Diversité, multiplicité des infections et résistance aux antipaludiques de P. falciparum dans un essai contrôlé de MII en zone de forte endémie

Atelier PALUDISME 2007Institut Pasteur de Madagascar

Atelier PALUDISME 2007Atelier PALUDISME 2007Institut Pasteur de MadagascarInstitut Pasteur de Madagascar

DiversitDiversitéé, , MultiplicitMultiplicitéé des infections et rdes infections et réésistance aux sistance aux antipaludiquesantipaludiques de Plasmodium falciparum de Plasmodium falciparum dansdans un un

essaiessai contrôlcontrôléé de de moustiquairesmoustiquaires imprimpréégngnééesesdd’’insecticideinsecticide en zone de forte en zone de forte endendéémiemie

HervHervéé BogreauBogreau

[email protected] IMTSSA—URBEP, « le PHARO »

PLANPLAN

• Situation du paludisme– Émergence & Diffusion des résistances– Paludisme Urbain– Moyens de lutte Évaluation ?

• Quels marqueurs pour une surveillance des populations plasmodiales ?

– Que disent les marqueurs moléculaires ?– Marqueurs non biaisés ?

• Structure or not structure ?– À l’échelle du continent– À l’échelle locale

• Transmission palustre & population plasmodiales– Transmission locale & diversité génétique…– Impacte transmission sur les populations plasmodiales

(Multiplicité, He, Fst,..)• Conclusion

SITUATION DU PALUDISMESITUATION DU PALUDISME

1960

Chloroquinorésistance



1970-1980



2006



2006

Sulfadoxine-pyrimethamine, Mefloquine

Mefloquine

Sulfadoxine-pyrimethamine

Mefloquine, Halofantrine, Sulfadoxine-purimethamine,Quinine



20062006

35 % de la population mondiale 2 millions morts / an

Essentiellement les enfants en Afrique (> 90% des cas)


Paludisme urbain

SolutionsSolutions

Stade sanguin Anophèle

Stade hépatique

SolutionsSolutions

Stade hépatique

Stade sanguin Anophèle

PolychimiothPolychimiothéérapierapie (ACT) limite :(ACT) limite :-- Emergence des souches rEmergence des souches réésistantessistantes-- Transmission aux anophTransmission aux anophèèlesles

Lutte antiLutte anti--vectorielle limite :vectorielle limite :-- Transmission de Transmission de P. falciparumP. falciparum-- Recours aux soins & pression Recours aux soins & pression de sde séélectionlection-- Diffusion des souches Diffusion des souches rréésistantessistantes

Comment Comment éévaluer leur efficacitvaluer leur efficacitéé contre contre les rles réésistances ?sistances ?

• Quelles échelle spatiale pour la surveillance ?



1 population Homogène





Plusieurs populations



Plusieurs populations

&

Migration de parasites

(flux de gènes)


• Quelle échelle spatiale pour la surveillance ?

Population structurée

Déterminer le niveau de structuration des populations plasmodiales

A partir de quelle distance les populations plasmodiales diffèrent-elles10km, 100km, 1000km ?


• Quelle échelle spatiale pour la surveillance ?

– Niveau de structuration ?

• Facteur(s) influençant les populations plasmodiales ?

– Niveau de transmission palustre ?

Quels marqueurs pour une surveillance Quels marqueurs pour une surveillance des populations des populations plasmodialesplasmodiales ??

Quels marqueurs pour une surveillance Quels marqueurs pour une surveillance des populations des populations plasmodialesplasmodiales ??

• Des marqueurs associés à la chimiorésistance de P. falciparum aux antipaludiques.

– Pf-crt, pf-mdr1– Dhfr, dhps– …

Informations apportInformations apportéées par les es par les marqueurs gmarqueurs géénnéétiques de rtiques de réésistances ?sistances ?

Distribution de la mutation Pfcrt T76 associée à la résistance de

P. falciparum à la chloroquine (CQ)

Sud deSud deDananDananéé








LibLibéériaria Côte dCôte d’’IvoireIvoire

10 Km

35 Km

% de 76T différents entre villages

76T : % isolats avec seulement Pfcrt 76T

Bepleu (23)76T =56%

Méantouo (24)76T =50%

Finneu (24) 76T =33%

Biétouo (24) 76T= 25%

Zoleu (21)76T =42%

Bouenneu (24) 76T =5%






10 Km

35 Km



Bepleu (23)76T =56%


Finneu (24) 76T =33%

Biétouo (24) 76T= 25%

Zoleu (21)76T =42%


Populations Isolées ?

- Évolution indépendante

- Faibles flux de gènes entre populations P.f.






10 Km

35 Km



Bepleu (23)76T =56%


Finneu (24) 76T =33%

Biétouo (24) 76T= 25%

Zoleu (21)76T =42%


Populations Isolées ?

- Évolution indépendante

- Faibles flux de gènes entre populations P.f.

Populations Mélangées ? (migrations)

- Importants flux de gènes

- Utilisation de CQ différente

Des marqueurs non biaisDes marqueurs non biaiséés ?s ?

Population A Population B

Marqueurs sous pression de sélection(Médicaments, immunité… modifications environnementales)

Sensible Résitant

Marqueurs sélectivement neutres



Marqueurs sous pression de sélection(Médicaments, immunité… modifications environnementales)

Sensible Résitant

Marqueurs sélectivement neutres

Parasite



Flux de gènes

Migrations



Reproduction sexuée & Recombinaison génétique



Élimination des P. falciparum avec l’allèle sensible & Sélection

des résistants (pression médicamenteuse…)



Élimination des P. falciparum avec l’allèle sensible & Sélection

des résistants (pression médicamenteuse…)



Conclusions différentes selon le marqueur observéMarqueur sous pression de sélection

Population A : ≠ Population B : Marqueur sélectivement neutres

Population A : = Population B :

Difficile d’étudier la structure des populations avec des gènes soumis à pression de sélection :

sélection médicamenteuse ou immunepeut camoufler des migrations de populations,

simuler ou masquer une structuration

Etudes avec des marqueurs (supposés) sélectivement neutres

(Anderson et al. 2000 Mol. Biol. Evol.)

