00 Page de couverture avec photo - sfeap.fr · Compte-rendu du MSBM, Dubrovnik, Croatie page 27 Compte-rendu école d'été Protéomique, Brixen, Italie page 28 ... formation très

Nouveau CA

Congrès SMAP Avignon

Congrès HUPO Genève

Dubrovnik, Brixen ...

n°45, JANVIER 2012

Que cette année vous apporte bonheur, joie, réussite dans votre vie professionnelle et bien sûr une excellente santé !

Ce nouveau numéro « Le Mag » ouvre l'année avec la composition du nouveau conseil d'administration de notre société. Vous y trouverez également les comptes rendus des congrès HUPO Genève 2011 et SMAP Avignon 2011.

De nouvelles rubriques peuvent être ajoutées dans les prochains numéros. Il tient à vous, adhérents de nous envoyer vos contributions et de faire vivre « Le Mag ». Pour commencer, vous avez une opinion, une réaction, un commentaire, quels qu’ils soient concernant notre société et nos activités scientifiques, nous le publierons dans le courrier des lecteurs. Pour enrichir la rubrique Art et Science, faites-nous parvenir des photos (dont vous êtes l’auteur).

Nous attendons vos contributions pour les prochains numéros.

Bonne lectureLuc Camoin

Le Mot de la présidente page 2

Le nouveau Conseil d'Administration page 3

Comptes-rendus du congrès HUPO Genève page 4

Bilan du Congrès SMAP d'Avignon page 9

Comptes-rendus du congrès SMAP d'Avignon page 11

Compte-rendu du MSBM, Dubrovnik, Croatie page 27

Compte-rendu école d'été Protéomique, Brixen, Italie page 28

Agenda page 31

Congrès SFEAP 2012, Rouen page 32

Nos Partenaires page 33

Brèves page 34

Association loi 1901.Membre du Conseil International

des Sociétés d'électrophorèse (ICES).Siège Social : 5 Rue des Myrtilles31650 Saint-Orens de Gameville

Responsable de la publication : Odile Schiltz

Odile.Schiltz @ ipbs.frRédacteur en chef : Luc Camoin

luc.camoin @ inserm.frRédacteur adjoint : Pascal Cosette

pascal.cosette @ univ-rouen.fr

Les textes publiés via la SFEAP engagent la responsabilité de leurs seuls auteurs, et restent leur propriété pleine et entière

Bonne Année 2012HUPO 2011 - La Cathédrale Saint-Pierre Genève

page 2

En tout premier lieu, je tiens à vous remercier toutes et tous, membres de la SFEAP, pour votre participation exceptionnelle (un taux record de 75%) aux dernières élections pour le renouvellement de notre Conseil d’Administration. Quelques changements accom-pagnent ce nouveau mandat, puisque la taille du CA est désormais réduite à 10 membres auxquels s’ajoute un nouveau poste de Président-conseil. Je remercie égale-ment cette nouvelle équipe pour la confiance qu’elle m’a accordée et pour sa volonté d’implication dans la

vie de notre société. Enfin, je tiens à souligner le travail accompli par les membres sortants du CA et je les en remercie vivement. Un merci tout particulier à Charles Pineau, Président sortant, qui continue à nous épauler en tant que Président-conseil, pour son énergie et son enthou-siasme, qui ont conduit entre autres choses au « relooking » du logo, de la Lettre désormais le Mag, et du site web. Notre société a donc une nouvelle adresse web, que je rappelle ici : http://www.sfeap.fr.

L’année 2011 restera comme un grand cru pour notre congrès annuel, organisé cette année conjointement avec la SFSM. Le lieu bien sûr était grandiose mais l’organisation l’était tout autant et la qualité du programme scientifique également. Bravo à toute l’équipe menée par Jean Armengaud et Jérôme Garin pour cette grande réussite. Notre prochain congrès est orga-nisé par Pascal Cosette et se tiendra à Rouen du 15 au 17 octobre 2012. Notez dès à présent ces dates et venez nombreux pour ce moment d’échanges et de rencontres, qui contribue à la dynamique de notre société.

Comme chaque année des bourses ont été attribuées, dont 3 pour le congrès HUPO à Genève et 9 pour le congrès SMAP d’Avignon. Vous pourrez lire dans ce numéro du Mag nou-velle formule les comptes-rendus scientifiques et les impressions de nos congressistes bour-siers, que je remercie pour leur contribution rédactionnelle de qualité. L’attribution de bourses sera bien sûr maintenue en 2012. Vous pourrez consulter le site web pour les modalités et les dates de dépôt des dossiers de demande de bourses.

Parmi les actions de la SFEAP, l’organisation d’une journée thématique conjointe avec la SFSM est devenue une tradition annuelle. Elle aura lieu cette année le 23 mars 2012 dans les locaux de l’ESPCI et traitera des méthodes SRM/MRM (Selected/Multiple Reaction Monitoring).

Nos jeunes adhérents sont également actifs dans l’organisation de manifestations puisqu’en 2012 se tiendront les Rencontres du Club Jeunes du 6 au 8 juin 2012 à Arras.

Pour finir, je ne peux que vous inciter à vous inscrire et renouveler votre adhésion à la SFEAP sur notre nouveau site web car la SFEAP, c’est vous !

Je vous souhaite à toutes et tous une excellente année 2012 en commençant par une bonne lecture de ce nouveau numéro du Mag.

Odile SchiltzPrésidente de la SFEAP

Le mot de la Présidente

!

page 3

Le nouveau Conseil d'AdministrationOdile SchiltzPrésidenteInstitut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS)CNRS 205 Route de Narbonne, 31077 Toulouse CedexTel : (+33) (0)5 61 17 55 47 ; Fax : (+33) (0)5 61 17 59 94

Virginie RedekerVice PrésidenteLaboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales1, Avenue de la Terrasse, 91190 Gif-sur-YvetteTel : (+33) (0)1 69 82 34 60 ; Fax : (+33) (0)1 69 82 31 29

Hélène RogniauxTrésorièreINRA UR1268 BIA - Plate-forme BIBSRue de la Géraudière BP 71627 44316 Nantes cedex 3Tel: (+33) (0)2 40 67 50 34; Fax: (+33) (0)2 40 67 50 25

Pascal CosetteSecrétaireUMR CNRS 6270, Plate-forme Protéomique de l'IFRMP23Blvd M. de Broglie, 76821 Mont-Saint-AignanTel : (+33) (0)2 35 14 63 97 ; Fax : (+33) (0)2 35 14 67 04

Charles PineauPrésident-ConseilPlate-forme Protéomique Biogenouest - Inserm U625Campus De Beaulieu - CS2407 35042 Rennes CedexTel : (+33) (0)2 23 23 52 79 ; Fax : (+33) (0)2 23 23 52 82

Rémy AurandPrésident CJSFEAPUR 1115 Plantes et Systèmes de Cultures Horticoles - INRA Avignon site Agroparc, 84914 Avignon cedex 9Tel: (+33) (0)4 32 72 23 06 ; Fax: (+33) (0)4 32 72 24 32

Luc CamoinMarseille Protéomique - Inserm U891, Institut Paoli-Calmettes27, Bd Leï Roure, BP30059, 13273 Marseille Cedex 9Tel : (+33) (0)4 91 22 33 19; Fax :(+33) (0)4 91 22 36 04

Daniel LafitteMarseille Protéomique Plate-forme PIT2 UMR INSERM 911 -Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie27 bd jean moulin, 13385 Marseille cedex 05Tel: (+33) (0)4 91 83 56 80

Jérôme Lemoine UMR CNRS 5280, Institut des Sciences AnalytiquesBâtiment CPE, Campus de la Doua, 69622 Villeurbanne CedexTel : (+33) (0)4 72 43 27 80

Véronique SantoniBiochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes - SupAgro/INRA/CNRS/UMII/UMR 5004Place Viala, 34060 Montpellier Cedex 1Tel: (+33) (0)4 99 61 20 20 ; Fax: (+33) (0)4 67 52 57 37

Yves Vandenbrouck EDyP - CEA-Grenoble17 Rue des martyrs, 38054 Grenoble cedex 9Tél. : 33 (0)4 38 78 26 74 ; Fax : 33 (0)4 38 78 50 32

Michel Zivy INRA/Université Paris-Sud/CNRS/AgroParisTech - Ferme du Moulon, 91190 Gif-sur-YvetteTel : (+33) (0)1 69 33 23 65 ; Fax : (+33) (0)1 69 33 23 40

page 4

Congrès HUPO, Genève

Comptes-rendus des Conférences HUPO 2011, GenèveAnne Gonzalez de Peredo (Toulouse), Emmanuelle Com (Rennes) et Franck Vandermoere (Montpellier)

Le Congrès HUPO 2011 s’est tenu à Genève du 4 au 7 septembre, avec une précision dans l’organisation digne de l’horlogerie suisse, et avec comme d’habitude un programme très riche sur tous les aspects de la protéo-mique : 8 conférences plénières, 15 sessions parallèles scientifiques, de nombreuses sessions dédiées aux diverses initiatives HUPO (cerveau, plasma, cellules souches, etc…) et au projet HPP (Human Proteome Project), des ateliers de formation très pratiques sur des aspects tels que l’ETD ou la MRM, et des conférences organisées par les constructeurs présentant les dernières innovations instrumentales. La langue française était souvent audible sur le lieu du congrès pas seulement du fait qu’il avait lieu en Suisse mais aussi parce que la communauté scientifique française était fortement représentée cette année. La proximité y était sûrement pour quelque chose. La forte participation de la communauté scientifique française s’est notamment

ressentie lors des sessions scientifiques parallèles grâce à 6 interventions orales dont deux sous forme d’invitations et par une cinquantaine de posters. Au sein d’un congrès dont le thème affiché était la protéo-mique translationnelle, le programme scientifique compre-nait logiquement beaucoup de sessions orientées vers des applications médicales, comme les maladies infectieuses, l’oncologie, les pathologies métaboliques, le système nerveux central, la recherche et la validation de biomar-queurs, les maladies cardiovasculaires. Cependant plusieurs sessions ont aussi été spécifiquement consacrées à des aspects méthodologiques ou fondamentaux : quantifica-tion, modifications post-traductionnelles, protéines mem-branaires, protéomique fonctionnelle, puces à protéines, imagerie, bases de données et bioinformatique. Le glissement qui s’opère depuis quelques années dans le domaine de la protéomique vers des approches expéri-

page 5

Congrès HUPO, GenèveComptes-rendus des Conférences HUPO 2011, Genève (suite)

Anne Gonzalez de Peredo (Toulouse), Emmanuelle Com (Rennes) et Franck Vandermoere (Montpellier)

-mentales ciblées de type MRM, était palpable lors de ce congrès, au travers de plusieurs présentations scienti�ques très convaincantes, mais aussi du succès remporté par exemple par l’atelier de formation dédié à la mise au point de tests MRM avec Ruedi Aebersold et Steve Carr, ou à l’intérêt suscité par certains workshops de constructeurs dont celui de Bruno Domon sur la pseudoMRM dans un Qexactive. Parmi les présentations basées sur ces approches, on peut citer par exemple celle de Leigh Ander-son (remplacé en réalité par Christine Miller) sur l’automatisation de la méthode SISCAPA : capture sur billes magnétiques avec 1 anticorps/peptide protéotypique, multiplexée en plaques 96 puits, réalisée sur 10µL plasma, avec des gradients très courts en HPLC conventionnelle et une approche méthodologique orientée vers l’analyse robuste de séries cliniques. Bien que Ruedi Aebersold n’ait pas consacré sa conférence orale aux approches MRM (présentant plutôt des études sur la caractérisation structu-rale très détaillée de complexes protéiques), plusieurs personnes de son groupe ont en revanche montré des applications cliniques intéressantes utilisant de la protéo-mique ciblée. Silvia Surinova ou Ruth Huttenhain par exemple, respectivement sur le cancer colorectal et le cancer ovarien, ont décrit la détection et la validation de biomarqueurs dans le plasma, avec une belle mise en œuvre dans ces deux études du modèle de stratégie mis en avant depuis quelques années pour la recherche de

biomarqueurs : phase de découverte par analyse de tissus (tissus sains versus tumeurs colorectales, ou bien tissus issus de modèles murins de cancer ovarien) par une approche quantitative label-free basée sur cartes LC-MS, suivie par une phase de validation des protéines di�éren-tielles dans le plasma par MRM. Lors de cette phase de validation, le nombre de candidats biomarqueurs suivis par MRM était respectivement de 90 et 125 pour chacune des deux études, sur 60 échantillons de plasma de patients, ce qui donne une idée des performances de ces approches en termes de débit et de multiplexage à l’heure actuelle. A noter que ces études ont été réalisées sur le sous-protéome N-glycosylé, à la fois pour la phase de découverte et pour celle de validation, en appliquant la méthode de marquage chimique et de capture des N-glycopeptides développée dans le groupe de Zurich, donnant accès à la détection de protéines très minoritaires et à des seuils de sensibilité très bas de l’ordre du « low ng/mL ». Malgré la sensibilité intrin-sèque de la MRM, une étape d’enrichissement par immu-noa�nité (SISCAPA) ou sélection de sous-protéomes est donc souvent mise en œuvre pour parvenir à détecter des marqueurs pertinents dans le plasma. Parmi beaucoup d’autres travaux utilisant de la spectrométrie de masse en mode MRM, on peut encore mentionner la présentation de Christine Carapito sur le N-terminome, et de Nobuaki Takemori sur l’analyse quantitative du protéome transmembranaire à l’aide de standards protéiques

marqués. Utilisant des méthodes particulières de synthèse de protéines recom-binantes membranaires en protéoliposomes, dans un système robotisé de production «cell-free», ce groupe japonais a pu générer 286 protéines transmembranaires de souris, marquées avec des isotopes lourds, et utiliser ces standards pour réaliser un pro�lage quantitatif très poussé des récepteurs neuronaux dans di�érentes régions du cerveau de souris, à l’aide de mesures MRM ciblées. En�n, d’un point de vue purement instrumental, Bruno Domon a présenté les premiers résultats illustrant l’utilisation potentielle du nouvel appareil Q-Exactive de Thermo pour la détection ciblée de protéines. Cet appareil doté d’un quadrupôle couplé à un analyseur orbitrap o�re des possibi-lités en termes de gamme dynamique (sélection des ions de faible abondance dans le quadrupôle) associés à une meilleure spéci�cité, grâce à la mesure à haute résolution des ions fragments dans l’orbitrap. Parallèlement, plusieurs posters signés par ABSciex illustraient également l’utilisation du nouveau Q-TOF 5600 pour des applications similaires de détection ciblée en mode « MRM Haute Résolution ». De fait, si les triple-quadrupôles restent pour l’instant les instruments les plus largement utilisés pour les approches MRM, la mise en œuvre de méthodes de détection ciblées sur ces nouveaux appareils incluant un analyseur haute résolution indique bien la recherche d’une plus grande spéci�cité dans ces approches, pour surmonter les problèmes d’interférences et d’erreurs d’identi�cation encore très importants dans les matrices complexes. En conclusion, beaucoup d’enthousiasme lors de ce congrès autour de la protéomique ciblée, des exemples intéressants d’application, mais aussi beaucoup de travail méthodologique portant sur les étapes en amont (enrichissement des peptides cibles, préparations des standards isotopiques,…) ou sur les méthodes d’acquisition. Le domaine est donc en pleine e�ervescence, et ces stratégies ciblées apparaissent très prometteuses, mais aussi encore assez lourdes à mettre en œuvre et destinées à évoluer sur les aspects sensibilité, spéci�cité, capacité de multiplexage, a�n de relever les dé�s ambitieux qu’elles se sont �xées comme celui de la caractérisation exhaustive du protéome humain dans le cadre du projet HPP (Human Proteome Project).

Lors l’atelier ETD, Donald Hunt a démontré, spectres à l’appui, pourquoi les moteurs de recherche actuels n’utilisent pas encore toute la richesse d’information des spectres ETD, ce qui laisse présager des améliorations futures dans ce domaine.

En parallèle, toutes les études basées sur de la protéomique globale, visant à caractériser et quanti�er les protéomes complexes de façon extensive non ciblée et sans à priori, n’ont pas fait pour autant mauvaise �gure. Atteignant un certain degré de maturité, ces stratégies globales haut-débit font réellement dans certaines études la preuve de leur utilité pour la caractérisation détaillée de systèmes biologiques. Dans beaucoup de travaux présentés, le nombre de protéines identi�ées et quanti�ées est de l’ordre de 5000 sur des échantillons humains. Même si on manque encore probablement certains composants très minoritaires, on a clairement progressé en couverture analytique du protéome, grâce aux appareils récents à haute vitesse de séquençage, et on n’a plus vraiment l’impression d’être toujours relégué à une analyse du sommet de l’iceberg. Repoussant toujours les limites dans cette course au nombre de protéines, Matthias Mann a présenté des résultats portant sur l’analyse en profondeur de di�érentes lignées cellulaires humaines, dans lesquelles près de 10000 protéines sont identi�ées avec un fractionnement très limité de l’échantillon. Dans la session Oncologie, Tamar Geiger, également issue du groupe de Matthias Mann, a présenté des travaux sur l’analyse quantitative de di�érents types de tumeurs de sein utilisant une approche « super-SILAC », dans laquelle un mélange complexe lourd (composé de di�érents types de lignées

(c) Florent Glück - www.capturedby�o.com

page 6

marqués. Utilisant des méthodes particulières de synthèse de protéines recombinantes membranaires en protéolipo-somes, dans un système robotisé de production «cell-free», ce groupe japonais a pu générer 286 protéines transmem-branaires de souris, marquées avec des isotopes lourds, et utiliser ces standards pour réaliser un pro�lage quantitatif très poussé des récepteurs neuronaux dans di�érentes régions du cerveau de souris, à l’aide de mesures MRM ciblées. En�n, d’un point de vue purement instrumental, Bruno Domon a présenté les premiers résultats illustrant l’utilisation potentielle du nouvel appareil Q-Exactive de Thermo pour la détection ciblée de protéines. Cet appareil doté d’un quadrupôle couplé à un analyseur orbitrap o�re des possibilités en termes de gamme dynamique (sélection des ions de faible abondance dans le quadrupôle) associés à une meilleure spéci�cité, grâce à la mesure à haute résolution des ions fragments dans l’orbitrap. Parallèle-ment, plusieurs posters signés par ABSciex illustraient également l’utilisation du nouveau Q-TOF 5600 pour des applications similaires de détection ciblée en mode « MRM Haute Résolution ». De fait, si les triple-quadrupôles restent pour l’instant les instruments les plus largement utilisés pour les approches MRM, la mise en œuvre de méthodes de détection ciblées sur ces nouveaux appareils incluant un analyseur haute résolution indique bien la recherche d’une plus grande spéci�cité dans ces approches, pour surmonter les problèmes d’interférences et d’erreurs d’identi�cation encore très importants dans les matrices complexes. En conclusion, beaucoup d’enthousiasme lors de ce congrès autour de la protéomique ciblée, des exemples intéressants d’application, mais aussi beaucoup de travail méthodolo-

gique portant sur les étapes en amont (enrichissement des peptides cibles, préparations des standards isotopiques,…) ou sur les méthodes d’acquisition. Le domaine est donc en pleine e�ervescence, et ces stratégies ciblées apparaissent très prometteuses, mais aussi encore assez lourdes à mettre en œuvre et destinées à évoluer sur les aspects sensibilité, spéci�cité, capacité de multiplexage, a�n de relever les dé�s ambitieux qu’elles se sont �xées comme celui de la caractérisation exhaustive du protéome humain dans le cadre du projet HPP (Human Proteome Project).

