Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, acide docosahexaénoïque ...docinsa.insa-lyon.fr/these/2008/bouvier/these.pdfBOUVIER J., PAGEAUX J. F., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON VANDENBROUCKE

N° d’ordre 2008-ISAL-0123 Année 2008

THESE

Présentée devant

L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR

Formation doctorale : Biochimie

Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé

Par

Jérôme BOUVIER

Bis(Monoacylglycéro)Phosphate,

acide docosahexaénoïque et cholestérol :

Relations métaboliques et fonctionnelles dans

les macrophages

Soutenance prévue le 18 décembre 2008

JURY

RECORD Michel Directeur de recherche Rapporteur

VISIOLI Francesco Professeur Rapporteur

BUCHET René Professeur Examinateur

DIONISI Fabiola Docteur Examinatrice

KOBAYASHI Toshihide Directeur de recherche Examinateur

LAGARDE Michel Professeur Directeur de thèse

VANDENBROUCKE Isabelle Maître de conférences Co-directrice de thèse

INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales – Quadriennal 2007-2010

SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

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bât. CPE 43 bd du 11 novembre 1918, 69622

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av. Jean Capelle, 69621 VILLEURBANNE Cedex.

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ScSo ScSo* M. BRAVARD Jean Paul. Université Lyon 2, 86 rue Pasteur,

69365 LYON Cedex 07.

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*ScSo : Histoire, Géographie, Aménagement, Urbanisme, Archéologie, Science politique, Sociologie, Anthropologie

RESUME

Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide localisé quasi exclusivement

dans les endosomes tardifs. Il est impliqué dans le transport de macromolécules qui transitent

via ce compartiment cellulaire. Nous montrons qu’un anticorps anti-BMP ainsi que

l’accumulation de BMP dans des macrophages en culture altère les flux du cholestérol issu

des lipoprotéines, depuis les endosomes tardifs vers la membrane plasmique et le réticulum

endoplasmique. Par ailleurs, le BMP incorpore sélectivement l’acide docosahexaénoïque

(DHA, 22:6n-3) dont les bénéfices cardiovasculaires ont été rapportés chez l’Homme. Notre

étude indique qu’un apport élevé de DHA in vitro ou in vivo stimule la formation de l’espèce

moléculaire 22:6/22:6-BMP. Cette molécule présente une grande sensibilité à la peroxydation,

ce qui lui confère un rôle protecteur vis-à-vis de l’oxydation du cholestérol. Nous proposons

que le 22:6/22:6-BMP puisse agir comme un anti-oxydant local au niveau des endosomes

tardifs.

SUMMARY

Bis(monoacylglycero)phosphate (BMP) is a unique phospholipid preferentially found in late

endosomes of mammalian cells. BMP is involved in the transport of macromolecules that

transit through this compartment. We show that an anti-BMP antibody or the accumulation of

BMP in cultured macrophages alters the redistribution of lipoprotein-derived cholesterol from

late endosomes to plasma membrane and endoplasmic reticulum. Moreover, BMP selectively

incorporates docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) whose cardiovascular benefits have been

reported in Humans. We here report that high supplementation of DHA both in vitro and in

vivo stimulate the formation of the 22:6/22:6-BMP molecular species. This molecule is very

prone to peroxidation, and as such, is able to protect cholesterol against oxidation. We

therefore propose that 22:6/22:6-BMP could act as a potential anti-oxidant in its immediate

vicinity in endosomal membranes.

AVANT PROPOS

Le travail présenté dans ce mémoire a fait l’objet de publications scientifiques et a été

présenté par communications orales ou affichées lors de congrès scientifiques.

Publications scientifiques avec comité de lecture :

BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., HULLIN-MATSUDA F., MAKINO A., MICHAUD

S., GELOEN A., MURPHY R. C., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-

VANDENBROUCKE I. Selective decrease of bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP) in

macrophages by high supplementation with docosahexaenoic acid. Journal of Lipid Research,

2007, Sous presse.

DELTON-VANDENBROUCKE I., BOUVIER J., MAKINO A., BESSON N., PAGEAUX

J. F., LAGARDE M. et KOBAYASHI T. Anti-bis(monoacylglycero)phosphate antibody

accumulates acetylated LDL-derived cholesterol in cultured macrophages. Journal of Lipid

Research, 2007, vol. 48, n°3, pp. 543-552.

Publications scientifiques (abstracts) :

BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., MURPHY R. C., LAGARDE M., KOBAYASHI T.,

DELTON-VANDENBROUCKE I. High docosahexaenoic acid content in

bis(monoacylglycerol)phosphate is associated with oxidative degradation of this

phsopholipid. Chemistry and Physics of Lipids, 2007, vol. 149 Supplement, p. S57

BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI

T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued

from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. Chemistry and Physics of Lipids, 2005, vol.

136 Supplement, p. S132

Communications orales:

BOUVIER J., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. First evidence for the

biocellular significance of very high docosahexaenoic acid enrichment in

Bis(Monoacylglycero)Phosphate. Séminaire doctorant 2008-2009 de l’IFR62, novembre

2008, Faculté de Médecine RTH Laennec, Lyon.

BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., HULLIN-MATSUDA F., MICHAUD S., MURPHY

R. C., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Selective

decrease of bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP) in macrophages by high supplementation

with docosahexaenoic acid. Groupe d'Etude et de Recherche en Lipidomique (GERLI) : 4ème

Congrès de Lipidomique, octobre 2007, Toulouse.

Communications affichées :

HULLIN-MATSUDA F., BOUVIER J., DELTON-VANDENBROUCKE I. MAKINO A.,

LAGARDE M., KOBAYASHI T. Cholesterol metabolism and transport are affected by the

late endosome lipid, bis(monoacylglycero)phosphate. The American Society for Biochemistry

and Molecular Biology : ASMBM Special Symposio, octobre 2008, Canmore, CANADA.

BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., MURPHY R. C., LAGARDE M., KOBAYASHI T.,

DELTON-VANDENBROUCKE I. High docosahexaenoic acid content in

bis(monoacylglycerol)phosphate is associated with oxidative degradation of this

phsopholipid. International Conference on the Bioscience of Lipids : the 48th

ICBL,

septembre 2007, Turku, FINLANDE.

