Diagnostic rapide de la shigellose Evelyne Bégaud1, Yves Germani2

1 evelyne.begaud@pasteur.fr - Centre de Ressources Biologiques, Institut Pasteur, 25 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France

2 yves.germani@biospeedia.com

- Unité Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France - BioSpeedia, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France

Typhoide 17 000 000 cas / an

Mortalité : 600 000 / an

Diarrheogenic E. coli 650 000 000 cas / an

Mortalité : 380 000 / an

Rotavirus 130 000 000 / an

Mortalité : 650 000 / an

Shigella 1, 2

140 millions de cas / an (5 à 15% des cas de diarrhée) Mortalité : 600 000 – 1 000 000 / an (2/3 d’enfants)

• S. flexneri est plus répandue dans les pays en développement (sérotype 2a) • S. sonnei prévalente dans les pays industrialisés • S. dysenteriae 1, forme épidémique (PED) – toxine Shiga – pronostic sévère 1 http://www.invs.sante.fr/publications/2005/snmi/pdf/shigelloses.pdf 2 Schroeder, G. N., & Hilbi, H. (2012). Clinical Microbiology Reviews, doi:10.1128/CMR.00032-07

Cholera 5 000 000 cas / an

Mortalité : 120 000 / an

CNR Institut Pasteur – 2011 (570 Shigella spp de France métropolitaine) 3 : S. sonnei (270) : 47 % S. flexneri (237) : 42 % (30 % de S. flexneri 2a)

3 http://www.pasteur.fr/ip/resource/filecenter/document/01s-00004r-01b/rapport-annuel-2011--cnr-es-version-dxc3xa9finitive-.pdf

De la coproculture en 4 étapes (48/72 heures)

Isolements Enrichissements

Identification – sérogroupage antibiogramme Prélèvement

Examens directs typage

Objectifs

12 to 24 h

12 to 24 h

12 to 24 h

au diagnostic direct immunochromatographique en 15 minutes en une étape

- Simple à utiliser - Robuste - Bas prix - Stable à 25 deg C

HISTORIQUE ACIP 2004 - Diagnostic d’urgence de la dysenterie et des colites hémorragiques

PTR 179 - An emergency diagnosis for bloody diarrhea

• Unité Pathogénie Microbienne Moléculaire - Y. Germani, A. Phalipon, C. Parsot, P. Sansonetti • Unité Biologie Cellulaire du Parasitisme - N. Guillen, M. Seigneur • Plate-Forme 5 / Production de Protéines Recombinantes et d’Anticorps - E. Fournié Amazouz, F. Nato • ICAREB - M. N. Ungeheuer, C. Ottone • Unité d’Épidémiologie des Maladies Emergentes - A. Fontanet, M. Vray • CRBIP & CNR Shigelles, Salmonelles, E. coli - F.X. Weill • Institut Cantacuzène - N. Bucurenci • Institut Pasteur de Madagascar - P. Combe, L. Rahalison • Institut Pasteur d’Ho Chi Minh Ville - N. Thi Phuong Lan • Institut Pasteur de Bangui - R. Bercion • Institut Pasteur de Dakar - B Garin • INRB Kinshasa / dispensaires de Bunia (RDC) - JJ. Koyengue, JC. Shako • PGIMER (Indes) - N. Taneeja • ICDDRB (Bengladesh) - B. Nair • Université de SANTIAGO (Chili) - V. Prado, C. Ducan

SSA - Programme de Recherche Clinique 34 – Valeur opérationnelle des bandelettes de diagnostic rapide de Shigella flexneri 2a.

Etude coordonnée associée au PTR 179/ACIP

• HIA Ste Anne-Toulon - MC Jérôme MASLIN • GMC Bouffard-Djibouti - MC Jérôme MASLIN • DIASS-Djibouti - MC C. Decam • 5ème RIAOM - MC D. Delasseau • 13ème DBLE - MC L. Journaux • SMIA - MP S.

ETAPES • Caractérisation et choix des cibles antigéniques • Production et purification des antigènes • Construction & sélection des AcM • Prototypes (essais sur souches et selles reconstituées)

– Temps optimal de lecture

• Organisation des sites de validations cliniques • Preuve de concept sur le terrain

– Confirmation du temps optimal de lecture

• Ajustement des prototypes si nécessaire • Production de lots pour les évaluations • Evaluation (STARD) – Référence : Copro / PCR • Si validation : … Pré-Industrialisation

S. flexneri 2a

Antigènes cibles du diagnosticS. dysenteriae (1) / S. flexneri (1b, 2a,3a, 6) / S. sonnei

LPS (diagnostic spécifique)

LPSUR

Antigène O Core Lipid A

n

O

O

OOHHO

Me

OO

HOHOMe

OO

OHOMe

ONHAcHO

OHO

HOOHO

HOOH

A

BC

DE'