Lors l’atelier ETD, Donald Hunt a démontré, spectres à l’appui, pourquoi les moteurs de recherche actuels n’utilisent pas encore toute la richesse d’information des spectres ETD, ce qui laisse présager des améliorations futures dans ce domaine.

En parallèle, toutes les études basées sur de la protéomique globale, visant à caractériser et quanti�er les protéomes complexes de façon extensive non ciblée et sans à priori, n’ont pas fait pour autant mauvaise �gure. Atteignant un certain degré de maturité, ces stratégies globales haut-dé-bit font réellement dans certaines études la preuve de leur utilité pour la caractérisation détaillée de systèmes biolo-giques. Dans beaucoup de travaux présentés, le nombre de protéines identi�ées et quanti�ées est de l’ordre de 5000 sur des échantillons humains. Même si on manque encore probablement certains composants très minoritaires, on a clairement progressé en couverture analytique du protéome, grâce aux appareils récents à haute vitesse de séquençage, et on n’a plus vraiment l’impression d’être toujours relégué à une analyse du sommet de l’iceberg. Repoussant toujours les limites dans cette course au nombre de protéines, Matthias Mann a présenté des résultats portant sur l’analyse en profondeur de di�érentes lignées cellulaires humaines, dans lesquelles près de 10000 protéines sont identi�ées avec un fractionnement très limité de l’échantillon. Dans la session Oncologie, Tamar Geiger, également issue du groupe de Matthias Mann, a présenté des travaux sur l’analyse quantitative de di�érents types de tumeurs de sein utilisant une approche « super-SI-LAC », dans laquelle un mélange complexe lourd (composé de di�érents types de lignées cellulaires de cancer de sein marquées SILAC), est rajouté à chaque biopsie de patient et sert de standard interne unique pour quanti�er l’ensemble des protéines de façon relative. Ces approches de «spike-in SILAC », utilisant un seul mélange standard rajouté à di�érents échantillons à comparer, semblent permettre de surmonter les limitations classiques du SILAC (impossibilité du marquage métabolique sur certains échantillons, nombre restreint d’échantillons pouvant être comparés). L’analyse du caractère dynamique du protéome a été évoquée dans plusieurs exposés et évaluée par di�érentes approches basées sur l’utilisation du SILAC telles que le « pulse SILAC » ou le dual SILAC. Ainsi Matthias Selbach a présenté un travail assez impressionnant sur l’analyse à grande échelle de l’expression génique et de son contrôle dans des cellules humaines. Pour la première fois, il compare sur les mêmes cellules à la fois le niveau d’abondance mais aussi la demi-vie des protéines et des


ARN messagers. Le turnover des protéines a pu être déterminé grâce à un marquage en « pulse-SI-LAC », dans lequel les cellules initialement non marquées sont placées dans un milieu lourd puis collectées à des temps di�érents, au terme desquels on peut mesurer l’apparition progressive des protéines nouvellement synthétisées sous forme lourde. Parallèlement, la demi-vie des ARNm est déterminée également par marquage métabolique et séquençage à très haut débit (Solexa). Au �nal, cette étude portant sur plus de 5000 gènes indique un certain degré de corrélation entre l’abondance des protéines et celui des ARNm (environ 40%, plus que ce qui était anticipé d’après des études antérieures), mais montre que le contrôle du niveau protéique s’e�ectue essentielle-ment au niveau du ribosome lors de la traduction. Angus Lamond a également utilisé cette approche de « pulse-SILAC » en ajoutant une dimension spatiale pour évaluer le turn over des protéines de di�érents compartiments de cellules humaines HeLa. Son équipe a ainsi pu montrer que la stabilité des protéines était di�érente selon les compartiments fonctionnels de la cellule. Les changements dynamiques du protéome ont également été appréhendés par des approches de « dual-silac » comme nous l’a présenté Ivo Fierro-Monti. Cette nouvelle approche permet la détec-tion simultanée des changements des taux de dégradation et de synthèse des protéines après un stimulus d’intérêt.


Comptes-rendus des Conférences HUPO 2011, Genève (suite)Anne Gonzalez de Peredo (Toulouse), Emmanuelle Com (Rennes) et Franck Vandermoere (Montpellier)

page 7


ARN messagers. Le turnover des protéines a pu être déter-miné grâce à un marquage en « pulse-SILAC », dans lequel les cellules initialement non marquées sont placées dans un milieu lourd puis collectées à des temps di�érents, au terme desquels on peut mesurer l’apparition progressive des protéines nouvellement synthétisées sous forme lourde. Parallèlement, la demi-vie des ARNm est détermi-née également par marquage métabolique et séquençage à très haut débit (Solexa). Au �nal, cette étude portant sur plus de 5000 gènes indique un certain degré de corrélation entre l’abondance des protéines et celui des ARNm (environ 40%, plus que ce qui était anticipé d’après des études antérieures), mais montre que le contrôle du niveau protéique s’e�ectue essentiellement au niveau du ribosome lors de la traduction. Angus Lamond a également utilisé cette approche de « pulse-SILAC » en ajoutant une dimension spatiale pour évaluer le turn over des protéines de di�érents compartiments de cellules humaines HeLa. Son équipe a ainsi pu montrer que la stabilité des protéines était di�érente selon les compartiments fonctionnels de la cellule. Les changements dynamiques du protéome ont également été appréhendés par des approches de « dual-silac » comme nous l’a présenté Ivo Fierro-Monti. Cette nouvelle approche permet la détection simultanée des changements des taux de dégradation et de synthèse des protéines après un stimulus d’intérêt.

Au-delà de ces analyses à grande échelle portant sur le protéome de cellules entières, beaucoup d’études globales étaient par ailleurs focalisées sur des sous-protéomes ou des modi�cations post-traductionnelles particulières. Sur le phosphoprotéome, on peut citer par exemple les travaux de Blagoy Blagoev présentés dans le cadre de l’initiative HUPO « cellules souches », portant sur l’analyse quantita-tive de plus de 23000 sites de phosphorylation suivis en cinétique lors de la di�érenciation de cellules souches embryonnaires humaines, et permettant d’élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pluripotence de ces cellules. Sur le glycoprotéome de surface, Bernd Wollscheid a présenté sa banque CSPA (Cell Surface Protein Atlas), intégrant des données d’identi�cation sur le surfaceome de 41 types cellulaires humains et 31 types cellulaires de souris. Cette base de données, générée à partir de l’approche « Cell Surface Capturing » pour le marquage et la puri�cation des N-glycopeptides, contient désormais environ 1400 protéines de surface humaines et murines, fournissant un outil pour la classi�cation phénoty-pique et fonctionnelle des di�érents types cellulaires en fonction du pro�l de leur protéome de surface, plus riche que les clusters de di�érenciation actuellement utilisés qui reposent sur un nombre limités d’antigènes.

Notons également les derniers développements de l’imagerie MALDI en terme de résolution spatiale (imagerie à 20 µm présentée par Mélanie Lagarrigue dans le contexte de la reproduction masculine) et spectrale, présentés lors de la session scienti�que dédiée. En particulier Herbert Thiele a présenté une méthode permettant la réalisation de cartes de segmentation à haute résolution qui combi-née à des images IRM permet une reconstruction en 3D des

organes et donc améliore la corrélation entre les structures tissulaires et les informations moléculaires obtenues en imagerie MALDI.

En�n, la nouveauté de ce Congrès Hupo 2011, à mi-chemin entre approches ciblées et globale, est peut-être le SWATH-MS (sequential windows acquisition), présenté par Ruedi Aebersold lors du workshop ABSciex, ce mode d’acquisition original consiste à fragmenter de façon systématique et simultanée l’ensemble des ions précur-seurs compris dans des fenêtres discrètes de 25 amu sur l’ensemble de la gamme de masse et du gradient chroma-tographique. A partir des spectres MS/MS haute-résolution enregistrés à haute vitesse sur TripleTOF 5600, il est possible de réaliser des appels d’ion sur n’importe quel fragment théorique d’intérêt, de façon à réaliser une quan-ti�cation de type SRM sans le besoin de designer des listes de transitions avant l’acquisition. Les fragments d’un même précurseur étant censés apparaitre en même temps que lui lors du gradient chromatographique. Bien que la gamme dynamique de cette approche semble quand même inférieure à celle de la SRM classique, elle est néanmoins présentée comme très sensible, permettant une analyse extensive des mélanges complexes sans optimisation préalable de la méthode, avec une très bonne précision quantitative. Peut-être une nouvelle stratégie d’avenir ? Au-delà des quelques posters présentés, il faudra peut-être attendre des résultats plus complets pour évaluer l’impact que pourra avoir cette approche. A l’heure actuelle, les outils bioinformatiques permettant de réaliser l’identi�cation des peptides à partir des spectres MS/MS « mélangés » sont encore en plein développement. Et bien sûr, comme dans cette approche on ne connaît pas à priori la masse de l’ion parent, les recherches doivent se faire dans des librairies de spectres MS/MS et non dans des bases de données de protéines, ce qui appelle un développement intensif de ces banques spectrales a�n d’inclure les protéines minoritaires. A suivre donc pour cette nouvelle stratégie prometteuse…

Quant au « Human Proteome Project », un an après son lancement o�ciel au Congrès Hupo 2010 de Sydney, le consortium commence à s’organiser. Dans une approche « gene-centric », plusieurs pays du monde se sont engagés à collecter les informations relatives aux protéines en se les partageant, parcimonie oblige, suivant le chromosome qui les code (chromosome 1 pour la Chine, le 2 pour la Suisse, le 6 pour le Canada, le 14 pour la France, le 17 pour les USA, etc…). Néanmoins des méthodes, lignes directrices, et formats de données communs restent encore à préciser. Parallèlement, Amos Bairoch a présenté la nouvelle base de données NextProt consacrée aux protéines humaines, qui devrait contenir des annotations très complètes sur ces protéines et intégrer tout un ensemble d’informations issues par exemple des études protéomiques ou géno-miques à haut-débit, ainsi que des outils bioinformatiques pour rechercher et parcourir facilement les données. Cette base de données sera ainsi le support principal des di�érentes initiatives HPP en regroupant les di�érentes données expérimentales issues de ces initiatives.

Près de 900 posters constituaient une source importante d’informations avec il faut le noter une forte poussée de la proportion des posters présentant de nouveaux outils informatiques pour l’exploitation, l’annotation et le stockage organisé des résultats de MS. A noter également un poster du groupe de Matthias Mann où était présentée une analyse en temps réel des spectres de fragmentation acquis par un LTQ-orbitrap. Parmi les buts annoncés par l’auteur de ce poster, la génération de listes d’inclusion ou d’exclusion durant le même run a�n de fragmenter en priorité les ions qui n’ont pas encore obtenu d’identi�cation correcte ou de précurseurs SILAC montrant des di�érentiels, une sorte d’acquisition intelligente sans le besoin d’injection.

Le diner de gala a eu lieu au cirque national suisse ou nous avons eu le droit à une représentation de qualité de la part de ses artistes. Pour la petite histoire, les organisateurs du congrès sont arrivés sous le chapiteau déguisés en clowns et repartis sur le dos d’un éléphant. Du grand spectacle !

En conclusion, ce fut un congrès HUPO très intéressant, témoignant du dynamisme de la protéomique et de la progression continue des techniques et des résultats dans ce domaine, et nous tenons pour �nir à remercier chaleureu-sement la SFEAP du support �nancier qu’elle nous a apporté pour participer à cette manifestation.

Comptes-rendus des Conférences HUPO 2011, Genève (suite)Anne Gonzalez de Peredo (Toulouse), Emmanuelle Com (Rennes) et Franck Vandermoere (Montpellier)

page 8

Congrès HUPO, GenèveComptes-rendus des Conférences HUPO 2011, Genève (suite)

Anne Gonzalez de Peredo (Toulouse), Emmanuelle Com (Rennes) et Franck Vandermoere (Montpellier)

Près de 900 posters constituaient une source importante d’informations avec il faut le noter une forte poussée de la proportion des posters présentant de nouveaux outils informatiques pour l’exploitation, l’annotation et le stockage organisé des résultats de MS. A noter également un poster du groupe de Matthias Mann où était présentée une analyse en temps réel des spectres de fragmentation acquis par un LTQ-orbitrap. Parmi les buts annoncés par l’auteur de ce poster, la génération de listes d’inclusion ou d’exclusion durant le même run a�n de fragmenter en priorité les ions qui n’ont pas encore obtenu d’identi�cation correcte ou de précurseurs SILAC montrant des di�éren-tiels, une sorte d’acquisition intelligente sans le besoin d’injection.

Le diner de gala a eu lieu au cirque national suisse ou nous avons eu le droit à une représentation de qualité de la part de ses artistes. Pour la petite histoire, les organisateurs du congrès sont arrivés sous le chapiteau déguisés en clowns et repartis sur le dos d’un éléphant. Du grand spectacle !

En conclusion, ce fut un congrès HUPO très intéressant, témoignant du dynamisme de la protéomique et de la progression continue des techniques et des résultats dans ce domaine, et nous tenons pour �nir à remercier chaleu-reusement la SFEAP du support �nancier qu’elle nous a apporté pour participer à cette manifestation.


page 9

L’édition 2011 du congrès SMAP s’est déroulée du 19 au 22 septembre au Centre de Congrès du Palais des Papes en Avignon. Cette édition a été organisée par deux labo-ratoires du CEA : l’iRTSV-BGE-EDyP de Grenoble (J. Garin) et l’iBEB-SBTN-LBSP de Mar-coule (J. Armengaud). Le succès était au rendez-vous avec 570 congressistes accueillis au sein du Palais des Papes en Avignon pour un programme … divin ! Les congres-sistes ont été pour la plupart aux anges dès l’inauguration comme en témoigne la photo ci-contre, avec deux conférences inaugurales de grande qualité proposées par Graham Cooks, un des papes de la spectrométrie, et Michel Desjardins, biologiste cellulaire qui a apporté de nouveaux concepts dans le domaine de l’immunologie grâce à la protéomique. L’enchantement du lieu historique, havre de paix, s’est mué en paradis de la spectrométrie de masse et de la protéomique pendant quatre jours où les congressistes ont pu assister à une soixantaine de conférences (www.smap2011.fr). Des échanges scienti�ques de très grande qualité ont porté notamment autour des nouveaux développements technologiques qui vont rapidement faire évoluer le domaine de la spectrométrie de masse appliquée à l’analyse des protéines et des petites molécules. Les conférences plénières ont été données par Anne-Claude Gavin, Martin Jarrold, Guy Bouchoux, Seth Grant, Olga Vitek, Virginie Brun et Pierre Chaurand. Pour ceux n’ayant pas eu la possibilité de se rendre en Avignon, certaines présenta-tions sont actuellement accessibles via le site web dédié. Les sessions posters ont vu la présentation de 266 communications. A noter la très forte participation d’industriels puisque 33 sociétés étaient présentes par le biais d’un stand d’exposition. D’autre part,

7 sessions de conférences commerciales ont été proposées par des constructeurs.

!

Spectrométrie de Masse et Analyse Protéomique à l’honneur au Palais des Papes en AvignonJean Armengaud, Jérôme Garin, Christophe Bruley

page 10

Un « Forum emploi » organisé sous la forme d’un « speed dating » a permis un premier contact entre étudiants et employeurs autour de 18 o�res d’emploi, dont plus d’un tiers provenait des industriels présents ! Une session de formation portant sur l’imagerie MALDI a été proposée par Julien Franck, Isabelle Fournier et Michel Salzet en amont du congrès.

L’ensemble des partici-pants ont pu gouter à de nombreuses spécialités provençales comme la frite de Panisse ou l’agneau de 12 heures, déguster quelques crus locaux, pro�-ter du cadre historique exceptionnel avec la visite privée du Palais, mais aussi danser sur le Pont St Béné-zet, et avoir un aperçu de l’ambiance festive de la ville d’Avignon, axée sur le théâtre. Le comité d’organisation remercie la SFSM & la SFEAP, tous les sponsors et exposants pour leur soutien, le comité scienti�que pour son implication dévouée lors de l’élaboration du programme scienti�que, l’ensemble des intervenants, et tous les congressistes pour leur participation active

! !

page 11

Congrès SMAP, Avignon

Conférence d’Ouverture de Graham CooksSandra Reinier et Valérie Ro�dal

"Avant toute chose, nous tenions à remercier la SFEAP pour nous avoir accordé une bourse afin de pouvoir assister au congrès SMAP 2011 conjointement organisé par la SFEAP et la SFSM qui s’est tenu du 19 au 22 septembre au Palais de Papes d’Avignon. Pour nous, ce premier congrès restera dans nos mémoires autant par son apport scientifique que culturel. Merci aussi, aux membres du comité organisateur pour leur introduction Théâtrale ainsi que pour leur dynamisme et leur disponibilité durant ces 4 jours."

