Journal of Natural P d u t s Vol. 5 0 , NO. 2 , pp. 277-280, Mar-Ap 1987

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ATTRIBUTION COMPLETE DES SIGNAUX DU SPECTRE DE RMN 13C DU GOSSYPOL A L’AIDE DES TECHNIQUES A DEUX DIMENSIONS

L I M E LACOMBE,

Lahatoire de Chimie des Interadom Molkulaires, CNRS UA 285, Collige de France, I I , Place Marcelin Bertklot, 7523 I Paris Cedex 0 5 , France

ANGELIIU DALKAFOUKI, et NICOLE KUNESCH

L h a t o i r e de Chimie des Substances Thirapeutiques Naturelles, CNRS UA 496, Centre &Etudes Pharmareutiques, 92296 Ch2tenay-Malabry Cedex, France

Le gossypol [la] est un pigment jaune polyphknolique t e e n i q u e isolC prin- cipalement des graines de diffkrents cotonniers du genre Gossypium (1). Des etudes effectuees en Chine ont montre que son administration orale induit une stCrilitC chez l’homme (2). Ce compose est donc l’objet de recherches actives en tant qu’anticonceptionnel masculin, bien qu’il soit toxique (3) et que son mode d’action ne soit pas encore totale- ment Glucide (4-6).

Des travaux rkcents indiquent que le gossypol ou ses derives possedent de plus une activiti antivirale (7), antimalarique (8 ,9) , et une action trypanocide sur le trypanosome (10,ll).

Etant donne I’intkrCt croissant du gos- sypol, il semble dbormais utile de dCter- miner quels elements structuraux sont associes A I’activite biologique.

I1 est bien etabli que le gossypol existe sous plusieurs formes tautomeres la, 2, et 3, particulierement observables en

2 3

HO

lb A

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rrnn ‘H ou 13C suivant les solvants utilises pour ces analyses (12,13). Ce fait entraine des difficult& de separation et d’identification des derivb du gossypol puisque les formes hemiacetal cycliques

deux dimensions, mettant en evidence les constantes de couplage yc-H et vc-H pour completer l’attribution des car- bones quaternaires du gossypol [la] (Tableau 1).

198,2 155,6

149,9 142,9

133,6

133,l 1292 117,6 115,4 1 1 4 1

111,2

27,4 27,4 19,8

TAFKEAU 1. Analyse des Scectres de Rmn I3C du Gossypol [I

carbone no.

15b 7

1 6

5

3 10 4 b

2 9

8

12 11 13 14

YC-H

191

158

130 129,5 129,5

multiplicitC

CDCI, CDC13/D20

d

m af f id

m affine

d

d

YC-H et YC-H

5 5

+d

6 4 5 ; 1,5

6

7 18; 5

18

a

corrklations 2D

H15,H12C

H,,,H12‘

H4

CH, en 11

H,,CH, en 11 H4

H15rH12C

t’ t’ t e

Toncentration de la: saturation dam CDCI, (0,2M),G=dCplacernent chimique en ppdTMS; ]=constante de couplage en Hz; Abkviations: s=singulet, d=doublet, q=quadmplet, m=multiplet, dd=doublet d6doublt.

bcarbones dont les dkplacements chimiques ont dCji CtC attribub antirieurement (12). ‘taches correspondant i de trk faibles intensit& de codlation. dfconstanks de couplage non directement observables Ctant donn& la complexitC du signal. 'tie domaine d’observation du spectre de corrClation 13C-1H a CtC IimitC, pour le carbone 13 i la partie

Dans les attributions qui vont suivre, nous utiliserons le fait bien connu que les constantes de couplage yc+, sont, dans les systkmes aromatiques, plus impor- tantes (7 Hz) que les constantes de coup- lage ’J ou 9 (2 Hz) ( 15).

aromatique.

de type 2 peuvent Ctre egalement isolkes ( 1 ~ 4 ) .

C’est la raison pour laquelle il nous a paru nkcessaire d’attribuer avec precision les valeurs de resonance des carbones, en rrnn du carbone 13, du gossypol sous sa forme l a dans le CDCI,, afin de s’ap- puyer avec certitude sur ces d o n n h pour toute etude de relation structure- activite ou de mecanisme des reactions biologiques.

Les techniques classiques de rrnn 13C(spectres avec et sans decouplage du proton) ne nous ont permis d’elucider qu’une partie du problkme. I1 a fallu re- courir au spectre de correlation 13C-lH i

A la concentration utilisee, on observe dans le spectre de rrnn ‘H un couplage

J H - H = ~ Hz entre deux hydrogknes phknoliques dont l’un, rksonnant i 15 ppm, est implique dans une liaison avec I’aldChyde en 15. Ceci permet de reviser

‘La numtroiation des carbones utili& ici s’appuie s u r I’origine biogCnCtique t een ique du gossypol (20) et suit celle du squelette farnbyle.

