Actions conduites par le laboratoire National de Référence sur Rhinotrachéite Infectieuse Bovine pour la prophylaxie et la qualification volontaire des cheptels bovins français

Eric Dubois1, V. Duquesne1, F. Suavet1, C. Gastaldi1, G. Adam1, A. Del Cont1, R. Thiéry1, S. Memeteau2

1-Laboratoire National de Référence Rhinotrachéite Infectieuse Bovine – Anses, Laboratoire de Sophia-Antipolis - 105 route des Chappes - B.P. 111 - F-06902 SOPHIA-ANTIPOLIS cedex – France ; (eric.dubois@anses.fr - Tél. : +33 492 94 37 00 - Fax : +33 492 94 37 01).

2-Association pour la certification en santé animale (ACERSA) – 149 rue de Bercy – 75595 Paris cedex 12, France.

Introduction

L’herpès virus bovin de type 1 (BoHV-1) est responsable de signes cliniques différents en fonction de la voie de contamination des animaux (Muylkens et al., 2007). La forme génitale (vulvo-vaginite de la vache ou balanoposthite du taureau) ne se rencontre que rarement en France, en raison de contrôles sanitaires rigoureux sur les animaux reproducteurs. La rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR) est la forme respiratoire de la maladie qui persiste sur le territoire. Les deux voies de contamination chez des vaches gestantes peuvent aussi conduire à des avortements. Toutefois, l’infection par le BoHV-1 est le plus souvent asymptomatique et d’un impact sanitaire limité. Les pertes économiques sont essentiellement liées au vice rédhibitoire que constitue l’IBR dans la vente ou l’échange de bovins au plan national (Décret n°2001-375). Au niveau européen, l’IBR donne lieu à des demandes de garanties additionnelles pour les échanges intracommunautaires de bovins (Décision du 21 août 2007) vers des pays qui ont mis en place un programme de lutte approuvé (certaines régions d’Allemagne et d’Italie) ou indemnes d’infection par le BoHV-1 (une province d’Italie, deux régions d’Allemagne, le Danemark, l’Autriche, la Finlande et la Suède).

En France, dans les années 90, plus de 40 départements avaient mis en œuvre des actions en matière d’IBR, mais sans harmonisation. Ce fut l’origine de la mise en place, en 1996, d’un dispositif national,

volontaire de qualification (dont le gestionnaire est l’Association pour la certification en santé animale - ACERSA), complété par la suite par des mesures obligatoires de prophylaxie nationale (Arrêté du 27 novembre 2006). Cette prophylaxie concerne annuellement l’ensemble des cheptels, tandis que la qualification est acquise par environ 58% (données 2009-2010) des exploitations (laitières, allaitantes ou mixtes) (Memeteau et al, 2011).

Programme Français de contrôle de l’IBR et qualification volontaire des cheptels.

La qualification volontaire des cheptels repose sur le cahier des charges techniques (CC/IBR/01) de l’ACERSA. Le document décrit les points de maîtrise pour l’acquisition et le maintien des qualifications. Il décrit également la gestion des introductions, du transport, des pâturages collectifs, des concours et définit les zones à situation épidémiologique favorables (à faible prévalence ou faible incidence) permettant l’allègement de certaines mesures de contrôle (Bronner et al., 2010).

Deux niveaux de qualification sont possibles : la qualification A « cheptel indemne d’IBR » et la qualification B « cheptel contrôlé en IBR ». En 2010, 122.072 cheptels étaient qualifiés A contre 1.058 qualifiés B (Memeteau et al, 2011).

La qualification A est acquise dans un intervalle de temps donné par des séries successives d’analyses sur des laits de grand mélange (LGM ; 4 séries négatives sur 16 à 24 mois) ou sur des mélanges de sérums (mélanges d’au plus 10 sérums issus des animaux de 24 mois et plus ; 2 séries négatives sur une période de 3 à 15 mois). En cheptel laitier, la qualification est maintenue par deux séries d’analyses négatives sur LGM, réalisées sur deux à six mois (une seule analyse par an est acceptée pour les cheptels en zone à situation épidémiologique favorable). En cheptel allaitant, la qualification est maintenue grâce à une analyse négative annuelle sur mélange de sérums (contrôle sérologique sur 20% des bovins de plus de 24 mois, avec un minimum de 10 animaux, pour les cheptels en zone à situation épidémiologique favorable).

La qualification B correspond à des cheptels dans lesquels les animaux de moins de 48 mois sont tous négatifs en analyses sérologiques sur mélanges de sérums au moment de l’acquisition de l’appellation. Toutefois ces cheptels peuvent héberger des animaux plus âgés connus positifs mais vaccinés régulièrement contre l’IBR.