Le congrès SMAP, conjointement organisé par la SFEAP et la SFSM, a eu pour premier invité M. Graham COOKS qui nous a présenté l'ionisation ambiante et la miniaturisation des spectromètres de masse. Deux méthodes d'ionisation principales nous ont été décrites : l'ionisation par désorp-tion et électrospray (DESI) et le système du "Paper Spray".

Le principe du DESI consiste à envoyer sur un échantillon

solide « brut » (sans préparation), un jet de gouttelettes chargées d’une source « electrospray » (électronébulisation). Ainsi, l’impact des gouttelettes sur l’échantillon entraine la désorption d’ions qui seront par la suite transférés dans le vide du spectromètre masse. Ceci permet l'analyse des particules présentes à la surface d'échantillons solides. Plusieurs applications de DESI ont été énoncées, notamment l’analyse de métabolites dans les �uides et les tissus, la recherche de biomarqueurs ou encore le diagnostic de maladies par imagerie. Des zones tumorales ont pu par exemple être visualisées et des stades d’avancement de cancer ont pu également être déterminés par imagerie. La miniaturisation des spectromètres de masse (une vingtaine de centimètres) est une avancée remarquable puisqu’elle permet de réaliser des analyses in situ et d’obtenir des images en temps réel.

page 12

Ensuite, nous a été présenté la méthode du "Paper Spray" dans laquelle les échantillons sont ionisés dans l'air, directe-ment à partir du papier. Ce procédé consiste à appliquer une haute tension à un petit triangle de papier imbibé de solution à analyser. Les ions sont émis à la pointe du triangle et envoyés dans l’e spectromètre de masse.

La recherche et la quanti�cation d'agents thérapeutiques ou de drogues dans le sang peut être réalisée par cette méthode de façon précise et exacte après simple dépôt d'une goutte de sang sur le papier.. Cette méthode peut être également appliquée dans la sécurité alimentaire par la recherche d’agents chimiques présents à la surface de fruits par exemple. L'aspect portatif de ces spectromètres couplés à une ionisation en pression atmosphérique est une révolution dans l’analyse par spectrométrie de masse.

La conférence plénière donnée par Michel Desjardins du Département de Pathologie et Biologie Cellulaire de l’Université de Montréal portait sur l’étude des phagosomes par analyse protéomique. Dans un premier temps, Michel Desjardins a décrit le rôle de ces organelles et de la phagocytose dans l’organisation cellulaire. Il a rappelé le travail précurseur de Metchniko� (prix Nobel 1908) qui fut le premier à faire le lien entre immunité innée et acquise. La première analyse protéomique d’ensemble du phagosome en électrophorèse bidimension-nelle a permis d’identi�er de nombreuses protéines du phago-some (Garin et al, 2001, J. Cell Biology). Puis, grâce aux avancées e�ectuées dans les domaines de la protéomique et de la spectrométrie de masse, le nombre d’identi�cations a considérablement augmenté. Ainsi, la caractérisation fonctionnelle du protéome entier du phagosome de la droso-phile a permis la construction de réseaux d’interactions protéine-protéine, et donc une meilleure compréhension des mécanismes de la phagocytose. Il est possible de citer le point d’ancrage grâce aux rafts lipidiques ou encore la présentation antigénique croisée. Dans un second temps, Michel Desjardins a présenté les travaux portant sur l’évolution du phagosome, basés sur la comparaison du protéome et du phosphoprotéome de trois organismes : l’amibe Dictyostelium discoideum, la mouche à fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus. Tout d’abord, les résultats ont permis d’identi�er un grand nombre de protéines communes aux trois espèces, à partir desquelles les fonctions du phagosome se seraient développées. Ensuite, le protéome du phagosome montre un remodelage corres-pondant à deux périodes de duplication de gènes qui coïnci-dent avec l’apparition de l’immunité innée et acquise. Cette étude protéomique a donc mis en évidence les changements qui ont contribué à l’évolution du phagosome d’un comparti-ment phagotrophe à une organelle capable de présentation antigénique.

La conférence plénière du mardi matin, présentée par Anne-Claude Gavin du Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire de Heidelberg, traitait de di�érentes approches permettant l’étude de réseaux d’interactions biomoléculaires. L’importance des interactions protéine-protéine et protéine-métabolite a tout d’abord été rappe-lée dans une première partie. En e�et, de nombreuses pathologies humaines, tels que certains cancers ou encore des désordres bipolaires, sont liées à l’altération de ces interactions.

La complexité des interactions protéine-protéine existant chez Mycoplasma pneumoniae, une bactérie à génome réduit (691 ORF) a été mise en évidence par une approche de TAP-MS (tandem a�nity puri�cation-MS). Puis dans un deuxième temps, les interactions protéine-lipide existant chez Saccharomyces cerevisiae ont été plus largement discutées. Cette étude a été réalisée par une approche utilisant des puces à lipides. 172 protéines solubles ont été utilisées dont 91 possédant un domaine LBD (Lipid Binding Domain). 530 interactions protéine-lipide ont été identi-�ées dont la plupart étaient nouvelles et notamment certaines faisant intervenir des sphingolipides. Ces dernières ont pu être validées in vivo par la technique d’imagerie de cellules vivantes. Pour cela, des protéines possédant potentiellement des domaines d’interactions ont été marquées à la GFP. Un changement de position a pu être observé pour 49 d’entre elles après l’ajout de myrio-cine, un perturbateur de la synthèse des sphingolipides. Il a également été observé que 60% de ces protéines possé-daient un domaine PH (pleckstrin homology domain) qui pourrait être des domaines de liaisons spéci�ques à ces lipides.

Ce travail a permis de mettre en évidence une nouvelle classe d’interactions entre des protéines et de nouveaux métabolites, et également d’obtenir de nouvelles données aidant à la compréhension du rôle des lipides dans les systèmes eucaryotes.


Conférence d’Ouverture de Graham Cook (suite)

Sandra Reinier et Valérie Ro�dal

Conférence d’Ouverture de Michel DesjardinsLaëtitia Théron et Yannick Charretier

Conférence Plénière d'Anne-Claude GavinSandra Reinier et Laëtitia Théron

page 13

Session : « Biologie des systèmes »Sandra Reinier et Laëtitia Théron

La session « Biologie des systèmes » a débuté par une conférence de Paola Picotti de l’Institut de Biochimie de Zurich qui nous a présenté une application de la SRM (Selected Reaction Monitoring) à l’étude de réseaux de protéines. Cette technique de spectrométrie de masse ciblée est généralement utilisée pour la quanti�cation de protéines prédéterminées dans di�érents échantillons de façon régulière et précise. Le modèle utilisé pour cette étude, Saccharomyces cerevisiae, a été cultivé dans di�érents milieux nutritifs. Des protéines impliquées dans di�érentes voies métaboliques ont été quanti�ées par SRM dans chaque condition et à di�érents temps de culture. Les données quantitatives obtenues ont pu montrer l’adaptation du microorganisme au substrat et au manque de nutriments par la mise en place de nouvelles voies du métabolisme. Cette application montre le potentiel de la technique pour élucider la dynamique du réseau cellulaire à travers un nombre important de conditions perturbantes. Une approche basée sur une banque de peptides synthé-tiques non puri�és a également été mise au point dans le but de développer un essai SRM sur un protéome entier. Pour S. cerevisiae, environ 30 000 peptides ont été synthéti-sés pour 6 600 ORF qui ont permis de couvrir environs 97% du génome de cette levure. La description de ces essais ainsi que les banques de spectres obtenus sont régulière-ment mis à jour et rendus publiques via l’interface SRMAt-las permettant leur dissémination à travers di�érents laboratoires.

Régis Lavigne de l’IRSET de Rennes nous a présenté des travaux de recherche portant sur l’analyse du protéome de la levure SK1 en condition de fermentation et de respira-tion. Les protéines extraites dans les deux conditions ont été séparées sur gel de polyacrylamide-SDS. Chaque ligne a été par la suite coupée en 30 bandes qui après digestion à la trypsine ont été analysées par LC-MS/MS pour l’identi�cation des protéines. Les résultats obtenus ont alors été comparés à des données de pro�ls d’expression du génome entier obtenus précédemment dans leur laboratoire, mais également à des données décrivant des réseaux protéiques disponibles via des bases de données gratuites. Très peu de di�érences dans la composition en protéines ont été observées entre les deux conditions de culture. Cependant, cette méthode simple et robuste a permis d’obtenir des résultats qui, associés à ceux de la génomique et la transcriptomique, a permis d’enrichir les connaissances sur les mécanismes de croissance végétative de la levure sous deux conditions métaboliques di�érentes.

Hans C. Hürlimann de l’Institut de Biochimie et Géné-tique Cellulaires du CNRS de Bordeaux a présenté une conférence portant sur l’identi�cation par protéomique des cibles cellulaires de l’AICAR, un métabolite intermédiaire de la synthèse de novo de la purine. Pour cela, une approche combinant la chromatographie d’a�nité et la spectromé-trie de masse pour la puri�cation et l’identi�cation des protéines de liaison a été réalisée. Les résultats montrent

que la distribution des groupes fonctionnels des protéines de liaison est conservée entre la levure et la souris. L’application de ces méthodes à l’humain a permis égale-ment d’obtenir une vue d’ensemble des cibles cellulaires du métabolite AICAR. La mise en relation de ces données protéomiques avec celles acquises en métabolomique et génétique permettra à court terme de dé�nir quelles cibles seront directement a�ectées par l’action de AICAR.

La conférence de Gérémy Clair du Laboratoire de Biochi-mie des Systèmes Perturbés du CEA a porté sur Bacillus cereus qui est un pathogène à l’origine de maladies humaines d’origine alimentaire. Cette bactérie est adaptée aux conditions de potentiel redox et d’oxygénation de l’intestin, dans lequel elle sécrète de nombreux facteurs extracellulaires, tels que les entérotoxines à l’origine de toxi-infections. Alors que la réponse bactérienne à une variation du taux d’oxygène a largement été étudiée, très peu de données sur l’adaptation aux variations de potentiel redox sont disponibles dans la littérature. A�n de comprendre ces mécanismes, B. cereus a été cultivée dans deux conditions di�érentes de potentiel redox (haut et bas), en absence ou avec 100% d’oxygène. Les protéines sécrétées et les protéines intracellulaires issues de ces di�érentes cultures ont été comparées. Après extraction, les protéines ont été analysées selon une méthode ‘Shot-Gun’. Parmi les protéines identi�ées, se trouvent de nombreux facteurs de virulence, ainsi que des protéines appartenant au métabolisme énergétique. Ainsi, pour les quatre conditions de potentiel redox, le réseau métabo-lique central (glycolyse, cycle de Krebs, …) a été reconstruit selon ces données. La comparaison de ces données met en évidence le rôle de la protéine OrhA, qui joue un rôle important dans les mécanismes globaux d’adaptation de B. cereus aux conditions de potentiel redox.

La conférence de Bertrand Fabre de l’Institut de Pharma-cologie et Biologie Structurale du CNRS portait sur l’étude de la distribution quantitative des complexes régulateurs du protéasome. Pour cela, l’équipe a développé une approche combinant de la puri�cation par immuno-a�-nité, suivi d’un traitement au formaldéhyde de sorte à stabiliser les complexes. L’activité du protéasome n’est pas modi�ée par le cross-link. La méthodologie a été optimisée de sorte à extraire les complexes protéasome spéci�ques du cytoplasme, des microsomes et des compartiments nucléaires. Dans les cellules modèles, le protéasome est majoritairement dans la fraction cytosolique. Une quanti�-cation en label-free réalisée à l’aide du logiciel MFPaQ permet d’étudier la diversité du protéasome dans la cellule. Chaque sous-unité régulatrice 20S montre une distribution cellulaire spéci�que. A terme, la mise en relation de la composition et de la localisation des complexes permettra une meilleure connaissance de leur mode d’action.


page 14

Conférence Plénière de Martin JarroldJérôme Lacombe et Valérie Ro�dal

Pour la deuxième conférence plénière du mercredi, Martin Jarrold de l'Université d'Indiana, discute de l’utilisation et l’utilité de la détection de charge par spectrométrie de masse (Charge Mass Spectrométrie, CDMS).

En spectrométrie conventionnelle, la charge (z) est déduite à partir de la distribution des rapports m/z a�n de déterminer la masse (m). Ceci pose néanmoins problème pour les ions de hautes masses car les états de charge complexes de ces composés sont moins résolus dans la distribution m/z. A�n de pallier à ce problème, la CDMS o�re une alternative qui consiste à mesurer le ratio m/z et à déterminer la charge z a�n de pouvoir en déduire la masse m (m/z × z = m). Dans sa forme la plus basique, la méthode consiste à séparer des détecteurs de charge par un accélérateur d’ions pulsé. Ainsi lors de la première détection, la charge et la vitesse de l’ion sont calculées, ensuite ce dernier est accéléré et ces paramètres sont à nouveau mesurés. Les détecteurs fournissent alors une image dont le graphe permet de dé�nir la charge de l’ion en calculant l’aire sous le pic de la courbe et de mesurer le rapport m/z grâce à la di�érence des deux vitesses enregistrés lors de

l’accélération (m/z = 2eV/(Vf²-Vi²)) et matérialisé sur le graphe par la distance séparant les deux pics.

Un des principaux challenges pour que la CDMS devienne une technique largement utilisée est d’augmenter la précision des mesures (RMS < 1e) et d’améliorer la sensibilité, autrement dit, diminuer la limite de détection à moins de 10e. Pour cela, Martin Jarrold et son équipe ont essayé un appareil avec des détecteurs de charge composés de 22 tubes de détec-tion divisés en deux ensembles de 11 détecteurs. Ils ont pu tester cette con�guration pour l’identi�cation de la masse d’un composé de 300 kDa, le Poly Ethylène Glycol (PEG). Ainsi ils ont pu obtenir une précision inférieure à 10e et une limite de détection inférieure à 200e. Malgré tout, l’incertitude sur la mesure de la masse reste relati-vement importante. C’est pourquoi de nouvelles con�-gurations devraient faire leur apparition avec notam-ment des appareils de 3ème génération constitués de 84 tubes de détection divisées en 7 groupes de 12 détec-teurs permettant une multiplication encore plus impor-tante des mesures. Ainsi cet appareillage permettrait d’obtenir une précision d’1 ou 2 charges élémentaires et une limite de détection aux alentours de 10-20e.


page 15

Session : « Dynamique des Protéomes » Sarah Triboulet

Tout d’abord, je tiens à remercier la SFEAP de m’avoir accordé une bourse me permettant de participer au congrès SMAP 2011, qui s’est tenu du 19 au 22 Septembre au Centre des Congrès du Palais des Papes à Avignon.

Le présent compte-rendu porte sur la session du mardi après-midi, intitulée « dynamique des protéomes », centrée sur les modi�cations post-traductionnelles et leur impor-tance sur le plan fonctionnel.

Cette session a été initiée par Christopher Overall, chercheur et Professeur à l’Université de Colombie Britan-nique (Canada), également impliqué dans le projet mondial Human Proteome Project (chromosome 6), et dont les travaux sont centrés sur une meilleure compréhension du rôle des protéases par l’analyse des extrémités N- et C-terminales des protéines (« terminomes »), notamment grâce à la méthode de marquage et d’analyse TAILS (Teminal Amine Isotopic Labelling of Substrates). Après avoir rappelé la complexité et le caractère ubiquitaire des clivages par protéolyse, qu’il considère comme la « modi�-cation post-traductionnelle » la plus fréquente, il a mis l’accent sur l’importance de la présence ou non d’extrémités N et C néo-synthétisées sur le plan fonctionnel : celles-ci constituent l’empreinte d’un tissu. Comprendre ces mécanismes s’avère donc essentiel pour approfondir les connaissances en biologie systémique. Dans cette optique, la « dégradomique » vise à comparer les pools de N-terminaux matures à ceux néo-synthétisés. La technique TAILS permet ici d’identi�er les potentiels peptides substrats de protéases : les échantillons de contrôles et tests sont soumis à l’action des protéases, puis, à l’issue d’un marquage di�érentiel sur les amines (terminales et lysines) par diméthylation, ils sont mélangés et digérés à la trypsine. Les peptides contenant encore des amines libres sont alors éliminés par capture sur une résine constituée d’un polymère dendritique de polyglycérols et d’aldéhydes (HPG-ALD), tandis que les peptides non retenus contenant les N-ter d’intérêt (enrichissement par sélection négative) sont analysés en spectrométrie de masse. En�n, au travers de quelques exemples concrets, Chris Overall a montré que cette méthode permettait d’analyser plus en profondeur le protéome, grâce à une identi�cation assez rapide des protéines avec des rendements satisfaisants, avec plus de 2 peptides pour plus de la moitié des protéines identi�ées, et tout en couvrant 6 ordres de grandeurs d’abondance. La méthode TAILS est également compatible avec les straté-gies shotgun conventionnelles, et applicable à l’étude des extrémités C-ter de la même façon. En conclusion, C. Overall rappelle que le plus important n’est pas l’ensemble des constituants cellulaires pris individuellement, mais leur(s) interaction(s).

Dans la seconde partie de cette session, Catherine Moali (Institut de Biologie et Chimie des Protéines – CNRS – Université Claude Bernard, Lyon) a exposé les travaux qu’elle a menés sur l’étude d’une famille particulière de métallo-protéases : human tolloid-like proteinases, ou

encore BMP-1, et de leurs substrats, dont le nombre ne cesse d’augmenter. Il peut en e�et s’agir de composants de la matrice extracellulaire (MEC), de facteurs impliqués dans l’angiogenèse, le métabolisme lipidique, la réparation tissulaire, ou encore de facteurs de croissance… Dans l’étude présentée ici, des stratégies de protéomique quanti-tative ont été employées, sur des cellules de la lignée de �brosarcome primate HT1080 transfectées avec BMP-1, a�n d’étudier les interactions entre récepteurs cellulaires et MEC. Les peptides impliqués sont libérés dans la matrice après protéolyse. Après ultra�ltration des sécrétomes, réduction/ alkylation, marquage iTRAQ, et fractionnement o�-gel, les peptides ont été identi�és et quanti�és par LC-MS/MS. Cependant, certains clivages connus n’étant pas détectés ici, ce protocole a dû être optimisé : à l’issue du marquage iTRAQ, les échantillons sont digérés à la trypsine, enrichis sur une résine de type HPG-ALD, puis fractionnés sur colonne échangeuse d’ions et analysés en LC-MS/MS. Ainsi, en combinant les stratégies de marquage iTRAQ et de marquage/enrichissement par TAILS, Catherine Moali a pu identi�er de manière plus précise et plus exhaustive un certain nombre de candidats substrats des protéases de la famille BMP-1, dont beaucoup sont aussi substrats d’une autre famille (MTLL-1).

