Etude biochimique des fractions lipidiques de graines de

$Page 1: Etude biochimique des fractions lipidiques de graines de$
http://lib.ulg.ac.be http://matheo.ulg.ac.be

Etude biochimique des fractions lipidiques de graines de la famille des

apiacées obtenues par différentes méthodes d'extraction

Auteur : Detry, Pauline

Promoteur(s) : Fauconnier, Marie-Laure

Faculté : Gembloux Agro-Bio Tech (GxABT)

Diplôme : Master en bioingénieur : chimie et bioindustries, à finalité spécialisée

Année académique : 2016-2017

URI/URL : http://hdl.handle.net/2268.2/3011

Avertissement à l'attention des usagers :

Tous les documents placés en accès ouvert sur le site le site MatheO sont protégés par le droit d'auteur. Conformément

aux principes énoncés par la "Budapest Open Access Initiative"(BOAI, 2002), l'utilisateur du site peut lire, télécharger,

copier, transmettre, imprimer, chercher ou faire un lien vers le texte intégral de ces documents, les disséquer pour les

indexer, s'en servir de données pour un logiciel, ou s'en servir à toute autre fin légale (ou prévue par la réglementation

relative au droit d'auteur). Toute utilisation du document à des fins commerciales est strictement interdite.

Par ailleurs, l'utilisateur s'engage à respecter les droits moraux de l'auteur, principalement le droit à l'intégrité de l'oeuvre

et le droit de paternité et ce dans toute utilisation que l'utilisateur entreprend. Ainsi, à titre d'exemple, lorsqu'il reproduira

un document par extrait ou dans son intégralité, l'utilisateur citera de manière complète les sources telles que

mentionnées ci-dessus. Toute utilisation non explicitement autorisée ci-avant (telle que par exemple, la modification du

document ou son résumé) nécessite l'autorisation préalable et expresse des auteurs ou de leurs ayants droit.

ETUDE BIOCHIMIQUE DES FRACTIONS LIPIDIQUES DE GRAINES DE LA FAMILLE

DES APIACEES OBTENUES PAR DIFFERENTES METHODES D’EXTRACTION

DETRY PAULINE

TRAVAIL DE FIN D’ETUDES PRESENTE EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME DE

MASTER BIOINGENIEUR EN CHIMIE ET BIO-INDUSTRIES

ANNEE ACADEMIQUE 2016-2017

PROMOTEUR : MARIE-LAURE FAUCONNIER

Toutereproductionduprésentdocument,parquelqueprocédéquecesoit,nepeutêtreréaliséequ'avecl'autorisationdel'auteuretdel'autoritéacadémiquedeGemblouxAgro-BioTech.

Leprésentdocumentn'engagequesonauteur.

ETUDE BIOCHIMIQUE DES FRACTIONS LIPIDIQUES DE GRAINES DE LA FAMILLE

DES APIACEES OBTENUES PAR DIFFERENTES METHODES D’EXTRACTION

DETRY PAULINE

TRAVAIL DE FIN D’ETUDES PRESENTE EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME DE

MASTER BIOINGENIEUR EN CHIMIE ET BIO-INDUSTRIES

ANNEE ACADEMIQUE 2016-2017

PROMOTEUR : MARIE-LAURE FAUCONNIER

II

INSTITUTIOND’ACCUEIL

Cetravaildefind’étudesaétéréaliséauseinduLaboratoiredeChimiegénéraleetorganiquedeGemblouxAgro-BioTech(UniversitédeLiège).

REMERCIEMENTS

J’aimeraisremerciertouteslespersonnesquiontcontribuédeprèsoudeloinàlaréalisationdecetravaildefind’étudesetquiontrenducescinqannéesàGemblouxinoubliables.

Avanttout, jeremercieparticulièrementMadameMarie-LaureFauconnierdem’avoirdonnélachancedemenermon travailde find’étudesdansson laboratoire,ainsiquepoursesconseilsavisésdanslesmomentsd’hésitation!JeremercieégalementInessBettaiebdem’avoirencadréesurcesujetettouslesmembresdemonjurydeconsacrerdeleurtempsàévaluermontravail.

Ensuite, je remercie du fond du cœur toute l’équipe du Laboratoire de Chimie Générale etOrganiquepoursonaccueil,sabonnehumeuretsonaide.UnimmensemerciàDannyquiaeulapatiencederépondreàchacunedemesquestionsavecbienveillanceetunimmensesavoir!UngrandmerciàFrancketThomaségalementpourleuraideaulaboetàNathaliepoursonécouteà toute épreuve.Merci encore à vous pour votre temps, vos conseils précieux et votre bonnehumeur! Je n’oublie évidemment pas Thierry,Matthew,Manon etMarie quim’ont égalementaidéeàmaintesreprisesdurantcetravail.

Enfin,jeremerciemafamillequiestmaprincipalesourcedecourageetquimedonnelesourirecommeriennipersonned’autre.Jepenseévidemmentégalementàtousmesamissansquicesannées n’auraient pas été pareilles. Merci pour tous ces beaux moments, ces fous rires etsourires, cette bonne humeur au quotidien, ces soupers copieux, cette entraide, ces stresspartagés, ces épisodes de soutien noctambule, ces pauses improvisées mais nécessaires, cesséancesdedécoupesdefourches,ettoutlereste…

III

RÉSUMÉ

LeFoeniculumvulgare Mill., lePimpinellaanisum L. et leCarumcarvi L. plus connus sous lesnoms de fenouil, anis vert et carvi respectivement, sont des plantes issues de la famillebotanique des Apiacées. Ce sont des plantes aromatiques et médicinales dont les huilesessentielles possèdent de nombreuses propriétés et sont déjà très étudiées et utilisées. Lesfractions lipidiques des graines de ces plantes ont également déjà été investiguées. L’acidepétroséliniqueestl’acidegrasmajeurdelafamilledesApiacéesetprésenteégalementdiversespropriétés,laplusreconnueétantuneactivitéanti-inflammatoire.Al’heureactuelle,l’extractiondes huiles végétales se fait à l’aide de solvants d’origine pétrolière. Cependant, cela pose desproblèmestantauniveauenvironnementaletsécuritairequ’auniveaudelasantépublique.Lesréglementationssontdoncdeplusenplusstrictesetdesméthodesd’extractionalternativesdeplus en plus recherchées. Celles-ci consistent généralement en l’utilisation de solvants desubstitutionmaisilestégalementpossibled’extraireleslipidesàl’aidededioxydedecarboneàl’état supercritique. Lors de ce travail, différentes méthodes d’extraction conventionnelles etalternatives ont été explorées en vue de les comparer. Les méthodes conventionnelles ontconsistéenuneextractionàchaudparlaméthodedeSoxhletàl’hexaneetuneextractionàfroidparlaméthodedeFolch.Lesméthodesalternativestestéesontétéuneextractionaudioxydedecarbone supercritique, à basse température, et une extraction à chaud selon la méthode deSoxhletàl’aided’unagro-solvant,le2-méthyltétrahydrofurane.Lesextraitslipidiquesdestroistypesde grainesobtenuspar cesquatreméthodesd’extractionont été analysés en termesdecompositionenacidesgras,compositionenstérolsetactivitéantioxydanteafindedéterminersiles méthodes d’extraction alternatives seraient capables de remplacer les méthodesactuellementutilisées.LesrésultatsobtenusontpermisdeconclurequelesextractionsparCO2supercritique et 2-méthyltérahydrofurane représentent, en termes de qualité des huilesobtenues,desalternativesprometteuses.

ABSTRACT

Foeniculum vulgare Mill., Pimpinella anisum L. and Carum carvi L., commonly called fennel,aniseed and caraway, are plants belonging to the botanical family of Apiaceae. These arearomaticandmedicinalplants.Theiressentialoilsshowmanypropertiesandarealreadywellstudied and used. The lipid fractions of their seeds have also already been investigated. ThemajorfattyacidofApiaceaefamilyispetroselinicacid.Thisonealsopresentsseveralproperties,including anti-inflammatory activity which is the most known. Nowadays, vegetable oils areextractedwiththehelpofpetrosolvents.Thisraiseissuesregardingenvironmentandsecurity,but alsopublichealth.Regulationsaremoreandmore strict, andalternativesmoreandmoresearched.Ingeneral,thoseonesconsistintheuseofsubstitutionsolvents,butlipidextractionisalsopossiblewiththehelpofcarbondioxideinitssupercriticalstate.Inthiswork,conventionalandalternativeextractionmethodshavebeenexploredinordertocomparethem.Conventionalmethods have consisted in a warm extraction by Soxhlet method with hexane and a coldextraction by Folch method. The performed alternative methods were a supercritical carbondioxideextraction, at cold temperature, andawarmextractionbySoxhletmethodwithabio-basedsolvent,2-methyltetrahydrofuran.Thelipidfractionsobtainedfromthosethreeseedsbythose four extraction methods have been analysed in terms of fatty acids and sterolscompositions and antioxidant activity. The objective of this work is to determine whetheralternative extraction methods could replace current conventional methods. The obtainedresultsallowed toconclude thatextractionsbysupercriticalCO2and2-methyltetrahydrofuranconstitute,regardingthequalityoftheobtainedoils,promisingalternatives.

IV

TABLEDESMATIÈRES

INSTITUTIOND’ACCUEIL II

REMERCIEMENTS II

RESUME III

ABSTRACT III

TABLEDESMATIERES IV

LISTESDESFIGURES,TABLEAUX,EQUATIONS,ANNEXESETABREVIATIONS VII1. LISTEDESFIGURES VII2. LISTEDESTABLEAUX VIII3. LISTEDESEQUATIONS VIII4. LISTEDESANNEXES IX5. LISTEDESABREVIATIONS X

INTRODUCTION 11. LESPLANTESAROMATIQUESETMEDICINALES(PAM) 1DEFINITIONS 1EVOLUTIONDEL’UTILISATIONDESPAM 1COMPOSITIONPHYTOCHIMIQUEDESPAM 2

Huilesessentielles 3Composésphénoliques 3Autrescomposésintéressants 4

PROPRIETESDESPAM 4FENOUIL(FOENICULUMVULGAREMILL.) 5

Classificationtaxonomique 5Origineetrépartitiongéographique 5Descriptionbotanique 5Compositionbiochimiquedelagraine 6Propriétésetutilisations 7Toxicité 8

ANISVERT(PIMPINELLAANISUML.) 8Classificationtaxonomique 8Origineetrépartitiongéographique 8Descriptionbotanique 9Compositionbiochimiquedelagraine 9Propriétésetutilisations 10Toxicité 11

CARVI(CARUMCARVIL.) 11Classificationtaxonomique 11

Origineetrépartitiongéographique 11Descriptionbotanique 12Compositionbiochimiquedelagraine 12Propriétésetutilisations 13Toxicité 14

2. MATIEREGRASSEVEGETALE 14GLYCERIDESETACIDESGRAS 14

Généralités 14Acidepétrosélinique 15

V

PHOSPHOLIPIDES 18STEROLS 19TOCOPHEROLS 20AUTRESCOMPOSESLIPIDIQUES 203. COMPOSESPHENOLIQUES 21DEFINITION 21CLASSIFICATION 21

Acidesphénoliques 22Flavonoïdes 22Tanins 22

PROPRIETES 224. EXTRACTIONDESLIPIDES 23METHODESCONVENTIONNELLES 23

Al’échellelaboratoire 23Al’échelleindustrielle 24Inconvénientsdesméthodesconventionnelles 24

EXTRACTIONAUXSOLVANTSDESUBSTITUTION 24EXTRACTIONAUCO2SUPERCRITIQUE 25

Alternativeauxméthodesconventionnelles 25Fluidessupercritiques 25CO2supercritiquecommesolvantd’extraction 26

5. ACTIVITEANTIOXYDANTE 27OXYDATION,RADICAUXLIBRESETANTIOXYDANTS 27ACTIVITEANTIOXYDANTEETSANTE 27ACTIVITEANTIOXYDANTEETPRODUITSAGRO-ALIMENTAIRES 28ACTIVITEANTIOXYDANTEDESPLANTES 28

MATERIELSETMETHODES 291. MATERIELVEGETAL 29CULTURE,RECOLTEETPREPARATIONDUMATERIELVEGETAL 29TENEURENMATIERESECHE 292. EXTRACTIONSDESHUILES 29EXTRACTIONPARL’HEXANESELONLAMETHODEDESOXHLET 30EXTRACTIONSELONLAMETHODEDEFOLCH 31EXTRACTIONAUCO2SUPERCRITIQUE 32EXTRACTIONPARUNSOLVANTALTERNATIFSELONLAMETHODEDESOXHLET 353. CARACTERISATIONDESHUILES 36PROFILENACIDESGRAS 36TENEURSENACIDESGRAS 37TENEURETPROFILENSTEROLS 37PROFILENCOMPOSESPHENOLIQUES 39

Préparationd’extraitsméthanoliques 39TeneurtotaleencomposésphénoliquesparFolin-Ciocalteu 40ProfilencomposésphénoliquesparHPLC 40

ACTIVITEANTI-OXYDANTE 414. TRAITEMENTSSTATISTIQUESDESRESULTATS 42

RESULTATSETDISCUSSIONS 431. TENEURENMATIERESECHEDESGRAINES 432. EXTRACTIONSDESHUILES 43GENERALITES 43COMPARAISONDESPLANTES 44COMPARAISONDESMETHODESD’EXTRACTION 443. CARACTERISATIONDESHUILES 45

VI

PROFILSENACIDESGRAS 45Fenouil 45Anisvert 48Carvi 50Comparaisondesplantes 51Comparaisonsdesméthodesd’extraction 52

TENEURSENACIDESGRAS 53Fenouil 53Anisvert 54Carvi 54Comparaisondesplantes 54Comparaisondesméthodesd’extraction 54

TENEURSETPROFILSENSTEROLS 55Fenouil 55Anisvert 58Carvi 59Comparaisondesplantes 61Comparaisondesméthodesd’extraction 61

TENEURSETPROFILSENCOMPOSESPHENOLIQUES 62TeneurtotaleencomposésphénoliquesparFolin-Ciocalteu 62ProfilencomposésphénoliquesparHPLC 63

ACTIVITESANTIOXYDANTES 64Généralités 64Comparaisondesplantes 65Comparaisondesméthodesd’extraction 66

DISCUSSIONGENERALE 681. RENDEMENTSMASSIQUESD’EXTRACTION 682. ACIDESGRAS 683. STEROLS 694. ACTIVITEANTIOXYDANTE 705. AUTRESCRITERES 706. INTERETAGRANDEECHELLE 71

PERSPECTIVES 73

CONCLUSION 74

REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES 75

ANNEXES 81

VII

LISTES DES FIGURES, TABLEAUX, ÉQUATIONS,ANNEXESETABRÉVIATIONS

1. ListedesfiguresFigure1:Structuressécrétricesdegrainesdecarvi(x48)(Svobodaetal.,2003b)_____________________________ 3Figure2:PlanchebotaniquedeFoeniculumvulgareMill.(Thomé,1885) ______________________________________ 5Figure3:Composésmajeursdel'huileessentielledegrainesdeFoeniculumvulgareMill._____________________ 7Figure4:PlanchebotaniquedePimpinellaanisumL.(Thomé,1885)___________________________________________ 9Figure5:Composésmajeursdel'huileessentielledegrainesdePimpinellaanisumL.________________________10Figure6:PlanchebotaniquedeCarumcarviL.(Thomé,1885)________________________________________________12Figure7:Composésmajeursdel'huileessentielledegrainesdeCarumcarviL._______________________________13Figure8:Structured'untriglycéride,d’après(Peter,2008) ____________________________________________________14Figure9:Structuresdel'acidepétroséliniqueetoléique________________________________________________________15Figure10:Structuredesprincipauxstérols(Trautweinetal.,2007)___________________________________________19Figure11:Structuredestocophérolsettocotriénols,d’après(Colombo,2010)________________________________20Figure12:Squelettemoléculairedebasedesflavonoïdes_______________________________________________________22Figure13:Diagrammedephasedudioxydedecarbone(Budisaetal.,2014)_________________________________26Figure14:Représentationdel'appareilutilisépourlesextractionsauCO2supercritique____________________33Figure15:Schémadeprincipesimplifiédel'appareilutilisépourlesextractionsauCO2supercritique_____34Figure16:Structuredelabétuline(d’après(Winkler-Moser,n.d.)) ___________________________________________37Figure17:Rendementsmassiquesd'extractiondeshuilesdesdifférentesgrainesparlesdifférentesméthodes

d'extraction_________________________________________________________________________________________________43Figure18:ChromatogrammesdeséparationdesEMAGdeshuilesextraitesdefenouil(a)parlaméthodede

Soxhletàl’hexane,(b)parlaméthodedeFolch,(c)auCO2supercritiqueet(d)parlaméthodedeSoxhletau2-méthyltétrahydrofurane_____________________________________________________________________46

Figure19:ChromatogrammedeséparationdesEMAGd’unehuileextraited’anisvertparlaméthodedeSoxhletàl’hexane___________________________________________________________________________________________48

Figure20:ChromatogrammedeséparationdesEMAGd’unehuileextraitedecarviparlaméthodedeSoxhletàl’hexane___________________________________________________________________________________________50

Figure21:Profilsenacidesgrasdesdifférentsextraitslipidiquesdesgrainesdefenouil,anisvertetcarvi_51Figure22:ChromatogrammedeséparationdesEMAGd’unehuileextraitedefenouilparlaméthodede

Soxhletàl’hexane.__________________________________________________________________________________________53Figure23:Chromatogrammesdeséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitsdefenouil

obtenuspar(a)Soxhletàl’hexane,(b)Folch,(c)CO2-SCet(d)SoxhletauMeTHF_____________________55Figure24:Structuredesstérolsidentifiésdansleshuilesdefenouil(d’après(Winkler-Moser,n.d.)) ________56Figure25:Compositionenstérolsdesextraitsdefenouil:(1)cholestérol,(2)cholest-7-en-3β-ol,(3)

campestérol,(4)stigmastérol,(5)Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérolet(9)Δ7-avenastérol__________________________________________________________________________________________57

Figure26:chromatogrammedeséparationdesstérolstriméthylsilylésd’unextraitauCO2-SCd’anisvert__58Figure27:Compositionenstérolsdesextraitsd’anisvert:(1)cholestérol,(2)cholest-7-en-3β-ol,(3)

campestérol,(4)stigmastérol,(5),Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérolet(9)Δ7-avenastérol__________________________________________________________________________________________59

Figure28:Chromatogrammedeséparationdesstérolstriméthylsilylésd’unextraitdecarviauCO2-SC____59Figure29:Structureducholestéroletducholest-7-en-3β-ol____________________________________________________60Figure30:Compositionenstérolsdesextraitsdecarvi:(1)cholestérol,(2)cholest-7-en-3β-ol,(3)

campestérol,(4)stigmastérol,(5),Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérolet(9)Δ7-avenastérol__________________________________________________________________________________________60

Figure31:Profilsenstérolsdesdifférentsextraitslipidiquesdesgrainesdefenouil,anisvertetcarvi______62Figure32:Chromatogrammedeséparationdescomposésphénoliquesd'unextraitd'huiledecarviobtenue

parSoxhletàl'hexane______________________________________________________________________________________63Figure33:Chromatogrammedeséparationdescomposésphénoliquesdumixdestandardsà0,05mg/mL,

détectionà280nm._________________________________________________________________________________________63

VIII

Figure34:Chromatogrammedeséparationdescomposésphénoliquesdel'extraitméthanoliqued'huiledecarviextraiteparSoxhletau2-méthyltétrahydrofuraneavec0,1mgd’acidecinnamique(SI)________64

Figure35:Activitésantiradicalairesdesdifférentesgrainespartyped'extraction(1)Soxhlethexane,(2)Folch,(3)CO2supercritiqueet(4)Soxhlet2-méthyltétrahydrofurane__________________________________65

Figure36:Activitésantiradicalairesdesextraitsobtenuspardifférentesméthodesd'extractionpartypedegraines(1)fenouil,(2)anisvertet(3)carvi______________________________________________________________66

Figure37:Procédédevalorisationdesgraines__________________________________________________________________72

2. ListedestableauxTableau1:CompositionbiochimiquedelagrainedeFoeniculumvulgareMill.________________________________ 6Tableau2:Variationdelacompositiond'huilesessentiellesdegrainesdeFoeniculumvulgareMill.en

fonctiondeleursprovenances______________________________________________________________________________ 7Tableau3:Variationdelacompositiond'huilesessentiellesdegrainesdePimpinellaanisumL.enfonctionde

leursprovenances __________________________________________________________________________________________10Tableau4:Variationdelacompositiond'huilesessentiellesdegrainesdeCarumcarviL.enfonctiondeleurs

provenances_________________________________________________________________________________________________13Tableau5:Teneurenhuile,acidesgrastotauxetacidepétroséliniquedestroisgrainesétudiées(Placek,

1963)________________________________________________________________________________________________________15Tableau6:Principalesclassesdescomposésphénoliques(Macheixetal.,2005)______________________________21Tableau7:PropriétésphysiquesduCO2àl'étatdegaz,supercritiqueetliquide,d’après(Herzi,2013)______25Tableau8:Propriétéschimiquesetphysiquesdun-hexane_____________________________________________________30Tableau9:Propriétéschimiquesetphysiquesduchloroforme _________________________________________________31Tableau10:Propriétéschimiquesetphysiquesdudioxydedecarbone________________________________________32Tableau11:Propriétéschimiquesetphysiquesdu2-méthyltétrahydrofurane________________________________35Tableau12:ProgrammedeséparationdescomposésphénoliquesparHPLC_________________________________40Tableau13:Pourcentagesrelatifsdesdifférentsacidesgrasparrapportàlateneurtotaledansleshuiles

extraitesdefenouil_________________________________________________________________________________________47Tableau14:Pourcentagesrelatifsdesdifférentsacidesgrasparrapportàlateneurtotaledansleshuiles

extraitesd’anisvert ________________________________________________________________________________________49Tableau15:Pourcentagesrelatifsdesdifférentsacidesgrasparrapportàlateneurtotaledansleshuiles

extraitesdecarvi___________________________________________________________________________________________50Tableau16:Teneurstotalesenstérolsdesdifférenteshuilesdefenouil________________________________________56Tableau17:Teneurstotalesenstérolsdesdifférenteshuilesd'anisvert_______________________________________58Tableau18:Teneurstotalesenstérolsdesdifférenteshuilesdecarvi__________________________________________60

3. ListedeséquationsÉquation1:Teneurenmatièresèche_____________________________________________________________________________29Équation2:Rendementmassiqued'extraction__________________________________________________________________31Équation3:ConcentrationrelativeenunAGparrapportàlateneurtotaleenAG ___________________________37Équation4:ConcentrationabsolueenAGdansl’huile __________________________________________________________37Équation5:Concentrationenstéroldel'huile___________________________________________________________________39Équation6:Absorbancecorrigéed'unéchantillon______________________________________________________________42Équation7:Activitéantiradicalaired'unéchantillon___________________________________________________________42

IX

4. ListedesannexesAnnexe1:PictogrammesdedangerCLPetleurssignifications(“PictogrammesCLP,”n.d.)__________________81Annexe2:Rendementsmassiquesd’extractionobtenuspourlesdifférentesgrainesparlesdifférentes

méthodesd’extraction______________________________________________________________________________________81Annexe3:Chromatogrammedeséparationd’EMAGd’unehuiledefenouilobtenueparlaméthodedeFolch

présentantdespicsidentifiéscommeétantdel’anisoleetdutrans-anéthol____________________________82Annexe4:Grosplansurdespicsséparésd’EMAGdeC18:1n-9(acidepétrosélinique)etn-12(acideoléique)

issud’unchromatogrammedeséparationd’EMAGd’unehuiled’anisvertobtenueparSoxhletàl’hexane_____________________________________________________________________________________________________82

Annexe5:ChromatogrammesdeséparationdesEMAGdeshuilesextraitesd’anisvert(a)parlaméthodedeSoxhletàl’hexane,(b)parlaméthodedeFolch,(c)auCO2supercritiqueet(d)parlaméthodedeSoxhletau2-méthyltétrahydrofurane_____________________________________________________________________83

Annexe6:ChromatogrammesdeséparationdesEMAGdeshuilesextraitesdecarvi(a)parlaméthodedeSoxhletàl’hexane,(b)parlaméthodedeFolch,(c)auCO2supercritiqueet(d)parlaméthodedeSoxhletau2-méthyltétrahydrofurane_____________________________________________________________________84

Annexe7:Moyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdefenouil_______________85Annexe8:Teneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdefenouil(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)

C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0___________________________________________________________________85Annexe9:Moyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasdeshuilesextraitesd’anisvert______________86Annexe10:Teneursenacidesgrasdeshuilesextraitesd’anisvert(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,

(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0_______________________________________________________________86Annexe11:Moyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdecarvi________________87Annexe12:Teneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdecarvi(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)

C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0___________________________________________________________________87Annexe13:Chromatogrammesdeséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitsd’anisvert

obtenuspar(a)Soxhletàl’hexane,(b)Folch,(c)CO2-SCet(d)SoxhletauMeTHF_____________________88Annexe14:Chromatogrammesdeséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitsdecarvi

obtenuspar(a)Soxhletàl’hexane,(b)Folch,(c)CO2-SCet(d)SoxhletauMeTHF_____________________89Annexe15:Moyennesetécarts-typesdesteneursenstérolsdeshuilesextraitesdefenouil___________________90Annexe16:Moyennesetécarts-typesdesteneursenstérolsdeshuilesextraitesd’anisvert__________________90Annexe17:Moyennesetécarts-typesdesteneursenstérolsdeshuilesextraitesdecarvi_____________________90Annexe18:Activitéantiradicalairedesdifférentesgrainespartyped'extraction_____________________________91Annexe19:Récapitulatifdestestsstatistiqueseffectués________________________________________________________91

X

5. ListedesabréviationsACP AcylCarrierProteinAGT AcidesgrastotauxAPP AmyloidPrecursorProteinBHA ButylhydroxyanisolBHT ButylhydroxytoluèneCLP Classification,Labelling,PackagingCO2-SC DioxydedecarbonesuperciritiqueDPPH 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyleEAG EquivalentenacidegalliqueEMAG Ester(s)méthylique(s)d’acide(s)grasGC-FID GasChromatography–FlameIonizationDetectorGC-MS GasChromatography–MassSpectrometryHPLC-DAD HighPerformanceLiquidChromatographywithDiode-ArrayDetectionIL InterleukinesLDL LowDensityLipoproteinMeTHF 2-méthyltétrahydrofuraneMWD MultiWavelengthDetectorPAM PlantesaromatiquesetmédicinalesROS ReactiveOxygenSpeciesSI StandardinterneTNF TumorNecrosisFactors

1

INTRODUCTION

1. Lesplantesaromatiquesetmédicinales(PAM)

Définitions

Uneplantearomatiqueestdéfinieparlejournal«MedicinalandAromaticPlants»commeétantune«plantequiproduitetexsudedessubstancesaromatiques».Cessubstancessontutiliséespourleursodeursparlesindustriesagroalimentaire,pharmaceutiqueouencorecosmétiqueetdeparfumerie.(“Medicinal&AromaticPlants,”March-28-2017)

Une plante médicinale est une plante contenant un certain nombre de composants actifs luiconférantdespropriétésthérapeutiques.Ellessontdèslorsutiliséesparl’hommedanslecadredelamédecineoudesonbienêtre.Lenombredeplantesutiliséesenmédecineestestiméà70000.(Daniel,2006)

Lesplantesaromatiquesetmédicinalesfontpartiedenotrequotidien.Ellessontprésentesdansnosaliments,danscertainesboissonsalcoolisées,médicaments,produitscosmétiques,parfums,colorants,etc.Enalimentation,ellessontutiliséespourleurgoût,leurcouleuretleurflaveurengénéral,maisellespossèdentégalementdenombreusespropriétés,entreautresantioxydantes,antimicrobiennes,pharmaceutiquesetnutritionnelles.(Peteretal.,2012)

Evolutiondel’utilisationdesPAM

Pendantdesmilliersd'années, leshommesn'avaientque lesplantespour se soigner.Celles-ciétaientutiliséesauxquatrecoinsdumondepoursoigner toutessortesdemaux.Nosancêtresont observé les effets, aussi bons que mauvais, provoqués par la consommation de l’une oul’autre plante et ont transmis ce savoir de génération en génération,menant à l’identificationd’ungrandnombredeplantesetdeleurspropriétéscuratives.LepremierrecueilconsacréauxplantesmédicinalesestlepapyruségyptienEbersdatéà1500ACN.AuIersièclePCN,lemédecingrecDioscoridearédigé lepremierherbierenEurope«MateriaMedica»qui recenseenviron600plantes.Cetouvrageaeuuneinfluenceconsidérablesurlamédecineoccidentale.AuMoyenAge,ledéveloppementducommerceintercontinentaletlescolonisationsdel'Amériquecentraleet du Sud ont multiplié le nombre de plantes disponibles en Europe. La médication par lesplantesétaitalorstoujourstrèsrépandue.(Iserinetal.,2001)

A partir du début du XIXe siècle, les laboratoires de chimie ont commencé à produire desmédicaments en isolant desmolécules de plantes. La phytothérapie et la médecine ont alorsévolué suivant des voies différentes. Toutefois, la phytothérapie restait la médecine la plusrépandue dans le monde, même en Occident. Dans les années 1930, les médecins et lespharmaciensprescrivaientouvendaientenviron90%deproduitsàbasedeplantes.(Iserinetal.,2001)

2

Ce n'est que dans les années 50 que lesmédicaments conçus en laboratoire, synthétiques ouextraits de plantes, se sont imposés. Au plus les médicaments chimiques se développent etpermettent des guérisons rapides, au plus l'opinion publique est convaincue que laphytothérapieest illusoireetdépassée.Néanmoins, lamédecineconventionnelleconnaîtaussideséchecs,commel’illustreletragiqueexempleduSoftenon.Leseffetssecondairesinduitsparlesmédicamentsinquiètentlesutilisateurs,quisetournentversdessoinsmoinsagressifspourl'organisme. De plus, bien que la médecine moderne ait apporté des solutions aux maladiesinfectieusesgraves, lesbactériesetvirusontpeuàpeudéveloppéunecertainerésistanceauxmédicaments.Au fildesannées, l'opinionpubliqueévolueet les traitementsàbasedeplantesreviennent au premier plan. En effet, les soins à base de plantes ont prouvé une efficacitécomparableauxmédicamentsclassiquesetdeseffetssecondairesmoindres.(Iserinetal.,2001)

Actuellement, l’intérêt commercial à développer de nouveaux produits pharmaceutiquesd’originenaturellenecessedecroître.(Peteretal.,2012)Eneffet,leconsommateurmontredeplusenplusd’intérêtenverslesproduitsnaturels.Laproductiondeformulationsvégétalespourlasanté,autantnutritionnellesquecosmétiques,augmente,entrainantunedemandeindustrielledeplantesaromatiquesetmédicinalesplusimportante.(Iserinetal.,2001)

De nos jours encore, quatre-vingt pourcents de la population mondiale dépend de plantesmédicinalespour lessoinsprimaires,principalementdans lespaysenvoiededéveloppement.(Peteretal.,2012)Plusdecinqmilleplantesàfleurssontutiliséesàdesfinsmédicinalesdanslemonde. (Kooti et al., 2015) Soixante pourcents des agents anti-tumeur et anti-infectieux sontd’origine végétale. (Peter et al., 2012) Toutefois, tout comme les médicaments, les plantesmédicinalesdoiventêtreemployéesavecprécaution.(Iserinetal.,2001)

CompositionphytochimiquedesPAM

Les propriétés bénéfiques des plantes sont dues aux composés phytochimiques qu’ellescontiennent. (Kurian, 2012) En effet, la plupart des espèces végétales possèdent des vertusthérapeutiques grâce aux principes actifs qu’elles renferment et qui agissent directement surl'organisme.(Iserinetal.,2001)

Enplusdesmétabolitesprimaires (glucides, protides, lipides, acidesnucléiques), les végétauxproduisentégalementdesmétabolitesdit«secondaires»dont les fonctionsphysiologiquesnesont pas toujours exactement connues, mais qui représentent pour l’homme une sourceimportantedemoléculesutilisablesdansdesdomainesaussidifférentsquelapharmacologieoul’agroalimentaire. Les métabolites secondaires appartiennent à des groupes chimiques variés(alcaloïdes,terpènes,composésphénoliques,…).(Macheixetal.,2005)Lerègnevégétalregorgedesourcespotentiellesdeparfums,deflaveurs,demédicamentspourlamédecinetraditionnellemais aussi conventionnelle, d’additifs alimentaires, d’intermédiaires pharmaceutiques, etc.(Handa et al., 2008) Les grandes firmes pharmaceutiques le savent et investissent d’ailleursd'importants capitaux pour trouver de nouvelles substances chimiques afin de lescommercialiser.(Iserinetal.,2001)Labioprospectionderessourcesnaturellesconnaîtunessor,larecherchedenouvellesmoléculescommeagentthérapeutiqueestvaste.(Peteretal.,2012)

Destravauxantérieursmenéssur lesextraitsdePAMontmontré l’importancedelanotiondesynergie.Lorsde l’utilisationd’uneplanteentière,différentessubstancesagissentensembleetsont donc plus efficaces qu’une dose équivalente d’un ou de plusieurs principes actifs. Uneplanteestdoncunensemblecomplexepourvudeprincipesactifsquiontuneinfluencesurlesdifférentssystèmesderégulationducorps.(Iserinetal.,2001)

3

Huilesessentielles

L’Organisation Internationale de Normalisation définit une huile essentielle comme étant un«produit obtenu à partir d’une matière première naturelle d’origine végétale, soit parentraînementàlavapeurd’eau,soitpardesprocédésmécaniquesàpartirdel’épicarpedefruitsdecitrus(agrumes),soitpardistillationsèche,aprèsséparationde l'éventuellephaseaqueusepardesprocédésphysiques».(“ISO9235:2013,”2013)

Bien que le travail porte sur les huiles fixes et non les huiles essentielles, ces dernières sontbrièvement abordées ici car elles comptent parmi les plus importants principes actifs desplantesaromatiquesetmédicinalesetpossèdentdenombreusespropriétés.(Iserinetal.,2001)

Leshuilesessentiellessontunmélangecomplexedemétabolitessecondairescontenant20à60composésvolatilsàdifférentesconcentrations.Cescomposéssontprincipalementissusdedeuxgrands groupes : les terpènes et terpénoïdes, et les composés aromatiques et aliphatiquesdérivésduphénylpropane.Elles sont liquidesetvolatiles, limpideset rarementcolorées.Ellessont caractérisées par une odeur particulière et sont solubles dans les phases lipidiques etsolvantsorganiques.Chaquehuileessentielleestcaractériséeparunchémotypequidésignelaoulesmoléculesla(les)plusabondante(s).Ce(s)composé(s)majeur(s)définit(ssent)d’ailleursengénérallespropriétésbiologiquesdel’huileessentielle.(Bakkalietal.,2008)

Les huiles essentielles sont reconnues commepossédant de nombreuses propriétés dont lesprincipales sont aromatiques, antiseptiques,antimicrobiennes, analgésiques, anti-inflammatoires,etc.(Bakkalietal.,2008)

L’huile essentielle est secrétée et stockée dans destissus sécréteurs spécialisés. Dans le cas des graines,l’huile essentielle produite est libérée à l’intérieurdelaplante,dansdesespacesintercellulairesspécialisés.(Svobodaetal.,2003a)(Figure1)

Figure1:Structuressécrétricesdegrainesdecarvi(x48)(Svobodaetal.,2003b)

Lacompositiondeshuilesessentiellesvarieentermesdeproportionsdesdifférentscomposésselondenombreuxfacteursintrinsèquesetextrinsèques.Elledépendducultivar,delapartiedela plante, du climat, du stade de maturation au moment de la récolte (Malhotra, 2012a), del’originedelaplante(Ratheretal.,2016),delacompositiondusol.(Bakkalietal.,2008)

Composésphénoliques1

Lescomposésphénoliquessontégalementdesmétabolitessecondaires.Ilssontproduitsparlesplantesdanslebutdeseprotégercontrelesprédateurs.Ilsreprésententunegrandevariétédemolécules dont le point commun est la présence d’au moins un cycle aromatique et un ouplusieursgroupementshydroxyles.Lespropriétésassociéesauxpolyphénolssontantioxydante,anticanceretanti-inflammatoire.(Quideauetal.,2011)

1Unepartiedelabibliographieestentièrementconsacréeauxcomposésphénoliques(cfrp.21-22).

