé
Host14.
Le second méthoxyle aromatique est donc positionné en C-5 ce qui explique l’absence de
proton phénolique vers δH 12 ppm (impossibilité de réaliser une liaison hydrogène avec la
fonction carbonyle).
L’ensemble des informations précédentes nous permet d’identifier le composé Host14 comme
étant la 4’-hydroxy-5,7-diméthoxyflavanone (Fig. 109) déjà isolée de Baccharis latifolia
(Asteraceae) [Bohlmann et Ates, 1984; Bohlmann et al., 1979] mais c’est la première fois que
ce composé est isolée au sein du genre Piper.
O
OO
O
OH
Fig. 109 : Structure de la 4’-hydroxy-5,7-diméthoxyflavanone : Host14.
III. Résultats et discussion
126
D. 5. 3. 6 Détermination structurale du composé Host15
Ce composé se présente sous la forme d’une poudre jaune pâle. Il réagit positivement au
réactif de Neu pour afficher une fluorescence bleu sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Les caractéristiques spectrales en UV et en IR sont identiques aux quatre flavanones
précédemment décrites.
Spectroscopie de masse et de RMN
Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif donne un ion quasi-moléculaire m/z 299
[M-H] - suggérant un masse de 300 uma. Il s’agit donc d’un isomère du composé Host15.
L’étude du spectre de RMN du 13C enregistré en J-modulé confirme la même formule brute
C17H16O5. Les spectres MS/MS des composés Host14 et Host15 sont présentés Fig. 110.
[M-H] -
[M-H-15]-[M-H-42]-
1,3B-
Spectre MS/MS de Host14
[M-H] -
[M-H-15]-[M-H-42]-
1,3B-
Spectre MS/MS de Host14
[M-H] -
Spectre MS/MS de Host15
[M-H-15]-
[M-H-30]-
[M-H-42]-1,3A- 1,2A-
[M-H] -
Spectre MS/MS de Host15
[M-H-15]-
[M-H-30]-
[M-H-42]-1,3A- 1,2A-
Fig. 110 : Spectres MS/MS des composés Host14 et Host15 obtenus en (-)-APCI.
III. Résultats et discussion
127
Nous pouvons constater que deux ions fils sont communs aux deux composés. Il s’agit de
l’ion m/z 284 et m/z 257 qui correspondent respectivement à une perte de 15 uma et 42 uma.
La perte de 15 uma correspond à la perte d’un méthyle et la perte de 42 uma correspond à la
perte de C2H2O caractéristique de la fragmentation des flavanones [Fabre et al., 2001].
Le composé Host14 présente un ion fils majoritaire à m/z 119 caractéristique de la perte d’un
p-hydroxyphényléthène [Hanaee et al., 1997]. Or dans le cas du composé Host15, cet ion
n’apparaît pas, ce qui prouve qu’il n’y a pas de groupement OH en position 4’ sur le cycle B
comme pour le composé Host14. Néanmoins, nous avons deux ions fils à m/z 165 et m/z 178
qui correspondent aux fragments 1,3A- et 1,2A- déjà identifiés dans des flavanones dont le cycle
A est substitué par un groupement phénol et un groupement méthoxyle [Fabre et al., 2001].
L’ensemble de ces informations apportées par la spectrométrie de masse nous permet
d’envisager une flavanone dont le cycle A est substitué par un OH et un méthoxyle et dont le
cycle B est substitué par un méthoxyle (en tenant compte de la formule brute).
L’étude des spectres de RMN va nous permettre de confirmer cette hypothèse. Les spectres de
RMN du 1H et du 13C sont identiques à ceux du composé Host14 avec de légères différences
au niveau des déplacements chimiques (Fig. 111).
Fig. 111 : Comparaison des spectres de RMN du 13C des composés Host14 et Host15
(125 MHz, MeOD).
III. Résultats et discussion
128
De plus, nous retrouvons, en plus des signaux des protons H-2 (δH 5.36 ppm) et H-3 (δH 2.68
ppm et 3.06 ppm) du cycle C:
-Aucun signal de proton phénolique vers δH 12 ppm.
-Quatre protons du cycle B entre δH 6.8 ppm et 7.3 ppm [Mabry et al., 1970] qui apparaissent
sous la forme de deux doublet intégrant chacun pour 2H à δH 7.33 ppm et δH 6.83 ppm avec
une constante de couplage de 8.7 Hz. Le cycle B est donc parasubstitué en C-4’.
-Deux protons du cycle A d’un flavonoïde entre δH 6.0 et 6.5 ppm [Mabry et al., 1970] qui
apparaissent sous la forme de deux doublets intégrant chacun pour 1H à δH 6.18 ppm et 6.20
ppm avec une constante de couplage de 2.3 Hz. Il s’agit respectivement des protons H-6 et H-
8 du cycle A.
-Deux groupements méthoxyles aromatiques à δH 3.85 ppm et 3.86 ppm, chacun sous forme
de singulet.
Ainsi, le composé Host15 est une flavanone dont :
-Le cycle A est substitué en C-5 et en C-7 par un groupement méthoxyle et un phénol.
-Le cycle B est substitué en C-4’ par un groupement méthoxyle.
Les spectres RMN 2D, COSY, HSQC et HMBC confirment cette hypothèse. L’ensemble des
données précédentes nous permet d’identifier le composé Host15 comme étant la 7-hydroxy-
4’,5-dimethoxyflavanone (Fig. 112) communément appelée tsugafoline déjà isolée des
feuilles de Tsuga diversifolia (Pinaceae) [Tanaka et al., 1989].
O
OO
HO
O
5
7
4'
Fig. 112 : Structure de 7-hydroxy-4’,5-dimethoxyflavanone : Host15.
III. Résultats et discussion
129
D. 5. 3. 7 Détermination structurale du composé Host16
Ce composé se présente sous la forme d’une poudre jaune pâle. Il réagit positivement au
réactif de Neu pour afficher une fluorescence bleu sous UV à 365 nm.
Spectroscopie UV et spectroscopie IR
Les caractéristiques spectrales en UV et en IR sont identiques aux quatre flavanones
précédemment décrites.
Spectroscopie de masse et de RMN
Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif donne un ion quasi-moléculaire m/z 283
[M-H] - suggérant un masse de 284 uma. Il s’agit donc d’un isomère du composé Host10.
L’étude du spectre RMN du 13C enregistré en J-modulé confirme qu’il s’agit d’une flavanone
avec la même formule brute que le composé Host10 : C17H16O4 avec un degré d’insaturation
de 10.
Le spectre de RMN du 1H montre :
-Aucun signal de proton phénolique vers δH 12 ppm.
-Un proton aromatique du cycle A à δH 6.15 ppm [Mabry et al., 1970].
-Le cycle B n’est pas substitué (massif intégrant pour 5H entre δH 7.36-7.54 ppm) [Mabry et
al., 1970].
-Un groupement méthoxyle aromatique à δH 3.81 ppm.
-Un méthyle aromatique à δH 2.02 ppm.
III. Résultats et discussion
130
Ainsi, le composé Host16 est une flavanone dont le cycle B est non substitué et le cycle A
substitué par un groupement méthoxyle, un phénol et un méthyle aromatique. L’étude des
spectres RMN 2D va nous permettre de positionner les différents substituants.
L’étude des corrélations HMBC (Fig. 113) révèle que le carbone à δC 160.4 ppm corrèle avec
les protons du groupement méthoxyle. L’absence de protons phénoliques vers δH 12 ppm
confirme qu’il n’y a pas de groupement phénol en C-5. Ainsi, le groupement méthoxyle est en
position 5 sur le cycle 1 et le carbone à δC 160.4 ppm est attribué au carbone C-5. De plus le
carbone C-5 et le carbone à δC 163.4 ppm corrèlent avec le proton à δH 6.15 ppm. Ainsi, le
carbone à δC 163.4 ppm est attribué au carbone C-7. Les protons du méthyle aromatique à δH
3.81 ppm corrèle avec le carbone C-7 et les carbones à δC 162.4 ppm et δC 104.4 ppm ce qui
nous permet d’attribuer respectivement ces carbones à C-9 et C-8.
O
OO
HO
5
7
8
Fig. 113 : Corrélations HMBC observées pour le composé Host16.
L’ensemble des informations précédentes nous permet d’identifier le composé Host16 comme
étant la 7-hydroxy-5-méthoxy-8-méthylflavanone (Fig. 113) déjà isolée des feuilles de
Pityrogramma pallida (Adiantaceae) [Markham, 1987]. C’est la première fois que ce
composé est isolé au sein du genre Piper.
III. Résultats et discussion
131
D. 5. 3. 8 Bilan des molécules isolées de type flavanone
Au total 7 flavanones ont été isolées dont l’originalité réside dans la présence de substituants
méthyles sur les cycles aromatiques pour trois d’entre elles (Host10, Host8 et Host 16). Les
déplacements chimiques en RMN relatifs aux atomes d’hydrogène et aux atomes de carbone
sont rassemblés dans les Tableaux 12 et 13 ci-dessous.
Host1 Host8 Host10 Host13 Host14 Host15 Host16
500 MHz, CDCl3 300 MHz, CDCl3 300 MHz, CDCl3 300 MHz, CDCl3 500 MHz, MeOD 500 MHz, MeOD 500 MHz, MeODFlavanoneH-2' - H-6' 7.4-7.5 m 7.4-7.5 m 7.4-7.44 m 7.36 d (8.6) 7.33 d (8.6) 7.43 d (8.6) 7.4-7.5 mH-3'- H-5' 7.4-7.5 m 7.4-7.5 m 7.4-7.44 m 6.90 d (8.6) 6.83 d (8.6) 7.00 d (8.6) 7.4-7.5 mH-4' 7.4-7.5 m 7.4-7.5 m 7.4-7.44 m / / / 7.4-7.5 mH- 2 5.43 dd (13, 3) 5.43 dd (13, 3) 5.43 dd (13, 3) 5.37 dd (13, 3) 5.36 dd (13, 3) 5.38 dd (13, 3) 5.45 dd (13, 3)H-3α 3.10 dd (17.1, 13) 3.10 dd (17.1, 13) 3.07 dd (17.1, 13) 3.10 dd (17.1, 13) 3.06 dd (17.1, 13) 3.08 dd (17.1, 13) 2.97 dd (17.1, 13)H-3β 2.84 dd (17.1, 3) 2.85 dd (17.1, 3) 2.87 dd (17.1, 3) 2.79 dd (17.1, 3) 2.68 dd (17.1, 3) 2.79 dd (17.1, 3) 2.77 dd (17.1, 3)H-6 / / / 6.09 dd (2.3, 0.7) 6.2 s 6.10 s 6.15 sH-8 6.04 s 6.03 s / 6.05 dd (2.3, 0.7) 6.19 s 6.11 s /OH-5 12.49 s 12.34 s 12.24 s 12.04 s / / /OH-7 6.93 s / / / / / /OCH3-5 / / / / 3.86 s 3.93 s 3.81 s
OCH3-7 / / / 3.83 d (0.7) 3.85 s / /
OCH3-4' / / / / / 3.88 s /
CH3-6 / 2.09 s 2.10 s / / / /
CH3-8 / / 2.09 s / / / 2.02 s
MonoterpeneH-2" 5.51 s large / / / / / /Ha-3" 3.90 d large / / / / / /
H-4" 1.56 m / / / / / /H-5" 1.45 m / / / / / /H-6" 2.15 m / / / / / /CH3-7" 1.80 s / / / / / /
H-8" 1.62 m / / / / / /CH3-9" 0.88 d (6.9) / / / / / /
CH3-10" 0.91 d (6.9) / / / / / /
Tableau 12 : Déplacements chimiques en RMN du 1H des composés Host1, Host8, Host10,
Host13, Host14, Host15 et Host16.
III. Résultats et discussion
132
Host1 Host8 Host10 Host13 Host14 Host15 Host16125 MHz, CDCl3 75 MHz, CDCl3 75 MHz, CDCl3 75 MHz, CDCl3 125 MHz, MeOD 125 MHz, MeOD 125 MHz, MeOD
Flavanone2 79.1 79.2 78.7 79.1 78.9 78.6 78.53 44.75 43.5 43.6 43.3 44.8 44.9 45.04 195.9 195.9 196.4 195.9 191.0 190.7 191.15 164.7 162.6 157.6 164.2 168.8 162.8 160.46 110.3 104.0 103.0 95.2 93.6 92.8 92.17 161.2 160.6 160.9 168.1 162.4 162.4 163.38 96.6 94.8 102.0 94.3 92.4 95.7 104.49 162.0 103.0 159.6 162.9 165.5 165.3 162.410 102.6 161.7 102.9 103.2 105.2 104.3 104.21' 138.7 138.5 139.3 130.9 129.7 131.1 139.62' 128.9 128.9 128.6 128.6 127.6 127.5 128.33' 128.7 128.8 128.8 115.7 114.9 113.6 128.04' 126.2 126.2 125.9 156.0 157.6 159.9 125.85' 128.7 128.8 128.8 115.7 114.9 113.6 128.06' 128.9 128.9 128.6 128.6 127.6 127.5 128.3OCH3-5 / / / / 54.9 54.8 54.7
OCH3-7 / / / 55.8 54.3 / /
OCH3-4' / / / / / 54.3 /
CH3-6 / 6.7 7.7 / / / /
CH3-8 / / 6.9 / / / 6.6Monoterpene1" 141.0 / / / / / /2" 124.4 / / / / / /3" 34.3 / / / / / /4" 44.0 / / / / / /5" 22.0 / / / / / /6" 30.6 / / / / / /7" 23.7 / / / / / /8" 27.9 / / / / / /9" 16.4 / / / / / /10" 21.7 / / / / / /
Tableau 13 : Déplacements chimiques en RMN du 13C des composés Host1, Host8, Host10,
Host13, Host14, Host15 et Host16.
III. Résultats et discussion
133
D. 6 Résultats des tests biologiques
D. 6. 1 Activités biologiques in vitro
L’ensemble des tests biologiques ont été effectuées à la plateforme de biologie de l’UMR-152
par Séverine Chevalley (Ingénieur en biologie) et par Eliane Pelissou (Technicienne en
biologie).
L’évaluation de l’activité antipaludique in vitro a été réalisée sur la souche chloroquino-
résistante FcB1. Les composés Host1 à Host9 ont également été testés sur la souche F32
chloroquino-sensible [Portet et al., 2007].
Les tests ont été effectués au moyen d’une technique radio-isotopique basée sur la méthode
décrite par Desjardins et al. |1979] et modifiée by Valentin et al. |1997]. Le test consiste à
utiliser comme indicateur de croissance des parasites, l’incorporation d’hypoxanthine tritiée
dans leur acide nucléïques. Les parasites sont maintenus en culture continue selon la méthode
décrite par Trager et Jensen [1976] (voir la partie Matériels et méthodes).
Le Tableau 14 présente les critères de sélection que nous avons choisis pour l’activité
antiplasmodiale (concernant des extraits) en fonction de la valeur de l’CI50 obtenue.
IC 50 en µg/ml Activité
<0.1 Très bonne
De 0,1 à 5 Bonne De 5 à 10 Modérée
>11 Inactif
Tableau 14 : Evaluation de l’activité antiplasmodiale en fonction de la valeur de l’CI50.
L’évaluation de la cytotoxicité a été réalisée sur une souche de cellules de tumeur mammaire
MCF-7. La méthode utilisée repose sur l’estimation de l’inhibition de la prolifération des
cellules par spectrophotométrie (voir la partie Matériels et méthodes). L’étude de la
cytotoxicité permet d’avoir des indications préliminaires sur la sélectivité des molécules. Le
Tableau 15 présenté à la page suivante résume les résultats in vitro sur l’ensemble des
composés isolés.
III. Résultats et discussion
134
P. falciparum Cellules humaines IS FcB1b IS F32c
F32 (2) FcB1 (2)a MCF7 (2)
Host1
10.33 ± 0.18 15.06 ± 9.38 52.29 ± 1.80 3.47 5.06
Host2
101.27 ± 4.56 125.23 ± 28.05 242.64 ± 3.46 1.94 2.4
Host3
68.4 ± 3.33 79.01 ± 11.67 153.30 ± 116.74 1.94 2.24
Host4
126.75 ± 4.21 233.49 ± 3.33 137.97 ± 138.42 0.59 1.09
Host5
229.95 ± 1.67 / 229.95 ± 1.67 1 /
Host6
55.44 ± 7.40 60.67 ± 8.89 120.29 ± 125.74 1.98 2.17
Host7
5.64 ± 1.04 5.27 ± 2.24 68.63 ± 10.4 13.02 12.17
Host8
168.52 23.57 366.48 4.98 281.48 125.71 0.76 2.19
O
OHO
OH
O
OOH
O
O
OO
OH
H HO H
O
OO
OH
H HOH
O
O HO
OH
H O
OOH
HO O
O O
O
OH
OH
OH
H
O
OOH
HO
P. falciparum Cellules humaines IS FcB1b IS F32c
F32 (2) FcB1 (2)a MCF7 (2)
Host9
12.69 ± 0.26 16.91 ± 2.60 187.51 ± 109.18 11.09 14.78
Host10
/ 37.32 ± 6.97 161.97 ± 14.9 4.3 /
Host11
/ 12.4 ± 4.74 27.68 ± 7.35 2.23 /
Host12
/ 11.61 ± 6.47 20.77 ± 4.48 1.79 /
Host13
/ 86.54 ± 6.18 / / /
Host14
/ 80 ± 4.71 / / /
Host15
/ 96.66 ± 4.71 / / /
Host16
/ 73.94 ± 9.96 / / /
OH
O HO
O
O
OOH
HO
OOH
HO O
OO H
HO O
O
OOH
O
O H
O
OO
O
O H
O
OO
HO
O
O
OO
HO
Extrait hexanique (CI 50 en µg/ml) / 8 ± 1 25 ± 3 3.12 /
Extrait chloroformique (CI 50 en µg/ml) / 22 ± 3 / / /CQ (CI50 en nM) 60 ± 10 145 ± 10 ND ND ND
DOX ND ND 0,4 ND ND
Tableau 15: Résultats des activités biologiques in vitro (en µM) pour les extraits et les molécules isolées.
III. Résultats et discussion
135
Comme le montre le Tableau 15, les molécules actives sur la souche FcB1 de P. falciparum
sont issues de l’extrait hexanique, il s’agit des composés Host1 (CI50= 5.9 µg/ml), Host7
(CI50= 2.15 µg/ml), Host9 (CI50= 4.6 µg/ml), Host11 (CI50= 4.7 µg/ml) et Host12 (CI50= 4.6
µg/ml). Nous n’avons pas concentré l’activité car les composés ont une activité proche de
celle de l’extrait hexanique de départ (CI50= 8 µg/ml). Nous pouvons supposer que l’activité
de l’extrait pourrait être due à la combinaison de plusieurs molécules ou à des composés
minoritaires présents dans l’extrait hexanique qui n’ont pas encore été identifiés.
L’activité antiparasitaire de flavonoïdes minoritaires C-alkylées ou C-prénylées a déjà été
reportée dans la littérature [Frölich et al., 2005; Yenesew et al., 2004] mais c’est la première
fois que des dérivés C-terpénés (Host1 et Host7) sont décrits comme possédant une activité
antiplasmodiale.
Les tests de cytotoxicité montrent que les composés actifs sont cytotoxiques surtout en ce qui
concerne les chalcones Host11 et Host12 qui ont des indices de sélectivité de l’ordre de 1.
D’autres auteurs ont démontré le potentiel cytotoxique du composé Host11 (avec des valeurs
de CI50 proches de celles obtenues dans le présent travail) sur des cellules cancéreuses KB.
[Qian et al., 2005] confirmant ainsi nos résultats.
De plus, le composé Host11 semblerait avoir un effet inhibiteur de la fonction MDR
(Multiple Drug Resistant) sur des cellules cancéreuses. Cet effet semble lié à une interaction
avec l’expression des ARN messagers des protéines MDR. D’autres pompes du même type
présentes chez le parasite pourraient être inhibées par Host11, on devrait aussi évaluer son
effet comme réverseur de la résistance à la chloroquine [Lakshmanan et al., 2005].
D. 6. 2 Activités biologiques in vivo
Les composés Host7 et Host9 sont les plus actifs in vitro et ont un indice de sélectivité
supérieur à 10. Ce potentiel (activité/sélectivité) nous a permis d’envisager un test in vivo
pour ces deux molécules [Likhitwitayawuid et al., 1993].
Le test utilisé est le test de Peters (voir partie Matériels et méthodes) qui consiste à inoculer
pendant quatre jours le produit à tester par voie intrapéritonéale à des souris infectées par P.
vinckei petteri [Peters, 1970].
III. Résultats et discussion
136
Les résultats sont présentés dans le Tableau 16 suivant :
Traitement Dose na Parasitémie moyenne b Taux d'inhibition Temps moyen de(mg. Kg. J) (± ecart-type) de parasitémie b survie (en jour)
Témoin 10 38 ± 13.7 / 7.7 ± 1.4
Host7 20 5 7.8 ± 6.7 80% 11.1 ± 1.59
20 5 5.4 ± 6.6 90% 12.6 ± 6.8Host9 10 5 16 ± 20 72% 15.2 ± 7.1
1 5 34 ± 22 40% 13.8 ± 5.8
CQc 10 5 0 100% > 215 5 0 100% 13.5 ± 0.51 5 33 ± 14,4 13% 7.1 ± 1.1
a Nombre de souris par groupe.
b à J4.
C Chloroquine.
Tableau 16 : Résultats des tests in vivo des composés Host7 et Host9 sur des souris infectées
par P. vinckei petteri.
Nous observons une diminution significative de la parasitémie : 80% pour le composé Host7
(20 mg/kg) et entre 40% et 90% pour le composé Host9 au J5. Pour le composé Host9 qui a
pu être testé à trois concentrations nous observons un effet-dose, avec une ED50 de 3.8 mg/kg
qui est proche de celle de la chloroquine (3 mg/kg).
Pour le composé Host7, le temps de survie est de trois jours et demi de plus par rapport au
témoin DMSO. Concernant le composé Host9, aux deux doses les plus élevées (10 et 20
mg/kg), le temps de survie est équivalent à celui des souris traitées par la chloroquine à la
dose de 5 mg/kg.
Ces résultats sont particulièrement encourageants mais montrent que la guérison n’est pas
complète aux doses testées. Il serait intéressant de retester les deux composés à des doses
supérieures pour obtenir 100% d’inhibition de parasitémie et obtenir une guérison totale des
souris. Il serait aussi intéressant d’envisager un traitement par voie orale.
Ainsi, bien que les résultats in vitro montraient une faible sélectivité (> 10), il semblerait que
les deux composés ne soient pas particulièrement toxiques pour la souris. Ces résultats sont
probablement dus au choix des cellules MCF-7. En effet, ces cellules sont, par comparaison à
d’autres lignées (CHO, A375, etc.), peu sensibles à l’action de xénobiotiques. Elles forment
III. Résultats et discussion
137
donc, en association avec la culture de P. falciparum un couple très sélectif en ce qui
concerne l’activité des produits.
Enfin, lorsque des tests in vivo sont réalisés, les composés sont métabolisés dans l’organisme
des souris avant d’atteindre la cible au niveau de la cellule, ce dernier point peut expliquer, en
partie les différences d’activités observées lors des test in vitro et in vivo.
D. 7 Bilan de l’étude phytochimique bioguidée de P. hostmannianum var.
berbicense
� Au total 17 molécules ont été isolées dont 3 chalcones, 7 dihydrochalcones et 7
flavanones. Cinq molécules sont nouvelles et présentent des structures originales
caractérisées par la combinaison d’une sous-unité dihydrochalcone et d’une sous-unité
terpénique.
� L’évaluation de l’activité antiplasmodiale des molécules isolées montre que les
molécules les plus actives ont des CI50 comprises entre 5 et 15 µM sur la souche FcB1
de P. falciparum.
� Deux molécules avec un indice de sélectivité égal ou supérieure à 10 ont pu être
évaluées in vivo sur des souris infectées par P. vinckei petteri et plus de 80%
d’inhibition de la parasitémie est observée après quatre jours de traitement. De plus, le
temps de survie des souris traitées par Host7 et Host9 est équivalent à celui des souris
traitées par la chloroquine à la dose de 5 mg/kg.
III. Résultats et discussion
138
E. Etude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et
flavanones par spectrométrie de masse
Ce travail est le résultat d’un stage de deux mois effectué au sein du laboratoire CHAM (unité
d’analyse physico-chimique des médicaments et pharmacognosie) à la faculté de médecine de
l’université catholique de Louvain à Bruxelles. Il a été encadré par le Professeur Joëlle
Quetin-Leclercq et le Professeur Jean-Louis Habib-Jiwan.
Le but de ce stage était d’étudier la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et
flavanones identifiées dans les feuilles de P. hostmannianum var. berbicense à l’aide de
témoins commerciaux de structure voisine.
Une meilleure connaissance de la fragmentation de ces composés permettra de mieux les
identifier dans un extrait brut de plante par LC/MS. Cette application fera l’objet de la
prochaine partie de ce manuscrit.
E. 1 Travaux préliminaires
L’ensemble des spectres de masse a été obtenu sur un spectromètre de masse à trappe d’ions.
Après avoir étudié l’ionisation des composés en ESI et en APCI selon les deux modes
d’ionisation (positif et négatif), nous avons pu constater que les meilleurs résultats* sont
obtenus en APCI en mode négatif.
Les paramètres d’ionisation et les conditions expérimentales sont présentés dans la partie
Matériels et méthodes.
* Remarque : les molécules s’ionisent beaucoup mieux en APCI qu’en ESI. La fragmentation
des ions en MSn est plus facile à interpréter dans le cas du mode négatif. De plus, l’utilisation
du mode négatif est largement favorisée dans l’étude de la composition d’un extrait de plante
par LC/MSn car il conduit généralement à une meilleure sélectivité et une meilleure
sensibilité [Fabre et al., 2001; Wolfender et al., 2000].
