Action de la 8-azaguanine sur la synthèse des protéines et des acides nucléiques chez Bacillus cereus

486 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

ACTION D E LA 8-AZAGUANINE SUR LA SYNTHI~SE

DES PROT]~INES ET DES ACIDES NUCLI~IQUES CHEZ

B A C I L L US C E R E US

H. CHANTRENNE ET S. DEVREUX

Laboratoire de Chimie biologique, Facultd des Sciences, Universit~ de Bruxelles (Belgique)

(Re~u le 26 Juin, 1959)

SUMMARY

E~ect of 8-azaguanine on the synthesis of proteins and nucleic acids in B. cereus

In the presence of 8-azaguanine, protein synthesis is strongly inhibited and the formation of constitutive penicillinase is completely abolished.

Low concentrations of azaguanine which are sufficient to block penicillinase formation do not change the rate of DNA synthesis. Higher concentrations cause an initial slight inhibition which becomes much stronger after about one doubling of the DNA.

Azaguanine increases the rate of RNA formation while being incorporated into RNA. At low concentration the analogue is incorporated for a limited time only; later a large part of it is rejected from the RNA.

The RNA of bacteria which have incorporated azaguanine is more labile in acid medium than normal RNA.

The effects of azaguanine on B. cereus resemble those of chloramphenicol on E. coli and S. aureus.

INTRODUCTION

Les travaux de LASNITSKI, MATTHEWS ET SMITH 1-3 et ceux de MANDEL 4 et de MARKHAM 5 ont 6tabli que l'azaguanine s'incorpore dans les acides ribonucl6iques de Bacillus cereus ~ la place de la guanine et qu'elle inhibe la croissance de ces bact6ries, telle qu'on peut l'6valuer en mesurant la densit6 optique des suspensions bact6riennes.

Nous avons soulign6 ailleurs e-8 que l'inhibition partielle de la "croissance" que l'on mesure ainsi masque des perturbations profondes de la synth~se des prot6ines et des acides nucl~iques. Nos r6sultats exp~rimentaux n'ont 6t~ pr6sent6s jusqu'ici que d'une fa~on sommaire; on en trouvera les d6tails darts le pr6sent article, en mSme temps que quelques observations nouvelles et une discussion plus complete de l'en- semble de nos r6sultats.

MATI~RIEL ET MI~THODES

Bact~rie: Mutant de Bacillus cereus produisant la p6nicillinase comme enzyme constitutif. Ce mutant fut isol6 d'une souche de B. cereus N.C.T.C. 569 selon la m~thode de KOGUT et al2.

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AZAGUANINE ET SYNTHI~SE DES PROTi~INES 487

Milieu de culture: Milieu contenant un hydrolysat de cas6ine et pr6par6 selon POLLOCK et el. 1°.

Milieu d'exp~rience: Le milieu de culture additionn6 de citrate et de Tween 80, selon TORRIANI n. Incubation dans des fioles de ioo ml contenant 20 ml de suspension bact6rienne, et agit6es en thermostat k 3 o°.

Dosage des prot~ines: Selon LOWRY et el. 19". Etalonnage avec une solution de tyrosine. Les r6sultats sont exprim6s en quantit~ de tyrosine donnant la m~me coloration que l'6chantillon dose.

Dosage des acides ribonucl~iques: M6thode ~ l'orcinol, version de MILLER et el. lz. Etalonnage avec une solution d'ARN de levure dont la concentration est d6termin6e par mesure de l'extinction k 260 m/, en admettent qu'une extinction de I.OO correspond k 34.6 vg d'ARN/ml.

Dosage des acides d~soxyribonucl~iques : M&hode de Ceriotti 14. Etalonnage avec de I'ADN de thymus de veau.

Dosage de la p~nicillinase: Selon TORRIAN111. Incorporation de substances marquees clans les prot~ines et les acides nucl~iques:

Sauf indications contraires, les pr6curseurs marqu6s utilis6s dans le pr6sent travail &aient suffisamment sp~cifiques des substances dont on 6tudiait la synthbse pour qu'il sufflt de d&erminer la quantit6 d'isotope radioactif incorpor6 dans les substances pr&ipitbes par l'acide trichlorac6tique.

Des &hantillons de la suspension bact6rienne 6taient m61ang6s k un volume double d'une solution glac6e d'acide trichlorac&ique dans laquelle on avait dissous au pr6alable un peu d'une substance non marqu6e identique, ~ cela pros, au pr6curseur radioactif utilis& Le m61ange ~tait conserv6 3 ° min dans la glace fondante. Le pr&ipit6 &ait ensuite transf6r6 quantitativement sur un filtre "Millipore" de 25 mm, lav6 deux fois sur le filtre avec la m~me solution d'acide trichlorac6tique, une fois encore avec une solution k 5 % de ce m6me acide, apr~s quoi le filtre &ait montr6 sur un support ad~quat'et s&h~ ~ l'air. La radioactivit~ du pr~cipit~ &ait mesur6e ~ l'aide d'un compteur k fen&re mince.

Substances marquees: DL-~asS]m&hionine, DL-[I-14C]valine, DL-[I-14C~leucine, Acide I)L[I-l*C]glutamique, acide z-aspartique et L-ph6nylalanine uniform6ment marqu6s, [2-1~C]uracile, [8-x~C]guanine ont 6t6 fournis par le Radiochemical Centre, Amersham, Grande Bretagne.