BOUVIER J., PAGEAUX J. F., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-

VANDENBROUCKE I. Modifications of Bis(Monoacylglycero)Phosphate content in RAW

macrophages as a new approach to study its cellular role in cholesterol homeostasis. Institut

Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides (IMBL) : 7ème

journée scientifique, septembre

2006, Lyon.



from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. Groupe d'Etude et de Recherche en

Lipidomique (GERLI) : 3ème Congrès de Lipidomique, mai 2006, Marseille.



from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. International Conference on the Bioscience

of Lipids : the 46th

ICBL, septembre 2005, Ajaccio.

SOMMAIRE

Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)

7

SOMMAIRE LISTE DES FIGURES ...................................................................................... 13

LISTE DES TABLEAUX ................................................................................. 16

LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................ 17

INTRODUCTION GENERALE ..................................................................... 18

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................ 21

Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol......................... 22 1.1 Le cholestérol ........................................................................................................ 22

1.1.1 Structure du cholestérol .................................................................................. 22 1.1.2 Distribution cellulaire du cholestérol ............................................................. 23 1.1.3 Les microdomaines riches en cholestérol ....................................................... 23

1.2 Métabolisme cellulaire du cholestérol ................................................................ 25 1.2.1 Biosynthèse du cholestérol ............................................................................. 25 1.2.2 Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol ......................................... 27 1.2.3 Cycle d’hydrolyse et d’estérification du cholestérol ...................................... 28

1.2.4 Oxydation du cholestérol - les oxystérols ....................................................... 29 1.2.4.1 Formation des oxystérols ...................................................................... 30

1.2.4.2 Implication des oxystérols au cours de l’athérogenèse ......................... 31 1.2.4.3 Régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol par les

oxystérols : LXR et OSBP .................................................................... 31

1.3 Le transport intracellulaire du cholestérol ........................................................ 33 1.3.1 Les différents modes de transport intracellulaire du cholestérol .................... 33

1.3.2 Généralités sur les lipoprotéines ..................................................................... 35 1.3.3 Endocytose des LDL par les macrophages ..................................................... 36

1.3.3.1 Les LDL et LDL oxydées ..................................................................... 36 1.3.3.2 Endocytose des LDL : les différents récepteurs et mécanismes ........... 37 1.3.3.3 La voie endocytique .............................................................................. 39

1.3.4 Le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs............................. 40

1.3.5 Le transport du cholestérol à partir de la membrane plasmique ..................... 41 1.3.6 Le transport du cholestérol à partir du réticulum endoplasmique .................. 42 1.3.7 Efflux du cholestérol ...................................................................................... 42

1.3.7.1 Efflux médié par les transporteurs ABCA1, ABCG1 et ABCG4 ......... 43 1.3.7.2 Efflux médié par le récepteur SR-BI .................................................... 45

Chapitre 2 : Généralités sur les acides gras et les phospholipides ................................ 47 2.1 Les acides gras ..................................................................................................... 47

2.2 Les phospholipides : classes, sous-classes et composition en acides gras ....... 52

2.3 Métabolisme des phospholipides ........................................................................ 55 2.3.1 Biosynthèse des phospholipides ..................................................................... 55 2.3.2 Remodelage des phospholipides ..................................................................... 58

2.3.2.1 Les phospholipases ............................................................................... 58 2.3.2.2 Voies de dé-acylation/ré-acylation ....................................................... 60 2.3.2.3 Voies de transacylation ......................................................................... 61

SOMMAIRE


8

Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA) ............................................................ 62

3.1 Généralités sur le DHA ........................................................................................ 62 3.1.1 Origine du DHA ............................................................................................. 62 3.1.2 Distribution du DHA ...................................................................................... 62

3.1.3 Incorporation du DHA dans les phospholipides in vitro et in vivo ................ 63

3.2 Rôle des acides gras oméga-3 dans l’incidence des maladies cardiovasculaires ................................................................................................. 64

3.2.1 Les études épidémiologiques .......................................................................... 65 3.2.2 Les études cliniques ........................................................................................ 65

3.2.3 Les mécanismes physiologiques mis en jeu ................................................... 66

3.3 Rôles cellulaires du DHA ..................................................................................... 67 3.3.1 Structure et dynamique moléculaires du DHA dans les membranes .............. 67 3.3.2 Modification des propriétés membranaires .................................................... 68 3.3.3 DHA et microdomaines membranaires .......................................................... 68

3.3.4 Le DHA comme médiateur lipidique et activateur de gènes .......................... 69

3.3.5 Rôle du DHA dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol .................. 70

Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP) .............................................. 71 4.1 Découverte, distribution et localisation subcellulaire du BMP........................ 71

4.1.1 Découverte et distribution du BMP ................................................................ 71

4.1.2 Localisation subcellulaire du BMP ................................................................. 71

4.2 Structure du BMP ................................................................................................ 72 4.2.1 Le squelette glycérophosphate ........................................................................ 72

4.2.2 La position des chaînes acyles ........................................................................ 74 4.2.3 La composition en acides gras ........................................................................ 75

4.3 La voie de biosynthèse du BMP .......................................................................... 75 4.4 Métabolisme du BMP .......................................................................................... 79

4.4.1 Modifications pathologiques et induites du BMP .......................................... 79

4.4.2 Dégradation enzymatique et remodelage des acyles gras du BMP ................ 81

4.5 Le rôle cellulaire du BMP ................................................................................... 82

Chapitre 5 : La peroxydation lipidique ........................................................................... 86

5.1 Les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS) ........................................... 86 5.2 Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique ........................... 86

5.2.1 Les différentes phases ..................................................................................... 87 5.2.2 Les anti-oxydants ............................................................................................ 88

5.3 Les produits d’oxydation des AGPI ................................................................... 89 5.3.1 Oxydation enzymatique des AGPI ................................................................. 89 5.3.2 Oxydation non-enzymatique des AGPI .......................................................... 91

5.3.2.1 Conservation de la structure de l’acide gras ......................................... 91 5.3.2.2 Altération de la structure de l’acide gras .............................................. 92

MATERIELS ET METHODES ...................................................................... 94

1. Produits spécifiques .................................................................................................... 95

1.1 Standards lipidiques ............................................................................................ 95 1.2 Molécules radioactives et consommables ........................................................... 95 1.3 Consommables pour la culture cellulaire .......................................................... 96

SOMMAIRE


9

1.4 Produits spécifiques pour la microscopie à fluorescence ................................. 96

1.5 Produits divers ..................................................................................................... 96