4

Autrescomposésintéressants

Bien que de nombreux bienfaits soient reconnus aux huiles essentielles et aux composésphénoliques, lesplantescontiennentdenombreuxautrescomposésdignesd’attentioncommeles saponines, stérols, glucosides, anthraquinones, polysaccharides, substances ambres,alcaloïdes,vitaminesetminéraux,acidesetrésines.(Iserinetal.,2001;Peteretal.,2012)

PropriétésdesPAM

Commedéjàintroduit,despropriétésantioxydantes2sontattribuéesauxplantesaromatiquesetmédicinale. Les antioxydants les plus puissants retrouvés dans les plantes sont les composésphénoliques. (Pokorný et al., 2012) Une corrélation positive a été établie entre la teneur encomposésphénoliqueset la capacitéantioxydanted’uneplante. (Peteretal.,2012)Laplupartsontdes composés légèrementpolaires et sontprésentsdans laplante sous formededérivésplus polaires, plus hydrophiles, les O-glycosides. (Pokorný et al., 2012) De par ce pouvoirantioxydant,lescomposésphénoliquessontassociésàlapréventiondesmaladiessoupçonnéesd’êtreprovoquéesparunstressoxydatif,commelesmaladiescardiovasculaires,inflammatoires,lescancersousimplementlevieillissement.(Malhotra,2012a;Badgujaretal.,2014;Ratheretal.,2016)Lesantioxydantslipophilessontlestocophérols,retrouvésdanslesgrainesoléagineuses.(Pokorný et al., 2012) Leur capacité anti-oxydante confèrent aux plantes une action neuro-protectriceetenfontunenouvellealternativedetraitementdesmaladiestouchant lesystèmenerveuxcentral(del’épilepsieàlamaladied’Alzheimer).(Kurian,2012)

Les composés responsables de propriétés antimicrobiennes sont les phénols simples, acidesphénoliques,coumarines,terpénoïdesetalcaloïdes.(Kurian,2012)

Lesplantesaromatiquesetmédicinalespeuventprésenterdenombreuxeffetsbénéfiquespourlasantéhumaine.Ellespeuvent jouerunrôlepréventif contre lecanceren inhibantdeseffetsmutagéniquesetépigénétiquesgrâceà leurspropriétésantioxydantes,antimicrobiennes,anti-inflammatoires, anti-tumeurs, d’altération de l’activité d’enzymes de biotransformation, etc.Certainesespècesdeplantespermettentderéduirelesrisquesdemaladiescardiovasculairesendiminuant le niveau de cholestérol LDL (lipoprotéines de basse densité). Les plantesaromatiquesetmédicinalesontégalementuneffetpositifdanslaluttecontrelediabètecarellespossèdentdeseffetshypoglycémiques,ellesaméliorentlasensibilitédel’insulineetlesdéfensesantioxydantes.Leurspropriétésanti-inflammatoirespeuventaussiêtrebénéfiquedans la lutteetpréventiondenombreusesmaladiestellesquelapolyarthriterhumatoïdeetl’arthrose.Ellespossèdent des propriétés intéressantes pour prévenir ou combattre l’obésité en diminuantl’appétit, l’absorption des graisses et leur déposition et en augmentant leur combustionmétabolique.Eneffet,denombreuxcomposésphytochimiquespeuventinfluencerlessécrétionsgastro-intestinales(salivaires,gastriques,biliairesetpancréatiques)etenzymesdedigestion.Denombreuxcomposés telsque leglycosides, flavonoïdes, triterpènesetphénoliques,présententuneactivitéhépatoprotectrice.Enfin,dans la luttecontre lesmaladies infectieuses, l’utilisationdeplantescommenouveauxagentsantiparasitairesesttrèsintéressanteauvudesrésistancesquelesparasitesontdéveloppéesauxthérapiesactuelles.(Kurian,2012)

2Lesconceptsd’oxydationetactivitéantioxydantesontreprisultérieurement(cfrp.27-28).

5

Fenouil(FoeniculumvulgareMill.)

Classificationtaxonomique

LefenouilestuneplantearomatiquedelafamilledesApiacées.D’après(Dupontetal.,2012),saclassificationbotaniqueestlasuivante:

• Embranchement:Spermaphytes• Sous-embranchement:Angiospermes• Classe:Dicotylédones• Sous-classe:Rosidae• Ordre:Apiales• Famille:Apiaceae• Genre:Foeniculum• Espèce:vulgareMill.

Origineetrépartitiongéographique

Le fenouil est une plante herbacée d’utilisationmédicinale et aromatique (Kooti et al., 2015)originaire de la Méditerranée. (Badgujar et al., 2014) Aujourd'hui, il est cultivé dans denombreusesrégionsd’Europe,delaMéditerranéeetd’Asie.(Kootietal.,2015)

Descriptionbotanique

Le fenouilestuneplanteherbacéemesurantde1à2mdehauteur.(Kootietal.,2015)Sesfeuillespeuventatteindre40cmde longetsontramifiéesentrès finssegments de 0,5 mm d’épaisseur. Les fleurs sontpetites, de couleur jaune et disposées en ombelles(Badgujar et al., 2014). (Figure 2) Les fruits sontformés de deux akènes (Rather et al., 2016) allongésmesurantde3à5mmdelonget1,5à2mmdelargeet présentent des nervures. Le stylopodium resteaccrochéaufruit.(Badgujaretal.,2014)Troisvariétésde fenouil différentes ont été décrites: annuelle,bisannuelle, périnéale. La pollinisation du fenouil estcroisée.(Malhotra,2012a)

Figure2:Planchebotaniquede

FoeniculumvulgareMill.(Thomé,1885)

6

Compositionbiochimiquedelagraine

La graine de fenouil est constituée de moins d’un dixième d’eau. Elle est riche en glucides(mucilages,sucresetamidon),maiségalementenlipidesetprotéines.(Tableau1)Ellerenfermeaussibeaucoupdefibresetminéraux,principalementduK,Na,PetCa.(Badgujaretal.,2014)C’estégalementunesourcedevitaminesA,niacine, thiamine, riboflavine(Malhotra,2012a)etvitamineC(Ratheretal.,2016).

Tableau1:CompositionbiochimiquedelagrainedeFoeniculumvulgareMill.

Teneur(g/100gMS) Hongrie

(Malhotra,2012a)Inde

(Ratheretal.,2016)Eau 8,8 6,3Glucides 36,6 42,3Lipides 14,9 10Protéines 15,8 9,5Fibres 1,7 18,5Minéraux 8,2 13,4Huileessentielle 0,6–6

Lipides

Lesgrainesdefenouilcontiennent10à24%d’huile(Kleimanetal.,1982;Malhotra,2012a)quiest composée d’acides gras saturés et insaturés. Cette huile est composée majoritairementd’acidepétrosélinique3(18:1n-12,un isomèrede l’acideoléique),quicomptepour60%de lacompositiontotaleenacidesgras.L’acideoléique(18:1n-9)représente22%,l’acidelinoléique(18:2n-6)14%etl’acidepalmitique(16:0)4%.(Kootietal.,2015,Malhotra,2012a)(Kleimanetal.,1982)attribuentmêmeàl’acidepétroséliniqueuneproportionde72,9%,11,0%àl’acidelinoléique,8,7%àl’acideoléique,5%àl’acidepalmitiqueet1,2%àl’acidestéarique.

Huileessentielle

L’huile essentielle de la graine de fenouil contient plus de 30 composés volatils (Kooti et al.,2015)dontlesprincipauxconstituantssontletrans-anéthol,lefenchone,l’estragol(aussiappeléméthylchavicol)et leδ-limonène.(Malhotra,2012a;Badgujaretal.,2014;Ratheretal.,2016)(Figure3)L’α-pinèneetle1,8-cineolesontdesexemplesdecomposésmineursretrouvésdansl’huileessentielledegrainedefenouil.(Ratheretal.,2016)

3L’acidepétroséliniqueestunacidegrasimportantdanslafamillebotaniquedesApiacées.Unepartiedelabibliographieyestconsacrée(cfr.p.15-18).

7

trans-anéthol estragol δ-limonène fenchone

Figure3:Composésmajeursdel'huileessentielledegrainesdeFoeniculumvulgareMill.

Comme expliqué précédemment, la composition de l’huile essentielle d’une plante dépend denombreuxfacteurs.Letableausuivant(Tableau2)présentelesprincipauxconstituantsd’huilesessentiellesdegrainesdefenouilissuesdedifférentesoriginesgéographiques.

Tableau 2 : Variation de la composition d'huiles essentielles de graines deFoeniculumvulgare Mill. enfonctiondeleursprovenances

Portugal(Malhotra,2012a)

Inde(Malhotra,2012a)

Bangladesh(Malhotra,2012a)

Egypt(Malhotra,2012a)

Chine(Badgujaretal.,2014)

Chine(Badgujaretal.,2014)

trans-anéthol 60 68 58,5 86,11 72,2 68,53estragol - - - 0,05 7,6 10,42δ-limonène 11 19,6 0,07 3,9 6,24fenchone 20 3,7 - 4,13 3,1 5,45

Composésphénoliques

Lateneurencomposésphénoliquestotauxaétédéterminéeà21,712±3,60mgd’équivalentenacide gallique par grammede graines de fenouil par (Pandey et al., 2012) et à 1,651 ± 0,114mg/gpar(Sourietal.,2008).Lesprincipauxcomposésphénoliquesprésentsdanslagrainedefenouil sont la quercétine, l’acide rosmarinique, l’apigénine, ainsi que l’acide chlorogénique,l’acideférulique-7-o-glucosideetl’acidep-coumariqueenplusfaiblesquantités.(Badgujaretal.,2014)

Propriétésetutilisations

Laplanteentièreestvalorisable.Lelargebulbeestconsommécommelégume.Lefenouilestunesourcedefibres,quipeutaideràréduireletauxdecholestérol.Lesfeuillessontaussiutiliséesencuisine,ellesprésententunebonneactivitéantioxydante.Lesgraines,quiontungoûtd’anis,sontutiliséescommeépiceetpourenextrairel’huileessentielle.Lesfleursetfeuillessontaussiutiliséespourleurcolorationjaune-brune.(Malhotra,2012a)

Le fenouil présente de nombreux bienfaits et est utilisé pour soigner différentes pathologies,principalementgastro-intestinales,lediabète,lestroublesrespiratoires.Ilestantioxydant,anti-inflammatoire, antiseptique. Il présente également une activité hépatoprotectrice, œstrogène,diurétique,antispasmodique,analgésiqueetbiend’autresencore.Auniveaudigestif, le fenouilagitcommestimulant,carminatif,anti-flatulent,stomachique,antiémétique,anti-colitiqueetestdoncutilisécontrelesdouleursgastriques,lesconstipationsetdiarrhéesetcontrelescoliques.Ilprésenteuneactivitéantiseptiqueautantcontrelesbactériesqueleschampignons,lesversouencore les virus. Il peut être utilisé par les patients diabétiques car il est hypoglycémiant et

8

hypolipémiant.Lefenouilestégalementexpectorantetestdoncutilisédanslecadredetroublesrespiratoires. Son activité œstrogène favorise la sécrétion lactée des mammifères et estemménagogue.Deparsonactionanti-inflammatoire, ilestutilisépourcombattre l’arthrite.Lefenouil permet aussi dans une certaine mesure de prévenir le cancer, grâce à ses activitéscytoprotectrices et anti-mutagènes. Il joue également un rôle contre l’hirsutisme, qui est ledéveloppementd’unepilosité selonun typemasculinchez la femme. (Kurian,2012;Malhotra,2012a;Badgujaretal.,2014;Kootietal.,2015;Ratheretal.,2016)

Toxicité

L’estragolestsuggérécommeétantcancérigène,l’anétholmutagèneetlaquercétineclastogène,c’est-à-direcapabledecauserlarupturedechromosomes.Decefait,ilestdéconseilléd’utiliserl’huileessentielleàdesdosestropélevées.Deplus, ilestpréférabled’éviterlefenouildanslesremèdes médicaux pour les femmes enceintes, à cause de ses effets estrogènes. (Malhotra,2012a)

Anisvert(PimpinellaanisumL.)


L’anisvertestuneplantearomatiquedelafamilledesApiacées.(Dupontetal.,2012)leclassentcommesuit:

• Embranchement:Spermatophytes• Sous-embranchement:Angiospermes• Classe:Dicotylédones• Sous-classe:Rosidae• Ordre:Apiales• Famille:Apiaceae• Genre:PimpinellaL.• Espèce:anisum


L’anisvertestoriginaireduMoyen-Orient.Ilestactuellementcultivédanslarégiondel’estdelaMéditerranée,dansl’ouestdel’Asie,dansleMoyenOrientetenAmériquecentrale.(Shojaiietal.,2012)

9


L’anisvert(Figure4)estuneplanteherbacée(Singhetal.,2008; Shojaii et al., 2012) de 30 à 50 cm de hauteur, àracine fuselée et à tiges cylindriques, finement striées etramifiées au sommet. (Filliat, 2012). Laplante entière estrecouverte de poils fins. (Özgüven, 2012) Les feuilles decouleurvertpâlesontalternes.L’inflorescenceest forméed’ombelles composées, comprenant de 7 à 15 rayons etdépourvues de bractées. (Filliat, 2012) Les fleurs sontpetites et blanches. (Özgüven, 2012) Le fruit est unschizocarpediakènevelude3à5mmdelong.(Ghouatietal.,2012)Ilestdeformeovoïdeaplatisurlecôté(Özgüven,2012) et de couleur jaune-brun à vert-brun (Rocha et al.,2016) à stries claires. (Ghouati et al., 2012) PiminellaanisumL.estuneplanteannuelledepollinisationcroisée.(Özgüven,2012)

Figure 4 : Planche botanique dePimpinellaanisumL.(Thomé,1885)


Lagrained’anisvertrenfermeuneteneurenglucidesdel’ordrede50%,18%deprotéineset8à16%delipides.(Özgüven,2012)Lerendementenhuileessentiellepeutvarierde1,5à6%(Shojaiietal.,2012).

Lipides

Les graines d’anis vert contiennent 8 à 16 % (23,9 % selon (Kleiman et al., 1982)) d’huilecontenant des acides gras saturés et insaturés. Le pourcentage des acides gras insaturés estnettementsupérieuràceluidesacidesgrassaturés.L’acidepétroséliniqueestl’acidegrasleplusimportant avec une contribution allant de 50 à 70%de la composition totale en acides gras.D’autresacidesgrassontégalementprésents telsque l’acideoléiqueavecunecontributionde22à28%,l’acidelinoléiquede5à21%etl’acidepalmitiquede5à10%.(Kleimanetal.,1982;Özgüven,2012)

Outre des acides gras, la graine de carvi renferme également des triterpénoïdes et stérols,principalementdelaβ-amyrineetdustigmastérolrespectivement.(Özgüven,2012)

10

Huileessentielle

DenombreuxtravauxsurPimpinellaanisumL.ontrévéléqueleconstituantmajoritairedesonhuile essentielle est le trans-anéthol et que le γ-himachalène et l’estragol y sont égalementprésentsmaisdansdesproportionsmoindres.(Singhetal.,2008;Ghouatietal.,2012;Shojaiietal., 2012) (Figure 5) Le p-anisaldéhyde, l’eugénol, le β-caryophyllène sont des exemple decomposés mineurs contenus dans l’huile essentielle de la graine d’anis vert. (Ghouati et al.,2012)

trans-anéthol estragol γ-himachalène

Figure5:Composésmajeursdel'huileessentielledegrainesdePimpinellaanisumL.

Les résultats repris dans le tableau ci-dessous (Tableau 3) illustrent la variation de lacompositiondecettehuileessentielleenfonctiondelaprovenancedelaplante.

Tableau3:Variationdelacompositiond'huilesessentiellesdegrainesdePimpinellaanisumL.enfonctiondeleursprovenances

Maroc(Ghouatietal.,2012)

Inde(Singhetal.,2008)

Turquie(Shojaiietal.,2012)

trans-anéthol 81,19 90,1 93,9

γ-himachalène 6,22 - V

(Z)-anéthol 0,59 - -

Estragole 0,46 2,3 2,4

p-anisaldehyde - - V


(Souri et al., 2008) attribuent aux graines d’anis vert une teneur en composés phénoliquestotauxde3,539±0,016mgéquivalentacidegallique/g.Auniveaudelacomposition, lagrained’anis vert contient différents flavonoïdes glycosylés tels que la quercétine-3-glucuronide, lerutoside,lalutéoline-7-glucoside,l’isoorientine,l’isovitexine,l’apigénine-7-glucoside.(Özgüven,2012;Shojaiietal.,2012)


L’anis vert est très utilisé en cuisine, cosmétique, médecine. La partie de la plante la plusvaloriséeestlefruit,bienquelaplanteentièresoitparfumée.(Özgüven,2012)

11

L’anis vert est antioxydant, antiseptique, agit sur le systèmedigestif et présentebiend’autrespropriétés.L’anisvertpossède,outreunpouvoirantioxydant,uneactioncontrelesbactéries,lesinsectes, les champignons, les virus. Il agit également sur le système digestif en tant questimulant, carminatif, antiémétique,anti-colitiqueet stomachique.Deplus, l’anisvertprésentedes actions antispasmodique, expectorante, diurétique. Il montre également une actionœstrogèneauniveaude lasécrétionde lait,de ladysménorrhée,desboufféesdechaleurde laménopause.Lefenouilprésenteaussidesactionsanalgésique,anti-inflammatoire,antipyrétique.Ilintervientdanslarégénérationhépatiqueetauneffetsurlediabèteenréduisantleniveaudelipideset sucresdans le sang. (Singhetal.,2008;Ghouatietal.,2012;Kurian,2012;Özgüven,2012;Shojaiietal.,2012;Rochaetal.,2016)

Toxicité

L’huileessentielledesgrainesd’anisestconsidéréecommeétantGRAS(généralementreconnucommesain).(Özgüven,2012;Rochaetal.,2016)Toutefois,l’anéthols’estrévéléêtremutagèneautestAmes(Özgüven,2012)etl’estragolestsuggéréétantcancérigène.(Malhotra,2012a)

Carvi(CarumcarviL.)


Le carvi est une plante aromatique issue de la famille des Apiacées. Sa classification selon(Dupontetal.,2012)estlasuivante:

• Embranchement:Spermaphytes• Sous-embranchement:Angiospermes• Classe:Dicotylédones• Sous-classe:Rosidae• Ordre:Apiales• Famille:Apiaceae• Genre:CarumL.• Espèce:carvi


Le carvi est originaire d'Europe, d’Asie occidentale et d’Afrique du Nord. Il est aujourd’huicultivédansplusieursrégionsd'Europe,d’Afriqueetd’Asie.(Rasoolietal.,2016)

Au moins 192 espèces de carvi sont connues. Parmi celles-ci, Carum carvi L. est la plusimportanted’unpointdevueéconomique.(Malhotra,2012b)

12


Le carvi (Figure 6) est une plante herbacée annuelle oubisannuelle. Elle est glabre et mesure 30 à 100 cm dehauteur. (Khan et al., 2016a) Sa racine est pivotante, enfuseau,charnueetodorantealorsquesatigeestsillonnée,anguleuse et ramifiée dès la base. (Avry et al., 2003) Sesfeuilles sont finement découpées et les fleurs, petites etblanches, roses (Rasooli et al., 2016) ou encore rouges(Khanetal.,2016a)sontdisposéesenombelles.Lefruitestun schizocarpe qui se sépare en deux akènes. (Rasooli etal.,2016)Lesakènesontuneformedecroissantd’environ2à5mmdelong.(Khanetal.,2016a;Rasoolietal.,2016)Ils sont dorsalement compressés, linéaires oblongs etcourbés (Khan et al., 2016a) et présentent cinq stries.(Rasooli et al., 2016) Le carvi est une plante depollinisation croisée et de nombre de chromosomessomatiques2n=20.(Malhotra,2012b)

Figure 6 : Planche botanique deCarumcarviL.(Thomé,1885)


La graine de carvi renferme une teneur en eau de 9,87%. Elle contient 49,90%de glucides,19,77 % de protéines et 14,59 % de lipides (19,4 % selon (Kleiman et al., 1982)) et estégalement riche en fibres, enminéraux et en acide ascorbique. La teneur en huile essentiellepeutvarierde1à9%.(Khanetal.,2016a)

Lipides

Lagrainedecarvirenfermeentre15à19%d’huilefixe(Kleimanetal.,1982;Khanetal.,2016a).Lacompositionenacidesgraslibresdelagrainedecarviestcaractériséeparladominancedel’acidepétroséliniquecomptantpour30à43%delacompositiontotaleenacidesgras,etl’acidelinoléique,comptantpour34à37%.Lesacidesoléique,palmitiqueetstéariquesontégalementprésentsavecdesteneursallantde15à25%,4à5%etenviron1%respectivement.(Kleimanetal.,1982;Khanetal.,2016a)

Leβ-sitostérol et le stigmastérol sont les stérolsmajoritaires (35-40%).D’autres stérols sontprésentsenquantitésmineurestelsquelecholestérol,lebrassicastérol,lecampestéroletleΔ7-campestérol,leΔ7-stigmastérol,leΔ5-etleΔ7-avénastérols.(Zlatanovetal.,1995)

13

Huileessentielle

Lecomposantmajoritairedel’huileessentielledesgrainesdecarviestleδ-carvone(45–95%),suiviparleδ-limonène(1,5–51%).(Figure7)(Malhotra,2012b;Agraharietal.,2014;Khanetal.,2016b;Rasoolietal.,2016)D'autrescomposésmineurssontprésentscommel’α-pinène, lelinalool,leγ-terpinène,leρ-cymène,lecarvacrol,carvenone,etc.(Agraharietal.,2014)

δ-carvone δ-limonène

Figure7:Composésmajeursdel'huileessentielledegrainesdeCarumcarviL.

Les valeurs reprises dans le tableau 4 montrent la variation de la composition d’huilesessentiellesdegrainesdecarvienfonctiondelaprovenancedelaplante.

Tableau4 :Variationde lacompositiond'huilesessentiellesdegrainesdeCarumcarviL.enfonctiondeleursprovenances

Norvège(Malhotra,2012b)

Tunisie(Malhotra,2012b)

Iran(Malhotra,2012b)

Inde(Malhotra,2012b)

δ-carvone 57–77 76,78–80,53 44,5–95,9 50–65δ-limonène 26–41 13,05–20,29 1,5–51,3 45


(Pandeyetal.,2012)rapportentune teneur totaleencomposésphénoliquesde35,445±1,84mgd’équivalentenacidegalliquepargrammedegrainesdecarvi.Lesflavonoïdesprésentsdanslesgrainesdecarvisontlaquercétineetlekaempférolquisontsurtoutprésentssouslaformede 3-O-glycosides. (Malhotra, 2012b; Khan et al., 2016b) Les coumarines identifiées sontl’ombelliférone, la coumarine et le scopolétol. (Malhotra, 2012b) Les graines contiennentégalement des acides phénoliques tel que l’acide caféique (Khan et al., 2016a) et des tanins.(Malhotra,2012b)


Lecarviesttraditionnellementutilisécommecondimentouépicegrâceàsaflaveur.(Rasoolietal., 2016) De nombreuses propriétés lui sont attribuées, tel qu’un pouvoir antioxydant,antiseptique, des effets sur le système digestif, sur le foie, le diabète, etc. Le carvimontre unpouvoirantioxydant important. Ilpeutégalementêtreutilisédans la luttecontre lesbactéries,champignons, insectes, virus, vers, mollusques. Il présente de nombreuses propriétésintervenant au niveau digestif: carminatif, anti-flatulent, stomachique. Il est donc utilisé pourtraiter les indigestions, coliques, etc. Une activité antispasmodique lui est reconnue. Il esthypoglycémiantethypolipémiantetpeutdoncjouerunrôledanslaluttecontrelediabète.Ilestégalement anti-inflammatoire, chimiopréventif et antiprolifératif. Il présente une activitédiurétique, hépatoprotectrice, diurétique, analgésique,mais également anti-stress, anti-ulcère,sédative et anesthésique. (Kurian, 2012; Malhotra, 2012b; Agrahari et al., 2014; Khan et al.,2016a;Rasoolietal.,2016)

14

Toxicité

Lecarvietlesproduitsquiendériventnesemblentpasprésenterdetoxicitépourl’êtrehumain.Toutefois,àdose trèsélevée, ilpeutcauser l’avortementouêtreneurotoxique.Desdoses tropélevéessurde longuespériodespeuventégalementengendrerdesdégâtsauxreinsetau foie.(Malhotra,2012b)

2. Matièregrassevégétale

Beaucoupderecherchesontétémenéessurlacompositionetlesactivitésbiologiquesdeshuilesessentielles et des fractions phénoliques. Cependant, peu d’études ont abordé les activitésbiologiquesdelafractionlipidiquedesplantesaromatiquesetmédicinales.

Leslipidesconsistentenunlargegroupedecomposéschimiquementhétérogènes(Leger,2010)mais qui présentent tous la propriété d’être insoluble dans l’eau et soluble dans des solvantsorganiquesnonpolaires(Johnsonetal.,2009;Leger,2010).Ilsontunedensitéinférieureàcelledel’eau.(Johnsonetal.,2009)

Leshuilesvégétalesbrutescontiennentprincipalementdestriglycérides,maisaussidesacidesgras libres,mono-etdiglycérides.Ellescontiennentégalementdesphospholipides,desstérols(Gunstone,2005;Gornay,2006;Johnsonetal.,2009),desalcoolsgras(Gornay,2006;Johnsonetal.,2009)ettriterpéniques(Gunstone,2005;Gornay,2006),destocophérols(Gornay,2006)ettocotriénols (Gunstone, 2005), des hydrocabures, carotènes, chlorophylles (Gunstone, 2005;Gornay,2006),desvitamines liposolubles(Johnsonetal.,2009)etd’autressubstancesencore.(Gunstone,2005;Johnsonetal.,2009)Lesconstituantsprincipauxsontabordésci-dessous.

Glycéridesetacidesgras

Généralités

Lesglycéridessontcomposésdemoléculesd’acidesgrasestérifiéessurunemoléculedeglycérol.Les triglycéridessontdesglycérolsauxquels sont fixées trois chainesd’acidesgras. (Figure8)Lorsquedeuxacidesgras seulement sontgreffés,undiglycérideest formé,etdans le casd’unseul acide gras fixé, unmonoglycéride. (Leger, 2010) Dans la plante, les triglycérides serventprincipalementdecomposésdestockage.(Buchananetal.,2015)

Figure8:Structured'untriglycéride,d’après(Peter,2008)

15

Lesacidesgrassontlesconstituantsélémentairesdeslipides.Ilspeuventêtreprésentestérifiésà un squelette glycérol ou libres. (Peter, 2008) Ils sont composés uniquement d’atomes decarbone,d’hydrogèneetd’oxygène.(Leger,2010)Cesontdesacidesorganiquesfaiblesformésd’unechainehydrocarbonéeseterminantd’uncôtéparungroupementméthyletdel’autreparun groupement carboxyle. Ils diffèrent les uns des autres par le nombre de carbone dont secompose cette chaine (Peter, 2008), généralement entre 4 et 30(Gornay, 2006), le nombred’insaturations(doublesliaisons)etlespositionsdecesdernières.(Peter,2008)

Acidepétrosélinique

Généralités

Le composémajeurde l’huile des grainesd’Apiacées est l’acidepétrosélinique, C18:1n-12ouC18:1∆6.Cetacidegrasnonusuelestun isomèrede l’acideoléique(C18:1n-9ouC18:1∆9)duquel il diffèrepar lapositionde ladouble liaison. (Figure9) Il représente lamajoritéde lacompositiontotaleenacidesgrasdesgrainesdecettefamille.(Kleimanetal.,1982)(Tableau5)

acidepétrosélinique

acideoléique

Figure9:Structuresdel'acidepétroséliniqueetoléique

Tableau5:Teneurenhuile,acidesgrastotauxetacidepétroséliniquedestroisgrainesétudiées(Placek,1963)

Teneurenhuiledesgraines(%)

Teneurenacidesgrastotauxdel’huile(%)

Teneurenacidepétrosélinique

(%acidesgrastotaux)

FoeniculumvulgareMill. 16,5 54,5 86

CarumcarviL. 9,0 26

PimpinellaaniseL. 23,5 88,0 17,5

Voiemétabolique

La raison pour laquelle cet acide gras n’est pas courant et est caractéristique de quelquesfamilles botaniques uniquement réside dans la façon dont ce dernier est produit dans cesplantes.(Cahoonetal.,1992;Ohlrogge,1994)ontmenédenombreuxtravauxvisantàéluciderla voie métabolique de l’acide pétrosélinique dans les graines de coriandre, une planteappartenantàlafamilledesApiacées.