La 8-[2-1~C]azaguanine nousa 6t6 aimablement donn6e par le Dr. G. B. BROWN; elle avait 6t6 pr6par6e par le Southern Research Institute pour l'Atomic Energy Commission.

Autres produits: 8-azaguanine: Light's et California Foundation. Guanosine: Schwarz.

RESULTATS EX~PRIMENTAUX

Inhibition de la synth~se des prot~ines par l'azaguanine

La presence d'acides amin6s et de sucres amin6s dens les patois cellulaires de B. cereus complique l'6tude de la synth~se des prot6ines chez cette bact&ie, car elle interdit l'emploi de plusieurs m6thodes classiques de dosage (par exemple la m6thode

la ninhydrine) et restreint consid~rablement le choix des acides amines marquis utilisables comme pr6curseurs sp&ifiques des prot6ines.

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4.88 H. CHANTRENNE, S. DEVREUX

Les patois cellulaires de B. cereus contiennent, ~ c6t6 de trois hexosamines, quatre acides amin6s: alanine, acide diaminopim61ique, acide glutamique 1~ et acide aspartique16; il est 6vident que ces acides amin6s et ceux qui peuvent leur donner naissance doivent 6tre exclus dans les exp6riences d'incorporation dans lesquelles les mesures portent sur la radioactivit~ du pr6cipit6 trichlorac6tique, et que de tr&s grandes pr6cautions doivent 6tre prises pour eviter toute confusion entre synth~se des prot6ines et formation des patois cellulaires ~7,18.

La Fig. I montre l'effet de 36 fig d'azaguanine/ml sur la synth~se des prot6ines dans une suspension de B. cereus. Le temps o correspond au moment de l'addition de l'azaguanine ~ une suspension de bact6ries en croissance exponentielle. Les prot6ines ont 6t6 dos6es par la m6thode de LowRY sur l 'extrait alcalin du pr6cipit6 trichlor-

100

50

25

ac6tique.

/ ./

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./" . y .

o 6'o

/ •

120 180 2,40 min Fig. I. Inh ib i t ion de la syn th~se des prot6 ines pa r l ' a zaguan ine . Les pro t6 ines on t 6t6 dosdes pa r la

m6 thode de LOWRY et al, 1~. • : p a s d ' azaguan ine . • : 36 fig d ' a z a g u a n i n e / m l au t e m p s o.

La Fig. 2a repr6sente les r6sultats d'une exp6rience dans laquelle 36 /~g d'azaguanine ont 6t6 ajout6s k l'instant indiqu6 par la fl~che k des suspensions de bact6ries auxquelles on avait ajout6 respectivement de la DL-[I-14C~valine et de la DL-[I-14C31eucine (0.06 /,moles et 0.3 /~C/ml). Le milieu contenait de l 'hydrolysat de cas6ine k raison de 20 mg/ml. On trouvera dans la Fig. 2b et dans d'autres publica- tions de ce laboratoireS, 8 les r6sultats d'exp6riences semblables dans lesquelles de la L-phenylalanine uniform6ment marqu6e ou de la DL-[35S]m6thionine ont 6t6 utilis6es.

Dans routes ces exp6riences, les r6sultats sont qualitativement les m~mes: l'azaguanine k 36 ~g/ml inhibe aussi bien la synth~se des prot6ines telle qu'on la mesure selon la m6thode de LOWRY 1~ que l'incorporation de m6thionine, valine, ph6nylalanine ou leucine. MANDEL 19 a ~galement observ6 une inhibition de 1'incorporation de ~5S donn6 sous forme de sulfate.

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AZAGUANINE ET SYNTHESE DES PROTEINES 489

Des quantit4s io fois plus faibles d'azaguanine (3.6/~g/ml) produisent aussi une inhibition tr~s nette de la synth~se des prot4ines (Fig. 3). Les r4sultats d'une ex- p4rience dans laquelle les prot6ines ont 6t6 dos4es selon LowRY ont 4t6 publi4s ailleurst Dans certaines exp6riences dans lesquelles des concentrations voisines de 3 ~g/ml ont 4t4 utilis6es, on a observ6 une reprise de la synth~se des prot4ines apr~s une p6riode d'inhibition plus ou moins longue; nous y reviendrons dans une publication ult6rieure consacr6e ~ la restauration de la synth~se des prot4ines apr~s inhibition par l'azaguanine.