Unité répétitive S. flexneri 2a

-3)-α-L-Rha-(1-4)-α-L-Rha-(1-2)-α-D-Gal-(1-4)-α-GlcNac-(1-

- Pathogènes - Cibles antigéniques du diagnostic

-3)-α-L-Rha-(1-3)-α-L-Rha-(1-2)-α-D-Gal-(1-3)-α-GlcNac-(1-

S. dysenteriae 1 S. sonnei phase 1

IcsA

Shigella spp

STOOL

Technologie

Sur souches et selles reconstitutées : aucun faux positif ou faux négatif

EVALUATIONS / VALIDATIONS

CFU/ml ng LPS / mL

S. dysenteriae 1

4.9 x 106

15

S. flexneri 2a

5 x 107

20

S. sonnei

4 x 106

5

Dipstick Test for Rapid Diagnosis of Shigella dysenteriae 1 in Bacterial Cultures and Its Potential Use on Stool Samples Neelam Taneja1, Faridabano Nato2, Sylvie Dartevelle2, Jean Marie Sire3, Benoit Garin3, Lan Nguyen Thi Phuong4, Tai The Diep4, Jean Christophe Shako5, François Bimet6, Ingrid Filliol7, Jean-Jacques Muyembe8, Marie Noelle Ungeheuer9, Catherine Ottone9, Philippe Sansonetti10, Yves Germani 10,11* 1 Department of Medical Microbiology, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Chandigarh, India, 2 Plate-Forme 5 - Production de Proteines recombinantes et d’Anticorps, Institut Pasteur, Paris, France, 3 Laboratoire de Biologie Médicale, Institut Pasteur de Dakar, Dakar, Sénégal, 4 Department of Immunology and Microbiology, Pasteur Institute of Ho Chi Minh City, Ho Chi Minh City, Vietnam, 5 Antenne Médicale de Bunia, Bunia, République Démocratique du Congo, 6 Centre de Ressources Biologiques, Institut Pasteur, Paris, France, 7 Centre National de Référence des Escherichia coli et Shigella, Unité´ de Recherche et d’Expertise des Bactéries Pathogènes Entériques, Institut Pasteur, Paris, France, 8 Institut National de Recherche Biomédicale, Kinshasa, République Démocratique du Congo, 9 Plate-forme Investigation Clinique et Accès aux Ressources Biologiques, Institut Pasteur, Paris, France, 10 Unité´ de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur, Paris, France, 11 BioSpeedia, Institut Pasteur, France

Dipstick for Rapid Diagnosis of Shigella flexneri 2a in Stool Faridabano Nato1, Armelle Phalipon2,3, Lan Phuong Thi Nguyen4, Tai The Diep4, Philippe Sansonetti2,3, Yves Germani2,3,5* 1 Plate-Forme 5-Production de Protéines Recombinantes et d’Anticorps, Institut Pasteur, Paris, France, 2 Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur, Paris, France, 3 Unité Institut National de la Sante´ et de la Recherche Médicale (INSERM) 786, Paris, France, 4 Institut Pasteur, Ho Chi Minh City, Vietnam, 5 Réseau International, Institut Pasteur, Paris, France

Using Dipsticks; Comparison of Rectal Swabs, Direct Stool and Stool Culture Claudia Duran1, Faridabano Nato2, Sylvie Dartevelle2, Lan Nguyen Thi Phuong3, Neelam Taneja4, Marie Noëlle Ungeheuer5, Guillermo Soza6, Leslie Anderson6, Dona Benadof7, Agustín Zamorano7, Tai The Diep3, Truong Quang Nguyen8, Vu Hoang Nguyen8, Catherine Ottone5, Evelyne Bégaud9, Sapna Pahil4, Valeria Prado1, Philippe Sansonetti10, Yves Germani 10, 11* 1 Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile, 2 Institut Pasteur, Plate-Forme 5 - Production de Protéines recombinantes et d'Anticorps, Paris, France, 3 Pasteur Institute of Ho Chi Minh City, Department of Immunology & Microbiology, Ho Chi Minh City, Vietnam, 4 Department of Medical Microbiology, Postgraduate Institute of Medical Education and Research, Chandigarh, India, 5 Institut Pasteur, Plate-forme Investigation Clinique et Accès aux Ressources Biologiques, Paris, France, 6 Hospital Dr. Hernán Henríquez Temuco, Temuco, Chile, 7 Hospital Roberto del Río-Santiago, Región Metropolitana, Chili, 8 Paediatric Hospitals I, Ho Chi Minh City, Vietnam, 9 Institut Pasteur, Centre de Ressources Biologiques, Paris, France, 10 Institut Pasteur, Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Paris, France 11 BioSpeedia, Institut Pasteur

EVALUATIONS / VALIDATIONS

Se (%) Sp (%) VPP (%) VPN (%) Concordance

HCMV 91.5 (95% CI: 83.6–99.4%)