MicrosatellitesMicrosatellites

A T C G T T A A T A A T A A T A A T A A A G T C A G T A G C A A T T A T T A T T A T T A T T T C A G T C

Régions flanquantes constantes

1 5 nucleotides par unité de répétition (TAA)n, (CA)n, (TA)n

Séquences ADN répétées en tandem


A T C G T T A A T A A T A A T A A T A A A G T C A G T A G C A A T T A T T A T T A T T A T T T C A G T C

Régions flanquantes constantes

1 5 nucleotides par unité de répétition (TAA)n, (CA)n, (TA)n

Unité de 3 nucleotides région codante ?

Séquences ADN répétées en tandem


X 13

X 23

X 9

La taille des microsatellites varie par leur nombre d’unités de répétition en tandem

Polymorphisme de taille entre individus


X 13

X 23

X 9

Temps de migration = f(taille de l’allèle)

A BÉlectrophorèse

PCR - amorce marquée fluorescente

Structure des populations de P. falciparum Structure des populations de P. falciparum avec marqueurs microsatellites : avec marqueurs microsatellites :

rréésultats incohsultats incohéérentsrentsPopulations Populations homoghomogèènes nes

((Afrique centrale, Afrique centrale, Anderson, 2000Anderson, 2000))

Dissimilitude Dissimilitude VillagesVillages——VilleVille

(Soudan(Soudan AbdelAbdel--MuhsinMuhsin, 2002, 2002))

ZimbabweZimbabwe

SoudanSoudanKhartoum vs. villagesKhartoum vs. villages

R.D.C. R.D.C.

OugandaOuganda

DDééssééquilibre de liaisonquilibre de liaisonEquilibre de liaisonEquilibre de liaison

Structure des populations de Structure des populations de P. falciparumP. falciparumavec marqueurs microsatellites : avec marqueurs microsatellites :

rréésultats incohsultats incohéérentsrentsPopulations Populations homoghomogèènes nes

((Afrique centrale, Afrique centrale, Anderson, 2000Anderson, 2000))

Dissimilitude Dissimilitude VillagesVillages——VilleVille

(Soudan(Soudan AbdelAbdel--MuhsinMuhsin, 2002, 2002))

DDééssééquilibre de quilibre de liaison en zones de liaison en zones de

fortes et faible fortes et faible transmission transmission (Leclerc, (Leclerc,

2002; Durand 2003)2002; Durand 2003)

ZimbabweZimbabwe

SoudanSoudanKhartoum vs. villagesKhartoum vs. villages

R.D.C. R.D.C.

OugandaOuganda

DakarDakar

DDééssééquilibre de liaisonquilibre de liaisonEquilibre de liaisonEquilibre de liaison

CongoCongo

DDééssééquilibre de Liaison gquilibre de Liaison géénnéétiquetique

Locus A

Locus B

1 population


Locus A

Locus B

Association aléatoire des allèles

Équilibre de liaison génétique

1 population


Locus A

Locus B

1 population




Locus A

Locus B

1 population 2 populations




Locus A

Locus B


Association non aléatoire des allèles

Déséquilibre de liaison génétique




Déséquilibre = proport. [ ] observée – proport.[ ] attendue si 1seule Liaison génétique population

Locus A

Locus B


Marqueurs non biaisMarqueurs non biaiséés ?s ?

Données microsatellites :

- Populations P. falciparum non structurées

- Déséquilibre de liaison génétique

Résultats incohérents…

Microsatellites neutres ?

P. falciparumP. falciparum : : 900 Microsatellites900 Microsatellites

Microsatellite tous les 2-3kb, uniformément sur l’ensemble du génome

Microsatellites complexesMicrosatellites complexes

(AAT) Unité répét. 1

(ATTTAT) Unitérépét. 2 (mini/microsatellite)

(AT) Unité répét. 3

Région flanquante

avec unités de répétition autres que tri-nucléotidiques

SSéélection de lection de 60 microsatellites60 microsatellites

1) Microsatellites complexes, non basés sur répétitions tri-nucléotidiques2) Taille comprise entre 50 et 350 bp

SpSpéécificitcificitéé

ADN P. falciparum

ADN autres Plasmodii

Séquence ADN des régions flanquantes des locimicrosatellites de Plasmodium falciparum absente du

génome humain ou d’autres Plasmodii

ADN Humain

SSéélection lection 17 microsatellites17 microsatellites

3) Spécificité : ADN autres Plasmodii et ADN Humain4) Sensibilité : séquences ADN des régions flanquantes constantes

DDéétermination facile de la taille termination facile de la taille

Trident « Cathédrale » Double pic

SSéélection par lection par «« autoauto--stopstop »»

Locus sous sélection

Microsatellite

Microsatellite

♂♀

Recombinaisons

Recombinaisons rares

Microsatellites à distance de loci sous sélection

Recombinaisons fréquentes indépendance des loci

PolymorphismePolymorphisme

0%

5%

10%

15%

20%

25%

118

218

221

223

225

228

231

233

235

237

239

242

245

252

255

259

263

270

283

326

Freq

uenc

y

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

91 94 98 101 110

Polymorphisme élevéPuissance d’analyse basse

Polymorphisme basFaible discrimination

Taille des allèles

Microsatellites à polymorphisme intermédiaire

SSéélection de lection de 6 microsatellites6 microsatellites

5) Electrophorégrames faciles à lire6) Microsatellites sur des chromosomes différents7) Distance entre loci microsatellites et loci sous sélection8) Polymorphisme intermédiaire

PLANPLAN







À l’échelle du continent africain ?