Nous allons étudier la fragmentation de trois classes de flavonoïdes (chalcone,
dihydrochalcone et flavanone) en adoptant la nomenclature de Ma et al. [1997] que nous
appliquons au squelette chalcone et dihydrochalcone comme le montre la Fig. 114. Les
III. Résultats et discussion
139
fragments obtenus sont de type A ou de type B (remarque : un fragment de type A correspond
à la perte du cycle B). L’exposant correspond à la coupure du (ou des) liaison(s) qui conduit à
l’obtention de ces fragments.
O
O
A
B
0 1
2
34
1,3 B-1,4 A-
1,3 A-
1,2 A-
0,3 A- R2
R1
O
A
B
R1
R2
01
2
3
0 A-
0 B-
1 A-
1 B-
2 A-
2 B-
Squelette flavanone Squelette (dihydro)chalcone
Fig. 114 : Nomenclature adoptée pour les fragments de type A ou B obtenus pour un squelette
flavanone ou un squelette (dihydro)chalcone.
En plus des fragments de type A ou B observés, nous parlerons de « perte de neutres ». Ce
terme considère les pertes de molécules neutres (CO, CO2, H2O) mais aussi les pertes de
radicaux (CH3 etc..).
Pour chaque classe de flavonoïde, un récapitulatif des ions significatifs sera établi en vue
d’élaborer (par MS et UV) une clé d’identification spécifique par type de flavonoïde étudié.
III. Résultats et discussion
140
E. 2 Etude de la fragmentation des chalcones par (-)-APCI
L’ensemble des molécules étudiées est présenté dans le Tableau 17 suivant :
OOH
HO O
Host11 (284 g/mole)
OOH
HO O
Host12 (298 g/mole)
OOH
HO O
OO
Host6 478 g/mole
O
TémoinC1 (Chalcone 208 g/mole)
OOH
TémoinC2 (2’-hydroxychalcone 224 g/mole)
O
O
TémoinC3 (4’-methoxychalcone 238 g/mole)
Chalcones isolées Chalcones témoins
Tableau 17
Seules quatre chalcones sur six s’ionisent (Host6, Host11, Host12 et TémoinC2). Les
chalcones TémoinC1 et TémoinC3 s’ionisent difficilement en négatif du fait de l’absence de
groupements OH. Sur les quatre chalcones étudiées, la chalcone Host6 présente une structure
complexe dont la fragmentation sera étudiée de façon indépendante.
Le Tableau 18 résume les différents ions fragments obtenus pour les chalcones Host11,
Host12 et TémoinC2.
III. Résultats et discussion
141
Molécules
Host12 Host11 TémoinC2Fragments
Energie de collision % 37% 37% 38%
Pertes de neutres
[M-H]- 283 (100) 297 (14) 223 (35)
[M-H-H2]-
281 (12) 295 (1) 221 (42)
[M-H-CH3]-
268 (88) 282 (100) /
[M-H-H2O]- / / 205 (14)
[M-H-CO]- 255 (4) 269 (1) 195 (100)
[M-H-CH3-CO]- 240 (6) 254 (4) /
[M-H-C2H2O]- 241 (21) 255 (2) /
[M-H-C2H2O-CH3]-
226 240 /
[M-H-C2H2O-CH3-CO]- 198 212 /
[M-H-CO2]-
239 (5) 253 (1) 179 (1)
Fragments de type A
0A- (perte de 130 uma) 153 (8) 167 (2) /
[1A - CH3]-(perte de 119 uma) 164 (38) 178 (26) /
1A- (perte de 104 uma) 179 (7) 193 (1) /
OOH
HO O
OOH
HO O
OOH
Remarque : les chiffres entre parenthèse correspondent au % relatif des ions sur le spectre MS2.
Tableau 18 : Bilan des ions fragments négatifs obtenus pour les chalcones Host11, Host12 et
TémoinC2 en (-)-APCI.
E. 2. 1 Fragments A ou B
Du fait de l’absence de substitution sur le cycle B pour ces composés, seuls des fragments de
type A sont obtenus, car ceux-ci s’ionisent très facilement (de part la présence de nombreux
substituants).
Deux fragments sont observés correspondant respectivement aux fragments 0A- et 1A-. De
plus une expérience de MS3 montre qu’un fragment de type [1A-CH3]- est obtenu après la
perte d’un groupement méthyle en MS2 comme le montre la Fig. 115.
III. Résultats et discussion
142
OOH
OHO -H
m/z 283
OHO -H
m/z 179
-CH3
OOH
OHO -H
m/z 268
OHO -H
m/z 164
OH
OHO -H
m/z 153O
O
OO
MS2 MS2
MS2
MS3
0A- 1A-
[1A-CH3]-
Fig. 115 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host12 (fragments de type A).
Une expérience de MS3 nous a permis de conclure que la perte de 119 uma (Tableau 18)
correspond à une perte successive de CH3 suivi d’une perte de 104 uma (vinylbenzene).
Ainsi, une perte de 104 (vinylbenzene) nous permet de conclure à l’absence de substituant sur
le cycle B.
Concernant le TémoinC2, aucun fragment de type A ou B n’est observé en mode négatif.
E. 2. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres
En plus des clivages conduisant à une perte du cycle B, de petites pertes de neutre sont
observées (CO, H2, H2O, CH3).
La perte de CO conduit en MS2 à l’ion fils majoritaire pour le TémoinC2. Cette perte est
communément rencontrée pour les chalcones avec un groupement hydroxyle [Zhang et
Brodbelt, 2003]. Pour les chalcones méthoxylées Host11 et Host12, la perte dominante en
MS2 est celle du radical méthyle alors que la perte de CO est observée seulement en MS4. Elle
n’intervient qu’après la perte de C2H2O et de CH3 (Tableau 18 : [M-H-C2H2O-CH3]- et [M-
H-C2H2O-CH3-CO]-).
III. Résultats et discussion
143
Une perte de 42 uma est également observée et elle correspond à la perte de C2H2O, déjà
obtenue pour d’autres flavonoïdes [Fabre et al., 2001] et certaines chalcones [Zhang et
Brodbelt, 2003] en ESI en mode négatif. La structure que nous proposons ici est la même que
celle proposée par Fabre et al. [2001] (Fig. 116) pour les flavanones. Cependant sa formation
devient plus complexe de part la nécessité de deux coupures de liaisons alors que pour les
flavanones, la présence du cycle C facilite la contraction de cycle.
Enfin, la perte de CO2 est très peu observée, les ions correspondant de faible intensité (voir
Tableau 18) ne sont pas significatifs.
Fig. 116 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host11
(Fragments de type A et perte de neutres). L’ion fragment en rouge correspond au fragment
majoritaire observé en MS2.
OOH
OHO
-H
m/z 283
OOH
OHO
m/z 268
-H
A B
-CH3
OH
HO
m/z 240-CO
-H
O
HO O
-H
-C2H2O
m/z 241
O
OHO -H
m/z 226
-CH3 -CO
OHO
m/z 198
-HO
HO O
-H
m/z 164
OO
OH
OHO
m/z 153
-H
OHO -H
m/z 179
OO
HO O
-H
m/z 164
OO
HO O-H
-CO2
m/z 135
-CH3
MS2
MS2
MS2
MS2
MS3
MS3
MS3
MS3
MS3
MS4
0A-
1A-
III. Résultats et discussion
144
E. 2. 3 Cas particulier de la chalcone Host6
Le schéma de fragmentation proposé est représenté Fig. 117. Les principales fragmentations
concernent la perte de la fonction méthyle ester qui se produit suite à une perte successive de
méthanol et de CO2 pour donner les ions m/z 445 et m/z 401. De plus, de part la présence d’un
cyclohexène, une réaction de type rétro Diels-Alder a lieu conduisant à la chalcone
correspondante (m/z 341) suite à la perte du dérivé myrcène (76 uma). Ainsi les principales
fragmentations sont dues à des pertes de neutre (CH3OH, CH3, CO2 etc..) plutôt que des
fragments de type A ou B.
O
O
O O
OH
HO
OOH
O
-32
-CH3OH
m/z 477
m/z 445
-H
-H
-44
-C02
OOH m/z 401
-H
OOH
O
m/z 361
-H
-C6H12
OOH
HO O
O
m/z 341
-H
RDA
O
-C10H16
-CO2 m/z 317
OOH
O
m/z 361
-H
O
O
O
O
O
O
O
OOH
O
-H
-C6H12
MS2
MS2
MS2
MS3
MS2 MS4
Fig. 117 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host6. (Fragments de type A
et perte de neutres). L’ion fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en
MS2.
E. 2. 4 Bilan : clé d’identification des composés de type chalcone
L’étude de la fragmentation des chalcones isolées ainsi que de leurs témoins commerciaux
nous permet d’établir une clé d’identification de cette classe de flavonoïdes.
III. Résultats et discussion
145
- En spectroscopie UV, deux maxima d’absorptions sont observés vers 300 nm et 340
nm qui correspondent respectivement au cycle A et au cycle B conjugué (unité
vinylbenzene) [Harborne, 1993; Mabry et al., 1970]. L’UV permet de présumer le
squelette chalcone.
- En spectroscopie de masse :
� Deux fragments de type A sont caractéristiques, il s’agit des fragments 0A- et 1A- indiquant la présence de substituants sur ce cycle. De façon similaire,
l’absence de fragment de type B nous informe de l’absence de substituants sur
le cycle B. La masse des fragments 0A- et 1A- renseigne sur la nature et le
nombre de substituants sur le cycle A.
Une perte de 104 uma indique une absence de substitution sur le cycle B.
� Une perte de CO (28 uma) majoritaire en MS2 nous informe de la présence de
groupements hydroxyles. De manière équivalente, une perte de 15 uma en MS2
correspondant à la perte d’un groupement méthyle nous permet d’identifier de
façon significative une chalcone méthoxylée.
� La perte de CO2 en MS2 est très faible voire inexistante pour les chalcones.
III. Résultats et discussion
146
E. 3 Etude de la fragmentation des dihydrochalcones par (-)-APCI
L’ensemble des molécules étudiées sont présentées dans le Tableau 19. Nous pouvons
distinguer :
-Quatre dihydrochalcones monoterpénées isolées (Host2, Host3, Host5 et Host7 sans
compter le composé Host4 qui est un stéréoisomère de Host3).
-Une dihydrochalcone simple (Host9).
-Une dihydrochalcone témoin notée TémoinDC.
O
OOH
O
O
OO
OH
H HOH
Host2 (408 g/mole) Host3 (424 g/mole)
O
OHO
OH
H O
O
OH
OH
OH
H
Host5 (424 g/mole) Host7 (408 g/mole)
OH
OHO
O
Host9 (272 g/mole)
OH
OHO
O
O
TémoinDC (302 g/mole)
Dihydrochalcones monoterpénées isolées Dihydrochalcone isolée
simple
Témoin dihydrochalcone
simple
Tableau 19
De façon générale, l’ensemble des molécules s’ionisent bien en négatif. Cependant les
dihydrochalcones substituées par des monoterpènes saturés étaient très instables dès
l’expérience de MS3. Seuls les spectres en MS2 ont pu être enregistrés ce qui est insuffisant
pour comprendre la fragmentation de ces composés. Des pertes communes sont observées
III. Résultats et discussion
147
mais leur interprétation est difficile et les propositions de structure ne sont toujours pas
élucidées. Le Tableau 20 résume les différents fragments obtenus pour l’ensemble des
dihydrochalcones :
Tableau 20 : Bilan des ions fragments négatifs obtenus pour les dihydrochalcones étudiées en
(-)-APCI.
III. Résultats et discussion
148
E. 3. 1 Fragments A ou B
Nous n’observons que des fragments de type A même pour la dihydrochalcone TémoinDC
qui présente un méthoxyle sur le cycle B.
Deux fragments sont observés correspondant respectivement aux fragments 0A- et 1A-. De
plus, une expérience de MS3 montre qu’un fragment de type [1A-CH3]- est obtenu après la
perte d’un groupement méthyle en MS2 (Fig. 118) comme dans le cas des chalcones (voir Fig.
115). Ce fragment [1A -CH3]- est le plus abondant des fragments de type A.
OOH
OHO -H
m/z 271
-CH3
OOH
OHO -H
m/z 268
OHO-H
m/z 152
OH
OHO -H
m/z 139
O OH
OO
-Hm/z 165
OH
O
MS2 MS2
MS2
0A- 1A-
1A--CH3
MS3
Fig. 118 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host9 (fragments de type A).
Pour les dihydrochalcones monoterpénées, nous avons en plus une coupure au niveau des
liaisons reliant la sous-unité dihydrochalcone à la sous-unité monoterpénique (voir Tableau
20). Cette information nous permet d’identifier la masse du monoterpène.
E. 3. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres
En plus des clivages conduisant à une perte du cycle B, de petites pertes de neutres sont
observées (H2O, CO, CH3).
La perte de neutre majoritaire est la perte d’H2O dont le schéma de fragmentation a déjà été
proposé pour les chalcones en APCI en mode positif [Tai et al., 2006] mais jamais pour les
dihydrochalcones.
III. Résultats et discussion
149
Nous proposons une structure (voir Fig. 119) où la perte d’H2O est due à un substituant OH
du cycle A et à un H du groupement CH2-β. Nous obtenons alors une structure pentacyclique.
Ainsi, la perte d’H2O ne peut pas faire intervenir le carbonyle (comme le propose Tai et al.
[2006] en APCI en mode positif) car une expérience de MS4 montre qu’il y a perte de CO
après pertes successives d’H2O et de CH3 (Fig. 119).
OOH
O OH
-H
m/z 271
OOH
O
-H
m/z 253
-H2O
OOH
O
-H
m/z 238
-CH3
OH
O
-H
m/z 210
-18 -15
-CO-28
A B
MS2 MS3
MS4
Fig. 119 : Schéma de fragmentations proposé pour la perte d’H2O pour le composé Host9.
L’ion fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2
Nous observons également une perte de CH3 (Fig. 119) mais elle est observée en MS3 après
une perte d’H2O et non en MS2 comme dans le cas des chalcones (voir Fig. 116).
Enfin, aucune perte de CO, de CO2 ou de C2H2O n’est observée pour l’ensemble des
dihydrochalcones étudiées.
En ce qui concerne les dihydrochalcones monoterpénées, une grande énergie de collision est
nécessaire pour réaliser la fragmentation des ions en MS2. En plus des pertes précédentes
deux pertes de neutre de 58 uma (C4H10 ou C3H6O, [De Hoffmann et al., 1999]) et 72 uma
(C2O3, [De Hoffmann et al., 1999]) sont observées mais leurs localisations n’ont pu être
expliquées.
III. Résultats et discussion
150
E. 3. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type dihydrochalcone
L’étude de la fragmentation des dihydrochalcones isolées ainsi que de leurs témoins
commerciaux nous permet d’établir une clé d’identification de cette classe de flavonoïdes.
- En spectroscopie UV, deux maxima d’absorptions sont observés vers 230 nm et 290
nm qui correspondent respectivement au cycle A et au cycle B [Harborne, 1993;
Mabry et al., 1970].
- En spectroscopie de masse :
� Deux fragments de type A sont caractéristiques, il s’agit des fragments 0A- et 1A- indiquant la présence de substituants sur ce cycle. La masse des fragments 0A- et 1A- renseigne sur la nature et le nombre de substituants sur le cycle A.
� Une perte d’H2O (18 uma) majoritaire observée en MS2 indique la présence
d’un groupement OH sur le cycle A (nécessaire à l’obtention de la structure
pentacyclique). De manière équivalente, une perte de 15 uma en MS3
correspond à la perte d’un groupement méthyle nous permettant d’identifier de
façon significative une chalcone méthoxylée.
� Aucune perte de CO, CO2 ou C2H2O n’est observée en MS2 pour les
dihydrochalcones.
III. Résultats et discussion
151
E. 4 Etude de la fragmentation des flavanones par (-)-APCI
L’ensemble des flavanones étudiées sont présentées dans le Tableau 21 :
O
OOH
HO
O
OOH
HO
Host1 (392 g/mole) Host8 (256 g/mol)
O
OOH
HO
O
OOH
O
OH
Host10 (284 g/mole) Host13 (286 g/mole)
O
OO
O
OH
O
OO
HO
O
Host14 (300 g/mole) Host15 (300 g/mole)
O
OOH
O
Host16 (284 g/mole)
O
OOH
HO O
O
TémoinF1 (256 g/mole) TémoinF2 (224 g/mole)
O
O
HO O
O
O
TémoinF3 240 g/mole TémoinF4 (254 g/mole)
O
OO
O
OO
O
TémoinF5 (254 g/mole) TémoinF6 (284 g/mole)
O
O
OH
O
TémoinF7 (270 g/mole)
Flavanones isolées Témoins flavanones
Tableau 21
Toutes les molécules ont pu être détectées en mode négatif même la flavanone TémoinF2 qui
ne possède pas de substituant hydroxyle. Le Tableau 22 suivant résume les différents
fragments obtenus pour l’ensemble des flavanones.
III. Résultats et discussion
152
Molécules Host1 Host8 Host10 Host13 Host14 Host15% d' énergie de collision 44 44 37 33 33 42Fragments
Perte de neutres
[M-H]- 391 (100) 269 (80) 283 (100) 285 (1) 299 (100) 299 (100)
[M-H-H2]- / / 281 (21) / 297 (3) /
[M-H-CH3]-
/ / / 284 (5) 284 (61)
[M-H-CO]- / 241 (27) 255 (13) / / /
[M-H-CO2]-
/ 225 (70) 239 (7) / 255 (2) 255 (4)
[M-H-H2O]- 373 (3) 251 (11) / / / /
[M-H-C2H2O]- 349 (31) 227 (100) 241 (20) / 257 (6) 257 (6)
[M-H-C2H2O-CO]- 321 199 213 / / /
[M-H-C3O2]-
323 (33) 201 (7) / / / /
[M-H-C2H2O-CO2]-
305 183 (17) / / / /
[M-H-C2H2O-CH3]- / / / / / 242 (3)
[M-H-CH3-CH3]-
/ / / / 269 (1) 269 (16)
[M-H-CO-CH3]-
/ / / / / /
[M-H-CH3-CO]- / / / / / 256 (6)
[M-CH3-H2O]- / / / / / /
[M-H-CH3-CH3-CO]- / / / / / /
[M-H-CH3-CH3-CO2]-
/ / / / / /
Fragments
1,3A- 287 (11) 165 (34) 179 (3) 165 (100) / 165 (19)
1,3A--CO2 / 121 (5) 135 (1) 121 (1) / /
1,2A- / 178 (21) 192 (7) / / 178 (24)
1,4A- / / / / / /
0,3A- / / / 150 (3) / /
[M-H-cycle B]- / / 205 (2) 191 (8) / /
1,3B- / / / 119 (4) 119 (60) /
O
OOH
HO O
OO
HO
O
O
OO
O
OH
O
OOH
O
OH
O
OOH
HOO
OOH
HO
Host16 TémoinF1 TémoinF2 TémoinF3 TémoinF4 TémoinF5 Témoi nF637 44 37 37 37 40 37
283 (100) 255 (100) 223 (100) 239 (96) 253 (46) 253 (8) 283 (16)
281 (46) / 221 (23) / / / /
268 (61) / / / 238 (100) 238 (4) 268 (18)
255 (2) 227 (3) 195 (63) / 225 (2) 225 (100) 255 (100)
239 (2) 211 (37) 179 (1) / / / /
/ / 205 (10) / / / /
241 (74) 213 (64) / 197 (100) / / /
213 185 / 169 / / /
/ 187 (1) / / / / /
/ 169 / / / / /
226 / / / / / /
/ / / / / / 253 (12)
/ / / / / 210 (1) 240 (3)
/ / / / / / /
/ / / / / /
/ / / / / / 225
/ / / / / / 209
179 (14) 151 (23) / 135 (11) / / /
135 (2) 107 (3) / 91 (1) / / /
/ / / 148 (3) / / /
153 (1) / / / / 123 (3) 153 (4)
164 (14) / / / / / /
/ / 145 (2) / / / /
/ / / / / / /
O
OO
HO O
OOH
HO O
OO
O
O
O
OO
OO
O
HO O
O
O
TémoinF742
269 (45)
/
254 (100)
/
/
251 (63)
/
/
/
/
/
/
/
226 (18)
236 (24)
/
/
165 (26)
121 (2)
/
/
/
191 (4)
/
O
O
OH
O
Remarque : les chiffres entre parenthèse correspondent au % relatif des ions sur le spectre MS2.
Tableau 22
III. Résultats et discussion
153
E. 4. 1 Fragments A ou B
Les différents clivages des liaisons observés sont représentés Fig. 120 selon la nomenclature
adopté par Ma et al. [1997].
O
O
A
B
0 1
2
34
1,3 B-1,4 A-
1,3 A-
1,2 A-
0,3 A- R2
R1
Fig. 120 : Nomenclature des fragments obtenus pour les flavanones en (-)-APCI.
Comme le montre le Tableau 22 et la Fig. 120, la majorité des fragments observés sont des
fragments de type A. Pour les fragments de type B, seules les flavanones porteuses de
substituants hydroxyles sur le cycle B donnent des fragments B (voir Tableau 22). En effet,
la perte de 119 uma est caractéristique de flavanones substituées par un hydroxyle sur le cycle
B (Host13 et Host14).
Ces différents clivages ont déjà été observés et étudiés pour les flavones, flavonols et
flavanones par Fabre et al [Fabre et al., 2001].
E. 4. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutre
En plus des clivages conduisant à une perte du cycle B, de petites pertes de neutre sont
observées (H2, H2O, CO, CO2 etc.).
Des pertes d’H2 et d’H2O sont observées mais il est difficile d’établir un schéma de
fragmentation car ces pertes ne sont observées que pour certaines flavanones.
Des pertes de CO, CO2 et C2H2O sont observées pour l’ensemble des composés. Au moins
une des trois pertes a lieu sauf dans le cas du composé Host13 (voir Tableau 22) où il n’y a
III. Résultats et discussion
154
qu’un fragment majoritaire qui correspond au fragment 1,3A-. Ces trois pertes de neutres ont
lieu au niveau du cycle C (voir Fig. 121: exemple avec la strobopinine, Host8).
O
OOH
HO
m/z 269
-H
-H
OH
HO O
m/z 241
-CO
-C2H2O
OH
HO O -H
-CO2
O -H
m/z 183
m/z 227
O -H
m/z 199
HO
-CO
-CO2
OH
HO
-H
m/z 225
MS2
MS2
MS2
MS3
MS3
Fig 121 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host8 (strobopinine). L’ion
fragment en rouge correspond au fragment majoritaire obtenu en MS2.
Dans le cas des flavanones méthoxylées, la perte de CH3 reste en général relativement
minoritaire par rapport aux autres pertes de neutre que sont les pertes de CO, CO2 ou C2H2O
sauf dans le cas de la pinocembrine méthoxylée (TémoinF7) et de la 4’-méthoxyflavanone
(TémoinF4).
E. 4. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type flavanone
L’étude de la fragmentation des flavanones isolées ainsi que de leurs témoins commerciaux
nous permet d’établir une clé d’identification de cette classe de flavonoïdes.
- En spectroscopie UV, deux maxima d’absorptions sont observés vers 230 nm et 290
nm qui correspondent respectivement au cycle A et au cycle B [Harborne, 1993;
Mabry et al., 1970]. Ainsi les dihydrochalcones et les flavanones présentent les
III. Résultats et discussion
155
mêmes maxima d’absorption mais les fragments obtenus en spectrométrie de masse en
(-)-APCI vont nous permettre de différencier les deux types de noyaux flavonoïdiques.
- En spectroscopie de masse :
� Les fragments de type A les plus rencontrés sont les fragments 1,3A- (le plus
abondant) et 1,2A- qui nous renseignent sur la nature et le nombre de
substituants sur le cycle A. En ce qui concerne les fragments de type B, une
perte de 119 uma est caractéristique d’un parahydroxyphénol sur le cycle B
(1,3B-).
� En MS2, les pertes les plus importantes sont les pertes de 28 uma (CO), 44 uma
(CO2) et 42 uma (C2H2O) qui ont lieu au niveau du cycle C du noyau
flavanone. Dans le cas de flavanones méthoxylées, la perte de 42 uma (C2H2O)
est plus abondante que la perte de 15 uma (CH3).
E. 5 Comparaison de la fragmentation des dérivés chalcones et
dihydrochalcones en APCI en mode négatif
� Comparaison des fragments A ou B obtenus
Les coupures observées pour les chalcones et leurs équivalents hydrogénés sont identiques.
Trois fragments de type A sont obtenus. Il s’agit des fragments 0A- et 1A- et [1A-CH3]-. Nous
pouvons constater qu’aucun clivage n’a lieu entre les carbones α et β.
� Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres
Pour les chalcones, la perte prépondérante est la perte de CH3 (dans le cas des dérivés
méthoxylés uniquement) et nous pouvons observer des pertes de CO, CO2 et C2H2O.
Dans le cas des dihydrochalcones, la perte prédominante est la perte d’H2O même dans le cas
de composés méthoxylés, et aucune perte de CO, CO2 ou C2H2O n’est observée directement.
La perte de CO est observée seulement en MS4 après perte successive d’H2O et de CH3.
III. Résultats et discussion
156
Ainsi, les chalcones et les dihydrochalcones ont tendance à se fragmenter de la même façon
sauf en ce qui concerne les pertes de neutre qui sont radicalement différentes. De plus en
spectroscopie UV, les deux noyaux présentent des maxima d’absorption différents de part la
présence d’une double liaison conjuguée dans le cas des chalcones.
Nous allons maintenant comparer la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones par
rapport à celle des flavanones.
E. 6 Comparaison de la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones et
flavanones par APCI en mode négatif
� Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus
En comparant les coupures observées pour les trois génines, nous pouvons considérer que les
fragments 0A- et 1A- des chalcones et dihydrochalcones sont équivalents aux fragments 1,4 A-
et 1,3 A- obtenus dans le cas des flavanones comme le montre la Fig. 122 :
O
O
A
B
0 1
2
34
1,4 A-
1,3 A-
R2
R1
O
OH
R1 R2
0A-
1A-
0 1 2 3
Fig. 122
Néanmoins, les flavanones présentent des fragments A ou B supplémentaires dû à la présence
du cycle C (voir Fig. 120). Ce sont essentiellement des différences au niveau des pertes de
neutre (paragraphe suivant) qui permettent de distinguer les deux génines.
