GMP, Paris, Février 20041 Autoradiographie quantitative danimaux entiers (QWBA) Alain A....

GMP, Paris, Février 2004 1

Autoradiographie quantitative Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA)d‘animaux entiers (QWBA)

Alain A. Schweitzer, PhDAlain A. Schweitzer, PhDPCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 BâlePCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle

GMP, Paris, Février 2004 2

SommaireSommaire• Définitions• Historique• La méthode d’Ullberg• Détection de la radioactivité• Quantification des autoradiogrammes• Interprétation des résultats • Principales applications• Conclusions

GMP, Paris, Février 2004 3

DéfinitionsDéfinitions• Ensemble de méthodes “photographiques” permettant

la détection et la localisation spatiale/géographique d’éléments radioactifs présents dans un échantillon solide• Macro- vs. Microautoradiographie• QWBAR, QWBAL et DNC

GMP, Paris, Février 2004 4

Historique Historique (autoradiographie)(autoradiographie)

1897 (Niepce de St Victor): 1er “autoradiogramme” (sels d’uranium)

GMP, Paris, Février 2004 5

Historique Historique (autoradiographie, suite)(autoradiographie, suite)

1904 (London) : 1ère application

biologique de l’autoradiographie

GMP, Paris, Février 2004 6

Historique Historique (autoradiographie, suite)(autoradiographie, suite) • 1953: 1ère utilisation des particules β- (Dziewiatkovski)• 1954: WBAR des substances diffusibles (Ullberg)• 1963: 1ère tentative de quantification WBAR (Kutzim)• 1975: Brévet (USA) des écrans-phosphore (Luckey)• 1983: Comptage Nucléaire Direct (Jeavons)• 1989: Autoradioluminographie (Miyahara)

GMP, Paris, Février 2004 7

Historique Historique (coupes d‘animaux entiers)(coupes d‘animaux entiers)

• 1947 (Libby) : scie à ruban, 2-3 mm, souris• 1954 (Ullberg) : microtome, 100 µm, en chambre froide

• 1959 (Cohen et al.) : microtome à congélation (CO2)

• 1961 (Pellerin) : rape/fraise d’atelier, seulement 1 WBA• 1962 (Martin et al.) : disque abrasif/perceuse, souris• 1966 (Kalberer) : scie circulaire, 2-4 mm, chat, singe• 1977 (Ullberg) : cryomicrotome, méthode actuelle

GMP, Paris, Février 2004 8

Historique Historique (méthode de Kalberer, 1966)(méthode de Kalberer, 1966)

GMP, Paris, Février 2004 9

La méthodeLa méthoded‘Ullbergd‘Ullberg

• Congélation• Enrobage• “Trimming”• Obtention des coupes• Cryodessication

GMP, Paris, Février 2004 10

Congélation des animauxCongélation des animaux

• Azote liquide ?? • Hexane-CO2 solide

– Souris 15-30 min (<pour males and fng <25 g)– Rat 30-60 min (<pour males and fng <180 g)– Lapin 2-4 h (<pour males and fng <2 kg)– Singe 2-4 h (<pour males and fng <1.5 kg)

• Congélation rapide = pas de diffusion

Curtis et al., 1981. Whole-Body Autoradiography. Academic Press, Inc., London)

GMP, Paris, Février 2004 11

EnrobageEnrobage

GMP, Paris, Février 2004 12

Le Leica CM3600 PLCLe Leica CM3600 PLC

GMP, Paris, Février 2004 13

Le Leica CM3600 PLCLe Leica CM3600 PLC

GMP, Paris, Février 2004 14

Atteinte du niveau de coupe (Atteinte du niveau de coupe (“trimming”)“trimming”)

GMP, Paris, Février 2004 15

Obtention des coupesObtention des coupes

GMP, Paris, Février 2004 16

La coupeLa coupe

GMP, Paris, Février 2004 17

Détection de la radioactivitéDétection de la radioactivité

• Autoradiographie, à l‘aide de films (QWBAR)• Autoradioluminographie/imagerie phosphore,

à l‘aide d‘écrans-phosphore (QWBAL)• Comptage nucléaire direct, dans le compteur

GMP, Paris, Février 2004 18

QWBA / Principe QWBARQWBA / Principe QWBAR

GMP, Paris, Février 2004 19

QWBA / Principe QWBALQWBA / Principe QWBAL

GMP, Paris, Février 2004 20

QWBAL / exemple de balayageQWBAL / exemple de balayage

GMP, Paris, Février 2004 21

QWBAL / exemple de balayage /CycloneQWBAL / exemple de balayage /Cyclone

GMP, Paris, Février 2004 22

QWBAL / exemple de balayage /BAS5000QWBAL / exemple de balayage /BAS5000

GMP, Paris, Février 2004 23

QWBA / principe DNC / MICADQWBA / principe DNC / MICAD

GMP, Paris, Février 2004 24

QWBA / principe DNC /BetaImager 2000QWBA / principe DNC /BetaImager 2000

GMP, Paris, Février 2004 25

QWBA / comparaison QWBAL et DNCQWBA / comparaison QWBAL et DNC

GMP, Paris, Février 2004 26

QWBA / durées QWBAR, QWBAL et QWBA / durées QWBAR, QWBAL et

DNCDNC

Durée (sem.) QWBAR QWBAL DNC n = 2 n = 30 n = 2 n = 20 n = 2 n = 40 Exposition 3.00 3.00 0.20 0.20 0.05 2.70 Analyse 0.15 2.20 0.10 1.00 0.10 1.00 In-life 0.20 1.00 0.20 1.00 0.20 1.00 Coupes 0.20 2.00 0.20 2.00 0.20 2.00 Durée totale 3.50 8.20 0.70 4.20 0.55 6.70