Structure or not structure ?Structure or not structure ?[Pour [Pour P. falciparumP. falciparum en Afrique]en Afrique]

Hypothèse : croisement aléatoire en Afrique intertropicale.

Pas de différences significatives entre les populations plasmodiales.

ProtocoleProtocole

Trans < 1 Trans < 1 Ib/pers/yIb/pers/yP rate <5%P rate <5%Djibouti Djibouti

Trans < 1 Trans < 1 Ib/pers/yIb/pers/yP rate <5%P rate <5%

DakarDakar

Trans < 1 Trans < 1 Ib/pers/yIb/pers/yP rate <5%P rate <5% 30%30%

NiameyNiamey

Trans > 300 Trans > 300 b/pers/yb/pers/yP rate >80%P rate >80%

South South DananDananéé

Trans : nbr de piqures infectantes /pers./anP. Rate : index plasmodique

ProtocoleProtocole

DakarDakar

NiameyNiameyDjiboutiDjibouti

South South DananDananéé

ProtocoleProtocole

Génotypage (6 à 17 microsatellite) AFCFst (pop comparées 2 à 2)

DjiboutiDjiboutin(42)n(42)

DakarDakarn(37)n(37)

SouthSouthDananDananéén(118)n(118)

NiameyNiameyn(43)n(43)

AFC 6 AFC 6 lociloci microsatellitemicrosatellite

-3.0 -1.5 0.0 1.5AXE I

-1.70

-1.02

-0.34

0.34

1.02

1.70AX

E II

NiameyDjiboutiDakarSud Danané

Sites

Dissemblances et diversité génétique

(Bogreau H. et al. AJTMH 2006)

DiffDifféérences grences géénnéétiques entre tiques entre populations (populations (FstFst))

Total population

Population 1 Population 2

Total population

Population 1 Population 2

Population 1 = Population 2 Fst = 0

flux importants de gènes entre pop1 & 2

Population 1 ≠ Population 2Fst = 1

pas d’échange entre les populations0 Pas de divergence

<0.05 Differentiation génétique négligeable0.05-0.15 Modérée0.15-0.25 Importante>0.25 Populations très structurées

1 Fixation d’allèles


Importante différentiation génétique entre les

populations de Djibouti et des autres sites

Structure à l’échelle du continent !

θθ==0.1890.189(0.121(0.121--0.265)0.265)

θθ==0.2100.210(0.152(0.152--0.272)0.272)

θθ==0.2460.246(0.166(0.166--0.321)0.321)

DjiboutiDjibouti

DakarDakar

SouthSouthDananDananéé

NiameyNiamey

0 Pas de divergence<0.05 Differentiation génétique négligeable0.05-0.15 Modérée0.15-0.25 Importante>0.25 Populations très structurées




Différentiation modérée entre la zone rurale de

Danané et les autres sites

θθ==0.1890.189(0.121(0.121--0.265)0.265)

θθ==0.2100.210(0.152(0.152--0.272)0.272)

θθ==0.2460.246(0.166(0.166--0.321)0.321)

DjiboutiDjibouti

DakarDakar


NiameyNiamey



θθ==0.1050.105(0.081(0.081--0.172)0.172) θθ==0.0840.084

(0.074(0.074--0.171)0.171)



Pas de Différentiation entre Dakar et Niamey

Réseau routier Migrationhumaine

θθ==0.1890.189(0.121(0.121--0.265)0.265)

θθ==0.2100.210(0.152(0.152--0.272)0.272)

θθ==0.2460.246(0.166(0.166--0.321)0.321)

DjiboutiDjibouti

DakarDakar


NiameyNiamey



θθ==0.1050.105(0.081(0.081--0.172)0.172) θθ==0.0840.084

(0.074(0.074--0.171)0.171)

θθ==0.0260.026(0.008(0.008--0.048)0.048)


RRéésultats divergents avec les sultats divergents avec les marqueurs smarqueurs séélectivement neutres !!lectivement neutres !!

ZIMBABWE

Dakar DjiboutiNiamey

Danané

CONGO

UGANDA0.003

0.003 0.01

2

0.189

0.0260.105

0.210

0.2460.084

Différents Microsatellites différents Fst

Différents échantillonnages différents Fst

??

RRéésultats divergents avec les sultats divergents avec les marqueurs smarqueurs séélectivement neutres !!lectivement neutres !!

ZIMBABWE

Dakar Djibouti

CONGO

UGANDA0.003

0.003 0.01

2

0.189

Différents Microsatellites le même Fst

Différents échantillonnages différents Fst

0.193


Structure or not structure ?Structure or not structure ?

Structure des populations de plasmodium falciparum à l’échelle du continent africain !!

Et localement ?

DDééssééquilibre de liaison gquilibre de liaison géénnéétique: tique: structure locale ?structure locale ?

Conditions pouvant engendrer un déséquilibre de liaison local :– Structure des populations– Expansion épidémique de souches– Croisement préférentiel entre souches

Sans dSans dééssééquilibrequilibrede liaisonde liaison

Sud Sud DananDananéé

Sans dSans dééssééquilibrequilibrede liaisonde liaisonNiameyNiamey

Sans dSans dééssééquilibrequilibrede liaisonde liaison

DakarDakarAvec dAvec dééssééquilibrequilibre

de liaisonde liaisonDjiboutiDjibouti


Structure or not structure ?Structure or not structure ?

