Approche pratique d’un développement de méh déthode en ......méh déthode en LC-MS ©2015 Waters Corporation 1 Développement de méthode Méthodes clef en main LC-MS Création

Approche pratique d’un développement de é h dméthode en LC-MS

©2015 Waters Corporation 1

Développement de méthode

Méthodes clef en main LC-MS

Création de méthodes MRM : bibliothèque, infusion de standards

Méthode LC : Transfert de méthode HPLC > UPLC

Méthode MRM : nombre de points/pic et fenêtre de temps

Evaluation de la robustesse de la méthode; effet matrice; efficacité de la préparation d ’échantillons

Vérification des résultats

Carte de contrôle / suivi


Contrôle des performances du système

Développement de méthode LC/MS :1- Méthode clef en main – QUANPEDIAQ

Méthodes clef-en-main incluant :méthode Inletméthode MRMméthode de quantification (TargetLynx)q ( g y )

Base de données avec plusieurs dizaines de plusieurs dizaines de méthodes disponibles


Développement de méthode LC/MS :1- Méthode clef en main

Définir dans quel projet seront créées les méthodes et Sample lists méthodes et Sample lists

Définir sous quel nom seront sauvegardées les méthodes et Sample lists lists


Développement de méthode LC/MS:1- Méthode clef en main - QUANPEDIAQ

Création de la sample list avec les méthodes d’acquisitions.


Développement de méthode MRM :2 Méthode Personnalisée à partir d’une bibliothèque2- Méthode Personnalisée à partir d une bibliothèque

Bibliothèques contenant plusieurs centaines de composés.


Plusieurs MRM par composés avec les tensions de cône et énergies de collision optimales .

Développement de méthode MRM :2 Méthode Personnalisée à partir d’une bibliothèque2- Méthode Personnalisée à partir d une bibliothèque

Composés peuvent être triés par groupe


Donner un nom à la méthode MRM, la localisation et la durée d’acquisition

Développement de méthode MRM :2- Méthode Personnalisée à partir d’une bibliothèque2- Méthode Personnalisée à partir d une bibliothèque

Fonctions MRM sur toute la durée du run , pas de temps temps de


Fonctions MRM sur toute la durée du run , pas de temps temps de rétention pour les composés, pas de méthodes Inlet associées

Développement de méthode MRM :3- Intellistart : sample tune and develop method

Possibilité d’optimiser jusqu’à 4 molécules en

3 Intellistart : sample tune and develop method

simultané.

Possibilité d’optimiser en ESI+ et ESI-

Jusqu’à 5 qtransitions par composé.


Développement de méthode MRM :3- Intellistart : sample tune and develop method3 Intellistart : sample tune and develop method

• Résultats obtenus avec l’optimisation Intellistart (Exemple pour la rifampicine)

• Tableau de résultats pour chaque composé

• Représentation graphique de l’optimisation en MS et MS/MS pour chaque composé (graphiques + spectres MS et MS/MS

• Edition automatique de la méthode MRM d’acquisition


Développement de méthode LC :4- Acquity column calculator

Nouveau Columns Calculator– De l’HPLC à UPLC et inversement

q y

– Accessible– Possibilité de copier coller

é Pré-injection volume et Gradient Smart Start– Pour tenir compte de la différence

de volume mort des systèmesde volume mort des systèmes

Nouveaux Method Transfer Chemistry KitsChemistry Kits


Transfert HPLC > UPLC


Développement de méthode : Autodwellé h d li é li d

Sélection des composés, définition de leur temps de rétention, création d’un méthode par palier de temps

5- Méthode Personnalisée par paliers de temps

méthode par palier de temps


Auto Dwell : Temps d’acquisition pour chaque transition (Dwell Time) calculéautomatiquement en fonction de la largeur des pics en secondes et du nombre depoints désirés.

Développement de méthode: colonne/gradient6 Modification des Temps de rétention

Sélection d’une analyse

6- Modification des Temps de rétention

Correction automatique des temps de rétention à partir d’une donnée brute acquise dans les nouvelles conditions d’analyses


Correction manuelle des temps de rétention (après injection dans les nouvelles conditions d’analyses)

d analyses

Développement de méthode: QUANPEDIA6- Modification des Temps de rétentionp

rentrer seulement 2 nouveaux Tr les Modification automatique de la méthode


rentrer seulement 2 nouveaux Tr, les autres sont calculés par extrapolation linéaire

qMRMModification automatique de la méthode de quanti

Développement de méthode:7- Evaluation de l’effet matrice : Mode RADAR

Electronique rapide : instrument switch ent e MRM et f ll scan < 0 003s d ée entre MRM et full scan < 0.003s; durée du Full scan env 0.05s– Pas de perte de la qualité du signal

MRM (même intensité)( )– Informations additionnelles accessibles

o Monitore la matriceo Possibilité de visualiser les

MRM

interactions de la matriceo Information pour l’optimisation de la

préparation d’échantillonh h d é f f

Full


o Recherche de composés significatifs non-ciblés en MRM

scan

Développement de méthode:7 E al ation de l’effet mat ice Mode RADAR

Full Scan MSStandard

7- Evaluation de l’effet matrice : Mode RADAR

MS ESI+MS ESI+Eau rivière

F ll S MS

MRM

Full Scan MSEau milliQ

MS ESI+Eau rivière


L’acquisition simultanée en Full Scan MS permet de visualiser la présence d’autres produits non dosés, de pics de matrice interférents, de pollution et d’extraire les spectres MS correspondants. Il peut également permettre de détecter la formation éventuelle d’adduits. Ici, on voit que l’essential de la matrice s’ionise de 0.3 à 1minute : l’effet matrice sera plus important pour les composés élués à ce moment-là.