III. Résultats et discussion
157
De plus, en spectroscopie UV, les chalcones ont des absorptions différentes des flavanones et
des dihydrochalcones [Harborne, 1993; Mabry et al., 1970].
� Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres
Le même type de pertes de neutres est observé pour les flavanones et les chalcones en ce qui
concerne les pertes de CO, CO2, C2H2O et CH3. Cependant nous avons des différences
d’intensité. En effet, si nous prenons l’exemple de la chalcone Host12 et de la flavanone
Host16 qui sont des isomères, les mêmes ions fragments sont obtenus (voir Fig. 123). Nous
retrouvons notamment les ions fils m/z 268 et m/z 241 qui correspondent respectivement à des
pertes de 15 uma et 42 uma que nous attribuons à des pertes de CH3 et de C2H2O.
Fig. 123 : Comparaison des spectres MS2 des composés Host12 et Host16 obtenus
en (-)-APCI.
Ainsi nous pouvons constater que dans le cas des chalcones, la perte de CH3 est majoritaire
par rapport à la perte de C2H2O et inversement pour les flavanones.
Ce phénomène peut s’expliquer en considèrant que la perte de C2H2O conduit à la même
structure pour les deux types de génine (Fig. 123). La formation de ce fragment est difficile à
réaliser dans le cas des chalcones car cela nécessite la coupure de deux liaisons covalentes.
Ainsi cette constatation nous permettra de distinguer la génine flavanone de la génine
chalcone dans l’identification de nouveaux composés présents dans un extrait.
III. Résultats et discussion
158
E. 7 Comparaison de la fragmentation des chalcones et des flavones en
spectrométrie de masse (techniques d’ionisation douces)
La fragmentation des flavones n’a pas été étudiée lors de ce stage mais il est important
d’étudier les différences de fragmentation entre les chalcones et les flavones en spectrométrie
de masse. En effet, les deux types de noyaux présentent les mêmes maxima d’absorption en
spectroscopie UV, ainsi, lors de l’étude d’un extrait par LC/DAD/MSn, seule l’étude des
spectres de masse nous permettra de différencier les deux types de noyaux flavonoïdiques.
La fragmentation des flavones a été étudiée en ESI en mode négatif par le Dr. Nicolas Fabre,
Maître de conférences au sein de l’UMR-152.
Nous nous sommes donc basés sur les travaux de Fabre et al. [2001] pour établir une
comparaison de fragmentations entre les chalcones et les flavones.
� Comparaison des fragments A ou B obtenus
Les flavones présentent les mêmes fragments de type A ou B observées pour les flavanones
(Fig. 120). Le fragment majoritaire obtenu est le fragment 1,3A- qui est équivalent au fragment 1A- observé dans le cas des chalcones (Fig. 122).
� Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutre
De façon générale, les flavones présentent des pertes de CO, de CO2 et de C2H2O. La perte de
CO2 est très souvent la perte majoritairement observée [Fabre et al., 2001]. Cependant dans le
cas des flavones méthoxylées, un seul fragment est obtenu correspondant à la perte d’un
radical méthyle et aucune autre perte de neutre n’est observée [Fabre et al., 2001].
Dans le cas des chalcones, la perte de CO2 est très faible voire inexistante. Dans le cas des
chalcones méthoxylées, la perte du radical méthyle est la perte majoritaire observée, mais
d’autres pertes de neutres sont également obtenues, notamment la perte de C2H2O (perte de 42
uma) (Fig. 123). Ainsi l’étude des pertes de neutre nous permettra de différencier un dérivé
chalcone d’un dérivé flavone.
III. Résultats et discussion
159
E. 8 Conclusion de l’étude de la fragmentation des chalcones,
dihydrochalcones et flavanones par (-)-APCI
Le Tableau 23 suivant récapitule l’ensemble des critères permettant l’identification des
chalcones, dihydrochalcones, flavanones mais aussi des flavones en tenant compte de la
spectroscopie UV et des ions significatifs obtenus suite à une fragmentation par MSn en (-)-
APCI et (-)-ESI (pour les flavones) [Fabre et al., 2001].
Flavonoïde
Chalcone Flavone Dihydrochalcone Flavanone
Spectroscopie UV
maxima d'absorptions 300 nm et 340 nm 300 nm et 340 nm 230 nm et 290 nm 230 et 290 nm
Spectroscopie de masseAPCI en mode négatif
Fragments de type A ou B 0A- , 1A- 1,3A- 0A- , 1A- 1,3A- et 1,4A-
[1A-CH3]- (le plus abondant) (le plus rencontré) [1A-CH3]
- (le plus abondant) (les plus rencontrés)
Perte de neutre majoritaire perte de CH3 (15 uma) perte de CO2 perte d'H2O (18 uma) perte de CO (28 uma)
(en MS2) perte de CH3 ou de CO2 (44 uma)
(pour dérivé méthoxylé) ou de C2H2O (42 uma)
perte de C2H2O (42 uma) perte de 33 uma perte de C2H2O (42 uma)
/ (perte d'H2O+perte de CH3)
Autres pertes de neutre
significatives (en MS 2)(flavonoïdes méthoxylées) perte de CH3 (15 uma) perte de C2H2O (42 uma)
plus abondante que la / / plus abondante que la
perte de C2H2O (42 uma) perte de CH3 (15 uma)
O
AR
B R'
O
AR
B R'
O
AR
B R'
O
O
AR
B R'
O
Tableau 23 : Clés d’identification des noyaux chalcones, dihydrochalcones, flavanones et
flavones par spectroscopie UV et spectroscopie de masse en (-)-APCI.
Ce travail nous a permis d’établir « une clé d’identification » regroupant des ions significatifs
pour chaque type de génine.
Nous allons maintenant étudier l’application de ces résultats à l’étude par LC/DAD/(-)-APCI-
MSn de l’extrait acétate d’éthyle de Piper hostmannianum var. berbicense.
III. Résultats et discussion
160
F. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MS n de l’extrait acétate d’éthyle
de feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense
Nous avons choisi d’identifier les principaux composés présents dans l’extrait acétate
d’éthyle de Piper hostmannianum var. berbicense par LC/DAD/(-)-APCI-MSn sans isolement
au préalable (identification dite « on line ») en utilisant les critères d’identification établis
dans l’étude précédente. Les conditions chromatographiques et spectrométriques utilisées
dans cette étude sont détaillées dans la partie Matériels et méthodes.
F. 1 Profil chromatographique
Les chromatogrammes obtenus après détection UV à 340 nm et après détection par
spectrométrie de masse (TIC : Total Ion Current-APCI négatif) sont représentés Fig. 124.
Fig. 124 : (a) Chromatogramme (TIC ) de l’extrait AcOEt avec détection APCI négatif
(b) Chromatogramme de l’extrait AcOEt enregistré en UV à 340 nm.
(b)
(a)
III. Résultats et discussion
161
L’étude du Courant Ionique Total et des spectres de masse en MS2 et MS3 correspondant à
des rapports m/z identiques aux flavonoïdes isolés de la plante nous a permis de sélectionner
11 composés (Tableau 24 et Fig. 124) dont nous avons étudié la fragmentation.
Temps de rétention en minutes (TIC) Rapport m/z (mode APCI négatif)
8.92 327
12.14 327
12.48 301
15.34 271
15.73 283
16.87 283
17.14 311
18.01 341
18.61 297
22.52 311
22.76 341
Tableau 24
La plupart des composés sont des isomères. Ainsi, nous distinguons :
- Deux isomères de masse 284 g/mole
- Deux isomères de masse 312 g/mole
- Deux isomères de masse 328 g/mole
- Deux isomères de masse 342 g/mole
Ainsi que trois composés de masses respectives 272 g/mole, 298 g/mole et 302 g/mole.
Remarque : le pic à Tr 21.16 n’a pas été étudié car le spectre de masse donnait quatre ions
majoritaires. Il s’agit donc d’un mélange de composés et leur fragmentation en MS2 n’a pas
donné de bons résultats dû à un nombre d’ions insuffisant.
III. Résultats et discussion
162
L’identification des composés sera permise grâce à l’étude de leur spectre UV et de leurs
spectres de masse (MS, MS2 et MS3). Nous étudierons les composés par ordre croissant de
leur masse.
F. 2 Identification des composés présents dans l’extrait AcOEt
� Composé de rapport m/z 271 à Tr 15.34 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 271 à Tr 15.34 min montre deux maxima
d’absorption à 211 nm et 286 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry
et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 125
suivante.
120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
50
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Re
lativ
e A
bun
da
nce
271,2
272,3
125,1111,0 273,2146,9 270,5152,1 286,2192,8181,1174,3127,9 197,3 236,9 256,9245,4221,1206,1253,2
271,1
238,2254,2
152,1272,1
239,3165,1 257,1139,1 173,1124,1 273,1210,2 237,7121,1 197,2179,3 226,6
Fig. 125 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 271 à Tr 12.14 min.
Ce composé a une masse de 272 g/mole comme l’atteste le spectre de masse enregistré en (-)-
APCI m/z 271 [M-H]-.
Le spectre MS2 montre trois ions fils à m/z 253, m/z 238 uma et m/z 152 uma qui
correspondent respectivement à des pertes de 18 uma, 33 uma et 119 uma. La perte
majoritaire est la perte de 18 uma qui correspond à une perte d’H2O. Or nous avons pu voir
III. Résultats et discussion
163
que dans le cas des dihydrochalcones la perte majoritaire est la perte d’H2O: Il s’agit donc
d’une dihydrochalcone.
L’ion fragment m/z 152 correspond donc au fragment de type A : [1A-CH3]-. Il s’agit donc
d’une dihydrochalcone dont le cycle A est substitué par deux groupements OH et par un
groupement méthoxyle.
Le spectre MS2 de ce composé est comparé au spectre MS2 de la 2’,6’-dihydroxy-4’-
méthoxydihydrochalcone (Host 9, Fig. 126) déjà isolée et identifiée dans l’extrait hexanique.
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
253.20
271.14
238.26
152.10
165.14139.09124.06 210.23197.1890.85 226.63253.34
271.12
238.36152.18
165.24124.13 226.54138.94 184.09
Fig. 126 : Comparaison des spectres MS2 de l’ion m/z 271 à Tr 15.34 min
et du composé Host9.
Nous pouvons constater que les deux spectres sont équivalents. Il s’agit donc de la 2’-6’-
dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone (Host9) dont la structure et le schéma de
fragmentations sont représentés Fig. 127.
Spectre MS/MS de l’ion m/z 271 (Tr 15.34min)
Spectre MS/MS de Host9
III. Résultats et discussion
164
OOH
O OH
-H
m/z 271
OOH
O
-H
m/z 253
-H2O
OOH
O
-H
m/z 238
-CH3
OH
O
-H
m/z 210
-18 -15
-CO-28
A B
OH
O OH
O OH
OO
-H
m/z 165
O
m/z 152
MS2
MS2
MS2
MS3
MS4
1A-
1A--CH3
Fig. 127 : Schéma de fragmentations de la 2’-6’-dihydroxy-4’-methoxydihydrochalcone
(Host9). L’ion fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2.
III. Résultats et discussion
165
� Composé de rapport m/z 283 à Tr 15.73 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 283 à Tr 15.73 min montre deux maxima
d’absorption à 221 nm et 294 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry
et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 128
suivante.
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z
37
0
5
10
15
20
25
30
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Re
lativ
e A
bun
dan
ce
283.25
125.04 271.27 306.85284.25110.97
146.89 285.12102.97 156.87132.80 179.18 196.86 233.19121.14 261.34224.99 252.09283.15
241.16
284.18255.20192.09
239.21179.07164.06 242.17205.13 256.20135.01 285.14213.21 268.21151.10111.05 227.2996.98
Fig. 128 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 283 à Tr 15.73 min.
Le spectre de masse donne un ion quasi-moléculaire m/z 283 [M-H]- en accord avec une
masse de 284 g/mole.
Le spectre MS2 présente deux ions fils majoritaires à m/z 255, m/z 241 correspondant
respectivement à des pertes de 28 uma (perte de CO) et de 42 uma (C2H2O). Notre clé
d’identification (Tableau 23) nous permet d’envisager une structure de type flavanone.
Aucune perte de méthyle n’est observée, il n’y a donc aucun groupement méthoxyle.
Nous avons deux autres ions fils à m/z 192 (perte de 91 uma) et m/z 179 (perte de 104 uma).
Ces deux fragments sont des fragments de type A, il s’agit des fragments 1,2A- et 1,3A-. Le
cycle B est donc non substitué et le cycle A est substitué par deux OH et deux groupements
méthyles.
III. Résultats et discussion
166
Le spectre MS2 de ce composé de masse m/z 283 est comparé aux spectres MS2 de la 6,8-
diméthylpinocembrine (Host10) (Fig. 129) déjà isolée dans l’extrait hexanique.
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
35
0
5
10
15
20
25
30
Re
lativ
e A
bun
danc
e
283,2
241,2
255,2 284,2192,1
239,2179,1164,1 242,2205,1 256,2135,0 285,1270,1213,2151,1111,1 227,3121,997,0283,2
281,4241,3284,2
255,3192,2 239,3179,2 242,5 256,3 285,1205,3164,2135,2 268,2213,3 221,1111,1 151,0121,193,0
Fig. 129 : Comparaison des spectres MS2 de l’ion m/z 283 à Tr 15.73 min
et du composé Host10.
Les deux spectres sont identiques. Il s’agit donc de la 6,8-diméthylpinocembrine (Host10)
dont le schéma de fragmentations est représentée Fig. 130.
O
OOH
HO
m/z 283
-H
-H
OH
HO O
m/z 255
-CO
-C2H2O
OH
HO O -H
OH
HO O
O
-H
m/z 192
OH
HO
O
O
-H
m/z 179
MS2
MS2
m/z 241
1,2A-
1,3A-
MS2
MS2
Fig. 130 : Schéma de fragmentations de la 6,8-diméthylpinocembrine (Host10). L’ion
fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2.
Spectre MS2 de l’ion m/z 283 (Tr 15.73min)
Spectre MS/MS de Host10
III. Résultats et discussion
167
� Composé de rapport m/z 283 à Tr 16.87 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 283 à Tr 16.87 min montre deux maxima
d’absorption à 305 nm et 347 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry et al.,
1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 131 suivante.
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z
35
0
5
10
15
20
25
30
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Re
lativ
e A
bund
anc
e
283.20
125.03
110.96
311.18284.21146.90102.91 271.19 306.85285.18148.87 170.83126.01112.97 179.02 222.94 233.14 265.15254.89209.00197.02
268.03
283.10
164.01
241.16
269.02 284.10
240.14179.10153.11136.06 270.02255.22 285.04210.94192.10 226.15177.18104.98 136.98111.24
Fig. 131 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 283 à Tr 16.87 min.
Le spectre de masse donne un ion quasi-moléculaire m/z 283 [M-H]- en accord avec une
masse de 284 g/mole.
Le spectre MS2 présente cinq ions majoritaires à m/z 268, m/z 241, m/z 179, m/z 164 et m/z
153. Les ions fragments m/z 268 et m/z 241 correspondent respectivement à des pertes de 15
uma (perte de CH3) et de 42 uma (perte de C2H2O). Il s’agit donc d’une chalcone et non d’une
flavone) méthoxylée. En effet, dans le cas des flavones, seule la perte de CH3 est observée
(voir clé d’identification Tableau 23).
Les ions fragments m/z 179 (perte de 104 uma), m/z 164 (perte de 119 uma) et m/z 153
correspondent à des fragments de type A. Il s’agit respectivement des fragments 1A-, [1A-
CH3]- et 0A-. Il s’agit donc d’une chalcone dont le cycle A est substituée par deux OH, un
méthoxyle et un méthyle.
III. Résultats et discussion
168
Le spectre MS2 de ce composé est comparé au spectre MS2 de la 2’,4’-dihydroxy-6’-méthoxy-
3’-méthylchalcone (Host12) (Fig. 132).
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
m/z
84
0
10
20
30
40
50
60
70
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90R
ela
tive
Abu
nda
nce
268,0
283,1
164,0
241,2
269,0 284,1
240,2179,1153,1136,1 255,2210,9 270,1192,1 285,0226,2154,1 177,1105,0 149,0111,291,0 128,8283,1
268,2
164,2
284,1241,3269,2
165,3 179,2153,2 240,3 242,4136,2 255,3 285,1192,2 270,1224,2177,1 211,2110,9 133,1105,181,0 93,0
Fig. 132 : Comparaison des spectres MS2 de l’ion m/z 283 à Tr 16.87 min
et du composé Host12.
Les deux spectres sont identiques. Il s’agit donc de la chalcone Host12: 2’,4’-dihydroxy-6’-
méthoxy-3’-méthylchalcone dont la structure et le schéma de fragmentations proposés sont
présentés Fig. 133.
OOH
OHO
-H
m/z 283
OOH
OHO
m/z 268
-H
A B
-CH3
O
HO O
-H
-C2H2O
m/z 241
HO O
-H
m/z 164
OH
OHO
m/z 153
OHO
-H
-H
m/z 179
OO O
O
-CH3
MS2
MS2
MS2
MS2
0A-
[1A-CH3]-1A-
Fig. 133 : Schéma de fragmentations proposé pour la chalcone Host12. L’ion fragment en
rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2.
Spectre MS2 de l’ion m/z 283 (Tr 16.87min)
Spectre MS/MS de Host12
III. Résultats et discussion
169
� Composé de rapport m/z 297 à Tr 18.61 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 297 à Tr 18.61 min montre deux maxima
d’absorption à 298 nm et 336 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry et al.,
1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 134 suivante.
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z
35
0
5
10
15
20
25
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0
10
20
30
40
50
60
70
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125.04
297.17
291.28277.23146.91161.04129.00 271.18170.88 179.02 285.16214.93196.96 222.91 236.91 243.05 267.04
282.00
178.02
283.01297.11
254.07150.09 179.03 284.00281.27167.09 193.10 269.15237.06224.99205.23141.28126.04
Fig. 134 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 297 à Tr 18.61 min.
Le spectre de masse enregistré en (-)-APCI présente un ion majoritaire m/z 297 [M-H]- en
accord avec une masse de 298 g/mole.
Le spectre MS2 présente deux ions majoritaires à m/z 282 (perte de 15 uma) et m/z 178.
Puisque un autre ion est observé en plus de la perte de CH3, il s’agit donc d’une chalcone
méthoxylée (voir clé d’identification Tableau 23). L’ion fragment à m/z 178 correspond alors
au fragment A : [1A-CH3]-, fragment A majoritaire (voir clé d’identification Tableau 23).
Le spectre MS2 de cet ion est comparé au spectre MS2 de la 2’,4’-dihydroxy-6’-méthoxy-3’-
méthylchalcone (Host11) déjà isolée dans l’extrait hexanique (Fig. 135).
III. Résultats et discussion
170
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z
100
0
10
20
30
40
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60
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282.00
178.02
283.01297.11
254.07150.09 179.03 298.12284.00281.27167.09 193.10 237.06224.99141.28126.04282.02
178.09
283.00297.09
283.99254.22179.16 298.08150.14 281.37193.11167.08 240.03205.26 226.35124.96109.78
Fig. 135 : Comparaison des spectres MS2 de l’ion m/z 297 à Tr 18.61 min
et du composé Host11.
Les deux spectres sont identiques, il s’agit donc de la 2’,4’-dihydroxy-6’-méthoxy-3’-
méthylchalcone (Host11) dont la structure et le schéma de fragmentations sont présentés Fig.
136.
OOH
OHO
-H
m/z 297 OOH
OHO
m/z 282
-H
A B
-CH3
OH
HO
m/z 254-CO
-H
O
m/z 193
OH
OHO
m/z 167
-H
OHO
OO
-CH3
OHO
OO
-H -H
m/z 178
MS2
MS2
MS2
MS3
MS3
0A-
1A-
[1A-CH3]-
Fig. 136 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host11. L’ion fragment en
rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2
Spectre MS/MS de l’ion m/z 297 (Tr 18.61min)
Spectre MS/MS de Host11
III. Résultats et discussion
171
� Composé de rapport m/z 301 à Tr 12.48 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 301 à Tr 12.48 min montre deux maxima
d’absorption à 229 nm et 290 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry
et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 137
suivante.
100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z
0
10
20
30
40
50
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70
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10
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80
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327.05
301.24
111.02 147.00 424.37 469.09283.47 343.06 386.89173.22 222.98269.07
127.05 173.19
112.06 285.99169.15 241.28178.16
Fig. 137 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 301 à Tr 12.48 min.
Le spectre de masse indique la présence de deux ions quasi-moléculaires à m/z 301 et m/z 327
(le composé à m/z 327 sera étudié dans le paragraphe suivant) en accord avec des masses
respectives de 302 g/mole et 328 g/mole.
Le spectre MS2 de l’ion m/z 301 présente un ion majoritaire à m/z 269 (perte de 32 uma) et
cinq autres ions à m/z 286 (perte de 15 uma), m/z 241 (perte de 60 uma), m/z 173 (perte de
128 uma), m/z 127 (perte de 174 uma) et m/z 112 (perte de 189 uma). Les perte de 32 uma et
15 suggèrent des pertes de CH3OH et de CH3.
Dans le but d’avoir des informations supplémentaires, nous avons réalisé un expérience de
MS3 sur l’ion m/z 269, le spectre obtenu est présenté dans la Fig. 138 suivante.
III. Résultats et discussion
172
Fig. 138 : De haut en bas : spectre MS2 et spectre MS3 du composé m/z 301 à Tr 12.48 min
L’ion m/z 269 donne :
-un ion m/z 254 (perte de 15 uma) ce qui correspond à une perte d’un CH3.
-un ion m/z 241 (perte de 28 uma) ce qui correspond à une perte de CO.
-un ion m/z 225 (perte de 44 uma) ce qui correspond à une perte de CO2.
-un ion m/z 178 (perte de 91 uma) ce qui correspond à la perte d’un méthylbenzene.
Aucune perte de C2H2O n’est observée, il ne s’agit donc pas d’une flavanone méthoxylée. Ces
informations indiquent que nous sommes en présence d’une dihydrochalcone doublement
méthoxylée dont un des groupements méthoxyles est perdu sous la forme d’une molécule de
CH3OH et l’autre méthoxyle est sur le cycle A car un groupement méthyle est perdu en MS3.
La structure que nous proposons est une dihydrochalcone α-méthoxylé dont la fragmentation
est représentée Fig. 139. Le groupement méthoxyle supplémentaire ne peut pas être placé sur
un des deux cycles aromatiques car aucune perte de CH3OH ne pourrait avoir lieu d’après ce
que nous avons pu constater en étudiant en introduction directe la fragmentation de ce type de
composés.
III. Résultats et discussion
173
OOH
O
O
m/z 301
OH-H
-CH3
OOH
O
O
m/z 286
OH-H
-CH3OH
OH
O O
O
-H
-CO
OH
O
O -H
m/z 241
-CO2
OH
O
-H
m/z 225
OH
OO
O
-H
m/z 178
-cycle B
OH
m/z 134-cycle A
m/z 269
-H
BA
MS2
MS2
MS3
MS3
MS3
MS3
Fig.139 : Schéma de fragmentations proposé pour l’ion m/z 301 à Tr 12.48 min.
La structure proposée serait une molécule nouvelle. Les dihydrochalcones α-hydroxylées
étant relativement peu rencontrées [Alvarez et Delgado, 1999; Fukai et al., 1996], il serait
intéressant de pouvoir isoler cette molécule afin de pouvoir confirmer la structure proposée.
III. Résultats et discussion
174
� Composé de rapport m/z 311 à Tr 17.14 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 301 à Tr 12.48 min montre deux maxima
d’absorption à 226 nm et 278 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry
et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 140
suivante.
140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z
51
0
5
10
15
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311,2
146,9283,2271,1 301,0148,8 156,9 285,4250,9171,1 222,2207,0 264,3141,0 234,1181,3 190,8283,1
311,1241,1
284,1268,1
269,0207,0 242,1 295,0191,9179,0164,0 267,2239,1227,1212,0138,7 153,1 298,0
Fig. 140 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 311 à Tr 17.14 min.
Sur le spectre de masse enregistré en (-)-APCI, nous observons un ion quasi-moléculaire m/z
311 [M-H]- suggérant une masse atomique de 312 g/mole.
Le spectre MS2 de ce composé présente un ion majoritaire m/z 283 (perte de 28 uma)
correspondant à une perte de CO. De plus, deux autres ions fragments sont observés à m/z 268
et m/z 241.
Pour avoir plus d’informations, nous réalisons le spectre MS3 à partir de l’ion fils majoritaire
m/z 283. Le spectre obtenu est présenté dans la Fig. 141 suivante.
III. Résultats et discussion
175
Fig. 141 : Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 à Tr 17.14 min.
L’ion m/z 283 donne :
-un ion m/z 268 (perte de 15 uma) ce qui correspond à une perte d’un CH3.
-un ion m/z 241 (perte de 42 uma) ce qui correspond à une perte de C2H2O.
Il s’agit donc d’une flavanone méthoxylée (et pas une dihydrochalcone car nous n’avons pas
de perte d’H2O). Les deux autres ions observés à m/z 164 (perte de 119 uma) et m/z 179 (perte
de 104 uma) correspondent aux fragments A : 0,3A- et 1,3A-.
Il s’agit donc d’une flavanone dont le cycle B est non substitué et le cycle A est substitué par
un OH, un méthoxyle et un méthyle. Le spectre MS3 est comparé au spectre MS2 de la 7-
hydroxy-5-méthoxy-8-méthylflavanone (Host16) déjà isolée dans l’extrait hexanique (Fig.
142).
III. Résultats et discussion
176
Fig. 142 : Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 et spectre MS2 du composé Host16.
Les deux spectres sont équivalents. Ainsi, l’ion de masse m/z 283 qui correspond à une masse
de 284 g/mole a la même structure que le composé Host16 dont le schéma de fragmentations
est présenté dans la Fig. 143.
