TP Microbiologie

Etat frais - Milieu solide: une goutte deau + une colonie

Milieu liquide: une goutte du milieu

Entre lame et lamelle observ au microscope lobjectif 40.

! Ensemencements

Milieu liquide: 5 10 gouttes de suspension dun milieu liquide

A partir dun milieu solide on prpare un tube hmolyse avec de leau physiologique soit on dpose quelques colonies avec lose.

Milieu solide:

Tubes: piqure centrale ou glose inclin

Boites: - talement en surface (rteau, 0,1ml)-Inondation puis on enlve lexcs

-Incorporation (en masse) 1mL

-Isolement en surface (Mthodes des stries ou par puisement) 0,1 ml Dnombrement: voir TP2N (UFC/ml) = Nombre de colonie (UFC) / Facteur de dilution (10-n) x Volume dpos (ml)

! Coloration de Gram

Raliser un frottis: goutte deau, colonie avec l ose, scher

1er colorant: Violet de gentiane (1min) puis rincer et scher

fixateur: le lugol (1min), rincer et scher

le diffrentiateur: alcool 95 (5-10s), rincer et scher

2me colorant: fushine ou safranine (1min), rincer et scher

observation objectif X 100 avec une goutte dhuile sur la lame:

Violet = gram +, rose = gram _ noter la forme, le gram et larrangement des cellules.

Gram +, coques (staphylococcaceae + Streptocaccaceae) Recherche de la catalase

Prsence catalase (enzyme catalysant destruction des H2O2)

Test: On place quelque goutte d H2O2 sur un prlvement de culture solide avec pipette pasteur.Rsultat: Catalase + dgagement gazeux avec mousse ou bulles (Staphylococcus)

Catalase -: Streptococcus Type respiratoire (tude avec O2 de lair)

Test: On utilise une glose VF liquide: on ensemence en spiral avec une pipette pasteur et on refroidit leau froide (puis incuber 37C 24h)Rsultats:

A: aro-anarobie facultativeB: arobie strictC: micro-arophilesD: anarobie strict

Mtabolisme oxydatif ou fermentatif

Test: On utilise le milieu de Hugh et Leifson pralablement fondu au bain marie puis refroidie 45C.

On ajoute 0,5 ml de glucose (concentration finale 1%) puis on ensemence 2x2 tubes par piqre centrale, dont 1 sera ferm F car il sera recouvert dhuile de paraffine.

Oxydative: si O vert/orang et F vert, elle utilise O2 et un peu acide.

Fermentative: si O et F jaune, pas utilisation O2 et trs dacide. Inactive: si F et O vert, inactive pour le glucose et pas dacide produit. si O et F vert-bleu, elle est alcalinisant et on a un produit alcalin (basique). Fermentation du mannitol, mobilit rduites des nitrates

Test: On utilise un milieu MMN ensemenc par piqre centrale.

Rsultats:

Mannitol: Mannitol +: Milieu devient jaune, fermentation du mannitol. Mobilit: Mobilit -: Bactries le long de la strie.

Mobilit +: partout.

Nitrate: On ajoute le ractif de Griess:

Raction positive: coloration rouge, la bactrie rduit les nitrates en nitrites.

Raction ngative: pas de coloration, rvler les nitrates par ajout de poudre de zinc:

- Si coloration rouge la bactrie ne rduit pas les nitrates (prsence de nitrites).

- Si pas coloration, pas de nitrate, pas de nitrites car dj rduit en N2.

streptococcus Prsence dune hmolysine (lyse hmaties)

Test: On utilise une glose au sang, on ralise une strie longitudinale.

Rsultat: Zone verdtre autour de la strie: Hmolyse

Aurole claire autour de strie: Hmolyse ( Aucune raction: pas hmolyse

Croissance sur milieux hostiles

Test: -On ensemence une culture en milieu glos dans une solution de NaCl 6,5%. - On ensemence une culture en milieu en solution pH 9,6.Rsultat: On apprcie la croissance (aprs incubation 5j 37C).*possibilit dvaluer la croissance diffrente T (30min 60C).

Milieu slectif: BEA (bile- esculine-azide): recherche de lesculinase (bile et azide: inhibiteur)Test: isolement sur BP BEA partir de la culture en glose (incuber 37C)

Rsultat: esculine +: petites colonies translucide entour dun halo noir (raction avec les ion Fe)

Esculine -: aucun changement

Milieu de slanetz et batley: Test: isolement sur BP SB partir de la culture en glose (incuber 37C)

Rsultat: si les colonies sont rose/rouge fonc se sont des streptocoques fcauxstaphylococcus Prsence dune hmolysine (lyse hmaties)

Test: On utilise une glose au sang, on ralise une strie longitudinale.