2. Matériels Biologiques ................................................................................................. 97 2.1 La lignée cellulaire RAW 264.7 .......................................................................... 97 2.2 La lignée cellulaire BHK 21 ................................................................................ 97 2.3 Les lipoprotéines .................................................................................................. 98

2.3.1 Préparation des lipoprotéines .......................................................................... 98 2.3.2 Acétylation des LDL ...................................................................................... 98

2.3.3 Marquage des LDL avec du [3H]cholestéryl oléate ou du [

3H]cholestérol .... 99

2.4 Animaux et traitements ....................................................................................... 99

3. Préparation des liposomes de phosphatidylglycérol (PG) .................................... 100

4. Traitements des cellules et protocoles expérimentaux .......................................... 101

4.1 Incubation en présence de l’anticorps anti-BMP ............................................ 101

4.2 Incubation en présence de U18666A et de F1394 ............................................ 101 4.3 Incubation en présence de liposomes de PG +/- vitamine E........................... 102 4.4 Incubation en présence de DHA non estérifié +/- vitamine E ........................ 102

4.5 Culture des cellules dans des conditions oxydantes ........................................ 102

5. Etude du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol ................. 103

5.1 Mesure de l’accumulation de cholestérol libre et d’esters de cholestérol ..... 103 5.2 Mesure de la captation des LDL et de l’hydrolyse des esters de

cholestérol ........................................................................................................... 103 5.3 Mesure de l’estérification du cholestérol dérivé de la captation des LDL .... 104

5.3.1 Première méthode : utilisation de [3H]FC-LDL ........................................... 104 5.3.2 Deuxième méthode : utilisation du [3H]oléate ............................................. 104

5.4 Mesure de l’efflux médié par les HDL ou la méthyl-β-cyclodextrine ........... 105 5.5 Traitement des cellules avec la cholestérol oxydase ........................................ 105 5.6 Mesure de la sensibilité des cellules avec l’amphotéricine B ......................... 106

6. Oxydation du BMP et du cholestérol en système acellulaire ................................ 106

7. Analyse des lipides .................................................................................................... 107 7.1 Extraction des lipides totaux ............................................................................. 107

7.1.1 Extraction à partir des cellules RAW 264.7 et BHK 21 ............................... 107

7.1.2 Extraction à partir de foie de souris .............................................................. 108

7.2 Séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides par chromatographie sur couche mince (CCM) .................................................... 109

7.2.1 Séparation des classes de lipides .................................................................. 109 7.2.2 Séparation des classes de phospholipides par CCM en 2 dimensions .......... 109

7.2.3 Traitements des plaques après élution .......................................................... 110

7.3 Purification du BMP et des PE par HPLC ...................................................... 111

7.4 Analyse des acides gras par chromatographie gazeuse (GC) ........................ 112 7.4.1 Préparation des échantillons ......................................................................... 112

7.4.2 Appareillage et conditions d’analyse ............................................................ 112 7.4.3 Identification des acides gras et quantification ............................................. 113

7.5 Quantification du cholestérol libre par GC-MS ............................................. 113

SOMMAIRE


10

7.6 Analyse des espèces moléculaires du BMP par ESI-MS ................................ 114

8. Analyse de la radioactivité ....................................................................................... 115

8.1 L’analyseur de radioactivité linéaire (Berthold) ............................................. 115 8.2 Le compteur à scintillation ................................................................................ 115

9. Dosage du dialdéhyde malonique (MDA)............................................................... 115

10. Dosage de la vitamine E ........................................................................................... 116

11. Fractionnement cellulaire sur les cellules BHK ..................................................... 117

12. Isolement des radeaux lipidiques riches en cholestérol ......................................... 118

13. Microscopie à fluorescence ...................................................................................... 119

13.1 Localisation du BMP par immuno-détection .................................................. 119

13.2 Localisation de l’anticorps anti-BMP accumulé dans les cellules ................. 120 13.3 Localisation du cholestérol cellulaire ............................................................... 120 13.4 Internalisation des DiI-LDL et DiI-acLDL ...................................................... 120

13.5 Observation de la fluorescence ......................................................................... 121

14. Analyses statistiques ................................................................................................. 121

RESULTATS ................................................................................................... 122

PREMIERE PARTIE...................................................................................................... 123

Introduction ..................................................................................................................... 124

1.1 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la distribution intracellulaire du cholestérol ........................................................................................................... 125

1.2 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre induite par la captation des acLDL ................................................................. 127

1.3 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’estérification du cholestérol .................. 129 1.4 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la captation des acLDL ............................ 132 1.5 Effet de l’anticorps anti-BMP sur le cholestérol libre de la membrane

plasmique ........................................................................................................... 133 1.5.1 Mesure de la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B ............................ 133

1.5.2 Mesure de l’oxydabilité du cholestérol membranaire par la cholestérol oxydase ......................................................................................................... 135

1.5.3 Mesure de l’extraction du cholestérol cellulaire par la cyclodextrine

(MβCD) ........................................................................................................ 136

1.6 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL .................................................................................................................... 137

1.7 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la répartition du cholestérol entre les

différents domaines membranaires.................................................................. 138

Discussion ......................................................................................................................... 140

SOMMAIRE


11

DEUXIEME PARTIE ..................................................................................................... 144

Introduction ..................................................................................................................... 145

2.1 Caractérisation et dosage du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ........................................................................... 146

2.1.1 Rappel de la méthode ................................................................................... 146 2.1.2 Quantification des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW

cultivés dans des conditions contrôles ......................................................... 149

2.1.3 Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW ...................................................................................... 149

2.2 Effets du 18:1/18:1-PG sur la quantité et la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW .............................................................. 151

2.2.1 Augmentation spécifique de la quantité de BMP dans les macrophages

RAW après supplémentation par du 18:1/18:1-PG ...................................... 151

2.2.2 Localisation du BMP dans les macrophages RAW après

supplémentation avec du 18:1/18:1-PG ....................................................... 156 2.2.3 Fractionnement cellulaire réalisé sur les cellules BHK après

supplémentation avec du 18:1/18:1-PG ....................................................... 157

2.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur le trafic intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL ...................................... 158

2.3.1 Colocalisation du BMP et des LDL endocytées ........................................... 159 2.3.2 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la

captation des LDL ........................................................................................ 160 2.3.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur

l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL ................................ 161 2.3.4 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la ré-

estérification du cholestérol libre dérivé de la captation des LDL et des

acLDL ........................................................................................................... 164