GMP, Paris, Février 2004 27

QWBA / analyse en temps réel DNCQWBA / analyse en temps réel DNC

GMP, Paris, Février 2004 28

QWBA / analyse en temps réel DNCQWBA / analyse en temps réel DNC

GMP, Paris, Février 2004 29

QWBA / comparaison QWBAL et DNCQWBA / comparaison QWBAL et DNC

GMP, Paris, Février 2004 30

QWBA : Résolution “QWBA : Résolution “film”film”

GMP, Paris, Février 2004 31

QWBA : Résolution QWBA : Résolution PhosphorImagerPhosphorImager

GMP, Paris, Février 2004 32

QWBA : Résolution QWBA : Résolution BetaImagerBetaImager (3H, 14C)

GMP, Paris, Février 2004 33

QWBA / DNC (résolution QWBA / DNC (résolution µ-Imager®)µ-Imager®)

GMP, Paris, Février 2004 34

QWBA : QuantificationQWBA : Quantification

GMP, Paris, Février 2004 35

QuantificationQuantification

HistoriqueHistorique

GMP, Paris, Février 2004 36

QuantificationQuantification

HistoriqueHistorique

Kutzim (1963)

1ère quantification desWBA par densitometrie

GMP, Paris, Février 2004 37

QuantificationQuantification

• auto-absorption tissulaire ?• caractéristiques des coupes ?• conditions d‘exposition ?

GMP, Paris, Février 2004 38

Quantification : Quantification : auto-absorption tissulaireauto-absorption tissulaire

Détecteur

Source radioactive homogène

Coupe (40 µm) d‘un rat non traité

GMP, Paris, Février 2004 39

QuantificationQuantificationTissus Absorbance moyenne ± SDFoie 91.0

1.9Moelle osseuse 91.2

2.2Cerveau 91.6

1.9Rate 92.0

1.6Coeur 92.4

1.1Rein 92.8

1.5Glande salivaire 93.0

1.2Vesicule séminale 93.0

1.2Poumon 93.0

2.3Surrénale 93.4

1.1SANG 93.6

1.5Muscle 94.0

1.6Testicule/epididyme 94.0

1.5

Os minéral 38.40.9

Tissue adipeux 60.01.2

Globe oculaire 109.8 0.4

GMP, Paris, Février 2004 40

Quantification : “efficacité relative” DNCQuantification : “efficacité relative” DNC

GMP, Paris, Février 2004 41

Quantification : épaisseur des coupes Quantification : épaisseur des coupes

GMP, Paris, Février 2004 42

Quantification : conditions d’exposition Quantification : conditions d’exposition

GMP, Paris, Février 2004 43

Quantification : conclusions Quantification : conclusions

Standardisation de toutes les étapes (coupe, exposition, balayage etc) nécessaire

▼

Utilisation systématique indispensable des standards de calibration

GMP, Paris, Février 2004 44

Quantification : DNC vs. LSCQuantification : DNC vs. LSC

GMP, Paris, Février 2004 45

Quantification : QWBAL vs. DNCQuantification : QWBAL vs. DNC

100

1000

10000

100 1000 10000

Activity Phosphor-imager - 4 days (dpm/mg)

Ac

tiv

ity

Be

ta-i

ma

ge

r (d

pm

/mg

)

200x250 - 4 heures

200x250 - 12 heures

120x160 - 24 heures

75x100 - 24 heures

Beta-Imager acquisition :

GMP, Paris, Février 2004 46

Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

• vue d‘ensemble de la distribution de la radioactivité (substance + métabolites) dans tout le corps• distribution régionale dans les tissus et structures • contrôle visuel de l‘absence de contamination• archivage permettant une re-lecture/contre-expertise• analyses complémentaires possibles

GMP, Paris, Février 2004 47

Interprétation des résultats Interprétation des résultats

• macro-, pas micro-autoradiographie (récepteurs!)• radioactivité totale, pas une structure chimique

donnée• pharmacocinétique!• importance des conditions expérimentales

– purité radiochimique de la substance testée– LOD, LOQ– doses nominales, doses radioactives – métabolites volatiles, 3H20

• „ouvrir les yeux, voir large“

GMP, Paris, Février 2004 48

Principales applicationsPrincipales applications

• contribution à la sélection de molécules (PD,Tox)• contribution à la sélection de formulations (Galénique)• études ADME (PK)• safety assessment (ex: passage transplacentaire)

(Tox)• estimation de la radio-exposition (hADME)• dossiers d‘enregistrement• études spécifiques (BBB, affinité à la mélanine,

résidus, „mottled pattern“ etc)

GMP, Paris, Février 2004 49

Exemples d’application Exemples d’application

GMP, Paris, Février 2004 50

Exemples d’application Exemples d’application

GMP, Paris, Février 2004 51

Exemples d’application Exemples d’application

GMP, Paris, Février 2004 52

Exemples d’application Exemples d’application

GMP, Paris, Février 2004 53

Exemples d’application Exemples d’application

GMP, Paris, Février 2004 54

Exemples d’application Exemples d’application

GMP, Paris, Février 2004 55

ConclusionsConclusions informations spécifiques, importantes nombreuses applications en recherche &

développement (universités, industries pharmaceutiques et agro-alimentaires etc)

difficultés techniques expertise nécessaire coût élevé des équipements radioactivité totale, macroscopie, animal

GMP, Paris, Février 2004 56

RemerciementsRemerciementsH.Harlemann, G.Gross, O.KretzA.Wach, P.Schnider

GMP, Paris, Février 2004 57

MerciMercipour votrepour votreattention !attention !