AEB20111 Marc Bonneu ESTBB 2008 Les approches protéomiques

AEB2011 1Marc Bonneu ESTBB 2008

Les approches protéomiques

Plan

1-Séparation des protéines par électrophorèse

2-Identification des protéines par spectrométrie de masseCarte peptidiqueSéquençage peptidique 3-Quantification des protéinesComparaison gel 2DMarquage isotopiqueLabel Free

4-Caractérisation des protéinesInteractions protéine-protéineModifications post-traductionnelles

SDS-PAGE


Avantage : • toutes les protéines y compris les

protéines membranaires

Inconvénient :• Plusieurs protéines dans la même

bande• Les petites protéines migrent toutes

ensemble au niveau du front de migration

Petites protéines emprisonnées dans des micelles de SDS

Remplacement de la glycine par un tripeptide de glycine (Tricine)

Tris-Tricine


pI

taille

Avantages :Excellente résolution

Les limites :

Protéines majeuresProtéines solubles4 < pI <1115 000 Da < PM < 150 000 Da

IPG/SDS-PAGE


16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride)

Détergent cationique16-BAC

SD

S

16-BAC/SDS-PAGE


Avantages :Séparation des protéines hydrophobes possible

Les limites :Résolution réduite

SyproRuby

1 2 3 4 5 6 7

Bleu Colloïdal

1 2 3 4 5 6 7

ProQ diamond

1 2 3 4 5 6 7

Nitrate d’argent

1 2 3 4 5 6 7

Coomassie R250

1 2 3 4 5 6 7

Ruthenium 16µl/L

1 2 3 4 5 6 7

1: 1000 ng/ protéine2: 500 ng/ protéine3: 250 ng/ protéine4: 125 ng/ protéine5: 62.5 ng/ protéine6: 31.25 ng/ protéine7: 15.6 ng/ protéine

La détection des protéines sur gel


Limite de détection

Gamme dynamique

Coloration au bleu de Coomassie 500 ng 1 ordre

Coloration au bleu de Coomassie colloïdal classique 100 ng 2 à 3 ordres

Coloration au bleu de Coomassie colloïdal rapide 20 ng 2 à 3 ordres

Coloration au nitrate d’argent 10 ng 1 ordre + prot spécifique

Coloration au nitrate d’argent non compatible avec la masse 1 ng 1 ordre + prot

spécifique

SyproRuby®, DeepPurple®, Ruthénium 1 ng 3 ordres

Marquage radioactif 0.000 2 ng excellente


La détection des protéines sur gel

La gamme dynamique est définie comme le rapport du signal maximal mesurable sur le signal minimal mesurable

Spectromètre de masse : mesure précise du rapport m/z d’un ion

peptideou

protéineion m/z

m : masse de l’ionz : valence de l’ion

unité : Thompson

Ionisation Analyseen m/z

H+ Spectromètre de Masse

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse

protéine gène

Pourquoi le spectromètre de masse mesure le rapport m/z ?


+

++

+

+ Champ électrostatique

m = 1000 Da

m = 1000 Da

m = 2000 Da

m/z =

m/z =

m/z =

1000 + 1

1000 + 2

2000 + 1

1

2

1

= 1001

= 501

= 2001

H+ = 1 Da

Vide suffisant

Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?


m/z =

m/z =

m/z =

1000 + 1

1000 + 2

2000 + 1

1

2

1

= 1001

= 501

= 2001

H+ = 1 Da

501

1001

2001



m/z =

m/z =

m/z =

1000 + 1

1000 + 2

2000 + 1

1

2

1

= 1001

= 501

= 2001

H+ = 1 Da

501

1001

2001



m/z =

m/z =

m/z =

1000 + 1

1000 + 2

2000 + 1

1

2

1

= 1001

= 501

= 2001

H+ = 1 Da

501

1001

2001

Le massif isotopique



Le massif isotopique

x 12C(x-1) 12C + 1 13C

(x-2) 12C + 2 13C

La différence de masse entre deux pics

successifs d’un massif isotopique est égale à

1Da



x 12C(x-1) 12C + 1 13C

(x-2) 12C + 2 13C



1Da

a Th a Th



x 12C(x-1) 12C + 1 13C

(x-2) 12C + 2 13C



1Da

a Th a Th

a = 1 z = 1a = 0.5 z = 2

a = 0.33 z = 3

Protéine àidentifier

Peptides générés par protéolyse

Spectre MS expérimental

YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD

LKLLIHGFDSQASDRFGNHGGTKTRFDFEEKYILMNPRTHSEIK

Séquences des protéines

Peptides générés in silico

Spectres MS théoriques

Comparaison

m/z

I

m/z

I

KK

K

K

R

R

Carte peptidique


Protéine Peptides générés par protéolyse

Spectre MS expérimental

YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD

LKLLIHGFDSQASDRFGNHGGTKTRFDFEEKYILMNPRTHSEIK

Séquences des protéines

Peptides générés in silico

Spectres MS2

théoriques

Co

mp

arai

sonm/z

I

m/z

I

KK

K

K

R

R

m/z

I

Spectre MS2 expérimental

Séquençage peptidique


découpage

Digestion in-gel

Identification par spectrométrie de masse

LC/MS/MS

Compilation et élimination de la

redondance

Identification des protéines dans un mélange complexe


trypsine

Protéines

dénaturation

Peptides

pH 3.5 pH 10

24 cm

32 morceaux

électrophorèse

Identification par spectrométrie de masse

LC/MS/MS

Compilation et élimination de la

redondance

Strip IPG


Digestion in-gel

Carte peptidique séquence peptidique

Identification par MS

RapidePeu coûteux

Attention à l’overlapping

Identification systématique des protéines d’un protéome


3-Quantification des protéines

Quantification relative par électrophorèseQuantification relative spectrométrie de masse