2.3.5 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD ............................. 165

2.3.6 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la

quantité cellulaire d’esters de cholestérol après incubation en présence

de acLDL ...................................................................................................... 167

Discussion ......................................................................................................................... 168

TROISIEME PARTIE .................................................................................................... 175

Introduction ..................................................................................................................... 176

3.1 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des liposomes de 22:6/22:6-PG ................................................................................ 177

3.2 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des concentrations croissantes de DHA non estérifié ........................................... 184

3.3 Analyse des espèces moléculaires du BMP ...................................................... 190 3.4 Formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP in vitro et in vivo ........... 193

SOMMAIRE


12

3.4.1 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages RAW

cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E ................... 194 3.4.2 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP in vivo dans le foie de souris

placées sous un régime alimentaire enrichi en DHA ................................... 195

3.5 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA sous l’action d’un stress oxydant ..................................................................................................... 197

3.5.1 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans les macrophages RAW ............................................................................................................. 198

3.5.2 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans un système

acellulaire ..................................................................................................... 199

3.6 Le BMP riche en DHA protège partiellement le cholestérol de l’oxydation dans un système acellulaire .......................................................... 200

Discussion ......................................................................................................................... 203

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES................................... 214

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................... 218

ANNEXES ........................................................................................................ 255

ANNEXE 1 ....................................................................................................................... 257

ANNEXE 2 ....................................................................................................................... 270

ANNEXE 3 ....................................................................................................................... 274

ANNEXE 4 ....................................................................................................................... 276

LISTE DES FIGURES


13

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Structure du cholestérol et du linoléoyl-cholestérol. ............................................... 22

Figure 2 : Représentation schématique des radeaux lipidiques et des cavéoles. ...................... 25 Figure 3 : Voie de biosynthèse du cholestérol. ........................................................................ 26 Figure 4 : Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol par SREBP. .............................. 28 Figure 5 : Formation des oxystérols. ........................................................................................ 30 Figure 6 : Transport intracellulaire du cholestérol. .................................................................. 33 Figure 7 : Les différents modes de transport du cholestérol. ................................................... 34 Figure 8 : Représentation schématique d’une particule de LDL. ............................................. 36 Figure 9 : Endocytose des LDL, représentation schématique de la voie endocytique. ............ 39 Figure 10 : Représentation schématique de l’efflux du cholestérol médié par SR-BI,

ABCA1, ABCG1 et par diffusion passive. ............................................................ 46

Figure 11 : abréviation symbolique et structure du DHA ........................................................ 48

Figure 12 : Structures et représentations de quelques acides gras. .......................................... 50 Figure 13 : Synthèse des acides gras oméga-6 et oméga-3 à partir de l’acide linoléique

(18:2n-6) et l’acide linolénique (18:3n-3) respectivement. ................................... 51 Figure 14 : Structures et représentations des phospholipides. ................................................. 54 Figure 15 : Biosynthèse des principaux phospholipides. ......................................................... 56 Figure 16 : Sites d’action des différentes phospholipases ........................................................ 60

Figure 17 : Cycle de dé-acylation-ré-acylation (cycle de Lands) ............................................ 61 Figure 18 : Représentation en 3 dimensions du 18:1/18:1-BMP ............................................. 74

Figure 19 : Structures du phosphatidylglycérol et du bis(monoacylglycéro)phosphate. ......... 74 Figure 20 : Voie de biosynthèse du BMP à partir du PG exogène. .......................................... 79 Figure 21 : Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique. ................................ 88

Figure 22 : Les principaux médiateurs lipidiques issus de l’oxydation enzymatique

des acides gras polyinsaturés AA, EPA et DHA. .................................................. 90

Figure 23 : Structures du DHA et de 3 docosanoïdes : le 17S-HydroxyDHA,

la protectine D1 et la résolvine D1. ....................................................................... 90

Figure 24 : Les produits d’oxydation non-enzymatique du DHA. ........................................... 93 Figure 25 : Schéma représentatif du gradient discontinu de sucrose (%) utilisé pour isoler

les endosomes tardifs et les endosomes précoces à partir de cellules BHK. ....... 118 Figure 26 : Schéma représentatif du gradient discontinu de saccharose utilisé pour isoler

les radeaux lipidiques. ......................................................................................... 119 Figure 27 : Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre dans les

macrophages THP-1. ........................................................................................... 126 Figure 28 : Colocalisation de l’anticorps anti-BMP et des DiI-acLDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 127

Figure 29 : Accumulation du cholestérol libre (FC) stimulée par les acLDL dans les

macrophages RAW.. ............................................................................................ 128 Figure 30 : Accumulation des esters de cholestérol (CE) stimulée par les acLDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 130 Figure 31 : Estérification du cholestérol stimulée par les acLDL. ......................................... 131 Figure 32 : Mesure de la sensibilité des macrophages RAW à l’amphotéricine B. ............... 135 Figure 33 : Efflux du [

3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par la MβCD dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 137 Figure 34 : Efflux du [

3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par les HDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 138

file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180179file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180180file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180181file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180182file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180183file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180184file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180185file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180186file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180187file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180188file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180188file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180189file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180190file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180191file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180191file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180192file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180193file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180194file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180195file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180196file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180197file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180198file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180199file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180200file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180200file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180201file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180201file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180202file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180203file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180203file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180204file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180204file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180205file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180205file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180206file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180206file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180207file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180207file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180208file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180208file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180209file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180210file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180211file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180211file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180212file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180212

LISTE DES FIGURES


14

Figure 35 : Séparation sur gradient de saccharose des radeaux lipidiques dans des

macrophages RAW. ............................................................................................. 140 Figure 36 : Profil de migration des classes de phospholipides en CCM-2D .......................... 147 Figure 37 : Protocole d’extraction et de purification des PC, des PE et du BMP. ................. 148

Figure 38 : Chromatogrammes HPLC d’un standard commercial de 18:1/18:1-BMP et de

BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. ...... 149 Figure 39 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE après

supplémentation des macrophages RAW avec différentes concentrations de

18:1/18:1-PG. ...................................................................................................... 153 Figure 40 : Profil d’élution des lipides marqués avec le [

3H]oléate après la première

migration en CCM. .............................................................................................. 153 Figure 41 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de

macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de

30 µM de 18:1/18:1-PG. ...................................................................................... 154