Développement de méthode:i d

SPE Background ms scan

Protein precipitationBackground ms scan

7- Comparaisont PPT vs SPE: Mode RADAR

Background ms scan2.61e7

Background ms scan2.44e8

Protein precipitationMonitor AlprazolamMRM 309->281

SPE Monitor AlprazolamMRM 309->2811 56 67.03e5 1.56e6


Développement de méthode:7 E al ation de l’effet mat ice Mode RADAR

MS

7- Evaluation de l’effet matrice : Mode RADAR

V(reprise)=200µLExtrait serum

MRMV(reprise)=600µL

Beaucoup de composés présents dans la matrice Les profils matriciels peuvent être comparés avec les acquisitions en Full scan Beaucoup plus de composés

Extrait salive

s’ionisent en ESI+ et peuvent induire un effet matrice. La dilution de la matrice (augmentation du volume de reprise), permet de minimiser ce phénomène éventuel, si la sensibilité du spectromètre le permet .

acquisitions en Full scan. Beaucoup plus de composés s’ionisent en ESI+ dans l’extrait sérique. Ces informations aident au développement de méthode et interprétations des résultats.


Vérification et suivi des résultats1- TargetLynx

TargetLynx (inclus dans MassLynx) est un logiciel de quantification automatique avec critères

de contrôle qualité et qui permet de surligner automatiquement les évènements ci-dessous :

g y

de contrôle qualité et qui permet de surligner automatiquement les évènements ci dessous

• Rapport d’ions de confirmation (jusqu’à 4) hors tolérance, avec possibilité de compensation des variations expérimentales.

• Rapport S/N inférieur au seuil minimum.

• Temps de rétention (absolus ou relatifs) hors tolérance.

• Réponse des QC hors tolérance.

• Produit au dessus de la limite maximum (MRL).

• Coefficient de détermination inférieur au seuil minimum.

• Réponse du blanc supérieure au seuil maximum


• Pourcentage de recouvrement hors tolérance.

Vérification et suivi des résultats1- TargetLynx

• La Browser de TargetLynx peut être personnalisé.

g y

Sommaire TargetLynx

Sommaire relatif aux critéres de ciblage et de confirmation

Les points n’étant pas conformes aux critéres

définis dans TargetLynx apparaissent en

Rouge avec une explication.

Courbes de Calibration


Chromatogrammes intégrés

Vérification et suivi des résultats1 Trenplot : Courbes de tendance et statistiques1- Trenplot : Courbes de tendance et statistiques


Vérification et suivi des résultats1 Trenplot : Courbes de tendance et statistiques1- Trenplot : Courbes de tendance et statistiques

Fichier évolutif; updaté avec les derniers résultats obtenusFichier évolutif; updaté avec les derniers résultats obtenus

Calcul statistique : moyenne, 2SD, 3SD, CV, RSD….

Possibilité de sauvegarde, impression, copy/paste

Affichage possible de tous les différents paramètres calculés dans le fichier Targetlynx,


Contrôle et vérification des performances1- Intellistart

L’utilitaire IntelliStartTM, inclu dans le logiciel, permet l’automatisation totale :— Des diagnostiques.

1 Intellistart

— De l’étalonnage en masse.

— De la détermination des paramètres de Tune.

— Du développement de méthodes.

— Du contrôle des performances (injection de QC).


Contrôle et vérification des performances2- Intellistart : System Check

Injection d’un standard référent pour contrôler les

y

Injection d un standard référent pour contrôler lesperformances du système LC/MS

C t ôl d èt d é ti LC t d dét ti MS Contrôle des paramètres de séparation LC et de détection MS

Lancement manuel du “LC/MS System Check” ou/ yprogrammation automatique

Sauvegarde des rapports de tests Sauvegarde des rapports de tests


Contrôle et vérification des performances2- System Checky

Spécifications et Tolérances requises pour que le test soit validé

Définir la fréquence du test

Rapport Automatique

• Vérifie le bon fonctionnement de l’instrument (par injection d’ lé l éfé ) S ibilité Ré ét bilité d

Automatique


d’une molécule référence): Sensibilité, Répétabilité des aires, des hauteurs, des temps de rétention.

Développement de méthode

Méthodes clef en main LC-MS….QUANPEDIA

C é ti d éth d MRM bibli thè i f i d t d d Création de méthodes MRM : bibliothèque, infusion de standards ….QUANPEDIA, INTELLISTART

Méthode LC : Transfert de méthode HPLC > UPLC CONVERTISSEUR Méthode LC : Transfert de méthode HPLC > UPLC ….CONVERTISSEUR

Méthode MRM : nombre de points/pic et fenêtre de temps…QUANPEDIA

Evaluation de la robustesse de la méthode; effet matrice; efficacité de la préparation d ’échantillons….RADAR

Vérification des résultats….TARGETLYNX

Carte de contrôle / suivi…TRENPLOT


Contrôle des performances du système….INTELLISTART

Documents

Approche pratique d’un développement de méh déthode en ......méh déthode en LC-MS ©2015 Waters Corporation 1 Développement de méthode Méthodes clef en main LC-MS Création