Difficile d’établire une Structure des populations de plasmodium falciparum àl’échelle locale avec un indicateur (D.L.) influencer par plusieurs paramètres…

PLANPLAN







DDééfinition : Transmission Palustrefinition : Transmission Palustre

Nombre de piqûres infectantes /pers / an

DDééfinition : Multiplicitfinition : Multiplicitéé des Infectionsdes Infections

Nombre de souches dans un isolat sanguin

DDééfinition : Diversitfinition : Diversitéé GGéénnéétiquetique(H(Hééttéérozygotie)rozygotie)

Probabilité d’obtenir 2 allèles =

Avec 2 tirages au sort

(Probabilité d’avoir un hétérozygotesi diploïde)

Population de Parasites

Transmission & GTransmission & Géénnéétique des tique des populations populations plasmodialesplasmodiales

Hypothèse : Transmission (en milieu urbain)⇒ Multiplicité & Diversité Génétique

Trans < 1 Trans < 1 b/pers/yb/pers/yP rate <5%P rate <5%DjiboutiDjibouti

Trans < 1 Trans < 1 b/pers/yb/pers/yP rate <5%P rate <5%

DakarDakar

Trans > 300 Trans > 300 b/pers/yb/pers/yP rate >80%P rate >80%


Trans < 1 Trans < 1 b/pers/yb/pers/yP rate <5%P rate <5% 30%30%

NiameyNiamey


Hypothèse : Transmission (en milieu urbain)⇒ Multiplicité & Diversité Génétique

Multiplicité en accord avec le niveau de transmission palustre

TransTrans < 1 b/pers/y< 1 b/pers/yMultMult.: 1.31.: 1.31DjiboutiDjibouti

TransTrans < 1 b/pers/y< 1 b/pers/yMultMult.: 1.41.: 1.41

DakarDakar

TransTrans > 300 b/pers/y> 300 b/pers/yMultMult.: 2.68.: 2.68

southsouthDananDananéé

TransTrans < 1 b/pers/y< 1 b/pers/yMultMult.: 1.63.: 1.63NiameyNiamey


Fort niveau de transmission & production locale de diversitégénétique

Danané : Fort niveau de transmission P. falciparum& Importante diversité génétique

DjiboutiDjiboutiNiameyNiamey

DakarDakar

H=0.76H=0.76SouthSouth

DananDananéé


Faible niveau de transmission & savane aride

Djibouti : Faible niveau de transmission P. falciparum& faible diversité génétique

H=0.53H=0.53DjiboutiDjibouti

NiameyNiameyDakarDakar


DananDananéé


Fort niveau de transmission autour des zones urbainesDiversité génétique importée !!

Dakar et Niamey : Faible niveau de transmission P. falciparum & grande diversité génétique

H=0.53H=0.53DjiboutiDjibouti


DananDananéé

H=0.76H=0.76NiameyNiamey

H=0.73H=0.73DakarDakar

Transmission du paludisme et Transmission du paludisme et diversitdiversitéé ggéénnéétique (Htique (Hééttéérozygotie)rozygotie)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Djibouti Dakar Niamey Danané

Mul

tiplic

ity

00,10,20,30,40,50,60,70,80,91

Het

eroz

ygos

ity

Multiplicity Heterozygosity

< 1b/pers/Y < 1b/pers/Y < 1b/pers/Y >300b/pers/Y

Le niveau de transmission ne peut pas expliquer à lui seul la diversitégénétique observé

La diversité génétique locale est en relation avec :

– situation palustre dans les zones environnantes &

Migration humaine

– Niveau Transmission local du paludisme

PLANPLAN







Effet de la rEffet de la rééduction de transmission ?duction de transmission ?

En théorie

En thEn thééorieorie

Contrôle du vecteur

Transmission

Diffusion des résistances

sur la probabilité d’avoir des résistances

Transmission palustre, Transmission palustre, effets supposés

S SSS

R RS

S

S

S

S

S

SS

SS

S

SS

S

S S

S

S S

S

S

Faible Transmission

ProblProbléématiquematique

RS

Parasite muté résistant

Parasite sauvage sensible

Forte Transmission

sur la probabilité d’avoir des résistances

Transmission palustre, Transmission palustre, effets supposés

S SSS

R RS

S

S

S

S

S

SS

SS

S

SS

S

S S

S

S S

S

S

Faible Transmission

ProblProbléématiquematique

probabilité d’avoir des résistancesR

S

Parasite muté résistant

Parasite sauvage sensible

Forte Transmission

R1

R2

SS

SS

SS

S

SS

Transmission palustre, Transmission palustre, effets supposés ProblProbléématiquematique

sur la diversité génétiqueForteTransmission

R1

R2S S

recombinaison inter chromosomique

ProblProbléématiquematiqueTransmission palustre, Transmission palustre, effets supposés

sur la diversité génétiqueFaibleTransmission

R1

R2S S

recombinaison inter chromosomique

combinaison de gène de résistance


sur la diversité génétiqueFaibleTransmission

Sur la pression médicamenteuseutilisation d’antipaludiques dans la population


S SSS

R RS

S

S

S

S

S

SS

SS

S

SS

S

S SS

RS

S

SS S

S

Faible Transmission

Sur la pression médicamenteuseutilisation d’antipaludiques dans la populationImmunité acquise

proportion infections symptomatiques


S SSS

R RS

S

S

S

S

S

SS

SS

S

SS

S

S SS

RS

S

SS S

S

Faible Transmission


proportion infections symptomatiquesproportion infections traitées


S SSS

R RS

S

S

S

S

S

SS

SS

S

SS

S

S SS

RS

S

SS S

S

Faible Transmission




SS S SR

R SS SSSS S SSS S SS

SSS SSS SSSS

R

Faible Transmission

R R




SS

S SS SSSSS S S SSS SSS

SS SS

S SS

S S

R

Faible Transmission

portion de parasites résistants

Relation complexe nécessitant des données expérimentales

Transmission palustre & ChimiorTransmission palustre & Chimioréésistance ?sistance ?ProblProbléématiquematique

transmission Chimiorésistancestransmission Chimiorésistances

Transmission du paludisme

•Diversité génétique•Multiplicité infection•Chimiorésistancede Plasmodium falciparum

?