Figure 42 : Chromatogrammes en HPLC des PE et du 18:1/18:1-PG ................................... 154

Figure 43 : Localisation subcellulaire du BMP. ..................................................................... 156 Figure 44 : Analyse de la composition en phospholipides des différentes fractions

isolées à partir de fibroblastes BHK. ................................................................... 158 Figure 45 : Colocalisation du BMP et des LDL endocytées dans les macrophages RAW. ... 159 Figure 46 : Captation des [

3H]CO-LDL dans les macrophages RAW.. ................................. 161

Figure 47 : Effet du F1394 sur l’estérification du cholestérol stimulé par les LDL dans

les macrophages RAW. ....................................................................................... 162 Figure 48 : Variation de la quantité de radioactivité associée au cholestérol libre ([

3H]FC)

et aux esters de cholestérol ([3H]CO) en présence de [

3H]CO-LDL. .................. 163

Figure 49 : Taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé de la captation des [

3H]CO-LDL dans

les macrophages RAW. ....................................................................................... 163

Figure 50 : Taux de ré-estérification du cholestérol dérivé des [3H]FC-LDL et des

[3H]FC-acLDL dans les macrophages RAW. ..................................................... 165

Figure 51 : Efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD dans les macrophages

RAW. ................................................................................................................... 166

Figure 52 : Accumulation d’esters de cholestérol stimulée par les acLDL dans les

macrophages RAW. ............................................................................................. 168

Figure 53 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE en présence de

22:6/22:6-PG.. ..................................................................................................... 178

Figure 54 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de

macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence

de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ......................................................... 182 Figure 55 : Variation des quantités de MDA dans les macrophages RAW en présence de

22:6/22:6-PG. ...................................................................................................... 183

Figure 56 : Variation de la proportion de DHA dans les PC, les PE et le BMP des

macrophages RAW en présence de DHA non estérifié....................................... 185 Figure 57 : Variation des quantités cellulaires de BMP dans les macrophages RAW en

présence de DHA non estérifié. ........................................................................... 189 Figure 58 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de


de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E. ................................................. 190

Figure 59 : Spectres de masse en ESI-MS du BMP extrait et purifié à partir de


de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ......................................................... 192

file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180213file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180213file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180214file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180215file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180216file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180216file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180217file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180217file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180217file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180218file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180218file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180219file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180219file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180219file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180220file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180221file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180222file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180222file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180223file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180224file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180225file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180225file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180226file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180226file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180227file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180227file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180228file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180228file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180229file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180229file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180230file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180230file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180231file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180231file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180232file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180232file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180232file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180233file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180233file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180234file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180234file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180235file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180235file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180236file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180236file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180236file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180237file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180237file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180237

LISTE DES FIGURES


15

Figure 60 : Variation de la quantité de BMP et de la proportion de OA et DHA dans les

macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en

vitamine E. ........................................................................................................... 195 Figure 61 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de foie

de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou

enrichi en DHA. .................................................................................................. 197 Figure 62 : Variation de la quantité de BMP en fonction de son enrichissement en

18:1 ou 22:6 dans les macrophages RAW soumis à un stress oxydant. .............. 199 Figure 63 : Oxydation du 18:1/18:1-BMP et du 22:6/22:6-BMP dans un système

acellulaire. ........................................................................................................... 200 Figure 64 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de

18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. ............................................................... 202 Figure 65 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de

18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. ............................................................... 203

Figure 66 : Nombre de décès liés aux maladies cardiaques ischémiques par pays en

1990 (pour 100000 habitants) .............................................................................. 258 Figure 67 : Représentation schématique de la paroi artérielle saine. ..................................... 260

Figure 68 : Schéma du métabolisme des lipoprotéines : le transport du cholestérol

dans l’organisme. ................................................................................................. 266 Figure 69 : Représentation schématique de l’évolution et la constitution d’une plaque

d’athérome de type fibreuse. ............................................................................... 269

Figure 70 : Chromatogrammes des acides gras. ..................................................................... 270 Figure 71 : Localisation subcellulaire du BMP dans les macrophages RAW incubés

dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG

+/- vitamine E. ..................................................................................................... 274 Figure 72 : Marquage des endosomes tardifs par des LDL et acLDL fluorescentes. ............ 275

file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180238file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180238file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180238file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180239file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180239file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180239file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180240file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180240file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180241file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180241file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180242file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180242file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180243file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180243file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180244file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180244file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180245file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180246file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180246file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180247file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180247file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180248file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180249file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180249file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180249file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final_corrections.docx%23_Toc216180250

LISTE DES TABLEAUX


16

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Caractéristiques et composition des différentes classes de lipoprotéines. ............ 35 Tableau 2 : Classification et nomenclature des principaux acides gras. .................................. 49

Tableau 3 : Composition en acides gras des régimes alimentaires standard (A03) et

enrichi en DHA. .................................................................................................. 100 Tableau 4 : Composition en nutriments des régimes alimentaires ......................................... 100 Tableau 5 : Composition en acides gras des esters de cholestérol cellulaires et associés

aux acLDL. .......................................................................................................... 131

Tableau 6 : Captation des [3H]CO-acLDL par les macrophages RAW et distribution

de la radioactivité cellulaire entre le cholestérol libre (FC) et les esters de

cholestérol (CE). .................................................................................................. 132

Tableau 7 : Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages

RAW cultivés dans des conditions contrôles. ..................................................... 150 Tableau 8 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans les macrophages

RAW cultivés en présence de 18:1/18:1-PG. ..................................................... 155

Tableau 9 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages

RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................... 179

Tableau 10 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages

RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................. 180 Tableau 11 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages

RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................. 181 Tableau 12 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages

RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 186 Tableau 13 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages

RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 187

Tableau 14 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages

RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 188 Tableau 15 : Variation de la composition des espèces moléculaires du BMP dans les

macrophages RAW en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG. .......................... 193

Tableau 16 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans le foie de

souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi

en DHA ............................................................................................................. 196

Tableau 17 : Classification des lésions de l’athérosclérose selon Stary................................. 267

file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647178file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647179file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647180file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647180file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647181file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647182file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647182file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647183file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647183file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647183file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647184file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647184file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647185file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647185file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647186file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647186file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647187file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647187file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647188file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647188file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647189file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647189file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647190file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647190file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647191file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647191file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647192file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647192file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647193file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647193file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647193file:///F:/thèse/Manuscript/rapport%20final/rapport%20final.docx%23_Toc210647194

