AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique: optimisation, nouveaux

AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012)

Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique:

optimisation, nouveaux formats

et défis technico-économiques

Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps »,

Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872)[email protected]


Les anticorps monoclonaux: 37 ans d’Histoire

Publication de la technique d’obtention des anticorps monoclonaux (AcM): Köhler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975

Premier AcM mis sur le marché (1986) :

Muromonab (anti-CD3, souris)

Derniers AcM mis sur le marché (2011) :

ipilimumab (anti-CTLA-4), belimumab (anti-BLyS/BAFF)

* 27 AcM ont actuellement une AMM [ USA (FDA) et Europe (EMA)]

AAEIP, Agence Universitaire de la Francophonie, Université Paris Sud (12 Juin 2012) 3

Génération d’un AcM recombinant huIgG,

Vecteur(s) avec séquences huC et huC

TransfectionLignée cellulaire (CHO, NS1…)

ADNc

VL

VH

ARNt/ARNm

Lymphocyte B Hybridome

AcM, HuIgG,

Clonage


Fixation au FcRn

Dualité fonctionnelle des anticorps (IgG1)

CH1CH1

VHVH

CL

VL

CL

VL

CH2

CH3

CH2

CH3

Fixation aux FcR

Fab

Fc

Fixation à l’Ag


Modes d’action des AcM à usage thérapeutique

- Neutralisation de l’interaction ligand soluble-récepteur (Ac anti-ligand, anticorps anti-récepteur): TNF, IL1, VEGF, IL6-R, EGF-R, CD25 (IL2-R), FcRI, toxine (charbon), C5

- Blocage de l’activation d’un récepteur (HER2/Neu, EGF-R)

- Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a, intégrine 4)

- Induction d’apoptose (CD20)

- Ciblage d’une drogue (CD33-ozogamicine*)

* Retiré du marché


Modes d’action des AcM à usage thérapeutique

- Activation de mécanismes effecteurs via la région Fc (ADCC, CDC, phagocytose, production de cytokines ou/et de chimiokines) (CD20, CD52)

- Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle (CD4, CTLA-4)

- Induction d’une réponse immune adaptative cellulaire à long-terme


«L’anticorps murin qui voulait être humain»

- L’infusion d’AcM de souris chez l’Homme => anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA)

=> neutralisation et clairance accélérée de l’AcM => chute de l’efficacité,

effets secondaires dus à la formation de complexes immuns et à leur dépôt.

- Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de l’immunité de façon optimale chez l’Homme :

=> faible activation du complément,

=> mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc des Ig (RFc) et du RFcn (=> diminution de la T1/2).


Ingénierie cellulaire pour générer des AcM humains

1977 : Transformation par l’EBV de lymphocytes B pour produire des AcM (Steinmitz et al., Nature, 269: 420, 1977)

Ac1Ac2Ac3

Clonage des cellules

AcM

Lignées B

(EBV)

Criblage

Lymphocytes B

du sang périphérique

Transformation

DonneurImmunisé

EBV


Ingénierie moléculaire pour générer des anticorps humains

1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)

1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)

1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)

1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)

1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)


De la souris à l’Homme… De la souris à l’Homme…

Domaine Ig de souris Domaine IgG humaine

AcM de souris AcM chimérique


Ingénierie moléculaire pour générer des anticorps humains







De la souris à l’Homme… De la souris à l’Homme…

Domaine Ig murin Domaine Ig humain CDRs murin

AcM de souris AcM humanisé


Génération d’un AcM recombinant humanisé huIgG1,

Vecteur avec séquences huC1 et huCLignée cellulaire (CHO, NS1…)

Transfection

AcM, HuIgG1,

Clonage

VL

VH

ARNt/ARNm

Hybridome B de souris

huVL

huVH

1. Séquençage2. Comparaison V humains3. Modélisation 3-D/cristal4. Détermination CDR/FR

contact5. Greffe CDR6. Mutations ponctuelles FR


Humanisation d’un AcM recombinant

Substitutions d’a.a. des FR humains impliqués dans des contacts avec des a.a. des moCDRs greffés: remplacement des a.a. «humains» par les a.a. trouvés à la même position sur les VH/VL murins de l’Ac de souris («FR back mutations»)


Ingénierie moléculaire: anticorps humains







Expression bactérienne de fragments d’anticorps: les « single chain Fv (scFv) »

Espaceur

VHa VLaLrbs

Stop

Etiquette

(GGGGS)3

P

VHa

VLa

Espaceur

Etiquette

scFv

VH

VL

Fv









Banques combinatoires de phages

Phage filamenteux

scFv

pIII


Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)

1. Clonage et expression de régions Fab ou de scFv humains => production d’une banque de phages

2. Sélection de Fab ou de scFv spécifiques exprimés à la surface des phages

3. Isolement des VH/VL spécifiques et «reformatage» sous forme d’IgG entière

4. Transfection et production de l’AcM recombinant dans des cellules eucaryotes (CHO, NS1…)


Banques combinatoires de phages

ADNc

ARNt/ARNm

Lymphocytes B

humains

VL

VH


Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)