Comme pour la synthèse de tout acide gras, les premières étapes sont la transformation demolécules d’acétyl coenzyme A en malonyl coenzyme A pour ensuite former du butyryl-ACP(C4:0-ACP), et les élongationsde la chaine carbonéeparplusieurs interventionsd’enzymes3-

16

cétoacyl-ACP-synthases.Cesréactionsprennentplacedanslesplastes.Ensuite,leursrecherchesont montré que l’acide pétrosélinique n’est pas formé par désaturation de l’acide stéarique(C18:0), comme ilpourraitêtre intuitifde lepenser.L’introductionde ladouble liaisonse faitsurlepalmitoyl-ACP,autrementditlachainecarbonéed’acidepalmitiquelorsqu’elleestencoreestérifiée à une protéine porteuse d’acyle (acyl carrier protien) dans le plaste. Trois enzymessont ensuite impliquées dans la synthèse de l’acide pétrosélinique à partir de palmitoyl-ACP.Premièrement, la palmitoyl-ACP Δ4 désaturase, une acyl-ACP désaturase spécifique, introduitune double liaison en position Δ4. Ensuite, une 3-cétoacyl-ACP synthase spécifique permetl’élongation du Δ4-hexadecenoyl-ACP en pétroselinoyl-ACP. Ce dernier sera enfin clivé par lapétroselinoyl-ACPthioestérase,uneacyl-ACPthioestérasespécifique, libérantl’acidegrasdelaprotéine ACP afin qu’il puisse sortir du plaste et être incorporé dans des triglycérides.L’explicationdelaprésenced’acidepétroséliniquedanscertainesplantessejustifiedoncparlaprésencedecestroisenzymes.

Propriétésetintérêts

Propriétéstechnofonctionnelles

Laseuledifférencedepositiondeladoubleliaisonentrel’acidepétroséliniqueetl’acideoléiqueengendreunestructuredifférentede l’acidegras,conduisantàuneaugmentationdesonpointde fusion.Alorsque l’acideoléique fondàune températurede12°C, l’acidepétroséliniquenefond qu’à une température de 33 °C. Cette propriété est intéressante pour l’industrie desmargarines pour la production d’huiles végétales insaturées solides à température ambiante.(Ohlrogge,1994)

Réductiondel’absorptionlipidique

Les huiles riches en acide pétrosélinique constituent une alternative «low-fat» aux huilesvégétales conventionnelles. En effet, (Heimermann et al., 1973) ontmontré que la lipolyse detriglycéridesd’acidepétroséliniquepar les lipasespancréatiquesétaitmoinsefficacequepourceuxd’acideoléique.Celarésulteenuneabsorptionplusfaibledecetacidegras.

(Alaluf et al., 2002) ont déposé un brevet pour des formulations contenant de l’acidepétroséliniquepouvantêtreutiliséescommesubstituantdematièregrassehabituelle.Leshuilesrichesenacidepétroséliniqueprésententdebonnespropriétésstructuralesmaisn’engendrentpasd’augmentationducholestérolLDLdanslesang.

Activitéanti-inflammatoire

L’acidepétroséliniqueestdéjàutilisédansdifférentesformulationsalimentaires,cosmétiquesetpharmaceutiques pour son activité anti-inflammatoire. Les explications de cette activitédiffèrentdanslesdifférentespublicationsetbrevets.

Avant tout, il est utile d’introduire la réaction inflammatoire. L’inflammation est une réponsenormalede l’organismeàune infection,uneallergie,uneplaie,unemaladieauto-immune,uneexpositionàdesradiations,àdesagentsirritants,etc.(Malnoeetal.,1999)Elleestcaractériséeparl’apparitionderougeur,gonflement,chaleuretdouleur.Cescaractéristiquessontduesàunflux sanguin amplifié, à une perméabilité des capillaires sanguins plus élevée permettant lepassagedegrossesmoléculesdusangvers lesparoisendothéliales,etaumouvementaccélérédes leucocytes vers les tissus environnants. L’inflammation enclenche de cette façon lesprocessus immunitaires liés à la destruction du pathogène ou des toxines étrangères, aunettoyagedesdébriscellulairesetàlaréparationdestissusabimés.Pourcela,lesgranulocytes,

17

monocytes,macrophagesetleucocytessontattiréssurlesited’inflammation.Ilssontactivéspardesendotoxines,oulipopolysaccharides,présentessurlaparoidesbactériesGramnégativesetformentalorsdescytokines(commelesfacteursdenécrosetumoraleTNF,interleukinesIL,etc),eicosanoïdes (dérivés de l’acide arachidonique), ROS (ReactiveOxygen Species, autrement ditespèces réactives oxygénées), monoxyde d’azote, et autres médiateurs. Bien que la réactiond’inflammation soit une réponse normale de l’organisme, une inflammation excessive ouinappropriéecontribueàdesdégâtstissulairesetàunpaneldemaladiesaiguesetchroniques.Enplusdesmaladiesinflammatoiresclassiques,l’inflammationjoueégalementunrôledanslestroublescardiovasculairesetneurodégénératifsliésauvieillissement.(Calder,2006)C’estdanscecadrequelarecherched’agentsanti-inflammatoiresestintéressante.

Laconsommationd’huilesrichesenacidepétroséliniquesembleavoirdeseffetsinhibiteurssurla synthèsed’acidearachindonique (précurseurdeseicosanoïdes,médiateursd’inflammation).Lorsdeleurstravaux,(Weberetal.,1997)ontnourrisdesratsàl’aided’unehuiledecoriandreriche en acide pétrosélinique d’une part, et d’une huile de tournesol riche en acide oléiqued’autre part, pour ensuite observer la composition en acides gras de leurs foies. Les résultatsobtenusindiquentquelestauxenacidelinoléique(C18:2n-6)sontplusélevésdanslesfoiesdesratsnourrisàl’huiledecoriandrealorsquelestauxenacidearachidonique(C20:4n-6)ysontpresqueréduitsdemoitié.Ilsenontdéduitquel’acidepétroséliniqueestunmétabolite«dead-end» (autrement dit sans issue, «cul-de-sac») de la voie métabolique de désaturation etélongationdechaine transformant l’acide linoléiqueenacidearachidoniquequi formeensuitedeseicosanoïdes. Ilsontsuggéréque l’acidepétrosélinique,avecsadouble liaisonΔ6, imiteunproduitdelaΔ6désaturase,inhibantl’enzymedecettefaçon.

(Alalufetal.,2002)ontdéposéunbrevetpourdes formulationsàbased’acidepétroséliniquepouvant être utilisées en tant qu’additif alimentaire ayant une action anti-inflammatoire. Ilsexpliquent l’action anti-inflammatoire de l’acide pétrosélinique par son inhibition de laformationdemétabolitesd’acidearachidonique.

(Malnoe et al., 1999) ont déposé un brevet pour «une composition alimentaire, cosmétiqueet/ou pharmaceutique contenant de l’acide pétrosélinique destinée à activer la β-oxydationperoxisomale des acides gras dans les tissus superficiels d’unmammifère de sorte à pouvoirtraiter ou prévenir les inflammation et/ou moduler le métabolisme des lipides des tissussuperficiels». Dans les cellules du foie, activer les peroxysomes permet d’augmenter ladégradation du leucotriène B4, un eicosanoïde, et de cette façon contrôler la réactioninflammatoire. Cependant, dans les tissus superficiels, l’effet anti-inflammatoire et/oumodulateurdumétabolismedeslipidesn’estpasexpliquédanscebrevet.

Autresbienfaits

L’acide pétrosélinique est également utilisé dans des compositions cosmétiques oudermatologiquespoursespropriétéshydratantes.Eneffet,(Laugieretal.,1998)ontdéposéunbrevetpourlapréparationd’unecompositiondestinéeautraitementthérapeutiquedelapeausèche.Desmesuresinvitrodepouvoirhydratantontétéeffectuéesmaislebrevetn’abordepaslesmécanismesd’actiondel’acidepétrosélinique.

(Alalufetal.,2002)reconnaîtégalementàl’acidepétroséliniqueuneffetanti-âgecarilboosteleniveaudedeuxprotéinesstructuralesdelapeau:lecollagèneetladécorine.Decettefaçon,ilaun impact positif sur les rides, la peau sèche abimée par les rayons lumineux, les taches devieillissement,etc.

L’acide pétrosélinique présente également une activité antimicrobienne considérable contrecertainesbactériesetlevures.(Placek,1963)

18

Intérêtindustriel

Auniveauindustriel,l’acidepétroséliniqueestintéressantgrâceàsastructureparticulière.Cetacidegrasdedix-huitatomesdecarboneprésentantunedouble liaisonenposition∆6offre lapossibilité de produire des dérivés chimiques intéressants. En effet, le clivage oxydatif, parozonolyseparexemple,de l’acidegras libèrede l’acide laurique (C12:0)etde l’acideadipique(C6:0dicarboxylique)(Kleimanetal.,1982;Cahoonetal.,1992),alorsquel’acideoléiquefournitdel’acidenonanoïqueetazélaïque.(Placek,1963)L’acidelauriqueestutilisédanslafabricationde savons, shampoings et autre produits cosmétiques, détergents et surfactants (Friedt et al.,1995) C’est également l’acide gras insaturé présentant la plus forte activité antimicrobiennecontrelesbactériesgrampositives,lesvirusetleschampignons.(Dayrit,2015)L’acideadipiqueestlemonomèreconstituantlenylon66.(Cahoonetal.,1992)

Production

Destravauxvisantàisoleretpurifierl’acidepétroséliniqued'huilesvégétalesàfortesteneursencet acide gras furent effectués dès les années 20. En 1927, (Van Loon, 1927) a effectué destravaux sur des huiles de persil pour en extraire l’acide pétrosélinique par de nombreuses etfastidieusesétapesdeséparations,decristallisationetdedistillationfractionnéedesacidesgras.En 1959, Shenolikar et Subbaram fractionnaient les acides gras par formation de complexesd’inclusion avec l’urée. Cependant, l’acidepétroséliniqueobtenude cettemanière était impur.(Chobanov et al., 1966) Les méthodes furent encore modifiées et améliorées lors de diverstravaux, entre autre par (Fore et al., 1960) et (Chobanov et al., 1966), mais restent toujoursfastidieuses. Des travaux ont également étémenés sur des plantes transgéniques dans le butd’obtenirdesculturesindustriellespermettantlaproductiondegrandesquantitésd’acidesgrasnonusuels,commel’acidepétroséliniqueparexemple.(Murphyetal.,1994;Ohlrogge,1994)

En1952,uneméthodedeproductionsynthétiqued’acidepétroséliniqueaétécrééepar(Lumbet al., 1952). Celle-ci consiste en la réduction partielle d’acide taririque (acide octadéc-6-ynoïque),cetacidegrasacétyléniqueétantpréalablementobtenuàpartirdetridecynyl-lithiumetdu1-chloro-3-iodopropaneautraversdedifférentesétapes.

L’obtentiondemoléculesd’acidepétroséliniquepuresetcompliquéeetprésentedescoutstrèsélevés.(Placek,1963)Cependant,touteslesapplicationsnenécessitantpasl’utilisationd’acidepétroséliniquesousformepure, ilrestetoutà faitpertinentdes’intéresseràdeshuilesquiencontiennentdefortesteneurs.

Phospholipides

Les phospholipides, comprenant les phosphoglycérides aussi appelés phosphatides,représententlaclassemajeuredeslipidespolaires.(Peter,2008)Leurstructureestsemblableàcelle des triglycérides. Sur la molécule de glycérol sont greffés deux acides gras et ungroupementphosphatechargénégativementetcoupléàunautrecomposéhydrophile. (Leger,2010)

Ils font partie de la fraction insaponifiable de l’huile (Peter, 2008) et ont un rôle biologiquecrucialcarcesontlesconstituantsmajeursdesmembranescellulaires(Peter,2008).

19

Stérols

Letermephytostérolfaitréférenceàplusdedeuxcentcomposésdifférentsquiressemblentaucholestérol non seulement par leurs structures mais aussi par leurs fonctions biologiques.(Trautweinetal.,2007;Rafia,2013)

Lesstérolssonttouscomposésd’unnoyaustérane,ungroupementhydroxyleaucarbone3àlapositionbetunedoubleliaison,généralementlocaliséeentrelescarbones5et6ducycleB.Lesdifférences majeures se situent au niveau des chaines alkyles. (Trautwein et al., 2007) Lesphytostérols lesplus répandus sont le sitostérol, le stigmastérol et le campestérol. (Gunstone,2005;Johnsonetal.,2009)(Figure10)Lesstanolssont lesformessaturéesdesstérols,quinepossèdentpasdedoubleliaisonauniveaudunoyaustéranenidelachainealkyle.(Trautweinetal.,2007)Lesstérolsfontpartiedelafractioninsaponifiabledel’huile.(Gunstone,2005;Gornay,2006)Ilspeuventêtreprésentssousformelibreouestérifés.(Gunstone,2005)

Figure10:Structuredesprincipauxstérols(Trautweinetal.,2007)

Lesphytostérolssontprésentsdanslespartiesrichesenlipidesetenfibresdesplantes.Cesontdes composants structuraux des membranes cellulaires dont ils régulent la fluidité et laperméabilité. Ils interviennent également dans divers processus métaboliques associés auxmembranes.(Trautweinetal.,2007)

Les stérols végétaux possèdent plusieurs propriétés bioactives. Malgré leur ressemblancestructuraleavec lecholestérol, ils sontabsorbésàmoinsde2%par les intestins,alorsque lecholestéroll’està30à60%.IlsréduisentdecettefaçonletauxdecholestérolLDL(lipoprotéinedebassedensité)dans lesang. (Trautweinetal.,2007;Rafia,2013)Ilspeuventdecette façondiminuerlerisquedemaladiescardiovasculaires.(Uddinetal.,2014)Ensuite,ilssontreconnuscomme possédant des effets protecteurs contre divers types de cancers (colorectal, sein,prostate). (Trautwein et al., 2007; Rafia, 2013) En effet, ils présentent une certaines toxicitéenvers les cellules tumorales dans le cas du cancer du sein et du colon et des étudesépidémiologiquesont suggéréqu’unealimentation riche enphytostérol réduit les cancersdespoumons, estomac, colon, sein et prostate. (Uddin et al., 2014) Ils présentent également desactivitésanti-inflammatoire,antiathérogèneetstimulantlesystèmeimmunitaire.(Trautweinetal.,2007;Rafia,2013)Leursaspectsbénéfiquessonttellementreconnusqu’ilexistedesalimentsenrichisenphytostérols.(Rafia,2013)

20

Tocophérols

Lestocophérolsetlestocotriénolsformentunefamilledehuitmoléculescomposéesd’uncyclechromanol et d’une chaine latérale aliphatique. Les tocophérols contiennent des chainessaturées et les tocotriénols insaturées. Au sein de chaque groupe, il existe quatre isoformes,différantparlapositionduoudesgroupement(s)méthyl(s)surlecyclechromanol(Tuckeretal.,2005): α (5,7,8-triméthyl), β (5,7- diméthyl), γ (7,8-diméthyl), and δ (8-méthyl). (Gunstone,2005) (Figure 11, R1 sur C5 et R2 sur C6) Les tocophérols sont inclus dans la partieinsaponifiabledeslipides.(Gunstone,2005;Gornay,2006)

Lestocophérolsettocotriénolssontdepuissantsantioxydants. (Gunstone,2005;Tuckeretal.,2005; Johnson et al., 2009) Ils sont sensibles à l’oxygène et sont plus stables sous formeestérifiée.(Gunstone,2005)Danslaplante,lestocophérolsprotègentlesmembranescontrelesdommages causéspar les radicaux libres. (Buchananet al., 2015)Dans l’alimentation, ils sontunesourcedevitamineEquiestunnutrimentessentiel.(Johnsonetal.,2009)

Tocophérol

Tocotriénol

Figure11:Structuredestocophérolsettocotriénols,d’après(Colombo,2010)

Autrescomposéslipidiques

Leshuilesvégétalescontiennentencorebiend’autrescomposéstelsquedessphingolipides,quisont des lipides polaires constitués d’un groupement aminé (Peter, 2008), des alcools gras(Johnson et al., 2009) ou encore des hydrocarbures qui peuvent être des alcènes, comme lesqualèneetlescaroténoïdes,oudeshydrocarburepolycycliquesaromatiques.(Gunstone,2005)Leshydrocarburesetalcoolsgrasfontpartiedelafractioninsaponifiabledel’huile.(Gunstone,2005;Gornay,2006)

21

3. Composésphénoliques

Définition

Les composés phénoliques ne font pas partie de la fraction lipidique. Ce sont desmétabolitessecondaires dérivés des voies de biosynthèse du pentose phosphate, shikimate etphénylpropanoïde.Ilsreprésententundesgroupeslespluslargementprésentsdanslesplanteset ne compte pas moins de huit milles composés différents. (Balasundram et al., 2006) Ilsconstituent un groupe très diversifié, mais sont tous caractérisés par la présence d’un ouplusieurscyclesbenzéniquesportantunouplusieursgroupementshydroxyles.(Macheixetal.,2005) Ils peuvent être des molécules phénoliques simples jusqu’à des composés hautementpolymérisés.(Balasundrametal.,2006)

Al’étatnaturel,lescomposésphénoliquespeuventêtreconjuguésàd’autresmolécules(glucides,lipides,protéines,autresmétabolitessecondaires,composésphénoliquesoupas).(Macheixetal.,2005)Laplupartsontd’ailleursprésentsdanslaplantesousformedeO-glycosidesquisontdesdérivéspluspolaires,plushydrophiles.(Pokornýetal.,2012)

Classification

Surbasedeleursstructurestrèsdiversifiées,lescomposésphénoliquespeuventêtreregroupésendifférentes classes en fonctionde la complexitédu squelettedebase (d’un simpleC6 àdesformes très polymérisées). (Tableau 6) Les composés se distinguent ensuite par le degré demodification de ce squelette par oxydation, hydroxylation, méthylation, etc. (Macheix et al.,2005)

Tableau6:Principalesclassesdescomposésphénoliques(Macheixetal.,2005)

Squelettecarboné

Classe Exemple

C6 Phénolssimples CatécholC6-C1 Acideshydroxybenzoliques p-HydroxybenzoïqueC6-C3 Acideshydroxycinnamiques

CoumarinesAcidescaféique,féruliqueScopolétine,esculétine

C6-C4 Naphtoquinones JugloneC6-C2-C6 Stilbènes ResvératrolC6-C3-C6 Flavonoïdes

• Flavonols• Anthocyanes• Flavanols• Flavanones

Isoflavonoïdes

Kaempférol,quercétineCyanidine,pélargonidineCatéchineNaringénineDaidzéine

(C6-C3)2 Lignanes Pinorésinol(C6-C3)n Lignines (C15)n Tanins

22

Acidesphénoliques

Les acides phénoliques sont composés de deux sous-groupes: les acides hydrobenzoïques ethydrocinnamiques. Les acides hydrobenzoïques présentent une structure C6-C1. A titred’exemple, l’acide gallique, p-hydrobenzoïque et salicylique peuvent être cités. Les acideshydroxycinnamiques portent une chaine latérale plus longue (C6-C3). Les acides caféïque,férulique,p-coumariqueetsinapiquesontdesacideshydroxycinnamiques.(Balasundrametal.,2006)

Flavonoïdes

Les flavonoïdesconstituent legroupe leplus largedecomposésphénoliquesauseindurègnevégétal.Ilsreprésententplusdelamoitiédescomposésphénoliquesretrouvésdanslesplantes.(Balasundrametal.,2006)

Les flavonoïdes sont des molécules de poids moléculairesrelativement faibles. Ils comportent 15 atomes de carbonearrangés en configuration C6-C3-C6, c’est-à-dire deux cyclesaromatiques A et B reliés par 3 carbone, habituellement sousforme de cycle hétérocyclique C. (Balasundram et al., 2006)(Figure 12) Les substituants liés au cycle C permettent deséparer les flavonoïdes en différentes classes (flavonols,flavones, flavanones, flavanols,etc) tandisque lessubstituantssur les cycles A et B permettent de distinguer différentscomposésauseind’unemêmeclasse.Lessubstitutionspeuventêtredesoxygénations,alkylations,glycosylations,acylationsousulfations.(Balasundrametal.,2006)

Figure12:Squelettemoléculairedebasedesflavonoïdes

Tanins

Lestaninssontdescomposésdepoidsmoléculairesplusélevés.(Balasundrametal.,2006)Ilssont séparés en deux grands groupes selon leur composition et leur réactivité chimique: lestanins hydrolysables et les tanins condensés. (Macheix et al., 2005) Ils sont responsables del’astringencedenombreuxfruits.(Balasundrametal.,2006)

Propriétés

Les composés phénoliques interviennent dans certains aspects de la physiologie de la plantecomme la lignification, la régulation de la croissance et les interactions qu’elle a avec sonenvironnement. (Macheix et al., 2005) Ils fournissent une protection contre les pathogènes etprédateurs. Ils contribuent également à la couleur et aux caractéristiques sensorielles decertainsorganesdelaplante.(Balasundrametal.,2006)

La principale activité attribuée aux composés phénoliques est antioxydante. Ils sont toutefoisreconnus et utilisés pour de nombreuses autres propriétés: antimicrobienne, anti-inflammatoire, anti-allergène, antiathérogène, anti-thrombotique, cardioprotectrice etvasodilatatrice.(Balasundrametal.,2006)

23

4. Extractiondeslipides

Méthodesconventionnelles

Al’échellelaboratoire

A l’échelle du laboratoire, différentes méthodes sont utilisées pour extraire les lipides dediverses matrices. Cela requiert généralement l’utilisation de solvants organiques tels quel’hexane, le chloroforme, l’éther de pétrole, etc. (Abert Vian et al., 2013) L’extraction solide-liquide par solvant est laméthode la plus utilisée. Elle consiste en un transfert demasse desprincipesactifssolublesverslesolvant.Celasefaitselonungradientdeconcentration,jusqu’àcequelaconcentrationenprincipeactifdanslamatricesolideetdanslesolvantsoientégales.Enchauffant lesolvant, lasolubilitédanscelui-ciestaméliorée, favorisantdonc le transfertdemasse. En remplacant le solvant à l’équilibre par du solvant frais, c’est le gradient deconcentration qui est modifié. Ces paramètres donnent lieu à différents types d’extraction.(Handaetal.,2008)

Pour la méthode de Soxhlet, le solvant est chauffé, l’extraction est continue et le solvant encontactavec l’échantillonestrenouvelé.Cetteméthodepermetd’extraireavecdespluspetitesquantitédesolvantsquelesdispositifsàcontrecourantparexemple.(Handaetal.,2008)

LaméthodedeFolchreposesurlamacérationàfroiddelamatricesolidedansunmélangedesolvantsapolaireetpluspolaire,danslesquelssepartitionnentlesmoléculesdel’échantillonenfonctiondeleurpolarité.(Folchetal.,1957)

L’extraction par solvant peut être améliorée par l’utilisation d’ultrasons. Ces derniersaugmentent la perméabilité des parois cellulaires et produit des cavitations. Cependant,l’énergie importantedesultrasonspeutcauser la formationderadicaux libresdans l’huile.Deplus,l’applicationdecetteméthodeàgrandeéchelleestlimitéeparsoncoûtélevé.(Handaetal.,2008)

Lesméthodes d’extraction assistées parmicro-onde permettent une isolation des lipides plusefficace en irradiant le mélange échantillon/solvant. Les extractions sont alors plus rapides,moins coûteuses et nécessitent de plus faibles volumes de solvant. Toutefois, l’énergie desmicro-ondespeutengendrerdesréactionsd’oxydationetdesmodificationsduprofilenacidesgras.Deplus,cetteméthodeestappropriéepourleséchantillonsprésentantunehauteteneurenlipidesuniquement.Jusqu’ici,peud’étudesontétémenéessurl’extractiondelipidesparmicro-ondes.(Handaetal.,2008)

L’extraction d’huile peut également se faire demanièremécanique, mais le recouvrement enhuileestbienplusfaible.Lepressagelibèregénéralementuntiersdel’huilecontenuedanslesgraines.Lapartiesolide,appeléetourteaux,contientalorsencoredeuxtiersdel’huilecontenueinitialementdanslesgraines.(Shahidi,2013)

24

Al’échelleindustrielle

En ce qui concerne l’extraction de lipides à grande échelle, le procédé industriel utilisé pourl’extraction des huiles oléagineuses n’a pas énormément évolué depuis une cinquantained’année.(Fineetal.,2013)Celui-cisuitdifférentesétapesdontunprétraitementdesgraines,unpressage mécanique et une extraction finale à l’hexane. (Parmentier et al., 2004) Leprétraitement des graines consiste en un nettoyage et décorticage mais également en untraitementthermique.Lamajeurepartiedel’huileestextraitedesgrainesparpression,laissantuntourteau,appelé«gâteaudecompression»,contenantencore16à24%dematièresgrassesenfonctiondelanaturedesgraines.Cettehuilerésiduelleestrécupéréeparextractioncontinueàl’aided’hexanequiestensuiteévaporépardistillation.L’extractionàl’hexanepermetd’obtenirunrendementd’extractionde97%,alorsqu’ilnedépassepas les89%parsimpleextractionmécanique. (Fine et al., 2013) L’huile obtenue est trouble, instable chimiquement et contientencoreuncertainnombredecomposésindésirables.Ellesubitalorsencorediversesétapesderaffinageplusoumoinsimportantesenfonctiondel’utilisationultérieuredel’huile.Leraffinagevise à éliminer les gommes, certains composés colorés, les acides gras libres responsables del’aciditéetdesmoléculesvolatilesresponsablesdemauvaisesodeurs.(Parmentieretal.,2004)

Actuellement,etdepuisdesannées, l’hexaneestlesolvantleplusutiliséàl’échelleindustriellepourextraireleshuilesvégétales.(AbertVianetal.,2013)Selon(Fineetal.,2013),ilestmêmeleseul.Celui-ciest intéressantdeparsonapolaritéetsachaleur latentedevaporisationassezfaible(31,56kJ/molà25°C(“HSDBAToxnetDatabase(ToxicologyDataNetwork),”August-10-2017)). Cette dernière caractéristique permet de l’évaporer facilement à faibles coûtsénergétiques.

Inconvénientsdesméthodesconventionnelles

Lessolvantsconstituentlasourcelaplusimportantededéchetsdesprocédéschimiques(Paceetal.,2012)et l’utilisationdesolvantsorganiquespar lesméthodesclassiquesd’extractiondelipidesprésentediversinconvénients.Premièrement,l’utilisationdesolvantsorganiquesdanslachainedeproductiondedenréesalimentairespréoccupedeplusenpluslesconsommateursencequiconcerne lasantépublique, l’environnementet la sécurité.Ensuite, lessolvantscoûtentcheret lesrèglementationsenvironnementalessontdeplusenplusstrictesetcontraignantes.(Sahenaetal.,2009)Eneffet, l’hexaneestunproduitdangereuxcarfacilementinflammable.Ilest également néfaste pour l’environnement, irritant et nocif, présentant une certaine toxicitésur le système nerveux central et pouvant provoquer des troubles de la fertilité. (Fine et al.,2013) Enfin, d’autres problèmes se posent encore, tels que la contamination éventuelle duproduit final par des résidus de solvants organiques, la dégradation thermique de composésd’intérêts sensibles par des opérations de traitement à chaud, d’éventuelles réactionsd’hydrolyses,etc.(Zekovicetal.,2016)

Extractionauxsolvantsdesubstitution

Pourtoutes lesraisonscitéesci-dessus, larecherched’alternativessedéveloppe fortement.Larecherche de solvants de substitution est une des pistes explorées. Les solvants d’originevégétale issus de la bioraffinerie représentent une alternative aux ressources fossiles etprésententunbilanenvironnementalpositif.(Fineetal.,2013)

25

(Fineetal.,2013)distinguetroistypesd’agro-solvantsenfonctiondelafilièredontilssontissus.Premièrement, de l’éthanol, du sorbitol, des esters d’acide lactique et des dérivés d’acidessucciniques peuvent être obtenus par fermentation de matières céréalières et sucrières.Deuxièmement,latransestérificationdansunalcooldematièrespremièresoléo-protéagineusespermet la formationd’estersd’acides gras et dedérivésde glycérol. Enfin, deshydrocarburesterpéniquespeuventêtreisoléspardistillationderésinesdeconifèresoud’écorcesdefruits.

ExtractionauCO2supercritique

Alternativeauxméthodesconventionnelles

L’extraction au fluide supercritique est uneméthode d’extraction verte. (Zekovic et al., 2016)Elle permet d’obtenir des extraits exempts de résidus de solvant, et cela sans étape deséparation. (DejoyeTanzi, 2013)L’extraction audioxydede carbone supercritique représenteunealternativeprometteuseauxsolvantsconventionnelsoumêmeauxextractionsmécaniquespar pressage pour les extractions de lipides, aussi bien dans l’industrie agro-alimentaire quepharmaceutique.Ellepermetmêmeunemeilleurerétentiondescomposésaromatiques.(Sahenaetal.,2009)

Fluidessupercritiques

Enfonctiondesconditionsdetempératureetpressiondanslesquellesilsetrouve,uncorpspurpeut se présenter sous différents états: solide, liquide et gazeux. (Figure 13) Au delà d’uncertain point appelé critique, caractérisé par une température et une pression critique, lecomportementdufluideditsupercritiqueadopteuncomportementintermédiaireentreceluidel’étatliquideetdel’étatgazeux.(Herzi,2013)Sadensité,etdoncsamassevolumique,estélevéeetsemblableàcelledesliquidesalorsquesaviscositéestfaibleetdumêmeordredegrandeurque celle des gaz. Sa diffusivité est intermédiaire entre celle des gaz et des liquides. (DejoyeTanzi, 2013; Herzi, 2013) Le tableau 7 expose les propriétés physiques du CO2 dans sesdifférentsétats.