La Fig. 3 montre l'effet de faibles concentrations d'azaguanine k la fois sur l'incorporation de L-ph4nylalanine marquee dans les prot4ines et sur la synth~se d'une

1000

75C

50C / /

60 120 180 240 rain

E E

3000

2000

1000

2 Ph4/,

// -1500

• I000 /"

-500 / M4t

- - i I I I 30 60 90 120 min b

Fig. 2. Inhibit ion de l ' incorporation d'acides amin4s marqu4s dens le pr4cipit4 trichlorac4tique. (a) Points noirs: DL-[I-14C]leucine. Points clairs: DL-[i-14C]valine. Cercles: pas d'azaguanine. Triangles: azaguanine (36/,g/ml) ajout6e ~ l ' ins tan t indiqu4 par la fl~che. (b) Points noirs: DL- [82S]m4thionine. Points clairs : L-ph4nylalanine uni lorm6ment marqu4e. Cercles : pas

d'azaguanine. Triangles : azaguanine (36/~g/ml) ajout4e au temps o.

prot4ine d4finie, la p4nicillinase. Dans la souche utilis4e, la p4nicillinase est un enzyme constitutif, une prot6ine parmi tant d'autres que la bact6rie produit normalement. Il est visible que la production de cet enzyme est compl~tement supprim4e alors que l'incorporation de t-ph6nylalanine n'est que partiellement inhib6e par les faibles concentrations d'azaguanine utilis4es. On peut faire la mSme constatation en com- parant l'action de l'azaguanine, mSme k forte concentration, sur la synth6se de l 'enzyme et sur l'incorporation de m6thionine dans les prot6ines e.

Effets de l'azaguanine sur la synth~se des acides nucl~iquss

L'addition de 3.6/~g d'azaguanine/m| ~ une suspension de B. cereus en croissance exponentielle qui contenait au moment de l'addition 0.3 mg de bact4ries (poids sec)/ ml, stimule la synth~se des acides ribonucl4iques, mais n'exerce pas d'action mesurable sur celle des acides d6soxyribonucl4iques. Par exemple, dans l'exp~rience reprise dans

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490 H. CHANTRENNE, S. DEVREUX

la Fig. 4 a, la synth~se de I 'ADN s'est poursuivie ~ la vitesse normale en pr6sence d'azaguanine. La vitesse de synth~se de I 'ARN 6tait ~ peu pros doubl6e pendant les IOO premieres minutes d'action de l'analogue, pour revenir ensuite ~ une valeur normale. On trouvera les r6sultats d'une autre exp6rience de ce type dans une autre

cc

1000

50C

publication 7.

E

- 800

o//

3O

j J/

6 0 9LO 120 min

Fig. 3. Effet de l 'azaguanine sur la synth~se de p6nicillinase const i tut ive. P6nicill inase: O : pas d 'azaguanine. A : 3.6 fig d 'azaguanine/ml ~ la 3oe minute . L-Ph6nylalanine dans le pr6cipit6

tr ichlorac6tique : • : pas d 'azaguanine. • : 3.6 fig d ' azaguanine /ml h la 3oe minute .

En pr6sence d'azaguanine ~ une concentration IO fois plus 61ev6e (36 ffg/ml), la synth~se d 'ADN peut se poursuivre ~ la vitesse normale pendant un certain temps, ou subir d~s le d~but une 16g~re inhibition. Dans tous les cas, on observe un ralen- tissement tr~s prononc6 de la synth~se d 'ADN vers le moment o/1 la quantit6 d 'ADN a doubl6 mais la synth~se se poursuit ~ faible vitesse pendant plusieurs heures (Fig. 4b).

La synth~se d 'ARN ne subit aucune inhibition en pr6sence d'azaguanine concentration 61ev6e (36/~g/ml); il arrive m~me que la quantit6 d 'ARN form6 soit plus 61ev6e que darts le t6moin 8. I1 faut souligner ici que nos r6sultats expriment la quantit6 d 'ARN par ml de suspension, et que les bact6ries-t6moins sont en pleine croissance tandis que les bact6ries soumises k l 'action de fortes concentrations d'azaguanine cessent bient6t de se multiplier et qu'elles ne font plus de prot6ines. I1 en r6sulte que, par bact6rie, la production d 'ARN est toujours beaucoup plus 61ev6e en pr6sence d'azaguanine qu'en son absence.

Pour une m6me quantit6 d'ADN, les bact6ries trait6es par l 'azaguanine contiennent donc beaucoup plus d 'ARN et beaucoup moins de prot6ines que les bact6ries normales s.

Incorporation d'azaguaninc dans I'ARN A des suspensions de bact6ries en croissance exponentielle, ajoutons de la [2-14C]


AZAGUANINE ET SYNTHI~SE DES PROTI~INES 491

azaguanine (4/zC/mg) k diverses concentrations et d6terminons comment 6volue, au cours du temps, la quantit6 totale de 14C contenu dans les acides nucl6iques d'un ml de suspension. L'azaguanine s'incorpore telle quelle dans I'ARN. Elle ne subit aucune dilution isotopique, puisque la bact6rie ne produit pas d'azaguanine. La radioactivit@

~ f

I0C

5C

15C x. Z em < 04 3.

-~O

o f

15( ARN o

150 120 180 "2,40 rain 60 120 180 2'40 mln a b

i < -~0

Fig. 4. Effets de l 'azaguanine sur la synth~se des acides nucMiques. Poin ts noirs : ADN. Points clairs : ARN. Cercles: pas d 'azaguanine . Triangles: azaguanine ajout6e au t e m p s o. (a): 3 . 6 # g

d 'azaguanine /ml . (b) : 36/zg d 'az~guanine/ml.

du pr6cipit6 trichlorac6tique est donc une mesure correcte de la quantit6 d'azaguanine contenue dans les acides nucl6iques.