Objectif de lObjectif de l’é’étudetude

Données expérimentales

MEANTOUOMEANTOUO

ZOLEUZOLEUPEPLEUPEPLEU

BEPLEUBEPLEU

BOUENNEUBOUENNEU

SEILEUSEILEU

DANTADANTA

FINNEUFINNEU

BIETOUOBIETOUO

COTE COTE DD’’IVOIREIVOIRE

LIBERIALIBERIA

GUINEEGUINEE

GHANAGHANA

BURKINABURKINAMALIMALI

HoloendemicitHoloendemicitéé≈≈ 300 piq300 piqûûres infect./pers./an.res infect./pers./an.

An. An. gambiaegambiae s.s. & An. s.s. & An. funestusfunestus1er 1er IntentIntent. . CQCQ22ééme me IntentIntent. SP. SP

MoustiquairesMoustiquaires SimplesSimples (MS)(MS)

MoustiquairesMoustiquaires ImprImpréégngnééeses (MI)(MI)

ContrôleContrôle (CTL)(CTL)

ZOLEUZOLEUPEPLEUPEPLEU

MEANTOUOMEANTOUO

BEPLEUBEPLEU

BOUENNEUBOUENNEU

SEILEUSEILEU

DANTADANTA

FINNEUFINNEU

BIETOUOBIETOUO

COTE COTE DD’’IVOIREIVOIRE

LIBERIALIBERIA

GUINEEGUINEE

GHANAGHANA

BURKINABURKINAMALIMALI

Juin1998

Mai1999

MaiMai20012001

JuinJuin20022002

E1E1 E8E8E2 E3 E4 E5 E6 E7

Intervention

Taux d’Inoculation Entomologique:72 Individus-nuits/site/année

MatMatéériels et Mriels et Mééthodesthodes: : Volet entomologiqueVolet entomologique

Juin1998

Mai1999

MaiMai20012001

JuinJuin20022002

E1E1 E8E8E2 E3 E4 E5 E6 E7

Intervention

Détection active de cas ≈ 100 enfants 0-5 ans (choix aléatoire) / site /étude (7 jours / étude)

Taux de prévalence des infections asymptomatiques (enfant 0.5-5 ans)

Isolat sanguin (Enfants asymptomatiques & symptomatique) :≈ 25 enfants (choix aléatoire) / site / mission

MatMatéériels et Mriels et Mééthodes:thodes: Volet cliniqueVolet clinique

MatMatéériels et Mriels et Mééthodes:thodes: Volet gVolet géénnéétiquetique

(E1 & E8, 420 isolats)

Amorce Amorce

5 loci Microsatellite (sélectivement neutre) par PCR fluo

Polymorphisme de taille

Analyse de fragment


Points de mutation associés aux résistancesPf-dhfr (codon 16, 51, 59, 108 & 164) Pf-dhps (codon 437, 540, 581 & 613)



1 nucléotide polymorphe

Amorce Elongationd’amorce


Points de mutation associés aux résistancesPf-dhfr (codon 16, 51, 59, 108 & 164) Pf-dhps (codon 437, 540, 581 & 613)

Pf-tcr (codon 76; PCR allèle-spécifique )



1 nucléotide polymorphe

AmorceAmorce PCR Spécifique

MatMatéériels et Mriels et Mééthodes:thodes: StatistiqueStatistique

Diversité génétique: Hétérozygotie (He)

Dissemblance entre les populations plasmodiales (Fst)comparées deux à deux

entre chaque village avant et après intervention

entre avant et après intervention pour chaque village

(FSTAT v2.9.4).....

1

3

+−∑

i yxi

0

100

200

300

400

Contrôle MoustiquaireSimple

MoustiquaireImprégnée

Juin 1998 - Mai 1999 (avant intervention)

Juin 2001 - Mai 2002 (pendant intervention)

- 13%

pi/p/a

(piqûre infectante / pers. / année)RRéésultats: Taux Annuel dsultats: Taux Annuel d’’Inoculation EntomologiqueInoculation Entomologique

-- 80%80% -- 97%97%

Mai 2001 (E1 : avant intervention)Juin - Dec. 2001 (E2 - E4 : pendant intervention)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1867 ej 4622 ej 1353 ej 4142 ej 1829 ej 5797 ej

+21% -9%

Accès P. / 100Enf. Jour (ej)

Contrôle MoustiquaireSimple


RRéésultats: sultats: Incidence des Incidence des accaccèès s palustrespalustres

-- 50%50%

Mai 2001 (E1 : avant intervention)Déc. 2001 (E4 : pendant intervention)

-12% -21%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Contrôle Moustiquairesimple


n=255 n=203 n=126 n=135 n=234 n=253

RRéésultats:sultats:Taux de prTaux de préévalence des infections valence des infections àà P. falciparumP. falciparum((enfant enfant asymptomatiqueasymptomatique ≤≤ 5 ans5 ans))

-- 25%25%

Contrôle Moustiquaires Simples

MoustiquairesImprégnées

1n=73 n=69 n=66 n=67 n=76 n=73

2

3

4

5

6

7

+10%(-39% +101%)

-8%(-23% +10%)

--15%15%((--21% 21% --9%)9%)

p<0.01p<0.01

Multiplicité

RRéésultats: sultats: MultiplicitMultiplicitéé des infections des infections àà P. falciparumP. falciparum(5 (5 lociloci microsatellite)microsatellite)

E1-Avant E8-Après

Mai 2001 (E1 : avant intervention)Juin 2002 (E8 : après intervention)

He

n=67 n=69 n=65 n=66 n=71 n=710,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00



RRéésultats: Diversitsultats: Diversitéé ggéénnéétique population tique population P. falciparumP. falciparum((HeHe))

(5 (5 lociloci microsatellite)microsatellite)

Mai 2001 (E1 : avant intervention)Juin 2002 (E8 : après intervention)

He

n=67 n=69 n=65 n=66 n=71 n=710,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00



RRéésultats: Diversitsultats: Diversitéé ggéénnéétique population tique population P. falciparumP. falciparum((HeHe))