Marquage isotopiqueSILACICATiTRAQ

Label FreeQuantification absolue par spectrométrie de masse

Comparaison de l’abondance des protéines entre des états physiologiques différents

synthèse dégradationabondance

modificationmodification

synthèse abondance dégradation

F1 F2

Identification par MSCarte peptidiqueSéquence peptidique

Quantification relative par électrophorèse bidimensionnelle


La spectrométrie de masse n’est pas quantitative

I

m/z

MS

1 Protéine Digestion Peptides

équimolaires

p


La spectrométrie de masse n’est pas quantitative et pourtant …

I

m/z

MS

1 Protéine Digestion Peptides

équimolaires

I

m/z

MS

Peptide p 14N

Peptide p 15N

p

I

m/z

MSI

m/z

MS

1:11:2

1:10


SILAC

ICAT

iTRAQ

Digestiontrypsique

échantillon

protéine

peptide

Spectrométrie de masse

La comparaison par marquage isotopique et analyse MS

Marquage isotopique


iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification

reporter balance

114 31+ 145115 30+ 145116 29+ 145117 28+ 145

Groupementréactif

H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…

R1 R2

H3CN

NN

OO

O

O


Mélange

MarquageiTRAQ 114

protéine

protéolyse

t0 T0+20 min

MarquageiTRAQ 115

protéine

protéolyse

T0+40 min

MarquageiTRAQ 116

protéine

protéolyse

T0+60 min

MarquageiTRAQ 117

protéine

protéolyse



114 31

115 30

116 29

117 28in

ten

sit

é

m/z

MS

inte

nsit

é

m/z

MS/MS

inte

nsit

é

m/z

11

41

15

11

61

17

peptidebalancereporter






quanti

té

temps de rétention

Label Free

LC/MS/MS

inte

nsi

té

m/z m/z m/z m/z

MS MS MS MS

C18


Label Free

inte

nsi

té

m/z m/z m/z m/z

MS MS MS MS

inte

nsi

té

Même temps de rétention


Label Free

inte

nsi

té


inte

nsi

té


Échantillon 1

Échantillon 2


Protéines dont protéine P à doser

protéolyse

Peptides dont peptide p de la protéine p

Peptide p marqué par un isotope stable(quantité connue)

Analyse par LC/MS/MS

La quantification absolue : AQUA®


m/z

MS

Peptide p Peptide p AQUA®

3-Caractérisation des protéines

Complexe protéique AgglomératsModification

post-traductionnelle

Complexe protéique

Le système double hybrideBlue Native / SDS-PAGECo-immunoprécipitationFar WesternPurification :

-Pull down-Purification des interactants par chromatographie d’affinité-Co-purification : TAP-tagPuce à protéinePhage displayComplémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)Transfert d’énergie de fluorescence par résonanceRésonance plasmonique des surfaces


promoteur reporteur

Gal4p

TA

DB

TA

DB

signal

Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10

Le système double hybride


XY

promoteur reporteur

X

Y

TA

DB

+

signal

Le système double hybride


Principe BN/SDS-PAGE

BN-PAGE

SD

S-P

AG

E

BN

-PA

GE

1ère dimensionBleu de Coomassie

Gradient

2ème dimensionÉquilibrationSDS

Mercaptant

dessalage

Détergent neutre

Complexes membranaires

Complexes cytosoliques

pH


4% 18% 7% 12 %

complexes hétéromultimériques cytosoliques


La co-immunoprécipitation

Extrait

Anticorps spécifique

de

+Protéine A sépharose

Identification par

spectrométrie de masse

SDS-PAGE


Le Pull Down

lysat

+GST

GST GST

GST

Glutathion sépharose

GST

GST

GST

Identification par


SDS-PAGE

Glutathion sépharose

GST

GST

GST

GST

Variantes :-fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose-autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag, …


NHS activated sepharose™

lysat

Identification par


SDS-PAGE

La purification des interactants par chromatographie d’affinité


La co-purification : TAP-Tag

Protéine appât

Calmoduline Binding Peptide

Site de clivage de la protéase du TEV

Fragment ZZ de la protéine A

IgG Sepharose

CalmodulineSepharose

1

2

3


Le phage display

Banque de phageM13 avec PIII rec

ou PVIII rec

Sélection Lavage Elution

Amplification et re-sélection


Le Far Western

Transfert sur membrane

Renaturation Incubation avec la protéine

appât

Incubation avec l’anticorps dirigé

contre la protéine appât

Révélation avec un anticorps secondaire

Découpage de la zone

Identification par spectrométrie de

masse


Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)

Protéine A Linker NYFP

1 154

Protéine B Linker CYFP155 233


Transfert d’énergie de fluorescence par résonance

Y YX

FRET

X


Résonance plasmonique des surfaces

Source de lumière

Unité de détection optique

Prisme

Puce avec film d’or

Canal

Lumière polarisée Lumière réfléchie

Angle

Inte

nsité


Puce à protéine


Agglomérats

Problème récurrent en bioproduction

Mise au point du process de production

Mesure de la masse du produit purifié


Modificationpost-

traductionnelle

Mesure de masse exacte de la protéine

Exemple : Masse mesurée = 65 864,338 DaMasse calculée = 65 928,435 Da

+58 Carboxymethyl (on Cysteine)+60 sodium + potassium+64 Selenocysteine (from Serine)+67 Asp transamidation with piperidine+68 3,5-Dichlorination (of Tyrosine with 35Cl)

D masse = + 64,097


Modificationpost-

traductionnelle

MS

fragmentation

protéolyse

MS2

MS3MS4


Merci de votre attention

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