En pr6sence de 36/~g d'azaguanine/ml, l'incorporation se poursuit presque lin6airement pendant plusieurs heures (Fig. 5) ainsi que MANDEL 4 l'avait d6j ~ observ6. Mais lorsque la concentration de l'analogue est io ou 20 fois plus faible, l'incorporation ralentit bient6t, et la quantit@ totale d'azaguanine contenue dans l'acide nucl6ique passe par un maximum pour d6crottre r6guli~rement ensuite.

Cette exp6rience montre que si les concentrations d'azaguanine ne sont pas trop 61ev6es, les bact6ries peuvent 61iminer la purine 6trang~re apr~s qu'elle se soit incor- por6e pendant quelque temps dans leur ARN.

MATTHEWS ET SMITH 2,3 e t MANDEL ET MARKHAM 4,5 ont montr6 que l'addition d'une purine ou d'un nucl6oside purique normal k une suspension de B. cereus

intoxiqu6 par l'azaguanine provoque l'expulsion de l'analogue qui s'6tait incorpor6 dans les ARN. I1 est donc vraisemblable que les observations rassembl6es dans la Fig. 5 rel~vent du m@me ph6nom~ne, et que lorsque la concentration de l'azaguanine n'est pas trop @l@vCe, les purines produites par la bact6rie elle-m@me d6placent l'analogue et provoquent son ~limination, comme le feraient des purines exog~nes.

Si nous rapprochons cette observation de celles que nous avons rapport6es plus haut concernant l'action de faibles concentrations d'azaguanine sur la synth~se des acides nucl6iques, nous constaterons que tout se passe comme si de I'ARN suppl6- mentaire s'accumulait dans les bact6ries pendant que de l'azaguanine s'y incorpore,



et comme s'il cessait de s'accumuler lorsque l 'azaguanine est rejet6e. L'action de faibles concentrations d'azaguanine sur la synth6se d 'ARN est semblable k celle de concentrations plus fortes, mais elle est de plus courte dur6e parce que ]es bact6ries se d6barrassent de l 'azaguanine aprhs un certain temps.

200C

1001

/ 6 g /

60 120 180 240 mln

Fig. 5. Evolut ion de la quanti t6 totale de[2-t4C]azaguanine contenue dans les acides nucl6iques d 'un rnl de suspension bact6rienne, pour les trois concentrations d 'azaguanine indiqu6es, iooo

coups/min correspondent & 1.25/~g d'azaguanine.

Propri~t~s m~taboliques de I 'ARN /orm~ e~ prfsence d'azaguanim

L'azaguanine inhibe donc fortement la synth6se des prot6ines chez B. cereus et elle provoque l 'accumulation d 'ARN dans la bact6rie. Cet ARN exc6dentaire est anormal, puisqu'une partie de la guanine y est remplac6e par de l 'azaguanine 5. La purine anormale n'exerce que tardivement une action sur la synth6se de I 'ADN, et elle n 'a pas d'effet sur la formation des constituants des parois cellulaires 8.

Toutes ces observations rappellent l 'action de la chloromyc6tine sur S. aureus: l 'antibiotique inhibe en effet la synth6se des prot6ines, sans affecter celle des parois cellulaires17,18 et il provoque l 'accumulation d'un ARN anormal. L 'ARN qui s'accumule chez E. coli en pr6sence de chloromyc6tine se distingue de I 'ARN normal par son instabilit6 m6tabolique; lorsque les bact6ries sont transf6r6es darts un milieu d6barrass6 de chloromyc6tine I 'ARN qui s'6tait accumul6 en pr6sence de l 'antibiotique est d6truit et ses produits de d6gradation sont rejet6s darts le milieu 23, 27.

Dans le but de comparer l 'action de l 'azaguanine ~ celle de la chloromyc6tine, nous avons cherch6 & savoir ce qu'il advient de I 'ARN form6 en pr6sence d'azaguanine lorsque l'effet de la purine anormale est supprim6 par addition de guanosine. On pourrait penser que l 'azaguanine est rejet6e ~-5 parce que les ARN anormaux sont d6truits.

Si les ARN des bact6ries en croissance ne pr6sentent pas de renouveUement


AZAGUANINE ET SYNTtII~SE DES PROTI~INES 493

notable, il est facile de distinguer les ARN qui existaient avant l'addition de l'azaguanine de ceux qui se sont form6s en sa pr6sence; il suffit d'ajouter au milieu de l'uracile marqu6e pendant une p6riode bien choisie. Nous avons ~tudi6 par ce moyen le sort des pyrimidines des ARN form6s en pr6sence d'azaguanine lorsque l'analogue est expuls6 sous l'effet de la guanosine.

Dans l'exp6rience dont les r6sultats sont rassembl6s dans le Tableau I, la ~2-14C] - uracile a 6t6 ajout6e 45 rain apr~s l'azaguanine (36/zg/ml) k une suspension de bact6ries en croissance; I h apr~s l'addition de l'uracile, les bact6ries ont 6t6 lav6es dans un milieu contenant de l'uracile non marqu6e et de l'azaguanine, puis incub6es soit en pr6sence de guanosine soit en son absence dans ce m6me milieu. I1 est clair (Tableau I) que les pyrimidines de I'ARN form6 en pr6sence d'azaguanine ne sont pas rejet6es, alors que pendant ce temps l'azaguanine est expuls6e de I'ARN dans lequel elle s'6tait incorpor6e (Tableau II).