Tableau7:PropriétésphysiquesduCO2àl'étatdegaz,supercritiqueetliquide,d’après(Herzi,2013)

Propriétés

Etat

Massevolumiqueρ(kg/m3)

DiffusivitéD(m2/s)

Viscositéη(Pa.s)

Gaz 0,6–2 (1–4).10-5 (1–3).10-5

Supercritique 200–500 0,7.10-7 (1–4).10-5

Liquide 600–1600 (0,2–2).10-9 (0,2–3).10-3

Unefaibleviscositépermetunemeilleurepénétrationdufluidedans lessolides(Sahenaetal.,2009;Herzi,2013),favorisantlestransfertsdemasse.(Herzi,2013)Unefaibleviscositépermetégalement un écoulement avec moins de frictions (Sahena et al., 2009), réduisant l’apporténergétique nécessaire pour déplacer le fluide. (Herzi, 2013) Une densité élevée favorise lesinteractions intermoléculaires (Herzi, 2013) et permet une meilleure solubilisation descomposésdans le fluide. (Sahenaetal.,2009)A l’état supercritique, le fluidepossèdedecettemanièreun certainpouvoir solvantvis-à-visde solutésnormalementà l’état liquideou solidedanscesconditionsdepressionettempérature.(Herzi,2013)

26

CO2supercritiquecommesolvantd’extraction

AvantagesetpropriétésduCO2

Lefluidesupercritique leplusutilisépour lesextractionsde lipidesest ledioxydedecarbone.(Sahena et al., 2009; Zekovic et al., 2016) Il présente en effet de nombreux avantages.Premièrement, ses conditions supercritiques sont facilement accessibles: Tc = 31,1 °C etpc = 73,8 bar. (Figure 13) De telles conditions d’opération sont faciles à atteindre et latempératurerelativementbasseestidéalepourextrairedesmoléculesthermosensiblessanslesdégrader.(Sahenaetal.,2009)Ensuite,leCO2estpeucoûteux(Sahenaetal.,2009;DejoyeTanzi,2013;Zekovicetal.,2016)etfacilementdisponibleàunepuretéélevée(Sahenaetal.,2009).Ilestnontoxique(DejoyeTanzi,2013;Herzi,2013;Zekovicetal.,2016),noninflammablecarilnepeut être oxydé (Herzi, 2013) et peu dangereux à manipuler (Sahena et al., 2009). Il estégalement chimiquement inerte (Dejoye Tanzi, 2013; Herzi, 2013; Zekovic et al., 2016), desréactions secondairesavec leCO2 sontdonc relativement rares.Enfin, il estévacuéàpressionatmosphériqueetlaissedoncunextraitexemptdesolvantrésiduel.(Herzi,2013)

Figure13:Diagrammedephasedudioxydedecarbone(Budisaetal.,2014)

Le CO2 supercritique solubilise des composés apolaires et très peu polaires de faiblesmassesmoléculaires. (Herzi, 2013) La puissance de solvant est d’autant plus élevée que le poidsmoléculairedu composéest faible. Lesprotéines,polysaccharides, sucreset selsminérauxn’ysontpassolubles.(Sahenaetal.,2009)

Influencedediversparamètres

Le CO2 supercritique possède un pouvoir solvant à géométrie variable. Cela signifie qu’il estpossible de modifier ses propriétés en jouant sur les paramètres opératoires tels que latempérature et la pression. En modifiant ces deux paramètres, il est possible d’obtenir unecertainesélectivitéduprocédéenutilisantunecertainecombinaisondepressionettempératurequiaffectelerendementmaisaussilacompositionchimiquedel’extraitobtenu.(Zekovicetal.,2016) En théorie, chaque composé est extractible de façon optimale à des conditions detempératureetpressionprécises.(Sahenaetal.,2009)

Lapressionest le facteurprésentant l’influence laplus importantesur lerendementmassiqued’extraction.Eneffet,uneaugmentationdepressionentraineuneaugmentationdeladensitéduCO2,etdoncunemeilleuresolubilitédescomposésdel’échantillondanslefluide.(Zekovicetal.,2016)Cependant,l’augmentationdelamassevolumiqueengendreàsontouruneaugmentationdelaviscositéetlimiteletransfertdematièreetdoncladiffusivité.(Herzi,2013)

27

La température a une influence sur deux paramètres. Une augmentation de températureengendreunediminutiondeladensitédufluideetuneaugmentationdelapressiondevapeur.Alorsqu’unediminutionde ladensitéprovoqueunediminutionde lasolubilitédescomposés,une augmentation de pression de vapeur a pour conséquence de l’augmenter. (Zekovic et al.,2016)Ladiffusivitéaugmenteaveclatempératureetlaviscositédiminue.(Herzi,2013)

D’autresfacteursontégalementuneinfluencesurleprocédéd’extractioncommeledébitdeCO2,laprésenced’unco-solvantetlatailledesparticulesdelamatricequisubil’extraction.(Zekovicetal.,2016)UneaugmentationdudébitdeCO2mèneàunrendementmassiqued’extractionplusélevé.Celas’expliqueparlefaitqu’ellerésulteenunediminutiondel’épaisseurdelacouchefilmautour des particules et donc une résistance au transfert de masse affaiblie. (Zekovic et al.,2016)Ensuite,leCO2étantunemoléculenonpolaire,leslipidespolairesnesontpasextraitsàcause de leur faible solubilité dans le CO2 supercritique. Dans le but de remédier à cetinconvénientetd’améliorerlepouvoirsolvantetdoncl’efficacitéd’extraction,lapolaritéduCO2supercritique peut être modifiée par ajout d’un co-solvant polaire. (Sahena et al., 2009)Généralement, les co-solvants les plus utilisés sont leméthanol, l’éthanol, l’eau ou encore deshuilesvégétales.Ilssontsouventajoutésenfaiblesproportions(5à15%).(Herzi,2013)

5. Activitéantioxydante

Oxydation,radicauxlibresetantioxydants

L’oxygène, bienqu’indispensablepour la vie, présentedes aspects indésirables. Il engendre laformationetl’activationdecomposéschimiques,appelésespècesréactivesoxygénées(ROS),quionttendanceàréagiravecd’autresmoléculesenlesoxydantformantdecettefaçondesradicauxlibres.Unradicallibreestuneespècemoléculairequicontientunélectronnonappariédanssonorbitalatomique.Cetélectronprovoqueune instabilitéetuneforteréactivitéducomposé.Lesradicaux libres peuvent donner un électron à d’autres molécules ou leur en arracher un, secomportantcommeoxydantouréducteur.(Loboetal.,2010)

Unantioxydantestunemoléculesuffisammentstablequepourdonnerunélectronàunradicallibre et de cettemanière le neutraliser, réduire sa capacité à nuire. Les antioxydants peuventêtre enzymatiques ou non-enzymatiques. Ils peuvent agir soit en rompant une réaction enchaine, en donnant des électrons aux radicaux libres, soit en éliminant des espèces réactivesoxygénéesenétanchantlescatalyseursàlasourcedelachaine.(Loboetal.,2010)

Activitéantioxydanteetsanté

L’organisme produit en permanence des petites quantités de radicaux libres. Ceux-ci sontimpliquésdansdiversesfonctionsbiologiquescommeladéfenseimmunitairecontrelesagentspathogènes, la transduction de signaux cellulaires et d’autres encore, et sont des produits deréactions énergétiques. L’organisme est pourvu de systèmes de défense qui maîtrisent cetteproduction.Cesmécanismesdedéfensesontaussibienenzymatiquesquenon-enzymatiquesetpermettentdemaintenirlabalanceantioxydant/prooxydantàl’équilibre.(Favier,2003)

Lorsque les espèces radicalaires sont présentes en excès, l’organisme ne parvient plus à lesneutraliser et est soumis à un stress oxydant. Cet excédant de radicaux libres peut avoirplusieurs origines: une production trop importante des suite d’irradiations ou un déficit enantioxydantsparexemple.Cedéséquilibreprovoquedesdégâtsauxmoléculesbiologiques.Lesradicauxs’attaquentauxlipides,constituantsprincipauxdesmembranesbiologiques,induisant

28

des réactions en chaine, aux molécules d’ADN qui sont la mémoire de toute la compositionbiochimiquedescellules,etauxprotéinesquiperdentalorsleurintégritéetleurfonctionnalité.(Favier,2003)Undéséquilibreentreoxydantetantioxydantestdonccorréléàdiversdégâtsauniveaude lacelluleetdes fonctionscellulairesdéfectueuses. (Kurian,2012)Lestressoxydantest la cause initiale de différentes maladies telles que le cancer, la sclérose latéraleamyotrophique, etc et est un facteur pouvant provoquer l’apparition de maladiesplurifactorielles telles que le diabète, lesmaladies cardiovasculaires, l’Alzheimer, etc. (Favier,2003) De nombreuses pathologies métaboliques et troubles dégénératifs liés à l’âge sontétroitementliésauxprocédésoxydatifsdansl’organisme.(Peteretal.,2012)Eneffet,avecl’âge,les défenses antioxydantes s’altèrent et la production mitochondriale de radicaux augmente.(Favier,2003)

Les antioxydants sont donc cruciaux pour maintenir l’intégrité et la fonctionnalité desmembranescellulaires,protéinesetacidesnucléiquescarilspeuventpiégerlesradicauxlibresetéviterlesdégâtsprovoquésparunstressoxydatif.(Kurian,2012)

Activitéantioxydanteetproduitsagro-alimentaires

Les procédés oxydatifs sont également problématiques au niveau de la qualité des aliments,autant durant leur conservation que lors de leur fabrication et transformation. (Singh et al.,2008)Danslesdenréesalimentaires,lescomposéssensiblesàl’oxydationsontlesacidesaminés,peptidesetprotéines,lessucresetleslipidespolaires.(Pokornýetal.,2012)

Pour prévenir les dégâts oxydatifs, différents antioxydants sont utilisés. Les antioxydantssynthétiques les plus répandus sont le BHA et le BHT (butylhydroxyanisol etbutylhydroxytoluène)(Singhetal.,2008).L’acideascorbique,lescaroténoïdesetlycopènessontégalementemployés.Généralement,unmélangededifférentsantioxydantsestutilisé.(Pokornýetal.,2012)Cependant,suiteaunombreetàlagravitécroissantsdecasdeproblèmesdesantépublique, la confiance des consommateurs en ce qui concerne la sécurité alimentaire s’altère.(Tassou et al., 2012) En effet, des études toxicologiques ont associé à certains antioxydantssynthétiques des effets cancérigènes, hépatotoxiques (Singh et al., 2008), tératogènes ou deprésenter une toxicité résiduelle. De même que de nombreux pathogènes alimentairesdéveloppentunerésistancecroissanteauxagentsutilisés.Touscesproblèmesrésultentenunepressionsur les fabricantspouréliminercesadditifs chimiqueset rechercherdesalternativesd’originenaturelle.(Tassouetal.,2012)

Activitéantioxydantedesplantes

Les plantes renferment de nombreux composés antioxydants tels que des caroténoïdes,rétinoïdes, tocophérols, de l’acide ascorbique, des acides phénoliques, flavonoïdes etpolyphénols. Les huiles essentielles présentent égalementune activité antioxydante grâce auxcomposés phénoliques et terpénoïdes qu’elles contiennent. (Bakkali et al., 2008) En ce quiconcerne les extraits lipidiques, laquestionestplus compliquée.Certains travauxdémontrentl’absencedepouvoirantioxydantd’extraits lipidiquesalorsqued’autres leurreconnaissentuneffetantiradicalaire.(Lietal.,2007)et(Yietal.,2009)ontconcluquel’extraitlipidiqueetleursacidesgraspolyinsaturésdenoyerduJaponetdemarcderaisinneprésententaucunpouvoirantioxydant,alorsque(Liuetal.,2009)ontassociéauxacidesgrasinsaturésdel’huiledegrained’Opuntiadilleni sonactivitéantioxydante. (Ramadanet al., 2003)ontdémontré l’efficacitédefractionslipidiquesdenigelle,coriandreetnigeràréduireleradicalDPPHetontassociéscettecapacité aux phospholipides en particulier. (Miraliakbari et al., 2008) ont attribué l’activitéantioxydantedeshuilesdenoisettesautantauxcomposésphénoliquesqu’auxphospholipides.

29

MATÉRIELSETMÉTHODES

1. Matérielvégétal

Culture,récolteetpréparationdumatérielvégétal

Lesgrainesmaturesde fenouil (FoeniculumvulgareMill.),d’anisvert (PimpinellaanisumL.)etdecarvi(CarumcarviL.)utiliséeslorsdecetravailproviennentdeplantscultivésenTunisieenjuin 2016, dans la région de Menzel Témine au Nord-Est du pays (latitude: 36°46’ Nord,longitude:10°59’Est,altitude:38m).Cetterégionappartientàl’étagebioclimatiquesemiaridesupérieur.Letravaildeprospectionetdecollectedesgrainesaétéréaliséàl’aidedelaCelluleTerritoriale de Vulgarisation de Menzel Témine. Une fois récoltées, les graines ont étéconservéesàl’obscuritédansdesrécipientshermétiques.

Afin d’optimiser l’extraction et obtenir une meilleure représentativité, ces graines ont étébroyéesleplusfinementpossibleàl’aided’unbroyeurIKAA11basic.

Teneurenmatièresèche

Bienquelesgrainessoientunematricerelativementsèche,lateneurenmatièresèchedecelles-ci a tout demême été calculée. Une prise d’essai de 2 g de poudre de graines a été placée àl’étuveà70°Cdurant16heures.Lateneurenmatièresècheestcalculéedelamanièresuivante:

Équation1:Teneurenmatièresèche

𝑇𝑒𝑛𝑒𝑢𝑟 𝑒𝑛 𝑚𝑎𝑡𝑖è𝑟𝑒 𝑠è𝑐ℎ𝑒 =𝑚!"#$% !""#$ !é!!é!

𝑚!"#$% !""#$ × 100 (𝑔/100 𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑜𝑢𝑑𝑟𝑒 )

Chaquemesureaétérépétéetroisfois.

2. ExtractionsdeshuilesLes fractions lipidiques de graines de fenouil, d’anis vert et de carvi ont été extraites selonquatre méthodes différentes. Premièrement, des méthodes conventionnellesont été utilisées.Ensuite, des méthodes alternatives visant à réduire l’impact écologique de l’opérationd’extractionont été effectuées: uneextractionauCO2 supercritiqueetuneextraction selon laméthodedeSoxhletàl’aideda2-methyltétrahydrofurane,unagro-solvant.

30

Extractionparl’hexaneselonlaméthodedeSoxhlet

L’hexaneestlesolvantleplusutilisépourl’extractiondeslipides.(AbertVianetal.,2013;Fineet al., 2013) Le tableau 8 reprend ses principales caractéristiques chimiques et physiquesintéressantesdanslecadredecetravail.

Tableau8:Propriétéschimiquesetphysiquesdun-hexane

Formuleetstructuremoléculaires

C6H14

1

Massemolaire(g/mol) 86,18 2

Densitéà25°C(g/mL) 0,659 3

Températured’ébullition(°C) 68,73 2

Solubilitédansl’eauà25°C(mg/L) 9,5 2

LogP4 3,90 1

Flashpoint(°C) -22 1

Sécurité5

1

Sources: 1(“PubChem Substance and Compound databases,” August-10-2017), 2(“HSDB A ToxnetDatabase(ToxicologyDataNetwork),”August-10-2017),3(“ProductSpecificationSigma-Aldrich,”August-10-2017)

Pourcettepremièreméthoded’extraction, l'huilevégétaleestextraiteencontinude lapoudredegrainesàl’aided’unextracteurdeSoxhlet.Pourcela,50gdepoudredegrainesontétépesésdansunecartouchedecellulose(Schleicher&Schuele)quiaensuiteétéplacéedansl’extracteur.Celui-ci est raccordé à un réfrigérant d’une part et à un ballon d’autre part. Un volume de400 mL de n-hexane (HPLC-S, Biosolve) a été utilisé pour extraire l’huile. Une partie de cevolumeaétéversédansl’extracteurdefaçonàcequelematérielvégétalmacèreunenuitavantlelancementdel’extraction.Leresteaétéversédansleballonavecquelquespierresd’ébullition(pierre ponce, VWR). Le ballon est ensuite porté à ébullition à l’aide d’un chauffe ballon. Lesvapeursdesolvantsecondensentdansleréfrigérantpourcoulerdansl’extracteuroùilextraitles lipides de l’échantillon. Le solvant en contact avec l’échantillon est continuellementrenouvelé.Ledispositifestchaufféduranthuitheuresaprèsobservationdupremierrefluxdesolvant.

4Le Log P est un paramètre caractéristique d’une molécule donnant une indication sur soncaractère lipophile. Il correspondau logarithmeducoefficientdepartagede lamoléculeentrel’octanolet l’eau,quiest lerapportdesconcentrationsdececomposéentrecesdeuxphasesàl’équilibre. Ce paramètre est très utilisé dans l’étude desmédicaments,mais il est égalementintéressant dans le cadre de ce travail, étant donné que les solvants sont utilisés dans le butd’extraireleslipides.PluslavaleurdelogPestpositiveetélevée,pluslamoléculeestlipophile.(“Lipophilicity,”2017)

5LespictogrammesCLPetleurssignificationssontreprisenannexe.(Annexe1)

31

L’hexaneaensuiteétéévaporéde l’extrait récupéréafind’obtenir l’huileextraiteuniquement.Cela a été fait à l’aide d’un évaporateur rotatif (bain marie Heidolph LABOROTA, pompeLabobase/Laborota4000HeidolphG4 typehaut)àune températurede60 °Cetunepressionpartant de 500 mbar pour diminuer progressivement jusqu’à 100 mbar afin d’éliminer lesdernièrestracesdesolvant.

Le rendementmassique est le rapport entre lamasse d’huile végétale extraite et lamasse dematièrevégétaleayantsubil’extraction.Ilexpriméenpourcentage(g/100g)surmatièrefraicheselonlaformulesuivante:

Équation2:Rendementmassiqued'extraction

𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑!𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 ℎ𝑢𝑖𝑙𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡𝑒𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑒 𝑑′𝑒𝑠𝑠𝑎𝑖

× 100 (𝑔/100 𝑔 𝑑′ℎ𝑢𝑖𝑙𝑒)

Chaqueopérationd’extractionaétérépétéetroisfoispourchaquegraineetlamoyennedecestroisrépétitionsaétécalculée.

ExtractionselonlaméthodedeFolch

Dans le cas de la méthode de Folch, le solvant solubilisant et extrayant les lipides est lechloroforme.(Tableau9)

Tableau9:Propriétéschimiquesetphysiquesduchloroforme


CHCl3

1



Températured’ébullition(°C) 61,17 2

Solubilitédansl’eauà25°C(mg/L) 7,95.103 2

LogP 1,97 1

Flashpoint(°C) / 1

Sécurité

1


Une prise d’essai de 20 g de poudre de graines a été placée dans un erlenmeyer auquel unvolumede200mLd’une solutionde chloroforme/méthanol2/1v/vaétéajouté (solvantsdegradeanalytique, Scharlau).Lamatièrevégétaleamacérédans lemélangede solvantsdurant15h30 sous agitation orbitale d’environ 100min-1. Lemélange filtré a été récupéré dans desampoules à décanter et le précipité a été lavé avec environ 50 mL du mélangechloroforme/méthanol. Ensuite, 80 mL d’une solution de NaCl 0,58 % ont été ajoutés (NaCltechnique VWR). L’ensemble a été agité puis laissé décanter durant 18h30. La phase

32

chloroformique a été séchée sur poudre de Na2SO4 anhydre (Carlo Erba) sur filtre plissé etrécupéréedansdesballonstarés.Lechloroformeaétéévaporéàl’aided’unévaporateurrotatif(bainmarie Heidolph LABOROTA, pompe Labobase/Laborota 4000Heidolph G4 type haut) àune température de 35 °C et une pression allant de 350mbar à 89mbar afin d’éliminer lesdernièrestracesdesolvantetdenegarderquel’huileextraite.

Chaque graine a subi trois opérations d’extraction et la moyenne des trois rendementsmassiques a été calculée. Le rendement massique est calculé de la même façon que pourl’extractionselonlaméthodedeSoxhlet(Equation2).

ExtractionauCO2supercritique

Pourl’extractionauCO2supercritique,lesolvantutiliséestledioxydedecarbonesoussonétatsupercritique. Il présente donc des propriétés intermédiaires à celles qu’il présente à l’étatgazeuxetliquideetquilerendenttrèsintéressantcommesolvantd’extraction(cfr.Introduction,p.25-27).Le tableausuivant(Tableau10)reprend lescaractéristiqueschimiquesetphysiquesintéressantesdudioxydedecarbone.

Tableau10:Propriétéschimiquesetphysiquesdudioxydedecarbone


CO2

1


Densité(g/mL) gaz(0°C,1atm):1,976.103(g/mL)liquide(0°C,34,3atm):0,914(-)critique:0,464(-)

2

Températured’ébullition(°C) -78,464 2

Solubilitédansl’eauà25°C(mg/L) 2,9.103 2

LogP 0,83 1

Flashpoint(°C) / 1

Sécurité

1


33

L’appareil utilisé pour les extractions au CO2 supercritique a été conçu par la firme Séparex.(Figures14et15)Ilsecomposededifférentesparties.6

LeCO2estprésentsousformeliquidedanslabonbonne(1).Ilestpompéàl’aided’unepremièrepompe(2)etpasseparunrefroidisseur(3)avantd’entrerdanslecircuit.C’estauniveaudelapompequeledébitdeCO2estrégulé.LeCO2estalorséventuellementrejointparleco-solvantpompéparunesecondepompe(4)àhauteurd’uneintersection(5)avantd’arriverà lacelluled’extractionde15mL(6)oùsetrouvel’échantillon.Lacelluled’extractionestplongéedansunbain marie (7). C’est à cette hauteur du circuit que le paramètre température est réglé. Lapressiondanslecircuitestrégléeà l’aided’unrégulateurdepression(8)situéaprèslacelluled’extraction.Enfin, leCO2 contenant lesmolécules extraites aprèspassagedans la cellule subiune chute de pression dans le séparateur (9). Il redevient alors gazeux et se sépare desmoléculesextraites.L’extraitestrécupéréaprèsceséparateur(10).

Figure14:Représentationdel'appareilutilisépourlesextractionsauCO2supercritique

6L’appareil contient également une cellule de réaction enzymatique mais celle-ci n’est pasutiliséedanscetravail.

34

Figure15:Schémadeprincipesimplifiédel'appareilutilisépourlesextractionsauCO2supercritique

Comme expliqué dans la partie bibliographique de ce travail, laméthode d’extraction au CO2supercritique permet d’extraire des composés apolaires et légèrement polaires à bassetempérature. Différents paramètres permettent de réguler les conditions d’extractions: latempérature, la pression, le débit de CO2, et la durée d’extraction. Après avoir testé quelquescombinaisons de paramètres et sur base des travaux menés par (Zekovic et al., 2016), lesconditions retenuespourextraire la fraction lipidiquedesgrainesde fenouil,d’anisvertetdecarvisontunetempératurede40°C,unepressionde200bars,undébitdeCO2de14mL/minetun débit d’éthanol (absolu, Merck) utilisé comme co-solvant de 0,7 mL/min. L’opérationd’extractionaétémaintenueduranttroisheures.LeCO2utiliséestissudebonbonnesfourniesparlafirmeAirLiquide(référenceI5100).Cesbonbonnesrenfermentdudioxydedecarboneàl’étatliquide(1013).

Il n’a pas été possible d’extraire une quantité satisfaisante de matière par flux de CO2uniquement.Iladoncéténécessairedefairecirculerunco-solvantdanslecircuit.Lechoixs’estarrêté sur l’éthanol, qui est très souvent utilisé comme co-solvant et qui peut être considérécommevert.Celui-ciadoncdûêtreévaporéafindenegarderquel’huileextraitedelamatricevégétale. Cela a été fait à l’aide d’un évaporateur rotatif (bain marie Heidolph LABOROTA,pompe Labobase/Laborota 4000 Heidolph G4 type haut) à une température de 40 °C et unepressionallantde250mbarjusqu’à75mbarafind’éliminerlesdernièrestracesdesolvant.

Le rendement massique est toujours calculé selon la même formule (Equation 2) et chaqueextractionaétérépétéetroisfoispourchaquegrainepermettantdecalculerlamoyennedecestroisrépétitions.

35

Extractionparunsolvantalternatifselon laméthodedeSoxhlet

Afindepouvoircompareruneméthoded’éco-extraction,laméthodedeSoxhletaétérepriseenutilisantunagro-solvant:le2-méthyltétrahydrofurane(MeTHF).

Eneffet, leMeTHFprésentediversavantagesetestgénéralementconsidérécommeétantuneoptionde substitutionaux solvants traditionnelsviable. Il estd’ailleursdeplusenplusutilisédans des installations industrielles pilotes. Premièrement, il peut être issu de ressourcesrenouvelables, à partir de furfural ou d’acide lévulinique. Ensuite, son impact surl’environnementestmoindre.Danslecasd’unefuitedeMeTHF,cedernierestdégradédefaçonabiotiqueparl’airetlesrayonsdusoleil.Deplus,ilestremarquablementstableencomparaisonauxautres solvants cycliques.Enfin, en cequi concerne l’impactdu solvant sur la santé, il estégalementlimitécardesétudestoxicologiquespréliminairesautorisentsonutilisationdansdesprocédéspharmaceutiques.(Paceetal.,2012)Lorsdetravauxsurdessolvantsalternatifspourextraireleslipidesdelevuresoléagineuses,(Breiletal.,2016)ontconcluqueleMeTHFestunboncandidatpour remplacer l’hexane.Le tableau11présente sesprincipales caractéristiqueschimiquesetphysiques.

Tableau11:Propriétéschimiquesetphysiquesdu2-méthyltétrahydrofurane

Formuleetstructuremoléculaire

C5H10O

1



Températured’ébullition(°C) 78–80 2

Solubilitédansl’eauà25°C(mg/L) Informationnontrouvée

LogP Informationnontrouvée7

Flashpoint(°C) -10 2

Sécurité

1

Sources: 1(“PubChem Substance and Compound databases,” August-10-2017), 2 (“Product SpecificationSigma-Aldrich,”August-10-2017)

Pourcesextractions,desconditionssimilairesàcellesdécritespourl’extractionselonSoxhletàl’hexane ont été appliquées. Environ 10 g de poudre de graines ont été placés dans unecartouche de cellulose. Un volume de 75mL de 2-methyl tétrahydrofurane (Sigma-Aldrich) aserviàl’extractiondont20à25mLsontversésdansl’extracteurcontenantlacartoucheafinquelamatièrevégétalemacèredurantunenuitentière.Lelendemain, ledispositifatournédurant8heuresaprèsavoirobservélepremierrefluxdesolvant.

7AucunevaleurdelogPn’aététrouvéepourle2-méthyltétrahydrofurane.Cependant,(Marcus,1993)placeleMeTHFentrel’hexaneetlechloroformeentermesdepolarité.

36

Comme pour les autres extractions, le solvant a été évaporé à l’aire d’un évaporateur rotatif(bainmarie Heidolph LABOROTA, pompe Labobase/Laborota 4000Heidolph G4 type haut) àunetempératurede40°Cetunepressionallantde250mbarjusqu’à50mbarafind’éliminerlesdernièrestracesdesolvant

Pour cette méthode également, trois répétitions d’extraction ont été effectuées pour chaquegraine.Lerendementmassiqueestcalculéselonl’équation2.

3. Caractérisationdeshuiles

Profilenacidesgras

Leprofilenacidesgrasaétédéterminéparuneméthodedechromatographieenphasegazeuse.Pourcela,lesacidesgrasdoiventêtredérivatisésenestersméthyliquesafind’êtreplusvolatils.

Unegoutted’huileaétédéposéedestubesétanchesdanslesquelsontensuiteétéajoutés0,2mLd’hexane(Biosolve)et0,5mLdesolutiondeBF3(préparationdelasolution:55mLméthanolsec (méthanoldegradeanalytique,Scharlau),20mLhexane(Biosolve),25mLBF3(trifluoridedebore14%dansméthanol,Sigma-Aldrich)).Letoutaincubéà75°Cdurant90minutes.Unefoislemilieuréactionnelrefroidi,0,5mLd’unesolutiondeNaCl(NaCltechnique,VWR)saturéet0,2mLd’H2SO410%ontétéajoutés.Letoutaétéhomogénéiséparvortex.Enfin,8mLd’hexane(Biosolve)ontétéajoutésafindediluerl’échantillon.

Cette solution a été injectée en GC-FID (Gas Chromatography – Flame Ionization Detector).L’appareil utilisé au laboratoire est unHP 6890 Series avec une colonne capillaire polaire VFWaxms0,25µmx250mmx30m.Unvolumede0,5µLaétéinjectéenmodeON-COLUMN.Leprogrammedetempératuresestlesuivant:injectionà55°C,montéeà150°Cavecunevitessede 30 °C/min, puis directement à 250 °C avec une vitesse de 5 °C/min pour rester à cettetempérature durant 15 minutes. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur à un débit de1,7mL/min.

Lespicsontétéidentifiésà l’aidedestempsderétentionobtenuspouruntémoincomprenantdenombreuxacidesgras.Eneffet,chaqueesterméthyliqued’acidegras(EMAG)estcaractériséparuntempsderétention,quiestfonctionautantdelalongueurdelachainecarbonéequedunombre d’insaturations que celle-ci comporte et de la (des) position(s) et configuration(s) decette(ces) dernière(s). De plus, un échantillon de chaque combinaison graine/méthoded’extractionaétéinjectéenGC-MS(GasChromatography–MassSpectrometry)afind’identifierles pics non identifiés. L’appareil utilisé est un Agilent 5973 Network, la colonne et leprogramme utilisés sont les mêmes que pour les analyses par GC-FID. L’identification desmoléculesaétéfaiteàl’aidedelabasededonnéepal600k.

Les analyses ont été répétées trois fois (sauf perte d’échantillon par fuite lors de la réactiond’estérification)surchacundestroisextraitscorrespondantàunecombinaisongraine/méthoded’extraction.

37

Leprofilenacidegrasestexprimédemanièrerelative,c’est-à-direquelacompositionenchacundesacidesgrasestexpriméeenpourcentageparrapportàlateneurtotaleenacidesgras(AGT).Pourcela,lesairesdespicscorrespondantsauxacidesgrasontétésomméesetlaconcentrationrelativeenunacidegras est égale au rapportde sonaire sur celuide la sommede toutes lesaires,commel’exprimel’équation3suivante:

Équation3:ConcentrationrelativeenunAGparrapportàlateneurtotaleenAG

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝐴𝐺 = 𝐴𝑖𝑟𝑒 𝐴𝐺

𝐴𝑖𝑟𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑑𝑒𝑠 𝐴𝐺 (% 𝐴𝐺𝑇)

Teneursenacidesgras

Etant donné que tous les résultats obtenus par les analyses précédemment présentées nedélivrentquedes informations relatives sansaucunenotionquantitative,desanalysesontétéeffectuéesparlasuiteàl’aided’unstandardinterne.Celapermetdepouvoirquantifierlesacidesgrasprésentsdans leshuilesde façonabsolue,en termemassique.Lestandard interneutiliséestuntriglycérided’acidesgrasà17atomesdecarbonecarcetacidegrasn’estpasprésentdansles échantillons analysés. Pour ces analyses, le mode opératoire a été légèrement modifié.Premièrement,lagoutted’huileaétéexactementpesée.Ensuite,les0,2mLd’hexaneajoutésontétéremplacéspar0,4mLd’unesolutionderéférence1mg/mLdetriglycéridedeC17(glycéryltriheptadécanoate ≥99%, Sigma-Aldrich) préparée dans l’hexane. Les étapes suivantes sontexactementidentiquesàcellesexpliquéesci-dessus.Ladernièredifférenceestleprogrammedetempératured’analysechromatographiquequiaétélégèrementmodifiédefaçonàraccourcirletemps d’analyse sans avoir d’impact sur les temps de rétention des EMAG : injection à 55 °C,montéeà150°Cavecunevitessede30°C/min,puisdirectementà235°Cavecunevitessede5°C/min,enfinà250°Cà50°C/minpourresteràcettetempératuredurant5minutes.

Laconcentrationabsolued’unacidegrasdansunehuileestalorscalculéedelafaçonsuivante:

Équation4:ConcentrationabsolueenAGdansl’huile

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝐴𝐺 = 𝑚!" × 𝐴!" 𝐴!"𝑚!"#$% !!!""#$

(𝑚𝑔/𝑔 𝑑′ℎ𝑢𝑖𝑙𝑒)

Teneuretprofilenstérols

Le profil en stérols est déterminé par chromatographie enphasegazeuseet requiertdifférentesétapespréliminaires:saponification, extraction liquide-liquide afin de nerécupérer que la fraction insaponifiable, purification desstérols par chromatographie sur couche mince et enfindérivatisation des stérols. La méthode fait usage de labétuline (Figure 16), qui est un stérol artificiel, commestandardinterne.

Figure 16 : Structure de labétuline(d’après(Winkler-Moser,n.d.))

38

Uneprised’essaid’environ0,2grammesdematièregrasseaétéplacéedansunballonrodéde100mL.

Afindesaponifierlamatièregrasse,10mLd’unesolutiondeKOH(KOHsolide,CarloErba)2Mpréparéedans leméthanolontétéajoutés,ainsiquequelquespierresporeuses(pierreponce,VWR).Lemélangeaalorsétéportéàébullitionsousréfrigérantdurantuneheure.Ensuite,unefois lemélange refroidi, le réfrigérant a été rincé à l’aidede5mLd’eaudistillée. Le standardinterne a été ajouté: 0,2 mL d’une solution de bétuline (standard analytique, Sigma-Aldrich)1mg/mLpréparéedansduméthanol(analytique,Scharlau)(labétulineestd’abordsolubiliséedansunpeudechloroforme).

Ensuite, les fractionssaponifiableset insaponifiablesde l’huileontétéséparéesparextractionliquide-liquide.Pourcela,lecontenuduballonaététransvasédansuneampouleàdécanterde250mL.Leballonaensuiteétérincéàl’aidede5mLd’eaudistillée,quiontégalementétéversésdans l’ampoule.L’extraction s’est faite à l’aidede25mLd’étherdiéthylique (Scharlau)à troisreprises,avecagitation(3x3x10mouvementsd’alleretvenue)etdécantation.L’agitationaétémenéeavecprécautionafind’éviterlaformationd’émulsion.Pourlapremièreextraction,les25mLontétéutiliséspourrincerleballonavantd’êtreversésdansl’ampoule.Laphaseméthanol-eau(saponifiable, inférieure)aétérécupéréedansunpremiererlenmeyeret laphaseéthérée(insaponifiable,supérieure)dansunseconderlenmeyer.Laphaseméthanol-eau(1eerlenmeyer)adenouveauétéextraiteàl’aidede25mLdeétherdiéthylique.Lanouvellephaseméthanol-eaua été séparée de la phase éthérée. Cette dernière a été rassemblée à la phase éthérée de lapremièreextraction (2e erlenmeyer).La troisièmeextraction s’estdérouléede lamême façon.Lestroisphaseséthéréesontéténettoyéesàl’aidede10mLd’eaudistilléeàtroisreprises.Lesphases aqueuses ont été éliminées et la phase éthérée résultante a été récupérée et séchée àl’aidedeNa2SO4anhydre(CarloErba)quiaensuiteétééliminéepar filtrationsur filtreplissé.L’étherdiéthyliqueaétéévaporé.

Afindepurifier lesstérols,unechromatographiesurcouchemincepréparativeaétéeffectuée.Pourcela,l’extraitaétéreprisdans2–2,5mLdechloroforme(Scharlau)lorsdetroisrinçagesdu ballon à l’aide d’environ 1 mL de CHCl3, afin de transvaser dans un tube sovirel. Lechloroforme a alors été évaporé pour reprendre le dépôt insaponifiable dans 0,2 mL dechloroforme.Suruneplaquedesilice(geldesiliceG60,Merck)de0,5mmd’épaisseurontétéétalés 120 µL de cet extrait, ainsi qu’un spot de solution témoin (1mg/mL de bétuline et decholestérol(Sigma-Aldrich)danslechloroforme)departetd’autredelaligned’échantillon.Lamigrations’estfaiteàl’aided’unéluantchloroforme/étherdiéthylique/ammoniaque90/10/0,5v/v/v (ammoniaque env. 25 %, ucb). La révélation s’est effectuée à l’aide de 2,7-dichlorofluorescéine (Merck) 0,2 % dans éthanol (Scharlau) sous lumière ultraviolette(λ = 254 nm). Les lignes de migration correspondant aux stérols et à la bétuline ont étéidentifiéesgrâceautémoindebétulineetcholestérolposédepartetd’autredel’échantillonetontétérécupéréesdansuntubesovirel.Afind’extrairelesstérolsetlabétulinedelasilice,3mLdechloroformeontétéajoutésàlasilicerécupérée.Letubeaétévortexéà2500rpmdurant10secondes,puiscentrifugéà2000rpmdurant2minutes.Lesurnageantaétérécupérédansunautretubesovirelpourvud’unbouchonétancheavecunjointentéflon.Leculot(lasilice)aétéépuisé en répétant trois fois ces étapes (reprise dans 3 mL de chloroforme, vortex,centrifugation, récupération du surnagent). Le surnageant récupéré a alors été placé sousbalayaged’azoteavecchauffagelégerafind’évaporerlechloroforme.