Dans le cadre des mesures de prophylaxie, le dépistage annuel des bovinés de 24 mois et plus, non vaccinés, s’appuie sur les mêmes essais en mélanges que ceux de la qualification volontaire.

D’un point de vue réglementaire, les contrôles sérologiques à l’introduction s’effectuent, quant à eux, sur tous les animaux, quelque soit leur âge, par des analyses individuelles dans les 15 jours maximum avant ou dans les 10 jours suivants leur arrivée dans le nouveau cheptel. Seuls les animaux issus de cheptels qualifiés A ayant bénéficié de conditions de transport maîtrisées peuvent déroger à ces contrôles. Les éleveurs engagés dans la qualification volontaire sont soumis à des règles particulières. Si les animaux introduits sont indemnes d’IBR, le contrôle doit être réalisé dans les 30 jours qui suivent l’arrivée des bovins. Il est recommandé de préférer un contrôle entre 15 et 30 jours, particulièrement si le transport des animaux n’était pas maîtrisé. Les animaux issus de cheptels non qualifiés seront, quant à eux, à nouveau contrôlés (en analyses de mélange dans le cas d’introduction d’un lot d’animaux) dans les 60 jours suivant leur arrivée dans le cheptel introducteur.

Ainsi, ce sont les mêmes essais de diagnostic de l’IBR qui servent à la qualification comme aux contrôles réglementaires, qu’il s’agisse d’analyses individuelles pour les contrôles d’introduction ou d’analyses de mélange pour les dépistages de troupeaux

Essais sérologiques et gestion des animaux positifs au diagnostic de l’IBR

Quatre tests sérologiques peuvent être utilisés pour établir le statut sanitaire d’un bovin vis-à-vis de l’IBR : la neutralisation virale, l’ELISA indirect et deux ELISA par compétition ciblant les anticorps dirigés contre soit la glycoprotéine virale B (gB) soit la glycoprotéine virale E (gE).

Seuls les ELISA indirects sont agréés pour les essais en mélange (mélange de sérums ou LGM). Les ELISA indirects et ELISA gB servent tous deux aux tests individuels. En France, les ELISA compétition gE, dont les performances sont moindres (confer ci-dessous), ne sont pas mis en œuvre pour définir

le statut d’un animal. Bien que normalisés (AFNOR, 2010), les essais de neutralisation sont généralement mis en œuvre dans le cadre d’expertises complémentaires. Selon la réglementation (Arrêté du 25 avril 2001), la seule réactivité en neutralisation virale suffit à considérer un bovin comme atteint de l’IBR. Toutefois, à elle seule, la négativité d’un sérum par ce test n’a pas suffisamment de valeur (valeur prédictive négative) pour permettre de statuer sur l’animal.

En prophylaxie, la positivité d’un mélange de sérum est vérifiée par une analyse sur chaque sérum ayant constitué le mélange (Figure 1). Les cheptels non négatifs par des analyses sur LGM sont recontrôlés sur LGM ; si le résultat est confirmé, ils sont vérifiés par des analyses sur sérums (mélanges de sérums suivis éventuellement d’analyses individuelles). Les animaux non négatifs doivent être vaccinés dans les deux mois qui suivent la notification du résultat et cette vaccination doit être entretenue par des rappels vaccinaux.

En cheptel qualifié (Figure 1), la positivité d’un LGM suspend la qualification dans l’attente des résultats d’une seconde analyse sur LGM (dans les 3 mois maximum). Si le second résultat sur LGM est négatif, le cheptel est requalifié mais reste suivi pendant deux mois avec la réalisation de deux nouvelles analyses sur LGM. Si par contre, le second résultat est de nouveau positif, une analyse sérologique sur mélanges de sérums est réalisée dans un délai maximum de trois mois. Les sérums des mélanges positifs seront repris en analyses individuelles (ELISA indirect).

Un sérum individuel positif, issu d’un animal qualifié (ou ayant déjà été testé négatif dans le cadre d’une démarche de qualification), dans un contexte épidémiologique favorable, sera vérifié par un second test ELISA compétition gB afin d’améliorer la spécificité du diagnostic sérologique (ACERSA, PR/IBR/03 et ACERSA, 2011). Trois interprétations différentes sont alors possibles : sérum positif, sérum négatif ou sérum divergent (Tableau 1).

Tableau 1 : Interprétation des analyses de sérums individuels selon la procédure ACERSA PR/IBR/03.