O
OO
HO
-H
m/z 283
-H
-C2H2O
O
HO O-H
m/z 241
O
OO
HO
m/z 268
-CH3
O
HO
O
O
-H
m/z 179
1,3 A-
O
HO
O-H
m/z 164
MS2
MS2
MS2
MS2
0,3 A-
Fig. 143 : Schéma de fragmentations du composé Host16. L’ion fragment en rouge
correspond au fragment majoritaire observé en MS2
Spectre MS2 de l’ion m/z 311 (Tr 17.14min)
Spectre MS2 de Host16
III. Résultats et discussion
177
Or le composé m/z 311 à Tr 17.14 min perd 28 uma pour donner l’ion m/z 283. Ainsi, pour ce
composé nous proposons la structure présentée Fig. 144 dans laquelle nous avons rajouté une
fonction aldéhyde supplémentaire sur le cycle A pour expliquer la perte de 28 uma.
La structure proposée est une flavanone connue déjà isolée d’une Myrtaceae (Cleistocalyx
operculatus), il s’agit de la 8-formyl-5-hydroxy-7-méthoxy-6-méthylflavanone [Chun-Lin Ye,
2004]. La différence concernant l’ion m/z 283 avec Host16 provient de la position des
substituants sur le cycle A mais seule une expérience HMBC en RMN 2D permettrait de
placer les substituants correctement.
O
OH
O
-H
m/z 311
-CH3
O
OOH
O
-H
O
O
m/z 283
-CO
(Isomère de Host16)
O
OH
O -H
m/z 296O
O
MS2
MS2
Fig. 144 : Structure proposée pour l’ion m/z 311 à Tr 17.14 min. Il s’agit de la 8-formyl-5-
hydroxy-7-methoxy-6-méthylflavanone. L’ion fragment en rouge correspond au fragment
majoritaire observé en MS2.
III. Résultats et discussion
178
� Composé de rapport m/z 311 à Tr 22.52 min
Ce composé est un isomère du composé précédent. Le profil du spectre UV de ce composé
montre deux maxima d’absorption à 286 nm et 338 nm ce qui nous permet d’envisager une
structure de type chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993;
Mabry et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig.
145 suivante.
160 180 200 220 240 260 280 300m/z
33
0
5
10
15
20
25
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0
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40
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311,2
299,1271,3146,9 283,1170,9 287,2157,1 185,0 253,2 257,2232,8215,1194,9 236,9223,0210,8283,1
311,1
191,9
281,1268,1 295,1163,9
194,0 279,1 296,0181,1 251,2235,1165,2 267,3 293,0152,0 241,1207,0 224,5211,1199,5
Fig. 145 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 311 à Tr 22.52 min.
Le spectre MS2 donne un ion fils majoritaire à m/z 283 comme précédemment. Nous réalisons
un expérience MS3 et nous comparons ce spectre MS3 avec le spectre MS3 du composé
précédent (Fig. 146).
III. Résultats et discussion
179
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z
100
0
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60
70
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ce268,0
283,1
281,1
284,2163,9 280,2
255,1241,2162,7 225,2 307,2178,9 190,176,0 113,7 136,1 312,2207,5 285,2283,1
241,0
268,0
284,0163,9 267,4242,0179,0135,8 269,2239,0226,0210,8156,1 285,0191,994,1
gb3186-06#966-970 RT: 22,34-22,43 AV: 3 NL: 3,51E4 F: - c APCI Full ms3 311,18@37,00 283,12@37,00 [ 75,00-320,00]
gb3186-06#735-741 RT: 16,96-17,09 AV: 7 NL: 3,87E4 F: - c APCI Full ms3 311,18@37,00 283,12@37,00 [ 75,00-320,00]
Fig. 146 : Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 à Tr 22.52 et spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 à
Tr 17.14 min.
Nous obtenons les mêmes ions fragments avec des différences d’intensité concernant les ions
m/z 268 (perte de 15 uma par rapport à l’ion m/z 283) et m/z 241 (perte de 42 uma par rapport
à l’ion m/z 283).
Or nous avons pu constater que dans le cas des chalcones et flavanones isomères méthoxylées
(Tableau 23), la perte de 15 uma (perte de CH3) est plus importante que la perte de 42 uma
(perte de C2H2O) dans le cas des chalcones comme nous pouvons le voir pour le composé m/z
311 à Tr 22.52 (Fig. 146).
Ainsi, le composé à Tr 22.52 min est l’isomère chalcone du composé m/z 311 à Tr 17.14. Il
s’agit d’un composé déjà connu, isolé d’une Myrtaceae (Cleistocalyx operculatus), il s’agit de
la 3’-formyl-4’,6’-dihydroxy-2’-méthoxy-5’-méthylchalcone [Chun-Lin Ye, 2004]. Sa
structure et son schéma de fragmentation sont présentés dans la Fig. 147.
Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 (Tr 22.52min)
Spectre MS3 de L’ion m/z 311/283 (Tr 17.14min)
III. Résultats et discussion
180
O
OH
HO
-H
m/z 311 -CH3
O
O
-COm/z 283
O
OH
HO
-H
O
O
m/z 295
O
OH
HO
-H
O
OOH
OHO
-H
m/z 283
OOH
OHO
m/z 268
-H
A B
-CH3
O
HO O
-H
-C2H2O
m/z 241
OH
OHO
m/z 153
-H
OHO -H
m/z 179
OO
HO O
-H
m/z 164
OO
-CH3
MS2
MS2
MS2
MS2 MS3
0A-
1A-
Fig. 147 : (a) Schéma de fragmentations de l’ion m/z 311 conduisant aux ions m/z 295 et m/z
283. (b) Schéma de fragmentations de la Chalcone Host12.
Nous pouvons constater que l’ion m/z 283 du composé m/z 311 à Tr 22.52 correspond à l’ion
m/z 283 du composé Host12 déjà isolé de l’extrait hexanique.
La position des substituants sur le cycle A reste à confirmer mais seule une expérience
HMBC en RMN 2D peut nous donner cette information.
(a)
(b)
III. Résultats et discussion
181
� Composé de rapport m/z 327 à Tr 8.92 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 327 à Tr 8.92 min montre deux maxima
d’absorption à 235 nm et 295 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry
et al., 1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont présentés dans
la Fig. 148 suivante.
100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z
12
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2
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327.05
328.04
110.97 146.91 329.05313.19 412.88370.82156.86 438.62283.24 478.94222.98208.97 236.98283.18
284.15
309.05241.30 282.47179.20 326.95164.12 211.24135.20104.98283.12
241.23
268.16
284.11
164.11 242.25179.15226.16153.16136.07 180.20105.03 243.21 285.00 313.08
Fig. 148 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 et spectre MS3du
composé m/z 327 à Tr 8.92 min.
Nous pouvons observer sur le spectre de masse un ion quasi-moléculaire m/z 327 [M-H]- qui
suggère une masse de 328 g/mole.
Le spectre MS2 présente un ion fils majoritaire m/z 283 (perte de 44 uma) sur lequel nous
avons réalisé une expérience MS3 (Fig. 148).
L’ion m/z 283 donne :
-un ion m/z 268 (perte de 15 uma) ce qui correspond à une perte d’un CH3.
-un ion m/z 241 (perte de 42 uma) ce qui correspond à une perte de C2H2O.
III. Résultats et discussion
182
Il s’agit donc d’une flavanone méthoxylée (et pas une dihydrochalcone car nous n’avons pas
de perte d’H2O) Les deux autres ions observés à m/z 164 (perte de 119 uma) et m/z 179 (perte
de 104 uma) correspondent respectivement aux fragments 0,3A- et 1,3A-.. Nous retrouvons les
mêmes ions fragments que pour la flavanone méthoxylée Host16 déjà isolée de l’extrait
hexanique (Fig. 149).
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z
19
0
2
4
6
8
10
12
14
16
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
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283,1
241,3
268,2
242,3164,1 179,2 267,3269,2226,2 240,4211,1136,1 153,2 165,1 180,2 255,2105,1 198,2111,1 133,191,2
283,1
241,1
268,1
281,3
179,0163,9 242,1 269,0267,2240,4165,1 226,0180,0135,1 251,1198,0 266,4138,0 154,9 210,8
Fig. 149 : Spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 et spectre MS2 du composé Host16.
Ainsi l’ion m/z 283 correspondant à une masse de 284 g/mole présente la même structure que
le composé Host16.
L’ion m/z 327 présente 44 uma supplémentaire. Nous proposons de rajouter une fonction
acide carboxylique sur le cycle A du composé Host16. La molécule proposée et son schéma
de fragmentations sont présentés dans la Fig. 150 suivante.
Spectre MS3 de l’ion m/z 327 (Tr 8.92min)
Spectre MS/MS de Host16
III. Résultats et discussion
183
O
OO
HO
O
-H
HO
m/z 327
-H2O
O
O
-H
m/z 309
-CO2
O
OO
HO
-H
m/z 283
O
O
O
MS2
MS2
O
OO
HO
-H
m/z 283
-H
-C2H2O
O
HO O-H
m/z 241
O
OO
HO
m/z 268
-CH3
O
HO
O
O
-H
m/z 1791,3 A-
O
HO
O-H
m/z 164
MS2
MS2
MS2
MS2
0,3 A-
Fig. 150 : (a) Schémas de fragmentations de l’ion m/z 327 conduisant aux ions m/z 309 et m/z
283. (b) Schémas de fragmentations de la flavanone Host16. les ions fragments en rouge
correspondent aux ions majortaires obtenus en MS2.
La fonction carboxylique a été placée sur le cycle A car si elle était sur le cycle B, nous
aurions dû avoir des ions fils correspondant. De plus, biogénétiquement, ce genre de fonction
se retrouve généralement sur le cycle A.
La séparation étant réalisée en phase inverse, le temps de rétention très rapide de ce composé
s’explique par son caractère très polaire dû à la présence de la fonction acide carboxylique.
Cette observation nous permet de confirmer notre hypothèse de structure pour ce composé.
(a)
(b)
III. Résultats et discussion
184
� Composé de rapport m/z 327 à Tr 12.14 min
Ce composé est un isomère du composé précédent. Le profil du spectre UV de ce composé
montre deux maxima d’absorption à 295 nm et 338 nm ce qui nous permet d’envisager une
structure de type chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993;
Mabry et al., 1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont
présentés dans la Fig. 151 suivante.
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z
19
0
5
10
15
67
0
10
20
30
40
50
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100
0
20
40
60
80
327,0
301,2
302,2125,1 147,0 318,9283,3133,0 156,9 257,3 300,5171,0 233,3 269,2223,1193,2 250,6209,1179,1283,2
284,2
309,0268,3164,2 241,3153,2 327,0179,4 284,9211,2 255,5136,0 197,4 226,0122,3
283,1
268,1
164,1284,1
241,3269,1
240,3179,2153,2136,1 255,3211,1192,2 226,1 299,7132,9
Fig. 151 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 et spectre MS3
du composé m/z 327 à Tr 12.14 min.
Nous pouvons observer sur le spectre de masse un ion quasi-moléculaire m/z 327 [M-H]- qui
suggère une masse de 328 g/mole.
Le spectre MS2 présente un ion fils majoritaire m/z 283 (perte de 44 uma) sur lequel nous
avons réalisé une expérience MS3 (Fig. 151).
L’ion m/z 283 donne les mêmes ions que le composé précédent :
-un ion m/z 268 (perte de 15 uma) ce qui correspond à une perte d’un CH3.
-un ion m/z 241 (perte de 42 uma) ce qui correspond à une perte de C2H2O.
III. Résultats et discussion
185
La Fig. 152 compare le spectre MS3 du composé m/z 327 à Tr 12.14 min et le spectre MS3 du
composé précédent m/z 327 à Tr 8.92 min.
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
91
0
10
20
30
40
50
60
70
80
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ce283,1
268,1
164,1
284,1
241,3269,1
240,3179,1153,2136,1 255,3211,1192,2 282,4105,0 299,7119,194,5 325,582,8283,1
241,3
268,2
284,1
242,3164,1 179,2 267,3269,2226,2211,1136,1 153,2 165,1 180,2 255,2105,1 207,3 284,9112,2 299,682,9 98,9 318,7
Fig. 152 : Spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 à Tr 12.14 et spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 à
Tr 8.92 min.
Nous obtenons les mêmes ions fragments avec des différences d’intensité concernant les ions
m/z 268 (perte de 15 uma par rapport à l’ion m/z 283) et m/z 241 (perte de 42 uma par rapport
à l’ion m/z 283).
Or nous avons pu constater que dans le cas des chalcones et flavanones isomères méthoxylées
(Tableau 23), la perte de 15 uma (perte de CH3) est plus importante que la perte de 42 uma
(perte de C2H2O) dans le cas des chalcones comme nous pouvons le voir pour le composé m/z
327 à Tr 12.14 (Fig. 152).
Ainsi, le composé m/z 327 à Tr 12.14 min est l’isomère chalcone du composé m/z 327 à Tr
8.92. La structure et le schéma de fragmentations de ce composé sont présentés dans la Fig.
153 suivante.
Spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 (Tr 12.14min)
Spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 (Tr 8.92min)
III. Résultats et discussion
186
O
OH
HO
-H
m/z 327
-H2O
OOH
-H
O
OOH
HO
-H
O
O OH
OO
O
m/z 309
m/z 283
-CO2
MS2
MS2
OOH
OHO
-H
m/z 283
OOH
OHO
m/z 268
-H
A B
-CH3
O
HO O
-H
-C2H2O
m/z 241
HO O
-H
m/z 164
OH
OHO
m/z 153
OHO
-H
-H
m/z 179
OO
OO
-CH3
MS2
MS2
MS2
MS2
0A-
1A-
[1A-CH3]-
Fig. 153 : (a) Schémas de fragmentations de l’ion m/z 327 conduisant aux ions m/z 309 et m/z
283. (b) Schémas de fragmentations du composé Host12. L’ion fragment en rouge correspond
à l’ion majoritaire obtenu en MS2.
Ainsi, les deux composés de masse 328 g/mole sont des isomères dont l’un présente une
génine flavanone et l’autre une génine chalcone. De plus les structures proposées présentent
(a)
(b)
III. Résultats et discussion
187
toutes les deux une fonction carboxylique, pouvant expliquer leur élution rapide sur colonne
en phase inverse.
� Composé de rapport m/z 341 à Tr 18.01 min
Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 341 à Tr 18.01 min montre deux maxima
d’absorption à 232 nm et 287 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry
et al., 1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont présentés dans
la Fig. 154 suivante.
Fig. 154 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 du composé m/z 341 à Tr 18.01 min
Nous observons sur le spectre de masse enregistré en (-)-APCI un ion m/z 341 [M-H]- en
accord avec une masse de 342 g/mole.
Le spectre MS2 donne un ion m/z 283 (perte de 58 uma) et un ion fils majortaire à m/z 271
(perte de 70 uma). Cet ion fils est fragmenté suite à une expérience de MS3 (Fig. 155).
III. Résultats et discussion
188
Fig. 155 : Spectre MS3 de l’ion m/z 341/271 à Tr 18.01 min.
Le spectre MS3 donne les ions suivants :
-un ion majoritaire m/z 253 (perte de 18 uma par rapport à m/z 271) suggérant la perte d’H2O.
-un ion m/z 238 (perte de 33 uma par rapport à m/z 271).
Une perte majoritaire d’H2O nous permet de considérer que le composé est une
dihydrochalcone (clé d’identification, Tableau 23). De plus, nous obtenons les mêmes ions
que la dihydrochalcone Host9 déjà isolée de l’extrait hexanique et déjà identifié dans l’extrait
par LC/MS à un temps de rétention de 15.34 min.
La comparaison des spectres est présentée dans la Fig. 156 suivante.
III. Résultats et discussion
189
120 140 160 180 200 220 240 260m/z
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0,9
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7R
ela
tive
Ab
un
da
nce
253,1
271,1
254,1238,0151,9
255,9138,9 257,1164,9153,2 182,9 251,1105,1 237,2178,5 207,2
253,2
271,1
238,3 254,2152,1
239,3165,1 257,1153,2139,1 173,1124,1 151,1 210,2121,1 180,2 197,2 228,8221,0108,4
Fig. 156 : Spectre MS3 de l’ion m/z 341/271 à Tr 12.14 et spectre MS2 de l’ion m/z 271 à Tr
15.34 min.
Nous pouvons constater que les deux spectres sont identiques. Ainsi l’ion m/z 271
correspondant à une masse de 272 g/mole est la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone.
L’ion m/z 341 présente 58 unités de masse supplémentaires par rapport à l’ion m/z 283 et 70
unités de masse supplémentaires par rapport à l’ion m/z 271.
Nous pouvons envisager deux hypothèses en ce qui concerne la formule brute correspondant à
une perte de 58 uma: C4H10 ou C3H6O [De Hoffmann et al., 1999].
Sachant que la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone (Host9) a été identifiée à un
temps de rétention de 15.34 minutes, ce composé de masse 342 g/mole qui présente un temps
de rétention de 18.01 min (séparation sur colonne en phase inverse) est donc plus apolaire.
L’hypothèse d’une perte de 58 uma correspondant à une perte de C4H10 est donc la plus
plausible et donc la différence de 70 unités de masse correspondrait à C5H10, un fragment
isoprénique.
Ainsi, nous proposons une structure de type dihydrochalcone dont un des substituants sur le
cycle A serait un isoprène. La structure et le schéma de fragmentations proposés sont
présentés Fig. 157.
Spectre MS3 de l’ion m/z 341/271 à Tr 18.01min
Spectre MS2 de l’ion m/z 271 à Tr 15.34min
III. Résultats et discussion
190
OH
OOH
O
-H
m/z 341
-H2O
OH
O
-H
m/z 323
O
-C4H10OH
OOH
O
-H
m/z 283
-C5H10
OH
OOH
O
-H
m/z 271
MS2
MS2
MS2
OOH
O OH
-H
m/z 271
OOH
O
-H
m/z 253
-H2O
OOH
O
-H
m/z 238
-CH3
OH
O
-H
m/z 210
-18 -15
-CO-28
A B
OH
O OH
O OH
OO
-H
m/z 165
O
m/z 152
MS2
MS2
MS2
MS3
MS4
1A-
1A--CH3
Fig. 157 : (a) Schéma de fragmentations de l’ion m/z 341 conduisant aux ions m/z 323, 283 et
271. (b) Schéma de fragmentations de la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone
(Host9). Les ions fragments en rouge correspondent aux ions majoritaires obtenus par MS2.
La structure proposée serait nouvelle. Des dihydrochalcones isoprénylées ont déjà été isolées
dans la nature, notamment dans les racines de Brosimum acutifolium (Moraceae) [Takashima
et Ohsaki, 2002].
(a)
(b)
III. Résultats et discussion
191
� Composé de rapport m/z 341 à Tr 22.76 min
Le profil du spectre UV du composé m/z 341 à Tr 22.76 min montre deux maxima
d’absorption à 287 nm et 337 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type
chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry et al.,
1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont présentés dans la Fig.
160 suivante.
140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z
95
0
10
20
30
40
50
60
70
80
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
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341,2
277,2
146,9 342,1
148,9156,9 271,2 327,0315,1285,2170,9 306,9197,0 214,8176,9 343,0220,9 253,1233,0
309,0
294,0341,1
310,0297,1
342,1189,9 325,9311,1265,1 293,2237,1222,0 280,9241,2 308,3140,9 195,0 209,2161,9 179,1
Fig. 158 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 du composé m/z 341 à Tr 18.01 min.
Le spectre de masse révèle un ion m/z 341 [M-H]- suggérant une masse molaire de 342
g/mole.
Le spectre MS2 présente un ion fils majoritaire m/z 309 (perte de 32 uma) sur lequel nous
avons réalisé une expérience MS3 (Fig. 159). La perte de 32 uma suggère la perte d’une
molécule de CH3OH. De plus, nous distinguons la présence d’un ion m/z 326 (perte de 15
uma) ce qui laisse supposer que le composé est une chalcone ou une flavone méthoxylée.
III. Résultats et discussion
192
Fig. 159 : Spectre MS3 de l’ion m/z 341/309 à Tr 22.76 min.
Le spectre MS3 conduit respectivement pour les ions majoritaires à une perte de CH3 (m/z
294, perte de 15 uma), de MeOH (m/z 277, perte de 32 uma) et de CO2 (m/z 265) par rapport à
l’ion m/z 309.
La présence de ces trois ions suggère que nous sommes en présence d’un composé qui
présente un substituant méthyle ester comme dans le cas du composé Host6 (structure Fig.
160).
OOH
HO O
OO
Fig. 160 : Rappel de la structure du composé Host6.
La structure et le schéma de fragmentations que nous proposons sont présentés dans la Fig.
161.
III. Résultats et discussion
193
O
OH
HO
-H
m/z 341O
O O
-CH4O
O
OH
-H
m/z 309O
O
O
-CH3
O
OH
-H
m/z 294O
O
O
-CO2
O
OH
-H
m/z 265O
OH
O
O
m/z 191(perte de 119 uma)-CH3
O
OH
HO -H
m/z 294O
O O
-H
MS2
MS2
MS3
MS3
O
O
MS3
Fig. 161 : Schéma de fragmentations proposé de l’ion m/z 341 à Tr 22.76 min. L’ion fragment
en rouge correspond au fragment majoritaire obtenu en MS2.
Nous avons choisi la génine chalcone plutôt que la génine flavone car nous avons déjà isolé et
identifié dans la plante le composé Host6 (Fig. 160) dont le précurseur correspondrait à cette
chalcone.
Néanmoins, dans le spectre MS2, nous n’avons pas les ions fragments qui correspondent aux
fragments A : 1A-, [1A-CH3]- et 0A- qui seraient attendus à m/z 238, m/z 223 et m/z 210.
Pour confirmer l’identification de ce composé, il serait souhaitable de pouvoir l’isoler et de
réaliser des expériences de RMN.
Ainsi le composé Host6 (Fig. 159) pourrait être le produit d’une réaction de Diels-Alder entre
la chalcone identifiée ici et un dérivé myrcène.
III. Résultats et discussion
194
F. 3 Bilan de l’analyse par LC/DAD/APCI-MSn
� L’étude par LC/DAD/MS de l’extrait AcOEt nous a permis d’identifier des molécules
déjà isolées dans l’extrait hexanique mais aussi de repérer de nouvelles structures d’un
point de vue phytochimique (Tableau 25).
� Au total 6 composés nouveaux dans la plante et dans le genre ont été identifiés dont au
moins 4 composés de structures nouvelles.
� Les molécules nouvelles présentent des génines de type flavanone, dihydrochalcone et
chalcone et présentent des substituants originaux de type méthyle, méthoxyester ou
monoterpéne.
Bien que l’utilisation des données en spectroscopie UV et MS nous a permis d’identifier de
nombreux composés, elles présentent certaines limites. Les règles de fragmentation que nous
avons établi ne sont valables que si l’on considère des chalcones, dihydrochalcones ou
flavanones de structure simple.
La spectrométrie de RMN reste néanmoins la méthode la plus sûre pour établir la structure
d’un composé inconnu.
III. Résultats et discussion
195
Temps de rétention Abondance Composés nouveaux
en minutes (TIC)
Relative des
composés (TIC)
(N) ou déjà identifiés (C)
en phytochimie
Structure
8.92 328 21 N
12.14 328 28 N
12.48 302 28 N
15.34 272 19 C
15.73 284 5 C
Masse molaire en
g/mole
O
OO
HO
O
HO
O
OH
HO
O
O OH
OOH
O
O
OH
OOH
O OH
O
OOH
HO
Temps de rétention Abondance Composés nouveaux
en minutes (TIC)
Relative des
composés (TIC)
(N) ou déjà identifiés (C)
en phytochimie
Structure
16.87 284 6 C
17.14 312 1 C
18.01 342 1 N
18.61 298 6 C
22.52 312 2 C
Masse molaire en
g/mole
OOH
OHO
O
OH
O
O
O
OH
OOH
O
OOH
OHO
O
OH
O
O
O
Temps de rétention Abondance Composés nouveaux
en minutes (TIC)
Relative des
composés (TIC)
(N) ou déjà identifiés (C)
en phytochimie
Structure
22.76 342 2 N
Masse molaire en
g/mole
O
OH
HO
O
O O
Tableau 25 : Bilan des molécules identifiées dans l’extrait AcOEt de P. hostmannianum var. berbicense par LC/DAD/APCI-MSn
IV. Conclusions et perspectives
196
Les plantes restent la source prédominante de médicaments pour la majorité de la population
mondiale, en particulier dans les pays en voie de développement. Environ 40 % des
médicaments sont ainsi dérivés de la nature [Newman et Cragg, 2007]. Dans le cas de la lutte
contre le paludisme, les succès en clinique de la quinine et de l’artémisinine, molécules
naturelles isolées respectivement de Cinchona sp. et Artemisia sp. encourage la recherche de
nouvelles molécules antipaludiques issues de la biodiversité végétale.
Mon travail de thèse s’est inscrit dans le cadre des travaux de recherche du laboratoire
de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox (UMR-152) dont l’un
des objectifs est de découvrir de nouveaux candidats médicaments dans le domaine des
maladies parasitaires (paludisme, leishmaniose) à partir d’espèces végétales de Guyane, de
Bolivie ou du Pérou.
Le but de ce travail était de réaliser l’étude phytochimique bioguidée d’une plante guyanaise
Piper hostmannianum var. berbicense en vue de l’identification de molécules potentiellement
antiplasmodiales. Le stage en spectrométrie de masse au laboratoire de pharmacognosie de
l’UCL à Bruxelles sous la direction du Pr. Joëlle Quetin-Leclercq a consisté à étudier la
fragmentation de composés de type chalcone, dihydrochalcone et flavanone en vue de pouvoir
les identifier dans un extrait brut par LC/MSn.
Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var. berbicense
La sélection du matériel végétal sur le terrain s’est avérée difficile car deux espèces de
Piper hostmannianum sont présentes en Guyane Française et leur différenciation selon des
critères botaniques est une tâche particulièrement difficile pour des non-spécialistes. La
comparaison des profils phytochimiques des extraits de deux variétés de plantes ainsi que
l’évaluation de leur activité antiplasmodiale nous a permis de distinguer sans aucune
ambiguïté les deux variétés. Seule la variété berbicense démontre une potentielle activité
antiplasmodiale. Une application future serait la comparaison des profils phytochimiques par
LC/MS.