Afinderendre lesstérolsvolatils,ceux-cidoiventêtredérivatiséspartriméthylsilylation.Pourcela, 100 µL de pyridine (Sigma-Aldrich) et 100 µL de BSTFA-TMCS 99-1 (Supelco Sigma-Aldrich)ontétéajoutésauxstérols.Lestubesbienfermésontétéplacésàl’étuveà90°Cdurant30minutes.Aprèscela, l’excèsderéactifsdesilylationaétéévaporésousbalayaged’azote.Lecontenu sec a été solubilisé dans 1 mL d’hexane (Biosolve) afin d’être injecté enchromatographieenphasegazeuse.

39

La solutionobtenuea enfinété injectéea en chromatographieenphasegazeuse coupléeàundétecteurFID.UnappareilHP6890SeriesetunecolonnecapillaireapolaireHP-5MS5%phénylméthyl siloxane 0,25 µm x 250mm x 30m ont été utilisés. Unmicrolitre d’échantillon a étéinjecté enmode SPLITLESS. En ce qui concerne le programme de températures, le four a étémaintenuà50°Cdurantuneminute,puisestmontéjusque275°Càunevitessede30°C/min,pour rester à cette température durant 30minutes. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteuravecundébitde1,5mL/min.

L’identification des stérols s’est faite sur plusieurs bases. Tout d’abord, à l’aide des temps derétentionscaractéristiquesdechacundesstérols triméthylsilylés.Les tempsde rétentionsontretrouvésdanslalittérature.(Winkler-Moser,n.d.;Lognayetal.,1993)Ilspeuventêtrecalculésde manière relative par rapport à un pic de référence comme le β-sitostérol pour plus deprécision. De plus, un échantillon de chaque condition (graine/méthode d’extraction) a étéinjectéenGC-MS,surunappareilAgilent5973Networkmunid’unecolonneHP-5MS5%phénylméthyl siloxane0,25µmx250mmx30met selonunprogrammesimilaireà celuiutiliséenGC-FID.Labasededonnéepal600kaserviàl’identificationdesmolécules,maislesspectresdemassesontégalementétéanalysésencasdedouteàl’aidede(Lognayetal.,1990).

Lesconcentrationsenlesdifférentsstérolsidentifiésontétédéterminéesàl’aidedecalculsdeproportionnalitésavec labétuline, selon l’équation5.Le facteurde réponsede labétulineparrapport au stérols peut être considéré comme étant égal à 1. (Lognay et al., 1990) C’est pourcetteraisonqu’ilnefigurepasdecorrectiondanslaformule.

Équation5:Concentrationenstéroldel'huile

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑠𝑡é𝑟𝑜𝑙 = 𝑚!" × 𝐴!"

𝐴!"é!"#𝑚!"#$% !!!""#$

(𝑚𝑔/𝑔 𝑑′ℎ𝑢𝑖𝑙𝑒)

Cetteanalyseaétérépétéeunefoissurchacunedestroisrépétitionsd’extractionuniquement,étantdonnéletempsetlaquantitédematièregrassequ’ellenécessite.

Profilencomposésphénoliques

Préparationd’extraitsméthanoliques

Afindepouvoirétudierlacompositionphénoliquedeshuiles,desextraitsméthanoliquesontétépréparés à partir de celles-ci. Pour cela, 0,2 grammes d’huile ont été pesés. A ceux-ci on étéajoutés2mLdeméthanol (gradeanalytique,Scharlau).Le toutaétéagitéà1000rpmdurant15minavecunvortexMultiReaxHeidolph,puiscentrifugéà2500rpmdurant10minà l’aided’une centrifugeuseThermoelectronCorporation.Le surnageanta été récupéré.Le culot a étéépuisé en répétant une deuxième et une troisième fois l’ajout de méthanol, l’agitation et lacentrifugation. Les surnageants poolés constituent l’extrait méthanolique. Afin de concentrerl’extrait,leméthanolaétéévaporésousbalayaged’azoteetlecontenusecaétéreprisdans2mLdeméthanol. Enfin, dans le but de se défaire de toute traced’huile éventuellement récupéréeaveclesurnageant,l’extraitaétécentrifugéunedernièrefoisà2500rpmdurant2minutes.

40

TeneurtotaleencomposésphénoliquesparFolin-Ciocalteu

La teneur en composés phénoliques totaux des huiles peut être mesurée à l’aide d’un testspectrophotométriqueutilisant leréactifdeFolin-Ciocalteudont lacolorationvireaubleuunefois réduit. Cette coloration bleue est donc proportionnelle au taux de composés phénoliquesprésentsdans l’extrait.Leprotocolesuiviestexpliquéci-après.Unvolumede0,1mLd’extraitméthanoliqueaétémisenprésencede0,5mLunesolutionderéactifdeFolin-Ciocalteau(réactifde Folin & Ciocalteu 2 N, Sigma-Aldrich) dilué dix fois dans l’eau, et après deux minutesd’incubation,2mLd’une solutionaqueusedeNa2CO3 (VWR)1,9Mafind’augmenter lepHdumilieu et ainsi colorer le réactif de Folin-Ciocalteu. Le tout a incubé 3min à l’obscurité avantd’êtresoumisàunemesurespectrophotométriqueponctuelleà760nm.LespectrophotomètreutiliséestunGEHealthcareUltraspec7000.

Cependant,cetestn’apaspuêtremenéàbienétantdonnélaformationd’émulsiondèsl’ajoutd’une solutionaqueuse.L’émulsion causeune interférence considérable rendant impossible lamesured’absorbancedumilieuréactionnel.Ilenaétédéduitqueleproblèmeétaitlamoléculed’anéthol. En effet, celle-ci est présente dans les huiles8et est responsable d’un phénomèneappelé«l’effetouzo»,autrementditdelaformationd’uneémulsionlorsd’ajoutd’eau.(Carteauetal.,2007)Afinderéglerceproblème,l’ajoutdesolutionsaqueusesdoitétéévité.LeréactifdeFolin-Ciocalteuadoncétésolubilisédans l’acétone.Encequiconcerne lasolutionbasiqueparcontre,iln’apasétépossibled’enpréparerunedansunautresolvant.

ProfilencomposésphénoliquesparHPLC

Le profil en composés phénoliques d’un échantillon peut être étudié en séparant ceux-ci parchromatographie en phase liquide couplée à un détecteur UV à barrette de diode HPLC-DAD(HighPerformance Liquid ChromatographywithDiode-ArrayDetection). L’appareil utilisé estunAgilent1200QuaternaryPump1munid’unecolonneC18KinetexPFP100x4,5mm,2,6µm(Phenomenex) et d’un détecteurMWD (MultiWavelengthDetector). Les longueurs d’onde demesuresont250,280,315et370nm(280nmuniquementestsuffisant).Unvolumede10µLd’échantillon a été injecté. Un débit de solvant de 1,5 mL/min a été maintenu suivant leprogrammed’analyseprésentédansletableau12.

Tableau12:ProgrammedeséparationdescomposésphénoliquesparHPLC

t(min)

SolvantA:H2O+0,1%HFo

SolvantB:ACN+0,1%HFo

0 95 56 95 513 80 2017 40 6019 0 10020 0 10021 95 525 95 5

8L’anéthol est un composant retrouvé dans les huiles essentielles des plantes étudiées. Cettemolécule a été identifiée lors d’analyses par chromatographie en phase gazeuse des huilesétudiées(cfr.Résultatsetdiscussion:Profilsenacidesgras,p.46)

41

Afin de pourvoir interpréter les chromatogrammes, autant d’un point de vue qualitatif quequantitatif,ilfautdisposerdestandardspurs.Lesstandardsutiliséssont:acideférulique(≥98%,Fluka),acidep-coumarique(≥98%,Fluka),quercétinedihydratée(≥98%,Fluka),rutine(≥90%,Fluka), catéchinehydratée (≥96%,Fluka), acide chlorogéniquedihydraté (≥98%,Fluka), acidecaféique (≥99%, Sigma-Aldrich), acide sinapique (≥97%, Fluka), acide cinnamique (Fluka) etlutéoline(Fluka).

Premièrement,dessolutionsdetémoinsseulsà0,05mg/mLontétéinjectéesafindeconnaîtreleurs temps de rétention et pouvoir identifier les différents composés contenus dansl’échantillon. Ensuite, des solutions mix contenant les différents témoins à différentesconcentrations sont injectées afin de pouvoir construire une droite d’étalonnage reliant l’airesous lespicsauxconcentrations.Eneffet,chaquecomposépeutplusoumoinsabsorberàunecertainelongueurd’ondeetprésenteruneréponsedifférente,unedroited’étalonnagespécifiqueàchaquecomposéestdoncnécessaire.

Depluss’estposélaquestionduchoixd’unstandardinterne.Eneffet,étantdonnélafaçondontles extraits méthanoliques ont été obtenus, des pertes sont inévitables. L’utilisation d’unstandardinterneestdèslorsindispensablepourprocéderàunequantificationprécise.Pourcela,lesextraitsméthanoliquespréparéscommeexpliquéci-dessussont injectésunepremièrefois.Avantd’être injectés, lesextraitsontétéfiltréssurfiltresdeporositéde0,2µm(PTFEsyringefilters0,22µm–13mm,ROCC).Lestandardchoisiestuncomposéphénoliquenonprésentdansl’échantillon. De nouveaux extraits méthanoliques sont alors préparés selon la mêmeméthodologie,avecajoutd’unequantitéexactementconnuedestandard interne(petitvolumed’unesolution1mg/mLdustandardchoisi)justeaprèslapeséedel’huile.Levolumeintroduitest fonctionde l’airedupicobtenu lorsde l’injectiondu témoin seul, afinque l’airedupicdestandardinternedansl’extraitfinalementobtenusoitdumêmeordredegrandeurqueceuxdescomposésphénoliquesprésentsdansl’échantillon.Danscetravail,100ou200µLd’unesolution1mg/mLontétéajoutéàl’huile.

Activitéanti-oxydante

Lamesurede l’activitéantioxydantes’est faiteparspectrophotométrieà l’aideduradical libreDPPH(2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle).Ce composéprésenteunecolorationviolette intenseàl’état oxydé qui vire au jaune lorsqu’il est réduit. Cette décoloration est proportionnelle àl’activité antiradicalaire de l’extrait avec lequel il réagit. Elle est mesurée parspectrophotométrieàlalongueurd’ondeabsorbéeparleDPPHviolet.

Afindemesurersonactivitéantiradicalaire,l’extraitestdilué100foisdansduchloroforme.Unvolumede500µLdecetextraitdiluésontmisenprésencede500µLd’unesolutiondeDPPH(Sigma-Aldrich)environ2.10-4Mdansduméthanol.Lemilieuréactionnelincube30minutesàl’obscurité.Aprèscela,unemesureponctuellede l’absorbancedumilieuréactionnelà517nmest effectuée. Le spectrophotomètre utilisé est un GE Healthcare Ultraspec 7000 et leprogrammeinformatiqued’analyseResolution.

Le témoin de réaction positive met en présence 500 µL de chloroforme (grade analytique,Scharlau)et500µLdesolutiondeDPPHetletémoinderéactionnégative500µLd’unesolutionde trolox (acide (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tétramethylchromane-2-carboxylique, Sigma-Aldrich) et500µLdesolutiondeDPPH.Eneffet, letroloxestunantioxydantreconnupouvantêtreutilisécommeréférence.

Cette analysea été répétée trois fois sur chacunedes trois extractionsde chaquegrainede lafaçonsuivante:unedilutionaétépréparéepourchaqueextrait,puistroisrépétitionsdemiseenprésencedeDPPHetdemesurespectrophotométriqueaétéeffectuéesurchaquedilution.

42

L’activitéantiradicalaireestexpriméedemanièrerelativeparcomparaisonàunantioxydantderéférence.Toutd’abordl’absorbancecorrigéeestcalculée,tenantcomptedesvaleursdesdeuxtémoinsderéactionpositiveetnégative.(Equation6)

Équation6:Absorbancecorrigéed'unéchantillon

𝐴𝑏𝑠!"## =𝐴𝑏𝑠é!! − 𝐴𝑏𝑠!é!".!𝐴𝑏𝑠!é!"! − 𝐴𝑏𝑠!é!".!

Ensuite,l’activitéantiradicalaireaétécalculéeselonl’équation7suivante:

Équation7:Activitéantiradicalaired'unéchantillon

% 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒 = !"#!"##, !é!" !!!"#!"##, é!!!"#!"##, !é!" !

× 100

4. Traitementsstatistiquesdesrésultats

Lesmoyennesetécarts-typesontétécalculésàl’aideduprogrammeMicrosoftExcel.

Lestraitementsstatistiquesdesdonnéesconsistentendescomparaisonsdemoyennes.Celles-ciontétéeffectuéesàl’aidedulogicielMinitab17.L’égalitédesmoyennesaététestéeparanalysede la variance à un facteur avec unα = 0,05 (les facteurs étant successivement le rendementmassique, la concentration en acides gras, en stérols et l’activité antioxydante). LesstructurationsdemoyennesontétédéterminéesparcomparaisondeFisher.Pours’assurerdelavaliditédesconclusionsobtenues,lesconditionsd’applicationdenormalitédespopulationsetd’égalitédeleursvariancesontétévérifiéespartestdeRyan-Joineretd’analysedelavariancerespectivement.

Afindecomparerlesgrainesentreelles,lesrésultatsobtenuspourchaqueméthoded’extractionontétécomparésindividuellement.Ensuite, l’impactdesméthodesd’extractionaétéétudiéencomparantlesrésultatsobtenuspourchacuned’entreelles,séparémentpourchaquegraine.

43

RÉSULTATSETDISCUSSIONS

1. Teneurenmatièresèchedesgraines

Les graines de fenouil sont constituées de 93,173 ± 0,097 g de matière sèche sur 100 g dematière fraiche, les graines d’anis vert de 94,479 ± 0,061 g/100 g et celles de carvi de94,135±0,050g/100g.

2. Extractionsdeshuiles

Généralités

Lesrendementsmassiquesd’extractiondeshuilesontétécalculéssurbasedestroisrépétitionseffectuéespourchacunedesméthodesd’extraction.Legraphiquesuivant(Figure17)illustrelesmoyennes et écarts-types obtenus sur matière fraiche à partir de ces trois répétitions. Untableaureprenant lesvaleursexactessurmatière fraicheet surmatièresècheestprésentéenannexe.(Annexe2)

Figure 17 : Rendements massiques d'extraction des huiles des différentes graines par les différentesméthodesd'extraction

Sur base de ce graphique, il parait évident que les rendements massiques d’extractionprésentent des différences autant en fonction des graines que des méthodes d’extraction.Néanmoins,lesrendementssesituenttoujoursauxalentoursde10à20%(gd’huilepour100gde graines fraiches). Cela correspond aux données récoltées dans la littérature. En effet,(Kleimanetal.,1982),(Malhotra,2012a),(Ratheretal.,2016),(Özgüven,2012)et(Khanetal.,

0

5

10

15

20

25

30%rendementmassique

(ghuile/100gmalèrefraiche)

Fenouil-Anis-Carvi

Rendementsmassiquesd'extrac_ondesdifférentesgrainespardifférentesméthodesd'extrac_on

FenouilSox.Hexane

FenouilFolch

FenouilCO2-SC

FenouilSox.Me-THF

AnisSox.Hexane

AnisFolch

AnisCO2-SC

AnisSox.Me-THF

CarviSox.Hexane

CarviFolch

CarviCO2-SC

CarviSox.Me-THF

44

2016a)présententtousdesteneuren lipidesallantde10à25%pour lesgrainesdecestroisplantes(voirci-dessous).

Comparaisondesplantes

Indépendammentdelaméthoded’extraction,lesgrainesd’anissemblentrenfermerplusd’huileque celles de fenouil, puis celles de carvi. Les études statistiques9confirment que les grainesd’anisdélivrentsignificativementplusd’huilequecellesdefenouiletdecarviqui,quantàelles,neprésententpasdes teneurssignificativementdifférentes.Cesconclusionsontpuêtre tiréespourchacunedesméthodesd’extractions(misàpartpourleSoxhletàl’hexanepourlequellesmoyennesnesontpassignificativementdifférentes).PourlaméthodedeFolch,quisembleêtrela plus efficace pour extraire les lipides, les graines d’anis contiennent jusqu’à 22,7 ± 1,8 gd’huile par 100 g de graines fraiches, alors que 100 g de graines de fenouil et de carvi nedonnentque18,6±1,7get18,6±0,6gd’huile.

Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par (Kleiman et al., 1982) qui attribuent auxgrainesd’anisvertuneteneurenlipidesde24%(g/100gmatièresèche),24%auxgrainesdefenouiletàcellesdecarvide19%.D’autrestravauxontégalementmesurélesteneursenhuilesdecesplantes.(Malhotra,2012a)attribueuneteneurenlipidesde14,9get(Ratheretal.,2016)de10gpar100gdegrainesdefenouil,(Özgüven,2012)8à16g/100gpourlesgrainesd’aniset(Khanetal.,2016b)14,6g/100gpourlesgrainesdecarvi.

Comparaisondesméthodesd’extraction

En ce qui concerne la comparaison desméthodes d’extraction, celles présentant lesmeilleursrendements en huiles sont laméthode conventionnelle de Folch et laméthode alternative deSoxhlet utilisant le 2-méthyltétrahydrofurane comme solvant. Celles-ci délivrent desrendements significativement supérieurs auxdeux autresméthodes et ne sont entre ellespassignificativementdifférentes.Demême,leSoxhletàl’hexaneetl’extractionauCO2supercritiqueneprésententpasdedifférencessignificativesentreelles.

Pourlestroistypesdegraines,l’extractionparSoxhletàl’agro-solvantaboutiàdesrendementsmassiques en huile supérieurs à ceux obtenus avec par Soxhlet à l’hexane, qui est le solvantclassiquement utilisé pour l’extraction de lipides. Les valeurs appuyant ces propos sont desrendementsenhuilede17,6±0,5g/100ggrainesfraichespourl’extractiond’huiledefenouilauMeTHF comparativement à 16,1 ± 1,3 g/100 g pour l’hexane, 22,4 ± 0,7 g/100 gcomparativementà15,5±2,6g/100gpourl’aniset16,7±1,4g/100gcomparativementà12,6±0,2g/100gencequiconcernelecarvi.Cesrésultatssontencourageantsétantdonnél’objectifdece travailquiestde trouveruneméthoded’extractiondeshuilesalternativeauxméthodesconventionnelles. En effet, ils montrent que l’agro-solvant 2-méthyltétrahydrofurane est plusefficacequel’hexanepourl’extractiondeslipides.(Breiletal.,2016)onttravaillésurdifférentséco-solvantspourextraireleslipidesdelevures.Dansleurstravaux,lesrendementsmassiquesd’huile récupérée avec l’extraction au MeTHF sont supérieurs à ceux obtenus avec l’hexane(15,94±0,44g/100get14,03±0,67g/100grespectivement).

9Untableaurécapitulatifreprenantlesrésultatsdesanalysesstatistiqueseffectuéesestannexéautravail.(Annexe19)

45

Lesquantitésd’huileobtenuesauCO2 supercritique sontpar contre lesplus faibles.Celapeutêtredûaufaitqueladuréed’extractionestpluscourtequepourlesautresméthodes.Eneffet,cette méthode d’extraction n’est pas encore totalement optimisée. Les rendements obtenussemblent cependantplusélevésqueceux référésdans la littérature. (Zekovicetal.,2016)ontobtenupourmeilleurrendementmassique7,16gd’huilepour100gdegrainesdecoriandre,quiappartientégalementàlafamillebotaniquedesApiacées.

Cependant, ces résultats ne sont que des premiers résultats, les compositions et activitésantioxydantesdecesextraitssontégalementdes informationsdécisivesdans lechoixde l’uneoul’autreméthode,enfonctiondel’applicationàlaquellel’huileestdestinée.

3. Caractérisationdeshuiles

Profilsenacidesgras

Fenouil

Desexemplesdechromatogrammesobtenuspourlaséparationdesestersméthyliquesd’acidesgrasdeshuilesextraitesparlesquatreméthodesd’extractiondifférentessontprésentésdanslafigure18ci-dessous.

46

Figure18:ChromatogrammesdeséparationdesEMAGdeshuilesextraitesdefenouil(a)parlaméthodede Soxhlet à l’hexane, (b) par laméthode de Folch, (c) au CO2 supercritique et (d) par laméthode deSoxhletau2-méthyltétrahydrofuraneLespicsidentifiéscorrespondentauxestersméthyliquesdesacidesgras(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0.

Lasimpleobservationdeceschromatogrammesdonnedéjàplusieursinformations.

Premièrement, les huiles extraites contiennent des acides gras de chaines allant de 14 à 20atomesdecarbone.Ilapparaîtégalementtrèsclairementquelesacidesgraslesplusabondantssont ceux possédant des chaines à 18 atomes de carbone et une insaturation, suivis des C18présentant deux insaturations, puis des C16 saturés. Les autres acides gras identifiés sontprésentsenmoindresquantités.

Ensuite,l’alluredecesquatrechromatogrammesesttoujourssimilaire,cequilaisseraitvoudraitdirequelaméthoded’extractionn’affecteraitpasoupeulesprofilsenacidesgrasdel’huile,d’unpointdevuerelatif.10

Enfin, ilestànoterque leschromatogrammesprésententégalementdespicscorrespondantàdescomposésautresquedesacidesgras.LeshuilesobtenuesparlaméthodeconventionnelledeSoxhletàl’hexanesontlesplusconcernéesparcesautrespics.Cetteméthodeseraitdoncmoinssélective et extrairait un plus large panel de molécules. Des composés issus des huilesessentiellesdesplantesontentreautreétéidentifiésgrâceauxspectresdemasse.L’anéthol,lecomposémajeurdel’huileessentielledegrainedefenouilaétéidentifiéàuntempsderétentionde6,9min.L’anisole,unfragmentdecettedernièremolécule,reconnuparsonpicà5,6min,estprésentenquantitésnonnégligeablesdansleshuiles.Unchromatogrammeprésentantcespicsest annexé au travail. (Annexe 3) Les méthodes d’extraction utilisées visant à extraire lescomposés apolaires, il est normal de retrouver des composés de l’huile essentielle dans leshuilesextraites.

10 Pour rappel, les résultats ont été interprétés de manière relative, comme expliquéprécédemment.Cependant,uneanalyseavecstandardinterneaétéeffectuéeparlasuite.

47

Comme expliqué dans la partie matériel et méthode, les résultats ont été traités de manièrerelative. Le tableau 13 ci-dessous reprend lesmoyennes et écarts-types des contributions dechaqueacidegras identifiéaux teneurs totalesenacidesgrasdeshuilesde fenouil. Il reprendégalementlesvaleursretrouvéesdanslalittérature.

Tableau13:Pourcentagesrelatifsdesdifférentsacidesgrasparrapportàlateneurtotaledansleshuilesextraitesdefenouil

Acidegras

Soxhlethexane(%)

Folch(%)

CO2-SC(%)

SoxhletMeTHF(%)

(Kleimanetal.,1982;Kootietal.,2015)

C14:0 0,09±0,01 0,09±0,02 - - -C16:0 4,96±0,12 5,29±0,07 5,12±0,17 5,06±0,062 4et5C16:1 0,44±0,01 0,46±0,02 0,78±0,03 0,73±0,022 -C18:0 1,37±0,03 1,40±0,03 0,96±0,14 0,87±0,037 1,2C18:1 80,93±0,39 80,72±0,15 80,12±0,23 82,00±0,15 n-12:60et72,9

n-9:22et8,7C18:2 11,31±0,23 11,21±0,05 12,10±0,10 11,10±0,14 14et11C18:3 0,51±0,02 0,54±0,01 0,65±0,01 0,45±0,01 -C20:0 0,37±0,04 0,31±0,01 0,26±0,06 0,21±0,04 -

Les proportions d’acides gras obtenues lors des analyses sont en accord avec les valeurstrouvéesdanslalittérature.

Touslesextraitsdefenouilcontiennentenviron80%deC18:1.IlestànoterquelesacidesgrasC18:1sontprésentssousformesdedifférentsisomèresdepositiondansleshuilesobtenues.Eneffet, comme exprimé dans la partie bibliographique, l’acide pétrosélinique, (18:1 n-12) estl’acide grasmajoritaire des plantes issues de la famille des Apiacées. Les graines contiennentégalement de l’acide oléique (C18:1 n-9). La colonne utilisée pour la séparation des EMAGmesurant 30 m seulement, elle ne permet pas une bonne séparation de ces isomères trèssemblables. Il est possible sur certains chromatogrammes d’observer une séparation du picC18:1,mais cela n’est pas toujours le cas. Lorsque c’est le cas, les pics peuvent être intégrésmanuellement.L’annexe4montreuneséparationdepicC18:1bienrésolue.

L’extraction par Soxhlet au 2-méthyltétrahydrofurane extrait une proportion très légèrementmais significativementplusélevéedeC18:1 (82%).Quantà l’extractionauCO2supercritique,elle donne des huiles contenant significativement légèrement moins de C18:1, maissignificativement légèrementplusdeC18:2etC18:3.C’estd’ailleurs laméthodequidélivre leshuileslesplusrichesenC18:2.Enrèglegénéral,lesC18:2représentent11à12%delateneurtotale en acides gras, cequi en fait lesdeuxièmeacides gras lesplus abondantsdeshuilesdefenouil.LeshuilesproportionnellementlespluspauvresenC18:2sontcellesobtenuesparFolchetSoxhletauMeTHF.Encequiconcernel’acidestéarique(C18:0),desproportionsplusélevéessemblent être obtenues avec les méthodes d’extraction conventionnelles. Cependant, il estdifficile d’affirmer la significativité de ces différences étant donné que les conditionsd’applicationduteststatistiqued’analysedelavariancenesontpasrespectées.

L’acidepalmitique(C16:0)estletroisièmeacidegrasleplusimportantentermesdeproportion.Ilcomptetoujourspourenviron5%delateneurtotale.SaproportionestplusélevéedansleshuilesobtenuesparlesméthodesdeFolch,suiviesdecellesauCO2supercritique.Saproportionest la plus faible dans les huiles obtenues par Soxhlet au MeTHF. L’acide gras insaturé à 16atomesdecarbonereprésentedanstoutesleshuilesmoinsde1%delatotalitédesacidesgras.

48

L’acide myristique (C14:0) n’a pas été détecté lors des analyses des extraits obtenus par lesméthodesd’extractionalternatives.Celapeutêtreexpliquépar le faitquecesderniersontétéinjectésdessemainesplus tardsur lacolonne.Entre temps,des triglycéridesnonestérifiéssesontaccumulésentêtedecolonne,provoquantunerésolutiondiminuée(décalagedestempsderétentionetaplatissementdespics).Lespicsplusaplatisn’ontdoncpasétédétectésmaisl’acidemyristiqueestbienprésentdanscesextraits(cfr.Teneursenacidesgrasp.53-54).

Les méthodes alternatives conduisent également à des proportions plus faibles en acidearachidique(C20:0).11

Anisvert

Un profil d’acides gras obtenu par chromatographie pour un extrait d’anis vert obtenu parSoxhlet à l’hexane est présenté dans la figure 19 ci-dessous. Les chromatogrammescorrespondants aux huiles extraites par les différentes méthodes d’extraction ne sont pasprésentésicicarilssontpeudifférents.Ilssonttoutdemêmeannexésautravail.(Annexe5)

Figure19:ChromatogrammedeséparationdesEMAGd’unehuileextraited’anisvertparlaméthodedeSoxhletàl’hexane

Lespicsidentifiéscorrespondentauxestersméthyliquesdesacidesgras(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0.

Les acides gras C18:1 sont les plus abondants, suivis des C18:2. Les C16:0 sont égalementprésentsmais en plus faible quantité, ainsi que les C14:0, C16:1, C18:0, C18:3 et C20 en plusfaiblesquantitésencore.

11Lepiccorrespondantàl’acidearachidiquen’estpastoujoursbienrésolu.Il formeparfoisunpic très aplati avec d’autres composés et a donc du être intégrémanuellement. L’intégrationn’estdèslorspastoujourstrèsprécise.

49

Le tableau 14 suivant reprend les moyennes et écarts-types des concentrations relatives enacidegrasdeshuilesd’anisvert,ainsiquelesvaleursretrouvéesdanslalittérature.

Tableau14:Pourcentagesrelatifsdesdifférentsacidesgrasparrapportàlateneurtotaledansleshuilesextraitesd’anisvert

Acidegras

Soxhlethexane(%)

Folch(%)

CO2-SC(%)

SoxhletMeTHF(%)

(Kleimanetal.,1982;Özgüven,

2012)C14:0 0,12±0,02 0,12±0,04 - - -C16:0 4,31±0,03 4,78±0,19 4,81±0,51 4,12±0,02 5et10C16:1 0,51±0,11 0,60±0,02 0,86±0,08 0,73±0,04 -C18:0 0,95±0,01 1,11±0,17 0,80±0,04 0,65±0,02 -C18:1 70,23±0,22 69,67±0,33 68,37±0,99 70,42±0,09 n-12:50et70

n-9:22et28C18:2 23,25±0,15 22,99±0,34 24,32±0,41 23,36±0,07 5et21C18:3 0,54±0,01 0,56±0,03 0,69±0,06 0,55±0,02 -C20:0 0,12±0,01 0,13±0,01 0,13±0,02 0,16±0,03 -

LesacidesC18:1représententdans leshuilesd’anisenviron70%de lacomposition totaleenacidesgrasetlesC18:2de23à24%.LesproportionslesplusélevéesenC18:1sontobtenuesaveclesextractionsàchaud.Commepourleshuilesdefenouil,l’extractionauCO2-SCdélivredeshuilesproportionnellementlégèrementmoinsrichesenC18:1,maiségalementlégèrementplusriches en acides gras C18 polyinsaturés. Les huiles les plus pauvres en C18:2 sont cellesobtenuesparlesméthodesconventionnelles.L’acidestéarique(C18:0)comptepourenvironuncentième de la composition totale en acides gras. Il semble plus important dans les huilesextraitesparlaméthodedeFolch.

La proportion en acide palmitique (C16:0) est légèrement inférieure à 5 %. Elle estsignificativementplusélevéeaveclesextractionsparFolchetauCO2-SC.L’acidegrasC16:1estprésententrèsfaibleproportiondanslesdifférentsextraits,représentantmoisde1%.

L’acidemyristique(C14:0)estprésententrèsfaiblesproportionsetn’estpasnonplusdétectépourleshuilesobtenuesparlesméthodesalternatives.L’acidearachidique(C20:0)représenteégalementdefaiblespourcentages.Lescontributionsdecesdeuxacidesàlacompositiontotaleenacidesgrasnedépassentpasnonplus1%.

50

Carvi

Unprofilchromatographiqueenacidesgrasd’unehuiledecarviobtenueparSoxhletàl’hexaneest présenté dans la figure 20 ci-dessous. Les chromatogrammes des huiles obtenues par lesautresméthodessontprésentésdansl’annexe6.

Figure 20: Chromatogramme de séparation des EMAG d’une huile extraite de carvi par laméthode deSoxhletàl’hexane

Lespicsidentifiéscorrespondentauxestersméthyliquesdesacidesgras(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0.

L’acideC18:1esttoujoursleplusabondant,maisladifférencedeproportionavecl’acideC18:2estmoinsélevée.L’acidepalmitiqueesttoujoursletroisièmeacidegrasleplusabondantetlesautresacidesgrassontprésentsenplusfaiblesproportions.

Lesmoyennesetécarts-typesdespourcentagesenacidesgrassontprésentésdansletableau15,quireprendégalementlesvaleurstrouvéesdanslalittérature.