TABLE I

]~FFET DE LA GUANOSINE SUR L'URACILE INCORPOR]~E ]~N PR]~SENCE D'AZAGUANINI~

A une suspension de B . cereus (0.3 mg/ml) en croissance, on a ajout6 de l 'azaguanine (36/zg/ml) puis, 45 rain plus tard (temps o), de la [2-14Cluracile (I.5 # g e t 0.06/zC/ml). Entre la 65e et la 8oe min, les bact6ries ont 6t6 centrifug6es, lav6es deux lois ~ 3 °o avec du milieu de culture additionn6 d'uracile non radioactive et d 'azaguanine (36 #g/ml), et f inalement reprises dans un milieu de m8me composition. La suspension a ~t6 partag6e en deux parties 6gales; ~ l 'une d'elles on a ajout6 de la guanosine (I35 #g/ml), l 'autre a servi de t6moin. Des 6chantillons de i ml ont 6t6 pr~lev~s et m61ang6s ~ une solution d'acide trichlorac~tique; les pr~cipit6s ont 6t6 recueillis

sur filtres "Millipore" et leur radioactivit~ a 6t6 mesur6e.

Temps Radioactivitd du prdcipitd (rain) coups/rain/rag de suspension

o o 15 I7II 3 ° 4284 60 781o

65 ~ 80 (lavages, partage) 80 (o ~g guanosine) (+135 ~g guanosine/ml) 9o 64o7 6584

12o 6652 6514 15o 699o 7127 I8o 6831 7212 215 681I 7335 240 6529 7164

Chez B. cereus, les pyrimidines de I'ARN form6 en pr6sence d'azaguanine ne subissent donc pas le m~me sort que l'azaguanine contenue darts cet ARN quand on ajoute de la guanosine: les pyrimidines restent dans des polynucl6otides tandis que l'azaguanine est expuls6e et se retrouve dans le milieu sous Iorme d'azaguanosine s. Ceci pourrait indiquer un ~change entre l'azaguanine des ARN et la guanosine libre sans que l'6difice polynucl6otidique se d6fasse compl~tement. MATTHEWS ET SMITH 2 ont, les premiers, attir6 l 'attention sur une teUe possibilit6.

Cultivons B. cereus en pr6sence de [8-14C]guanine, puis transf6rons les bact6ries marquees dans un milieu non radioactif, et ajoutons alors de l'azaguanine (36 ~C/ml). Bien que l'action de l'azaguanine sur l'accroissement de la densit6 optique de la

B i o e h i m . B i o p h y s . Ac ta , 39 (196o) 486-499

494 H. CHANTRENNE, 8. DEVREUX

suspension se fasse sentir normalement, toute la guanine qui se trouvait dans I 'ARN au d6but de l'exp6rience y reste (Tableau III); elle n'est aucunement d6plac6e par l'azaguanine. On ne peut donc pas dire que la guanine et l'azaguanine s'6changent.

T A B L E i i

]~FFET DE LA GUANOSINE SUR L'AZAGUANINE PR~ALABLEMENT INCORPOR~E

La [2-x4CJazaguanine a 6t6 a jout6e (36 #g /ml ) au t e m p s o ~ une suspens ion de B. cereus en croissance. 65 min p lus tard , la su spens ion a 6t6 par tag6e en deux par t i es 6gales. De la guanos ine (135 #g /ml ) a 6t6 a jout6e ~t l ' une d'elles, l ' au t r e n ' a re~u aucune addi t ion. Les chiffres i nd iquen t la radioact iv i t6 du pr6cipit6 t r ichlorac6t ique pa r m l de suspens ion bac tdr ienne , iooo coups / ra in

co r r e sponden t ~ 1.25 # g d ' azaguan ine .

Temps Radioactivitd du pvdcipit (m~n) eoups/min/ml de suspension

o 4 15 i7o 3 ° 400 60 683 65 (o ~g guanosine) ( + 135 ~ g g u a n o s i n e / m l ) 9 ° 95 ° 541

12o 1251 457 15o 1572 360 18o 1793 283 14o 2o5o 230

T A B L E I I I

~FFET DE L'AZAGUANIN~ SUR LA GUANIN~ PRI~ALABLI~MENT INCORPORI~E

Les bact6r ies on t ~t6 cul t iv6es dans u n mi l ieu c o n t e n a n t 2 # m o l e s de [8-14C]guanine (i # C / # m o l e ) / ml. El les on t 6t6 rdcolt6es apr~s 18 h de cul ture , lav6es e t repr ises dans du mi l ieu de cu l ture sans guanine , g 3 o°. La suspens ion de bact6r ies m a r q u 6 e s a 6t6 par tag~e en deux pa r t i e s 6gales; ~t l ' une d 'e l les on a a jou t6 36 #g d ' a z a g u a n i n e / m l , l ' au t r e a 8t6 conservde c o m m e t6moin . Les chiffres c i -dessous i nd iquen t la radioact iv i t6 du pr6cipit~ t r ichlorac~t ique d '6chan t i l lons (i ml) de sus-

pens ion bac t6r ienne pr61ev6s au cours de l ' i ncuba t ion .