Après une pause permettant de voir les di�érents posters exposés ce jour-là, la session s’est poursuivie par la présentation d’Anne Gonzalez De Peredo (Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale – CNRS, Toulouse). Les travaux exposés visaient à évaluer par une approche globale l’e�cacité du protocole de protéomique quantitative utilisé par l’IPBS, dans lequel les échantillons sont non marqués et fractionnés sur gel SDS-PAGE 1D a�n d’améliorer les taux de recouvrement des protéines en LC-MS, en particulier sur des échantillons complexes. Cette dernière étape pouvant induire des biais expérimentaux et donc une plus grande variabilité, la méthode a ici été évaluée avec et sans fractionnement. Pour cela, des lysats de cellules endothéliales humaines ont été digérés à la trypsine, avec ou sans séparation par électrophorèse 1D préalable, puis les peptides extraits ont été analysés par nano-LC-MS/MS sur un instrument de type Orbitrap-Velos. Après identi�cation des protéines (Mascot) et validation (Prosper), le logiciel MFPaQ a été utilisé pour la quanti�ca-tion et la normalisation des données obtenues. L’étude a montré que le fractionnement sur gel 1D améliore considé-rablement le nombre de protéines identi�ées (>5 fois plus), et ce avec une reproductibilité qui reste tout à fait satisfai-sante (CV médian de l’ordre de 7% au lieu de 5%), malgré la présence de valeurs extrêmes plus élevées. De plus, MFPaQ apparaît comme un outil robuste parfaitement adapté à l’étude de protéomes complexes. Sa combinaison au fractionnement permet aussi de réduire les erreurs de quanti�cation. L’application de la méthode avec fractionne-ment sur un type cellulaire proche (cellules endothéliales HUVEC) soumis à l’action de plusieurs cytokines in�amma-toires (TNFα, IFNγ, IL1β), a ainsi permis d’identi�er plus de 4000 protéines dont plus de 200 variants par comparaison

aux cellules non traitées. Ces résultats montrent qu’une stimulation pro-in�ammatoire sur les cellules endothéliales conduit principalement à deux événements : a) sécrétion de cytokines et chimiotaxie, et b) expression de récepteurs de surface et de facteurs d’adhésion cellulaire.

La session s’est poursuivie par une présentation de Joseph Gault (Laboratoire des Mécanismes Réactionnels, DCMR – CNRS – Ecole Polytechnique, Palaiseau), dont les travaux portent sur l’emploi d’approches de spectrométrie de masse de type top-down pour l’étude des modi�cations post-traductionnelles et de la pathogénicité de Neisseria meningitidis. Cette bacté-rie a la capacité de passer d’un état dormant à un état pathogénique, colonisant alors les tissus cibles et provoquant une in�ammation des méninges. Le passage d’un état à l’autre pourrait s’expliquer par une modi�cation a�ectant les pili, structures protéiques présentes en surface de la bactérie et impliquées dans l’agrégation bactérienne et l’adhésion aux cellules hôtes. En e�et, une modi�cation de la protéine constitutive des pili de type IV, nommée pilE, pourrait être à l’origine de la colonisation dynamique des tissus. Plusieurs méthodes de spectrométrie de masse ont été testées et comparées pour l’étude de pilE : la méthode optimale utilise une fragmentation par ECD (dissociation par capture d’électrons) couplée à la FT-ICR. L’approche top-down employée, qui consiste à étudier la protéine entière en phase gazeuse pour élucider ensuite sa structure moléculaire �ne, a permis pour la première fois de mettre en évidence la présence d’un sucre (GATDH) et de modi�-cations de type phosphoglycérol sur les sérines 69 (majoritaire) et 93 de pilE. Ces dernières modi�cations sont probablement introduites par la phosphoglycerol transférase pptB, dont le gène est surexprimé après quelques heures de contact entre les bactéries et les cellules hôtes in vitro. Si la variation de niveau d’expression du gène de pptB n’est pas encore expliquée à ce jour, cette modi�cation de surface de pilE, et donc des pili, pourrait favoriser le détachement des colonies bactériennes en dormance en vue de la colonisation des tissus cibles.

En�n, la session a été clôturée par Pascal Seyer (Institut de Génomique Fonctionnelle - CNRS - INSERM – Universités de Montpellier 1 & 2), qui a présenté ses résultats sur l’identi�cation et la caractérisation de nouveaux partenaires du transpor-teur membranaire de la sérotonine SERT, l’une des cibles principales de nombreux antidépresseurs et anxiolytiques couram-ment prescrits, et dont le rôle est de favoriser l’entrée de sérotonine (5-HT) dans les cellules. Ce système régule de nombreuses fonctions, telles que la cognition, le sommeil, la douleur, l’alimentation, l’humeur… SERT est au centre d’un vaste et complexe réseau d’interactions, et les protéines déjà connues régulant son activité interagissent souvent avec l’extrémité C-ter du transporteur. Cependant, SERT est exprimé en très faible quantité dans les cellules, ce qui rend son étude et celle de ses partenaires di�cile. Pour contourner ce problème, des peptides correspondants à l’extrémité C-ter de SERT ont été synthétisés et �xés sur des billes d’agarose. L’ensemble a été incubé avec des extraits de cerveau de souris. En parallèle, des protéines de fusion contenant SERT et un tag YFP en N-ter ont été surexprimées dans des neurones murins, a�n de pouvoir co-immuno-précipiter les partenaires de SERT. Après digestion à la trypsine, les échantillons ont été analysés par nano-LC-FT-MS/MS sur un Orbitrap a�n d’identi�er les protéines. Les données ont été validées avec le logiciel myProMS. Ce travail a révélé l’interaction de SERT avec des protéines impliquées dans le transport vésiculaire, l’adhésion cellulaire, la signa-lisation, mais aussi avec d’autres transporteurs membranaires… Pascal Seyer a ensuite choisi de développer deux exemples. En particulier, SERT interagit avec la calcineurine, une phosphatase dont l’activité est régulée par la concentration en calcium Ca2+ dans les cellules, et qui semble agir comme un agoniste de la sérotonine : son inhibition induit une augmentation de la dépression chez les souris in vivo, tandis que son expression constitutive augmente l’absorption de sérotonine dans les cellules et diminue la dépression chez l’animal in vivo. De plus une inhibition de l’expression du transporteur induit une accumulation de calcineurine dans les cellules. L’hypothèse d’une phosphorylation des thréonines par la calcineurine a été étudiée de manière plus approfondie, et validée, par quanti�cation relative sans marquage. Le second partenaire présenté est le transporteur d’acides aminés ASCT2, qui diminue l’absorption de sérotonine par les cellules, en régulant son état de glycosylation. Les di�érents partenaires mis à jour sont autant de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.


page 16

aux cellules non traitées. Ces résultats montrent qu’une stimulation pro-in�ammatoire sur les cellules endothéliales conduit principalement à deux événements : a) sécrétion de cytokines et chimiotaxie, et b) expression de récepteurs de surface et de facteurs d’adhésion cellulaire.

La session s’est poursuivie par une présentation de Joseph Gault (Laboratoire des Mécanismes Réactionnels, DCMR – CNRS – Ecole Polytechnique, Palaiseau), dont les travaux portent sur l’emploi d’approches de spectrométrie de masse de type top-down pour l’étude des modi�cations post-traductionnelles et de la pathogénicité de Neisseria meningitidis. Cette bactérie a la capacité de passer d’un état dormant à un état pathogénique, colonisant alors les tissus cibles et provoquant une in�ammation des méninges. Le passage d’un état à l’autre pourrait

s’expliquer par une modi�cation a�ectant les pili, structures protéiques présentes en surface de la bactérie et impliquées dans l’agrégation bactérienne et l’adhésion aux cellules hôtes. En e�et, une modi�cation de la protéine constitutive des pili de type IV, nommée pilE, pourrait être à l’origine de la colonisation dynamique des tissus. Plusieurs méthodes de spectrométrie de masse ont été testées et comparées pour l’étude de pilE : la méthode optimale utilise une fragmentation par ECD (dissociation par capture d’électrons) couplée à la FT-ICR. L’approche top-down employée, qui consiste à étudier la protéine entière en phase gazeuse pour élucider ensuite sa structure molécu-laire �ne, a permis pour la première fois de mettre en évidence la présence d’un sucre (GATDH) et de modi�ca-tions de type phosphoglycérol sur les sérines 69 (majoritaire) et 93 de pilE. Ces dernières modi�cations sont

probablement introduites par la phosphoglycerol transférase pptB, dont le gène est surexprimé après quelques heures de contact entre les bactéries et les cellules hôtes in vitro. Si la variation de niveau d’expression du gène de pptB n’est pas encore expliquée à ce jour, cette modi�cation de surface de pilE, et donc des pili, pourrait favoriser le détachement des colonies bactériennes en dormance en vue de la colonisation des tissus cibles.

En�n, la session a été clôturée par Pascal Seyer (Institut de Génomique Fonctionnelle - CNRS - INSERM – Universités de Montpellier 1 & 2), qui a présenté ses résultats sur l’identi�cation et la caractérisation de nouveaux partenaires du transporteur membranaire de la sérotonine SERT, l’une des cibles principales de nombreux antidépresseurs et anxiolytiques couramment prescrits, et dont le rôle est de favoriser l’entrée de sérotonine (5-HT) dans les cellules. Ce système régule de nombreuses fonctions, telles que la cognition, le sommeil, la douleur, l’alimentation, l’humeur… SERT est au centre d’un vaste et complexe réseau

En�n, la session a été clôturée par Pascal Seyer (Institut de Génomique Fonctionnelle - CNRS - INSERM – Universités de Montpellier 1 & 2), qui a présenté ses résultats sur l’identi�cation et la caractérisation de nouveaux partenaires du transporteur membranaire de la sérotonine SERT, l’une des cibles principales de nombreux antidépresseurs et anxiolytiques couramment prescrits, et dont le rôle est de favoriser l’entrée de sérotonine (5-HT) dans les cellules. Ce système régule de nombreuses fonctions, telles que la cognition, le sommeil, la douleur, l’alimentation, l’humeur… SERT est au centre d’un vaste et complexe réseau

Congrès SMAP, AvignonSession : « Dynamique des Protéomes » (suite)

Sarah Triboulet

d’interactions, et les protéines déjà connues régulant son activité interagissent souvent avec l’extrémité C-ter du transporteur. Cependant, SERT est exprimé en très faible quan-tité dans les cellules, ce qui rend son étude et celle de ses partenaires di�cile. Pour contourner ce problème, des peptides correspondants à l’extrémité C-ter de SERT ont été synthétisés et �xés sur des billes d’agarose. L’ensemble a été incubé avec des extraits de cerveau de souris. En parallèle, des protéines de fusion contenant SERT et un tag YFP en N-ter ont été surexprimées dans des neurones murins, a�n de pouvoir co-immuno-précipiter les partenaires de SERT. Après digestion à la trypsine, les échantillons ont été analysés par nano-LC-FT-MS/MS sur un Orbitrap a�n d’identi�er les protéines. Les données ont été validées avec le logiciel myProMS. Ce travail a révélé l’interaction de SERT avec des protéines impliquées dans le transport vésiculaire, l’adhésion cellulaire, la signalisa-tion, mais aussi avec d’autres transporteurs membranaires… Pascal Seyer a ensuite choisi de développer deux exemples. En particulier, SERT interagit avec la calcineurine, une phospha-tase dont l’activité est régulée par la concentration en calcium Ca2+ dans les cellules, et qui semble agir comme un agoniste de la sérotonine : son inhibition induit une augmentation de la dépression chez les souris in vivo, tandis que son expression constitutive augmente l’absorption de sérotonine dans les cellules et diminue la dépression chez l’animal in vivo. De plus une inhibition de l’expression du transporteur induit une accumulation de calcineurine dans les cellules. L’hypothèse d’une phosphorylation des thréonines par la calcineurine a été étudiée de manière plus approfondie, et validée, par quanti�-cation relative sans marquage. Le second partenaire présenté est le transporteur d’acides aminés ASCT2, qui diminue l’absorption de sérotonine par les cellules, en régulant son état de glycosylation. Les di�érents partenaires mis à jour sont autant de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

page 17

d’interactions, et les protéines déjà connues régulant son activité interagissent souvent avec l’extrémité C-ter du transporteur. Cependant, SERT est exprimé en très faible quantité dans les cellules, ce qui rend son étude et celle de ses partenaires di�cile. Pour contourner ce problème, des peptides correspondants à l’extrémité C-ter de SERT ont été synthétisés et �xés sur des billes d’agarose. L’ensemble a été incubé avec des extraits de cerveau de souris. En parallèle, des protéines de fusion contenant SERT et un tag YFP en N-ter ont été surexprimées dans des neurones murins, a�n de pouvoir co-immuno-précipiter les parte-naires de SERT. Après digestion à la trypsine, les échan-tillons ont été analysés par nano-LC-FT-MS/MS sur un Orbitrap a�n d’identi�er les protéines. Les données ont été validées avec le logiciel myProMS. Ce travail a révélé l’interaction de SERT avec des protéines impliquées dans le transport vésiculaire, l’adhésion cellulaire, la signalisation, mais aussi avec d’autres transporteurs membranaires… Pascal Seyer a ensuite choisi de développer deux exemples. En particulier, SERT interagit avec la calcineurine, une phosphatase dont l’activité est régulée par la concentration en calcium Ca2+ dans les cellules, et qui semble agir comme un agoniste de la sérotonine : son inhibition induit une augmentation de la dépression chez les souris in vivo, tandis que son expression constitutive augmente l’absorption de sérotonine dans les cellules et diminue la dépression chez l’animal in vivo. De plus une inhibition de l’expression du transporteur induit une accumulation de calcineurine dans les cellules. L’hypothèse d’une phospho-rylation des thréonines par la calcineurine a été étudiée de manière plus approfondie, et validée, par quanti�cation relative sans marquage. Le second partenaire présenté est le transporteur d’acides aminés ASCT2, qui diminue l’absorption de sérotonine par les cellules, en régulant son état de glycosylation. Les di�érents partenaires mis à jour sont autant de nouvelles cibles thérapeutiques poten-tielles.


Session : « Dynamique des Protéomes » (suite) Sarah Triboulet

page 18

Conférence Plénière de Guy BouchouxJérôme Lacombe et Valérie Ro�dal

Les conférences du 21 Septembre ont débuté par une présentation de Guy BOUCHOUX sur certains aspects mécanistiques de chimie des ions en phase gazeuse allant du proton mobile à l'errance de l'ion hydrure.

La conférence a débuté par une introduction sur les généralités de la fragmentation en spectrométrie de masse en fonction du mode de fragmentation. Cette fragmentation peut être soit radicalaire soit induite par la charge. La fragmentation des ions en phase gazeuse implique donc le passage de la structure initiale de la molécule en une structure réactive pour en�n former un complexe d’ion neutre (INC). Pour cela, di�érents méca-nismes ont été présentés tels que le transfert de protons (sur les sites les plus basiques), les attaques nucléophiles et les ions hybrides.

Le concept du proton mobile de type bi-moléculaire existe depuis longtemps et l’étude de ces dissociations est réalisée en mesurant la vitesse de transfert (thermodynamique).

Après protonation du peptide, le proton intramolécu-laire migre sur une amine (NH2). Il faut noter que les transferts « naturel » de courte distance de type H+1,2 et H+1,3 sont gourmands en énergie (100-200 KJ/mol), à

l'inverse du type H+1,4. L'énergie de transfert requise peut néanmoins être diminuée par la solvatation. Ce phénomène peut avoir lieu dans une molécule complexe grâce non pas à de l’eau mais à la présence d’une autre molécule. Ce schéma classique entraine la formation des ions b et y. D’un point de vue moléculaire, ces transferts de protons sont faciles et nécessitent peu d’énergie (50 KJ/mol). S’en suit une attaque nucléophile aboutissant à la formation de la pipérazine ou de l'oxazolone, cette dernière étant favorisée.

Il est à noter que la présence d'arginine dans la séquence nécessitera une énergie plus importante pour fragmenter la molécule.

Il existe d’autres types de fragmentation telle que la dissociation par capture d’électrons (ECD), qui va conduire à la formation d’un ion c et z.

En�n, un nouveau modèle de fragmentation implique des ions hydrures. Le transfert de ces ions hydrures peut se réaliser de façon bi-moléculaire ou uni-moléculaire, dans ce dernier cas une énergie de 20-30 KJ/mol est nécessaire. Le carbocation primaire n’est qu’un état de transition, le secondaire existe peut-être, mais le plus probable reste le carbocation tertiaire.


page 19

Session : « Protéomique et santé »Jérôme Lacombe

Bruno Domon du Centre de Protéomique Clinique de Luxembourg nous a présenté les nouvelles stratégies de protéomiques quantitatives et ses implications dans la recherche biomédicale. Dans un premier temps, il nous a présenté les di�cultés à surmonter pour analyser des protéines dans les �uides biologiques notamment la complexité de ces �uides, la large gamme dynamique de concentration en protéines et la variabilité biologique inhérente à ces derniers. Ces di�cultés nécessitent une mesure quantitative, précise, sensible et une plate-forme de haut-débit pour permettre de larges études. Les straté-gies présentées ont été développées sur un instrument hybride quadripôle-orbitrap. Les expériences quantitatives peuvent être mises au point soit grâce à la haute résolution et les capacités de masse précise ou en analysant spéci�-quement des ions fragments. La sensibilité est similaire quelque soit le mode et est meilleur que celle d’un triple quadripôle classique en mode SRM. Le gain en sensibilité est obtenu grâce à une sélectivité améliorée sur les ions parents ou sur les ions fragments. Dans un second temps, cette stratégie a été appliquée à la quanti�cation de b i o m a r q u e u r s urinaires par la méthode « IGNIS ». Elle fait intervenir l’utilisation d’un polypeptide synthé-tique et un peptide reporteur universel permettant une quan-ti�cation précise et multiplexée dans des échantillons biolo-giques complexes. Les résultats permettent donc d’a�rmer que l’utilisation de cette stratégie possède de nombreux avantages pour une utilisation clinique grâce notamment à une spéci�cité importante et une quanti�cation précise pour un large panel de candidats, faisant même de cette technique une référence possible parmi d’autres.

