Etude de la variabilité du potentielprotéolytique de paroi chezStreptococcus thermophilus

Caractérisation de la variabilité du gène prtS

Sous la direction Pr. Annie DARY et Dr. Clarisse PERRIN

Wessam GALIAEcole Doctorale RP2E

15 janvier 2009

L'équipe Domestication en aquaculture continentale L'équipe Micropolluants & résidus dans la chaîne alimentaire

L'équipe Protéolyse & biofonctionnalités des protéines et des peptides

Production de peptides bioactifs

Le peptide bioactif d’origine alimentaire :

• ne répond pas seulement aux besoins nutritionnels

• joue un rôle bénéfique chez le consommateur

- rôle anxiolytique ou anti hypertensif...

Production de peptides bioactifs issus du lait

Les protéines du lait renferment dans leur séquence une grande variété de peptides potentiellement bioactifs :

par protéolyse in vitro ajout à l’aliment

directement dans l’organisme générés par des protéases endogènes 2 % des gènes humains codent pour des protéases ou des inhibiteurs de protéases

pendant la fabrication / transformation de l’aliment (fermentation, affinage) générés par des bactéries lactiques (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ..)

Production de peptides bioactifs par voie microbienne

Mieux comprendre le potentiel protéolytique d’une bactérie lactique : Streptococcus thermophilus

Caractérisation du potentiel protéolytique – Caractériser les différents acteurs du système

– Caractériser sa variabilité au sein de l’espèce St. thermophilus

dans le but de sélectionner des souches capables de libérer des peptides bioactifs.

Présentation de Streptococcus thermophilus

Une des bactéries lactiques les plus utilisées dans l’industrie des ferments (du lait)

Homofermentaire et se développe entre 37 et 42°C

Appartient au genre Streptococcus

Non pathogène

Séquençage complet de 3 génomes a révélé :- l’absence des gènes de virulence- une faible variabilité de séquence

Bolotin et al., Nature Biotechnology (2004) 22:1554-1558

Variabilité phénotypique chez St. thermophilus

Variabilité phénotypique affecte différents caractères tels que :- morphologie des colonies,- taille des chaînettes,- résistance à différents stress,- vitesse de croissance et d’acidification du lait

Système protéolytique de St. thermophilus

Milieu extracellulaire

Paroi bactérienne

Cytoplasme

Monnet, Bull. Soc. Fr. Microbiol (2006) 21:23-28

CW M C

Cell WallMembraneCytoplasme

Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques

CW M C

Cell WallMembraneCytoplasme

Prédomaine (signal+proséquence)

PP

PP

PP

PP

PP PR

PR

PR

PR

PR

Domaine catalytique

A

A

A

A

A

?

W

W

W

W

W

Espaceur

Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques

CW M C

Cell WallMembraneCytoplasme

H

H

H

Positionnement de A et B

AN

Ancrage

AN

AN

Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques

Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385

Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation

Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines

Capable d’hydrolyser les caséines S1 et

Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée

Régulation du gène prtS est inconnue

Fernandez-Espla et al., AEM (2000)

Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385

Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation

Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines

Capable d’hydrolyser les caséines S1 et

Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée

Régulation du gène prtS est inconnue

Fernandez-Espla et al., AEM (2000)

Activité protéolytique de surface retrouvée uniquement chez quelques souches

Shahbal et al., AEM (1993)

Démarche expérimentale

• Evaluer la variabilité génétique d’une collection de souches de St. thermophilus

• Evaluer la variabilité du potentiel protéolytique de surface de St. thermophilus

Gène ARNr 16S Gène ARNr 23SITS 16S-23S

ITS-I AAGGCCAAAAATAAITS-III ..........T...ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T...ITS-II ..........-...Consensus..........t...

Mise en évidence d’un nouveau type ITS-V

Génotypage de souches de St. thermophilus

Séquençage de la région Internal Transcribed Spacer 16S-23S

ITS-I AAGGCCAAAAATAAITS-III ..........T...ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T...ITS-II ..........-...

(Galia et al., 2009)

Génotypage de souches de St. thermophilus

Mise en évidence d’une variabilité génétique au sein de la collection de

souches de St. thermophilus

Variabilité du système protéolytique de surface

Détermination de l’acidité Dornic (acide lactique produit) permet d’évaluer la croissance d’une souche en milieu lait

Présence de la protéase de surfaceForte croissance = fort pouvoir acidifiant

Absence de la protéase de surfaceFaible croissance = faible pouvoir acidifiant

Variabilité du système protéolytique de surface ?

Variabilité du système protéolytique de surface

12 Souches à fort pouvoir acidifiant 53,4 ± 4,5°D

2 Souches à faible pouvoir acidifiant 11,0 ± 2,4°D

16 Souches à moyen pouvoir acidifiant 29,8 ± 4,2°D

après 6 h de croissance en lait(° Dornic)

Variabilité du système protéolytique de surface

Recherche du gène prtS

800 pb

11/16 souches posséderaient le gène prtS

12/12 souches posséderaient le gène prtS

5/16 souches ne possèdent pas le gène prtS

2/2 souches ne possèdent pas le gène prtS

Souches à fort pouvoir acidifiant

Souches à faible pouvoir acidifiant

Souches à moyen pouvoir acidifiant

Variabilité du système protéolytique de surface

Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie

PB18o

PrtS

CNRZ1066 LMD9

Variabilité du système protéolytique de surface

Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie pour toutes les souches

PrtS

Pouvoir acidifiant

Nombre de souches

Faible

2

Moyen

5

Moyen

8

Moyen

3

Fort

12

Présence du gène prtS - - + + +

Activité protéolytique - - - + +++

• Pourquoi ? Gène prtS muté Gène prtS non exprimé

Séquençage du gène prtS chez :- 4 souches à moyen pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS-)- 3 souches à fort pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS+)

Comparaison de séquences : - 100% identiques entre elles et avec la souche LMD-9- 95% identiques avec la souche CNRZ385

Variabilité de l’activité protéolytique de surface

Variabilité du système protéolytique de surface

Séquençage du gène prtS :

SS PP PR A H W ANPB18o ou LMD9 1 36 177 492 1110 1477 1583

1618CNRZ 385 1 36 145 460 1077 1444 1550

1585

PB18O OU LMD9 60SESPVAEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETLGSESPVVEELVDTSVEATPTDVTTTDNVEETLGSE126

CNRZ385 60--------------------------------SESPVVEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETPGSE94

PB18o ou LMD9 720VQNGLITLAPRLLAEIPGGKVTVQ743

CNRZ 385 688AQKRIDHLGSTSISRDSWRKVTVK711

fonction inconnue

PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946

CNRZ 385 904SGDKNIYSGNP914

Région fixation du substrat

PB18o Moyen pouvoir acidifiantLMD9 Fort pouvoir acidifiant

Variabilité du système protéolytique de surface

Séquençage du gène prtS :

PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946

CNRZ 385 904SGDKNIYSGNP914

Région fixation du substrat

PB18o Moyen pouvoir acidifiantLMD9 Fort pouvoir acidifiant

Conclusion

Variabilité du système protéolytique de surface

Pouvoir acidifiant

Gène prtS Activité caséinolytique

Fortes 12/12 12

Moyennes 11/16 3/16

Faibles 0/2 0/2

Variabilité affecte la régulation du gène

- Variabilité en terme de présence / absence du gène prtS

- 2 allèles prts différents ont été mis en évidence chez S. thermophilus

Perspectives :

- Etude de la régulation du gène prtS entre

- les souches qui ont le gène et qui l’expriment fortement

- et les souches qui ont le gène et qui l’expriment peu ou pas.