1. Adsorption 2. Lavage 3. Elution (pH acide)


Génération d’un AcM recombinant humain IgG1, à partir d’un phage sélectionné

ADNc

Vecteur avec séquences huC1 et huC

TransfectionLignée cellulaire (CHO, NS1…)

AcM, HuIgG1,

Clonage

Phage sélectionné

huVL

huVH

PCR


Phage display: génération de fragments d’Ac mutés

**** *

1. Phage parental

**

2. Mutagenèse

scFv ou Fab

Purificationde l’ADN wt

3. Banque de Phages mutants


Phage display: sélection de fragments d’Ac de forte affinité

2. Lavage1. Adsorption sur l’Ag (faible densité)

*

*

Banque dephages mutés

3. Elution

*

Phage mutésélectionné(forte affinité)









Génération d’AcM humains: utilisation de souris transgéniques humanisées contenant les gènes d’Ac humains


2. Insertion des gènes codant une partie des chaînes lourdes et légères humaines (YAC) (lignée B). Croisement (AxB) => souris « humanisée »

3. Production d’hybridomes après immunisation

1. Invalidation des gènes DJ & J(chaînes H & L) de souris (lignée A)

4. Clonage de l’AcM humain et expression dans des cellules eucaryotes (CHO, NSO …)


Immunogénicité des Ac recombinants

1.Ac chimériques: Dépend de l’Ac chimérique: pas, peu ou fortement immunogène (Homologie plus ou moins forte avec les VH/V humains?)

2. Ac humanisés:Peu immunogène mais dépend également de l’Ac considéré

Pour tous les Ac recombinants:

1. Rôle de la voie d’injection?2. Rôle des doses injectées et de leur nombre/fréquence?3. Rôle de l’antigène ciblé?4.Test de détection des HAMA utilisé!


Les 27 AcM utilisés en clinique en 2012 (FDA+EMEA)

- 2 AcM sont des IgG de souris (une IgG1, une IgG2a)

- 4 AcM sont des IgG1 humaines chimériques

- 9 AcM sont des IgG humanisées (dix IgG1 dont deux

Fab, deux IgG4, une IgG2/4)

- 9 AcM sont des IgG humaines (sept IgG1, deux IgG2)

- 1 Ac bi-spécifique (rat IgG2b/souris IgG2a)

- 2 Fab (un chimérique PEGylé, un humanisé)

* Juin 2012


Les AcM utilisés en clinique (FDA+EMEA+ Chine)

33 AcM sont/ont été sur le marché* et ont généré des revenus de près de quarante milliards d’Euros en 2011:

- 8 AcM dans les maladies inflammatoires/auto-immunes

- 1 AcM dans les maladies infectieuses (VRS)

- 3 AcM dans la transplantation

- 1 AcM dans les maladies cardio-vasculaires

- 1 AcM dans une maladie neuro-dégénérative (SEP)

- 1 AcM dans l’asthme allergique

- 15 AcM en oncologie

- 1 Acm en ophtalmologie (DMLA)

- 1 AcM dans les maladies osseuses

- 1 AcM en hématologie (HPN) * Juin 2012


Quelques règles de lecture à propos des AcM

Nom Type Ex. d’anticorps

xxmOmab Mouse muromonab (souris) britumomab

xxXImab Chimeric rituximab (chimérique) cetuximab

XXZUmab Humanized trastuzumab (humanisé) alemtuzumab

XxmUmab Fully Human panitumumab (humain) adalimumab


Optimiser les anticorps monoclonaux

*Optimisation de la fixation des AcM et des effets biologiques induits sur la cible :

- affinité et avidité- spécificité «fine»: choix de l’épitope

(effets pro-apoptotiques, cytostatiques …)

*Optimisation des fonctions effectrices :- meilleurs recrutement et activation des

cellules effectrices [cellules NK, neutrophiles, monocytes/ macrophages, CTLs (anticorps bispécifiques, «T-bodies»)]

- meilleure activation du complément (C1q) (voie classique: IgG3> IgG1, IgG2)

=> formation du Complexe d’Attaque Membranaire


AcM optimisés: les anticorps bispécifiques (BsAb)

Ag cible Cellule cible

LyseBsAb

(B)

Drogues

Cytokines

Vecteurs

Haptènes bivalents

Ag cible

Cellule effectrice

Cellule cible

Lyse

Phagocytose

BsAb

Molécule destimulation

(A)


Anticorps bispécifique: 1. Ingénierie cellulaire (quadromes)

BsAb

(Milstein & Cuello, Nature, 305, 537-540, 1983)

Fusion Sélection


Anticorps bispécifique: 2. Ingénierie biochimique (MDX-260, anti-CD64/anti-GD2)

Q représente le N-éthyl succinimidyl; R, le O-phénylène-dissuccinimidyl


Anticorps bispécifiques: 3. Ingénierie moléculaire

VH

VL

Tag

Espaceur

VLa

VHa

VLaVLb

VHb

Fv VHa VLaLrbs

Stop

Etiquette

(GGGGS)3

P

VHa

VLa

Espaceur

Etiquette Etiquette

VHa VHa

VLa

Espaceur

Etiquette

Espaceur

scFv “Diabody” bivalent “Diabody” bispécifique


Génération et ingénierie de fragments d’Ac

1989: Isolement de domaines VH ayant de fortes affinités à partir de banques de domaines VH exprimés dans E. coli (Ward et al, Nature, 341:544)

1993: Ac intracellulaires (“Intrabodies”) (Marasco et al, PNAS, 90:7889) et fragments Fc à usage thérapeutique (Debré et al, Lancet, 342:945)

1993: Ingénierie moléculaire de formats bispécifiques: “diabodies” (Holliger et al, PNAS, 90:6444), “triabodies”….