L’étude phytochimique bioguidée des extraits hexanique et chloroformique des
feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense a conduit à l’isolement de 17 composés dont
3 chalcones, 7 dihydrochalcones et 7 flavanones. Cinq composés présentent des structures
IV. Conclusions et perspectives
197
nouvelles. L’originalité des molécules isolées réside dans la présence de substituants terpénés
ou méthylés relativement rares dans le règne végétal.
L’ensemble des composés isolés ont été évalués in vitro sur deux souches de P. faciparum,
une souche chloroquino-résistante, FcB1 et une souche chloroquino-sensible, F32. Leur
cytotoxicité a été évaluée sur des cellules de tumeur mammaire MCF-7. Sur 17 composés
isolés, 6 molécules sont potentiellement actives : une flavanone (Host1), deux
dihydrochalcones (Host7 et Host9) et deux chalcones (Host11 et Host12) avec des CI50
comprises entre 2 et 6 µg/ml. Les molécules ayant une activité proche de celle de l’extrait de
départ (CI50= 8 µg/ml), nous pouvons supposer que l’activité est due à la combinaison de
plusieurs molécules ou à des composés minoritaires qui n’ont pas été identifiés.
Par conséquent, il serait intéressant de pouvoir évaluer l’éventuelle synergie d’action des deux
composés les plus actifs et qui présentent le meilleur indice de sélectivité à savoir les deux
dihydrochalcones Host7 et Host9. Cette étude est actuellement en cours au sein de la
plateforme de biologie de l’UMR-152.
De plus, l’activité in vivo de ces deux dihydrochalcones (Host7 et Host9) a été évaluée sur
des souris infectées par P. vinckei petteri. Les résultats obtenus montrent une diminution
significative de la parasitémie : 80% pour le composé Host7 (20 mg/kg) et entre 40% et 90%
pour le composé Host9 au J5.
Pour le composé Host7, le temps de survie est de trois jours et demi de plus par rapport au
témoin chloroquine. Concernant le composé Host9, aux deux doses les plus élevées (10 et 20
mg/kg), le temps de survie est équivalent voir supérieur à celui de la chloroquine.
Ces résultats très encourageant doivent être confirmés par d’autres expériences avec des doses
plus importantes pour obtenir 100% de guérison et évaluer le temps de survie des souris. Il
serait aussi intéressant d’envisager un traitement par voie orale.
Bien que les doses testées soient relativement importantes (jusqu’à 20 mg/kg), nous n’avons
pas de problème de disponibilité car le composé Host9 est le composé majoritaire ( environ 1
g) de l’extrait chloroformique (15 g) de cette plante (voir paragraphe D. 4. 3. 1). Concernant
le composé Host7, une hémisynthèse à partir du composé Host9 serait potentiellement
envisageable en réalisant la condensation du p-menthène sur l’unité dihydrochalcone pour
pouvoir en disposer plus rapidement en plus grande quantité .
IV. Conclusions et perspectives
198
Le mode d’action de ces composés restent encore à déterminer bien que des études récentes
ont pu démontré que les molécules de type chalcone seraient des inhibiteurs de cystéine
protéases [Dominguez et al., 2001; Li et al., 1996].
Etude en spectrométrie de masse des chalcones, dihydrochalcones et flavanones
Afin de mieux appréhender « on-line » l’identification par LC/MS de ces composés,
nous avons étudié la fragmentation des molécules isolées et de quelques témoins
commerciaux de même génine en APCI en mode négatif sur un spectromètre de masse à
trappe d’ions.
Des règles de fragmentations ont pu être établies mettant en évidence des ions diagnostics
spécifiques de ces structures. Un clé d’identification a pu être établie en tenant compte des
informations apportées par les spectres UV et les spectres enregistrés en MSn. La comparaison
des différents fragments obtenus dans les cas des chalcones, dihydrochalcones et flavanones
montre des différences essentiellement au niveau des pertes de neutre. Ainsi, les chalcones
méthoxylées perdent plus facilement leur groupement méthyle alors que dans le cas des
dihydrochalcones méthoxylées la perte d’H2O est majoritaire.
Les chalcones et flavanones isomères présentent des spectres MS2 identiques (avec une même
énergie de collision) qui diffèrent seulement au niveau de l’intensité des fragments. Les
flavanones méthoxylées ont ainsi une perte de C2H2O (perte de 42 uma) favorisée par rapport
à la perte d’un radical méthyle (et inversement dans le cas des chalcones méthoxylées).
L’identification d’un type de noyau flavonoïde chalcone, dihydrochalcone ou flavanone peut
donc être résolue rapidement grâce à l’analyse des son spectre de masse enregistré en MS2 et
de son spectre UV.
L’application directe de ce travail a été menée sur l’extrait acétate d’éthyle de Piper
hostmannianum var. berbicense. Les spectres MS, MS2 et MS3 de onze composés ont été
étudiés. Quatre d’entre eux ont été identifiés aux composés déjà isolés dans l’extrait
hexanique par comparaison de leur spectre MS2. Les structures des sept autres composés ont
été proposées sur la base des fragments obtenus en MS2 et en MS3 en considérant les règles de
fragmentation établies dans la première partie de ce stage. Les structures proposées sont des
chalcones, dihydrochalcones ou flavanones présentant des substituants méthylés, méthoxylés
IV. Conclusions et perspectives
199
ou ester. Il serait intéressant de pouvoir isoler ces composés et de confirmer leurs structures
par des analyses en RMN 1D et 2D dans le but de pouvoir évaluer leur potentiel
antiplasmodial. L’application des résultats de cette étude a déjà pu être réalisée sur des
composés isolés au Pérou sur d’autres plantes du genre Piper démontrant la réelle efficacité
de cette technique.
En conclusion, ce travail de thèse a permis d’isoler par bioguidage 17 composés de P.
hostmannianum var. berbicense dont six d’entre eux révèlent une potentielle activité
antiplasmodiale. La technique du bioguidage présente néanmoins des limites car des
composés actifs minoritaires sont ainsi difficilement détecté dans une fraction qui en
dénombre des centaines de molécules inactives.
L’identification de molécules de type chalcones et dihydrochalcones démontre leur intérêt
comme source de substances naturelles aux activités antiparasitaires prometteuses.
Face à l’urgence de la découverte de nouvelles molécules antipaludiques, la détection rapide
de molécules potentiellement actives notamment par LC/MS devient une réelle nécessité.
Cette technique est néanmoins plus facile à réaliser dans le cas des flavonoïdes dont les
propriétés spectrales sont caractéristiques et bien connues que pour d’autres classes de
composés. Celle-ci devrait être facilitée au fur et à mesure du progrès des avancées techniques
en analytique et notamment de la LC/RMN. Les sujets d’études dans ce domaine ne manquent
donc pas et chaque plante est un réservoir potentiel de métabolites avec des caractéristiques
phytochimiques originales
V. Matériels et méthodes
200
G. Matériels et méthodes
G. 1 Matériel végétal et extraction
Identification de la plante
Tous les échantillons étudiés ont été récoltés entre juillet 2003 et février 2006 sur la piste de
Saint Elie en Guyane Française. Ils ont été identifiés par le Dr. Geneviève Bourdy, chargé de
recherche à l’IRD et cette identification a été confirmée par le Pr. Ricardo Callejas Posada de
l’Université d’Antioquia en Colombie. Les échantillons d’herbiers (1016, 1032, GB3141,
GB3142, GB3143, GB3144, GB3145, GB3162, GB3163, GB3164, GB3165, GB3166,
GB3167, GB3168, GB3169, GB3169bis, GB3171, GB3172, GB3174, GB3175, GB3176,
GB3177, GB3178, GB3179, GB3180, GB3181, GB3182, GB3183, GB3184, GB3185 et
odonne /delnatte6) ont été déposés à l’herbarium de l’IRD de Cayenne.
Préparation des échantillons
Au cours de ces recherches, nous avons travaillé sur des feuilles de Piper hostmannianum var.
berbicense. Elles ont été séchées en Guyane à température ambiante et à l’abri de la lumière
avant d’être envoyées à Toulouse. Elles ont été pulvérisées à l’aide d’un broyeur Retsch® avec
un tamis de 0,5 mm. Cette poudre est conservée à température ambiante, à l’abri de la lumière
et de l’humidité.
Extraction
• Extraction par l’ASE 100 Dionex
Les lots ont d’abord été extraits en petite quantité (environ 2 g de poudre) par l’acétate
d’éthyle à l’aide d’un extracteur ASE 100 de marque Dionex avant d’être envoyés à tester in
vitro sur P. falciparum. Cet appareil permet une extraction rapide en utilisant des solvants à
températures variables et à pression élevée (100 Bars). Les conditions d’extraction sont :
-Cartouche d’extraction de 10 ml.
-Nombre de cycles : 2.
-Température ambiante.
V. Matériels et méthodes
201
• Extraction par lixiviation
Les lots actifs sont ensuite extraits en grande quantité (500 g pour le lot 1016 et 900 g pour le
lot 1016bis) successivement par de l’hexane, du chloroforme et du méthanol.
La lixiviation (ou percolation) consiste à faire passer un solvant au travers d’une poudre de
plante jusqu’à épuisement de cette dernière. La percolation, même si elle est coûteuse en
temps et en solvant, offre l’avantage d’assurer une extraction quasi-totale des principes actifs
à température ambiante, diminuant ainsi les risques de dégradation.
G. 2 Méthodes chromatographiques analytiques
G. 2. 1 Chromatographie sur couche mince (CCM)
Utilisés à chaque étape pour le suivi et le contrôle des purifications, les chromatogrammes sur
couche mince permettent de vérifier la présence et l’état de pureté des produits suivis.
Les analyses sur couche mince sont réalisées en phase normale sur des plaques d’aluminium
recouvertes d’un gel de silice Silicagel 60 F254 (Merck). Le développement des plaques
s’effectue dans des cuves en verre saturées avec l’éluant approprié. Cette phase mobile est
constituée d’un mélange binaire ou tertiaire de solvants selon le type de séparation souhaitée.
Dans notre cas, les systèmes de solvants pour les différentes classes de composés sont les
suivants (les proportions sont données en volume et ils sont classés par polarité croissante) :
• Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)
• CHCl3/MeOH (90/10)
• CHCl3/MeOH/H2O (65/25/4)
L’observation des CCM s’effectue en lumière visible et sous UV (254 et 365 nm), avant et,
dans certains cas, après révélation par les réactifs appropriés.
L’utilisation de différents réactifs permet de rassembler judicieusement les fractions récoltées
suite aux différentes séparations chromatographiques.
V. Matériels et méthodes
202
Les réactifs utilisés pour le présent travail sont les suivants :
• Réactif à la Vanilline sulfurique (Révélateur universel).
Préparer une solution composée de 1 g de vanilline, 2 ml d’acide sulfurique et de l’éthanol à
95% q.s.p. 100 ml. Après pulvérisation, chauffer la plaque de CCM à 110°C pendant 5
minutes environ. Plusieurs colorations apparaissent en fonction du type de composés.
• Réactif de Neu ou NP/PEG (Révélateur des flavonoïdes).
Préparer une solution A composée de 1 g d’acide amino-2-éthyldiphénylborique et de 100 mL
de méthanol et une solution B composée de 5 g de PEG 4000 et de 100 ml d ‘éthanol.
Pulvériser un mélange de 10 mL de solution A et 8 mL de solution B (préalablement
mélangées avant pulvérisation). Chauffer la plaque de CCM à 110 °C pendant 2 minutes
environ. Observés en lumière UV à 365 nm, les flavonoïdes apparaissent sous forme de taches
fluorescentes jaunes, vertes ou orange [Wagner et Bladt, 2001].
• Réactif de Dragendorff (Révélateur des alcaloïdes).
Préparer une solution composée de 0,85 g de nitrate basique de bismuth et 10 g d’acide
tartrique dans 40 mL d’eau (solution A) et une solution contenant 16 g de KI dans 40 mL
d’eau (solution B). Mélanger extemporanément 5 mL de A, 5 ml de B, 100 ml d’eau et 20 g
d’acide tartrique. Vaporiser le mélange sur la plaque. Les alcaloïdes apparaissent sous forme
de taches oranges [Merck, 1975].
G. 2. 2 Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV)
Les analyses HPLC/UV(DAD) ont été effectuées à l'aide d'une chaîne HPLC Merck Hitachi
Lachrom munie d’une pompe Lachrom 7100 et d’un détecteur UV à barrettes de diodes
(DAD-UV) Merck Hitachi Lachrom 7455 pilotés par le logiciel D-7000 HSM (Merck).
Les analyses ont été réalisées en phase inverse avec une colonne HPLC de type Pursuit XRs
RP-18 (Varian) (5 µm, 250 x 4.6 mm). Les solvants utilisés sont de qualité HPLC et le débit
est fixé à 1 ml/min.
En règle générale, pour l’analyse HPLC/UV des extraits bruts, des solutions de 1 à 3 mg/ml
de solvant ont été utilisées. Pour toutes les analyses, les conditions chromatographiques ont
consisté en un gradient de MeOH/H2O. Le solvant d’injection est de composition identique à
celui du solvant initial de l’analyse et le volume d’injection fixé à 20 µL.
V. Matériels et méthodes
203
Conditions chromatographiques particulières :
• Composés Host3, Host4, Host5 et Host6 : élution selon un gradient MeOH/H2O : t=0
min 80% MeOH ; t=10 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux
conditions initiales en 5 minutes.
• Composés Host8 et Host9 : élution en mode isocratique MeOH/H2O 60/40.
• Composés Host14, Host15 et Host16 : élution selon un gradient MeOH/H2O : t=0
min 60% MeOH ; t=20 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux
conditions initiales en 5 minutes.
G. 2. 3 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
Les analyses LC-MS ont été effectuées sur l’appareillage constitué des éléments suivants :
� Système HPLC TSP (Thermo Separation Product) muni d’une pompe quaternaire (P
4000), d’un autosampler (AS 3000) et d’un détecteur UV à barrettes de diodes (6000LP).
Elution selon un gradient MeOH/H2O : t=0 min jusqu’à t=20 min 60% MeOH jusqu’à 100%
MeOH pendant 5 min puis retour aux conditions initiales en 5 minutes. Débit 1 ml/min.
Détection UV réglée à 360 nm.
� Spectromètre de masse à trappe d’ions LCQ Finnigan équipé d’une interface d’ionisation
APCI et contrôlé par le logiciel Xcalibur. Température de la source : 420 °C, 37% d’énergie
de collision.
G. 3 Méthodes chromatographiques préparatives
G. 3. 1 Chromatographie sur colonne ouverte (CC)
Pour les chromatographies sur colonnes ouvertes, plusieurs types de phases ont été mises en
œuvre dans des colonnes en verre. La taille et le diamètre de la colonne sont choisis en
fonction de la quantité d’échantillon à purifier et de la résolution souhaitée.
V. Matériels et méthodes
204
Pour les chromatographies d’adsorption, la phase stationnaire utilisée est la silice en phase
normale SDS 60 Å 70-200 µm (SDS) préalablement activée quelques heures à l’étuve à 110
°C. L’élution est réalisée par simple gravité. La quantité de silice utilisée est généralement 30
à 50 fois supérieure à la quantité d’échantillon déposée. L’extrait à fractionner est adsorbé sur
une quantité de silice correspondant à environ 2 fois sa masse et le dépôt de l’extrait a lieu
sous forme solide.
Les chromatographies d’exclusion sont réalisées sur gel de Sephadex® LH20.
Les fractions recueillies sont regroupées selon les résultats de l’analyse par CCM.
G. 3. 2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC)
La chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) est réalisée à l’aide d’une pompe
Büchi 688, sur colonnes de chromatographie moyenne pression en verre Büchi remplies soit
avec de la silice SDS 60 Å 6-35 µm (SDS) en phase normale (préalablement activée quelques
heures à l’étuve à 110 °C), soit avec de la silice en phase inverse de type C18 90 Å 40-60 µm
(AIT).
L’échantillon est introduit sous forme solide mélangé à la phase stationnaire. Les systèmes
d’élution utilisés sont généralement des mélanges binaires dans des proportions variables au
cours de l’élution. La colonne est éluée avec un débit d’environ 20 mL/min et la pression est
en moyenne de 2 Bar.
Les fractions recueillies sont regroupées selon les résultats de l’analyse par CCM.
G. 3. 3 Chromatographie SPE sur cartouches de silice C18 (Vac elut®)
Les colonnes prêtes à l’emploi Analytichem Mega Bond ElutTM (Varian) utilisées sont garnies
de silice greffée C18. Ces cartouches, associées à une unité de filtration sous vide Vac Elut®
SPS 24 (Analytichem International), autorisent un réglage de débit précis à l’aide d’une
molette et d’un manomètre, sous vide contrôlé.
V. Matériels et méthodes
205
G. 3. 4 Chromatographie liquide haute performance semi-préparative (HPLC semi-
prep)
Les purifications ont été effectuées à l'aide d'une chaîne HPLC Merck Hitachi Lachrom munie
d’une pompe Lachrom 7100 et d’un détecteur UV à barrettes de diodes (DAD-UV) Merck
Hitachi Lachrom 7455 pilotés par le logiciel D-7000 HSM (Merck).
Les analyses ont été réalisées en phase inverse avec une colonne HPLC de type Microsorb
Dynamax RP-18 (Varian) (5 µm, 250 x 10 mm). Les solvants utilisés sont de qualité HPLC et
le débit est fixé à 3 mL/min.
G. 4 Méthodes physico-chimiques
G . 4. 1 Point de fusion
La mesure du point de fusion est réalisée sur un appareil Electrothermal 9100.
G 4. 2 Pouvoir rotatoire
Le pouvoir rotatoire a été mesuré sur un polarimètre de type Perkin-Elmer 241 à la longueur
d’onde de la raie D du sodium (λ= 589 nm) dans une cuve de 1 cm à température ambiante.
Le pouvoir rotatoire spécifique [α]D, exprimé en degré, est calculé à partir de la formule
suivante :
[α]D = 1000 . α / l . c
(α : angle de rotation, en degré, lu sur le polarimètre, l : longueur, en dm, de la cuve de
mesure, c : concentration de la molécule en solution en g/L)
G. 4. 3 Spectrométrie Ultraviolet (UV)
Les spectres UV des composés ont été mesurés dans le méthanol à l’aide d’un
spectrophotomètre de type Perkin-Elmer UV/Vis Lambda 20, double faisceau permettant des
lectures directes contre liquide de compensation. Les mesures se font dans des cuves de quartz
à trajet optique de 1 cm.
V. Matériels et méthodes
206
G. 4. 4 Spectrométrie Infra-rouge (IR)
Les spectres infra-rouge des molécules ont été réalisés au moyen d’un spectrophotomètre
Perkin-Elmer Paragon 1000 FT-IR dans des pastilles de KBr.
G. 4. 5 Spectrométrie de masse (MS)
Les spectres de masse en introduction directe et en LC/MS ont été réalisées sur un
spectromètre de masse à trappe d’ions LCQ Finnigan équipé d’une interface d’ionisation
APCI et contrôlé par le logiciel Xcalibur. Température de la source : 370 °C ; Débit : 15
µl/min ; Energie de collision appliquée pour les fragmentations en MS/MS est réglée de
manière à obtenir une transmission optimale des ions fils (en général entre 33% et 40% de 5
V).
Ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
APCI
L’APCI est une technique d’ionisation qui fait appel à des réactions ions-molécules en phase
gazeuse à pression atmosphérique. C’est une technique analogue à l’ionisation chimique (CI)
où les ions primaires sont produits par des décharges Corona sur un aérosol de solvant.
L’éluat chromatographique (maximum 2 ml/min) est directement introduit dans un nébuliseur
pneumatique où il est converti en un fin brouillard à l’aide d’un jet d’air ou d’azote à haute
vitesse. Les gouttelettes sont alors déplacées par le flux gazeux au travers d’un tube de quartz
chauffé, appelé chambre de désolvatation / vaporisation. La chaleur transférée aux gouttelettes
de l’aérosol va permettre la vaporisation de la phase mobile et de l’échantillon dans le courant
de gaz. Le contrôle de la température dans cette chambre rend les conditions de vaporisation
dépendantes du débit et de la nature de la phase mobile. Le gaz chaud (120 °C) et les
substances sortent de ce tube pour arriver dans la région de transfert de la source se trouvant à
pression atmosphérique où ils sont ionisés chimiquement par le transfert de protons en mode
positif et le transfert d’électrons en mode négatif. En général, la phase mobile vaporisée joue
le rôle de gaz ionisant en produisant des ions quasi-moléculaires [De Hoffmann et al., 1999].
Spectrométrie de masse haute résolution
Les spectres de masse de haute résolution ont été enregistrés en ESI sur un appareil Q-Tof
Ultima (Waters). Ces analyses ont été menées par Véréna Poinsot du Laboratoire des
V. Matériels et méthodes
207
Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique de l’Université Paul
Sabatier de Toulouse.
Ionisation par Electrospray (Electro Spray Ionisation) ESI
L’ionisation est ici produite par application, à pression atmosphérique, d’un fort champ
électrique (3 à 6 KeV) sur un liquide traversant un capillaire à un faible débit (1-10 µl.min-1).
Ce champ provoque une accumulation de charges à la surface du liquide, situé à l’extrémité
du capillaire. La rupture de la phase liquide forme des gouttelettes hautement chargées
(Spray). L’évaporation du solvant contenu dans ces gouttelettes va provoquer leur
rétrécissement jusqu’au sommet où des forces coulombiennes répulsives vont approcher le
niveau des forces de cohésion de celle-ci et provoquer leur explosion. Ces gouttelettes
subissent alors une cascade de fissions donnant des gouttelettes de plus en plus petites,
jusqu’au moment où le champ électrique en leur surface devient suffisant pour provoquer la
désorption des ions. Ces ions ainsi produits sont porteurs d’un grand nombre de charges s’il
existe plusieurs sites ionisables sur la molécule [De Hoffmann et al., 1999].
G. 4. 6 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de résonance magnétique nucléaire ont été enregistrés au service commun de
RMN de l’Université Paul Sabatier de Toulouse sur des appareils de type Brüker Avance 300
et 400 (fréquences de 300.13 (1H) et 75.46 MHz (13C), et 400.13 (1H) et 100.03 MHz (13C)),
ou Brüker Avance 500 avec cryosonde (fréquences de 500.13 (1H) et 125.75 MHz (13C))
selon la quantité de produit à analyser et la résolution souhaitée.
Les échantillons ont été solubilisés dans les solvants deutérés CDCl3, DMSO-d6, MeOD
(Euriso-top, Gif sur Yvette) dans des tubes analytiques de 5 mm de diamètre.
Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm par rapport au tétraméthylsilane
(TMS) ; les constantes de couplage sont exprimées en Hz.
Les programmes de séquences impulsionnelles standard fournies par Brüker ont été utilisées
pour chaque type d’analyse.
V. Matériels et méthodes
208
Corrélations homonucléaires
-COSY (1H – 1H): cette expérience fournit des informations sur les couplages homonucléaires
2J et 3J (protons séparés par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont
adjacents.
-NOESY (1H – 1H) : cette technique permet d’observer, dans l’espace, les corrélations entre
protons (effets Overhauser) d’une même molécule.
Corrélations hétéronucléaires
-HSQC (1JH–C) : cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones
et les protons directement liés entre eux.
-HMBC (2JH–C, 3JH–C) : cette technique permet la détection des couplages longue distance 2JH–
C et 2JH–C.
G. 4. 7 Diffraction aux rayons X
Les expériences ont été menées au service commun de l’Université Paul Sabatier de Toulouse
sur un diffractomètre Bruker-AXS CCD 1000 avec une radiation MoKα (λ = 0.71073 Å). La
résolution des structures a été faite à l’aide du logicierl SHELXS [Sheldrick, 1990]. Les
expériences ont été réalisées par le Pr. Heinz Gornitzka du Laboratoire d’hétérochimie
fondamentale et appliquée de l’Université Paul Sabatier de Toulouse.
G. 5 Test biologiques
G. 5. 1 Tests réalisés sur P. falciparum
G. 5. 1. 1 La culture in vitro
La première culture de P. falciparum fut réalisée par Trager et Jensen en 1976, ce qui permit
un développement considérable de l’étude du parasite et des drogues anti-paludiques. Les
tests in vitro sur Plasmodium nécessitent l’accessibilité permanente à une souche cultivée qui
fournit les parasites. Le milieu nutritif est composé de RPMI 1640 (Lonza) enrichi de 10% de
sérum humain AB+ (Etablissement Français du Sang) et de L-glutamine (2 mM) (acide aminé
V. Matériels et méthodes
209
essentiel) (Lonza). Ce milieu est changé tous les jours afin de renouveler les nutriments et de
rehausser le pH (autour de 7,2), les parasites libérant dans le milieu l’acide lactique issu du
métabolisme du glucose. Pour une bonne compatibilité sérique, les globules rouges sont de
groupe O et de Rhésus positif. La culture, placée dans un incubateur, est maintenue à 37 °C
dans un air humidifié et enrichi en CO2 (5%). La parasitémie est maintenue à 2% par dilution
quotidienne permettant ainsi le développement du parasite dans des conditions optimales. La
parasitémie est estimée par comptage visuel au microscope (x 1000) à partir d’un frottis
sanguin, coloré au Giemsa. Lorsque la parasitémie est supérieure à 2%, elle est abaissée par
division du culot globulaire centrifugé (avec ajout de globules rouges sains).
G. 5. 1. 2 La synchronisation [Lambros et Vanderberg, 1979]
Principe
Les tests biologiques sont réalisés sur une population de parasites de même génération. La
synchronisation de la souche repose sur la lyse simultanée de tous les globules rouges
parasités par des schizontes. En effet, afin de garantir l’accès aux métabolites plasmatiques, le
parasite perméabilise la membrane érythrocytaire mais la rend aussi sensible aux chocs
osmotiques. A un stade avancé du parasite, l’ajout de sorbitol dans le milieu lyse les
érythrocytes parasités par les schizontes mûrs alors que les autres globules résistent à ce choc.
Il ne reste alors que des globules rouges sains ou des globules parasités par des mérozoïtes et
des jeunes trophozoïtes (stade anneaux).