Résultat ELISA indirect Résultats ELISA compétition gB Positif Négatif

Positif sérum positif sérum divergentNégatif sérum divergent sérum négatif

Douteux sérum positif sérum négatif

Si plus de 1% de l’effectif des bovins qualifiés est positif, le cheptel est déqualifié. Si un seul animal ou moins de 1% de l’effectif est positif, la qualification du cheptel est suspendue ; une seconde prise de sang est réalisée sur les animaux positifs et les deux tests ELISA, indirect et gB, sont utilisés. Les animaux non négatifs aux deux kits seront éliminés et le cheptel entier sera recontrôlé (au moins 3 mois après élimination du dernier bovin positif si c’est en analyses de mélange et au moins 1 mois si c’est en analyses individuelles) pour recouvrir sa qualification.

Figure 1 : Synoptique des analyses conduites en prophylaxie et qualification, en cas de positivité d’animaux.

Les animaux divergents ne peuvent entrainer à eux seuls la déqualification d’un cheptel. Toutefois, il est conseillé de refaire des analyses dans un délai d’un mois au cas où il s’agirait d’un animal en cours de séroconversion.

Dans ce contexte des mesures de contrôle de l’IBR, le Laboratoire National de Référence (LNR-IBR) conduit des actions d’appui scientifique et technique, d’expertise et de recherche.

Contrôle des outils sérologiques de diagnostic et des conditions de leur mise en application

Officialisé en 2009 par arrêté ministériel (Arrêté du 29 décembre 2009), le LNR-IBR s’appuie sur une expérience de plus de 15 ans de travaux scientifiques sur cette maladie. L’Anses (laboratoire de Lyon) a soutenu dès 1996 le diagnostic sérologique de l’IBR en mettant en place une procédure volontaire de contrôle des trousses ELISA indirect (recherche des anticorps totaux dirigés contre le BoHV-1) et compétition (anticorps dirigés contres la protéine virale gB). Le contrôle des kits reposait également sur l’élaboration d’une collection de sérums nationaux (sérums de référence Ref46 pour les analyses individuelles, Ref46/10 pour les essais sur mélanges de sérums, et lait français de référence LFI/10) et internationaux (sérums OIE EU1 [positif fort], EU2 [positif faible] et EU3 [négatif en anticorps]). Le laboratoire de Sophia-Antipolis a repris ces travaux en 2007 avec la mise en place de la prophylaxie nationale.

Le contrôle des kits de diagnostic est rendu obligatoire afin de garantir leurs performances en détectabilité, sensibilité, spécificité et répétabilité (Tableau 2). Chaque année des kits ne satisfont pas à ces exigences (Figure 2) et ils ne sont donc pas autorisés pour le diagnostic de l’IBR en France. Particulièrement, aucun kit gE actuellement disponible sur le marché ne satisfait à ces exigences notamment en terme de détectabilité.

Tableau 2 : Critères d’agrément du LNR-IBR, en fonction des matrices, des kits ELISA indirect et ELISA par compétition

Critères Mélange de sérum Sérum individuel Lait de grand mélangeDétectabilité1 EU1 et EU2 positifs

Détectabilité2 Ref46/dilué au 10ème

positif 5 fois sur 10Ref46 positif 5 fois sur

10LFI dilué au 10ème

positif 8 fois sur 10

Relation dose/réponseEvolution de la positivité à la négativité et de façon cohérente des

résultats obtenus à partir d’une dilution de raison deux d’un échantillon positif

Sensibilité 5 échantillons positifs de référence trouvés positifs

RépétabilitéCoefficient de variation obtenu à partir de 56 répétitions

inférieur ou égale à 12%Spécificité1 EU3 négatifSpécificité 10 échantillons négatifs de référence trouvés négatifs

Spécificité97 % à partir de 100 mélanges négatifs

99,3 % à partir de 1000 sérums négatifs

99% à partir de 100 laits de grand mélange

négatifs1 : essais sur sérums de référence internationaux (OIE) : EU1 est un sérum fort positifs, EU2 est faiblement positifs et EU3 est négatifs.2 : essais sur échantillons de référence français : Ref46 est le sérum national de référence faiblement positif ; LFI est le lait de référence français positif.

Figure 2 : Résultats des contrôles de kits de diagnostic de l’IBR, réalisés par le LNR

Le LNR vérifie aussi les conditions d’usage de ces kits en organisant périodiquement des essais interlaboratoires d’aptitudes auprès du réseau de 85 laboratoires agréés pour le diagnostic sur sérum et 25 sur le lait. Il est également ouvert à d’autres participants sur le plan national et international. Les données de ces essais permettent aussi d’apprécier la justesse et la fidélité des méthodes.