Christophe Masselon du Laboratoire d’étude de la Dyna-mique des Protéomes (EdyP) au CEA de Grenoble nous a présenté la découverte de biomarqueurs candidats du cancer de la vessie par une approche protéomique « Accurate Mass Tag AMT» dans une cohorte de patients multi-site. L’objectif de cette étude est de fournir un nombre restreint de biomarqueurs urinaires de manière à détecter ce cancer récurrent de cinquième incidence. La stratégie utilisée est une technique de quanti�cation sans marquage basé sur le tag de masse exacte et du temps de rétention : « AMT ». L’avantage de cette stratégie est de permettre l’analyse de nombreux échantillons dans un temps raisonnable adapté à la phase de découverte. Elle

fournit également une large couverture du protéome et une gamme dynamique adaptée à la quanti�cation de peptides. 1200 protéines ont pu être quanti�ées durant l’étude. Deux approches statistiques ont permis d’évaluer ces résultats. La première sur l’index d’abondance permet-tant d’évaluer au niveau peptidique. La seconde sur une ANOVA aux e�ets mélangés permettant d’évaluer au niveau protéique. Une liste �nale de 73 biomarqueurs candidats a pu être établie. Par ailleurs, la corrélation entre SRM et AMT s’avère très bonne.

Willy V. Bienvenut de l’institut des sciences végétales du CNRS est venu nous démontrer que les avancées protéo-miques de ces dernières années permettaient la réalisation d’études comparatives à grande échelle particulièrement ciblées et spéci�ques comme la caractérisation du N-ter-minale des protéines. De nombreuses protéines subissent des modi�cations post-traductionnelles importantes notamment au niveau de leur extrémité N-terminale,

parmi lesquelles l’excision de la méthionine N-termi-nale (NME) ou encore l’acétylation N-termi-nale (NTA), modi�ca-tion la plus fréquente chez l’animal, les plantes ou encore les levures. Dans un premier temps Willy V. Bienvenut nous a présenté les résultats d’une étude qui visait à comparer les modi�-cations N-terminale chez Arabidopsis thaliana avec celles présentes chez

l’Homme. Grâce à un échantillonnage important, les auteurs ont pu montrer une grande convergence entre les deux systèmes biologiques avec néanmoins une NTA plus spéci�que chez la plante au niveau des protéines du chloroplaste. Un autre exemple de caractérisation de peptides N-terminaux a également été abordé et concerne l’identi�cation des cibles de METAP2. METAP2 est une enzyme qui catalyse la réaction NME et qui peut être inhibé par la fumagillin, bloquant ainsi la prolifération des cellules endothéliales et inhibant l’angiogenèse. Par une approche associant SCX et LC-MS/MS, sur les lignées cellulaires HUVEC et U87, plus de 1100 peptides N-termi-naux ont pu être identi�és, correspondant à 508 protéines. Les cibles identi�ées de METAP2 sont principalement le substrat méthionine-valine-acide aminé (MVX) à 50%, puis le peptide MTX (méthionine-thréonine-acide aminé) à 15 % et en�n un ensemble d’autres substrats moins repré-senté. Ces résultats démontrent la capacité de la spectro-métrie de masse et de la protéomique dans la réalisation d’étude comparative à grande échelle dans des domaines

précis et bien déterminés.

Yannick Charretier de bioMérieux à Marcy l’Etoile nous a présenté la caractérisa-tion des microorganismes en mode « SRM » pour une future utilisation en clinique. La protéomique vient de délivrer sa première application clinique de routine en microbiologie grâce à l’identi�cation de micro-organismes par MALDI-TOF. L’empreinte protéique ainsi générée permet d’avoir une probabilité d’identi�cation et n’est pas adaptée à l’antibiogramme. Pour surmonter ces limita-tions, une approche triple quadripôle en mode SRM a été proposée couplée à une séparation chromatographique classique. La méthode employée fait intervenir soit une hydrolyse trypsique de colonies ou d’échantillons primaires. Cette approche a été appliquée à l’étude de Staphylococcus aureus et permet notam-ment de con�rmer de manière non ambiguë ce dernier, d’évaluer le typage par l’intermédiaire de la protéine A, la résistance à la méticilline grâce à la détection de la protéine liant la pénicilline 2a et la virulence grâce à la détection de la Panton-Valentin leucocidine. Ce type d’analyse ciblée et multiplexée grâce aux capacités du mode SRM permettent d’envisager de couvrir de nouvelles applications cliniques dans un futur proche.

Pour conclure la session 6, Jérôme Chenau du CEA à Saclay est venu nous démontrer que l’utilisation de la spectrométrie de masse pouvait être utile dans la détection sensible et spéci�que des spores de la bactérie pathogène Bacillus anthracis (Ba) et dans la recherche de nouveaux marqueurs. Bien qu’il existe déjà un biomarqueur (un isoforme particulier de la protéine SASP-B) permettant de discriminer les spores de Ba des autres bactéries de la famille cereus, ce dernier est encore trop peu sensible. Pour pallier ce problème, une approche originale a été utilisée. Après avoir isolé spéci�quement les spores de leur environnement souvent complexe par immunocapture, permettant ainsi de gagner en sensibilité, la détection des di�érentes isoformes de la protéine SASP-B a été faite par spectrométrie de masse en mode SRM. La limite de détection a pu être abaissée jusqu’à 103 spores/mL de lait ou 10 mg de terre, atteignant ainsi les niveaux de dose infectieuse minimum (ID50 : 104 spores inhalées). Suivant le même raisonne-ment, J. Chenau et son équipe ont tenté d’identi�er de nouvelles protéines a�n d’avoir une combinaison de biomarqueurs permettant de discriminer Ba des autres souches sans ambiguïté. En utilisant 13 souches di�érentes, ils ont ainsi pu mettre en évidence 8 isoformes protéiques di�érents dont 3 protéines SASPs et 5 nouvelles protéines. En étendant la cohorte de 13 à 38 souches, deux marqueurs ont pu être éliminés renforçant ainsi la spéci�cité des 6 isoformes restantes. Cette stratégie innovante nous démontre toute l’utilité que peut avoir la spectrométrie de masse en bactériologie et dans la recherche spéci�que et sensible d’agents pathogènes.

En conclusion, cette session a mis en évidence les dernières avancées en matière d’analyse protéomique avec de puissants outils permettant de répondre à de nombreuses questions biologiques complexes.


page 20

précis et bien déterminés.

Yannick Charretier de bioMérieux à Marcy l’Etoile nous a présenté la caractérisation des microorganismes en mode « SRM » pour une future utilisation en clinique. La protéo-mique vient de délivrer sa première application clinique de routine en microbiologie grâce à l’identi�cation de micro-organismes par MALDI-TOF. L’empreinte protéique ainsi générée permet d’avoir une probabilité d’identi�cation et n’est pas adaptée à l’antibiogramme. Pour surmonter ces limitations, une approche triple quadripôle en mode SRM a été proposée couplée à une séparation chromatogra-phique classique. La méthode employée fait intervenir soit une hydrolyse trypsique de colonies ou d’échantillons primaires. Cette approche a été appliquée à l’étude de Staphylococcus aureus et permet notamment de con�r-mer de manière non ambiguë ce dernier, d’évaluer le typage par l’intermédiaire de la protéine A, la résistance à la méticilline grâce à la détection de la protéine liant la pénicilline 2a et la virulence grâce à la détection de la Panton-Valentin leucocidine. Ce type d’analyse ciblée et multiplexée grâce aux capacités du mode SRM permettent d’envisager de couvrir de nouvelles applications cliniques dans un futur proche.

Pour conclure la session 6, Jérôme Chenau du CEA à Saclay est venu nous démontrer que l’utilisation de la spectrométrie de masse pouvait être utile dans la détec-tion sensible et spéci�que des spores de la bactérie patho-gène Bacillus anthracis (Ba) et dans la recherche de nouveaux marqueurs. Bien qu’il existe déjà un biomar-

queur (un isoforme particulier de la protéine SASP-B) permettant de discriminer les spores de Ba des autres bactéries de la famille cereus, ce dernier est encore trop peu sensible. Pour pallier ce problème, une approche originale a été utilisée. Après avoir isolé spéci�quement les spores de leur environnement souvent complexe par immunocapture, permettant ainsi de gagner en sensibilité, la détection des di�érentes isoformes de la protéine SASP-B a été faite par spectrométrie de masse en mode SRM. La limite de détection a pu être abaissée jusqu’à 103 spores/mL de lait ou 10 mg de terre, atteignant ainsi les niveaux de dose infectieuse minimum (ID50 : 104 spores inhalées). Suivant le même raisonnement, J. Chenau et son équipe ont tenté d’identi�er de nouvelles protéines a�n d’avoir une combinaison de biomarqueurs permettant de discriminer Ba des autres souches sans ambiguïté. En utilisant 13 souches di�érentes, ils ont ainsi pu mettre en évidence 8 isoformes protéiques di�érents dont 3 protéines SASPs et 5 nouvelles protéines. En étendant la cohorte de 13 à 38 souches, deux marqueurs ont pu être éliminés renforçant ainsi la spéci�cité des 6 isoformes restantes. Cette stratégie innovante nous démontre toute l’utilité que peut avoir la spectrométrie de masse en bacté-riologie et dans la recherche spéci�que et sensible d’agents pathogènes.

En conclusion, cette session a mis en évidence les dernières avancées en matière d’analyse protéomique avec de puissants outils permettant de répondre à de nombreuses questions biologiques complexes.

Session : « Protéomique et santé » (suite)Jérôme Lacombe


page 21

Session : « Signalisation»Valérie Ro�dal

Avant toute chose, je tiens à remercier la SFEAP de m'avoir accordé une bourse afin de pouvoir assister au congrès SMAP 2011, qui s’est tenu du 19 au 22 septembre au Centre des Congrès du Palais des Papes à Avignon.

Ce compte-rendu porte sur la session « Signalisation » du mercredi après-midi. Cette session a débuté par la conférence de Sacha Baginsky, de l’Université Martin Luther de Halle (Allemagne), nous démontrant l’utilité des outils de protéomique fonctionnelle pour la caractérisa-tion du protéome des organites cellulaires d'Arabidopsis thaliana et du riz, avec un accent sur les plastides spéci-�ques des plantes. L’analyse du protéome d'A. thaliana a fourni des informations sur le génome (protéogénomique). Ces informations ont été implémen-tées dans les bases de données, comme pep2pro. Le phosphoprotéome du chloroplaste a également été analysé et sa dynamique caractérisée au cours d'un cycle circadien par des méthodes classiques de phosphoprotéo-mique : séparation des phosphopeptides par chromato-graphie échangeuse de cations (SCX), enrichissements soit sur colonne de dioxyde de titane (TiO2), soit par IMAC et quanti�cation par Label-free. Cela a permis d'évaluer la régulation à court terme du protéome du chloroplaste en réponse aux signaux environnementaux. Ensuite, s’en sont suivies des expériences comparatives quantitatives entre du matériel de type sauvage et mutant kinase STN8 a�n de caractériser les liens kinase/substrat. La phosphorylation di�érentielle des protéines a été évaluée par la quanti�ca-tion relative avec les ions extraits du chromatogramme (XIC).

Sonia Hem, du laboratoire de Protéomique Fonction-nelle à l’INRA de Montpellier, nous a présenté une approche par MRM pour quanti�er les familles multigé-niques de transporteurs (transportome) présents sur la membrane plasmique d’Arabidopsis thaliana. Le choix de la stratégie ciblée MRM permet d’allier à la fois une grande spéci�cité, une sensibilité accrue et la possibilité d’établir une quanti�cation absolue. Néanmoins, l’homologie entre les membres d’une même famille de transporteurs, surtout lorsqu’ils sont membranaires, rend très di�cile la sélection des peptides protéotypiques potentiels. Ainsi, sur 28 transporteurs étudiés, un seul peptide par transporteur a pu être sélectionné. Ces peptides ont ensuite été synthéti-sés en version lourde. Di�érents paramètres de réglage en spectrométrie de masse en mode MRM ont été déterminés pour chacun d’eux (potentiel de déclusterisation, énergie de collision, et dwell time) avant de passer à l’analyse biologique. Cette approche MRM, spéci�que et très sensible, a permis une quanti�cation absolue de 20 transporteurs et l’identi�cation de réponses spéci�ques des di�érentes isoformes, suite à un stress salin, Cette même approche a également prouvé son e�cacité pour la quanti�cation des états de phosphorylation sans passer par un enrichissement en phosphopeptides. Au �nal, cette étude utilisant la technologie MRM est la première

approche protéomique ciblée de familles multigéniques de plantes et rend accessible de nombreuses ressources réutilisables comme les peptides synthétiques ou encore les transitions et les conditions de détection associées.

Frank Vandermoere, de l’Institut de Génomique Fonctionnelle de Montpellier, a continué cette session en abordant l’intérêt de l’utilisation de la phosphoprotéo-mique quantitative par SILAC dans le cas de la signalisation du récepteur à la sérotonine 5-HT2A. En e�et, les travaux présentés ont montré une réponse di�érente associée au récepteur en fonction du ligand agoniste (hallucinogène comme le LSD versus non-hallucinogène comme le lisuride). Ces deux réponses pourraient s’expliquer par une phosphorylation di�érentielle du récepteur mais égale-ment d’autres protéines e�ectrices. Ainsi, le phosphopro-téome transitoire des cellules exprimant le récepteur 5-HT2A a été comparé sous trois conditions: pas de stimu-lation, exposition à un agoniste hallucinogène (DOI) ou non hallucinogène (lisuride). L’étude des phosphorylations di�érentielles a suivi un protocole de lyse cellulaire, trypsi-nolyse, puis fractionnement des peptides sur colonne HILIC et enrichissement sur IMAC, pour �nir par une identi-�cation et quanti�cation par SILAC en spectrométrie de masse (LTQ Orbitrap). De cette analyse, 5996 phosphopep-tides ont été identi�és, avec environ 80 % qui ont pu être quanti�és et 454 sites di�éremment phosphorylés entre l’exposition au DOI ou au lisuride. La phosphorylation de la sérine en position 280 du récepteur a été plus particulière-ment mise en cause, car elle se situe dans une région qui est impliquée dans la désensibilisation du récepteur, ce qui a été con�rmé par une expérience de mutagenèse dirigée de cet acide aminé. Il en résulte que l'exposition aux substances hallucinogènes induit une désensibilisation des récepteurs moins prononcée que l'exposition à des agonistes non-hallucinogènes. Cette analyse phosphopro-téomique a permis de mettre en évidence des voies de phosphorylation di�érentes expliquant un comportement distinct des agonistes du récepteur 5-HT2A.

Toujours dans le domaine de la phosphoprotéomique, Jordane Biarc, de l’Université de Californie à San Francisco, nous a présenté son travail sur l'induction des phospho-rylations sur les résidus sérine ou thréonine des protéines de cellules de phéochromocytome de rat PC12 (modèle de di�érenciation neuronale). Le récepteur tyrosine kinase TrkA, activé par la �xation du NGF (Nerve Growth Factor), joue un rôle majeur dans la di�érenciation et la survie des neurones du système nerveux périphérique et central. Après la stimulation des cellules PC12 par le NGF, TrkA subit une autophosphorylation des tyrosines permettant l'activation des voies de signalisation en aval, caractérisées par une seconde vague de phosphorylation des protéines ciblant les résidus sérine et thréonine. Les tyrosines Y490 et Y785 du récepteur jouent un rôle particulièrement impor-tant dans ces événements. Pour s’a�ranchir de la réponse associée à p75NTR (autre récepteur du NGF) ou aux TrkA

Congrès SMAP, Avignon natifs, des récepteurs chimériques PDGFR (partie extracellulaire)/TrkA (parties transmembranaire et intracellulaire) ont été transfectés stablement dans les cellules PC12. Cette étude a permis de montrer des changements quantitatifs sur certaines protéines déjà connues dans les voies de signalisation de TrkA, démontrant la spéci�cité de la méthode, ainsi que de nouvelles entités modi�ées. Cette analyse di�éren-tielle a été réalisée par marquage métabolique (SILAC) ; les digestats trypsiques ont été enrichis en phosphopeptides par TiO2 puis fractionnés sur colonne SCX avant d'être identi�és et quanti�és en spectrométrie de masse. Trois types de modi�cations ont été observées: celles dépendantes uniquement de la mutation Y490 ou Y785, et celles non dépendantes de ces mutations. Cette dernière suggère une activation par la phosphorylation d'autres acides aminés intracellulaires de TrkA.

La session « Signalisation » s’est achevée sur l’étude et la mise en évidence d’une modi�cation post-tra-ductionnelle moins courante: la sulfatation, présentée par Sonia Cantel, de l’Institut des Biomolécules Max Mousseron à Montpellier. La sulfatation se présente sur les résidus tyrosine des protéines membra-naires et des protéines secrétées. Bien que seul 1% des résidus tyrosines des protéines totales d'un organisme peut être sulfaté, cette modi�cation semble intervenir dans la régulation des interactions protéine/protéine ou peptide/protéine. L’étude du « sulfoprotéome » est essentiellement e�ectuée en MALDI-TOF. Cependant, les groupements sulfates sont perdus en mode positif. Il nous a été décrit ici l’utilisation d’une petite molécule de synthèse (PMG) de masse 273,1 kDa qui se lie de façon non covalente aux sulfo-peptides et permet la détection des peptides mono- et polysulfatés. Sonia Cantel nous a démontré l’utilité de ce PMG pour détecter des peptides intacts en MALDI-TOF en mode positif en utilisant le ré�ectron. De plus, lors de la fragmentation MS/MS, une perte spéci�que de PMG-SO3 conduit à une di�érence de masse de 353,1 kDa. Ainsi, le PMG a la propriété d’augmenter la sensibilité de détec-tion des sulfo-peptides et son couplage à la technologie MALDI-TOF en mode ré�ectron apparaît comme une méthode de choix pour l’étude et la caractérisation structurale des protéines sulfatées.

page 22

natifs, des récepteurs chimériques PDGFR (partie extracellulaire)/TrkA (parties transmembranaire et intracel-lulaire) ont été transfectés stablement dans les cellules PC12. Cette étude a permis de montrer des changements quantitatifs sur certaines protéines déjà connues dans les voies de signalisation de TrkA, démontrant la spéci�cité de la méthode, ainsi que de nouvelles entités modi�ées. Cette analyse di�érentielle a été réalisée par marquage métabo-lique (SILAC) ; les digestats trypsiques ont été enrichis en phosphopeptides par TiO2 puis fractionnés sur colonne SCX avant d'être identi�és et quanti�és en spectrométrie de masse. Trois types de modi�cations ont été observées: celles dépendantes uniquement de la mutation Y490 ou Y785, et celles non dépendantes de ces mutations. Cette dernière suggère une activation par la phosphorylation d'autres acides aminés intracellulaires de TrkA.