Mode opératoire
La culture est centrifugée (à 500 g pendant 5 min.), le surnageant est remplacé par neuf
volumes de solution de D-sorbitol (5% dans de l’eau distillée). Une fois homogénéisée, la
culture est placée à 37°C pendant 10 minutes puis centrifugée (à 500 g pendant 5 min.), ce qui
permet d’isoler le culot de globules rouges parasités par des formes anneaux, alors que les
lysats cellulaires sont en suspension.
V. Matériels et méthodes
210
G. 5. 1. 3 Evaluation de l’activité antiplasmodiale
Principe
P. falciparum est incapable de synthétiser ex novo les bases puriques (adénine, guanine)
contrairement aux bases pyrimidiques (uracile, thymine, cytosine). Il a donc besoin d’utiliser
les purines exogènes pour la synthèse de ses nucléotides puriques.
L’hypoxanthine est le précurseur principal utilisé par le parasite pour la synthèse des
nucléotides puriques. L’introduction d’hypoxanthine tritiée dans le milieu permet (par suivi
de la radioactivité β), de quantifier l’incorporation de ce précurseur dans le parasite et ainsi
d’évaluer le développement du parasite. L’incorporation étant plus grande dans les schizontes
que dans les anneaux, l’hypoxantine radio-marquée est introduite un jour après la préparation
des plaques.
Les souches de P. falciparum utilisées sont les souches FcB1 et F32. La souche FcB1,
originaire de colombie, est résistante à la chloroquine et la souche F32, originaire de
Tanzanie, est sensible à la chloroquine.
Mode opératoire
Les tests sont réalisés sur des plaques à 96 puits remplis d’un volume fixe d’hématies
parasitées (parasitémie de 1,0% et hématocrite de 1,5%). Les fractions à tester (à différentes
concentrations) sont alors additionnées en triplicata dans les puits. Après 24 heures
d’incubation à 37 °C, l‘hypoxantine tritiée est ajoutée à raison de 0,25 µCi/puits (Perkin
Elmer à 1 µCi/ml, France), et les plaques sont remises dans l’incubateur pendant 24 heures. A
la fin du cycle, les plaques sont congelées à - 20°C pour provoquer l’hémolyse des
érythrocytes. Après décongélation (4ème jour), les acides nucléiques sont collectés sur filtres à
l’aide d’un collecteur de cellules automatique (Perkin Elmer, France). La radioactivité
déposée sur le filtre (séché au micro-onde et enveloppé dans un plastique dans lequel sont
ajoutés 4 ml de liquide de scintillation (Betaplate Scint, Perkin Elmer) est alors mesurée par
un compteur β (Microbeta Trilux, Perkin Elmer).
Détermination de la CI50
L’ CI 50 (concentration de l’échantillon qui inhibe 50% de la croissance du parasite) est
déterminée par interpolation linéaire, à l’aide du rapport du % de parasitémie sur le
logarithme des concentrations des échantillons.
V. Matériels et méthodes
211
G. 5. 2 Tests de cytotoxicité réalisés sur des cellules MCF-7
Il s’agit de mesurer la cytotoxicité d’échantillons sur des cellules MCF-7 (cellules mammaires
cancéreuses humaines). La méthode utilisée repose sur l’estimation de l’inhibition de la
prolifération des cellules par spectrophotométrie.
Principe
Le principe repose sur la réduction enzymatique d'un sel de tétrazolium appelé XTT (sodium
2,3 Bis (2-méthoxy-4-nitro-5 sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanolide. Ce XTT est
réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes, en présence du
coenzyme Q, il se forme un composé hydrosoluble orangé. Celui-ci est dosable par
spectrophotométrie à 450 nm.
Mode opératoire
Les cellules sont comptées sur une cellule de Malassez (plaque de microscope quadrillée). La
culture est ensemencée dans une plaque 96 puits à raison de 30 000 cellules par puits dans 200
µl de milieu. Les plaques sont mises dans l’incubateur (24 h à 37 °C, air humidifié, 5% CO2).
Le 2ème jour, les échantillons sont ajoutés au milieu (DMEM enrichi de 10% de sérum de veau
foetal) à différentes concentrations (0,1 ; 1 ; 10 et 100 µg/ml), puis les plaques sont mises à
incuber pendant 48 heures. Au 4ème jour, le XTT et le coenzyme Q sont ajoutés puis les
plaques sont mises à incuber pendant 3 heures de plus. La réaction est alors arrêtée par ajout
de SDS à 10% et l’absorbance de chaque puits est mesurée à 450 nm.
G. 5 . 3 Test in vivo sur souris
Les souris utilisées sont des souris swiss non consanguines (Le genest-sur-isle). Nous avons
utilisé la technique décrite par Peters en 1970. Sur des lots de cinq souris, l’inoculation est
faite par voie intra péritonéale à partir d’une suspension parasitaire de P. vinckeï petteri avec
100 µl de sang contenant 2.107 GRP par ml (J1). Le traitement commence deux heures après
l’infection. Les souris sont traitées par voie intra péritonéale avec une dose de produit à tester,
une fois par jour, pendant quatre jours consécutifs (J1, J2, J3, et J4).
Un lot de 5 souris traitées avec le solvant de la drogue (DMSO, qui sert à dissoudre le produit
à tester) constitue le groupe témoin de l’infection. Chaque concentration de produit à tester est
administrée à un lot de 5 souris. Au cinquième jour, J5, la parasitémie des souris traitées est
V. Matériels et méthodes
212
évaluée, par microscopie, par rapport au lot témoin et le pourcentage d’inhibition est calculé
selon la formule suivante :
% d’inhibition= (parasitémie du groupe témoin – parasitémie du groupe traité) x100
parasitémie du groupe témoin
La survie des souris est également évaluée par rapport au lot témoin.
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VII. Annexes
222
Host1 5,7-dihydroxy-6-p-menthen-flavanone
Lindératone [Ichino et al., 1990]
O
OHO
OH
C25H28O4 392 g/mole
Aspect : poudre blanche Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –32,4 (c 0,5, CHCl3). UV : λmax (MeOH) 295, 335 nm. IR : (KBr) υmax 3435 (br OH), 1635 (C=O), 1620, 1580 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 391. RMN 1H : (CDCl3 400 MHz) δ 12.48, 12.49 ( ½ H × 2, s× 2 , OH chelated), 7.4-7.5 (5H, m, Ar-H), 6.92, 6.93 (½ H × 2, s× 2, OH), 6.03, 6.04 (½ H × 2, s× 2, H-8), 5.51 (1H, brs, H-2”), 5.41, 5.46 (½ H × 2, dd, J= 3.1, 12.9 Hz, H-2), 3.90 (1H, brd, H-3”), 3.09, 3.10 (½ H × 2, dd, J= 12.9, 17.1 Hz, H-3α), 2.82, 2.84 ((½ H × 2, dd, J= 3.1, 17.1 Hz, H-3β), 2.15 (2H, m, H-6”), 1.80 (1H, s, H-1”), 1.62 (1H, m, H-8”), 1.82, 1.45 (2H, m, H-5”), 0.88, 0.89, 0.90, 0.91 (3/2 H × 4, d× 2, J=6.9 Hz) RMN13C : (CDCl3, 100 MHz) δ 195 (C, C-4), 164.7 (C, C-5), 162.0 (C, C-9), 161.2 (C, C-7), 141.0 (C, C-1”), 138.7 (C, C-1’), 128.8 (CH, C-2’, C-3’), 128.7 (CH, C-5’, C-6’), 126.2 (CH, C-4’), 124.4 (CH, C-2”), 110.3 (C, C-6), 102.6 (C, C-10), 96.6 (CH, C-8), 79.1 (CH, C-2), 44.0 (CH, C-4”), 43.8 (CH2, C-3), 34.3 (CH, C-3”), 30.6 (CH2, C-6”), 27.9 (CH, C-8”), 23.7 (CH3, C-7”), 22.0 (CH2, C-5”), 21.7 (CH3, C-10”), 16.4 (CH3, C-9”).
VII. Annexes
223
Host2 2’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4α-isopropyl-1β-méthyl-cyclohexane-1-O-5-yl)
dihydrochalcone ; Hostmanin A et Hostmanin B [Portet et al., 2007]
O
OOH
O O
OOH
O
C26H32O4 408 g/mole
Aspect : cristaux. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –31 (c 0.15, MeOH). UV : λmax (MeOH) 206, 292 nm. IR : (KBr) υmax 3425 (chelated OH), 1616 (C=O), 1585 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 407. RMN 1H : Host2a (CDCl3, 500 MHz), δ 13.90 (1H, s, OH-2’), 7.29-7.21 (4H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.02 (1H, s, H-3’), 3.83 (3H, s, OCH3), 3.49 (2H, m, H-α), 3.39 (1H, m, H-5’’), 3.06 (2H, t, H-β), 1.91 (1H, dd , J= 13.4 , 3.4 Hz, Ha-6’’), 1.78 (1H, m, H-8’’), 1.74 (1H, m, Ha-2’’), 1.61 (1H, m, Hb-2’’), 1.53 (2H, m, H-3’’), 1.51 (1H, dd, J= 13.4, 5.3 Hz, Hb-6’’), 1.36 (3H, s, H-7’’), 1.21 (1H, m, H-4’’), 1.08 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’), 0.97 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’). Host2b (CDCl3, 500 MHz), δ 13.90 (1H, s, OH-2’), 7.29-7.21 (4H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.01 (1H, s, H-3’), 3.80 (3H, s, OCH3), 3.49 (2H, m, H-α), 3.49 (1H, m, H-5’’), 3.06 (2H, t, H-β), 1.99 (1H, m, Ha-2’’),1.81 (1H, m, Ha-6’’), 1.73 (1H, Hb-6’’), 1.63 (2H, m, H-3’’), 1.53 (1H, m, Hb-2’’), 1.37 (3H, s, H-7’’), 1.24 (1H, m, H-4’’), 1.22 (1H, m, H-8’’),1.09 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’), 0.75 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’). RMN13C : Host2a (CDCl3, 125 MHz), δ 204.9 (C, C=O), 165.4 (C, C-6’), 162.3 (C, C-4’), 158.9 (C, C-2’), 141.8 (C, C-1), 128.4 (CH, C-3, C-5),128.3 (CH, C-2, C-6), 125.9 (CH, C-4), 106.8 (CH, C-5’), 104.7 (C, C-1’), 91.2 (C, C-3’), 77.9 (C, C-1”), 55.7 (CH3, OCH3), 45.5 (CH2, C-α), 44.0 (C, C-4”), 35.3 (CH, C-6”), 30.7 (CH2, C-β), 30.1 (CH2, C-2”), 29.2 (CH3,
C-7’’), 27.2 (CH2, C-3”), 26.3 (CH, C-8”), 22.1 (CH3, C-10”), 20.9 (CH3, C-9”), 20.5 (CH, C-5”). Host2b (CDCl3, 125 MHz), δ 204.8 (C, C=O), 165.3 (C, C-6’), 163.2 (C, C-4’), 159.3 (C, C-2’), 141.8 (C, C-1), 128.4 (CH, C-3, C-5),128.3 (CH, C-2, C-6), 125.8 (CH, C-4), 103.5 (CH, C-5’), 104.9 (C, C-1’), 91.0 (C, C-3’), 76.7 (C, C-1”), 55.1 (CH3, OCH3), 45.5 (CH2, C-α), 49.9 (C, C-4”), 40.2 (CH, C-6”), 30.7 (CH2, C-β), 36.9 (CH2, C-2”), 28.7 (CH3, C-7’’), 28.4 (CH2, C-3”), 29.6 (CH, C-8”), 20.4 (CH3, C-10”), 22.4 (CH3, C-9”), 22.5 (CH, C-5”).
VII. Annexes
224
Host3 rel-(1’’ R,4’’R,5’’S,6’’S)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1-méthyl-
cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl) dihydrochalcone; Hostmanin C [Portet et al., 2007]
O
OO
OH
H H
OH
C26H32O5 424 g/mole
Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 + 4 (c 0.17, MeOH). UV : λmax (MeOH) 232, 285 nm. IR : (KBr) υmax 3390 (br OH), 1633 (C=0), 1600, 1580 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 423. RMN 1H : (CDCl3 , 500 MHz) δ 13.26 (s, OH-2’), 7.3-7.2 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.09 (1H, s, H-3’), 4.54 (1H, dd, J= 5.7, 1.2 Hz, H-6”), 3.84 (3H, s, CH3), 3.41 (2H, m, H-α), 3.07 (1H, t, J=5.7, H-5”), 3.07 (2H, t, J= 7.9 Hz, H-β), 1.88 (1H, m, H-8”), 1.79 (1H, m, Ha-2”), 1.68 (1H, m, Hb-2”), 1.67 (2H, m, Hb-3”), 1.41 (3H, s, H-7”), 1.21 (2H, m, Ha-3”), 1.11 (1H, m, H-4’’), 0.90 (3H, d, J=7 Hz, H-9”), 0.86 (3H, d, J=7 Hz, H-10”). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 203.4 (C, C=O), 165.5 (C, C-2’), 161.7 (C, C-6’), 161.3 (C, C-4’), 141.2 (C, C-1), 128.6 (CH, C-3, C-5),128.2 (CH, C-2, C-6), 126.3 (CH, C-4), 112.9 (C, C-5’), 102.7 (C, C-1’), 92.9 (CH, C-3’), 89.2 (CH, C-6”), 81.9 (C, C-1”), 55.5 (CH3, OCH3), 44.2 (CH2, C-α), 46.8 (C, C-4”), 41.1 (CH, C-5”), 30.6 (CH2, C-β), 30.3 (CH2, C-2”), 26.9 (CH, C-8”), 21.8 (CH3, C-10”), 21.2 (CH3, C-7’’), 19.4 (CH2, C-3”), 15.3 (CH3, C-9”).
VII. Annexes
225
Host4 rel-(1’’ R,4’’S,5’’S,6’’S)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1-méthyl-
cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl) dihydrochalcone; Adunctine E [Ichino et al., 1990]
O
OO
OH
H H
OH
C26H32O5 424 g/mole
Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 +16.3 (c 0,65, MeOH) UV : λmax (MeOH) 232, 285 nm. IR : (KBr) υmax 3390 (br OH), 1633 (C=0), 1600, 1580 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 423. RMN 1H : (CDCl3 , 500 MHz) δ 13.26 (s, OH-2’), 7.3-7.2 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.07 (1H, s, H-3’), 4.52 (1H, dd, J= 5.7, 1.2 Hz, H-6”), 3.84 (3H, s, CH3), 3.37 (2H, m, H-α), 3.10 (1H, dd, J= 11, 5.7 Hz, H-5”), 3.06 (2H, t, J= 7.9 Hz, H-β), 2.01 (1H, m, Ha-2”), 1.85 (1H, m, H-8”), 1.60 (1H, m, Hb-2”), 1.46 (3H, s, H-7”), ”), 1.37 (1H, m, H-4’’), 1.37 (2H, m, Hb-3”), 1.33 (2H, m, Ha-3), 0.86 (3H, d, J=7 Hz, H-9”), 0.83 (3H, d, J=7 Hz, H-10”). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 203.3 (C, C=O), 165.3 (C, C-2’), 161.8 (C, C-6’), 161.6 (C, C-4’), 141.3 (C, C-1), 128.4 (CH, C-2, C-6), 128.3 (CH, C-3, C-5), 126.0 (CH, C-4), 113.2 (C, C-5’), 102.7 (C, C-1’), 92.9 (CH, C-3’), 87.6 (CH, C-6”), 80.9 (C, C-1”), 55.5 (CH3, OCH3), 46.3 (C, C-4”), 44.7 (CH2, C-α), 39.8 (CH, C-5”), 31.8 (CH2, C-2”), 30.1 (CH2, C-β), 27.2 (CH, C-8”), 22.0 (CH3, C-7’’), 21.8 (CH3, C-10”), 17.2 (CH2, C-3”), 15.4 (CH3, C-9”).
VII. Annexes
226
Host5 rel-(1’’ R,4’’S,5’’S,6’’R)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1,6-epoxy-
1-méthyl-cyclohexane-5-yl) dihydrochalcone
O
OHO
OH
H O
C26H32O5 424 g/mole
Aspect : poudre blanche. UV : λmax (MeOH) 230, 283 nm. IR : (KBr) υmax 3390 (br OH), 1633 (C=0), 1600, 1580 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 423. RMN 1H : 1H NMR (CDCl3 , 500 MHz) δ 13.26 (s, OH-2’), 7.3-7.2 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.07 (1H, s, H-3’), 4.52 (1H, dd, J= 5.7, 1.2 Hz, H-6”), 3.84 (3H, s, CH3), 3.37 (2H, m, H-α), 3.12 (1H, dd, J= 11, 5.7 Hz, H-5”), 3.05 (2H, t, J= 7.5 Hz, H-β), 1.87 (1H, m, H-8”), 1.78 (1H, m, Ha-2”), 1.67 (1H, m, Hb-2”), 1.42 (2H, m, H-3”), 1.39 (3H, s, H-7”), 1.08 (1H, m, H-4’’), 0.92 (3H, d, J=7 Hz, H-9”), 0.86 (3H, d, J=7 Hz, H-10”). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 203.3 (C, C=O), 165.3 (C, C-2’), 161.8 (C, C-6’), 161.6 (C, C-4’), 141.3 (C, C-1), 128.4 (CH, C-2, C-6), 128.3 (CH, C-3, C-5), 126.0 (CH, C-4), 112.9 (C, C-5’), 102.7 (C, C-1’), 92.8 (CH, C-3’), 92.4 (CH, C-6”), 69.3 (C, C-1”), 55.5 (CH3, OCH3), 46.6 (C, C-4”), 43.7 (CH2, C-α), 39.6 (CH, C-5”), 35.3 (CH2, C-2”), 30.2 (CH2, C-β), 28.2 (CH3, C-7’’), 27.2 (CH, C-8”), 21.8 (CH3, C-10”), 17.2 (CH2, C-3”), 15.4 (CH3, C-9”).
VII. Annexes
227
Host6 (1’R*, 6’R*)-(4,6-dihydroxy-5-méthyl-3-methylester-2-méthoxyphényl)-(3’-isohexenyl-1’-
phénylcyclohex-3’-enyl) méthanone. Hostmanine D
OOH
HO O
O O
C29H34O6 478 g/mole
Aspect : prismes jaunes. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –31 (c 0.15, MeOH). UV : λmax (MeOH) 206, 292 nm. IR : (KBr) υmax 3425 (chelated OH), 1616 (C=O), 1585 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 477. RMN 1H : (CDCl3 , 500 MHz) δ 12.23 (1H, s, OH-6), 12.06 (1H, s, OH-4), 7.10-7.12 (4H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’, H-6’’), 7.06 (1H, m, H-4’’), 5.55 (1H, brs, H-4’), 5.13 (1H, d, J= 6.8 Hz, H-8’), 4.21 (1H, ddd, J= 10.2, 10.2, 5.4 Hz, H-6’), 4.03 (3H, s, (C=O)O-CH3)), 3.79 (3H, s, OCH3), 2.49 (2H, m, H-5’), 2.25 (2H, m, H-2’), 2.05-2.013 (2H, m, H-12’), 2.12 (1H, m, Ha-7’), 2.03 (1H, m, Hb-7’), 1.90 (3H, s, CH3-5), 1.73 (3H, s, H-10’), 1.64 (3H, s, H-11’). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 210.8 (C, C=O, C-7), 170.9 (C, O-C=O), 164.8 (C, C-4), 164.2 (C, C-6), 163.8 (C, C-2), 137.4 (C, C-3’), 131.7 (C, C-9’), 128.1 (C, C-3’’-C-5’’), 127.5 (C, C-2’’-C-6’’), 124.1 (C, C-8’), 118.9 (C, C-4’), 111.2 (C, C-1), 108.6 (C, C-5), 99.4 (C, C-3), 65.2 (CH3, O-CH3), 51.5 (CH, C-6’), 45.1 (C, C-1’), 37.3 (CH2, C-2’), 37.4 (CH2, C-7’), 30.2 (CH2, C-5’), 26.4 (CH2, C-12’), 25.8 (CH2, C-11’), 17.7 (CH3, C-10’), 7.3 (CH3, CH3-C).
VII. Annexes
228
Host7 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxy-5’-p-menthen-dihydrochalcone. (-)-méthyllindératin
O
OHO
OH C26H32O4 408 g/mole
Aspect : huile incolore. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –40.1 (c 0,1, CHCl3). UV : λmax (MeOH) 211, 289 nm. IR : (KBr) υmax 3359 (br OH), 1623 (C=O), 1580, 1450 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 407. RMN 1H : (CDCl3 , 400 MHz) ) δ 13.74 (1H, s, OH-2’), 7.31 (4H, m, H-2, H-3, H-5, H-6), 7.23 (1H, m, H-4), 7.1 (1H, s, OH-6’), 6.07 (1H, s, H-3’), 5.50 (1H, s, H-6”), 3.81 (3H, s, OCH3), 3.42 (2H, ddd, J=1.6, 4.9, 7.3 Hz, H-α), 3.39 (1H, brd, J=10 Hz, H-5”), 3.03 (2H, t, J= 7.3 Hz, H-β), 2.12 (2H, m, H-2”), 1.81 (3H, s, H-7”), 1.79 (1H, m, Ha-3”), 1.56 (1H, m, H-4”), 1.49 (1H, m, H-8”), 1.4 (1H, m, Hb-3”), 0.85 (3H, d, J=6.7 Hz, H-10”), 0.82 (3H, d, J=6.7 Hz, H-9”) RMN13C : (CDCl3, 100 MHz), δ 205.2 (C, C=O), 165.2 (C, C-2’), 163.9 (C, C-4’), 158.8 (C, C-6’), 142.2 (C, C-1), 141.7 (C, C-1”), 128.8 (CH, C-3, C-5), 128.6 (CH, C-2, C-6), 126.1 (CH, C-4), 124.5 (CH, C-6”), 109.1 (C, C-5’), 106.1 (C, C-1’), 92.2 (CH, C-3’), 55.8 (CH3, OCH3), 46.4 (CH2, C-α), 43.8 (CH, C-4”), 34.9 (CH, C-5”), 30.8 (CH2, C-2”), 28.1 (CH, C-8”), 24.1 (CH3, C-7”), 21.9 (CH3, C-10”), 16.4 (CH3, C-9”).
VII. Annexes
229
Host8 5,7-dihydroxy-6-méthylflavanone. Strobopinine
[Diaz et al., 1987]
O
OOH
HO
C16H14O4 270 g/mole
Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –90,4 (c 0,05, CHCl3). UV : λmax (MeOH) 295, 335 nm. IR : (KBr) υmax 3125 (OH), 1635 (C=O), 1620,1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 269. RMN 1H : 1H NMR (CDCl3 , 500 MHz) δ 12.34 (s, OH), 7.4-7.5 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.03 (1H, s, H-8), 5.43 (1H, dd, J=13, 3.0 Hz, H-2), 3.10 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.85 (1H, dd, J= 3.0, 17.1 Hz, H-3β), 2.09 (3H, s, CH3-6). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 195.9 (C, C=O), 162.6 (C, C-5), 161.7 (C, C-9), 160.6 (C, C-7), 138.5 (C, C-1’), 128.8 (CH, C-2’, C-6’), 128.9 (CH, C-3’, C-5’), 126.2 (CH, C-4’), 104.0 (C, C-6), 103.0 (C, C-10), 94.8 (CH, C-8), 79.2 (C-2), 43.5 (CH2, C-3), 6.7 (CH3-6).
VII. Annexes
230
Host9 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone
[Burke et Nair, 1986 ; Orjala et al., 1994]
OH
OHO
O C16H16O4 272 g/mole
Aspect : poudre blanche UV : λmax (MeOH) 211, 286 nm. IR : (KBr) υmax 3264 (br, OH), 1646 (C=O), 1600, 1526 cm-1 (cycle aromatique) MS : (-)-APCI, m/z 271. RMN 1H : 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 12.33 (1H, s, OH-2’), 7.27 (5H, m, H-2, H-6, H-3, H-5, H-6), 5.97 (2H, s, H-3’, H-5’), 3.75 (3H, s, CH3O), 3.33 (2H, t, J=7,5 Hz, H-α), 2.91 (2H, t, J=7,5 Hz, H-β). RMN13C : (DMSO-d6, 125 MHz), δ 205.1 (C, C=O), 165.9 (C, C-4’), 164.5 (C, C-2’,C-6’), 142.0 (C, C-1), 128.8 (CH, C-2, C-6), 128.7 (CH, C-3, C-5), 126.3 (CH, C-4), 105.0 (C, C-1’), 93.7 (CH, C-3’, C-5’), 55.8 (CH3, OCH3), 45.6 (CH2, C-α), 30.5 (CH2, C-β).
VII. Annexes
231
Host10 5,7-dihydroxy-6,8-diméthylflavanone. 6,8-diméthylpinocembrine.
[Diaz et al., 1987 ; Mustafa et al., 2005]
O
OOH
HO
C17H16O4 284 g/mole
Aspect : cristaux jaunes clairs. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –48 (c 3,8, CH3COCH3). UV : λmax (MeOH) 221, 294 nm. IR : (KBr) υmax 3120 (OH), 1635 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 283. RMN 1H : 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 12.24 (s, OH-5), 7.4-7.44 (5H, m, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’, H-6’), 5.43 (1H, dd, J= 13, 3.0 Hz, H-2), 3.07 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.87 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β), 2.10 (3H, s, CH3-6), 2.09 (3H, s, CH3-8). RMN13C : (CDCl3, 75 MHz), δ 196.4 (C, C=O), 157.6 (C, C-5), 159.6 (C, C-9), 160.9 (C, C-7), 139.3 (C, C-1’), 128.6 (CH, C-2’, C-6’), 128.8 (CH, C-3’, C-5’), 125.9 (CH, C-4’), 103.0 (C, C-6), 102.9 (C, C-10), 102.0 (CH, C-8), 78.7 (C-2), 43.6 (CH2, C-3), 7.7 (CH3-6), 6.9 (CH3-8).