(5 (5 lociloci microsatellite)microsatellite)

Pas de Pas de diffdifféérencerence

RRéésultats:Diffsultats:Difféérenciation des populations de renciation des populations de P. P. falciparum (falciparum (FstFst))

((5 loci microsatellite)

MEANTOUOMEANTOUO

ZOLEUZOLEU

PEPLEUPEPLEU

BEPLEUBEPLEU

BOUENNEUBOUENNEU

SEILEUSEILEU

DANTADANTA

FINNEUFINNEU

BIETOUOBIETOUO

AVANT INTERVENTION

Aucune différencesignificative entre les

populations plasmodialesdes villages comparés deux

à deuxMEANTOUOMEANTOUO



MEANTOUOMEANTOUO

ZOLEUZOLEU

PEPLEUPEPLEU

BEPLEUBEPLEU

BOUENNEUBOUENNEU

SEILEUSEILEU

DANTADANTA

FINNEUFINNEU

BIETOUOBIETOUO

APRES INTERVENTION


populations plasmodialesdes villages comparés deux

à deuxMEANTOUOMEANTOUO



MEANTOUOMEANTOUO

ZOLEUZOLEU

PEPLEUPEPLEU

BEPLEUBEPLEU

BOUENNEUBOUENNEU

SEILEUSEILEU

DANTADANTA

FINNEUFINNEU

BIETOUOBIETOUO

AVANT & APRESINTERVENTION


populations plasmodialesdans un village avant et

après interventionMEANTOUOMEANTOUO

Thr Lys/Thr Lys

0%

20%

40%

60%

80%

100%

RRéésultats:Mutation sultats:Mutation PfPf tcrtcr Codon 76Codon 76



APRESn=68

AVANTn=65

APRESn=64

AVANTn=78

APRESn=70

AVANTn=71

Thr Lys/Thr Lys

0%

20%

40%

60%

80%

100%

RRéésultats:Mutation sultats:Mutation PfPf tcrtcr Codon 76Codon 76



APRESn=68

AVANTn=65

APRESn=64

AVANTn=78

APRESn=70

AVANTn=71

Pas de diffPas de difféérences significativesrences significatives

RRéésultats: Mutation sultats: Mutation PfPf--dhfrdhfr PfPf--dhpsdhps

Les proportions de mutants, de double ou triple mutants ne sont pas modifiées

Réduction importante de la transmission palustre

ConclusionConclusion

Réduction importante de la transmission palustre

faible effet (court terme) sur la multiplicité

pas d’effet (court terme) sur la diversitégénétique du parasite

pas d’effet (court terme) sur les fréquences des marqueurs associés aux résistances

Flux de parasites entre les sites!(Bogreau H. et al. AJTMH 2006)

ConclusionConclusion

CollaborateursCollaborateurs

Centre Centre MurazMuraz& & InstitutInstitut P. P. RichetRichet

M.C. HenryM.C. HenryS.B. AssiS.B. Assi

InstitutInstitut PasteurPasteuràà ParisParis

O. O. PuijalonPuijalon

IRD IRD Montpellier,Montpellier,F. F. RenaudRenaudP. DurandP. Durand

UnitUnitéé de de RechercheRecherche en en BiologieBiologie & & EpidEpidéémiologiemiologie

ParasitairesParasitaires -- IMTSSAIMTSSAC. C. RogierRogier

B. B. PradinesPradinesH. H. BouchibaBouchibaR. R. AmalvictAmalvict

M. HenryM. Henry

MinistMinistèèrere de de la Santla Santéé DjiboutiDjibouti

M.A. M.A. KamilKamil

INSERM U399INSERM U399LaboratoireLaboratoire de de ParasitologieParasitologie et et

MycologieMycologie

P. P. ParolaParola

HôpitalHôpital PrincipalPrincipalde Dakarde Dakar

B. WadeB. Wade

HôpitalHôpital National National de Niameyde Niamey

E. E. AdehossiAdehossi

HIA HIA LaveranLaveranE. E. GarnotelGarnotel

RemerciementsRemerciementsRemerciements

• Programme PAL+, Ministère de la Recherche• Impact-Malaria (Sanofi-Aventis)• Délégation Générale pour l'Armement, Ministère

de la défence• Société de Pathologie Exotique

•• Programme PAL+, MinistProgramme PAL+, Ministèère de la Recherchere de la Recherche•• ImpactImpact--Malaria (Malaria (SanofiSanofi--AventisAventis))•• DDéélléégation Ggation Géénnéérale pour l'Armement, Ministrale pour l'Armement, Ministèère re

de la de la ddééfencefence•• SociSociééttéé de Pathologie Exotiquede Pathologie Exotique

Institut de Médecine Tropicaledu Service de Santé des Armées

« Le Pharo »

Institut de MInstitut de Méédecine Tropicaledecine Tropicaledu Service de Santdu Service de Santéé des Armdes Armééeses

«« Le Le PharoPharo »»

[email protected] IMTSSA—URBEP, « le PHARO »

DananDananéé

NiameyNiameyDakarDakar

DiengaDienga

DjiboutiDjibouti

THIAGOTHIAGO

TEMEYE SALANETEMEYE SALANE

SANINTESANINTENDIAKHAYENDIAKHAYE

MALLAMALLA

FATINFATIN

TIPTENGATIPTENGA

S29S29--3030NIOKO II S26NIOKO II S26

PISSY S17PISSY S17

KATEKATE

YOUKOUTYOUKOUT

TCHOLLIRE IITCHOLLIRE II

SAKDJESAKDJE

BOCKIBOCKI

MELEN/MELEN/NKOLAFENDEKNKOLAFENDEK

MIATTA / DJOUZEMIATTA / DJOUZE

ENDEGUE/ENDEGUE/ABDELONABDELON

ZOEBEFAM/ZOEBEFAM/NKOLEMBOULANKOLEMBOULA

YEN/YEN/MEBAN IIMEBAN II

NIENANIENA

TENASSOTENASSO

Q. SAMAGANQ. SAMAGAN

Q. DOGONAQ. DOGONA

Q. KUINIMAQ. KUINIMA

TIABEDJITIABEDJI

LANDELANDERUNDE/BAITILRUNDE/BAITIL

SAMALSAMALTHIOBOTHIOBO

BANTATABANTATA

ASSONIASSONI

Sites Sites éétuditudiéés s –– programme DYNAPOP programme DYNAPOP –– PAL+/DGAPAL+/DGA