LISTE DES ABBREVIATIONS


17

LISTE DES ABREVIATIONS

AA : acide arachidonique

ACAT : acyl-CoA cholestérol acyl transférase

AG : acide gras

AGPI : acides gras polyinsaturés

ALA : acide alpha-linolénique

BMP : Bis(monoacylglycéro)Phosphate

CCM (CCM-2D) : chromatographie sur couche mince (en deux dimension)

CE : esters de cholestérol

CL : cardiolipines

CO : cholestéryl-oléate

DHA : acide docosahexaénoïque

DMA : diméthylacétals

EDTA : acide éthylène-diamine-tétra-acétique

EE : « early endosomes », endosomes précoces

EPA : acide eicosapentaénoïque

FC : « free cholesterol », cholestérol libre

FCS : « fœtal calf serum », sérum de veau fœtal

GC : chromatographie gazeuse

HDL : « high density lipoprotein», lipoprotéine de haute densité

HPLC : chromatographie liquide haute performance

IDL : « intermediate density lipoprotein », lipoprotéine de densité intermédiare

LA : acide linoléique

LDL : « low density lipoprotein», lipoprotéine de faible densité

LE : « late endosomes », endosomes tardifs

LPDS : « lipoprotein deficient serum », sérum déficient en lipoprotéines

MDA : dialdéhyde malonique

MβCD : méthyl-β-cyclodextrine

NPC : Niemann-Pick de type C

OA : acide oléique

PA : acide phosphatidique

PBS : « Phosphate-buffered saline », tampon phosphate

PC : phosphatidylcholines

PE : phosphatidyléthanolamines

PG : phosphatidylglycérols

PI : les phosphatidylinositols

PL/GPL : phospholipides/glycérophospholipides

PLA / PLC / PLD : phospholipase A / phospholipase C / phospholipase D

PM : membrane plasmique

PS : phosphatidylsérines

RE : réticulum endoplasmique

Rf : référence frontale

ROS : espèces réactives dérivées de l’oxygène

SM : sphingomyélines

TAG/TG : Triacylglycérols

VLDL : « very low density lipoprotein », lipoprotéine de très faible densité

INTRODUCTION GENERALE


18


L’athérosclérose est une pathologie majeure en santé publique. Dans le monde, et

plus particulièrement dans les pays industrialisés, les deux premières causes de mortalité sont

des complications de l'athérosclérose : les ischémies cardiaques et les accidents vasculaires

cérébraux. L’athérosclérose est définie par l’Organisation Mondiale de la Santé comme « une

association de remaniements de l’intima des artères de gros et moyen calibre consistant en

une accumulation focale de lipides, de glucides complexes, de sang et de dépôts calcaires

avec remaniement de la média » (Toussaint et al., 2003). Elle se caractérise notamment par

une dérégulation de l’homéostasie du cholestérol au niveau du plasma sanguin et des cellules

vasculaires. Les monocytes du sang périphérique peuvent traverser l’endothélium et se

différencier en macrophages résidents dans l’espace sous endothélial. Au cours de

l’athérogenèse et en présence de lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées les

macrophages résidents accumulent de grandes quantités de cholestérol et d’esters de

cholestérol. Ceci conduit à la formation de cellules spumeuses qui constituent les premiers

dépôts lipidiques dans l’intima des artères et participent ainsi à l’apparition et au

développement de la plaque d’athérome (Vainio et Ikonen, 2003).

L’accumulation de cholestérol dans les macrophages spumeux résulte d’une

perturbation du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol. Les macrophages

acquièrent du cholestérol principalement par endocytose des LDL. Après avoir été captées, les

LDL suivent la voie endocytique et aboutissent aux endosomes tardifs où les esters de

cholestérol qu’elles contiennent sont hydrolysés. Les endosomes tardifs constituent alors le

point de départ du transport intracellulaire du cholestérol et assurent sa redistribution vers les

autres compartiments cellulaires, principalement vers le réticulum endoplasmique où le

cholestérol est ré-estérifié, et vers la membrane plasmique dans laquelle le cholestérol est

incorporé et à partir de laquelle il peut être exporté hors de la cellules par différents

mécanismes d’efflux stimulés par des accepteurs extracellulaires comme les lipoprotéines de

haute densité (HDL) (Simons et Ikonen, 2000 ; Soccio et Breslow, 2004).

Les endosomes tardifs sont des compartiments multi-vésiculaires et multi-

lamellaires jouant un rôle de stockage et de redistribution de différentes molécules. Les

membranes internes des endosomes tardifs contiennent une forte proportion du phospholipide

bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP), parfois appelé acide lyso-bis-phosphatidique



19

(LBPA). Le BMP est un isomère structural du phosphatidylglycérol (PG) qui constitue par

ailleurs le précurseur principal dans la voie de biosynthèse du BMP (Amidon et al., 1995). Le

BMP représente généralement une faible proportion des phospholipides cellulaires mais est

localisé presque exclusivement dans les endosomes tardifs/lysosomes où il forme des

microdomaines spécialisés (Kobayashi et al., 2001a ; Kobayashi et al., 2002).

Le BMP présente des caractéristiques originales sur le plan structural et

métabolique (Huterer et Wherrett, 1979 ; Joutti et Renkonen, 1979a ). En particulier,

d’anciennes études ont montré que le BMP possède une forte propension à incorporer l’acide

docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3), un acide gras polyinsaturé à longue chaîne de la série n-

3 (Huterer et Wherrett, 1986). Le DHA est un constituant majeur des huiles de poissons dont

le rôle cardio-protecteur a été rapporté par de nombreuses études épidémiologiques et

cliniques (Lee et al., 2008 ; von Schacky et Harris, 2007). A ce titre le DHA a fait l’objet de

nombreux travaux dans notre unité (Delton-Vandenbroucke et al., 2001 ; Lagarde et al.,

2003) et c’est dans ce cadre que nous avons commencé à nous intéresser au BMP notamment

d’un point de vue structural (Luquain et al., 2000 ; Luquain et al., 2001) et métabolique

(Besson et al., 2006).

