Introductionxavierbataille.free.fr/ana/1_clhp2.pdfX. Bataille – ENCPB - 2008 Temps mort (tmou t0)...

Chromatographie

Liquide de Haute

Performance

(CLHP-HPLC)

Introduction

X. Bataille – ENCPB - 2008

Principe de la CLHP

Séparation de constituants dans un mélange complexeMise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant)Analyse qualitativeAnalyse quantitative

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X. Bataille – ENCPB - 2008

Principe

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Schéma

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CLHPApparition : années 1950

Chromatographie : séparation et quantificationLiquide : travail en solutionHaute performance : Grande efficacité de la séparation

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Comparaison CPG-CLHP

CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse : � composés volatils,

� faibles masses molaires

CLHP : � toutes molécules trouvent un solvant pour y

être dissoutes : méthode universelle

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Exemple de chromatogramme

Rétention différée

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Performance - Efficacité

Nombre de plateaux théoriques

N > 2000

2 2

0 1/ 2

16 5,54r rth

t tN

ω ω

= =

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Résolution

R ~ 1,5

0 0 1/ 2 1/ 2

2 1,18A B A B

A B A B

r r r rt t t tR

ω ω ω ω− −

= =+ +

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Asymétrie

As = A/B

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Autres paramètres

Temps de rétention réduit : t’R = tR – t0Facteur de capacité :

0

0,2

2

t

ttk R −

=0

0,1

1

t

ttk R −

=

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Temps mort (tm ou t0)

Temps que met un produit pour traverser la colonne sans être retenu.Se calcule si on connaît la porosité de la colonne, définie par :

Le temps mort dépend des caractéristiques de la colonne : la longueur (l), son diamètre (2r), sa porosité (ε) et du débit imposé par la pompe (d).

3 -1éluant m

2 2colonne vide

/ cm .min / minε =

/ cm π / cm

×=× ×

V d t

V l r

2

m

ε π =

l rt

d

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Autres paramètres

Sélectivité :

Sous réserve de certaines approximations :

Nk

kRS

+

−=1'

'1

4

1

αα

,

,

1

2

R

R

t

t=α

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Objectif

Séparation individuelle de tous les constituants d’un mélange

Deux facteurs :� Miscibilité dans la phase mobile� Interaction (affinité) avec la phase

stationnaire

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Principe d’une

séparation

Temps d’analyse :minimal

Performance : maximale

Constitution de la

chaîne

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Les pompes

Délivrer un débitconstant sous une pression élevée, constante

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Vanne d’injection

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Boucle d’injection

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Colonnes

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Détecteur UV

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Détecteur UV

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Détecteur

réfractométrique

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Détecteur fluorimétrique

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Constitution de la

colonne

Colonne remplie de billesBilles de silice tapissées d’un revêtement

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Billes

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Phase inverse (RP)

/ phase normale

Complémentarité

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Physico-chimie

de la rétention

Compromis entre:� phase stationnaire

� phase mobile

Interactions

intermoléculaires

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X. Bataille – ENCPB - 2008

Interactions

intermoléculaires

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Moment dipolaire

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Autres moments

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Interaction dipôle-dipôle

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Interaction dipôle-dipôle

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Polarisabilité

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Interaction dipôle

permanent-dipôle induit

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Dispersion

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Interactions

de Van der Waals

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Liaison hydrogène

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Bilan

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O

H

O

O

O

H

O

O

H

O

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« Magic » LogPoctanol/eau

Constante de partage octanol / eau

i,octanoli

i,eau

P = C

CO

H

HOH

H

OH

H

O H

HO

H

HO

HH

O

H HOH

H

OH

H

O H

HO

H

HO

H

H

O

H HOH

H

OH

H

O H

HO

H

HO

HH

O

H

O

H

O

H

O

H

O

HO

H

O

H

O

H

O

H

?

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Version Chemsketch

(ACDLABS)

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LogP par la méthode de Villar

(Int. J. Quantum Chem., 44444444, 203 (1992))

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LogP / Villar en PM3

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LogP par la méthode Ghose, Pritchett et Crippen

(J. Computational Chem., 9999, 80 (1988))

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Influence de la polarité

de l’éluant

Notion de force éluante : � Influence de la proportion de solvant apolaire

Isothermes de van’t Hoff

( ) i ii iln k' ln + +

H S

RT Rφ ∆ ° ∆ °=

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Préparation d’une

séparation

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Choix de l’éluant

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Gradient d’éluant

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Gradient

d’éluant

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Couplages

Identifier les produits sortants par : � Spectrométrie de masse

� Résonance magnétique nucléaire� Spectroscopie Infra-Rouge

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Couplage CLHP-SM

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Couplage CLHP-RMN

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Couplage CLHP-IR

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Optimisation d’une

séparation

tanalyse le plus petit possibleRésolution : 1,7 > R > 1,4Asymétrie : centrée sur 1Performance élevéeRobustesse : une légère modification des paramètres ne doit pas influer sur la qualité de la séparation et de l’analyse.

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Facteurs d’optimisation

Colonne (longueur, diamètre, particules, chaîne alkyle)Débit - PressionEluant (%polaire-apolaire, pH)Température

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Efficacité

-

Débit

Anisotropie d’écoulement

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Van-Deemter / Knox

Hauteur Equivalente en Plateaux Théoriques :

N

LH =

3

Van Deemter : .

Knox : . .

VDVD VD

KnKn Kn

BH A C v

vB

H A v C vv

= + +

= + +

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Efficacité d’une colonne (nombre de plateaux théorique):

Efficacité réelle (nombre de plateaux efficace) :

avec

222

1654,5

=

=

=ωδσ

RRR tttN

222'

16'

54,5'

=

=

=ωδσRRR

eff

tttN

0' ttt RR −=

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Perte de charge

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Exemple : optimisation

de la séparation des

bases de l’ADN

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Stabilisation

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Choix judicieux des

concentrations

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Spectre UV-visible

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Débit

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% MeOH

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pH

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Température

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Bilan

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Bilan de l’optimisation

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Applications de la CLHP

Analytique

CLHP Analytique � Gamme d’étalonnage

� Ajouts dosés� Etalon interne

CLHP préparative� Dérivation en sortie

� Boucle d’injection à gros volume