Le LNR (accrédité pour les essais en immunosérologie selon la norme NF/EN/ISO 17025) réalise également des contre-expertises à la demande des laboratoires ou des gestionnaires de la prophylaxie comme de la qualification. Il complète les essais de recherche d’anticorps en ELISA par des essais de neutralisation virale et développe de nouveaux outils pour renforcer encore son expertise (western blot, neutralisation virale croisée, PCR).

Perspectives du diagnostic de l’IBR

Le diagnostic sérologique de l’IBR profite régulièrement de l’avancée des connaissances scientifiques et des développements méthodologiques. L’objectif visé est à chaque fois d’améliorer la sensibilité tout en maintenant une spécificité élevée des essais. Toutefois, l’enjeu des prochaines évolutions sera aussi de contribuer à la reconnaissance, au plan européen, des méthodes de diagnostic mise en œuvre dans le cadre du programme français d’éradication.

Dans un contexte d’éradication de l’IBR où la proportion et le nombre d’animaux indemnes augmente chaque année, les animaux nouvellement positifs devront faire l’objet d’études plus approfondies afin d’apporter des éléments scientifiques et épidémiologiques pour statuer sur une exposition au BoHV-1 ou sur un manque de spécificité du diagnostic. Le LNR s’intéresse notamment aux interférences des alpha-herpes virus (différents du BoHV-1) sur le diagnostic de l’IBR. Ces recherches ont permis d’identifier, pour la première fois, l’herpesvirus caprin de type 1 (CpHV-1) dans des cheptels caprins de France continentale. Les travaux se poursuivent afin d’évaluer la prévalence de ce virus et les possibilités d’échanges entre cheptels caprins et bovins.

Les futurs axes de recherche devront aussi contribuer à développer des méthodes complémentaires aux diagnostics de routine : neutralisation virale croisée, western blot, voire pour permettre plus aisément le diagnostic direct de l’infection par PCR.

Références

1- ACERSA, 2011. Evolution de la PR/IBR/03 à prévoir pour 2011-2012. Brèves n°44.

2- ACERSA, CC/IBR/01. Cahier des charges techniques du système national de qualification de cheptel en matière de rinotrachéite infectieuse bovine. Version M du 29/01/2010.

3- ACERSA, PR/IBR/03. Analyses. Rév C du 16/04/07.

4- AFNOR, 2010. Recherche d’anticorps contre la rhinotrachéite infectieuse bovine par la technique de neutralisation virale. NF U47-030.

5- Arrêté du 29 décembre 2009 désignant les laboratoires nationaux de référence dans le domaine de la santé publique vétérinaire et phytosanitaire. AGRG0930196A.

6- Arrêté du 27 novembre 2006 fixant des mesures de prophylaxie collective de la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR). AGRG0602473A.

7- Arrêté du 25 avril 2001 fixant les procédés et critères d’établissement d’un diagnostic pour la rhinotrachéite infectieuse bovine visée à l’article 285 du code rural. Journal officiel de la République française du 2 mai 2001. AGRG0001294A.

8- Décision de la commission du 21 août 2007 modifiant la décision 2005/558/CE mettant en œuvre la directive 64/432/CEE du Conseil en ce qui concerne des garanties additionnelles pour les échanges intracommunautaires de bovins en rapport avec la rhinotrachéite infectieuse bovine et l’approbation des programmes d’éradication présentés par certains Etats membres. 2007/584/CE.

9- Décret n°2001-375 du 25 avril 2001 modifiant le décret n°90-572 du 28 juin 1990 pris pour application du titre VI du livre III du code rural et reklatif aux vices rédhibitoires dans les ventes et échanges d’animaux domestiques. AGRG0001293D.

10- Memeteau S, Mési F, Dubois E, Bronner A. 2011. Bilan de la surveillance réglementée et facultative de la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR) en 2010. Bulletin épidémiologique, santé animale et alimentation, sous presse.

11- Muylkens B., Thiry J., Kirten P., Schynts F., Thiry E. (2007) Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. Vet. Res. 38:181-209.

12- Norme internationale (2005). Exigence générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essai. NF EN ISO/CEI 17025.

13- Bronner A, Guerrier-Chatellet M-C. Languille J., Petit E., Duquesne V., Dubois E. (2010) La lutte contre la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR) en France : un dispositif original. Présentation, bilan et perspectives. Bulletin épidémiologique, santé animale et alimentation, n°41.