La session « Signalisation » s’est achevée sur l’étude et la mise en évidence d’une modi�cation post-traductionnelle moins courante: la sulfatation, présentée par Sonia Cantel, de l’Institut des Biomolécules Max Mousseron à Montpel-lier. La sulfatation se présente sur les résidus tyrosine des

protéines membranaires et des protéines secrétées. Bien que seul 1% des résidus tyrosines des protéines totales d'un organisme peut être sulfaté, cette modi�cation semble intervenir dans la régulation des interactions protéine/protéine ou peptide/protéine. L’étude du « sulfoprotéome » est essentiellement e�ectuée en MALDI-TOF. Cependant, les groupements sulfates sont perdus en mode positif. Il nous a été décrit ici l’utilisation d’une petite molécule de synthèse (PMG) de masse 273,1 kDa qui se lie de façon non covalente aux sulfo-peptides et permet la détection des peptides mono- et polysulfatés. Sonia Cantel nous a démontré l’utilité de ce PMG pour détecter des peptides intacts en MALDI-TOF en mode positif en utilisant le ré�ectron. De plus, lors de la fragmentation MS/MS, une perte spéci�que de PMG-SO3 conduit à une di�érence de masse de 353,1 kDa. Ainsi, le PMG a la propriété d’augmenter la sensibilité de détection des sulfo-peptides et son couplage à la technologie MALDI-TOF en mode ré�ectron apparaît comme une méthode de choix pour l’étude et la caractérisation structurale des protéines sulfatées.


Session : « Signalisation»Valérie Ro�dal

page 23

La conférence plénière donnée par Seth Grant du Wellcome Trust Sanger Institute de l’université de Cambridge portait sur l’organisation du protéome des synapses. Une meilleure connaissance de l’origine et de l’évolution du répertoire comportemental ainsi que des synapses, permettrait de mieux comprendre l’origine de certaines maladies mentales. L’approche combinée de la protéomique et de la génomique a permis d’étudier l’évolution de la densité post-synaptique (PSD), de la protéine MAGUK (membrane-associated guanylate kinase) et des complexes MASC (MAGUK-associated signaling complexes) à la base de l’apprentissage et de la mémoire. En e�et, des mutations de MASC et PSD sont impliquées dans de nombreuses maladies génétiques mendéliennes neurologiques et psychiatriques. La caractérisation protéo-mique de MASC par ‘Targeted Tandem A�nity Puri�cation’ chez les mammifères a aboutit à l’identi�cation de 200 protéines des complexes synaptiques, et 1200 pour l’étude de la PSD. Parmi les 600 protéines présentes dans les synapses de mammifères, 50 % sont présentes également dans les synapses des invertébrés et 25 % d’entre elles le sont chez les êtres unicellulaires. Au cours de l’évolution, deux périodes de complexi�cation croissante de la structure fonctionnelle des synapses, auraient permis aux animaux d’évoluer vers des cerveaux de plus en plus complexes.

La conférence plénière de la matinée du jeudi 22 Septembre, présentée par Olga Vitek, du département de statistique et de génie informatique de l’université de Purdue aux Etats-Unis, a été dédiée à l’utilisation des méthodes statistiques dans des analyses de protéomique quantitative. Après avoir rappelé les di�érentes stratégies d’analyses protéomiques quantitatives actuelles, elle a montré que ces analyses ne permettent pas d’obtenir des résultats reproduc-tibles et précis si une attention particulière n’est pas apportée au plan expérimental.Le plan expérimental dé�nit chaque étape de l’expérience et permet d’améliorer la reproductibilité des résultats (en minimisant les biais) ainsi que l’e�cacité de l’analyse statistique (en minimisant la variance). Pour cela il faut suivre trois principes fondamentaux : 1/ Réplication : Les analyses répétées d’échantillons (répétitions techniques ou biologiques) ont pour objectif de permettre une estimation de la variabilité qui n'est pas liée aux outils d’analyses et ainsi d'augmenter la précision de l’expérience. 2/ Randomisation: c'est-à-dire la sélection et l’analyse aléatoire des réplicats biologiques et techniques a�n d’éliminer les erreurs systématiques. 3/ Blocking : Il a pour but, comme la répétition, d'augmenter la précision de l'expérience. Lorsque des sources de variations

indésirables sont connues mais ne peuvent pas être éliminées, il est préférable de les prendre en compte. Pour cela il faut créer des blocs d’échantillons à comparer entre eux : par exemple dans les cas d’individus avec des caractéristiques similaires (âge, sexe) ou d’échantillons analysés le même jour.Elle a ensuite présenté un modèle statistique permettant d’augmenter la sensibilité, la spéci�cité et la précision d’une analyse quantitative. Dans ce modèle, tous les signaux LC-MS attribués à une protéine sont considérés comme des réplicats de mesure de l’abondance d’une protéine. Ils sont transformés en logarithme et normalisés a�n de discriminer les véritables variations biologiques des variations artéfactuelles puis ils sont soumis à une analyse de variances (ANOVA). En�n, elle a conclu en insistant sur l’importance de travailler en concertation avec des statisticiens à chaque étape du plan expérimental.


Conférence Plénière de Seth GrantSandra Reinier et Laëtitia Théron

Conférence Plénière d'Olga VitekChrystelle Lacroix et Karima Chaoui

page 24

La dernière session de ce congrès a été consacrée à la bioinformatique, domaine devenu incontournable en protéomique haut débit. En e�et, ces 20 dernières années ont vu des progrès croissants dans la sensibilité, la résolu-tion et la vitesse de séquençage des instruments de spectrométrie de masse. Ces développements se sont accompagnés par la génération de données de plus en plus complexes nécessitant des outils bioinformatiques dédiés à l’analyse de ces données protéomiques. Dans cette optique, les deux premiers orateurs de la session nous ont présentés leurs outils bioinformatiques dédiés à ces analyses.

Oliver Kohlbacher du centre de bioinformatique de l’université de Tübingen en Allemagne, a ainsi participé à l’élaboration d’un logiciel polyvalent et convivial (en accès libre) permettant la création rapide de work�ow en protéomique : OpenMS/TOPP (The OpenMS Proteomics Pipeline). Il s’agit d’un pipeline dédié à l’analyse des données qui permet de créer facilement des work�ows d’analyses en assemblant di�érents modules. Ces modules peuvent être classés en di�érentes catégories : l’import/export, le traitement du signal (réduction de la ligne de base ou du bruit) et l’identi�cation. Pour ce dernier module, il est possible d’utiliser plusieurs moteurs de recherche (Mascot, Sequest, OMSSA, X!Tandem…) et ainsi d’obtenir des identi�cations et scores consensus. Deux modules supplémentaires sont dédiés à la quanti�-cation et l’analyse des données. Open MS TOPP inclut également des outils de visualisation la création des work�ows (TOPPAS : TOPP Pipeline Assistant) et les données MS (TOPPView).

Dans la conférence suivante, Christine Carapito, du laboratoire de Spectrométrie de Masse Bioorganique de Strasbourg, nous a présenté l’interface MSDA (Mass Spectrometry Data Analysis) développé à l’IPHC (Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien). Il s’agit d’une suite logicielle bâtie sur des logiciels libres qui a été adaptée sur une grille de calcul. Cette approche permet de répondre au besoin croissant de puissance de calcul nécessaire à l’interprétation des données MS/MS. Cette interface permet notamment de lancer des requêtes OMSSA (Open Mass Spectrometry Search Algorithm) sur des données MS/MS générées sur tous types de plateformes LC-MS/MS. L’adaptation d’OMSSA sur la grille de calcul permet à la fois un gain en temps et un résultat d’identi�cation de protéines plus �able. Bientôt cette interface logicielle permettra également d’accéder à des annotations fonctionnelles sur les protéines identi�ées et de réaliser du séquençage de novo (PepNovo). A�n d’utiliser cette interface, il su�t de se connecter au site https://msda.u-strasbg.fr/ puis de demander un accès.

Au cours de cette session, les problématiques liées à l’analyse à grande échelle des modi�cations post-traduc-tionnelle ont également été abordées. En e�et, ces études conduisent souvent à des incertitudes d’assignement des

sites de modi�cations et notamment des phosphoryla-tions lorsque les phosphosites sont voisins.

Dans cette problématique, Markus Müller, de l’Institut Suisse de Bioinformatique à Genève, nous a présenté un outil, nommé QuickMod pour l’identi�cation et la localisa-tion des phosphorylations. Cet outil basé sur l’utilisation d’une librairie de spectres MS/MS, par opposition aux banques de données classiques qui utilisent des spectres MS/MS théoriques. Les spectres des peptides non modi�és présentent une forte similarité avec leurs homologues modi�és, QuickMod utilise cette caractéristique et a ainsi été développé pour utiliser une librairie de spectres de peptides non modi�és pour identi�er les peptides modi-�és. Un algorithme permettant de localiser les sites de modi�cations a également été développé.

Pour �nir, Benoît Valot, de la Plateforme d'Analyse Protéomique de Paris Sud-Ouest (PAPPSO), a présenté, dans une première partie, un nouvel algorithme de regrou-pement pour gérer l’identi�cation des protéines dans les analyses de protéomique « bottom-up » à haut débit. Cet algorithme a plusieurs avantages, il permet d’éliminer les protéines redondantes (grâce à l’utilisation d’une seconde étape de regroupement au lieu d’une seule classiquement utilisée), d’avoir accès aux peptides communs et spéci-�ques de chaque sous-groupe et de regrouper des protéines par fonction. Dans une deuxième partie, un algorithme de regroupement des modi�cations post-tra-ductionnelles a été détaillé. Dans les analyses de protéo-mique à haut débit, les modi�cations post-traduction-nelles peuvent être identi�ées dans plusieurs spectres MSMS. Classiquement, les moteurs de recherche analysent séparément chaque spectre pouvant conduire à des résultats contradictoires suivant la qualité du spectre analysé. L’algorithme présenté par Benoît Valot pallie ces problèmes en regroupant l'ensemble des spectres MS/MS correspondant à une même modi�cation (Par exemple, dans le cas de l’étude de phosphorylations, il y a création d’îlots de phosphorylations correspondant à des segments de protéines contenant des sites de phosphorylations). Par la suite di�érentes stratégies peuvent être menées a�n de localiser plus précisément le site de modi�cation. Ces deux algorithmes ont été implémentés dans le logiciel open source X !Tandem et peuvent être téléchargés et installés à l’adresse http://pappso.inra.fr/bioinfo/xtandempipeline/.


Session : « BioinformatiqueChrystelle Lacroix et Karima Chaoui

page 25

Conférence Plénière de Virginie BrunChrystelle Lacroix et Karima Chaoui

Virginie Brun, du laboratoire d’Etude de la Dynamique des Protéomes de Grenoble, nous a présenté le concept de la méthodologie PSAQ™ (Protein Standard Absolute Quanti�cation) ainsi que de récentes applications cliniques de cette méthode. Cette stratégie de quanti�-cation absolue de protéines a été développée en 2007 par l’équipe de Virginie Brun et utilise comme étalons internes des protéines recombinantes entières synthéti-sées in vitro en système « Cell-Free », ajoutés préalable-ment à tout traitement de l’échantillon (préfractionnement, digestion enzymatique...). La validité de cette approche a été démontrée par compa-raison avec les approches de quanti�cation absolue préexistantes utilisant des standards peptidiques ou polypeptidiques isotopiquement alourdis, les stratégies AQUA et QconCAT. En e�et, la méthode PSAQ™ s’est avérée beaucoup plus robuste et juste pour le dosage de toxines superantigéniques de Staphylococcus aureus dans des échantillons urinaires, que les méthodes concurrentes. Contrairement aux standards peptidiques, l’utilisation de ces étalons internes PSAQ™ ajoutés avant la digestion de l’échantillon, présente l’avantage de s’a�ranchir de tout biais dû au processus analytique ou à une digestion trypsique incomplète. Le fait de prendre en compte les rendements des étapes de pré-fraction-

nement, de décomplexi�cation et de digestion trypsique, rend cette stratégie particulièrement attrac-tive pour la quanti�cation de biomarqueurs protéiques de faible abondance dans des échantillons biologiques complexes tels que les �uides biologiques. Dans cette optique, la combinaison de la stratégie PSAQ™ avec la SRM (Selected Reaction Monitoring) a été testée pour la quanti�cation de biomarqueurs cardiovasculaires cliniquement validés, dans des échantillons de sérum. Il a ainsi été montré la compatibilité de l’approche PSAQ™ avec des quanti�cations multiplexes. En e�et, dans des échantillons cliniques provenant de patients atteints d’infarctus du myocarde, la quanti�cation de ces biomarqueurs a donné des résultats très précis et bien corrélée à un dosage ELISA. Sa grande spéci�cité, sa précision et sa compatibilité avec des quanti�cations multiplexes font de la méthode PSAQ™ une stratégie de choix pour la quanti�cation à grande échelle de biomar-queurs dans des échantillons cliniques préfractionnés.

Nous tenons à remercier la Société Française d’Electrophorèse et d’Analyse Protéomique, de nous avoir accordé une bourse afin de pouvoir assister au congrès SMAP qui a eu lieu à Avignon du 19 au 22 Septembre 2011.

Conférence de clôture Pierre Chaurand

La conférence de clôture donnée par Pierre Chaurand du

département de chimie de l’Université de Montréal portait sur l’Imagerie MALDI.

Dans un premier temps, le principe et l’état de l’art de cette technologie ont été présentées par Pierre Chaurand. Il nous a montré que cette nouvelle technologie basée sur la spectrométrie de masse permettait de cartographier les compo-sés biologiques et les xénobiotiques directement dans les �nes couches de tissus. Il nous a montré les deux modes principaux qui o�rent des pro�ls moléculaires ou des images moléculaires. Il nous a présenté une étude portant sur la strati�cation de gliomes humains. Il est ainsi possible de distinguer les cellules tumorales et non tumorales au sein du même tissu.

De nombreuses techniques de dépôt de matrice ont été développées et automatisées : spray enduisant, faisceau de gouttes haute densité, sublimation ou séchage enduisant. Un échantillon très usuel en histopathologie est le tissu para�né �xé au formol. Pierre Chaurand nous a montré qu’il était possible de faire une comparaison exacte du même tissu entre les techniques usuelles de coloration et l’imagerie. Pour l’imagerie MALDI, ces échantillons nécessitent une hydrolyse trypsique puis la matrice est éliminée et les échantillons peuvent ensuite être colorés pour pratiquer la technique usuelle.

Dans un second temps, Pierre Chaurand nous a présenté les champs d’applications de cette technologie depuis son avènement en 1997 et les avancées futures. La recherche pharmaceutique béné�cie de la spéci�cité et de la sensibilité de la technique pour avoir un aperçu de la pharmacodynamie.

Les études métaboliques ont été entreprises avec succès et notamment dans l’investigation sur la biotechnologie des plantes.

La médecine clinique possède maintenant un autre outil puissant d’investigation dans la découverte de biomarqueurs pour la prévention des maladies.

Les futurs challenges vont impliquer, l’amélioration de la sensibilité et de la spéci�cité pour cibler chimiquement in situ, la vitesse d’acquisition pour l’imagerie de corps entier, le pré-traitement et les analyses statistiques des données et l’identi�cation et la quanti�cation absolu des analytes. Des avancées technologiques continues ont été menés jusqu’au récent développement d’optique et de laser ayant une taille de spot aussi petite que 10µm. Cela nous promet l’emploi futur de l’imagerie MALDI à l’échelle d’une cellule unique o�rant de nouvelles opportunités dans le domaine de l’imagerie microbienne et de la protéomique.


Conférence de cloture de Pierre ChaurandJérôme Lacombe

La conférence de clôture donnée par Pierre Chaurand du département de chimie de l’Université de Montréal portait sur l’Imagerie MALDI.

Dans un premier temps, le principe et l’état de l’art de cette technologie ont été présentées par Pierre Chau-rand. Il nous a montré que cette nouvelle technologie basée sur la spectrométrie de masse permettait de cartographier les composés biologiques et les xénobio-tiques directement dans les �nes couches de tissus. Il nous a montré les deux modes principaux qui o�rent des pro�ls moléculaires ou des images moléculaires. Il nous a présenté une étude portant sur la strati�cation de gliomes humains. Il est ainsi possible de distinguer les cellules tumorales et non tumorales au sein du même tissu.

De nombreuses techniques de dépôt de matrice ont été développées et automatisées : spray enduisant, faisceau de gouttes haute densité, sublimation ou séchage enduisant. Un échantillon très usuel en histopathologie est le tissu para�né �xé au formol. Pierre Chaurand nous a montré qu’il était possible de faire une comparaison exacte du même tissu entre les techniques usuelles de coloration et l’imagerie. Pour l’imagerie MALDI, ces échantillons nécessitent une hydrolyse trypsique puis la matrice est éliminée et les échantillons peuvent ensuite être colorés pour pratiquer la technique usuelle.

Dans un second temps, Pierre Chaurand nous a présenté

les champs d’applications de cette technologie depuis son avènement en 1997 et les avancées futures. La recherche pharmaceutique béné�cie de la spéci�cité et de la sensibilité de la technique pour avoir un aperçu de la pharmacodynamie.