VII. Annexes
232
Host11 2’,4’-dihydroxy-3’,5’-diméthyl-6’-méthoxychalcone
[Resurreccion-Magno et al., 2005 ; Salem et Werbovetz, 2005 ; Shibata et al., 2000]
OOH
HO O
C18H18O4 298 g/mole
Aspect : poudre blanche. UV : λmax (MeOH) 300, 340 nm. IR : (KBr) υmax 3369 (br, OH), 1628 (C=O), 1606 (C=C), 1526 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 297. RMN 1H : (CDCl3, 300 MHz) δ 13.6 (1H, s, OH-2’), 8.01 (1H, dd, J= 15.6, 3 Hz, H-α), 7.86 (1H, dd, J= 15.6, 1.5 Hz, H-β), 7.27-7.19 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 3.67 (3H, s, CH3O), 2.16 (3H, s, (CH3)C-3’), 2.18 (3H, s, (CH3)C-5’). RMN13C : (CDCl3, 75 MHz), δ 193.4 (C, C=O), 159.2 (C, C-4’), 162.1 (C, C-2’,C-6’), 142.9 (C, C-β), 135.4 (C, C-1), 130.2 (CH, C-4), 129.0 (CH, C-3, C-5), 128.8 (C, C-α), 128.4 (CH, C-2, C-6), 109.1 (C, C-1’), 108.9 (CH, C-5’), 106.6 (CH, C-3’), 62.5 (CH3, OCH3), 8.3 (CH3, CH3-5’),7.6 (CH3, CH3-3’).
VII. Annexes
233
Host12 2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone
[Mustafa et al., 2005 ; Resurreccion-Magno et al., 2005]
OOH
HO O
C17H16O4 283 g/mole
Aspect : cristaux jaune-orangé. UV : λmax (MeOH) 305, 347 nm. IR : (KBr) υmax 3362 (br, OH), 1632 (C=O), 1604 (C=C), 1526 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 283. RMN 1H : (CH3COCH3-d6, 300 MHz) δ 13.6 (1H, s, OH-2’), 8.03 (1H, dd, J= 15.6, 4.1 Hz, H-α), 7.76 (1H, dd, J= 15.6, 2.4 Hz, H-β), 7.44-7.39 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 3.94 (3H, s, CH3O), 2.05 (3H, s, (CH3)C-3’). RMN13C : (CH3COCH3-d6, 75 MHz), δ 192.4 (C, C=O), 159.2 (C, C-4’), 162.7 (C, C-2’,C-6’), 141.5 (C, C-β), 135.7 (C, C-1), 130.2 (CH, C-4), 130.0 (CH, C-3, C-5), 127.8 (C, C-α), 128.4 (CH, C-2, C-6), 105.3 (C, C-1’), 90.8 (CH, C-5’), 103.7 (CH, C-3’), 55.4 (CH3, OCH3), 6.2 (CH3, CH3-3’).
VII. Annexes
234
Host13 5,4’-dihydroxy-7-méthoxyflavanone. Sakuranetine.
[Dutta et Som, 1978]
O
OOH
O
OH
C16H14O5 286 g/mole
Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –8 (c 7.92, CH3COCH3). UV : λmax (MeOH) 220, 292 nm. IR : (KBr) υmax 3118 (OH), 1630 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 285. RMN 1H : (CDCl3, 300 MHz) δ 12.04 (s, OH-5), 7.36 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 6.90 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 6.09 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-6), 6.05 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-8), 5.37 (1H, dd, J= 13., 3.0 Hz, H-2), 3.83 (3H, s, OCH3), 3.10 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.79 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (CDCl3, 75 MHz), δ 195. (C, C=O), 164.2 (C, C-5), 162.9 (C, C-9), 168.1 (C, C-7), 130.9 (C, C-1’), 128.6 (CH, C-2’, C-6’), 115.7 (CH, C-3’, C-5’), 156.0 (CH, C-4’), 95.2 (C, C-6), 103.2 (C, C-10), 94.3 (CH, C-8), 79.1 (C-2), 43.3 (CH2, C-3), 55.8 (CH3, OCH3-7).
VII. Annexes
235
Host 14 4’-hydroxy-5,7-diméthoxyflavanone
[Bohlmann et Ates, 1984 ; Bohlmann et al., 1979]
O
OO
O
OH
C17H16O5 300 g/mole
Aspect : poudre jaune pâle. UV : λmax (MeOH) 220, 290 nm. IR : (KBr) υmax 3122 (OH), 1632 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 299. RMN 1H : 1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.33 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 6.83 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 6.2 (1H, dd, H-6, J= 2.3, 0.7 Hz), 6.19 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-8), 5.36 (1H, dd, J= 13., 3.0 Hz, H-2), 3.86 (3H, s, OCH3-5), 3.85 (3H, s, OCH3-7), 3.06 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.68 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (MeOD, 125 MHz), δ 191.0 (C, C=O), 168.8 (C, C-5), 165.5 (C, C-9), 162.4 (C, C-7), 129.7 (C, C-1’), 127.6 (CH, C-2’, C-6’), 114.9 (CH, C-3’, C-5’), 157.6 (CH, C-4’), 93.6 (C, C-6), 105.2 (C, C-10), 92.4 (CH, C-8), 78.9 (C-2), 44.8 (CH2, C-3), 54.9 (CH3, OCH3-5), 54.3 (CH3, OCH3-7).
VII. Annexes
236
Host15 7-hydroxy-4’,5-diméthoxyflavanone.
[Tanaka et al., 1989]
OH
O
OO
HO
O
C17H16O5 300 g/mole
Aspect : poudre jaune pâle. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 +7 (c 0.47, Pyr) UV : λmax (MeOH) 220, 290 nm. IR : (KBr) υmax 3122 (OH), 1632 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 299. RMN 1H : 1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.43 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 7.00 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 6.1 (1H, dd, H-6, J= 2.3, 0.7 Hz), 6.11 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-8), 5.38 (1H, dd, J= 13, 3.0 Hz, H-2), 3.93 (3H, s, OCH3-5), 3.88 (3H, s, OCH3-4’), 3.08 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.79 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (MeOD, 125 MHz), δ 190.7 (C, C=O), 162.8 (C, C-5), 165.3 (C, C-9), 162.4 (C, C-7), 131.1 (C, C-1’), 127.5 (CH, C-2’, C-6’), 113.6 (CH, C-3’, C-5’), 159.9 (CH, C-4’), 92.8 (C, C-6), 104.3 (C, C-10), 95.7 (CH, C-8), 78.6 (C-2), 44.9 (CH2, C-3), 54.8 (CH3, OCH3-5), 54.3 (CH3, OCH3-4’).
VII. Annexes
237
Host16 7-hydroxy-5-méthoxy-8-méthylflavanone
[Markham, 1987]
O
OO
HO
C17H16O4 284 g/mole
Aspect : poudre jaune pâle. UV : λmax (MeOH) 220, 290 nm. IR : (KBr) υmax 3122 (OH), 1632 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 283. RMN 1H : 1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.5-7.4 (5H, m, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’, H-6’), 6.15 (1H, dd, H-6, J= 2.3, 0.7 Hz), 2.02 (3H, s, CH3-8), 5.38 (1H, dd, J= 13, 3.0 Hz, H-2), 3.81 (3H, s, OCH3-5), 2.97 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.77 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (MeOD, 125 MHz), δ 191.1 (C, C=O), 160.4 (C, C-5), 162.4 (C, C-9), 163.3 (C, C-7), 139.6 (C, C-1’), 128.3 (CH, C-2’, C-6’), 128.0 (CH, C-3’, C-5’), 128.0 (CH, C-4’), 92.1 (C, C-6), 104.2 (C, C-10), 104.4 (CH, C-8), 78.5 (C-2), 45.0 (CH2, C-3), 6.6 (CH3, CH3-8).
VII. Annexes
238
Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et RMN 2D du composé Host9 2’, 6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone
Spectre UV enregistré dans le MeOH, C= 10-3 M.
Spectre IR (pastille KBr)
VII. Annexes
239
Spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif dihydrochalcone #1 RT: 0,03 AV: 1 NL: 4,18E5T: - c Full ms [ 50,00-1000,00]
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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271,3
255,5
272,4253,5
281,4285,3
267,4227,5 238,4309,3 367,5205,5 220,3 297,3 313,1 435,3419,3 461,1375,1356,3 473,5349,4 401,1 483,7449,6 493,5
Spectre RMN du 1H enregistré au 500 MHz dans le DMSO-d6
VII. Annexes
240
Spectre RMN du 13C enregistré au 125 MHz dans le DMSO-d6
Spectre RMN 2D COSY
ppm (f2)5.010.0
5.0
10.0
ppm (f1)
VII. Annexes
241
Spectre RMN 2D HSQC
ppm (f2)5.010.0
50
100
ppm (f1)
Spectre RMN 2D HMBC
ppm (f2)5.010.0
50
100
150
200ppm (f1)
VII. Annexes
242
Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et RMN 2D du composé Host12 2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone
Spectre UV enregistré dans le MeOH, C= 10-3 M.
Spectre IR (pastille KBr)
VII. Annexes
243
Spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif Chalcone1 #1 RT: 0,01 AV: 1 NL: 2,42E6T: - c ms [ 50,00-1000,00]
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z
0
5
10
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283,5
284,5
435,5
285,4436,5255,5 267,8241,5 451,3319,5286,5 301,5205,5 212,7 496,8467,3407,9393,3350,6 423,7 489,3375,5339,5 358,8
Spectre de RMN du 1H enregistré au 300 MHz dans l’acétone-d6
VII. Annexes
244
Spectre RMN du 13C enregistré au 75 MHz dans l’acétone-d6
Spectre RMN 2D COSY
ppm (f2)5.010.015.0
0
50
100
150
ppm (f1)
VII. Annexes
245
Spectre RMN 2D HMBC
ppm (f2)5.010.015.0
0
50
100
150
200
ppm (f1)
VII. Annexes
246
Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et RMN 2D du composé Host10 6, 8-diméthypinocembrine
Spectre UV enregistré dans le MeOH, C= 10-3 M
Spectre IR (pastille KBr)
VII. Annexes
247
Spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif Dimethylpinocembrin #95-96 RT: 1,57-1,60 AV: 2 NL: 2,58E6T: - c Full ms2 283,20@33,00 [ 75,00-290,00]
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390m/z
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241,3285,2255,4 282,6242,5239,3205,2 265,5211,3 217,3 225,2
Spectre RMN du 1H enregistré au 300 MHz dans le CDCl3
VII. Annexes
248
Spectre RMN du 13C au 75 MHz enregistré dans le CDCl3
Spectre RMN 2D COSY
ppm (f2)5.010.0
5.0
10.0
ppm (f1)
VII. Annexes
249
Spectre RMN 2D HSQC
ppm (t2)5.010.0
0
50
100
150
ppm (t1)
Spectre RMN 2D HMBC
ppm (t2)5.010.0
0
50
100
150
200
ppm (t1)
Activity-guided isolation of antiplasmodial dihydrochalconesand flavanones from Piper hostmannianum var. berbicense
Benedicte Portet a, Nicolas Fabre a,*, Vincent Roumy a, Heinz Gornitzka b,Genevieve Bourdy a, Severine Chevalley a, Michel Sauvain a,
Alexis Valentin a, Claude Moulis a
a UMR 152, IRD – Universite Paul Sabatier Toulouse 3, Faculte des Sciences Pharmaceutiques, 31062 Toulouse Cedex 09, Franceb Laboratoire Heterochimie Fondamentale et Appliquee du CNRS (UMR 5069), Universite Paul Sabatier, 31062 Toulouse Cedex 09, France
Received 20 November 2006; received in revised form 6 February 2007
Available online 29 March 2007
Abstract
The bioassay-guided purification of an n-hexane extract from the leaves of Piper hostmannianum var. berbicense led to the isolation offour monoterpene or prenyl-substituted dihydrochalcones (1a, 1b, 2, 3) as well as the known compounds 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone (4), linderatone (5), strobopinin (6), adunctin E (7) and (ÿ)-methyllinderatin (8). Their structures wereestablished on the basis of NMR and X-ray analysis. (ÿ)-Methyllinderatin, linderatone and 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalconeexhibited the most potent antiplasmodial activity with IC50 values of 5.64, 10.33 and 12.69 lM, respectively against both chloroquine-sensitive and resistant strains of Plasmodium falciparum (F32,FcB1). The activity of (ÿ)-methyllinderatin was confirmed in vivo againstPlasmodium vinckei petteri in mice (80% of reduction of parasitemia) at a dose of 20 mg/kg/day.Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Piper hostmannianum var. berbicense; Piperaceae; Dihydrochalcones; Flavanones; Antiplasmodial activity; Plasmodium falciparum
1. Introduction
Due to the rising prevalence of Plasmodium falciparum
resistance to chloroquine and other antimalarial drugs,the treatment of malaria is becoming increasingly difficult(Hyde, 2002; Winstanley et al., 2002). There is an urgentneed to discover new drugs that are safe and effective forthe prophylaxis and treatment of malaria (Biagini et al.,2003). Previous findings of antimalarial agents such as qui-nine and artemisinin from medicinal plants also encour-aged the possibility of finding new antimalarial drugsfrom plant source (Schwikkard and van Heerden, 2002).In part of our research aiming to uncover antimalarialagents from the biodiversity of French Guiana, the n-hexane extract of leaves of Piper hostmannianum var. berbi-
cense (Miq.) C. DC. (Piperaceae) exhibited interestingactivity against Plasmodium falciparum (IC50 = 8 lg/ml).The phytochemical investigation of the genus Piper, widelydistributed in the tropical and subtropical regions of theworld, has reported the isolation of several classes of anti-protozoal compounds such as alkaloids (Rukachaisirikulet al., 2002, 2004), lignans (Lee and Ley, 2003; Ma et al.,1991), chalcones and dihydrochalcones (Jenett-Siemset al., 1999). From a phytochemical point of view, thisplant species is known to contain chromenes, flavanonesand benzoic acid derivatives evaluated for their antifungicactivity (Diaz et al., 1987; Lago et al., 2004). In the presentinvestigation, an activity bioassay-guided fractionation ofn-hexane extract by a variety of chromatographic methodshas led to the isolation of four new dihydrochalcones (1a,1b, 2, 3) as well as the known compounds 2 0,6 0-dihy-droxy-4 0-methoxydihydrochalcone (4) linderatone (5), stro-bopinin (6), adunctin E (7) and (ÿ)-methyllinderatin (8)
0031-9422/$ - see front matter Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.phytochem.2007.02.006
* Corresponding author. Tel.: +33 5 62 25 68 48; fax: +33 5 61 55 43 30.E-mail address: [email protected] (N. Fabre).
www.elsevier.com/locate/phytochem
Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320
PHYTOCHEMISTRY
(see Fig. 1). The structure of 1 has been confirmed bymeans of X-ray crystallography. The in vitro activity ofthe isolated compounds was assessed against both chloro-quine-resistant (FcB1) and chloroquine-sensitive (F32)strains of Plasmodium falciparum and MCF7 cells wereused to evaluate the cytotoxicity. In addition, the majordihydrochalcone, (ÿ)-methyllinderatin (8), was evaluatedfor in vivo antimalarial activity against Plasmodium vinckei
petteri in mice.
2. Results and discussion
Compound 1 obtained as yellow prisms had the molec-ular formula C26H32O4, determined by ESI-Q-TOF-HRMS at m/z 407.2242 [MÿH]ÿ (calcd. 407.2222). Its IR
spectrum contained absorption bands due to hydrogen-bonded OH (3400 cmÿ1), conjugated carbonyl (1616cmÿ1) and aryl (1585 cmÿ1) moieties. Although the productappeared to be homogeneous by TLC, structurally relatedexamination of the 1H and 13C NMR spectra indicated thatit was still a mixture as there was slight doubling up of cer-tain signals. Indeed, the 13C NMR spectrum of 1 displayeda set of major peaks accompanied by corresponding lessintense peaks in a ratio of approximately 55:45. However,various HPLC separations of compound 1 failed to resolveit, suggesting that the latter could be an inseparable mix-ture of two structurally close isomers. Structure elucidationwas thus primarily based on the major peaks in its 1H and13C NMR spectra. In the 1HNMR spectrum of 1 (Table 1),signals characteristic of a 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-methoxy-dihydrochalcone derivative were clearly observed at dH
Fig. 1. Dihydrochalcones and flavanones isolated from the leaves of P. hostmannianum var. berbicense.
B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320 1313
13.90 (OH chelated), 7.21–7.29 (5H, m), dH 3.06 (2H, t), dH3.49 (2H, m), dH 6.02 (1H, s) and dH 3.83 (3H, s) (Burkeand Nair, 1986) supported by kmax in the UV spectrumat 234 nm and 292 nm. The 13C NMR spectrum confirmedthe signals of the dihydrochalcone and contained ten addi-tional resonances with three methyls at dC 29.2 (C-700), dC20.9 (C-900), and dC 22.1 (C-1000), three methylene carbons(dC 30.1 (C-600), dC 20.5 (C-300), dC 35.3 (C-200)), threemethine carbons (dC 44.0 (C-400), dC 27.2 (C-500), dC 26.3(C-800)) and a quaternary carbon at dC 77.9 (C-100), bearingan O-atom. The latter, associated with the molecular for-mula, suggested that the dihydrochalcone was substitutedby a saturated cyclic monoterpene moiety (Tables 1 and2). Indeed, the 1H NMR spectrum showed signals charac-teristic of an isopropyl moiety (dH 1.78, 1.08, 0.97(H-800(Me)2)) and a methyl group (dH 1.36 (H-7 0)). Thisspectroscopic data (Tables 1 and 2) was quite similar to ap-menthane unit (Senda and Imaizumi, 1975). The positionof the p-menthane unit on the dihydrochalcone moiety wasestablished with the combined results of COSY, HSQC andHMBC experiments. The chemical shift of H-500 at dH 3.39was indicative of a CH group adjacent to an aryl moiety asseen in methyllinderatin (Ichino, 1989). This hypothesiswas supported by HMBC correlations between H-500 (dH3.39) and C-5 0 (dC 106.8) denoting that p-menthane wasC-linked to the dihydrochalcone core between C-500 andC-5 0. In the HMBC spectrum (see correlations in Fig. 2),protons of the methyl group (dH 1.36) displayed correla-tions with the deshielded quaternary carbon at dC 77.9(C-100) and the aromatic carbon C-6 0 (dC 158.9) of thedihydrochalcone which indicated that the p-menthane unitwas O-linked to the dihydrochalcone unit between C-100
and (O-(C-6 0)) thus forming a six-membered ring betweenthe p-menthane unit and the dihydrochalcone core. The
proposed structures 1a and 1b (Fig. 1) with their relativeconfiguration were eventually confirmed by a single-crystalX-ray analysis. The structure showed that the monoterpeneunit adopted a chair conformation in which the methylgroup at C-700 appeared to be in equatorial position in
Table 11H NMR spectral data for compounds 1–3 (500 MHz, in CDCl3)
a
H 1a (major dia) 1b (minor dia) 2 H 3
Dihydrochalcone moiety
H-2 to H-6 7.21–7.29 m 7.21–7.29 m 7.21–7.31 m 10 3.11 ddd (10.6, 10.6, 6.4)
H-a 3.49 m 3.49 m 3.41 m 20 2.25a
H-b 3.06 t (8.0) 3.06 t (8.0) 3.07 t (7.9) 40 5.55 br s
H-3 0 6.02 s 6.01 s 6.09 s 50 2.49 a
OH-2 0 13.90 s 13.90 13.26 s 60 4.21 ddd (10.2, 10.2, 5.4)
OCH3-40 3.83 s 3.80 s 3.84 s 70a 2.12 a
Monoterpene moiety 70b 2.03 a
Ha-200 1.74 m 1.99 m 1.79 m 80 5.13 t (6.8)
Hb-200 1.61 m 1.53 m 1.68 m 100 1.64 s
Ha-300 1.53 m 1.63 m 1.21 m 110 1.73 s
Hb-300 – – 1.67 m 120 2.05, 2.13
H-400 1.21 m 1.24 m 1.19 m 200/600 7.12
H-500 3.39 m 3.49 m 3.07 t (5.7) 300/500 7.12
Ha-600 1.91 dd (13.4, 3.4) 1.81 m 400 7.06
Hb-600 1.51 dd (13.4, 5.3) 1.73 m 4.54 dd (5.7, 1.2) OH-6 12.23 s
CH3-700 1.36 s 1.37 s 1.41 s OH-4 12.06 s
H-800 1.78 m 1.22 m 1.88 m OCH3-2 3.79 s
CH3-900 1.08 d (6.8) 1.09 d (6.6) 0.90 d (7.0) CH3-5 1.90 s
CH3-1000 0.97 d (6.8) 0.75 d (6.6) 0.86 d (7.0) C@OOCH3-3 4.03 s
a Multiplicity patterns were unclear due to signal overlapping.
Table 213C NMR data of compounds 1–3 (125 MHz in CDCl3)
C 1a (major dia) 1b (minor dia) 2 C 3
Dihydrochalcone moiety
1 141.8 141.8 141.2 1 111.2
2/6 128.3 128.3 128.2 2 163.8
3/5 128.4 128.4 128.6 3 99.4
4 125.8 125.9 126.2 4 164.8
a 45.5 45.5 44.2 5 108.6
b 30.7 30.7 30.6 6 164.2
C@O 204.9 204.8 203.4 7 210.8
1 0 104.7 104.9 102.7 10 45.1
2 0 165.4 165.3 165.6 20 37.3
3 0 91.2 91.0 92.9 30 137.4
4 0 162.3 163.2 161.3 40 118.9
5 0 106.8 103.5 112.9 50 30.2
6 0 158.9 159.3 161.7 60 51.5
CH3O 55.7 55.1 55.5 70 37.4
Monoterpene moiety 80 124.1
100 77.9 76.7 81.9 90 131.7
200 35.3 40.2 30.3 100 17.7
300 20.5 22.5 19.4 110 25.8
400 44.0 49.9 46.8 120 26.4
500 27.2 28.4 41.1 100 143.8
600 30.1 36.9 89.2 200/600 127.5
700 29.2 28.7 21.2 300/500 128.1
800 26.3 29.6 26.9 400 126.2
900 20.9 22.4 15.3 OCH3-2 65.2
1000 22.1 20.4 21.8 CH3-5 7.3
C@OOCH3 170.9
C@OOCH3 52.8
1314 B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320
the two isomers. On the other hand, the position of the iso-propyl group appeared to be in axial position in the majorisomer 1a and in equatorial position in the minor isomer1b. The NOESY spectrum confirmed this result by display-ing interactions between H-500 (dH 3.39) and H-400 (dH 1.21)in the major isomer. As shown in Fig. 3, the two diastere-oisomers which co-crystallized, were perfectly ordered andpacked around an approximate inversion center. Althoughthe absolute configuration could not be determined, it wasarbitrarily assigned (Fig. 3). Therefore the structures ofthese two new monoterpene-substituted dihydrochalconeswere elucidated as 2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0,6 0-O-(4b-iso-propyl-1b-methyl-cyclohexane-1-O-5-yl)dihydrochalcone(1a) and 2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0,6 0-O-(4a-isopropyl-1b-methyl-cyclohexane-1-O,5-yl) dihydrochalcone (1b) andthe trivial names hostmanin A and hostmanin B were pro-posed. Compound 2 obtained as a white amorphous pow-der was assigned the molecular formula C26H32O5 from itsESI-Q-TOF-HRMS (m/z 425.2286 [M+H]+ (calcd.425.2328)) and suggested that 2 differed from 1 by an addi-tional oxygen atom. All the spectral data of compound 2
(Tables 1 and 2) indicated it to be also a 5 0-monoterpene-substituted 2 0-6 0-dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone
derivative. Concerning this monoterpene moiety, the 13CNMR spectrum displayed two methylene carbons (dC30.3 (C-200), 19.4 (C-300)) and three methine carbons (dC46.8 (C-400), 41.1 (C-500), 89.2 (C-600)) instead of three meth-ylene carbons (dC 35.3 (C-200), 20.5 (C-300), 30.1 (C-600)) andtwo methine carbons (dC 44.0 (C-400), 27.2 (C-500)), for com-pound 1 as shown in Table 2. Thus the difference between 1
and 2 referred to the substitution of the saturated cyclicmonoterpene moiety and the presence of an additionalalcohol function in 2. The low-field signal of the C-100 (dC81.9) suggested that this quaternary carbon bore the addi-tional alcohol function. Thus the p-menthane unit might belinked to the dihydrochalcone core as in compound 1 withan hydroxyl group in C-600. Nevertheless, this hypothesiswas rejected. Indeed, in the COSY spectrum, correlationcross-peak was seen between H-500 (dH 3.07) and H-600 (dH4.54) with a coupling constant of J(H500,H600) = 5.7 Hz.The latter consideration and the presence of the deshieldedsignal for H-600 at dH 4.54 supported by HMBC correlationbetween H-500 (dH 3.07) and C-6 0 (dC 161.7) revealed thatthe second connectivity of the p-menthane unit was locatedat C-600. Thus the p-menthane unit and the dihydrochal-cone core formed a five-membered ring as in agreementwith the spectral data of adunctin E previously isolatedfrom Piper aduncum (Orjala et al., 1993). Nevertheless the2D NOESY experiment revealed NOE interactionsbetween H-400 (dH 1.19)/H-500 (dH 3.07), H-500 (dH 3.07)/H-600 (dH 4.54), and H-600 (dH 4.54)/H-700 (dH 1.41), thusestablishing the relative configuration at (C-400)/(C-500)and (C-100)/(C-600), the isopropyl and methyl group (C-700)being trans to each other. The structure of 2 wasestablished as a diastereoisomer of adunctin E as(100R,400R,500S,600S)-2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0, 6 0-O-(4-iso-propyl-1-methyl-cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl) dihydrochal-cone and named hostmanin C. Compound 3 was isolatedas an optically inactive yellow oil. The molecular formulaC29H34O6 was determined by ESI-Q-TOF-HRMS at m/z479.2367 [M+H]+ (calcd. 479.2434). The infrared spectrumcontained a broad band at 3500 cmÿ1 due to hydrogen-bonded OH, conjugated ester carbonyl (1700 cmÿ1), conju-gated carbonyl (1616 cmÿ1) and aromatic ring (1550 cmÿ1).The 1H NMR spectrum of compound 3 exhibited signalsassignable to a dimethylallyl group at dH 1.64 and dH1.73, one aromatic methyl at dH 1.90, an aromatic methoxygroup at dH 3.79, an aryl methyl ester at dH 4.03, twoolefinic signals at dH 5.13 and dH 5.55, a monosubstitutedphenyl group at dH 7.06–7.12 and two hydrogen-bondedOH at dH 12.06 and dH 12.23. The 13C NMR spectrum fur-ther disclosed the presence of four methylene carbons (dC37.4, 26.4, 37.3, 30.2), two methine carbons (dC 45.1 and51.5) and six fully substituted sp2 carbons attesting thepresence of a second aromatic ring. This data led us tothink that 3 should be a prenylated dihydrochalcone inwhich the ring A was totally substituted. This was sup-ported by the comparison with the 1H and 13C NMR dataof the known geranylated dihydrochalcone (±)-nicolaiode-sin C (Gu et al., 2002) which essentially displayed
Fig. 3. ORTEP drawing showing the oxygen atom and solid-state
conformation of 1a and 1b.