99.2 (95% CI: 97.8–100%)

79.6 (95% CI: 69–90.3)

97 (95% CI: 89.6–100%)

92

Chili 83.3 100 100 99.7 99.7

S. flexneri 2a : Chili, Vietnam, France

TDR S. flexneri 2a –

Coprocultures

Positif Négatif Total

Positif 43 HCMV 10 Chili

11 HCMV 0 Chili

54 HCMV 10 Chili

TDR Négatif 4 HCMV 2 Chili

133 HCMV 734 Chili

137 HCMV 736 Chili

Total 47 HCMV 12 Chili

144 HCMV 734 Chili

191 HCMV 746 Chili

GMCB

Coprocultures (GMBC)

Positive Négative Total Positive 3 0 3 Negative 0 18 18

Total 3 18 21

SMIA

Coprocultures (GMBC)

Positive Négative Total Positive 3 0 3 Negative 0 44 44

Total 3 44 47

Djibouti / Opération 2007 rc 34

Valider ces tests en conditions réelles : sur le terrain, dans des pays à forte prévalence de diarrhées graves où séjournent des forces projetées. L’objectif n’est pas de déterminer leur sensibilité et leur spécificité déjà connues, mais d’évaluer leur valeur opérationnelle.

Infirmerie 13ème DBLE

Coproculture (GMBC)

Positive Négative Total Positive 5 1 6 Négative 0 17 17

Total 5 18 23

Se (%) Sp (%) VPP (%) VPN (%) Concordance (%) 100 98.7 91.6 100 98.9

Se (%) Sp (%) VPP (%) VPN (%) Concordance

91.7 (95% CI: 59.8–99.6%)

98.7

(95% CI: 96.6–99.6%)

73.3

(95% CI: 44.8–91.1%)

99.7

(95% CI: 98–100%)

98.4

TDR S. dysenteriae 1

Coprocultures TDR

Positif Négatif Total

Positif 11 4 15

Négatif 1 74 (India 2007) 43 (India 2009) 75 (Senegal) 48 (DRC) 48 (Vietnam) 24 (France)

312

Total 12 316 328

PATH (NGO) Program for Appropriate Technology in Health

Conclusions From these preliminary experiments, it is clear that the core antibody used in the test has both a very high sensitivity and specificity ... With a small amount of optimization, this could prove to be a strong and viable diagnostic device.

INRB Kinshasa / dispensaires de Bunia (RDC) MEMISA Belgique (épidémie de Zunguluka)

TDR S. sonnei

Se (%) Sp (%) VPP (%) VPN (%) Concordance

S. sonnei - 342 Ecouvillons

- 219 Selles

100

100

95.3 (95% CI: 92.9 - 97.7%)

96 (95% CI: 92–98%)

77 (95% CI: 65 - 86.5%)

72.4 (95% CI: 56.1–88.6%)

100

100

95.5

96.3

• S. Sonnei : Chili, Vietnam, Indes, France

Ecouvillons

/ TDR

Ecouvillons / Coprocultures

Positive Negative Total

Positive 47 14 61

Negative 0 281 281

Total 47 295 342

TDR

Coproculture

Positive Negative Total

Positive 8 (Chile) 6 (Vietnam)

7 (India)

3 (Chile) 3 (Vietnam)

2 (India)

29

Negative 0 40 (Chile) 51 (Vietnam) 51 (France) 48 (India)

190

Total 21 198 219

TDR Shigella spp (Chili)

Coproculture TDR Shigella spp

Total Observations

+ + 5 5 TDR Ss +

- - 38 38 TDR Ss Sf2a -

+ - 3 3 TDR Ss +

- + 5 5 TDR Ss + 51

• Présence de la ligne contrôle • Volume de selles • Type de tube, toujours en verre • Mouvement de l’écouvillon dans l’eau distillée • Respect du temps de lecture • Respect du temps entre la défécation et la réalisation du test

Tests en perspectives

KERP1 : a protein involved in the pathogenic process of Entamoeba histolytica

H D H D

25 kDa

50 kDa

75 kDa

Mouse anti-KERP1 monoclonal antibody

Mouse anti-actinmonoclonal antibody

The anti-KERP1 antibody is specific of Entamoeba histolytica

Total protein extractH = Entamoeba histolyticaD = Entamoeba dispar

Entamoeba histolytica

Seigneur M, Mounier J, Prevost MC, Guillén N. Cell Microbiol. 2005 Apr;7(4):569-79.

ECEH O157

Fraser, M. E. et al. J. Biol. Chem. 2004;279:27511-27517

Shiga tox, SLTX 1 & 2 (B sub) STEC EPEC

Oswald E. et al

19

Institut Pasteur (spin out) 25 rue du Dr Roux

75724 Paris Cedex 15 - FRANCE

www.biospeedia.com (in progress)

Diarrhée Méningite

(Peste)