Les études métaboliques ont été entreprises avec succès et notamment dans l’investigation sur la biotechnologie des plantes.

La médecine clinique possède maintenant un autre outil puissant d’investigation dans la découverte de biomar-queurs pour la prévention des maladies.

Les futurs challenges vont impliquer, l’amélioration de la sensibilité et de la spéci�cité pour cibler chimique-ment in situ, la vitesse d’acquisition pour l’imagerie de corps entier, le pré-traitement et les analyses statistiques des données et l’identi�cation et la quanti�cation absolu des analytes. Des avancées technologiques continues ont été menés jusqu’au récent développement d’optique et de laser ayant une taille de spot aussi petite que 10µm. Cela nous promet l’emploi futur de l’imagerie MALDI à l’échelle d’une cellule unique o�rant de nouvelles opportunités dans le domaine de l’imagerie microbienne et de la protéomique.

page 26


Prix SMAP 2011

A l’issue du congrès SMAP2011, six prix ont été décernés par un jury composé de Mme Julia Chamot-Rooke, Mr Philippe Dugourd, Mr Marc Bonneu, et Mr

Philippe Marin.

Catégorie « Meilleures communications orales sélec-tionnées parmi les étudiants en thèse »

• Prix Veolia Waters STI “ELGA” sous la forme d’un chèque de 250 € :

Gérémy Clair [O32] System biology insights into the global remodeling of proteome and pathogenicity of Bacillus cereus induced by oxydoreduction potential.

• Prix SMAP sous la forme d’un chèque de 250 € :

Joseph Gault [O37] Post Translational Modi�cations and Pathogenesis of Bacterial Meningitis: Is a «one shot» Approach for Complete Mapping Realistic?

Catégorie « Meilleures communications sous forme poster parmi les étudiants, post-doctorants, et ingénieurs »

• 4 Prix SMAP sous la forme d’un chèque de 150 € chacun:

Karima Chaoui [P163] Microenvironnement et cancer du sein : analyse protéomique du sécrétome d’adipocytes cocultivés en présence de cellules tumorales.

Julien Peltier [P142] Contribution of Isotopic Mass Spectrometry to Pro�ling protein Changes in Colorectal Cancer disease (CRC).

Stéphanie Petiot [P205] Le couplage Mobilité Ionique - Spectrométrie de Masse (IM-MS) pour le suivi de change-ments conformationnels induits par la �xation d’un ligand sur une cible protéique.

Vincent Guérineau [P52] Identification de substrats d’enzymes de modi�cation des ARN par spectrométrie de masse MALDI-TOF et MALDI-TOF/TOF.

De gauche à droite : Mme Julia Chamot-Rooke, Mr Joseph Gault, Mr Gérémy Clair, Mr Jean Armengaud

page 27

Compte-rendu Université d'été Dubrovnik 2011Sarah Lennon

Tout d’abord, je tiens à remercier vivement la SFEAP de m’avoir accordé une bourse pour assister à la 5ème école d’été de Dubrovnik en Croatie.

Cette école s’est tenue du dimanche 3 au samedi 9 juillet à l’université de Dubrovnik et a rassemblé une cinquan-taine de participants autour du thème de la spectrométrie de masse en biotechnologie et médecine. Les participants étaient majoritairement issus de di�érents pays européens. Nous étions trois étudiants français. Tout au long de cette semaine, 29 cours ont été dispensés par 16 professeurs et 5 intervenants industriels. Par ailleurs, j’ai eu l’occasion de présenter les résultats obtenus au cours de ma première année de thèse.

Après un mot d’accueil de la présidente de l’organisation, Jasna Peter-Katalinic, de l’université de Rijeka en Croatie, nous avons eu la possibilité de suivre une conférence plénière réalisée par Jane Thomas Oates, de l’université de York en Angleterre. Cette conférence nous a montré l’apport important de la spectrométrie de masse pour des études archéologiques. Ainsi, les échantillons d’os fossilisés sont susceptibles de contenir des protéines, dont l’analyse de la séquence permettrait d’identi�er l’organisme d’origine et dans le cadre d’organismes éteints, de révéler des liens de parenté entre di�érentes espèces. La protéomique par spectrométrie de masse s’avère ici être un instrument de choix pour l’analyse de ces protéines. Dans le cadre de ces études, il faut surmonter plusieurs di�cultés. Tout d’abord, l’objet étudié étant très précieux, l’échantillonnage ne doit pas être destructif ou de très petite taille. Par ailleurs, il faut tenir compte des risques de contamination ainsi que de dégradation qui peuvent survenir. Dans ce contexte, le professeur Jane Thomas Oates, nous a montré l’intérêt de la source DESI qui permet de réaliser une désorption des composés de la surface de l’échantillon sans l’abîmer.

Le deuxième jour a été consacré à des cours de base sur la spectrométrie de masse : l’instrumentation : les di�érents types de sources et d’analyseurs, l’interprétation des spectres MS et MS/MS, les di�érents types de fragmenta-tion ECD, ETD, CID. Les cours ont été assurés par Yury Tsybin de l’Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, David R.

Goodlett de l’université de Washington, Jasna Peter-Katali-nic et Sergey Vakhrushev de l’université de Copenhague.

Au cours des jours suivants, nous avons pu suivre des cours abordant di�érents domaines de la protéomique :

• la préparation d’échantillons

• la puri�cation de protéines,

• l’analyse des protéines glycosylées (N- et O- glycosyla-tion) et des phosphoprotéines,

• les développements instrumentaux pour l’analyse protéomique

• l’imagerie par spectrométrie de masse pour l’analyse de tissus

• les applications cliniques de la spectrométrie de masse

• l’art et la manière de publier.

Ces cours étaient présentés par Jerry Thomas, de l’université de York, Harmut Schlüter de l’université d’Hambourg, Djuro Josic de l’université de Rijeka, Ron Heeren de l’université d’Amsterdam, Steven Levery de l’université de Copenhague, Laura Bindila, de l’université du Luxembourg, Manfred Wuhrer, de l’université de Leiden et Garry Corthals, de l’université de Turku.

Les cours présentant la préparation d’échantillon m’ont plus particulièrement intéressée. Ainsi, après avoir rappelé les di�cultés liées à la recherche de biomarqueurs et les di�érents écueils rencontrés, Djuro Josic a insisté sur l’importance de bien préparer l’échantillon. Il a ainsi présenté plusieurs techniques d’enrichissement d’un échantillon en protéines membranaires :

• L’utilisation d’anticorps monoclonaux immobilisés sur un lit magnétique avec une élution par des détergents ioniques ou non

• Les méthodes basées sur la chromatographie d’a�nité (biotinylation des protéines membranaires et chromato-graphie d’a�nité biotine/avidine)

• La chromatographie d’immunoa�nité

• L’enrichissement par la génération de microparticules, exosomes ou microvésicules. Ces vésicules sont émises de manière spontanée dans certaines conditions par la mem-brane plasmique et sont naturellement enrichies en protéines membranaires

Il a ensuite montré que les protéines membranaires étaient fréquemment modi�ées chez un patient malade. L’identi�cation de ces modi�cations post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, acétylation…) devrait permettre de découvrir de nouveaux biomarqueurs candi-dats potentiels.

Pour conclure, cette université d’été s’est avérée très enrichissante. En e�et, elle m’a permis de faire un point sur mes connaissances en spectrométrie de masse, de décou-vrir de nouveaux aspects de la protéomique mais aussi et surtout de rencontrer des chercheurs et étudiants issus de di�érents laboratoires européens.

Ecole d'été du Mass Spectrometry in Biotechnology & Medecine (MSBM 2011), Dubrovnik, Croatie

page 28

Compte-rendu Brixen 2011Lyna Sellami

Je suis Lyna Sellami, doctorante en deuxième année à la plateforme « protéomique et innovation technologique Timone » composante de Marseille protéomique au sein de la faculté de pharmacie de Marseille sous la direction du Dr Daniel Lafitte. J’ai assisté à la 5ème école d’été européenne de protéomique qui s’est tenue à Bressanone-Brixen dans le sud du Tyrol en Italie du 31 juillet au 06 aout 2011 grâce à une bourse octroyée par la société française d’électrophorèse et d’analyse protéomique (SFEAP).

Introduction

L’école qui s’est tenue au sein de l’ abbazia Novacella, regroupait approximativement quatre-vingts personnes. Les organisateurs eux-mêmes faisaient la navette entre la gare et l’abbaye à l’arrivée de chaque train pour nous récupérer. Après l’enregistrement, nous avons été conforta-blement installés deux personnes par chambre soit du même laboratoire, soit regroupées par pays. J’ai partagé la chambre avec une post doctorante de Montpellier Melle Iulia Blesneac, nous étions les seules participantes repré-sentant des laboratoires Français.

Les cours on été répartis en sessions : Gel-based Proteo-mics, MS-based Proteomics, modi�cations post traduction-nelles et recherche de biomarqueurs. A côté des cours, les participants (étudiants) devaient obligatoirement faire une présentation d’une durée d’une minute et qui consistait à présenter le but du travail sur un transparent A4 avant les sessions poster où il y eut beaucoup de discussions entre nous.

Des workshops ont également été organisés : (MaxQuant, interprétation de spectres (basique et avancé), Identi�cation des Protéines, SRM/MRM, modi�cations post traductionnelles (PTMs), MSE et ion mobility, électropho-rèse gel 2D, Quanti�cation et imagerie MALDI). Chaque étudiant devait choisir deux thèmes.

Tous les deux jours, des activités « extra protéomiques » étaient proposées incluant une randonnée pour tout le monde et des activités au choix : le rafting, l’escalade, le vélo en montagne, la visite guidée de la ville, une partie de football et une soirée spéciale dégustation de vins.

Cette semaine fut très béné�que pour moi pour complé-

ter les notions de base et approfondir mes connaissances dans l’éventail des techniques protéomiques proposées. Ceci m’a donc permis de faire une synthèse sur tout ce qui pourrait être entrepris et ré�échir à certaines approches qui pourraient être complémentaires pour mon propre travail. C’était aussi très béné�que pour la communication, l’évasion et la pratique de l’anglais.

Les cours et les présentations des compagnies

La session d’ouverture de l’école d’été a été proposée par le Pr. M. Mann elle portait la MS haute résolution dans la recherche en biologie, il détailla les étapes classiques utilisées en protéomique de la digestion des protéines à l’HPLC puis la spectrométrie de masse MS et MS/MS et en�n l’identi�cation des protéines. Il évoqua aussi quelques techniques de quanti�cation telle que l’AQUA et le SILAC avec ses avantages et inconvénients.

La première session fut consacrée au « gel based proteo-mics » qui a commencé par une présentation de T. Rabilloud sur les gels 2D et les approches quantitatives. Nous avons eu, ensuite, une présentation de D. Becher sur les aspects et applications de l’analyse par gel 2D. Elle détailla les techniques de visualisation des protéines sur gel en pré séparation (32P, 33S labelling,…etc) et en post séparation (coloration au nitrate d’argent) avec les paramètres à considérer tel que la gamme dynamique, les corrections à faire sur les gels après leur superposition pour une étude de protéomique comparative. Sa présentation con�rme la place toujours cruciale du gel 2D en protéo-mique.

Avant d’entamer la deuxième session, il y eut des présen-tations de compagnies telle que Waters, NonLinear, Loge et de Bruker par M. Becker qui introduit remarquablement l’imagerie MALDI, une technique qui m’intéresse particuliè-rement.

En ce qui concerne la session « MS based proteomics », la première présentation était assurée par C. Hubert sur les méthodes LC. La deuxième présentation était sur les méthodes de spectrométrie de masse par M. Shabaz orien-tée physique et instrumentation.

La troisième intervention fut assurée par J. Cottrell sur

l’identi�cation des protéines, il se focalisa sur Mascot. Sa présentation, très claire, m’a permis de comprendre certains détails auxquels je ne prêtais pas attention. Il récapitula les trois façons de faire de l’identi�cation : PMF, sequence query et la MS/MS, ensuite il détailla les paramètres de recherche et les di�érentes bases de données.

La dernière présentation de cette session était l’intervention de M. Bantsche� sur la quanti�cation MS, il expliqua les techniques H2O18, AQUA et label free.

Nous avons eu une présentation de la compagnie Thermo par K. Sche�er sur l’orbitrap avant d’entamer la session des modi�cations post traductionnelles par le Pr. O. Jensen avec des exemples sur l’identi�cation des phosphorylations.

La dernière session était consacrée au « clinical day » ou plutôt journée spéciale biomarqueurs en commençant par les techniques de protéomique pour la recherche de biomarqueurs par H. Steen, ou il exposa l’état d’avancement de son travail et ses essais sur la recherche de biomarqueurs de l’appendicite à l’hôpital pédiatrique de Boston.

Il y eut ensuite l’analyse de tissus par imagerie MALDI de A. Römpp, une présentation complémentaire de celle de M. Becker (Bruker), ou il détailla la préparation des échantillons ainsi que l’in�uence des solvants sur la cristallisation de la matrice. Il montra des images de coupes du côlon. Il a expliqué l’intérêt de cartographier des protéines car elles vont au delà de la frontière de la coloration histologique et de ce que l’œil humain peut distinguer. Il montra aussi des images à 7μm de résolution spatiale sur de petites molécules. Il termina sa présentation en parlant des dé�s qu’aura à surmonter l’imagerie MALDI si on veut qu’elle soit utilisée en routine dans la recherche clinque.

Miriam Böckmann nous a présenté son travail sur les réactions auto immunes et développement des maladies neurodégé-neratives. La technique qu’elle utilise dans sa recherche de biomarqueurs précoces de ces maladies est un système de puces à protéines (des anticorps) gre�és et qui servent à la recherche de protéine spéci�que « des autoantigènes » sur échantillons sanguins.

Oliver Pötz nous a présenté la capture de biomarqueurs par des anticorps d’un point de vue global. Ses diapositives étaient très explicites et ont bien détaillés le principe, il nous a fait rire à plusieurs reprises.

Une perspective épidémiologique a été donnée par Beate Pesch. Elle nous parla des méthodes de recherche de biomar-queurs précoces: du screening et l’identi�cation, la comparaison avec les contrôles approprié en liaison avec l’âge et le sexe tout en prenant en considération d’autres facteurs tels que les habitudes (fumeur ou non) et la validation des biomarqueurs par de longues cohortes.

Nous avons eu une présentation intéressante de l’application des technologies de la protéomique dans l’industrie pharmaceutique par H. Langent. Il a montré le rôle de la protéomique dans plusieurs étapes du développement d’un médica-ment tel que la compréhension des di�érences entre patients, l’identi�cation de la meilleure molécule, l’amélioration de la qualité des résultats…etc. Il a illustré sa présentation par un exemple sur le développement d’un inhibiteur de kinase en utilisant la quanti�cation MS (SILAC, ITRAQ et le label free)

La semaine fut clôturée par le Pr. Albert Heck qui a présenté le work�ow et les méthodes qu’ils développent en protéo-mique dans son laboratoire.

Les présentations sur transparent A4

Il y eut durant la semaine deux sessions de présentations d’une minute des travaux de chaque participant sur un transpa-rent A4 (retro projecteur) par ordre alphabétique: une première session pour les noms qui commencent par « A » jusqu'à « Ma » et la deuxième session pour les participants dont le nom commence par « Me » jusqu'à « Z ». Le but est qu’en une minute chrono, le travail de chaque participant ainsi que la raison pour laquelle on devrait visiter le poster dans la soirée devait être présenté. Il y avait un compte à rebours en projection, ceux qui dépassaient la minute se voyaient retirer leurs transparents d’une manière plutôt drôle. La pression se faisait sentir sur chacun de nous! Les deux sessions étaient espacées de deux jours. Ceux qui ont présenté au cours de cette dernière session ont TOUS �ni leurs présentations en moins d’une minute !

Les sessions poster

Les deux soirées posters étaient très interactives comme dans une vraie conférence. La salle était pleine où les participants, exposants et organisateurs discutaient ensemble autour d’un apéritif.

J’ai présenté une partie de mon travail au cours de la 2ème session, j’ai eu droit à plusieurs questions et de nombreuses discussions.

Les sessions posters étaient, à mon avis, aussi importante que les cours car chacun d’entre nous parlait de son approche en protéomique ce qui a crée un ensemble très diversi�é baignant dans une belle ambiance estudiantine.

Les workshops

Nous devions choisir deux workshops parmi dix (MaxQuant, interprétation de spectres (basique et avancé), Identi�cation des Protéines, SRM/MRM, modi�cations post traductionnelles (PTMs), MSE et ion mobility, électrophorèse gel 2D, Quanti�ca-tion et imagerie MALDI). J’avais choisi l’imagerie MALDI, technique que je commence à utiliser. Le workshop était assuré par M. Becker et A. Römpp. Malheureusement, j’étais la seule à l’avoir testée car les autres participants venaient pour découvrir ce qu’était l’imagerie MALDI et donc seulement les principes de base ont été abordés. Néanmoins, les explications ont permis de comprendre l’utilité de bien cibler les analyses pour ne pas se noyer dans une masse de données inutiles.

Mon deuxième workshop de la semaine portait sur « les modi�cations post traductionnelles » avec O. Jensen et M. Shabaz où plusieurs modi�cations post traductionnelles ont été abordées : phosphorylation, acétylation, méthylation et carbonyla-tion avec quelques di�cultés techniques telles que l’enrichissement des échantillons, l’analyse MS qui peut s’avérer di�cile surtout si la modi�cation est minoritaire, labile ou si elle supprime le signal MS.

Les activités extra protéomiques

La première activité était une randonnée commençant a Zanser Alm (1685 m d’altitude), elle a duré quatre heures et à chacun son rythme, les plus courageux (voir la photo) sont montés jusqu’au sommet à 2420 m d’altitude en passant par le « schlütter hütter » (2297m) pour s’hydrater un peu. Ceci demandait une certaine endurance. Le retour du sommet était facile

Ecole d'été Protéomique 2011 Brixen, Italie

page 29

l’identi�cation des protéines, il se focalisa sur Mascot. Sa présentation, très claire, m’a permis de comprendre certains détails auxquels je ne prêtais pas attention. Il récapitula les trois façons de faire de l’identi�cation : PMF, sequence query et la MS/MS, ensuite il détailla les paramètres de recherche et les di�érentes bases de données.