Mar-Apr 19871 Lacombe et al. : RMN 13C du Gossypol 279

les valeurs des dkplacements chimiques a t t r i buh antkrieurement (16) aux hy- drogknes des phenols: H1(6,40 pprn), H6(6,06 ppm), H7(15,05 ppm) et explique que les couplages entre car- bones et hydrogknes phenoliques aient pu Ctre aisement observes. Nous avons mis A profit ces couplages 133C-1H pour I’attribution des carbones 1,6,7 porteurs des fonctions phenols et le repi5rage des carbones voisins 2,5,8, et 9. Dans ce but, deux spectres ont et6 enregistrb, I’un dans CDCI,, I’autre aprks addition d’eau lourde (Figure 1).

N

N m. - 1

i ‘4 j I

rnents chimiques qui sont en excellente concordance avec les valeurs calcul&s pour le modkle Ib en utilisant les incre- ments dkterminb dans de cas des naphtalkKs substituks (17,18). Le doublet ddoublk i 1 1 1,2 pprn correspond au car- bone 8 en raison de son couplage ’J avec le proton aldkhydique dont la valeur, re- lativement faible pour un couplage de ce type (18 Hz), est dQe i I’existence d’un groupement phenolique en ortho (19).

Le quadruplet v = 6 Hz) qui se trouve a 133,l ppm est dQ au carbone 3, par suite de sa correlation avec les protons du

I 1 % .

FIGURE 1. Spectre de rmn I3C non dicouplk du gossypol [la] a: dans CDCI,; b: dans CDC13+D,0

Les signaux des trois atomes de car- bone associks aux phenols apparaissent a 142,9, 149,9, et 155,6 ppm. L’un d’eux, A 149,9 ppm est un singulet (Fig- ure 1) et ne donne aucune correlation, tandis que les deux autres carbones sont couplks avec le proton aldkhydique en 15 et avec le proton en 12 du reste isop- ropyle (Tableau 1). Ceci fixe donc la re- sonance du carbone phknolique en 1 i 149,9 ppm.

Les deux autres carbones dont les sig- naux, aprks addition d’eau lourde (Fig- ure l), se simplifient en doublet (vC7-H15=5 Hz, 155,6 ppm)et multi- plet affink (1423 ppm) ont des dkplace-

methyle en 11. Le carbone resonnant a 115,4 pprn est le seul i prbenter une double corrklation avec H4 et les protons du methyle en 11 et ne peut Ctre que le carbone 2, tandis que la valeur de 1 14, l ppm est attribuie au carbone 9 du fait de sa corrklation avec H4.

Le multiplet i 133,6 pprn s’affine aprks addition d’eau lourde (Figure l), ce qui situe le carbone correspondant au voisinage d’un phenol. De plus, sa cor- relation avec H, permet d’affecter cette valeur au carbone 5.

Le signal restant, situ6 a 129 ppm est donc celui du carbone 10. Bien qu’il ap- paraisse sous la forme d’un doublet de-

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double, dans les conditions expkrimen- tales utilis&s, nous n’avons pas pu ob- server de correlation avec les protons voi- sins.

En conclusion, les techniques d’analyse en rmn de 13C rnises en oeuvre ici ont donc perrnis l’attibution defini- tive de tous les carbones du gossypol [la). Les valeurs consignk dans le Tab- leau 1 sont en bon accord avec les valeurs calculkes figurant sur la formule du rnod- d e lb.

PARTIE EXPERIMENTALE Le gossypol a ttt isole sous forme de gossypol-

acktique, des graines d’une variCtC cultide de Gosrypium d o n la mtthode de Carruth (2 l), avec un rendement de 0,65%.

Les spectres de rmn I3C ont CtC enregist& i 50,3 MHz sur un appareil Bruker AM200 SY 6quipi de I’ordinateur ASPECT 3000, d m CDCI, ainsi que dans CDCI, additionnk d’une petite quantitC d’eau lourde.

L’expkience de cordation 13C-’H a deux di- mensions a utilis6 la dquence d’impulsion suivante: 90’1 ‘HI- %t 180°[ l3C)- %t -7, -90” [’H)-90°[13C]-~,-BB[’HlFIDI‘3Cl-t2 (22) et un programme de phase permettant une dCtection en quadrature dans les deux dimensions (23), ainsi que des dClais T~ (70 ms) et T2 (35 ms) adapt& i I’observation de constantes de couplage de I’ordre de 7 Hz.

Les largeurs spectrales ont CtC respectivement en proton et en carbone 13, 10 ppm et 166 ppm.

La matrice finale de 256 sur 2048 points a CtC obtenue gdce i 192 acquisitions de 128 spectres ayant 2048 points chacun. Elk a CtC trait& par multiplication gaussienne dans les deux dimen- sions avant transformation.

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Receiwd I 9 June I986