CTRL UBN IBN

Bepleu Bietouo Meantouo Pepleu Seileu Zoleu Bouenneu Dania Finneu

Bepleu 0.0210 0.0209 0.0006 -0.0016 0.0061 0.0052 0.0333 0.0215 0.0100

CTL Bietouo -0.0132 0.0010 -0.0084 0.0077 -0.0029 0.0003 0.0092 0.0101 -0.0101

Meantouo 0.0123 -0.0015 -0.0025 0.0008 -0.0106 -0.0009 0.0107 0.0271 -0.0133

Pepleu 0.0020 0.0186 0.0120 -0.0134 -0.0109 -0.0180 0.0227 0.0384 -0.0120

UBN Seileu 0.0496 0.0390 0.0316 0.0299 0.0244 -0.0122 0.0184 0.0333 -0.0143

Zoleu 0.0124 0.0073 0.0033 -0.0118 0.0127 -0.0180 0.0155 0.0171 -0.0080

Bouenneu 0.0150 0.0185 0.0131 -0.0025 0.0190 -0.0085 0.0422 0.0292 -0.0024

IBN Dania 0.0274 0.0375 0.0362 -0.0103 0.0137 0.0057 -0.0049 0.0153 0.0255

Finneu 0.0134 0.0168 0.0166 -0.0176 0.0109 -0.0050 -0.0109 -0.0178 0.0078

P. falciparumP. falciparum populations populations differentiationdifferentiation(Estimated Fst between all pairs of villages and between S1 & S8,

5 microsatellite loci : 7A11, C4M69, C4M79, Pf2689 & Pf2802 )

Before (S1) After (S8) S1 vs. S8

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Control Unimpregnatedbednet

Impregnatedbednet

S1-Beforen=61

S8-Aftern=63

S1-Beforen=63

S8-Aftern=65

S1-Beforen=53

S8-Aftern=58

PfPf--dhfrdhfr codon 51, 59 & 108 codon 51, 59 & 108 haplotypehaplotypeTriple mutant present (51 Ile, 59 Arg & 108 Asn) Absent Indeterminate

0%

20%

40%

60%

80%

100%


Impregnatedbednet

S1-Beforen=56

S8-Aftern=62

S1-Beforen=42

S8-Aftern=59

S1-Beforen=49

S8-Aftern=50

PfPf--dhfrdhfr 108 & 108 & dhpsdhps 437 double mutation437 double mutationDouble mutant present Absent Indeterminate

Mutated Mixte Wild-type

PfPf--dhfrdhfr codon 16, 51, 59 108 & 164 codon 16, 51, 59 108 & 164 genotypegenotype

0%

20%

40%

60%

80%

100%

dhfr 16n=367

dhfr 51n=370

dhfr 59n=374

dhfr 108n=366

dhfr 164n=375

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ser Ser/Thr Ser/Asn Asn/Thr Thr Asn


Impregnatedbednet

S1-Beforen=62

S8-Aftern=63

S1-Beforen=63

S8-Aftern=65

S1-Beforen=55

S8-Aftern=58

PfPf--dhfrdhfr codon 108 codon 108 genotypegenotype

Mutated Mixte Wild-type

PfPf--dhpsdhps codon 437, 540, 581 & 613 codon 437, 540, 581 & 613 genotypegenotype

0%

10%20%30%

40%50%60%

70%80%90%

100%

dhps 437n=370

dhps 540n=375

dhps 581n=374

dhps 613n=369

Gly Ala/Gly Ala


Impregnatedbednet

S1-Beforen=63

S8-Aftern=67

S1-Beforen=57

S8-Aftern=60

S1-Beforen=67

S8-Aftern=56

PfPf--dhpsdhps codon 437 codon 437 genotypegenotype

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Liaison (pseudoLiaison (pseudo--RR22) entre les all) entre les allèèles de 6 loci microsatellitesles de 6 loci microsatellites(C4M79, Pf2689, TRAP, Pf2802, 7A11, C4M69), (C4M79, Pf2689, TRAP, Pf2802, 7A11, C4M69), DiiboutiDiibouti, 2002, 2002

avec (avec ( ) ou sans () ou sans ( ) prise en compte des g) prise en compte des géénotypes notypes multilocusmultilocus««doublonsdoublons»» (( significatif avec p< 0,0009)significatif avec p< 0,0009)

Pseu

doPs

eudo

-- RR22

C4M79C4M79Pf2689Pf2689

C4M79C4M79TRAPTRAP

C4M79C4M79Pf2802Pf2802

C4M79C4M797A117A11

C4M79C4M79C4M69C4M69

Pf2689Pf2689TRAPTRAP

Pf2689Pf2689Pf2802Pf2802

Pf2689Pf26897A117A11

Pf2689Pf2689C4M69C4M69

TRAPTRAPPf2802Pf2802

TRATRAPP7A117A11

TRAPTRAPC4M69C4M69

Pf2802Pf28027A117A11

Pf2802Pf2802C4M69C4M69

7A117A11C4M69C4M69

00

0,050,05

0,10,1

0,150,15

0,20,2

0,250,25

0,30,3

0 20km

Erythrée

Ethiopie

Somalie

Ali SabiehDikhil

Tadjoura

Obock

DjiboutiDjibouti

Djibouti, Corne de lDjibouti, Corne de l’’AfriqueAfrique

•• Cas de paludisme Cas de paludisme autochthoneautochthonedepuis les anndepuis les annéées 1970es 1970

•• Transmission faible et irrTransmission faible et irrééguligulièère re ((AnophelesAnopheles arabiensisarabiensis))

•• Incidence Incidence àà habituellement faiblehabituellement faible

•• RRéésistance sistance àà la chloroquine la chloroquine ddéécrite depuis 1990 (RII/RIII, crite depuis 1990 (RII/RIII, NAMRUNAMRU--3, Rodier 3, Rodier et al.et al.))