La dernière présentation de cette session était l’intervention de M. Bantsche� sur la quanti�cation MS, il expliqua les techniques H2O18, AQUA et label free.

Nous avons eu une présentation de la compagnie Thermo par K. Sche�er sur l’orbitrap avant d’entamer la session des modi�cations post traductionnelles par le Pr. O. Jensen avec des exemples sur l’identi�cation des phospho-rylations.

La dernière session était consacrée au « clinical day » ou plutôt journée spéciale biomarqueurs en commençant par les techniques de protéomique pour la recherche de biomarqueurs par H. Steen, ou il exposa l’état d’avancement de son travail et ses essais sur la recherche de biomarqueurs de l’appendicite à l’hôpital pédiatrique de Boston.

Il y eut ensuite l’analyse de tissus par imagerie MALDI de A. Römpp, une présentation complémentaire de celle de M. Becker (Bruker), ou il détailla la préparation des échan-tillons ainsi que l’in�uence des solvants sur la cristallisation de la matrice. Il montra des images de coupes du côlon. Il a

expliqué l’intérêt de cartographier des protéines car elles vont au delà de la frontière de la coloration histologique et de ce que l’œil humain peut distinguer. Il montra aussi des images à 7μm de résolution spatiale sur de petites molécules. Il termina sa présentation en parlant des dé�s qu’aura à surmonter l’imagerie MALDI si on veut qu’elle soit utilisée en routine dans la recherche clinque.

Miriam Böckmann nous a présenté son travail sur les réactions auto immunes et développement des maladies neurodégéneratives. La technique qu’elle utilise dans sa recherche de biomarqueurs précoces de ces maladies est un système de puces à protéines (des anticorps) gre�és et qui servent à la recherche de protéine spéci�que « des autoantigènes » sur échantillons sanguins.

Oliver Pötz nous a présenté la capture de biomarqueurs par des anticorps d’un point de vue global. Ses diapositives étaient très explicites et ont bien détaillés le principe, il nous a fait rire à plusieurs reprises.

Une perspective épidémiologique a été donnée par Beate Pesch. Elle nous parla des méthodes de recherche de biomarqueurs précoces: du screening et l’identi�cation, la comparaison avec les contrôles approprié en liaison avec l’âge et le sexe tout en prenant en considération d’autres facteurs tels que les habitudes (fumeur ou non) et la valida-tion des biomarqueurs par de longues cohortes.

Nous avons eu une présentation intéressante de l’application des technologies de la protéomique dans

l’industrie pharmaceutique par H. Langent. Il a montré le rôle de la protéomique dans plusieurs étapes du développement d’un médicament tel que la compréhension des di�érences entre patients, l’identi�cation de la meilleure molécule, l’amélioration de la qualité des résultats…etc. Il a illustré sa présentation par un exemple sur le développement d’un inhibi-teur de kinase en utilisant la quanti�cation MS (SILAC, ITRAQ et le label free)

La semaine fut clôturée par le Pr. Albert Heck qui a présenté le work�ow et les méthodes qu’ils développent en protéo-mique dans son laboratoire.


Il y eut durant la semaine deux sessions de présentations d’une minute des travaux de chaque participant sur un transpa-rent A4 (retro projecteur) par ordre alphabétique: une première session pour les noms qui commencent par « A » jusqu'à « Ma » et la deuxième session pour les participants dont le nom commence par « Me » jusqu'à « Z ». Le but est qu’en une minute chrono, le travail de chaque participant ainsi que la raison pour laquelle on devrait visiter le poster dans la soirée devait être présenté. Il y avait un compte à rebours en projection, ceux qui dépassaient la minute se voyaient retirer leurs transparents d’une manière plutôt drôle. La pression se faisait sentir sur chacun de nous! Les deux sessions étaient espacées de deux jours. Ceux qui ont présenté au cours de cette dernière session ont TOUS �ni leurs présentations en moins d’une minute !

Les sessions poster




Les workshops

Nous devions choisir deux workshops parmi dix (MaxQuant, interprétation de spectres (basique et avancé), Identi�cation des Protéines, SRM/MRM, modi�cations post traductionnelles (PTMs), MSE et ion mobility, électrophorèse gel 2D, Quanti�ca-tion et imagerie MALDI). J’avais choisi l’imagerie MALDI, technique que je commence à utiliser. Le workshop était assuré par M. Becker et A. Römpp. Malheureusement, j’étais la seule à l’avoir testée car les autres participants venaient pour découvrir ce qu’était l’imagerie MALDI et donc seulement les principes de base ont été abordés. Néanmoins, les explications ont permis de comprendre l’utilité de bien cibler les analyses pour ne pas se noyer dans une masse de données inutiles.

Mon deuxième workshop de la semaine portait sur « les modi�cations post traductionnelles » avec O. Jensen et M. Shabaz où plusieurs modi�cations post traductionnelles ont été abordées : phosphorylation, acétylation, méthylation et carbonyla-tion avec quelques di�cultés techniques telles que l’enrichissement des échantillons, l’analyse MS qui peut s’avérer di�cile surtout si la modi�cation est minoritaire, labile ou si elle supprime le signal MS.


La première activité était une randonnée commençant a Zanser Alm (1685 m d’altitude), elle a duré quatre heures et à chacun son rythme, les plus courageux (voir la photo) sont montés jusqu’au sommet à 2420 m d’altitude en passant par le « schlütter hütter » (2297m) pour s’hydrater un peu. Ceci demandait une certaine endurance. Le retour du sommet était facile ! Puis nous avons diné dans le restaurant « Zanser Alm » qui se trouve à notre point de départ.

Lors de la deuxième activité, j’ai choisi le rafting. On était soixante trois au total répartis par groupe de neuf. C’était tout simplement sublime ! Après avoir écouté les instructions de sécurité du guide, et fait un essai sur un tronçon calme, nous avons e�ectué un test de baignade dans la rivière d’EISACK dans une eau à +7°C puis on entama notre descente sur 18 km. C’était plutôt hétérogène, la plus forte descente était de niveau 4.5. Les paysages étaient à couper le sou�e.

La soirée juste après le diner était consacrée à une partie de football des participants contre les organisateurs et exposants. Bien évidemment les participants ont gagné parce qu’on était …… en surnombre !

Il y eut une dégustation de vins de la région la veille du départ et une visite guidée de la Novacella après la présentation de clôture de l’école que j’ai malheureusement ratée à cause de mon train.


Compte-rendu Brixen 2011 (suite)Lyna Sellami

page 30

l’industrie pharmaceutique par H. Langent. Il a montré le rôle de la protéomique dans plusieurs étapes du dévelop-pement d’un médicament tel que la compréhension des di�érences entre patients, l’identi�cation de la meilleure molécule, l’amélioration de la qualité des résultats…etc. Il a illustré sa présentation par un exemple sur le développe-ment d’un inhibiteur de kinase en utilisant la quanti�cation MS (SILAC, ITRAQ et le label free)

La semaine fut clôturée par le Pr. Albert Heck qui a présenté le work�ow et les méthodes qu’ils développent en protéomique dans son laboratoire.


Il y eut durant la semaine deux sessions de présentations d’une minute des travaux de chaque participant sur un transparent A4 (retro projecteur) par ordre alphabétique: une première session pour les noms qui commencent par « A » jusqu'à « Ma » et la deuxième session pour les partici-pants dont le nom commence par « Me » jusqu'à « Z ». Le but est qu’en une minute chrono, le travail de chaque participant ainsi que la raison pour laquelle on devrait visiter le poster dans la soirée devait être présenté. Il y avait un compte à rebours en projection, ceux qui dépassaient la minute se voyaient retirer leurs transparents d’une manière plutôt drôle. La pression se faisait sentir sur chacun de nous! Les deux sessions étaient espacées de deux jours. Ceux qui ont présenté au cours de cette dernière session ont TOUS �ni leurs présentations en moins d’une minute !

Les sessions poster




Les workshops

Nous devions choisir deux workshops parmi dix (MaxQuant, interprétation de spectres (basique et avancé), Identi�cation des Protéines, SRM/MRM, modi�cations post traductionnelles (PTMs), MSE et ion mobility, électropho-rèse gel 2D, Quanti�cation et imagerie MALDI). J’avais choisi l’imagerie MALDI, technique que je commence à utiliser. Le workshop était assuré par M. Becker et A. Römpp. Malheureusement, j’étais la seule à l’avoir testée car les autres participants venaient pour découvrir ce qu’était l’imagerie MALDI et donc seulement les principes de base ont été abordés. Néanmoins, les explications ont permis de comprendre l’utilité de bien cibler les analyses pour ne pas se noyer dans une masse de données inutiles.

Mon deuxième workshop de la semaine portait sur « les modi�cations post traductionnelles » avec O. Jensen et M.

Shabaz où plusieurs modi�cations post traductionnelles ont été abordées : phosphorylation, acétylation, méthyla-tion et carbonylation avec quelques di�cultés techniques telles que l’enrichissement des échantillons, l’analyse MS qui peut s’avérer di�cile surtout si la modi�cation est minoritaire, labile ou si elle supprime le signal MS.


La première activité était une randonnée commençant a Zanser Alm (1685 m d’altitude), elle a duré quatre heures et à chacun son rythme, les plus courageux (voir la photo) sont montés jusqu’au sommet à 2420 m d’altitude en passant par le « schlütter hütter » (2297m) pour s’hydrater un peu. Ceci demandait une certaine endurance. Le retour du sommet était facile ! Puis nous avons diné dans le restau-rant « Zanser Alm » qui se trouve à notre point de départ.

Lors de la deuxième activité, j’ai choisi le rafting. On était soixante trois au total répartis par groupe de neuf. C’était tout simplement sublime ! Après avoir écouté les instruc-tions de sécurité du guide, et fait un essai sur un tronçon calme, nous avons e�ectué un test de baignade dans la rivière d’EISACK dans une eau à +7°C puis on entama notre descente sur 18 km. C’était plutôt hétérogène, la plus forte descente était de niveau 4.5. Les paysages étaient à couper le sou�e.

La soirée juste après le diner était consacrée à une partie de football des participants contre les organisateurs et exposants. Bien évidemment les participants ont gagné parce qu’on était …… en surnombre !

Il y eut une dégustation de vins de la région la veille du départ et une visite guidée de la Novacella après la présen-tation de clôture de l’école que j’ai malheureusement ratée à cause de mon train.

Conclusion

Je voudrais remercier la SFEAP pour m’avoir accordé la bourse et permis d’assister à cette riche semaine. Je recom-mande FORTEMENT cette école car elle ne m’a été que béné�que et si je devais faire une critique pour l’améliorer c’est que ça dure plus longtemps !


Compte-rendu Brixen 2011 (suite)Lyna Sellami

page 31

Agenda 2012

22 mars : Journées Scienti�ques SFEAP/SFSM"SRM-MRM"- ESPCI Paris - Amphithéâtre Joliot

9-13 Septembre 2012Réunion COST European Plant Proteomics

HUPO 2012 Annual World Congress

Bostonwww.hupo2012.org

9-12 Juillet 2012Congrès EuPA 2012Glasgow Royal Concer Hall, Glasgow, Scotlandwww.eupa2012.org

15-17 OctobreCongrès SFEAP 2012Halle aux Toiles, Rouen rouensfeap2012.fr

page 32

Notre prochain Rendez-vous , Rouen

Cher(e)s Collègues,

Au nom de la Société Française d'Electrophorèse et d’Analyse Protéomique (SFEAP), de l'Université de Rouen, de la Mairie de Rouen et de la Région Haute-Normandie, nous avons le plaisir de vous inviter à participer à la 29ème édition du Congrès de la SFEAP, qui aura lieu à Rouen du 15 au 17 octobre 2012. Le congrès se tiendra à la "Halle aux Toiles", un bâtiment historique situé dans le centre de Rouen, à proximité immédiate de la Cathédrale, que les tableaux de Claude Monet ont rendue célèbre dans le monde entier, de la Seine et de la Place du Vieux-Marché (où Jeanne d'Arc fut brûlée vive en 1431).

Le programme scientifique portera sur toutes les déclinaisons de l’Analyse Protéomique depuis les aspects les plus fondamentaux jusqu’aux applications cliniques. Tous les domaines de la protéomique animale et de la santé, de la protéomique végétale et de la protéomique microbienne seront représentés tout au long des conférences plénières, des communications orales et des sessions posters. Les activités sociales, incluses dans les frais d'inscription, comprendront une visite de Rouen pour découvrir les trésors architecturaux de la ville et un dîner de gala dans la ville, près du fleuve.

Nous espérons vivement que vous vous joindrez à nous pour ce grand moment de protéomique à Rouen en 2012. Vous pourrez échanger sur les plus récentes avancées en protéomique et disciplines connexes, rencontrer de vieux amis et collègues, et certaine-ment initier de nouvelles relations et collaborations. Dans l'intervalle, si nous pouvons faire quoi que ce soit pour vous aider à partici-per au Congrès, n'hésitez pas à nous contacter directement à [email protected].

Avec nos plus chaleureuses salutations

Pascal Cosette Odile Schiltz

Responsable du Comité d’Organisation Présidente, SFEAP

page 33

Nos Partenaires

AGILENT Division Sciences de la Vie 1 rue Galvani , 91745 Massy Cedex Tél 06 78 73 55 26 ; Fax 01 64 63 56 39 Courriel : [email protected] www.agilent.com

Proteinsimple - ex CELL BIOSCIENCES3040 Oakmead Village Drive Santa Clara, CA 95051 USATél +1 408 510 5500Fax +1 408 510 5599Courriel : [email protected] www.proteinsimple.com

BIO-RAD 3 bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Tél 01 47 95 69 65 ; Fax 01 47 95 61 21 www.discover.bio-rad.com

BRUKER 34 rue de l'Industrie 67166 Wissembourg Cedex Tél 03 88 73 68 30 ; Fax 03 88 73 68 79 www.bruker.fr

DIONEX S. A. 164-166 avenue Joseph Kessel 78960 Voisins le Bretonneux Tél 01 39 30 01 10 ; Fax 01 39 30 01 12 Courriel : [email protected] www.dionex.fr

GE Healthcare Europe GmbHParc Technologique, rue René Razel 91898 Orsay Cedex Tél 01 69 35 67 00 ; Fax 01 69 41 96 77Courriel : [email protected] www.gelifesciences.com

PROMEGA FRANCE Parc d'activités des Verrières 24 Chemin des Verrières 69260 Charbonnières les Bains Tél 04 37 22 51 03 ; Fax 04 37 22 50 15 Courriel : [email protected] www.promega.com

PROTEABIO Europe SAS 80 rue Etienne Lenoir 30900 Nimes Tél 04 66 67 08 16 ; Fax 04 66 67 41 77 Courriel : [email protected] www.proteabio.com

PROTEOMIC SOLUTIONS BP 22237 rue Léo lagrange 27950 Saint-Marcel Tél 02 32 54 16 28 ; Fax 02 32 54 03 77 Courriel: [email protected] www.proteomicsolutions.fr

SEBIA Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY cedex Tél 01 69 89 80 80 ; Fax 01 69 89 78 78 www.sebia.com

THERMO FISHER SCIENTIFIC16 Avenue du Quebec Silic 765 91963 Courtaboeuf Cedex Tél 01 60 92 48 24 ; Fax 01 60 92 48 29 Courriel : jocelyn.dupuis@thermo�sher.com http://www.thermoscienti�c.com

WATERS S. A. S.BP 60878056 St-Quentin-en-Yvelines Cedex Tél 0820 885 885 ; Fax 01 30 48 72 01 Courriel : [email protected] www.waters.com

Les sociétés commerciales suivantes accordent leur soutien à la SFEAP en souscrivant comme partenaires. Nous les remercions pour leur concours

ASAADVANCED SOLUTIONS ACCELERATORCap Alpha6 avenue de l'Europe - 34830 ClapiersTél: 04 67 59 36 40; Fax: 04 67 59 02 51Courriel: [email protected]

SERVA Electrophoresis GmbHCarl-Benz-Str. 7 P.O.B. 10 52 6069115 Heidelberg GermanyTel.: +49-(0)6221-13840-0Fax: +49-(0)[email protected]

page 34

Brèves

C'est une grande première !

Le Club-Jeunes de la SFEAP possède à présent sa page Facebook.

En plus de notre site internet, vous pourrez suivre notre actualité,

mais surtout poser des questions et apporter des solutions à notre

communauté scientifique.

Rejoignez notre page facebook, devenez fan, et partagez la avec vos amis !

http://www.facebook.com/pages/Club-jeunes-Sfeap/106868609431246

Rémy Aurand

Président du Club-Jeunes

8ème édition des Journées du Club-Jeunes de la SFEAP auront lieu les 6, 7 et

8 juin 2012 à ARRAS.

Comme d’habitude, ces journées scientifiques s’articulent autour des thématiques

d’analyse protéomique et de spectrométrie de masse.

Les objectifs sont multiples, d’une part permettre aux jeunes de suivre des forma-

tions de qualité dispensées par des professionnels reconnus, créer un réseau natio-

nal des jeunes protéomistes français, mais également interagir avec les industriels

/ fournisseurs pouvant offrir des solutions à nos problèmes quotidiens. Enfin, les

membres du cjSFEAP qui le souhaitent peuvent également y présenter leurs

travaux.D’après la citation latine « Mens sana in corpore sano » des rencontres scientifiques

ne sauraient être réussies sans une activité sportive (et ludique). Après avoir expéri-

menté l’aviron l’an passé, nous participerons cette année à la mission « Inquest » où

la tête et les jambes seront fortement sollicités pour relever les défis. Serez-vous à

la hauteur ?Le cjSFEAP, fort du soutien de la SFEAP, met un point d’honneur à rendre la partici-

pation aux Journées gratuite pour tous les membres du Club-Jeunes de la SFEAP

(hébergement et restauration). Pour plus d’information et pour vous inscrire pro-

chainement, suivez notre actualité sur notre site web (http://cj.sfeap.fr) et sur

notre page Facebook.

! !

Documents

00 Page de couverture avec photo - sfeap.fr · Compte-rendu du MSBM, Dubrovnik, Croatie page 27 Compte-rendu école d'été Protéomique, Brixen, Italie page 28 ... formation très