Temps (min)

Radioactivild du prdcipitd Coups/min/ml de suspension

o I~g azaguanine 36 t*g azaguanine/ml

o 3703 387 ° 3 ° 3575 3886 60 3696 3697 90 3663 3769

12o 3882 3837 18o 3545 3612

Le remplacement--si c'est de cela qu'il s ' ag i t - -ne se fait que dans un sens: l'acide guanylique se substitue peut-~tre ~. une partie de l'acide azaguanylique pr6sent dans I 'ARN anormal, mais l'acide azaguanylique ne se substitue pas au nucl6otide normal darts les ARN normaux. Le remplacement est donc propre aux ARN anormaux; il n'est sans doute possible que parce que l'acide azaguanylique se trouve surtout en bout de chaine 5. Nos exp6riences n'excluent cependant pas un remaniement plus profond des ARN anormaux sous l'aetion de la guanosine.

Bioch im . B i o p h y s . Ac ta , 39 (196o) 486-499


Influence de l'azaguanine sur la stabilitd chimiaue de I 'ARN

Des irr6gularit6s dans les r6sultats des dosages d ' A R N ont attir6 notre a t tent ion sur la labilit6 en milieu acide des A R N chez les bact6ries qui ont subi l 'action de l 'azaguanine. Nous avons 6tudi6 syst6matiquement l 'hydrolyse de I ' A R N en milieu HC104 3 % a 37 °.

A une suspension de bact6ries en croissance exponentielle, ajoutons 36 ~g d 'azaguanine/ml puis, 15 min plus tard, de la [2-14C]uracile (o.I vC et IO vg/ml). Pr61evons des 6chantillons de cette suspension 30, 60, 12o et 18o min plus tard, et m61angeons-les ~t un volume d'alcool, & o °. Apr~s lavage ~ l'alcool 70 %, les pr6cipit6s seront remis en suspension dans de l 'acide perchlorique & 3 % et maintenus k 37 ° en thermostat . Des 6chantillons pr~lev6s au cours de l ' incubation seront filtr6s rapidement sur filtre "Millipore". Apr&s lavage par de l 'acide perchlorique froid, les pr6cipit6s seront s6ch6s et leur radioactivit6 mesur6e.

La quantit6 de 14C restant sur le filtre est une mesure approxilnative de la quanti t6 d ' A R N form6 en pr6sence d 'azaguanine et non encore hydrolys6. (On n6glige ici I 'ADN qui contient environ IO % du 14C avant l 'hydrolyse.)

I1 est clair que les A R N form6s en presence d 'azaguanine sont labiles et qu'ils le sont d ' au tan t plus que l 'analogue a agi plus longtemps (Fig. 6a).

La mSme exp6rience a 6t6 faite en marquan t les ARN form6s avant l 'action de l 'azaguanine. Pour cela, B. cereus a 6t6 cultiv~ dans un milieu contenant 7/~g et 0.03/~C de [2J4C]uracile/ml, transf6r~ dans un milieu non radioactif oh il a ~t6 cultiv6 encore pendant 2 h. Ensuite les bact6ries ont 6t6 lav6es et reprises dans un milieu frais contenant de l 'uracile non radioactive. La suspension a 6t6 partag6e en deux; l 'une des partie a 6t6 additionn6e de 36 ~g d'azaguanine/ml, l 'autre a servi de t6moin. On a

10C

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(~ 60 720 rain (3 6~9 120 rain t Temps d'hydrolyse Temps d'hydrolyse

a b

Fig. 6. Labilisation des ARN pendant l'incorporation d'azaguanine. Courbes d'hydrolyse dans HClO4 3 % & 37 ° des acides nucl$iques de bact~ries pr61ev6es & diff~rents temps apr~s l'addition d'azaguanine (36 #g/ml). Les chiffres inscrits aupr~s des courbes indiquent la dur6e d'incubation des bact6ries en pr6sence d'azaguanine. (a) Courbes d'hydrolyse des acides nucl6iques form6s en pr6sence d'azaguanine. (b) Courbes d'hydrolyse des acides nucl6iques qui s'dtaient form,s avant

l'addition de l'azaguanine (voir texte).



6tudi6 comme pr6c6demment l 'hydrolyse de I 'ARN marqu6 (c'est 5. dire dans le cas pr6sent I 'ARN form6 en l 'absence d'azaguanine). La Fig. 6b montre que l 'azaguanine provoque une certaine labilisation des ARN qui s'6taient form6s dans les bact6ries avant l 'addition de l'analogue. Mais l'effet est beaucoup plus tardif que pour les ARN form6s en pr6sence de l 'azaguanine.

I1 ne semble pas que ces modifications des propri6t6s des ARN puissent s'expliquer par la pr6sence, l 'activation ou la formation d'enzymes nucl6olytiques. En effet, nous n'avons pu d6tecter aucune activit6 de ce type en effectuant des dosages de "fibo- nucl6ase" dans des extraits de bact6ries broy6es ~ l'alumine. La recherche d'enzyme a ~t6 effectu6e ~ pH 5 et 7, par les m6thodes de CHANTRENNE 28, de KUNITZ 27 et de DICKMAN a°. Les dosages n 'ont r6v616 que des traces d'activit6 nucl6asique qui n'6taient d'ailleurs pas modifi6es par le traitement pr6alable des bact6ries par l 'azaguanine.