Rsultat: Zone verdtre autour de la strie: Hmolyse

Aurole claire autour de strie: Hmolyse ( Aucune raction: pas hmolyse

Prsence de la thermonuclase

Test: On utilise une glose ADN dans une glose 3 puits que lon ensemence (tmoin, froid et chaud)Rsultat: Puits chaud et froid diffrents: DNase non thermostable

Puits chaud et froid identique: DNAse thermostable (Staphylococcus aureus)

Prsence de la coagulase libre

Test: 0,5ml de culture 24h 37C sur bouillon cur/cervelle 0,5 ml de plasma de lapin Agiter et incuber 24h 37C.

Rsultat: Coagulase +: coagulation du contenu du tube. (Staphylococcus aureus)

Milieux slectifs

Milieu de Chapman: Staphylococcus (Gram +)

Test: faire un talement par puisement par strie partir dune culture de 24h sur le milieu (contenant NaCl qui permet la slection de bactries halophile et inhibe les autre).Rouge de phnol dans le milieu permet de distingu les espces. (incuber 24h 37C)Rsultat: Mannitol +: grosses colonies entoures dune aurole jaune (fermentation mannitol): staphylococcus aureus Mannitol -: pas petites colonies entour de rouge Milieu Baird parker: pour coagulase positive, il met en vidence la lcithinase et la lipoprotinaseTest: partir dune culture de 24h ensemenc les BP par strie (incuber 24h 37C)

Rsultat: -colonie noire: rduction du tllurite en tllure.

- halo claire: prsence de protolyse

-prcipit blanc: hydrolyse des lcithines par lcithinase Les staphylocoques coagulase + sont lcithinase + et protolyse+ Gram +, bacilles (Lactobacillaceae) Type de mtabolisme (homofermentaire ou htrofermentaire)

Test: On ensemence un milieu liquide MRS (Man, Rogosa, Sharpe) + cloche de Durham

Rsultat: Htrofermentaire: production de CO2: prsence de gaz sous la cloche.

Temprature de croissance

Test: On ensemence 3 milieux MRS quon incube diffrentes tempratures.

Recherche de larginine dihydrolase: ADH pour bactries en anarobiose

Test: On ensemence un milieu liquide de Mller larginine qui sera recouvert de parrafine.Rsultat: Positif: croissance et coloration pourpre (enzyme dgrade arginine)

Ngatif: coloration jaune

Recherche de lesculinase

Test: On ensemence pour piqure centrale une glose lesculine.

Rsultat: Positif: milieu noir (la bactrie possde lenzyme esculinase)

Ngatif: milieu reste gris

Fermentation des glucides

Test: Dans un milieu viande levure, on ajoute 1 mL de solution de glucide puis on ensemence avec la culture 24h et incubation 30c 5j).

Rsultat: fermentation + si virage de lindicateur de pH.

Gram , bacilles (pseudomonadaceae + Enterobacteria) Recherche de loxydase

Test: On dpose un disque oxydase sur une lame sur laquelle on ajoute la colonie (sans pince et ose)

Rsultat: Oxydase +: violet (Pseudomonas)

Oxydase -: pas de raction (Enterobacteriaceae) Type respiratoire (tude avec O2 de lair)

Test: On utilise une glose VF liquide: on ensemence en spiral avec une pipette pasteur et on refroidit leau froide (puis incuber 37C 24h)

Rsultats:

A: aro-anarobie facultativeB: arobie strictC: micro-arophilesD: anarobie strict

Mtabolisme oxydatif ou fermentatif

Test: On utilise le milieu de Hugh et Leifson pralablement fondu au bain marie puis refroidie 45C.

On ajoute 0,5 ml de glucose (concentration finale 1%) puis on ensemence 2x2 tubes par piqre centrale, dont 1 sera ferm F car il sera recouvert dhuile de paraffine.

Oxydative: si O vert/orang et F vert, elle utilise O2 et un peu acide.

Fermentative: si O et F jaune, pas utilisation O2 et trs dacide.

Inactive: si F et O vert, inactive pour le glucose et pas dacide produit.

si O et F vert-bleu, elle est alcalinisant et on a un produit alcalin (basique).

Fermentation du mannitol, mobilit rduites des nitrates

Test: On utilise un milieu MMN ensemenc par piqre centrale.

Rsultats:

Mannitol: Mannitol +: Milieu devient jaune, fermentation du mannitol. Mobilit: Mobilit -: Bactries le long de la strie.

Mobilit +: partout.

Nitrate: On ajoute le ractif de Griess:

Raction positive: coloration rouge, la bactrie rduit les nitrates en nitrites.