Tableau15:Pourcentagesrelatifsdesdifférentsacidesgrasparrapportàlateneurtotaledansleshuilesextraitesdecarvi

Acidegras

Soxhlethexane(%)

Folch(%)

CO2-SC(%)

SoxhletMeTHF(%)

(Kleimanetal.,1982;Khanetal.,2016a)

C14:0 0,11±0,01 0,13±0,05 - - -C16:0 5,31±0,04 5,73±0,16 5,33±0,02 5,03±0,03 4et5C16:1 0,20±0,02 0,29±0,07 0,66±0,03 0,61±0,02 -C18:0 1,79±0,02 1,97±0,17 1,51±0,11 1,23±0,09 1C18:1 58,13±0,12 58,53±0,31 57,88±0,21 59,08±0,10 n-12:30et43

n-9:15et25C18:2 33,21±0,04 32,31±0,10 33,34±0,21 33,14±0,04 34et37C18:3 0,87±0,02 0,70±0,01 0,88±0,02 0,68±0,02 -C20:0 0,37±0,02 0,34±0,01 0,36±0,05 0,19±0,04 -

Les extraits de carvicontiennent unpeumoins de 60%deC18:1 et unpeuplus de 30%deC18:2. Une fois de plus, les huiles obtenues à l’aide de 2-méthyltétrahydrofurane sontsignificativement proportionnellement plus riche en C18:1. Inversement, et comme pour lesdeux autres graines, l’extraction au CO2 supercritique donne une huile contenantproportionnellement un peu moins de C18:1 mais légèrement plus de C18:2 et 18:3. L’huileproportionnellementlamoinsricheenC18:2estcelleobtenueparlaméthodedeFolch.L’acidestéarique représente dans toutes les huiles environ1 à 2%de la composition en acides grastotaux.

51

L’acidepalmitiquecomptepourenviron5%delatotalitédesacidesgras.LaméthodedeFolchsemble donner des huiles contenant proportionnellement légèrement plus d’acide palmitiquequelesautresméthodes,maiscelanepeutêtreaffirmécarlesconditionsd’applicationdestestsstatistiquesnesontpasvérifiées.

L’acidemyristique et l’acide arachidique sont présents en faibles proportions dans toutes leshuiles,nereprésentantmêmepas1%delacompositiontotalesenacidesgras.


Le graphique ci-dessous (Figure 21) est une manière plus visuelle de représenter lespourcentagesmoyensdesacidesgrasretrouvésdanslesdifférenteshuiles.

Figure21:Profilsenacidesgrasdesdifférentsextraitslipidiquesdesgrainesdefenouil,anisvertetcarvi

Fe:fenouil,An:anisvert,Ca:carvi,et(S):Soxhletàl’hexane,(F):Folch,(C):CO2-SCet(T):SoxhletauMeTHF

Danslestroisgraines,lesacidesgrasC18:1représententlamajoritédesacidesgrastotaux.Eneffet, l’acide gras pétrosélinique (C18:1n-12) est l’acide grasmajoritaire caractéristiquede lafamilledesApiacées.Celaaétéconfirmépardenombreuxtravauxeffectuéssur lesplantesdecettefamillebotanique.(Kleimanetal.,1982;Malhotra,2012a,2012b;Özgüven,2012;Ratheretal.,2016)attribuenttousdescontributionsdecetacidegrasparticulierauxAGTallantde30à43%pour le carvi,50à70%pour l’anisvertet60à73%pour le fenouil. LaproportionenC18:1 contenus dans les huiles des différentes graines est donc un critère de comparaisonintéressant. Les graines de fenouil en contiennent proportionnellement significativement plusque les grainesd’anis, qui à leur tour en contiennentplusque cellesde carvi. Inversement, lecarvicontientproportionnellementsignificativementplusdeC18:2quel’anisetquelefenouil.IlpeutégalementêtreobservéquelaproportionenC18entrelesdifférentesgrainesestconstante.Eneffet,dans toutes lesgraines, lesacidesgrasC18saturéset insaturés représententplusde90%delacompositiontotaleenacidesgras,etlorsqu’uneplantecontientmoinsdeC18:1(60à80%),ceux-cisontcompensésparlesC18:2,quireprésententtoujoursledeuxièmeacidegrasentermesdequantité(10à30%).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%teneurtotaleenacidesgras

Fe(S)-Fe(F)-Fe(C)-Fe(T)-An(S)-An(F)-An(C)-An(T)-Ca(S)-Ca(F)-Ca(C)-Ca(T)

Profilsenacidesgrasdesdifférentsextraits

C20

C18:3

C18:2

C18:1

C18:0

C16:1

C16:0

C14:0

52

Ensuite,letroisièmeacidegrasleplusabondantestl’acidepalmitique(C16:0)avecenviron5%pour les trois graines. Celui-ci est faiblement mais significativement plus abondant dans leshuilesdecarviquedefenouiletsignificativementencoremoinsabondantdanscellesd’anis.

LesacidesgrasC18:0etC18:3sontprésentsenmoindresquantités.L’acidestéarique (C18:0)comptetoujourspourenviron1%delacompositiontotaleenacidesgras.Ilsembleplusélevédansleshuilesdecarviquedanscellesdefenouil,l’huiled’anisétantlapluspauvreencetacidegras.Cependant,aucuneconclusionstatistiquenepeutêtretiréeétantdonnélanon-vérificationdes conditions d’application des tests. L’acide gras C18:3 est présent en des proportionslégèrement plus faibles. Les huiles de carvi sont significativement relativement plus riches enC18:3queleshuilesd’anisetdefenouil.

Le rapport entre les acides gras insaturés et saturés peut constituer un autre critère decomparaison. Leshuilesdes trois graines contiennent toutedix à vingt fois plusd’acides grasinsaturésqued’acidesgrassaturés.L’anisprésentelesrapportslesplusélevés,suividufenouilpuisducarvi.

Ilestjudicieuxderappelerquetouscesrésultatsnepeuventêtrecomparésquedefaçonrelative.Ilsnedonnentaucuneinformationquantàlateneurtotaleenacidesgrasdesleshuiles.L’huiled’unecertainegrainepeutcontenirproportionnellementmoinsd’acidegrasC18:1qu’uneautremais en contenir tout de même plus, si la teneur totale en acides gras est plus élevée. C’estpourquoi de nouvelles analyses ont été effectuées ultérieurement avec ajout d’un standardinterne.Lesrésultatsdecelles-cisontabordéesdanslepointsuivant«Teneursenacidesgras».

Comparaisonsdesméthodesd’extraction

Lacompositionrelativeenacidesgrasdeshuilesnesembleêtrequepeuaffectéeparlaméthoded’extraction.Quelqueslégèresdifférencespeuventcependantêtreobservées.

Encequiconcernel’acidegrasmajoritaireC18:1,sonextractionestfavoriséeparleMeTHF.Eneffet, ces huiles contiennent des teneurs significativementplus élevées en cet acide graspourchaquetypedegraines.Cependant,celanesemblepasenaccordaveclestravauxde(Breiletal.,2016)quiretrouventuneproportionlégèrementmoindreenC18:1danslesextraitsobtenusauMeTHFcomparativementàceuxobtenusàl’hexane.LeCO2-SCsembleparcontreextrairemoinsde C18:1 que les autres acides gras car ces huiles en sont toujours significativementproportionnellementlespluspauvres.Pourtant,selon(Sahenaetal.,2009), lateneurenC18:1estaugmentéelorsd’extractionparCO2-SCencomparaisonavecuneextractionparSoxhlet.

LesextractionsauCO2-SCpermettentunrecouvrementplusélevépourlesautresacidesgrasà18 atomes de carbone. Les acides gras C18:2 semblent proportionnellement plus importantsdans les huiles obtenues à l’aide de CO2 supercritique. Il n’est cependant pas possible del’affirmerentermesdestatistiquescarlesconditionsd’applicationdutestnesontpasvérifiées.Les méthodes de Folch et de Soxhlet au MeTHF semblent quant à elles donner des huilesproportionnellementpluspauvresenC18:2.Pourl’acidestéarique, lesconclusionsstatistiquesne sont pas non plus solides pour lesmêmes raisons. Cependant, il semblerait que les huilesobtenues par Folch soient les plus riches en cet acide gras et celles obtenus par Soxhlet auMeTHFlespluspauvres.L’acidegrasC18:3estsignificativementplusimportantdansleshuilesobtenuesauCO2-SC.Dans lecasducarvi, l’hexanedonnedeshuilesà teneurssemblables.LeshuileslespluspauvresenC18:3sontobtenuesparSoxhletauMeTHF.

DesproportionslégèrementmaissignificativementsupérieuresenC16sontretrouvéesdansleshuiles extraites par Folch. L’extraction au CO2-SC la talonne, les huiles obtenues par cetteméthodeprésententdesproportionssignificativementplusfaiblesdans lecasdufenouiletducarvi.LaméthodedonnantleshuileslespluspauvresenC16estleSoxhletauMeTHF.

53

Toutes ces différences sont minimes mais souvent significatives. Celles-ci s’expliquent sansdouteparlapolaritédessolvantsutilisés.Chaqueacidegraspossédantunepolaritéintrinsèque,ilestplusoumoinssolubledans,etdoncextractiblepar,uncertainsolvant.

Teneursenacidesgras

Etant donné que les compositions en acides gras ont déjà été développées précédemment entermesdeproportions,ilestsurtoutintéressantd’abordericilateneurtotaleenacidesgrasdesdifférentes huiles. En effet, une extraction pourrait favoriser l’extraction des acides gras plusqu’uneautreetdonnerdeshuilesplusrichesenacidesgras.

Fenouil

Leschromatogrammesobtenuspour lesanalysesavecstandard interne (triglycéridesdeC17)sontlesmêmesqueceuxobtenuslorsdesanalysesprécédentes,sicen’estqu’ilscontiennentunpicsupplémentaire,correspondantàl’esterméthyliqued’acidegrasC17.Leprofild’unehuiledefenouilextraiteparSoxhletàl’hexaneestprésentédanslafigure22.

Figure22:ChromatogrammedeséparationdesEMAGd’unehuileextraitedefenouilparlaméthodedeSoxhletàl’hexane.

Les pics identifiés correspondent aux acides gras (1) C14:0, (2) C16:0, (3) C16:1, (4) C17:0, (5) C18:0,(6)C18:1,(7)C18:2,(8)C18:3et(9)C20:0.

Les méthodes d’extraction alternatives donnent des huiles significativement plus riches enacides gras que les méthodes conventionnelles. En effet, les huiles obtenues à l’aide de2-méthyltétrahydrofuranecontiennent896,68±35,74mgd’acidesgras totauxpargd’huileetcellesobtenuesauCO2 supercritique827,84± 110,02mg/g,alorsque leshuilesobtenuesparSoxhletàl’hexaneetparlaméthodedeFolchencontiennent706,02±43,24mg/get744,36±35,01 mg/g respectivement. Les teneurs des huiles obtenues par CO2-SC et Folch ne sontcependantpassignificativementdifférentes.

Ungraphiqueetuntableauprésentantlesmoyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasprésents dans les huiles sont annexés au travail pour des informations plus approfondies.(Annexes7et8)

54

Anisvert

Danslecasdeshuilesd’anisvert, leshuiles issuesdesméthodesd’extractionalternativessontégalement plus riches en acides gras totaux. Les huiles obtenues par MeTHF et au CO2-SCprésententdesteneursenacidesgrasde729,55±70,49mg/ghuileet756,294±145±07mg/g.Celles obtenues à l’hexane et par la méthode de Folch sont caractérisées par des teneurs de669,85±32,95mg/get693,68±20,62mg/g.Cependant,danscecas,lesdifférencesnesontpassignificativesd’unpointdevuestatistique.

Ungraphiqueetuntableaureprésentantetdétaillantlesvaleursexactessontprésentésdanslesannexes9et10.

Carvi

Unefoisdeplus,lesméthodesd’extractionspeuventêtreclasséesdanslemêmeordreentermesde richesse en acides gras des huiles qu’elles délivrent. Les huiles obtenues au MeTHFcontiennent 857,06 ± 115,04 mg d’acides gras par g d’huile, celles obtenues au CO2-SC837,38 ± 104,05 mg/g. Les huiles obtenues par les méthodes conventionnelles contiennent739,01±37,34mg/get765,58±31,20mg/gpourleSoxhletàl’hexaneetleFolch.Néanmoins,lesdifférencesnesontpassignificativesd’unpointdevuestatistique.

Ungraphiqueetuntableaudesmoyennesetécarts-typesdesrésultatssontannexés.(Annexes11et12)


Pour chaque type d’extraction, les huiles issues de carvi contiennent plus d’acides gras(73,9±3,7à85,7±11,5%)quecellesdefenouil(70,6±4,3à89,7±35,7%)quiencontiennentà leur tour plus que celles d’anis vert (67,0 ± 3,3 à 75,6 ± 14,5 %). Ces différences ne sontsignificativesquedanslecasdesextraitsobtenusparlaméthodedeFolch.


Danslesrésultatsprésentéspourchaquetypedegraine,ilressortquelesméthodesalternativesdonnentdeshuilesplusrichesenacidesgras.Eneffet,malgréquelesdifférencesnesoientpastoujours significatives, le Soxhlet au 2-méthyltétrahydrofurane est la méthode qui délivretoujours leshuiles lesplus riches en acides gras, suivi duCO2 supercritique, duFolchpuisdel’hexane. Ces résultats sont encourageant dans l’optique de remplacement des méthodesd’extractionconventionnelles.

Si la composition en acides gras plus détaillée est observée, le Soxhlet au MeTHF semblepermettreunmeilleureextractiondesC18:1(significatifdanslecasdufenouilseulement).DesquantitésplusimportantesdesacidesgrasC18:2,C18:3,C18:0etC16:0sontretrouvéesdansleshuiles obtenues par CO2 supercritique (significatif dans beaucoup de cas, mais passystématiquement).

55

Teneursetprofilsenstérols

Fenouil

Afin d’illustrer le type de profil en stérols des huiles de fenouil, les chromatogrammes deséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitssontreprisdanslafigure23.

Figure23:Chromatogrammesdeséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitsdefenouilobtenuspar(a)Soxhletàl’hexane,(b)Folch,(c)CO2-SCet(d)SoxhletauMeTHF

Lespicsidentifiéscorrespondentau(1)cholestérol,(2)campestérol,(3)stigmastérol,(4)Δ7-campestérol,(5)β-sitostérol,(6)sitostanol,(7)Δ5-avenastérol,(8)Δ7-avenastérolet(9)bétuline,SI.

56

Comme pour les analyses d’acides gras, les chromatogrammes obtenus pour chaque typed’extractionprésententdesprofilssimilaires.Septstérolsetunstanolontpuêtreidentifiésdansleshuilesdefenouil.Lesdeuxstérols lesplusabondantssont lestigmastérolet leβ-sitostérol.L’huile de fenouil contient également du campestérol, du Δ7-avenastérol, du cholestérol, dusitostanoletduΔ5-avenastérolenplusfaiblesquantités.Lafigure24reprendlesstructuresdecescomposés.

Lepiccaractériséparuntempsderétentionde27,4–27,5mincorrespondàlabétuline,stérolartificiel utilisé comme standard interne (figure16). Celui sortant au tempsde rétention22,2minn’apaspuêtreidentifiémaisnesemblepascorrespondrepasàunstérol.

Stigmastérol β-sitostérol Campestérol

Cholestérol Sitostanol Δ7-campestérol

Δ7-avenastérol Δ5-avenastérol

Figure24:Structuredesstérolsidentifiésdansleshuilesdefenouil(d’après(Winkler-Moser,n.d.))

Lateneurtotaleenstérolsdesextraitsaétédéterminéeparadditiondesteneursindividuellesdechaquestérolidentifié.(Tableau16)

Tableau16:Teneurstotalesenstérolsdesdifférenteshuilesdefenouil

Méthoded’extraction

Teneurtotaleenstérols(mg/ghuile)

Soxhletàl’hexane 4,189±0,295

Folch 3,272±0,342

CO2supercritique 4,640±0,236

SoxhletauMe-THF 3,652±0,326

Lesquantitésdestérolsretrouvéesdansleshuilesdefenouilvarientassezfortementenfonctiondelaméthoded’extractionparlaquelleellesontétéobtenues.Laméthodedonnantleshuileslesplus riches en stérols est l’extraction au CO2 supercritique. Les huiles obtenues par Soxhlet àl’hexanene sontque légèrementmoins richesen stérol (ladifférencen’étant significativequedanslecasducarvi).LeshuilesobtenuesparlaméthodedeFolchprésententquantàelles lesteneursenstérolslesplusbasses,cellesobtenuesparSoxhletauMeTHFn’étantquefaiblementplusélevées(égalementsignificatifdanslecasducarviuniquement).

57

Auniveaudesprofilsenstérols, legraphiqueci-dessous(Figure25)présente lesmoyennesetécart-typesdesquantitésdestérolsidentifiésdanslesdifférentsextraitsdegrainesdefenouil.Untableaureprenantlesvaleursdemoyennesetécarts-typesestannexéautravail.(Annexe15)

Figure 25 : Composition en stérols des extraits de fenouil: (1) cholestérol, (2) cholest-7-en-3β-ol, (3)campestérol,(4)stigmastérol,(5)Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérolet(9)Δ7-avenastérol

Lestigamastérolestlestérolleplusabondantavecdesteneursallantde2,234±0,091mgpargramme d’huile pour l’extrait obtenu au CO2 supercritique, qui semble être la méthoded’extraction donnant les huiles les plus riches en stérols. Indépendamment de la méthoded’extraction,lestigmastérolreprésentetoujourslamoitiédelateneurtotaleenstérolsdel’huilede fenouil. Le second stérol le plus abondant est leβ-sitostérol, qui comptepourun tiers desstérolstotaux,avecuneteneurde1,6124±0,036mg/ghuilepourl’extraitauCO2supercritique.Lecampestérolestensuiteprésentàuneteneurallantjusque0,392±0,016mg/ghuile,toujourspour l’extrait au CO2-SC. Il représente entre 7 et 9 % de la composition totale en stérols enfonctiondelaméthoded’extraction.LeΔ7-avenastéroletΔ7-campestérolprésententégalementdes teneurs appréciables, 0,176 ± 0,061 et 0,091 ± 0,003 mg/g huile respectivement. Enfin,l’huiledefenouilcontientégalementducholestérol,dusitostanoletduΔ5-avenastérolmaisenmoindresquantités.Lesmêmesstérolssontretrouvésdanslemêmeordred’abondanceaveclesautresméthodesd’extraction,bienquecelles-cidonnentdeshuilesmoinsrichesenstérols.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Teneurenstérol(mgstérol/ghuile)

Composi_onenstérolsdesdifférentsextraitsdefenouil

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMe-THF

58

Anisvert

Afind’illustrer le typedeprofilenstérolsde l’huiled’anis,unchromatogrammedeséparationdesstérolstriméthylsilylésdel’extraitdefenouilissud’uneextractionauCO2supercritiqueestprésenté ci-dessous. (Figure 26) Un seul chromatogramme est présenté car, pour l’aniségalement, les profils sont similaires indépendammentde laméthoded’extraction.Une figurereprenantunchromatogrammepourchaquetyped’extraitesttoutdemêmeannexéautravail.(Annexe13)

Figure26:chromatogrammedeséparationdesstérolstriméthylsilylésd’unextraitauCO2-SCd’anisvert

Lespicsidentifiéscorrespondentau(1)cholestérol,(2)campestérol,(3)stigmastérol,(4)Δ7-campestérol,(5)β-sitostérol,(6)sitostanol,(7)Δ5-avenastérol,(8)Δ7-avenastérolet(9)bétuline,SI.

Leshuitmêmescomposésontété identifiésdansleshuilesd’anisvert.Lestigmastérolet leβ-sitostérolsontlesdeuxstérolslesplusabondants,suiviparlecampestérol,leΔ7-campestérol,leΔ7-avenastérol,lecholestérol,leΔ5-avenastéroletlesitostanol.Leβ-sitostérolestdansleshuilesd’anisplusimportantquelestigmastérol.

Leshuilessontplusoumoinsrichesenstérolsenfonctionde laméthoded’extractionutilisée.(Tableau17)L’extractionauCO2supercritiqueestcellequidonne leshuiles lesplusrichesenstérols.ElleestsuivieduSoxhletàl’hexanequin’estpassignificativementdifférent.LeSoxhletau2-méthyltétrahydrofuraneestsignificativementmoinsefficacequeleCO2supercritiquepourextraire les stérolsmais neprésentepasdedifférence significative avec le Soxhlet à l’hexane.Enfin, l’extraction par la méthode de Folch arrive en dernière position mais n’est passignificativementdifférentedel’extractionauMeTHF.

Tableau17:Teneurstotalesenstérolsdesdifférenteshuilesd'anisvert




Folch 2,439±0,274



Dans la figure27sontprésentées les teneursenchaquestérol identifiédans leshuilessous laforme desmoyennes et écarts-type. Pour les valeurs détaillées, un tableau est présenté dansl’annexe16.

59

Figure 27 : Composition en stérols des extraits d’anis vert: (1) cholestérol, (2) cholest-7-en-3β-ol, (3)campestérol,(4)stigmastérol,(5),Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérolet(9)Δ7-avenastérol

Leβ-sitostérolreprésentelamoitiéouplusdelatotalitédesstérols(56à60%enfonctiondelaméthoded’extraction)avecuneteneurallantjusque2,175±0,386mg/ghuilepourlesextraitsobtenusauCO2supercritique.Vientensuitelestigmastérol(28à31%desstérolstotaux)avecuneteneurde1,184±0,179mg/ghuileextraiteauCO2-SC.Lecampestérolreprésente5%delatotalitédesstérolsavec0,190±0,030mg/ghuiledecemêmeextrait.LesstérolsΔ7-avenastérol,sitostanol,Δ7-campestérol,cholestéroletΔ5-avenastérolsontégalementprésentsenplusfaiblesquantités. Le même ordre d’abondance des stérols est observé peu importe la méthoded’extraction,bienquecelles-ciextraientplusoumoinslesstérols.

Carvi

Unchromatogrammedeséparationdesstérolstriméthylsilylésd’unehuiledecarviobtenueparextractionauCO2supercritiqueestprésentédanslafigure28.Leschromatogrammesdeshuilesdecarviobtenuespard’autresméthodes,àl’alluresimilaire,sontprésentésdansl’annexe14.

Figure28:Chromatogrammedeséparationdesstérolstriméthylsilylésd’unextraitdecarviauCO2-SC

Les pics identifiés correspondent au (1) cholestérol, (2) cholest-7-en-3β-ol, (3) campestérol,(4)stigmastérol,(5)Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérol,(9)Δ7-avenastérolet(10)bétuline,SI.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9


Composi_onenstérolsdesdifférentsextraitsd'anisvert

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMe-THF

60

Cechromatogrammeindiquequeleβ-sitostérolestlestérolmajoritaire,suividusigmastérol.Lecampestérol et le cholestérol sont également présents dans les huiles de carvi, ainsi leΔ7-campestérol, le Δ7-avenastérol, le Δ5-avenastérol, le sitostanal et le cholest-7-en-3β-ol. Cestérol,quinesemblepasprésentdansleshuilesdefenouilnid’anis,aétéidentifiédanscellesdecarvi. Cettemolécule est semblable à celle du cholestérol,mais différent par la position de ladoubleliaisonquisesitueauniveauducarbone7aulieuducarbone5.(Figure29)

Cholestérol Cholest-7-en-3β-ol

Figure29:Structureducholestéroletducholest-7-en-3β-ol

Une fois de plus, les huiles extraites au CO2 supercritique sont les plus riches en stérols.(Tableau 18) Elles contiennent significativement plus de stérols que les huiles extraites auSoxhlet à l’hexane, ellesmême significativement plus riches en stérols que celles obtenues auSoxhlet auMeTHF. Enfin, les huiles issuesde laméthodedeFolch sont significativementpluspauvresenstérolsquetouteslesautres.

Tableau18:Teneurstotalesenstérolsdesdifférenteshuilesdecarvi




Folch 4,527±0,198



LaFigure30reprendlesmoyennesetécartstypesdesquantitésdestérolsretrouvéesdanslesdifférenteshuilesdecarvietuntableauaveclesvaleursexactesestannexé.(Annexe17)

Figure 30 : Composition en stérols des extraits de carvi: (1) cholestérol, (2) cholest-7-en-3β-ol, (3)campestérol,(4)stigmastérol,(5),Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérolet(9)Δ7-avenastérol

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9


Composi_onenstérolsdesdifférentsextraitsdecarvi

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMe-THF

61

Lestérolmajoritairedansleshuilesdecarviestleβ-sitostérol.Ilreprésenteenvironlamoitiédela composition totale en stérols. Dans un gramme d’huile obtenue au CO2 supercritique sontcontenus 3,611± 0,198mg deβ-sitostérol. Ensuite, le stigmastérol est également présent enrelativementgrandesquantités,avec2,036±0,123mg/ghuileextraiteauCO2-SC,représentant28à32%desstérolstotauxdanscettehuile.Lecampestérolreprésenteplusoumoins5%desstérolstotaux.LeΔ7-avenastéroletleΔ5-avenastérolsontégalementprésentsdansdesquantitéssimilaires,saufdansl’huileobtenueparFolch.Lecholestérolcomptepour3%.Enfinlecholest-7-en-3β-oletlesitostanolsontprésentsenplusfaiblesquantités,comptantchacunpourmoinsde1%delateneurtotaleenstérols.Cesproportionssontobservéesdanstoutesleshuiles,peuimportelaméthoded’extractionàpartirdelaquelleellesontétéobtenues.


Les teneurs totales en stérols sont indubitablement plus élevées dans les huiles de carvi quedanscellesdefenouiletd’anis.Ladifférenceestmêmetrèshautementsignificative.Leshuilesd’anissont lesmoinsrichesenstérols.Pour toutes lesextractions,ellessontsignificativementpluspauvresenstérolsqueleshuilesdefenouil,saufpourcelleauCO2supercritique.

Lesdeuxstérolsmajoritairesdanstouslestypesdegrainessontleβ-sitostéroletlestigmastérol.Ilsreprésententensembletoujours80à90%delacompositiontotaleenstérols.Alorsqueleshuiles de fenouil contiennent plus de stigmastérol, celles d’anis et de carvi contiennentmajoritairement du β-sitostérol. Le carvi renferme significativement plus de β-sitostérol quel’anis, et le fenouil significativement encore moins, peu importe la méthode d’extraction. Lestigmastérol est plus présent dans le fenouil. Cependant, les huiles de carvi n’en contiennentsignificativement moins que dans le cas des méthodes conventionnelles. La teneur enstigmastérolesttoujourssignificativementlaplusfaibledansleshuilesd’anisvert.

Lecampestérol,présentenconcentrationsmoinsimportantes,esttoujoursletroisièmestérolleplus abondant. Les huiles de carvi et de fenouil en contiennent significativement plus que leshuilesd’anis.

Les autres stérols sont présents en plus faibles quantités. Les teneurs en cholestérol sontsignificativement plus importantes dans les huiles de carvi, et le cholest-7-en-3β-ol n’estretrouvéquedanscesdernières.LeΔ7-campestérolyestparcontremoinsabondantquedansles autres huiles. Ce stérol est significativement plus présent dans les huiles de fenouil. LeΔ5-avenastérol et leΔ7-avenastérol sont principalement retrouvés dans l’huile de carvi, où ilssontprésentsenconcentrationssignificativementplusélevéesquedansleshuilesdefenouiletd’anis.Enfin,lesteneursensitostanolsontsignificativementplusélevéesdansleshuilesd’anisquedanscellesdesautresgraines.


Ilestcertainquetouteslesméthodesd’extractionnesontpaségalesauniveaudelateneurenstérols des huiles qu’elles délivrent. Deux méthodes sortent du lot. Comme déjà constatéprécédemment, l’extraction au CO2 supercritique donne les huiles les plus riches en stérols.Cependant,leshuilesobtenuesparSoxhletàl’hexanesontégalementrichesenstérolsetnesontpastoujourssignificativementpluspauvresquecellesobtenuesauCO2-SC.Leshuilesobtenuespar Soxhlet au 2-méthyltétrahydrofurane par contre sont plus pauvres en stérols, et cellesobtenues par Folch encore plus. En considérant chaque stérol individuellement, lesconstatations sont identiques, les huiles obtenues par CO2 supercritique et à l’hexane sonttoujoursplusfourniesenstérols.

62

Les proportions entre les différents stérols des huiles obtenues par différentes méthodesd’extractionsontsemblables.Untyped’extractionnesembledoncpasfavoriserl’extractiond’unstérolplutôtqu’unautre.(Figure31)

Figure31:Profilsenstérolsdesdifférentsextraitslipidiquesdesgrainesdefenouil,anisvertetcarvi

Fe:fenouil,An:anisvert,Ca:carvi,et(S):Soxhletàl’hexane,(F):Folch,(C):CO2-SCet(T):SoxhletauMeTHF

Teneursetprofilsencomposésphénoliques

TeneurtotaleencomposésphénoliquesparFolin-Ciocalteu

La teneur en composés phénoliques totaux des huiles devait initialement être mesurée partechnique spectrophotométrique à l’aide du réactif de Folin-Ciocalteu. Cependant, l’ajout desréactifs en solutions aqueuses provoquant une émulsion, il n’a pas été possible d’obtenir desrésultatscorrectsetexploitables.(cfr.Matérielsetméthodesp.40).Aucuneconclusionn’adoncpuêtretiréedecetestd’unpointdevuequantitatif.Cependant,ilétaitclairementvisibleàl’œilnuquelemilieuréactionnelcontenantl’extraitd’anisétaitleplusfoncé,suivideceluidecarvietenfin celui de fenouil. Cela est très approximatif mais concorde toutefois avec les valeurstrouvéesdanslalittérature.Eneffet,(Pandeyetal.,2012)attribuentuneplusforteteneurtotaleen composés phénoliques aux graines de carvi qu’à celles de fenouil avec des valeurs de35,445 ± 1,84 mg d’équivalent en acide gallique par g de graines de carvi et21,712 ± 3,60 mg EAG/g graines de fenouil. (Souri et al., 2008) rapportent une teneur encomposésphénoliquesde353,92±1,64mg/100gdegrainesd’aniset165,07±11,43mg/100gde grainesde fenouil. Il semblerait doncque les grainesd’anis contiennent plus de composésphénoliquesquecellesdecarvi,quielles-mêmesencontiennentplusquecellesdefenouil.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%%teneurtotaleenstérols

Fe(S)-Fe(F)-Fe(C)-Fe(T)-An(S)-An(F)-An(C)-An(T)-Ca(S)-Ca(F)-Ca(C)-Ca(T

ProfilsenstérolsdesdifférentsextraitsSitostanol

Cholest-7-en-3b-ol

cholestérol

D5-avénastérol

D7-avenastérol

D7-campestérol

Campestérol

Slgmastérol

b-Sitostérol

63

ProfilencomposésphénoliquesparHPLC

Lescomposésphénoliquesd’unextraitpeuventêtreséparés, identifiésetquantifiésparHPLC-DADselonlesétapesexpliquéesdanslapartiematérieletméthode.Cependant,parmanquedetemps, iln’apasétépossibled’analysertoutesleshuiles.Laméthodeatoutefoisététestéesurl’uned’entreelles.Lechoixs’estportésurcelleprésentantl’activitéantioxydantelaplusélevée:l’huile de carvi obtenue par Soxhlet au 2-méthyltétrahydrofurane. (cfr. Résultats: Activitéantioxydantep.65)

Unpremierextraitméthanoliqued’unehuiledecarvi(celleobtenueparSoxhletàl’hexane)aétéinjectéenHPLC-DAD.Lechromatogrammeobtenuestprésentédanslafigure32.

Figure 32 : Chromatogramme de séparation des composés phénoliques d'un extrait d'huile de carviobtenueparSoxhletàl'hexane

Un mix de standards a ensuite été injecté dans le but d’identifier quelques composésphénoliques.Lafigure33représentelechromatogrammedeséparationdescomposéstémoins.Ceux-ciontpuêtreidentifiéssurbasedeleurstempsderétentioncarilsontpréalablementétéinjectésseuls.

Figure 33 : Chromatogramme de séparation des composés phénoliques du mix de standards à0,05mg/mL,détectionà280nm.Lespicscorrespondentauxcomposéssuivants:(1)catéchine,(2)acidecafféique,(3)acidechlorogénique,(4) acide p-coumarique, (5) acide férulique, (6) acide sinapique, (7) rutine, (8) acide cinnamique,(9)quercétine,(10)lutéoline12

12Laconcentrationenlutéolineestinconnue.Lerécipientétantpresquevide,laquantitérestantdedansn’apuêtrepeséeetasimplementétérécupéréparsuspensiondansleméthanol.

64

Par comparaisonde cesdeux chromatogrammes, le choixdu standard interne s’est arrêté surl’acide cinnamique. Ce composé ne semble pas être présent dans l’extrait d’huile de carvi etprésenteuneréponseélevéeaudétecteurDAD.Unenouvelleextractionméthanoliquedel’huileaalorsétéeffectuéeenajoutant100µLd’unesolutiond’acidecinnamiqueà1mg/mLàlaprised’essai.Lechromatogrammeobtenuestprésentédanslafigure34.