DISCUSSION

Nos r6sultats montrent clairement que la synth~se des prot6ines est fortement inhib6e par l'azagunine. Que l 'on dose les substances prot6iques par la m6thode de Lowry, on que l 'on mesure l 'incorporation de m6thionine, de ph6nylalanine, de leucine ou de valine dans les substances pr~cipit6es par l'acide trichlorac6tique, on arrive 5. la m6me conclusion. MANDEL a 6galement observ6 que l 'incorporation des acides amin6s contenant du soufre est fortement inhib6e 19. Toutefois l 'incorporation de l'acide glutamique dans le pr6cipit6 trichlorac6tique de m~me que la synth~se des substances dos6es par la ninhydrine n'est pas inhib6e; pour un accroissement donn6 de la densit6 optique, elle est m6me accruO 1. MANDEL pense que l'analogue modifierait les pro- portions des diff6rents acides amin6s qui s'incorporent dans les prot6ines. Nous avons obtenu pour l'acide glutamique et l'acide aspartique ainsi que par des dosages 5. la ninhydrine des r6sultats qui s'accordent parfaitement avec ceux de IV[ANDEL, mais nous n'en avons pas tenu compte car nous croyons que ces donn6es renseignent mal sur la synth~se des prot6ines. En effet, MANDELSTAM ET ROGERS 17, ainsi que HANCOCK ET PARK ls ont attir6 l 'attention sur la n6cessit6 de distinguer les acides amin6s incorpor6s dans les prot6ines de ceux qui font partie des patois bact6riennes. Nous avons montr6 dans une autre publication s que l 'azaguanine n'exerce aucune inhibition sur la synth~se des parois bact6riennes dans des conditions oil elle inhibe fortement la synth~se des prot6ines. Or, les parois de B. cereus contiennent de l'alanine, de l'acide glutamique, de l'acide aspartique et de l'acide diaminopim61ique 15,1~. La diff6rence de comportement de la m6thionine, cyst6ine, ph6nylalanine, valine d'une part et des acides glutamique et aspartique d 'autre part s'explique sans doute par le fait que les premiers ne s'incorporent que clans les prot6ines tandis que les seconds sont des pr6curseurs ~ la lois des prot6ines et des constituants non prot6iques des parois bact6riennes, dont la formation n'est pas affect6e par l 'azaguanine.

D'ailleurs, RICHMOND s2, qui a 6tudi6 l'effet de plusieurs toxiques sur B. subtilis, bact6rie tr~s 6troitement apparent6e ~ B. cereus, a 6tabli que l 'azaguanine inhibe fortement l 'incorporation d'alanine dans les prot6ines, sans affecter l ' incorporation du m~me acide amin6 dans les patois bact6riennes isol6es par un traitement limit6 au lysozyme.

Nous croyons aussi que la comparaison de la densit6 optique des suspensions de bacteries trait~es par l 'azaguanine ~ celle de bact6ries normales peut induire en erreur.


AZAGUANINE ET SYNTHESE DES PROTEINES 497

En effet, l'analogue modifie profond6ment les vitesses relatives de synth~se des pro- t6ines, ARN, ADN et patois bact6riennesS; aussi la composition des bact6fies intoxi- qu6es est-elle toute diff6rente de celle des bact~ries t6moins. La quantit6 de constituants des patois bact6riennes est fortement accrue par rapport aux prot6ines, et la densit~ optique n'a pas ]a mSme signification chez les bact6ries qui ont subi l'action de l'azaguanine que chez les t6moins. C'est la raison pour laquelle nos r6sultats n'ont pas 6t6 rapport6s k la densite optique des suspensions.

Ces remarques n'excluent pas que l'id6e de MANDEL puisse 8tre en partie correcte. La faib!e synth~se de prot6ines qui se poursuit en presence d'azaguanine pourrait correspondre k la formation de proteines anormales. L'inhibition complete de la synth~se de p6nicillinase dans des conditions oh l'incorporation de ph6nylalanine n'est pas compl~tement supprim6e (Fig. 3) ainsi que d'autres ph6nom~nes qui accompagnent le r6tablissement de la synth~se prot6ique apr~s inhibition par l'azaguanine 3~-35, s'accordent en effet avec l'id~e que l'azaguanine agirait au niveau d'un m6canisme qui r6git la sp6cificit6 des syntheses prot6iques.

Quoiqu'il en soit, les r6sultats de MANDEL et les n6tres s'accordent pour montrer que la synth~se de prot6ines parfaites--sinon celle de substances polypeptidiques-- est supprim~e peu de temps apr~s l'addition de l'azaguanine. I1 en r6sulte que le contenu en enzymes par ml de suspension bact6rienne cesse d'augmenter quelques minutes apr~s l'addition de l'analogue tandis qu'il s'accroit au rythme de la croissance chez les bact6ries normales. On peut pr6voir que les syntheses deviendront t6t ou tard lin6aires dans une suspension de bact6ries intoxiqu6es par l'azaguanine, exactement comme cela se produit chez des bact6ries soumises k l'action d'analogues d'acides amin6s m.