Fig. 2. Selected COSY (dotted line) and HMBC (solid line) correlations
for 1a.
B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320 1315
differences in the resonances due to ring A. In the HMBCspectrum, a quaternary aromatic carbon at dC 108.6 wasseen to correlate with the aromatic methyl at dH 1.90 andwith the two hydrogen-bonded phenolic protons at dH12.06 and dH 12.23 (Fig. 4). This consideration suggestedthat the aromatic methyl was located in C-5 position inthe aromatic ring A and a hydroxyl group was borne byC-4 and C-6, respectively. Moreover, the presence of thesecond chelated hydroxyl group at dH 12.06 allowed us toassign the aromatic methyl ester in C-3 to a chemical shiftat (dH 4.03) for the methyl group correlating with the car-bonyl ester at (dC 170.9) in the HMBC spectrum. Longrange correlations in the HMBC spectrum permitted toassign the last substituent in ring A, the methoxy groupat dH 3.79 in C-2. The presence of two methine carbonsC-6 0 and C-1 0 in a and b position, respectively of carbonylfunction suggested that the di-prenylated moiety wassubstituted in these positions. This was supported byNOE interactions between the aromatic methoxy group(dH 3.79) with H-5 0 (dH 2.49) and H-6 0 (dH 4.21) (Fig. 4).
The relative stereochemistry at (C-1 0) and (C-6 0) wasdeduced from the J-value between H-1 0 and H-6 0
(J = 11 Hz) indicating a trans diaxial coupling in a normalhalf-chair conformation (Tuntiwachwuttikul et al., 1984).In order to distinguish the two possibilities of the attach-ment of the prenyl side chain, we have observed long rangeHMBC correlations between H-4 0 (dH 5.55) and C-(5 0) (dC30.2)/C-(6 0) (dC 51.5) which confirmed the attachment ofthe prenyl unit to C-3 0 like (±)-nicolaiodesin C (Guet al., 2002). Compound 3 was determined as a racemateon the basis of the optical rotation profile, the structureshown in Fig. 4 is one of the two possible representationsof the relative stereochemistry. Thus the structure of com-pound 3 was assigned as (1 0R*,6 0R*)-(4,6-dihydroxy-5-methyl-3-methylester-2-methoxyphenyl)-(3 0-isohexenyl-1 0-phenylcyclohex-3 0-enyl) methanone and named hostmaninD. According to Shibata et al. (2000), these compoundscould be conceivably derived from a non-enantioselectiveDiels–Alder reaction between the related chalcone andthe acyclic monoterpene myrcene. Although numerouscompounds containing cyclohexene moiety have beenfound in nature (Gu et al., 2002; Pancharoen et al., 1987;Shibata et al., 2000; Tuntiwachwuttikul et al., 1984), thisconstitutes the first report of this type of compoundisolated in the genus Piper. The structures of the knowncompounds 4–8 were determined by comparison of theirphysical and spectroscopic features with those reported inthe literature and identified as 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-meth-oxydihydrochalcone (Burke and Nair, 1986), linderatone(Ichino et al., 1990), strobopinin (Mayer, 1990), adunctinE (Orjala et al., 1993) and (ÿ)-methyllinderatin (Ichino,1989), respectively. When tested in vitro against Plasmo-
dium falciparum (Table 3), at least two compounds (5 and8) were considered to be potentially interesting. Thedihydrochalcone 8 was as active as observed for similarmolecules (Froelich et al., 2005). When tested on human
Fig. 4. Selected NOESY (dotted line) and HMBC (solid line) correlations
for compound 3.
Table 3
Biological activity (lM) of the compounds 1–8
P. falciparum Human cells CAR FcB1a CAR F32b
F32 (2)c FcB1 (2) MCF7 (3)
1 101.27 ± 4.56d 125.23 ± 28.05 242.64 ± 3.46 1.9 2.4
2 68.4 ± 3.33 79.01 ± 11.67 233.49 ± 3.33 2.9 3.4
3 55.44 ± 7.40 60.67 ± 8.89 207.12 ± 2.96 3.4 3.7
4 12.69 ± 0.26 16.91 ± 2.60 27.51 ± 5.23 1.63 2.2
5 10.33 ± 0.18 15.06 ± 9.38 52.29 ± 1.80 3.4 5.1
6 168.52 ± 23.57 366.48 ± 4.98 366.67 ± 5.23 1.0 2.2
7 126.75 ± 4.21 233.49 ± 3.33 233.49 ± 3.3 1.0 1.82
8 5.64 ± 1.04 5.27 ± 2.24 68.63 ± 10.4 13.0 12.2
CQe 60 · 10ÿ3 145 · 10ÿ3 ND ND ND
Doxf ND ND 0.4 ND ND
a CAR cytotoxic/antiplasmodial (FcB1) ratio.b CAR cytotoxic/antiplasmodial (F32) ratio.c Number of independent experiment.d Means ± SD.e CQ, chloroquine positive control for P. falciparum inhibition.f Dox, doxorubicin; positive control for MCF7 inhibition.
1316 B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320
cell lines, the most efficient compound (8) against P. falci-parum had a CAR (cytotoxicity antiplasmodial ratio)higher than 10, a value that allowed to perform anin vivo test (Likhitwitayawuid et al., 1993). When testedin vivo against P. vinckei petteri, a clear decrease in para-sitaemia (80% at day 5) was observed for the mice treatedwith 8 when compared to control mice (Table 4). The sur-vival time was only of 3.5 additional days when comparedto control thus a complete cure was not achieved at thedose tested.
3. Experimental
3.1. General experimental procedures
Melting points were determined on an Electrothermal9100 apparatus. Optical rotations were measured on a Per-kin–Elmer 241 polarimeter with a sodium lamp(k = 589 nm) in a 1 cm microcell. The UV spectra wererecorded on an Anthelie 2 Advanced spectrometer. IRspectroscopy was performed on a Perkin–Elmer Paragon1000 FT-IR spectrophotometer. NMR (500 and400 MHz for 1H NMR, 125 and 100 MHz for 13C NMR)were obtained with CDCl3 and DMSO-d6 as solvent on aBruker Avance 500 equipped with a TBI z-gradient 5 mmprobe and a Bruker ARX 400 spectrometer. 1D and 2D(COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR experiments wereperformed at 298 K using standard pulse sequences. Chem-ical shifts (d) are given in ppm relative to TMS with cou-pling constant (J) reported in Hz. APCI-MS (positiveand negative-ion mode) spectra were recorded on anLCQ DecaXPmax Thermo Electron mass spectrometer.HRESI-MS spectra (positive and negative-ion mode) wereobtained on a Q-Tof Ultima (Waters) apparatus. Columnchromatography and medium-pressure column chromatog-raphy were performed on silica gel 60 SDS 70–200 lm and6–35 lm, respectively. Reversed-phase chromatographieswere accomplished with RP-18 Mega Bond ElutÒ Variancartridge and RP-18 (40–60 lm, AIT). Analytical and pre-parative HPLC were performed using lBondapack C18 col-umn (10 lm, 3.9 · 300 mm, Waters) and Dynamaxmicrosorb C18 column (5 lm, 10 · 250 mm, Varian) witha UV-DAD Hitachi L 7455 as detector. TLC was carriedout on precoated silica gel 60 F254 aluminium plates
(Merck). Spots were detected under UV (254 and 366nm) before spraying with diphenylborate reagent or a van-illin sulfuric solution followed by heating the plate at110 °C. All solvents were spectral grade or distilled fromglass prior to use.
3.2. Plant material
Leaves of Piper hostmannianum var. berbicense (Miq.)C. DC. were collected in French Guiana in the Saint Elietropical rain forest and identified by Dr Ricardo Calle-jas-Posada R (Univ Antioquia, Inst Biol, Fac CienciasExactas & Nat, Apartado Postal 1226, Medellin, Colom-bia, [email protected]). This samplingspot is a permanent investigation area containing up to800 identified trees. A herbarium voucher specimen(1016) was deposited at the IRD herbarium of Cayenne(CAY).
3.3. Extraction and isolation
Air-dried and powdered leaves of P. hostmannianum
var. berbicense (500 g) were successively percolated withn-hexane (10 l), chloroform (20 l) and methanol (25 l).The dried n-hexane extract was found to exhibit the high-est antiplasmodial activity with an IC50 = 8 lg/ml againstthe growth of chloroquine-resistant strain (FcB1). Theisolation process was guided throughout by the resultsof the antiplasmodial activity and bioautographic TLCassays. After evaporation of the solvent under reducedpressure, the oily residue (15 g) was subjected to columnchromatography (7.5 · 120 cm) on silica gel (400 g,70–200 lm) and sequentially eluted with n-hexane, ethylacetate and methanol to afford 14 fractions (500 ml each).Fractions F1 and F3 eluting with n-hexane–ethyl acetate75:25 proved to be the most active in the antiplasmodialassay. Fraction F1 (4.9 g) was further purified by silicagel (150 g, 6–35 lm) medium-pressure column chromatog-raphy (3.5 · 17.5 cm) using a mixture of n-hexane–ethylacetate of increasing polarity as eluent to give 13 fractions(150 ml each). The purification of the most potentfractions F1.2, F1.3, F1.4 was further investigated. FromF1.2 (1.35 g), linderatone 5 (10 mg) and compound 1
(20 mg) were obtained after repeated purification on anRP-18 (30 g, 40–60 lm) medium-pressure column (2.5 ·
Table 4
In vivo activity of (ÿ)-methyllinderatin 8 against P. vinckei petteri in mice
Treatment Dose (mgÿ1 kgÿ1 dayÿ1) n a Mean (±SD) parasitaemiab Reduction of parasitaemia b (%) Mean survival time (day)
Control 10 38.1 ± 3.7 7.7 ± 1.3
8 20 5 7.8 ± 6.7 80 11.1 ± 1.59
CQc 10 5 0 100 >21
1 5 33 ± 14.4 13 7.1 ± 1.1
a Number of mice by group.b At day 4.c Chloroquine.
B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320 1317
20 cm) chromatographic separation eluted with MeOH–H2O 80:20. Fraction F1.3 (192 mg) was purified bychromatography on a reversed-phase silica gel cartridge(VarianÒ, Mega Bond Elut) (MeOH–H2O 85:15) followedby a semi-preparative HPLC (RP-18 at a 3 ml/min flowrate; elution from 80% to 100% MeOH in H2O over10 min; 100% MeOH during 10 min; finally returning tothe initial condition) to yielded compounds 2 (1.7 mg), 3(1.5 mg), and adunctin E (7) (1.8 mg). From F1.4(167 mg), (ÿ)-methyllinderatin 8 (30 mg) was obtainedafter purification on a reversed-phase silica gel cartridge(VarianÒ, Mega Bond Elut) (MeOH–H2O 85:15). 2 0,6 0-Dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone 4 (10 mg) andstrobopinin 6 (4 mg) were isolated from fraction F3(1.03 g) after a SephadexÒ LH-20 column (2.5 · 20 cm)using CHCl3 as eluting solvent followed by RP-18 columncartridge (VarianÒ, Mega Bond Elut) separation (MeOH–H2O 60:40) and semi-preparative HPLC (RP-18 at a 3 ml/min flow rate of MeOH–H2O 60:40).
3.4. Hostmanin A rel-(100R,400R,500R)-2 0-hydroxy-4 0-
methoxy-5 0,6 0-O-(4-isopropyl-1-methyl-cyclohexane-1-O,
5-yl)dihydrochalcone (1a) and hostmanin B rel-
(100R,400S,500R)-2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0,6 0-O-
(4-isopropyl-1-methyl-cyclohexane-1-O,5-
yl)dihydrochalcone (1b)
Yellow prisms: mp 58–60 °C (from MeOH); ½a�25D ÿ 31
(MeOH, c 0.15); UV kMeOHmax (log e) 234 (3.00), 292
(3.15) nm; IR tCHCl3max 3425 (chelated OH), 1616 (C@O),
1585 (aromatic ring) cmÿ1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3),see Table 1; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) see Table 2;APCI m/z 407 [MÿH]+; HRESIMS m/z 407.2242 (calcd.407.2222) for C26H32O4.
3.5. Hostmanin C rel-(100R,400R,500S,600S)-2 0-hydroxy-4 0-
methoxy-5 0,6 0-O-(4-isopropyl-1-methyl-cyclohexan-1-ol-5,
6-O-yl)dihydrochalcone (2)
White amorphous powder: ½a�25D þ 4 ðMeOH; c 0:17Þ;UV kMeOH
max (log e) 232 (3.70), 285 (3.78) nm; IR tCHCl3max
3390 (br OH), 1633 (C@O), 1600, 1580 (aromatic ring),1215 (C–OH) cmÿ1; 1HNMR (500 MHz, CDCl3) see Table1; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) see Table 2; APCI m/z 423[MÿH]+; HRESIMS m/z 425.2286 (calcd. 425.2328) forC26H32O5.
3.6. Hostmanin D rel-(1 0R*,6 0R*)-(4,6-dihydroxy-5-methyl-
3-methylester-2-methoxyphenyl)-(3 0-isohexenyl-1 0-
phenylcyclohex-3 0-enyl) methanone (3)
Yellow oil: ½a�25D 0 (MeOH, c 0.1); UV kMeOH
max (log e) 232(3.23), 292 (3.52) nm; IR tCHCl3
max 3500 (br OH), 1700 (O–C@0), 1616 (C@O), 1580 (aromatic ring) cmÿ1; 1H NMR(500 MHz, CDCl3) see Table 1; 13C NMR (125 MHz,
CDCl3) see Table 2; APCI m/z 477 [MÿH]+; HRESIMSm/z 479.2367 (calcd. 479.2434) for C29H34O6.
3.7. 2 0-6 0-Dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone (4)
Colourless plates: mp 175 °C (from CH2Cl2) (Burke andNair, 1986), 174–175 °C; UV kMeOH
max 232 (4.94) 287(5.08) nm; IR tCHCl3
max 3264 (br, OH), 1646 (C@O), 1600,1526 (aromatic ring) cmÿ1; APCI m/z 271 [MÿH]+; 1HNMR and 13C NMR (Orjala et al., 1994).
3.8. Linderatone (5)
Amorphous powder: ½a�25D ÿ 32:4 ðCHCl3; c 0:5Þ; UV
kMeOHmax (log e) 295 (3.98), 335 (3.57); IR tCHCl3
max 3435 (brOH), 1635 (C@O), 1620, 1580 (aromatic ring) cmÿ1; APCIm/z 391 [M+H]+; 1H NMR and 13C NMR (Ichino et al.,1990).
3.9. Strobopinin (6)
Solid: mp 228–230 °C (from Et2O) (Mayer, 1990) 223–232 °C; ½a�25D ÿ 90:4ðCHCl3; c 0:05Þ; UV kMeOH
max (log e) 295(3.61), 335 (3.43) nm; IR tCHCl3
max 3125 (chelated OH), 1635(C@O), 1620, 1587 (aromatic ring) cmÿ1; APCI m/z 269[MÿH]+; 1H NMR and 13C NMR (Mayer, 1990).
3.10. Adunctin E (7)
White amorphous powder: ½a�25D þ 16:3 (MeOH, c 0.65);
UV kMeOHmax (log e) 232 (3.70), 285 (3.78) nm; IR tCHCl3
max 3390(br OH), 1633 (C@O), 1600, 1580 (aromatic ring), 1215 (C–OH) cmÿ1; APCI m/z 423 [MÿH]+; 1H NMR and 13CNMR (Orjala et al., 1993).
3.11. (ÿ)-Methyllinderatin (8)
Colourless oil: ½a�25D ÿ 40:1ðCHCl3; c 0:1Þ; UV kMeOH
max
(log e) 211 (4.72), 289 (4.54) nm; IR tCHCl3max 3359 (br OH),
1623 (C@O), 1580, 1450 (aromatic ring) cmÿ1; APCI m/z407 [MÿH]+; 1H NMR and 13C NMR (Ichino, 1989).
3.12. Plasmodium in vitro culture and antiplasmodial activity
Parasites were cultured according to the methoddescribed by Trager and Jensen (Trager and Jensen,1976) with modifications described by Benoit et al.(1995). The cultures were synchronized every 48 h by 5%D-sorbitol lysis (Lambros and Vanderberg, 1979) (Merck,Darmstadt, Germany). The F32-Tanzania strain was con-sidered as a chloroquino-sensitive strain (chloroquineIC50: 60 nM), and FcB1-Columbia was considered as chlo-roquino-resistant strain (chloroquine IC50: 145 nM). In
vitro antimalarial activity testing was performed by [3H]-hypoxanthine (Amersham-France) incorporation asdescribed by Desjardins et al. (1979) with modifications(Valentin et al., 1997).
1318 B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320
3.13. In vitro cytotoxicity evaluation
Human breast adenocarcinoma (MCF-7) cells werecultured in DMEM culture media containing 2 mML-glutamine (Cambrex, Emerainville, France) supple-mented with 1% fetal calf serum (FCS) (Cambrex) andincubated under standard conditions (37 °C, 5% CO2).All experiments were carried out using cells in the expo-nential phase of growth. Cells were trypsinized, resus-pended in DMEM containing 10% FCS and seeded(200,000 cells/ml) in 96-well plates. After 24 h the mediumwas replaced by fresh medium containing the compoundsat concentrations ranging from 1 to 100 lg/ml. At theend of the treatment (48 h) cell viability was evaluatedby measuring the activity of the mitochondrial enzymesuccinate deshydrogenase. The medium was replaced by50 ll of a sodium 2,3–bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophe-nyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt (XTT)(Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) in water solu-tion (0.5 mg/ml), and cells were incubated for 180 min.The reaction was stopped by addition of a SDS solution(10% in water). XTT was converted to a formazan prod-uct, detected by spectrophotometry at 450 nm. IC50 val-ues were determined graphically from the dose–responsecurves (Tabbi et al., 2002).
3.14. In vivo antiplasmodial activity testing
In order to test the in vivo antimalarial activity, a 4-day-suppressive assay was performed on CD female mice, usingP. vinckei petteri (Peters, 1965). Mice (mean body weight:20 ± 2 g) were infected with 106 infected red blood cellsin RPMI on day 0. Groups of five mice were treated intrap-eritonally from day 0–3 with one dose (20 mg/kg) of themost efficient drug 8. On day 4, Giemsa stained smearswere made for each mouse after tail blood sampling. Para-sitaemia was estimated by visual counting of at least 5000erythrocytes. Controls were mice treated with RPMI aloneor chloroquine (1 and 10 mg/kg). The inhibition percentagewas calculated with the following formula: (control para-sitaemia – parasitaemia with drugs)/ (control parasitaemia)X 100. Mice were maintained under institutional animalguidelines.
3.15. X-ray crystallographic analysis of 1
C26H32O4, M = 408.52, monoclinic, P21, a = 11.739(1)A, b = 16.054(1) A, c = 12.667(1) A, b = 111.718(2)°,V = 2217.9(3) A3, Z = 4, T = 173(2) K. Nine thousandnine hundred and sixteen reflections (6272 independent,Rint = 0.0438) were collected. Largest electron density res-idue: 0.138 e Aÿ3, R1 (for I > 2r(I)) = 0.0494 and wR2 =0.0976 (all data) with R1 = RiFo| ÿ |Fci/R |Fo| andwR2 ¼ ðRwðF 2
o ÿ F2cÞ
2= RwðF 2
oÞ2Þ0:5. All the data for this
structure was collected at low temperatures using an oil-coated shock-cooled crystal on a Bruker-AXS CCD 1000diffractometer with Mo Ka radiation (k = 0.71073 A).
The structure was solved by direct methods (SHELXS-97, (Sheldrick, 1990)) and all non-hydrogen atoms wererefined anisotropically using the least-squares method onF2 (SHELXL-97, Program for Crystal Structure Refine-ment, G.M. Sheldrick, University of Gottingen 1997).
4. Supplementary material
The crystallographic data for the structures reported inthis paper has been deposited with the Cambridge Crystal-lographic Data centre as supplementary publication(Deposition No. CCDC 624770). This data can be obtainedfree of charge, by request to the Director, via www.ccdc.ca-m.ac.uk/conts/retrieving.html (or from the CCDC, 12Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK; fax: +44 1223336033; e-mail: [email protected]).
Acknowledgements
We thank Jean-Marie Chantraine and Christian Mor-etti from IRD research unit (US084) for the first plantcollecting and the French Ministry of Research for Na-tional Science Grant from ACI Pal +. Martine Kniebhi-eler and Frederic Ausseil from Pierre Fabre Medicament– CNRS research unit (UMS 2646) are acknowledgedfor technical support and Georges Massiot from PierreFabre Medicament – CNRS research unit (UMS 2597),for his advice. The authors are grateful to Dr. VerenaPoinsot from Laboratoire des IMRCP (UMR 5623UPS/CNRS) Toulouse, for high resolution mass spec-trometry; Eliane Pelissou from UMR 152, for technicalassistance in biological evaluations and Dr. RicardoCallejas Posada for scientific plant determinations. Final-ly, Universite Paul Sabatier is also acknowledged for itstechnical platforms.
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1320 B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320
TITLE : Bioguided research of antimalarial compounds from a plant of Guyana : Piper
hostmannianum var. berbicense
ABSTRACT :
Malaria is an infectious disease that occurs in one hundred countries located in tropical and
subtropical regions in the world. The emergence of resistant strains to antimalarial drugs in
use makes it necessary to discover new antimalarials. Previous findings of antimalarial agents
such as quinine and artemisinin from medicinal plants also encouraged the possibility of
finding new active drugs from plant sources. In our search aiming to discover new
antimalarial from the biodiversity of French Guiana, the n-hexane extract and the chloroform
extract of the leaves of Piper hotmannianum var berbicense revealed a potential
antiplasmodial activity with IC50 between 8 and 20 µg/ml. After purification, seventeen
compounds have been isolated. Their structures were established on the basis of NMR
experiments, mass spectroscopy and X-ray analysis. The antiplasmodial and cytotoxic in vitro
activities of all isolated compounds were assessed against chloroquine-sensitive and
chloroquine-resistant P. falciparum strains and MCF-7 cells. Moreover, the most active
compounds with the best selectivity were evaluated for in-vivo antimalarial activity against P.
vinckei petteri in mice. We have investigated the specific fragmentation patterns of the
flavanones, chalcones and dihydrochalcones previously isolated in mass spectrometry by (-)-
APCI in the university of Bruxelles . The present approach have been applied to study the
flavonoids in the ethyl acetate extract of the leaves of P. hostmannianum var. berbicense by
LC/UV/APCI-MSn. Based on the identification rules by MS spectroscopy, five new molecules
were tentatively characterized including flavanones, chalcones and dihydrochalcones.
KEY WORDS : Piperaceae, chalcones, flavanones, NMR, mass spectrometry, malaria, P.
falciparum.
AUTEUR : Bénédicte PORTET TITRE : Recherche bioguidée de molécules antipaludiques d’une plante guyanaise : Piper hostmannianum var. berbicense.
DIRECTEUR DE THESE : Pr. Claude MOULIS
CO-DIRECTEUR DE THESE : Pr. Isabelle FOURASTE
LIEU ET DATE DE LA SOUTENANCE : Faculté des sciences pharmaceutiques de Toulouse le 19 octobre 2007.
RESUME : Le paludisme est une maladie parasitaire qui touche une centaine de pays situés dans les zones tropicales et sub-
tropicales de l’hémisphère sud. L’apparition des phénomènes de résistance du parasite aux médicaments actuels
souligne le besoin urgent de nouveaux agents antipaludiques. La découverte de deux antipaludéens majeurs (la
quinine et l’artémisinine) issus des plantes médicinales encourage la recherche de nouveaux médicaments issus
de la biodiversité végétale. A la suite d’un screening à haut débit sur une centaine de plantes originaires de
Guyane Française, les extraits hexanique et chloroformique des feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense
ont révélé une activité antiplasmodiale potentielle avec des CI50 comprises entre 8 et 20 µg/ml. Après
purification de ces extraits par diverses méthodes chromatographiques, 17 molécules de type chalcone,
dihydrochalcone et flavanone ont été isolées et identifiées par plusieurs techniques spectroscopiques (UV, IR
RMN, SM, rayons X). L’activité antiplasmodiale de ces molécules a été évaluée in vitro sur des souches de
Plasmodium falciparum. Des cellules de type MCF-7 ont été utilisées pour évaluer leurs cytotoxicités. De plus,
le potentiel antiplasmodial des composés les plus actifs a pu être confirmé par des tests in vivo sur des souris
infectées par P. vinckei petteri. Une étude en spectrométrie de masse au sein de la Faculté de pharmacie de
Bruxelles a permis d’étudier la fragmentation des molécules isolées. Ainsi, l’analyse par LC/MS d’un extrait brut
de P. hostmannianum var. berbicense a permis l’identification de cinq nouvelles molécules de type chalcone,
dihydrochalcone et flavanone.
MOTS-CLES : Piperaceae, chalcones, flavanones, RMN, spectrométrie de masse, paludisme,
P. falciparum.
DISCIPLINE : Chimie, spécialité chimie-biologie
UMR-152 IRD-UPS Laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox. Faculté des sciences pharmaceutiques. Toulouse.