1993: Découverte d’Ac de Camelidæ dépourvus de chaînes légères (Hamers-Casterman et al, Nature, 363:446)

2008: Régression tumorale chez des patients cancéreux après injection de très faibles doses de fragments d’Ac bispécifiques (Bargou et al, Science, 321:974)


Expression de «single chain Fv (scFv)» à la surface de cellules de mammifères

Espaceur

VHa VLaL Tag

(GGGGS)3

P/O

Stop

TM ± région ICExpression (« Hooking »)

Expression + transduction (« T-bodies »)

VHa

VLa

Espaceur

Tag

scFv-TM-IC

TM ± IC


Anticorps bispécifique de lama VHH: ciblage du RFcIII/CD16 et d’un antigène associé aux tumeurs (ACE)

VHH Ab

bispécifique

Cellule NK

ACE

Cellule tumorale

RFcIII

VHH (anti-ACE) - huC VHH (anti-RFcIII) - huCH1

Fab-like (bispécifique)


L’expression intracellulaire d’un scFv anti-ras neutralisant à l’aide d’un vecteur viral induit la régression tumorale dans des souris nude (HCT 116)

VHa

VLa

Espaceur

Tag

scFv

Utilisation de fragments scFv comme «intrabodies»


Anticorps monoclonaux optimisés:

ingénierie de la région Fc (IgG1)


Fonctions effectrices des IgG dépendantes des récepteurs pour la région Fc des IgG (RFc)

* Fixation aux RFc activateurs (I, IIA, III):* La cytotoxicité dépendante d’anticorps (ADCC)

(cellules NK, monocytes, neutrophiles)* La phagocytose de particules opsonisée (DC,

(macrophages)* L’endocytose de complexes immuns (monocytes,

DC, macrophages, neutrophiles, lymphocytes B)* La sécrétion de cytokines et chimiokines

* Fixation aux RFc inhibiteurs (IIB) : blocage de l’activation cellulaire induite par d’autres récepteurs (BCR, RFc, RFc activateurs…) (lymphocytes B, mastocytes, monocytes…)


Stratégies d’ingénierie de la région Fc :

1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1

ayant une région Fc mutée

2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1

Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)


Sélection de mutants IgG1 ayant une fixation accrue au RFcIIIA et présentant une plus forte ADCC

Stratégie: mutagenèse dirigée de tous les acides aminés exposés aux solvants dans les domaines CH2 et CH3 d’une IgG1 humaine (anti-HER2/Neu, trastuzumab)

Mutants >WT ( FcRIIIA binding)* T256AK290AS298AE333AK334AA339TS298A/E333AS298A/K334AS298A/E333A/K334A

* Numérotation «Eu» (Shields et al., J. Biol. Chem., 2001)

WT

AICC


Stratégies d’ingénierie de la région Fc :

1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée

2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1

Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)


Glc NAc

Mannose

Galactose

Fucose 1,6

NeuAc 2,6

m/z

CpmG0

G1

G1F

G2F

(courtesy of L. Krummen, Genentech, Inc., USA)

Hétérogénéité de la glycosylation des AcM


L’absence de fucose ou un contenu faible en fucose (20-35%),

La présence de galactose et/ou de galactose et d’acide sialique à l’extrémité de/des GlcNAc terminales,

La présence d’une GlcNAc intercalaire,

accroissent la fixation aux RFc

et augmente l’ADCC des IgG1 monoclonales humaines

Ingénierie de la glycosylation (IgG1 humaines)


Les anticorps monoclonaux optimisés

* Optimisation des propriétés pharmaco-cinétiques

* Meilleure bio-distribution et ciblage (notamment au site de la tumeur)

* Meilleure capture de drogues, vecteurs viraux, et haptènes radio-marqués au voisinage de la cellule-cible (dans la plupart des cas, des cellules tumorales)


Les nouveaux défis des anticorps monoclonaux

- Un, deux, trois AcM (bio-terrorisme, oncologie…)?

- Les anticorps conjugués aux drogues (immunoconjugués): le grand retour de la “magic bullet”?

-Les nouveaux formats (Ac bi- ou tri-spécifiques, simples domaines VH, VHH…?

- Nouvelles utilisations: anticorps intra-cellulaires, fragment d’Ac à la surface de cellules effectrices (« T-bodies ») ou cibles (« Hooking »): AcM et thérapie cellulaire?

- Qu’est ce qu’un biosimilaire?!



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