Figure34:Chromatogrammedeséparationdescomposésphénoliquesdel'extraitméthanoliqued'huiledecarviextraiteparSoxhletau2-méthyltétrahydrofuraneavec0,1mgd’acidecinnamique(SI)

Lapremièreobservationquipeut être faite àproposde ce chromatogrammeestqu’il compteénormémentdepics.Ilnepeutêtreaffirméaveccertitudequetouscespicscorrespondentàdesphénolsmaislaplupartensontcertainementcarilsabsorbentauxmêmeslongueursd’ondesetsortentdanslamêmefourchettedetempsderétention.

Lestandardinterne,l’acidecinnamique,sortà16,329min.D’autrespicspeuventêtreidentifiésgrâceaumixdetémoins.L’huiledecarvisemblecontenirundelacatéchine(tr=7,880min),del’acide caféique (tr = 8,457 min), de l’acide chlorogénique (tr = 8,815 min), de l’acidep-coumarique (tr = 11,176 min), de l’acide férulique (tr = 12,537 min), de l’acide sinapique(tr = 13,650 min), de la rutine (tr = 13,806 min), de la quercétine (tr = 16,057 min), de lalutéoline(tr=16,492min).Nombredecespicsn’étaientpasvisiblelorsdel’injectiondel’extraitsansstandard interne(extraitd’huileobtenueparSoxhletà l’hexane). Ilestdoncpossiblequel’extrait (d’huile obtenue par Soxhlet au MeTHF) contienne originellement déjà de l’acidecinnamique.Dèslors,iln’estpasprudentd’établirunequantificationsurlesvaleursobtenues.

Denombreuxpicsrestentnonidentifiés.L’identificationesteneffetlimitéeauxcomposésdontles standards purs sont disponibles pour être injectés comme témoins. Dans la nature, lescomposés phénoliques sont souvent présents liés à des molécules de sucre. Cette liaisoninfluençantleurstempsderétention,cestypesdecomposésnepeuventêtrereconnusdansceschromatogrammescaraucunstandardn’étaitdisponible. Ilestplusqueprobablequecertainsdespicsnonidentifiéscorrespondentàdetelscomposésphénoliques.

Activitésantioxydantes

Généralités

Lesactivitésantiradicalairesdesdifférenteshuilesontétécalculéesenutilisantletroloxcommeréférence,enconsidérantl’activitéantioxydantedecederniercommeétantégaleà100%.Lesmoyennes et écarts-types d’activités antiradicalaires des différentes huiles sont représentésdans les figures 35 et 36. Ces figures présentent lesmêmes résultats,mais agencés de façonsdifférentesafindepouvoircomparerplusfacilementlesdifférentesgraines,puislesdifférentesméthodesd’extraction.Lesvaleursexactessontreprisesdansuntableauannexé.(Annexe18)

65

Lesactivitésdetoutesleshuiles(auxdilutionstestées)sontinférieuresàcelledelasolutiondetrolox.Lasolutiondetroloxutiliséecommeréférencecontientlamoléculedetroloxuniquement,alorsque leshuiles sontdes extraits bruts, desmélanges complexesdemolécules.Deplus, letrolox a été testé à une concentration 10-3M et les extraits ont été dilués 102 fois en termevolumique. Il est dès lors compliqué de comparer les extraits à la référence directement.Néanmoins,lesextraitspeuventêtrecomparésentreeux.


De manière générale, les huiles d’anis et de carvi possèdent de meilleures activitésantiradicalaires que les huiles de fenouil. En effet, les activités antioxydantes des différentsextraits de fenouil ne dépassent jamais 70 % par rapport à la référence, alors que certainsextraitsd’anisetdecarvipeuventatteindredesactivitésde90%.Pourcequiestdel’anisetducarvi,ilestdifficilededéterminersilesdifférencessontsignificativesounoncarlesconditionsd’applicationsd’analysedelavariancenesontpasrespectées.

Figure35:Activitésantiradicalairesdesdifférentesgrainespartyped'extraction(1)Soxhlethexane,(2)Folch,(3)CO2supercritiqueet(4)Soxhlet2-méthyltétrahydrofurane

Cesrésultatspeuventêtreappuyésparlesteneursencomposésphénoliquesdeshuilescarcesmoléculessontreconnuescommepossédantdespropriétésantioxydantes.Malheureusement,iln’a pas été possible de déterminer les teneurs totales en phénols des huiles (cfr. p.62).Cependant, les données trouvées dans la littérature permettent d’expliquer les différencesd’activitésantioxydantesentrelefenouil,l’anisetlecarvi.Commedéjàexposéprécédemment,lalittératurereconnaituneteneurencomposésphénoliquesplusélevéeàl’anisvert,puisaucarvietenfinau fenouil. (Sourietal.,2008;Pandeyetal.,2012)Malgré l’absencedecaractérisationdes huiles testées en termes de composition phénolique, les résultats obtenus semblentcohérentsaveclesteneursphénoliquestrouvéesdanslalittérature.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4

%aclvitéanlradicalaire(parrapportàtrolox10-3M=100%)

Ac_vitésan_radicalairesdeshuilesdesdifférentesgrainesselonletestDPPH

Fenouil

Anis

Carvi

66

Ces différences sont très faibles et ne peuvent pas toujours être confirmées de manièrestatistique,mais lorsque leshuiles sontobtenuespardesméthodesd’extractionà froid, l’anisprésenteunmeilleurpouvoirantioxydantque le carvi, alorsquepour leshuilesobtenuesparextractionsà chaud, les résultatsdeshuilesd’anis sontmoinsconvaincantsqueceuxdecarvi.Cela pourrait être du à la présence demolécules à pouvoir antioxydant plus thermosensiblesdanslesgrainesd’anisquedanscellesdecarvi.Lestraitementsàlachaleurpourraientdégradercesmoléculesetdoncdiminuerlepouvoirantioxydantdesextraitsd’anis.


Figure36:Activitésantiradicalairesdesextraitsobtenuspardifférentesméthodesd'extractionpartypedegraines(1)fenouil,(2)anisvertet(3)carvi

Pourchacunedesgraines,lesméthodesalternativesdonnentdeshuilesàpouvoirsantioxydantsplusélevés(lasignificativitédeladifférencen’apuêtreconfirméequedanslecasdufenouil,lesconditionsd’applicationduteststatistiquen’étantpasvérifiéedanslecasdel’anisetducarvi).Le CO2 supercritique semble être lameilleureméthoded’extraction pour obtenir des huiles àhauts potentiels antioxydants. L’activité antioxydante d’un extrait peut être corrélée avec sateneurenphénols.Celaestenaccordaveclestravauxde(Zekovicetal.,2016)quimontrentquelesextraitslipidiquesdegrainesdecoriandreobtenusauCO2-SCsontenrichisenpolyphénols.Pour expliquer cela, plusieurs hypothèses peuvent être émises: les méthodes alternativespourraientêtreplusefficacespourextrairelescomposésphénoliques,êtremoinsdestructricespourcesmolécules,ouencorefavoriserl’extractiond’autresmoléculeségalementpourvuesd’unpouvoirantioxydant.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3

%aclvitéanlradicalaire(parrapportàtrolox10-3M=100%)

Ac_vitésan_radicalairesdeshuilesobtenuespardifférentesméthodesd'extrac_onselonletestDPPH

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMeTHF

67

L’extraction par Soxhlet à l’hexane est la méthode la plus conventionnelle pour extraire leslipides. C’est également celle qui donne les huiles présentant généralement les propriétésantioxydantes les plus faibles. L’hypothèse de la dégradation thermique de moléculesantioxydantes n’est que peu pertinente étant donné que l’extraction par Soxhlet au2-méthyltétrahydrofurane, méthode d’extraction à chaud également, donne des huiles àpouvoirsantioxydants largement supérieurs.Le facteurdéterminant seraitdès lors le solvant,sans doute plus précisément sa polarité. Il est toujours possible que desmolécules à pouvoirantioxydant se trouvent dégradées par la chaleur, mais si tel est le cas, cette perte seraitcompensée par d’autres molécules. Le MeTHF aurait dès lors une meilleure affinité pour lesphénolsoud’autresmoléculesàpropriétésantioxydantesquel’hexane.

LaméthodedeFolch,bienqu’étantuneméthoded’extractionàfroid,nedonnepasdeshuilesàfortesactivitésantioxydantes.Dans lecasdu fenouil, l’activitéantioxydantede l’huileobtenueparlaméthodedeFolchestaussifaiblequecelledel’huileobtenueparSoxhletàl’hexane.Dansle cas de l’anis, l’activité de l’huile obtenue par Folch est plus élevée que celle par Soxhlet àl’hexane. Enfin, dans le cas du carvi, elle présente une activitéencore plus faible que celleobtenueparSoxhletàl’hexane.

68

DISCUSSIONGÉNÉRALE

LeshuilesdegrainesdelafamillebotaniquedesApiacéescontiennentdenombreuxcomposésd’intérêts. Un certain nombre d’entre eux a été étudié dans ce travail visant à comparerdifférentes méthodes d’extraction des fractions lipidiques de ces graines. Le solvantactuellementutilisépourextraireleslipidesestlen-hexane,maiscelui-ciposediversproblèmes,aussi bien au niveau environnemental et sécuritaire qu’au niveau de la santé publique. C’estpourquoi des alternatives sont recherchées afin d’éviter l’utilisation de solvants d’originepétrolière. (AbertVianetal.,2013)C’estdanscetteoptiqueques’inscritcetravail lorsduqueldes huiles ont été extraites par deux méthodes conventionnelles puis par deux méthodesalternativesplus vertes. Ceshuiles ont été caractérisées en termesde compositions en acidesgrasetenstérols.Leursactivitésantioxydantesontégalementétédéterminées.Chacundecesrésultats est abordé dans cette discussion générale de façon orientée sur les différentesapplicationsqu’unehuileissuedegrainesd’Apiacéespourraitavoir.Eneffet,lechoixdel’uneoul’autregraineetméthoded’extractiondépendradel’applicationdestinéeàl’huileetdecequiestrecherchédanscelle-ci.

1. Rendementsmassiquesd’extraction

Pourcommencer,lesgrainescontenantlesplushautesteneursenlipidessontcellesd’anisvert.En termesderendementmassique, lesméthodesd’extraction lesplusrentablessontcellesdeFolch et de Soxhlet à l’agro-solvant 2-méthyltétrahydrofurane. Ces résultats sont positifs etconstituentunargumentauremplacementdel’hexaneparl’agro-solvant,quipermetd’obtenirdesquantitésd’huilesupérieures.L’extractionauCO2supercritiquenedonnepasdesquantitésd’huiles aussi élevées que les autres méthodes. Néanmoins, en optimisant la méthode et enextrayantsurdespluslonguesdurées,ilseraitcertainementpossiblederattraperl’écart.

2. AcidesgrasLes huiles les plus riches en acides gras sont celles de carvi, suivies de celles de fenouil puiscellesd’anis. En termed’extraction, cellesobtenues à l’aidede2-méthyltétrahydrofurane sontles plus riches, suivie de l’autre méthode d’extraction alternative, au CO2 supercritique.Néanmoins,d’unpointdevuestatistique,cesdifférencesnesont,danslamajoritédescas,passignificatives.

Les acides gras saturés laurique, myristique et palmitique engendrent une augmentation ducholestérol total et LDL dans le plasma. Quant à l’acide stéarique, c’est l’acide gras saturé lemoins hypercholestérolémiant. (Williams, 2000; Lecerf, 2007) Si l’acide linoléique représenteplusde5à6%del’apporténergétiquetotal,cedernierannulel’effethypercholestérolémiantdel’acide palmitique. (Lecerf, 2007) L’acide myristique est présent dans toutes les huiles enproportions infimes. Quant à l’acide palmitique, les graines en contenant lemoins sont cellesd’anis. Les méthodes d’extraction alternatives donnent des huiles plus riches en C16:0.Cependant, d’un point de vue relatif, les proportions en C16:0 sont les plus élevées dans leshuilesobtenuesàl’hexaneetlesplusfaiblesdanscellesobtenuesau2-méthyltétrahydrofurane.Cependant,l’acidelinoléiqueétanttoujoursprésentenproportionsbeaucoupplusimportantesquel’acidepalmitique,cecritèren’estpasdiscriminantpourunehuileplutôtqu’uneautre.

69

La famillebotaniqueétudiéeétant lesApiacées, la teneurenacidepétroséliniqueconstitueuncritèredecomparaisonmajeur.Eneffet, celui-ciaune importance industriellecar ilestutilisépour la fabrication de polymères et de détergents (Murphy, 1996), mais il est égalementbénéfique dans l’alimentation. (Weber et al., 1997) lui ont attribué un rôle d’inhibition desréactions d’élongation de chaine de l’acide linoléique, ce quimène à une diminution du tauxd’acide arachidonique dans le foie. De plus, l’acide pétrosélinique a aussi un intérêtpharmaceutique, (Alalufetal.,2002) luiont reconnuuneffetanti-inflammatoire.Pourobtenirunehuile riche en acidepétrosélinique, la graine à privilégier est le fenouil car c’est celle quiprésentel’huileencontenantleplus,autantentermesdeproportionquedeteneurabsolue.Auniveaudesextractions,lesméthodesd’extractionalternativesdonnentdeshuilesàplushautesteneursenC18:1,enparticulierleSoxhletauMeTHF.

L’acide linoléique (C18:2n-6)estunacidegrasessentielpour l’homme. Il estnécessairepourunecroissancenormaleetlebondéroulementdesfonctionsphysiologiquesdestissus.Deplus,l’hommeetl’animalsontincapablesdelesynthétiser.Ildoitdoncêtreapportéparl’alimentation.(Legrand,2007)CelaconfèreauxacidesgrasC18:2unintérêtcertainenagroalimentaire.Dansce cas, les graines de carvi sont sans doute plus intéressantes car elles contiennentproportionnellement plus de C18:2. Au niveau desméthodes d’extraction, les deuxméthodesd’extractionalternativesdonnentdeshuileslégèrementenrichiesencetyped’acidesgras.

Ledegréd’insaturationd’unehuilepeutégalementêtreuncritèredesélectiond’unegraineoud’une méthode d’extraction. Comme expliqué précédemment, la consommation d’acides grasinsaturésestpréférable,leurconférantunintérêtenagroalimentaire.Néanmoins,d’unpointdevue stabilité de l’huile, il est préférable de limiter le degré d’insaturation car les acides grasinsaturés sontdavantage sensibles à l’oxydation.En cequi concerne le choixd’unegraine surbasedececritère,l’anisestcellequiprésentelerapportinsaturé/saturéleplusélevé,suividufenouil, puis du carvi. Au niveau des méthodes d’extraction le Soxhlet au 2-méthyl-tétrahydrofurane est celle donnant les huiles aux rapports d’insaturation les plus élevés pourchaquetypedegraine,etlaméthodedeFolchlesplusfaibles.

3. StérolsLes phytostérols ont des rôles importants dans divers domaines. Ils sont utilisés enpharmaceutique pour la production de stéroïdes thérapeutiques. Dans les industriescosmétiquesetagroalimentaires, ilssontajoutésauxproduitspourleursbienfaitssurlasanté.Les stérols végétaux sontprincipalement connuspour avoir un effet réducteurdu cholestérolLDL dans le plasma et de cette façon diminuer le risque de maladies cardiovasculaires. Ilsprésententégalementuneactivitéanticancéreuse. (Uddinetal.,2014)Pourunehuilericheenstérols, la grainede carvi estde loin le choix leplus judicieux car elle en contientune teneurtotaleplusélevée.Entermed’extraction,leCO2supercritiqueestlameilleureméthodecarc’estcellequioffrelesmeilleursrecouvrementsenstérols.L’extractionparSoxhletàl’hexanepermetégalementl’obtentiond’huilesrichesenstérols.

Des activités plus spécifiques sont attribuées à certains stérols en particulier. Par exemple, le∆5-avenastérol aurait une activité antioxydante supérieure aux autres stérols. (Uddin et al.,2014)Ce composé confèredoncunemeilleure stabilité à l’huile. Cependant, ce composén’estprésentqu’eninfimesquantitésdanstoutesleshuilesextraiteslorsdecetravail.

70

Les travauxde (Burget al., 2013)ontmontréque le stigmastérolpourrait êtreun composantalimentaire intéressant dans la maladie d’Alzheimer. En effet, les phytostérols, et plusparticulièrement lestigmastérol,sontmoinsamyloïdogéniquesque lecholestérol.Celasignifieque le stigmastérol joue un rôle ayant pour conséquence la diminution la transformationamyloïdogénique de l’APP (amyloid precursor protein) menant à la formation des fragmentspeptidiquesformantlesagrégatstoxiques.Danscecontexte,lestigmastérolpeutêtrerecherchédansl’huile.Lesgrainesdefenouilserontalorsprivilégiéescarcesontcellesdontleshuilesencontiennentleplus.Cellesdecarviencontiennentégalementbeaucoup,d’ailleursladifférencen’est pas significative pour toutes les extractions. Afin d’optimiser le recouvrement enstigmastérol, l’extraction par CO2 supercritique est la meilleure option, suivie du Soxhletconventionnelàl’hexane.

4. ActivitéantioxydanteUnebonneactivitéantioxydanteestunepropriététrèsrecherchéedansdenombreuxdomaines,enagroalimentaireouenpharmaceutiqueparexemple.Commeexpliquédanslabibliographie,undéséquilibrede labalancenaturelleprooxydant/antioxydantdans le corpspeutprovoquerdivers types de dégâts cellulaires et causer différentes maladies. En agroalimentaire, lesantioxydants permettent de limiter la dégradation des aliments dûe à l’oxydation de diverscomposés.Lesgrainesdélivrantleshuileslesplusantioxydantessontcellesd’anisetdecarvi.Auniveaude laméthoded’extraction, ilestpossiblederendreoptimale l’activitéantioxydantedel’huile d’une graine en l’extrayant au CO2 supercritique ou par Soxhlet au 2-méthyl-tétrahydrofurane.

5. AutrescritèresOutre les caractéristiques des huiles précédemment décrites, qui sont fonction autant desgrainesquedesméthodesd’extraction,d’autrescritèresdoiventégalementêtreprisencomptedanslechoixdel’uneoul’autreméthoded’extraction.

Sidesalternativesauxméthodesconventionnellessontrecherchées,c’estparcequelessolvantsactuellementutilisésposentproblème.Eneffet, ceux-ciontdeseffetsnéfastes,principalementau niveau environnemental. En effet, les solvants conventionnels sont issus de sourcespétrolières, qui s’épuisent chaque jour de plus en plus. D’un point de vue écologique, lesméthodes alternatives seront donc privilégiées. En effet, les agro-sovlants sont issus deressources renouvelables. Le Soxhlet au 2-méthyltétrahydrofurane est plus respectueux del’environnement que celui à l’hexane. L’extraction au CO2 supercritique permet de réduiredavantage l’impactenvironnementalduprocédéd’extraction.C’est laméthodedont le solvantestlemoinsnéfaste.

Un autre problème posé par les méthodes conventionnelles se situe au niveau de la santépubliqueetde la sécurité.Eneffet, l’hexaneest toxiqueet inflammable.Deplus,des tracesdesolvant peuvent subsister dans le produit fini. Dans cette optique, c’est encore l’extraction auCO2 supercritiquequi est lameilleure option car le CO2 n’est ni toxiqueni inflammable. Cettetechniqueassuremêmeunproduitfinalexemptdequelconquerésidudesolvant.

71

Evidemment, l’aspect économique est également un argument pesant de façon considérabledansunchoix.D’après(“ProductSpecificationSigma-Aldrich,”August-10-2017),lessolvantssesituent tous dans la même gamme de prix, mis à part le chloroforme qui est moins cher.Cependant, pour l’extraction par laméthode de Folch, duméthanol est également nécessaire,ainsi que de la main d’œuvre. En effet, cette méthode est plus complexe, elle se déroule endifférentes étapes et requiert plus d’interventions. Dans le cas de l’extraction au CO2supercritique, il faut évidemment prendre en compte l’investissement pour l’appareillaged’extractionmaisleprixdusolvant,lesbonbonnesdeCO2liquide,estbeaucoupmoinsélevé.

6. IntérêtàgrandeéchelleAfin de replacer ce travail dans un contexte à plus grande échelle, il est intéressant de serenseignersurlemarchépotentieldanslequelilpourraits’inscrire.Cependant,ilestdifficiledetrouverdesinformationsexactesconcernantlesvolumesdeplantesaromatiquesetmédicinalesimpliquésdans les échanges internationaux.Cela est enpartiedûau fait que cesplantes sontutilisées par de nombreuses industries différentes et que les compagnies concernées par cecommerce partagent peu d’informations. (Lubbe et al., 2011) Quelques valeurs exposées ci-dessouspermettenttoutefoisdesefaireuneidéedel’importancedumarchédecestroisgraines.

Premièrement, 74 000 tonnes de graines de fenouil ont été produites en Inde en 2011. Lerendementdeculturepeutatteindre2à2,5tonnesdegrainesparhectare.Lesgrainesdefenouilsont valorisées de différentes façons. Elles sont principalement produites pour leur huileessentielle,pourenfairedelapoudreouencorepourenextrairel’huilefixe.(Malhotra,2012a)Ensuite, l’anis est cultivédansdenombreuxpaysméditerranéens et enRussie.Unhectaredeculture permet de produire entre 0,5 et 1 tonne de graines. Les pays exportateurs sontprincipalementlaTurquie,l’Egypteetl’Espagne.Entre40et50tonnesd’huileessentielled’anisvert sont produites chaque année dans le monde. L’anis et son huile essentielle sont trèslargementutiliséscommeagentdegoûtdanstoutessortesdeproduitsalimentaires(boissons,friandises, produits laitiers, viandes, etc). (Özgüven, 2012)Enfin, chaque année, la productionmondialedegrainesdecarvisechiffreàenviron15000tonnes.Lerendementengrainesdelaculturedecarvis’élèveà1à3 tonnesparhectarepour lesespècesbiennaleset0,7à1 tonnepourlesespècesannuelles.Environ3500tonnesdegrainesdecarvietdeproduitsdérivéssontimportéesparanauxEtatsUnis,dont80%proviennentdesPays-Bas,leplusgrandexportateurmondial.Laproductionannuelled’huileessentielledecarvitourneautourde30à40tonnes,cequireprésenteunevaleurdeplusd’unmilliondedollars.(Malhotra,2012b)

Lesrésultatsobtenuslorsdecetravailpeuventnonseulementservirdanslecadredelasimpleextractiond’huiledecesgraines,dontlecommerceadéjàuneimportancemondiale,maisilestpossibled’allerplusloindanslavalorisationdesgraines.(Figure37)Actuellement, lesgrainesde fenouil, d’anis vert et de carvi sont principalement valorisées comme épices, sous formebroyée, ou pour en extraire les huiles essentielles. Etant donné qu’une partie importante desgraines de ces trois plantes cultivées est utilisée pour en soutirer l’huile essentielle, il seraitintéressant de valoriser le résidu de distillation obtenu après extraction de l’huile essentielle.Cette opération d’extraction ne soutirant que les composés volatils, le résidu de distillation,«résidu1»,contientencoredenombreuxcomposés intéressants,dontceuxétudiés lorsdecetravail. La chaleur ne semble pas dégrader ces composés d’intérêt ni altérer l’activitéantioxydante car les résultats obtenus pour les huiles extraites à chaud au 2-méthyl-tétrahydrofurane sont intéressants. De plus, (Navarrete et al., 2011) ont obtenu de bonsrésultatsd’activités antioxydantes surdes résidus solidesd’extractionde l’huile essentiellederomarinlorsdetravauxvisantàvalorisercedéchetagricole.Parlasuite,étantdonnéqueselonla littérature, lesgrainesde fenouild’anisetdecarvisontcomposéesdepresquedemoitiédeglucides,contiennent10à20%deprotéinesetsontégalementrichesenfibresetminéraux,le

72

tourteau obtenu après cette seconde étape, «résidu 2», pourrait être valorisé à son tour. Ilpourrait être épandu sur des cultures et faire office de fertilisant, servir comme alimentationpourbétailouencoreêtretransforméenbiogazafindeproduiredel’électricité

Figure37:Procédédevalorisationdesgraines

73

PERSPECTIVES

Autermedecetravail,différentspointsrestentincompletsoupourraientêtreaméliorés.

Premièrement, au niveau des extractions, il serait intéressant de comparer ces méthodesd’extractionchimiquesavecuneméthoded’extractionphysiquecommelepressage.L’extractionau CO2 supercritique pourrait également être optimisée plus en profondeur. Il est probablequ’enextrayantsimplementdurantdepluslonguesdurées,lesrendementsmassiquesenhuilessoientplusélevés.

Ensuite,l’absencederésultatsconcernantledosagedescomposésphénoliquestotauxconstitueune lacune du travail. Le problème rencontré lors du test de Folin-Ciocalteu n’a pas pu êtrerésolu,maiscelaneveutpasdirequ’iln’existepasdesolution.Deplus, ilserait intéressantdepoursuivre l’identification et la quantification des composés phénoliques par HPLC suivant laméthode expliquée dans la partie «matériel et méthode» et testée pour une huile. Il seraitd’autant plus intéressant de pouvoir se baser sur plus de témoins ou effectuer une étape dedéglycosylationdescomposésphénoliquesprésentsdansleshuilesafindepouvoiridentifierunmaximumdecomposés.

D’autrescomposéset caractéristiquesvalentégalement lapeined’être investigués, comme lestocophérols, les phospholipides ou encore l’activité anti-inflammatoire. En effet, en tenantcompte des concentrations observées en acides gras et en stérols, 70 à 90 % (en termemassique) de la composition chimique des huiles seulement est élucidée. Ensuite, l’acidepétrosélinique possédant une activité anti-inflammatoire, une tentative de test spectro-photométrique basé sur unemesure d’inhibition de l’enzyme lipoxygénase, impliquée dans laréaction inflammatoire, a été effectuée,mais sans succès, pour lamême raison que le test deFolin-Ciocalteu.Leprotocolenécessitaitl’ajoutdetamponphosphateafindemaintenirlepHdumilieu réactionnel au pH physiologique de l’enzyme. L’ajout de ce tampon a immédiatementprovoquélaformationd’uneémulsion,rendantimpossiblelamesured’absorbancedumilieu.

Enfin,danslebutdevaloriserlesdéchetsagricolesactuellementobtenussuiteauxextractionsd’huiles essentielles des graines de fenouil, anis vert et carvi, il serait intéressant de tester leprocédédevalorisation imaginéprécédemment.Pourcela, il faudraiteffectuerdesextractionsd’huiles essentielles sur les poudres de graines et extraire l’huile des résidus de distillationobtenus. Il faudrait ensuite analyser les compositions chimiques et propriétés des produits àchaqueétapeafindedéterminersileprocédédevalorisationpourraitvraimentêtreintéressantetmenéàgrandeéchelle.

74

CONCLUSION

D’aprèslesdifférentesanalyseseffectuéeslorsdecetravail,laprincipaleconclusionquipeutenêtre tirée est qu’il est tout à fait possible de remplacer les méthodes d’extractionconventionnelles par des méthodes alternatives. En effet, l’utilisation de solvants d’originepétrolière pose divers problèmes auxquels des méthodes d’extraction alternatives peuventrépondre.Cesalternativesconstituentdonc,enthéorie,dessolutionsconvaincantes.Enpratique,cela est également le cas, car après analyse des compositions en acides gras et stérols et despouvoirs antioxydants des huiles obtenues, les méthodes d’extraction alternatives testéesdélivrentd’aussibons,voirdemeilleursrésultats.

LeSoxhletà l’agro-solvant2-méthyltétrahydrofuraneestunedesdeuxméthodesquidélivrentlesplushautsrendementsenhuile,aveclaméthodeconventionnelledeFolch.Deplus,leshuilesobtenues auMeTHFprésententdehautspotentiels antioxydants et sontplus riches enacidesgras,dontl’acidepétroséliniquequiprésentedenombreuxintérêts.Quantàl’extractionauCO2supercritique,malgrésesrendementsmassiquesd’extractionplusfaibles,cetteméthodepermetd’obtenir les huiles les plus riches en stérols, avec l’extraction conventionnelle à l’hexane, etpossédant lespouvoirs antioxydants lesplusélevés.Auniveaudes teneursenacidesgras, leshuiles obtenues au CO2-SC sont moins riches que celles obtenues au MeTHF mais restenttoutefoisplusrichesquecellesobtenuesparlesméthodesconventionnelles.Encequiconcernelaméthode conventionnelle de Folch, elle a beau fournir de bons rendementsmassiques, leshuilesobtenuesneprésententaucunrésultatintéressant,nientermesdecompositionenacidesgrasoustérols,nientermed’activitéantioxydante.LeSoxhletàl’hexanedonnedeshuilesassezrichesenstérols,maiscelaestleseulrésultatquiluiconfèredel’intérêt.

Tous ces résultats sont donc encourageants dans l’optique de remplacer les méthodesconventionnellesd’extractiondeshuilesdesgrainesdefenouil,d’anisvertetdecarvi.Ilpourraitmêmeêtreenvisagéd’extraire leshuilesdesrésidusdedistillationaprèsextractiondeshuilesessentielles, valorisant de cette manière un déchet issu d’une voie de valorisation déjàdéveloppéeetimportantedesgrainesdontlemarchémondialestimportant.

75

RÉFÉRENCESBIBLIOGRAPHIQUES

AbertVianM.,DejoyeTanziC.&ChematF.,2013.Techniquesconventionellesetinnovantes,etsolvants alternatifs pour l’extraction des lipides demicro-organismes.Oilseeds fats Crop.Lipids20(6),1–6.

AgrahariP.&SinghD.K.,2014.AreviewonthepharmacologicalaspectsofCarumcarvi.J.Biol.EarthSci.4(1),M1–M13.

Alaluf S., Green M.R., Rogers J.S., Watkinson A., Cain F.W., Hu H.L. & Rawlings A.V., 2002.Petroselinicacidanditsuseinfood.

AvryM.-P.&GallouinF.,2003.Epices,aromatesetcondiments,Belin,Paris.

Badgujar S.B., Patel V. V. & Bandivdekar A.H., 2014. Foeniculum vulgareMill: A Review of ItsBotany,Phytochemistry,Pharmacology,ContemporaryApplication,andToxicology.BiomedRes.Int.2014.

BakkaliF.,AverbeckS.,AverbeckD.& IdaomarM.,2008.Biologicaleffectsofessentialoils -Areview.FoodChem.Toxicol.46,446–475.

Balasundram N., Sundram K. & Samman S., 2006. Phenolic compounds in plants and agri-industrialby-products:Antioxidantactivity,occurrence,andpotentialuses.FoodChem.99,191–203.

BreilC.,MeullemiestreA.,VianM.&ChematF.,2016.Bio-BasedSolventsforGreenExtractionofLipidsfromOleaginousYeastBiomassforSustainableAviationBiofuel.Molecules21,1–14.

BuchananB.B.,GruissemW.&JonesR.L.(Eds.),2015.Biochemistry&MolecularBiologyofPlants.

BudisaN.&Schulze-MakuchD.,2014.SupercriticalCarbonDioxideand ItsPotentialasaLife-SustainingSolventinaPlanetaryEnvironment.Life4,331–340.

BurgV.K.,GrimmH.S.,RothhaarT.L.,GroS.,HundsdoB.,HaupenthalV.J., ZimmerV.C.,Mett J.,WeingaO., LaufsU., Broersen L.M., TanilaH., VanmierloT., LuD.,HartmannT.&GrimmM.O.W.,2013.PlantSterolstheBetterCholesterolinAlzheimer’sDisease?AMechanisticalStudy.J.Neurosci.33(41),16072–16087.

CahoonE.B.,ShanklinttJ.&OhlroggeJ.B.,1992.Expressionofacorianderdesaturaseresultsinpetroselinicacidproductionintransgenictobacco.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,11184–11188.

CalderP.C.,2006.nϪ3Polyunsaturatedfattyacids,inflammation,andinflammatory.Am.J.Clin.Nutr.83(suppl),1505S–1519S.

Carteau D., Bassani C. & Pianet I., 2007. The “ Ouzo effect ”: Following the spontaneousemulsificationoftrans-anetholeinwaterbyNMR.ComptesRendusChim.1–6.

ChobanovD.,AgovaM.,ChooparovaE.&ChaluckovaR.,1966.PreparationofPurePetroselinicAcid.J.Am.OilChem.Soc.43,625–626.

ColomboM.L.,2010.AnupdateonvitaminE,tocopherolandtocotrienol-perspectives.Molecules15,2103–2113.

DanielM.,2006.MedicinalPlants:ChemistryandProperties.

76

DayritF.M.,2015.ThePropertiesofLauricAcidandTheirSignificanceinCoconutOil.J.Am.OilChem.Soc.92,1–15.

DejoyeTanziC.,2013.Eco-ExtractionetAnalysedelipidesdemicro-alguespourlaproductiond’algo-carburant.

DupontF.&GuignardJ.-L.,2012.Botanique :lesfamillesdeplantes,Issy-les-Moulineaux,408.

FavierA.,2003.LestressoxydantIntérêtconceptueletexpérimentaldanslacompréhensiondesmécanismesdesmaladiesetpotentielthérapeutique.Actual.Chim.108–115.