Les premières données sur la fonction du BMP proviennent de travaux réalisés par

le Dr. Toshihide Kobayashi grâce à un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le

BMP. Des études réalisées sur des fibroblastes et des cellules endothéliales ont montré que

l’anticorps anti-BMP, après internalisation par endocytose, modifie l’organisation des

membranes internes des endosomes tardifs et entraîne une accumulation de cholestérol dans

ces structures (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999). Dans le cadre des maladies

cardiovasculaires qui constituent le contexte physiopathologique de notre projet de recherche

et grâce à une collaboration entreprise avec l’institut RIKEN au Japon, nous nous sommes

également intéressés au rôle cellulaire du BMP dans les macrophages. Dans un premier temps

nous avons cherché à étudier en détail les conséquences sur le métabolisme et le transport

intracellulaire du cholestérol d’une perturbation de la fonction du BMP induite par

l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les endosomes tardifs des macrophages THP-1

et RAW. Les résultats obtenus, publiés dans « Journal of Lipid Research » (Delton-

Vandenbroucke et al., 2007), sont présentés dans la première partie des résultats.

Afin de mieux comprendre le rôle des microdomaines à BMP dans le métabolisme

et le transport intracellulaire du cholestérol dans les macrophages nous avons ensuite cherché



20

à étudier les conséquences d’une augmentation spécifique de la quantité cellulaire de BMP.

Pour cela notre stratégie a consisté à incuber les cellules en présence de liposomes

reconstitués avec du di-oléoyl-phosphoglycérol (18:1/18:1-PG) qui est efficacement converti

en BMP par les macrophages RAW (Amidon et al., 1995). Nous avons montré qu’il était

possible de cette manière d’augmenter la quantité de BMP dans les macrophages RAW d’un

facteur 4, puis nous avons étudié les conséquences fonctionnelles de cette accumulation de

BMP sur le transport intracellulaire du cholestérol. Nos résultats, encore préliminaires, sont

présentés dans la deuxième partie des résultats.

L’une des priorités de notre projet de recherche consistait également à déterminer

la signification biologique de l’enrichissement du BMP en DHA. En nous appuyant sur

l’approche développée avec le précurseur 18:1/18:1-PG nous avons supplémenté les

macrophages RAW avec du di-docosahexaénoyl-phosphoglycérol (22:6/22:6-PG). Nous

avons ainsi pu mettre en évidence la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP qui

présente une très grande sensibilité à la peroxydation lipidique. Nos résultats indiquent

également que dans un modèle membranaire in vitro, l’espèce 22:6/22:6-BMP qui constitue

une cible privilégiée des espèces radicalaires dérivées de l’oxygène, protège partiellement le

cholestérol de l’oxydation. Ainsi pour la première fois nous avons mis en évidence une

conséquence fonctionnelle de l’avidité du BMP pour le DHA et nous proposons que l’espèce

22:6/22:6-BMP pourrait jouer un rôle anti-oxydant spécifiquement dans les endosomes

tardifs, notamment vis-à-vis du cholestérol dérivé des LDL. Le BMP enrichi en DHA pourrait

ainsi prévenir la formation intracellulaire d’oxystérols qui participent à l’évolution des

macrophages en cellules spumeuses (Brown et Jessup, 1999 ; Clare et al., 1995). Les résultats

obtenus, publiés dans « Journal of Lipid Research » (Bouvier et al., 2008), sont présentés

dans la troisième partie des résultats.

La première partie de ce mémoire est consacrée aux rappels bibliographiques

comportant cinq chapitres. Le premier concerne le transport intracellulaire du cholestérol puis,

après un chapitre de généralités sur les différentes classes de lipides, nous présentons plus en

détail les données de la littérature sur le BMP et le DHA. Enfin le dernier chapitre traite de la

peroxydation lipidique. Nous présentons ensuite une partie de Matériels et Méthodes puis

l’ensemble des résultats expérimentaux obtenus au cours de cette étude. Ce mémoire se

termine par une conclusion générale et par l’exposé des perspectives qui découlent de notre

étude.

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES


21

RAPPELS

BIBLIOGRAPHIQUES

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol


22

Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol

1.1 Le cholestérol

1.1.1 Structure du cholestérol

Le cholestérol fut identifié pour la première fois, sous sa forme solide, dans des

calculs biliaires par François Poulletier de la Salle en 1769. Toutefois sa découverte est

généralement attribuée au chimiste français Eugène Chevreul en 1815 qui lui donna le nom de

cholestérine. Sa formule empirique (C27H46O) ne fut établie qu’en 1888 par Reinitzer. Enfin

sa structure correcte, formulée par Wieland et Dane, fut rapportée en 1932 (Vance et Van den

Bosch, 2000).

Le cholestérol est un lipide de la famille des stéroïdes. Sa structure est caractérisée

par quatre cycles notés A, B, C et D et une chaîne hydrocarbonée branchée. Les atomes de

carbone sont numérotés de 1 à 27. Le cholestérol possède également une double liaison entre

les carbones 5 et 6 (cycle B), et un groupement hydroxyle (alcool secondaire) sur le carbone 3

en position β (au dessus du plan du cycle A) (Figure 1).

Au niveau cellulaire le cholestérol existe de manière stable principalement sous

deux formes : une forme libre et une forme estérifiée où la fonction hydroxyle est estérifiée

par un acide gras (Figure 1). Le cholestérol libre est un constituant majeur des membranes

cellulaires et intervient dans différentes voies de signalisation, alors que le cholestérol

estérifié est davantage une forme de stockage pour la cellule.

cholestérollinoléoyl-cholestérol (18:2n-6-cholestérol)

Figure 1 : Structure du cholestérol et du linoléoyl-cholestérol.



23

1.1.2 Distribution cellulaire du cholestérol

Les différents compartiments des cellules de mammifères présentent des

compositions lipidiques et protéiques distinctes. Ceci est particulièrement vrai pour le

cholestérol. En effet sa concentration est très faible dans le réticulum endoplasmique (RE)

mais augmente progressivement dans l’appareil de Golgi, du cis- au trans-Golgi, pour

atteindre son niveau le plus élevé dans la membrane plasmique. Ainsi, la membrane

plasmique contient environ 70% du cholestérol cellulaire total (Maxfield et Wustner, 2002).

La concentration en cholestérol varie également beaucoup entre les différents compartiments

de la voie endocytique (Kobayashi et al., 1998a). Les endosomes de recyclage et les vésicules

internes des endosomes précoces apparaissent relativement riches en cholestérol

contrairement aux endosomes tardifs/lysosomes (Mobius et al., 2003).