Raction ngative: pas de coloration, rvler les nitrates par ajout de poudre de zinc:

- Si coloration rouge la bactrie ne rduit pas les nitrates (prsence de nitrites).

- Si pas coloration, pas de nitrate, pas de nitrites car dj rduit en N2.

Pseudomonas Utilisation du citrate

Test: On ensemence la pente dun tube de citrate de Simmons par strie centrale et longitudinale.Rsultat: Positif: alcalinisation du milieu (qui devient bleu cause du bleu de bromothymol) car colonie utilise le citrate en augmentant le pH et dveloppement des bactries.

Ngatif: pas dalcalinisation donc pas de virement de couleur.*incubation 30C Recherche de la Glatinase

Test: On ensemence par piqure centrale le culot dun milieu la glatine, aprs refroidissement.

(Incuber 48h 1 semaine T ambiante).

Rsultat: positif sil y a liqufaction de la glatine. Pigmentation: milieu King A et King B:Test:Rsultat: Milieu slectif pyocyanosel glose:Test: raliser un isolement (par strie) sur milieu pyocyanosel

Rsultat: si croissance: pseudomonas (car ctrimide inhibe toutes colonies sauf pseudomonas) Milieu bleu/vert: production de pyocianine

Milieu vert fluorescent: production de pyoverdine+pyocianineenterobacterie

Mtabolisme des glucides

Test: On ensemence la pente du milieu Kliger Hajna en strie et son culot par piqure.

Ne pas visser totalement le bouchon pour arer le milieu (incubation24h 37C).Rsultats: Pente: Lactose +: jaune

Lactose -: rouge

Culot: Glucose +: jaune

Glucose -: rouge Le glucose est toujours utilis en premier Exemple: Production de gaz: dcollement de la glose et/ou bulles

Bactries H2S+: Prsence de sulfure dhydrogne: prcipit noir

H2S-: Pas de prcipit

LDC+: Prsence de lysine dcarboxylase car lysine transform en cadaverine: coloration violette LDC-: incolore

Test ONPG: Test: prlever un peu de culture dans la pente du tube et mettre en suspension dans 0,5 ml deau distill et mettre un disque ONPG puis incuber 37C observ toutes les 15min pendant 1h.Rsultat: test positif si couleur jaune Test de la phnylalanine:Test: ensemencer le milieu APP (glose phnylalanine) avec le germe (incuber 24h 37C)

Rsultat: recouvrir la culture de 0,2 ml dune solution FeCl3

Si coloration verte rsultat +, la phnylalanine est transform en acide phnylpyruvique Test tryptophane: recherche urase, tryptophane dsaminase, tryptophanaseTest: Ensemencer quelques gouttes de suspension bactrienne (ou colonie) en milieu ure indole (incuber 24h 37C)Rsultat: urase: si le rouge de phnol vire au rouge prsence durase (alcalinisation).

Tryptophanase: spar le contenu du tube dans 2 tubes hmolyse

-ajouter 3 gouttes de perchlorure de fer si coloration rouge/brun TDA+ - ajouter 3 gouttes de ractif de Kovac, si apparition dun anneau rouge, tryptophanase + (production dindole). Milieu slectif: Drygalski pour Bactries Gram

Test: avec culture 24h ensemenc BP par mthode des stries (incuber 24h 48h 37C)Rsultat: Lactose +: colonie jaune (fermentation lactose) Lactose -: colonie bleu-vert

Milieu slectif: EMB Test: Ensemencer le milieu par stries dpuisement (incuber 24h 37C)

Rsultat: -colonies plates, violette fonce mtallique: E.coli -grosses colonies: enterobacter

-petites colonies grise: Salmonella

-colonies violet ple, reflet mtallique: citrobacter

Galerie API: on compte que les chiffre test + et on relve le numro (6373)

TP fromage + yaourt.

Dilution:

Milieu et temps dincubation: voir tableau TP fromage

N (UFC/g) = Nombre de colonie (UFC) / Facteur de dilution (10-n) x quantit dpos (g)Le yaourt: lait ferment par 2 bactries thermophiles: Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus (salivarius)

Fermentation qui conduit la prise en masse du lait (coagulum ferme, sans lactoserum)

TP antibiotiquesManque de temps donc regarder votre TP

Croissance microbienneSe reporter au cour de microbiologie (boucher) + TP3 Nombre de bactries par unit de volume

Densit optique

Poids sec

Dvellopement de colonie

et puits 2 et 3 rose; thermonuclase thermostable

1ml

Volume total de chaque tube:

10ml

Le tube 1 contient 1ml de solution bactrienne et 9ml de liquide physiologique (dilution 10^-1)

On prlve 1ml du tube 1 quon met dans 9ml de liquide physio dans le tube 2 (dilution 10^-2)