FilliatP.,2012.LesplantesdelafamilledesApiacéesdanslestroublesdigestifs.

Fine F., Abert Vian M., Fabiano Tixier A.-S., Carre P., Pages X. & Chemat F., 2013. Les agro-solvantspourl’extractiondeshuilesvégétalesissuesdegrainesoléagineuses.OilseedsfatsCrop.Lipids20(5).

FolchJ.,LeesM.&SloaneStanleyG.H.,1957.Asimplemethodfortheisolationandpurificationoftotallipidesfromanimaltissues.J.Biol.Chem.226(1),497–509.

ForeS.P.,HolmesR.L.&BickfordW.G., 1960.PreparationofPetroselinicAcid. J.Am.OilChem.Soc.37,490–491.

FriedtW.&LühsW.,1995.Developmentinthebreedingofrapeseedoilforindustrialpurposes.OilQual.(D19),437–448.

Ghouati Y., Belaiche T., OuhssineM., Amechrouq A., Tahiri A. & Chakir S., 2012. Compositionchimiqueetactivitéantibactériennedel’huileessentielledefruitsd’anisvertmarocain(*).Bull.Soc.Pharm.Bordeaux151(1–4),25–34.

GornayJ.,2006.Transformationparvoiethermiquedetriglycéridesetd’acidesgras.Applicationàlavalorisationchimiquedesdéchetslipidiques.

GunstoneF.D.,2005.VegetableOils.In:Shahidi,F.ed..JohnWiley&Sons,Inc.,213–267.

HandaS.S.,KhanujaS.P.S.,LongoG.&RakeshD.D.,2008.ExtractionTechnologiesforMedicinalandAromaticPlants.

HeimermannW.H.,TH.R.,GordonD.T.,KowalyshynD.E.& JensenR.G., 1973.Effect ofDoubleBondPositioninOctadecenoatesuponHydrolysisbyPancreaticLipase.Lipids8(1),45–47.

HerziN.,2013.Extractionetpurificationdesubstancesnaturelles :comparaisondel’extractionauCO2-supercritiqueetdestechniquesconventionnelles.

HSDBAToxnetDatabase(ToxicologyDataNetwork),August-10-2017. .U.S.NationalLibr.Med.https://toxnet.nlm.nih.gov/,(10/08/2017).

Iserin P., Masson M. & Restellini J.-P., 2001. Encyclopédie des plantes médicinales. Iserin, P.,Masson,M.,Restellini,J.-P.eds.,Larousse,Londres.

ISO 9235:2013, 2013. . ISO. https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:9235:ed-2:v1:fr,(11/08/2017).

JohnsonS.,SaikiaN.,MathurH.B.&AgarwalH.C.,2009.FattyacidsprofileofEdibleOilsandFatsinIndia,NewDelhi.

Khan R.M., Ahmad W., Ahmad M. & Hasan A., 2016a. Phytochemical and PharmacologicalPropertiesofCarumcarvi.Eur.J.Pharm.Med.Res.3(6),231–236.

77

Khan R.M., Ahmad W., Ahmad M. & Hasan A., 2016b. Phytochemical and pharmacologicalpropertiesofCarumcarvi.Eur.J.Pharm.Med.Res.3(6),231–236.

KleimanR.&Spencer,GF.,1982.SearchforNewIndustrialOils:XVI.Umbelliflorae-SeedOilsRichinPetroselinicAcid.J.Am.OilChem.Soc.59,29–38.

KootiW.,MoradiM.,Ali-AkbariS.,Sharafi-AhvaziN.,Asadi-SamaniM.&Ashtary-LarkyD.,2015.Therapeutic and pharmacological potential of Foeniculum vulgare Mill: a review. J.HerbMedPharmacol.J.JHerbMedPharmacol4(1),1–9.

KurianA.,2012.Healthbenefitsofherbsandspices.In:Limited,W.P.ed.HandbookofHerbsandSpices:Volume2.72–88.

LaugierJ.-P.&PicardE.,1998.Utilisationd’unehuilericheenacidepétroséliniquecommeagenthydratant.

LecerfJ.-M.,2007.Lipidesetsanté.Cah.Nutr.Diététique42,1S24-1S33.

LegerA.,2010.Analysefonctionnelled’AtMYB30,unrégulateurtranscriptionnelimpliquédanslamortcellulairehypersensiblechezArabidopsisthaliana.

Legrand P., 2007. Les acides gras : structures, fonctions, apports nutritionnels conseillés.Cah.Nutr.Diététique42,1S7-1S12.

Li L., Tsao R., Yang R., Kramer J.K.G. & Hernandez M., 2007. Fatty acid profiles, tocopherolcontents,andantioxidantactivitiesofheartnut(JuglansailanthifoliaVar.cordiformis)andPersianwalnut(JuglansregiaL.).J.Agric.FoodChem.55,1164–1169.

Lipophilicity, 2017. . Cambridge MedChem Consult.http://www.cambridgemedchemconsulting.com/,(10/08/2017).

LiuW.,FuY.-J.,ZuY.-G.,TongM.H.,WuN.,LiuX.-L.&ZhangS.,2009.Supercriticalcarbondioxideextraction of seed oil fromOpuntia dillenii Haw. and its antioxidant activity.FoodChem.114,334–339.

LoboV.,PatilA.,PhatakA.&ChandraN.,2010.Freeradicals,antioxidantsandfunctionalfoods:Impactonhumanhealth.PhcogRev4(8),118–126.

Lognay G., Lacoste F., Marlier M., Mordret F., Auge C., Raoux R., Wagstaffe P.J., Boenke A. &SeverinM.,1993.TheCertificationoftheIdentityofIndividualSterolsinThreeBCROilandFatReferenceMaterialsbyGC-MS.Eur.J.LipidSci.Technol.95(3),98–104.

Lognay G. &MarlierM., 1990. GC-MS Identification of the Sterols from Three BCR ReferenceMaterials :Soya-MaizeRM162,Pig-BeeffatblendRM163andButterfatRM164.

Lubbe A. & Verpoorte R., 2011. Cultivation of medicinal and aromatic plants for specialtyindustrialmaterials.Ind.CropsProd.34,785–801.

LumbP.B.&SmithJ.C.,1952.982.HigherAliphaticCompounds.PartX.ASynthesisofTariricandPetroselinicAcids.J.Chem.Soc.(5032),5032–5035.

Macheix J.-J., Fleuriet A. & Jay-Allemand C., 2005. Les composés phénoliques des végétaux: unexempledemétabolitessecondairesd’importanceéconomique,PPURPressespolytechniques.

Malhotra S.K., 2012a. Fennel and fennel seed. In: Handbook of Herbs and Spices: Volume 2.WoodheadPublishingLimited,275–302.

Malhotra S.K., 2012b. Caraway. In: Handbook of Herbs and Spices: Volume 2. Woodhead

78

PublishingLimited,225–248.

MalnoeA.,BaurM.&FayL., 1999.Utilisationde l’acidepétroséliniquepour le traitementdesinflammationsdestissussuperficiels.

MarcusY.,1993.ThePropertiesofOrganicLiquidsthatareRelevanttotheirUseasSolvatingSolvents.Chem.Soc.Rev.409–416.

Medicinal & Aromatic Plants, March-28-2017. . Omi. Int.https://www.omicsonline.org/medicinal-aromatic-plants.php,(28/03/2017).

Miraliakbari H. & Shahidi F., 2008. Antioxidant activity ofminor components of tree nut oils.FoodChem.111,421–427.

MurphyD.J.,1996.Engineeringoilproductioninrapeseedandotheroilcrops.TrendsBiotechnol.14,206–213.

MurphyD.J.,RichardsD.,TaylorR.,CapdevielleJ.,GuillemotJ.-C.,GrisonR.,FairbairnD.&BowraS., 1994.Manipulation of seedoil content to produce industrial crops. Ind.CropsProd.3,17–27.

NavarreteA.,HerreroM.,MartinA.,CoceroM.J.& IbáñezE.,2011.Valorizationofsolidwastesfromessentialoilindustry.J.FoodEng.104,196–201.

OhlroggeJ.B.,1994.DesignofNewPlantProducts:EngineeringofFattyAcidMetabolism.PlantPhysiol.104,821–826.

ÖzgüvenM., 2012.Aniseed. In:HandbookofHerbsandSpices:Volume2.WoodheadPublishingLimited,138–150.

Pace V., Hoyos P., Castoldi L., Domínguez de Maria P. & R. Alcantara A., 2012. 2-Methyltetrahydrofuran(2-MeTHF):ABiomass-DerivedSolventwithBroadApplicationinOrganicChemistry.ChemSusChem5,1369–1379.

PandeyM.M., VijayakumarM., Rastogi S. & Ajay K.S., 2012. Phenolic Content and AntioxidantPropertiesofSelectedIndianSpicesofApiaceae.J.Herbs.SpicesMed.Plants18(3),246–256.

Parmentier M., Guillemin S., Barbar R., Linder M. & Fanni J., 2004. De nouveaux procédésd’extraction des huiles pour des produits finis de haute qualité.Oilseeds fatsCrop.Lipids11(6),377–380.

PeterM.,2008.ProfiletmétabolismedesacidesgrasdanslestissusdelaperchecommunePercafluviatilisL.

Peter K. V. & Nirmal Babu K., 2012. Introduction to herbs and spices: medicinal uses andsustainableproduction.In:HandbookofHerbsandSpices:Volume2.1–16.

Pictogrammes CLP, n.d. . Eur. Chem. Agency. https://echa.europa.eu/fr/chemicals-in-our-life/clp-pictograms

PlacekL.L.,1963.Areviewonpetroselinicacidanditsderivatives.J.Am.OilChem.Soc.40,319–329.

PokornýJ.&PánekJ.,2012.Theeffectofnaturalantioxidantsinherbsandspicesonfoodshelf-life.In:Limited,W.P.ed.HandbookofHerbsandSpices:Volume2.51–71.

Product Specification Sigma-Aldrich, August-10-2017. . Sigma-Aldrich.http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/296090?lang=fr&region=BE&gclid=C

79

j0KCQjwiLDMBRDFARIsACNmiX_xSH4d-hGMSLRQY_wZR-bj_EBfo521ADpRPr_ob2DhfTmRiVYvIRoaAmeGEALw_wcB,(10/08/2017).

PubChem Substance and Compound databases, August-10-2017. . PubChem.https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov,(10/08/2017).

Quideau S., Deffieux D., Douat-Casassus C. & Pouységu L., 2011. Plant Polyphenols: ChemicalProperties,BiologicalActivities,andSynthesis.Angew.Chemie-Int.Ed.50,586–621.

RafiaB.,2013.PhytosterolsinHumanNutrition.Int.J.Sci.Res.Rev.2(2),01–10.

Ramadan M.F., Kroh L.W. & Mörsel J.-T., 2003. Radical Scavenging Activity of Black Cumin(Nigella sativaL .),Coriander (CoriandrumsativumL .), andNiger (GuizotiaabyssinicaCass.)CrudeSeedOilsandOilFractions.J.Agric.FoodChem.51,6961–6969.

RasooliI.&AllamehA.,2016.Caraway(CarumcarviL.)EssentialOils.In:EssentialOilsinFoodPreservation,FlavorandSafety.ElsevierInc.,287–293.

Rather M.A., Dar B.A., Sofi S.N., Bhat B.A. & Qurishi M.A., 2016. Foeniculum vulgare: Acomprehensive review of its traditional use, phytochemistry, pharmacology, and safety.Arab.J.Chem.9,S1574–S1583.

RochaL.&FernandesC.P.,2016.Aniseed(Pimpinellaanisum,Apiaceae)Oils.In:EssentialOilsinFoodPreservation,FlavorandSafety.ElsevierInc.,209–213.

SahenaF.,Zaidul I.S.M., JinapS.,KarimA.A.,AbbasK.A.,NorulainiN.A.N.&OmarA.K.M.,2009.ApplicationofsupercriticalCO2inlipidextraction–Areview.J.FoodEng.95(2),240–253.

Shahidi F., 2013. Oilseed Processing and Fat Modification. In:Biochemistry of Foods. Elsevier,363–384.

ShojaiiA.&FardM.A.,2012.ReviewofPharmacologicalPropertiesandChemicalConstituentsofPimpinellaanisum.Int.Sch.Res.Netw.ISRNPharm.1–8.

SinghG.,KapoorI.,SinghP.,HeluaniC.&CatalanC.,2008.Chemicalcompositionandantioxidantpotential of essential oil and oleoresins from anise seeds (Pimpinella anisum L.). Int. J.Essent.OilTher.2(September),122–130.

SouriE.,AminG., FarsamH.&BarazandehTehraniM.,2008.Screeningof antioxidantactivityandphenoliccontentof24medicinalplantextracts.DARUJ.Pharm.Sci.16(2),83–87.

SvobodaK..&GreenawayR..,2003a.InvestigationofvolatileoilglandsofSaturejahortensisL.(summer savory) and phytochemical comparison of different varieties. Int. J. Aromather.13(4),196–202.

SvobodaK..P.&GreenawayR..I.,2003b.InvestigationofvolatileoilglandsofSaturejahortensisL.(summersavory)andphytochemicalcomparisonofdifferentvarieties.Int.J.Aromather.13(4),196–202.

TassouC.C.,ChorianopoulosN.G.,SkandamisP.N.&NychasG.-J.E.,2012.Herbs,spicesandtheiractive components as natural antimicrobials in foods. In:Handbook of Herbs and Spices:Volume2.17–50.

ThoméO.W.,1885.FloravonDeutschlandÖsterreichundderSchweiz.

Trautwein E.A. & Demonty I., 2007. Phytosterols: Natural compounds with established andemerginghealthbenefits.OCL-Ol.CorpsGrasLipides14(5),259–266.

80

Tucker J.M. & Townsend D.M., 2005. Alpha-tocopherol: roles in prevention and therapy ofhumandisease.Biomed.Pharmacother.59,380–387.

Uddin S., Sarker Z.I., Ferdosh S., Akanda J.H., Easmin S., Shamsudin S.H.B., Yunus B. &Kamaruzzaman,2014.Phytosterolsandtheirextractionfromvariousplantmatricesusingsupercriticalcarbondioxide :areview.J.Sci.FoodAgric.(December2013).

Van Loon J., 1927. The composition of parsley seed oil.Recl. desTrav. Chim.desPays-Bas46,492–500.

WeberN.,VosmannK.,BrühlL.&MukherjeeK.,1997.Metabolismofdietarypetroselinicacid:adead-endmetaboliteofdesaturation/chainelongationreactions.Nutr.Res.17(1),89–97.

WilliamsC.M.,2000.Dietaryfattyacidsandhumanhealth.Ann.Zootech.49,165–180.

Winkler-Moser J., n.d. Gas Chromatographic Analysis of Plant Sterols. AOCS Lipid Libr.http://lipidlibrary.aocs.org/Analysis/content.cfm?ItemNumber=40384

YiC.,ShiJ.,KramerJ.,XueS.,JiangY.,ZhangM.,MaY.&PohorlyJ.,2009.Fattyacidcompositionandphenolicantioxidantsofwinemakingpomacepowder.FoodChem.114,570–576.

ZekovicZ.,PavlicB.,CvetanovicA.&DurovicS.,2016.Supercriticalfluidextractionofcorianderseeds:Processoptimization,chemicalprofileandantioxidantactivityoflipidextracts.Ind.CropsProd.94,353–362.

ZlatanovM.&IvanovS.A.,1995.StudiesonsterolcompositionofsomeglycerideoilsfromfamilyApiaceae.Fett97,381–383.

81

ANNEXESAnnexe1:PictogrammesdedangerCLPetleurssignifications,d’après(“PictogrammesCLP,”n.d.)

Peutirriterlesvoiesrespiratoires,provoquersomnolence ou vertiges, une allergiecutanée.

Provoqueunesévèreirritationdesyeux,uneirritationcutanée.

Nocifencasd'ingestion,parcontactcutané,parinhalation.

Nuitàlasantépubliqueetàl'environnementen détruisant l'ozone dans la hauteatmosphère.

Inflammable

Toxique pour les organismesaquatiques, entraîne des effetsnéfastesàlongterme.

Mortel en cas d'ingestion, parcontactcutané,parinhalation.

Toxique en cas d'ingestion, parcontactcutané,parinhalation.

Peut être mortel en cas d'ingestion et depénétrationdanslesvoiesrespiratoires.

Risque avéré d'effets graves pour lesorganes.

Risque présumé d'effets graves pour lesorganes.

Peut nuire à la fertilité ou au fœtus,provoquer le cancer, induire des anomaliesgénétiques, provoquer des symptômesallergiques ou d'asthme ou des difficultésrespiratoiresparinhalation.

Contient un gaz sous pression;peut exploser sous l'effet de lachaleur.

Contient un gaz réfrigéré; peutcauser des brûlures ou blessurescryogéniques.

Annexe 2: Rendementsmassiques d’extraction obtenus pour les différentes graines par les différentesméthodesd’extraction

Soxhlethexane Folch CO2-SC SoxhletMeTHF

Rendementsmassiquesd’extraction(g/100gmatièrefraiche)

Fenouil 16,097±1,292 18,560±1,733 12,899±0,662 17,592±0,492

Anis 15,499±2,556 22,748±1,837 16,701±1,259 22,351±0,711

Carvi 12,591±0,235 18,553±0,563 10,906±1,773 16,712±1,419

Rendementsmassiquesd’extraction(g/100gmatièresèche)

Fenouil 17,276±1,387 19,920±1,860 13,844±0,711 18,881±0,528

Anis 16,405±2,706 24,077±1,945 17,677±1,333 23,657±0,752

Carvi 13,376±0,249 19,709±0,598 11,585±1,884 17,753±1,507

82

Annexe 3: Chromatogramme de séparation d’EMAG d’une huile de fenouil obtenue par laméthode deFolchprésentantdespicsidentifiéscommeétantdel’anisoleetdutrans-anéthol

Annexe 4: Gros plan sur des pics séparés d’EMAG de C18:1 n-9 (acide pétrosélinique) et n-12 (acideoléique)issud’unchromatogrammedeséparationd’EMAGd’unehuiled’anisvertobtenueparSoxhletàl’hexane

83

Annexe5:ChromatogrammesdeséparationdesEMAGdeshuilesextraitesd’anisvert(a)parlaméthodede Soxhlet à l’hexane, (b) par laméthode de Folch, (c) au CO2 supercritique et (d) par laméthode deSoxhletau2-méthyltétrahydrofurane.Lespicsidentifiéscorrespondentauxestersméthyliquesdesacidesgras(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0.

84

Annexe6:ChromatogrammesdeséparationdesEMAGdeshuilesextraitesdecarvi(a)parlaméthodedeSoxhletàl’hexane,(b)parlaméthodedeFolch,(c)auCO2supercritiqueet(d)parlaméthodedeSoxhletau2-méthyltétrahydrofurane.Lespicsidentifiéscorrespondentauxestersméthyliquesdesacidesgras(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0.

85

Annexe7:Moyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdefenouil

Acidegras

Soxhlethexane(mg/ghuile)

Folch(mg/ghuile)

CO2-SC(mg/ghuile)

SoxhletMeTHF(mg/ghuile)

AGT 706,02±43,24 744,36±35,01 827,84±110,02 896,68±35,74

C14:0 0,64±0,04 0,76±0,13 1,05±0,07 0,91±0,05

C16:0 41,26±1,22 45,98±4,45 53,45±5,49 51,67±0,36

C16:1 5,62±0,64 5,78±0,44 6,61±0,72 7,06±0,16

C18:0 9,91±0,35 10,60±0,61 13,94±2,03 12,07±0,09

C18:1 550,02±34,71 580,66±22,55 632,69±87,80 707,33±32,30

C18:2 90,89±4,66 92,54±5,87 109,89±13,15 109,11±2,21

C18:3 5,48±1,46 5,27±0,77 7,52±0,71 2,91±0,10

C20:0 2,20±0,17 2,77±0,20 2,70±0,06 2,91±0,48

Annexe8:Teneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdefenouil(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

800,0

1 2 3 4 5 6 7 8

mgAG/ghuile

Composi_onenacidesgrasdesdifférentsextraitsdefenouil

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMe-THF

86

Annexe9:Moyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasdeshuilesextraitesd’anisvert

Acidegras


Folch(mg/ghuile)

CO2-SC(mg/ghuile)


AGT 669,85±32,95 693,68±20,62 729,55±70,49 756,29±145,07

C14:0 0,51±0,10 0,65±0,02 0,60±0,07 0,71-

C16:0 32,14±1,80 37,85±1,90 41,96±1,38 39,08±2,49

C16:1 2,65±0,15 3,48±0,19 3,82±0,29 4,81±0,24

C18:0 6,58±0,38 7,25±0,27 8,48±0,79 8,79±2,03

C18:1 457,06±19,34 467,52±11,03 485,68±53,74 495,11±126,17

C18:2 164,06±10,40 169,96±6,49 180,07±13,46 200,37±13,18

C18:3 4,37±0,64 5,00±0,61 6,47±0,67 4,99±0,64

C20:0 1,87±0,14 2,22±0,12 2,47±0,10 2,45±0,31

Annexe 10: Teneurs en acides gras des huiles extraites d’anis vert (1) C14:0, (2) C16:0, (3) C16:1, (4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

1 2 3 4 5 6 7 8

mgAG/ghuile

Composi_onenacidesgrasdesdifférentsextraitsd'anisvert

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMe-THF

87

Annexe11:Moyennesetécarts-typesdesteneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdecarvi

Acidegras


Folch(mg/ghuile)

CO2-SC(mg/ghuile)


AGT 739,01±37,34 765,58±31,20 837,38±104,05 857,06±115,04

C14:0 0,93±0,06 0,85±0,04 0,87±0,21 0,91±0,08

C16:0 45,66±2,33 49,69±2,46 49,73±8,03 51,90±6,23

C16:1 5,84±0,27 5,44±0,25 6,05±1,00 6,34±0,22

C18:0 14,35±0,72 15,07±0,73 16,32±1,32 15,18±2,25

C18:1 411,75±20,20 435,21±15,78 470,87±51,81 482,08±65,16

C18:2 249,98±13,35 249,97±11,12 282,50±39,64 290,27±39,73

C18:3 8,10±0,30 6,30±0,57 8,10±1,61 7,39±1,05

C20:0 2,390±0,120 3,046±0,174 2,954±0,428 2,993±0,324

Annexe12:Teneursenacidesgrasdeshuilesextraitesdecarvi(1)C14:0,(2)C16:0,(3)C16:1,(4)C18:0,(5)C18:1,(6)C18:2,(7)C18:3et(8)C20:0

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

1 2 3 4 5 6 7 8

mgAG/ghuile

Composi_onenacidesgrasdesdifférentsextraitsdecarvi

Soxhlethexane

Folch

CO2-SC

SoxhletMe-THF

88

Annexe13:Chromatogrammesdeséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitsd’anisvertobtenuspar(a)Soxhletàl’hexane,(b)Folch,(c)CO2-SCet(d)SoxhletauMeTHF.Lespicsidentifiéscorrespondentau(1)cholestérol,(2)campestérol,(3)stigmastérol,(4)Δ7-campestérol,(5)β-sitostérol,(6)sitostanol,(7)Δ5-avenastérol,(8)Δ7-avenastérolet(9)bétuline,SI.

89

Annexe14:Chromatogrammesdeséparationdesstérolstriméthylsilylésdesdifférentsextraitsdecarviobtenus par (a) Soxhlet à l’hexane, (b) Folch, (c) CO2-SC et (d) Soxhlet au MeTHF. Les pics identifiéscorrespondentau(1)cholestérol,(2)cholest-7-enol,(3)campestérol,(4)stigmastérol,(5)Δ7-campestérol,(6)β-sitostérol,(7)sitostanol,(8)Δ5-avenastérol,(9)Δ7-avenastérolet(10)bétuline,SI.

90

Annexe15:Moyennesetécarts-typesdesteneursenstérolsdeshuilesextraitesdefenouil

Stérol


Folch(mg/ghuile)

CO2-SC(mg/ghuile)


Stérolstotaux 4,19±0,30 3,27±0,34 4,64±0,24 3,65±0,33

Cholestérol 0,06±0,01 0,04±0,0 0,06±0,00 0,04±0,00

Campestérol 0,32±0,06 0,29±0,05 039±0,02 0,32±0,03

Stigmastérol 2,17±0,11 1,66±0,11 2,23±0,09 1,70±0,16

Δ7-campestérol 0,12±0,01 0,09±0,01 0,09±0,03 0,10±0,01

β-sitostérol 1,26±0,04 1,15±0,16 1,61±0,04 1,24±0,11

Sitostanol 0,05±0,01 0,03±0,00 0,02±0,00 0,02±0,00

Δ5-Avenastérol 0,02±0,01 0,00±0,00 0,06±0,03 0,06±0,00

Δ7-Avenastérol 0,19±0,04 0,02±0,00 0,18±0,06 0,16±0,01

Annexe16:Moyennesetécarts-typesdesteneursenstérolsdeshuilesextraitesd’anisvert

Stérol


Folch(mg/ghuile)

CO2-SC(mg/ghuile)


Stérolstotaux 3,43±0,36 2,44±0,27 3,86±0,67 2,90±0,26

Cholestérol 0,04±0,00 0,02±0,00 0,05±0,02 0,02±0,01

Campestérol 1,18±0,01 0,12±0,01 0,19±0,03 0,14±0,02

Stigmastérol 0,98±0,10 0,72±0,08 1,18±0,18 0,85±0,08

Δ7-campestérol 0,06±0,03 0,05±0,01 0,05±0,02 0,04±0,01

β-sitostérol 1,94±0,11 1,45±0,15 2,18±0,39 1,70±0,14

Sitostanol 0,10±0,03 0,06±0,01 0,08±0,02 0,06±0,01

Δ5-Avenastérol 0,02- 0,02±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01

Δ7-Avenastérol 0,11±0,08 0,01±0,00 0,09±0,02 0,06±0,00

Annexe17:Moyennesetécarts-typesdesteneursenstérolsdeshuilesextraitesdecarvi

Stérol


Folch(mg/ghuile)

CO2-SC(mg/ghuile)


Stérolstotaux 6,45±0,27 4,53±0,20 7,26±0,47 5,38±0,39

Cholestérol 0,23±0,02 0,15±0,01 0,22±0,02 0,15±0,01

Cholest-7-enol 0,06±0,00 0,04±0,00 0,06±0,01 0,04±0,00

Campestérol 0,36±0,01 0,29±0,01 0,40±0,02 0,31±0,20

Stigmastérol 1,79±0,10 1,43±0,06 2,04±0,12 1,51±0,90

Δ7-campestérol 0,03±0,01 0,02±0,00 0,03±0,00 0,02±0,00

β-sitostérol 3,21±0,08 2,41±0,11 3,61±0,20 2,57±0,15

Sitostanol 0,03±0,01 0,05±0,00 0,06±0,01 0,04±0,01

Δ5-Avenastérol 0,41±0,03 0,09±0,01 0,48±0,03 0,40±0,05

Δ7-Avenastérol 0,34±0,01 0,06±0,00 0,36±0,06 0,35±0,06

91

Annexe18:Activitéantiradicalairedesdifférentesgrainespartyped'extraction

%activitéantiradicalaire(parrapportàtrolox10-3M=100%)

Soxhlethexane Folch CO2-SC SoxhletMeTHF

Fenouil 34,02±10,86 38,56±5,73 69,58±4,98 49,23±10,04

Anis 58,32±8,60 81,82±5,73 92,99±0,67 87,04±3,69

Carvi 69,14±10,01 49,12±6,83 91,44±1,14 93,46±0,20

Annexe 19: Récapitulatif des tests statistiques effectués. Les conditions d’application sont la normalitédespopulations, l’égalitédesvariancesdecelles-ci.L’hypothèsenulledutestest l’égalitédesmoyennes.Une p-valeur < 0,05 signifie un rejet significatif de l’hypothèse nulle (*), < 0,01 un rejet hautementsignificatif(**)et<0,001unrejettrèshautementsignificatif(***).Lesgroupementsontlesrésultatsdesstructurationsdesmoyennes.Lesmoyennesnepartageantpasdelettresontsignificativementdifférentes.Rendementsmassiquesd’extraction

Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000Groupements

Ca A B A A CO2-SC A A A(2)An B A A B MeTHF B B A(1)Fe C C B C Folch C C C Hexane C D B

Acidesgrastotaux Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. 0,155 RH0*0,038 0,370 0,259 R*0,023 0,487 0,297Groupements

Ca A MeTHF A Fe AB CO2-SC AB An B Folch BC Hexane C

Acidesgras:C18:1 Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0**,002 RH0***0,000 RH0*0,045 RH0*0,029 RH0*0,025 0,907 0,252Groupements

Fe A A A A CO2-SC A An B B B B MeTHF AB Ca B B B B Folch B Hexane B


CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0*0,025 RH0*0,019 0,271Groupements

Ca A A A A CO2-SC A AB An B B B B MeTHF A A Fe C C C C Folch B B Hexane B B


CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0*0,010 0,113 RH0*0,010 RH0*0,012 RH0**0,002 0,575Groupements

Ca A A A CO2-SC A A Fe B A A MeTHF AB AB An C B B Folch BC B Hexane C C

92


CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0**0,002 RH0*0,012 RH0**0,008 0,126 0,433Groupements

Ca A A A A CO2-SC A Fe B B A AB MeTHF AB An C C B B Folch BC Hexane C


CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0**0,007 0,108 0,253 RH0*0,015 0,051 RH0*0,020 0,176Groupements

Ca A A CO2-SC A A Fe B B MeTHF B B(3) An B B Hexane B B(4) Folch B B(2)

Acidesgras(relatif):C18:1 Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi


Fe A A A A MeTHF A A AAn B B B B Hexane B A CCa C C C C Folch B B B CO2-SC C C D



Ca A A A A CO2-SC A A AAn B B B B Hexane B BC ABFe C C C C Folch BC C C MeTHF C B B



Ca A A A A Folch A A AFe B B AB B CO2-SC B A BAn C C B C Hexane C B B MeTHF D B C



Ca A A A A Folch A A AFe B B B B Hexane A B BAn C C C C CO2-SC B C C MeTHF C - D



Ca A A A A CO2-SC A A AAn B B B B Folch B B BFe C B B C Hexane C B(4) A MeTHF D B(3) C

Stérolstotaux Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0**0,001 RH0***0,000 0,306 RH0*0,010 RH0***0,000Groupements

Ca A A A A CO2-SC A AFe B B B B Hexane AB BAn C C B C MeTHF BC C Folch C D

93

Stérols:stigmastérol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0**0,001 RH0**0,007 RH0***0,000Groupements

Fe A A A A CO2-SC A A ACa B B A A Hexane A AB BAn C C B B MeTHF B BC C Folch B C C

Stérols:β-sitostérol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0**0,002 RH0*0,021 RH0***0,000Groupements

Ca A A A A CO2-SC A A AAn B B B B Hexane B AB BFe C C C C MeTHF B BC C Folch B C C

Stérols:campestérol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0**0,002 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 0,076 RH0**0,005 RH0***0,000Groupements

Ca A A A A CO2-SC A AFe A A A A Hexane AB BAn B B B B MeTHF BC C Folch C C

Stérols:cholestérol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0*0,034 0,096 RH0***0,000Groupements

Ca A A A A CO2-SC A A AFe B B B B Hexane A AB AAn B C B C MeTHF AB B B Folch B B B

Stérols:∆5-avenastérol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0***0,000 RH0*0,038 RH0*0,014 RH0***0,000Groupements

Ca A A A A CO2-SC A A AFe B - B B Hexane B BC BAn B B B B MeTHF A AB B Folch - C C

Stérols:∆7-avenastérol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0***0,000 RH0***0,000 RH0**0,001 RH0***0,000 RH0**0,003 RH0***0,000 RH0***0,000Groupements

Fe A A A A Hexane A A AAn B B B B CO2-SC A A ACa B C B C MeTHF A AB A Folch B B B

Stérols:Sitostanol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. CAEgal.var. p-valég.moy. RH0**0,004 RH0*0,010 RH0**0,002 RH0**0,001 RH0**0,001 RH0*0,037 RH0*0,022Groupements

An A A A A Hexane A A CCa B A B B CO2-SC B AB AFe B B C C MeTHF B B BC Folch B B AB

94

Stérols:cholest-7-enol Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi

CANorm.pop. - - - - - - CAEgal.var. - - - - - - p-valég.moy. - - - - - - RH0***0,000Groupements

- - - - Hexane - - A - - - - CO2-SC - - A - - - - MeTHF - - B Folch - - B

Activitéantioxydante Comparaisongraines Comparaisonméthodesd’extraction Hexane Folch CO2-SC MeTHF Fenouil Anis Carvi


Ca A B A A CO2-SC A A A(2)An B A A B MeTHF B B A(1)Fe C C B C Folch C C C Hexane C D B

Documents

Etude biochimique des fractions lipidiques de graines de