De plus, les feuillets internes et externes des membranes biologiques présentent

aussi des compositions lipidiques différentes. Toutefois, concernant le cholestérol, sa

répartition entre les deux feuillets est encore mal connue. Plusieurs études ont pour le moment

fourni des résultats divergents (Maxfield et Wustner, 2002).

Enfin, les membranes biologiques présentent une grande hétérogénéité latérale.

Contrairement au modèle de la mosaïque fluide proposée par Singer et Nicholson en 1972, il

se forme dans les membranes biologiques des microdomaines membranaires appelés

« radeaux lipidiques » ou « rafts » qui se distinguent du reste de la membrane par leur

composition et leurs propriétés.

1.1.3 Les microdomaines riches en cholestérol

Notre vision de la membrane plasmique des cellules a beaucoup évoluée ces vingt

dernières années. D’abord considérée comme un assemblage homogène de lipides et de

protéines en libre diffusion, la membrane plasmique est aujourd’hui décrite comme une

mosaïque de microdomaines qui présentent différentes compositions en lipides et en protéines

(Maxfield, 2002 ; Mishra et Joshi, 2007 ; Schmitz et Grandl, 2008 ). Certains microdomaines

ont des structures très particulières et spécifiques comme les puits recouverts de clathrine ou

les cavéoles en forme d’invagination (Figure 2) (Conner et Schmid, 2003). Les radeaux



24

lipidiques constituent un autre type de microdomaines dont l’assemblage met en jeu de fortes

interactions lipides-lipides et lipides-protéines. En effet ils sont riches en cholestérol,

sphingolipides, glycosphingolipides et en phospholipides contenant des acyles gras saturés à

longues chaînes. Cet environnement lipidique spécifique génère une région localement plus

ordonnée et plus compacte (phase liquide ordonnée ou Lo) que les membranes environnantes

(phase liquide désordonnée ou Ld), et attire certaines protéines notamment celles possédant

une ancre GPI ou des groupements palmitoyles comme les Src-kinases (Figure 2). Les

radeaux lipidiques représentent cependant un groupe hétérogènes de microdomaines (Pike,

2004). De plus, leur composition peut être modifiée dans certaines conditions physiologiques

(de Mello Coelho et al., 2004) ou après la liaison de ligands sur leurs récepteurs (Magee et

al., 2002). La caractérisation des radeaux lipidiques a très souvent été basée sur leur résistance

à la solubilisation dans les détergents comme le triton (Babiychuk et Draeger, 2006). Bien que

cette technique biochimique soit controversée (Lichtenberg et al., 2005 ; Ostrom et Liu,

2007), l’analyse des membranes résistantes aux détergents (DRM) reste un outil très utile en

particulier pour des études comparatives. La membrane plasmique n’est pas la seule à être

constituée de microdomaines, les membranes internes notamment celles du réticulum

endoplasmique (Browman et al., 2006), de l’appareil de Golgi (Eberle et al., 2002) et des

endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo et al., 2007 ) sont constituées de

microdomaines spécifiques.

Les microdomaines membranaires sont impliqués dans certaines voies de

signalisation (Magee et al., 2002), et mécanismes d’endocytose (Parton et Richards, 2003)

ainsi que dans le transport intracellulaire du cholestérol. En effet la plupart des protéines

jouant un rôle de transporteurs du cholestérol sont associées à des microdomaines (Orlowski

et al., 2007). Les cavéoles en particulier jouent un rôle important dans le transport

intracellulaire du cholestérol (Ikonen et al., 2004), notamment dans l’efflux du cholestérol

aux HDL (Chao et al., 2003) et dans le transport du cholestérol à partir du réticulum

endoplasmique vers la membrane plasmique (Smart et al., 1996). De plus les cavéoles sont

associés à une protéine membranaire, la cavéoline, qui possède des sites de liaison au

cholestérol. D’autres protéines impliquées dans le transport du cholestérol sont associées aux

microdomaines riches en cholestérol. Il s’agit entre autres du récepteur « scavenger » SR-BI,

impliqué dans la captation des LDL oxydées par les macrophages (Rhainds et al., 2004), et du

transporteur ABCG1 impliqué dans l’efflux du cholestérol aux HDL (Vaughan et Oram,

2006).



25

1.2 Métabolisme cellulaire du cholestérol

1.2.1 Biosynthèse du cholestérol

Les cellules de mammifères possèdent toutes les enzymes nécessaires à la

synthèse de novo du cholestérol. Le foie et l’intestin sont les lieux principaux de la synthèse

du cholestérol mais les cellules périphériques, notamment les macrophages, synthétisent

également une partie de leur cholestérol.

Le cholestérol est synthétisé dans le réticulum endoplasmique à partir d’acétate et

via une série d’environ 30 réactions enzymatiques successives (Figure 3). Une étape

importante en raison de son ciblage pharmacologique par les statines fait intervenir l’enzyme

hydroxyméthylglutaryl CoA réductase (HMG-CoA réductase) qui génère du mévalonate.

L’HMG-CoA réductase est l’enzyme limitante dans la voie de biosynthèse du cholestérol. A

partir du mévalonate la cellule synthétise de l’isopentényl pyrophosphate puis du farnésyl

pyrophosphate et enfin du squalène. La première molécule de stérol produite dans cette voie

Figure 2 : Représentation schématique des radeaux lipidiques et des cavéoles.

Modifié à partir de Chang et al. (2006)

protéine àancre GPI

protéine palmitoylée

radeau lipidique cavéole

cavéoline

cholestérol

SM PC PS phospholipide insaturé

GSL PE PI phospholipide saturé

feuillet externe

feuillet interne



26

de biosynthèse est le lanostérol, formé à partir du squalène par l’enzyme squalène cyclase. Le

lanostérol est ensuite converti en cholestérol lors d’un processus complexe composé de 19

étapes au cours desquelles les doubles liaisons sont réduites, leurs positions modifiées et les

groupements méthyles supprimés (Berg et al., 2002).

Acétate

Mévalonate

Farnésyl pyrophosphate

Squalène

Lanostérol

Cholestérol

Isopentényl pyrophosphate

Figure 3 : Voie de biosynthèse du cholestérol.

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Mé

Documents

Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, acide docosahexaénoïque ...docinsa.insa-lyon.fr/these/2008/bouvier/these.pdfBOUVIER J., PAGEAUX J. F., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON VANDENBROUCKE