•• Suspicion dSuspicion d’’importation de importation de paludisme des pays adjacentspaludisme des pays adjacents

Incidence mensuelle des cas de paludisme, DjiboutiIncidence mensuelle des cas de paludisme, Djibouti--ville, ville, CHA CHA BouffardBouffard, Janvier 1997 , Janvier 1997 -- Juin 2002Juin 2002

0

50

100

150

200

250

Jan 19

97MarMayJu

lSep Nov

Jan 19

98MarMayJu

lSep Nov

Jan 19

99MarMayJu

lSep Nov

Jan 20

00MarMayJu

lSep Nov

Jan 20

01MarMayJu

lSep Nov

Jan 20

02MarMay

AccAcc

èè s p

alus

tres

s

palu

stre

s àà

P. f

alci

paru

mP

. fal

cipa

rum

(Rogier C et al. Emerg Inf Disease 2005)

00

2020

4040

6060

8080

100100

120120

140140

160160

180180

200200

00

Jan

Jan 19

9719

97MarMarMaMaiiJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 19

9819

98MarMarMaMaiiJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 19

9919

99MarMarMaMaiiJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 20

0020

00MarMarMaMaii Ju

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 20

0120

01MarMarMaMaiiJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 20

0220

02MarMarMaMaii

AccAcc

èè s p

alus

tres

s

palu

stre

s àà

P. f

alci

paru

mP

. fal

cipa

rum

Plui

esPl

uies

(mm

(mm

))

100100

200200

300300

400400

500500

600600

Incidence mensuelle des cas de paludisme et pluviomIncidence mensuelle des cas de paludisme et pluvioméétrie, Djiboutitrie, Djibouti--ville , ville , CHA CHA BouffardBouffard (( ) & dispensaires de la ville de Djibouti () & dispensaires de la ville de Djibouti ( ), Janvier 1997 ), Janvier 1997 -- Juin Juin

20022002

ÉÉtendue des trois principales ptendue des trois principales péériodes de prriodes de prééllèèvements, vements, DjiboutiDjibouti--ville, CHA ville, CHA BouffardBouffard, ,

00

5050

100100

150150

200200

250250

Jan

Jan 19

9719

97MarMarMayMayJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 19

9819

98MarMarMayMayJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 19

9919

99MarMarMayMayJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 20

0020

00MarMarMayMayJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 20

0120

01MarMarMayMayJu

lJu

lSepSep NovNov

Jan

Jan 20

0220

02MarMarMayMay

19981998 19991999 20022002A

ccAcc

èè s p

alus

tres

s

palu

stre

s àà

P. f

alci

paru

mP

. fal

cipa

rum


1998 1999 2002

0

20

40

60

80

K1K1

129 203 166 184 193 202 237 241 131 221 226 248 253 261 275 282 284 308 346 366 371 173 373 408 444 468

Mad20Mad20 RO33RO33 3D73D7 FC27FC27

msp1msp1 block2block2 msp2msp2

pourcentage

Distribution des Distribution des allalléélesles msp1msp1 block2 et block2 et msp2msp2 àà DjiboutiDjiboutiavant, pendant et apravant, pendant et aprèès ls l’é’épidpidéémiemie


0%0%

20%20%

40%40%

60%60%

80%80%

100%100%

19981998(n=46)(n=46)

19991999(n=61)(n=61)

20022002(n=32)(n=32)

Het

eroz

ygoc

itH

eter

ozyg

ocit éé

atte

ndue

: at

tend

ue :

HeHe

msp1msp1 block2block2msp2msp2

DiversitDiversitéé ggéénnéétique des populations de tique des populations de P. falciparumP. falciparumavant, pendant et apravant, pendant et aprèès ls l’é’épidpidéémie de 1999mie de 1999

(probabilit(probabilitéé que deux parasites tirque deux parasites tiréés au hasard aients au hasard aientdes alldes allèèles diffles difféérents rents àà un locus donnun locus donnéé))


Souche sauvage (pas de mutation détectée)

combinée (souche sauvage et souche mutante présentes en même temps)

Mutant (seulement des souches mutantes sont détectées)

Pf-crtcodon

76

Pf-dhpscodon

437

Pf-dhfrcodon

59 10851 436 540

0%

20%

40%

60%

80%

100%

98 99 98 99 98 99 98 99 98 99 98 99 98 99

GenotypesGenotypes PfPfcrtcrt,, PfdhfrPfdhfr et et PfPfdhpsdhps avant pendant et apravant pendant et aprèès ls l’é’épidpidéémiemie

0%

20%

40%

60%

80%

100%

98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02

Souche sauvage (pas de mutation détectée)

combinée (souche sauvage et souche mutante présentes en même temps)

Mutant (seulement des souches mutantes sont détectées)

Pf-crtcodon

76

Pf-dhpscodon

437

Pf-dhfrcodon

59 10851 436 540

GenotypesGenotypes PfPfcrtcrt,, PfdhfrPfdhfr et et PfPfdhpsdhps avant pendant et apravant pendant et aprèès ls l’é’épidpidéémiemie

Health & Medicine

Diversité, multiplicité des infections et résistance aux antipaludiques de P. falciparum dans un essai contrôlé de MII en zone de forte endémie