Plusieurs observations indiquent que l'azaguanine peut inhiber la synth~se des prot6ines dans divers types de cellules, par exemple Bacillus subtilis 32, 41, Staphylococcus aureus ~, Tetrahymena gdeii ~, les racines d'oignons39; elle inhibe aussi la synth~se d'anticorps par des cellules de rate de lapin 4°. C'est peut-Stre en entravant la synth~se des prot6ines qu'elle ralentit la croissance de certaines tumeurs ~, le d6veloppement de l 'embryon de poulet 47, celui du gam6tophyte de foug~re 44 et la multiplication de bact6riophages ~, ~.

La nature mSme de l'azaguanine et la suppression de ses effets par la guanosine nous renseignent sur son mode d'action. Elle se substitue sans doute k la guanine dans une substance impliqu6e dans la synth~se des prot6ines. MANDEL a a soulign6 que l'inhibition de la croissance est plus directement li6e k la teneur en azaguanine des acidosolubles qu'k celle des acides nucl6iques. Cependant chez Tetrahymana gddi, l'inhibition de la croissance et de la synth~se des prot6ines par l'azaguanine ne s'observe qu'en pr6sence d'uracile3~,~; elle d6pend sans doute de la synth~se de polynucl6otides. I1 est donc probable que c'est en s'incorporant dans un acide ribo- nucl6ique particulier, en liaison m6tabolique assez 6troite avec les acidosolubles, que l'azaguanine inhibe la synth~se des prot6ines.

Cela n'exclut nullement une action de l'azaguanine sur d'autres ARN, plus inertes, voire sur I'ADN.

Les effets de faibles concentrations d'azaguanine (3 a 4 tzg/ml) sur la formation des prot6ines et des ARN sont qualitativement semblables ~ ceux de concentrations IO lois plus fortes. Par contre, la synth~se d'ADN n'est inhib~e que si la concentration de l'analogue est 61ev6e. I1 en r6sulte qu'on peut dissocier ces effets.

Biochirn. Biophys. Acta, 39 (196o) 486-499

49 8 H. CHANTRENNE, S. DEVREUX

En pr6sence de 3.6 ~g d'azaguanine/ml, concentration qui suffit {t supprimer la synth~se d'enzymes ac t i f s - -e t peut-6tre celle de route prot6ine normale-- l 'ADN peut effectuer plusieurs duplications. Nous ignorons si I'ADN qui se forme dans ces conditions est normal; mais puisqu'il s'accroit au m6me rythme que chez les bact6ries t6moins, il faut en conclure qu'il conserve au moins la capacit6 d'accomplir la fonction qui lui revient dans sa propre multiplication.

Au contraire, si la concentration de l'azaguanine est IO fois plus 61ev6e, la vitesse de synth~se de I'ADN est l~g~rement r6duite d~s le d6but, et elle diminue fortement vers le moment oh la quantit6 d'ADN a doubl6. Tout se passe comme si I'ADN form6 dans ces conditions perdait, dans une large mesure, la facult6 de se multiplier. Cela s'explique peut-~tre par l'incorporation de faibles quantit6s d'azaguanine aux chaines d'ADN form6es en pr6sence de concentrations ~lev6es de l'analogue.

Soulignons enfin que les effets de l'azaguanine sur B. cereus sont tr~s semblables k ceux de la chloromyc6tine: inhibition de la synth~se des prot6ines, accumulation d'ARN anormaux, inhibition tardive de la synth~se des ADN, absence d'action sur la formation des parois cellulaires. It est vraisemblable que les deux toxiques agissent k peu pros au mSme niveau sur le m&anisme de ces syntheses.

R]~SUME

L'azaguanine inhibe fortement la synth~se des prot6ines et elle supprime compl&e- ment la formation de p6nicillinase constitutive, chez B. cereus.

De faibles concentrations d'azaguanine suffisantes pour supprimer la synth~se de p6nicillinase ne modifient pas la vitesse de synth~se de I'ADN. Des concentrations plus 61ev6es exercent sur la synth~se de I'ADN une certaine inhibition qui s'accentue vers le moment oh I'ADN a doubl6.

L'azaguanine stimule la synth~se des ARN. Lorsque la concentration de l'azaguanine est faible, l'analogue ne s'incorpore dans les ARN que pendant quelque temps; une grande partie de l'azaguanine contenue dans les ARN est ensuite 61imin6e.

L'ARN de bact6ries qui ont incorpor6 de l'azaguanine est plus labile en milieu acid que I'ARN normal.

L'action de l'azaguanine sur B. cereus ressemble fort k celle de la chloromyc~tine sur E. coli ou sur S. aureus.

REMERCIEMENTS

Nous remercions vivement le Dr. G. B. BROWN de nous avoir procur6 de l'azaguanine radioactive.

Un des auteurs (S.D.) est chercheur agr66 de l 'Institut Interuniversitaire des Sciences Nucleaires.

Le pr6sent travail a b6n6fici6 de l'aide du Fonds national de la Recherctm scientifique, de l 'Institut interuniversitaire des Sciences nucl6aires, et du Centre interuniversitaire de Recherches enzymologiques.

B I B L I O G R A P H I E

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Action de la 8-azaguanine sur la synthèse des protéines et des acides nucléiques chez Bacillus cereus