Ex. du Danio rerio - Master Pathologie Humainemaster-pathologie-humaine.org/IMG/pdf/Cours_modeles_experimentau… · Facteurs de virulence Mécanismes de résistance Mécanismes de

Audrey BERNUT

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Apport des modèles animaux pour l’étude des infections

mycobactériennes

Ex. du Danio rerio

Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques - Pathogénie Tuberculeuse et Nouvelles Cibles Thérapeutiques - Montpellier

Apport des modèles animaux pour l’étude des

infections mycobactériennes

Ex. du Danio rerio

Plan

1) Intérêt des modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses - Généralités sur les modèles expérimentaux

- Focus sur le Danio rerio

2) L’embryon de Danio rerio comme modèle d’étude des infections mycobactériennes - Mycobacterium marinum / Danio rerio comme modèle d’étude de la tuberculose

- L’embryon de Danio rerio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de Mycobacterium

abscessus



Ex. du Danio rerio

Plan





abscessus

Les maladies infectieuses : enjeux majeur en santé publique

La problématique

Début des années 80

- Emergence et réémergence de maladies infectieuses

- Maladies nosocomiales

…. Et toutes les autres

(Données WHO, 2008)

- Emergence mondiale de la résistance aux ATB

- Manque/absence de vaccins/traitements

- Physiopathologie des maladies mal/non connue

Urgent

La problématique

Prévenir les maladies infectieuses

• Nouvelles thérapies anti‐infectieuses actives contre de nouvelles cibles bactériennes

• Nouveaux vaccins : Recherche et identification de nouveaux constituants spécifiques

Une solution?

Mieux comprendre la physiopathologie

des maladies infectieuses

Problème dans le cas des maladies humaines Expérimentation sur l’homme?

Louis Pasteur (1822‐1895)

Importance de connaître le « mode de vie »

des microorganismes afin de les domestiquer et de contrer leurs éventuels effets néfastes

Couple hôte ‐ pathogène

Facteurs de virulence

Mécanismes de résistance Mécanismes de défense

Utilisation de modèles animaux

« En recherche biomédicale, un modèle animal est un modèle permettant l'étude de

données de référence sur la biologie ou le comportement, ou chez lequel on peut étudier

un processus pathologique spontané ou induit, celui-ci ayant un ou plusieurs aspects

communs avec un phénomène équivalent chez l'humain ou d'autres espèces animales. »

L'American National Research Council Committee on Animal Models for Research and Aging

Utilisation des animaux comme modèles pour : - Comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie

- Elaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques

Expérimentation animale en infectiologie

Modèle animal

Le choix du modèle animal le plus approprié selon la condition à étudier est délicat et

fondamental afin de pouvoir valider l’extrapolation qui sera faite à l’homme.


Choix du modèle

Le modèle parfait n’existe pas

Simplicité d’analyse génétique

Meilleure analogie possible

/ cas humain

Faible coût d’élevage

Facilité d’élevage Vitesse de reproduction

Simplicité d’analyse génétique

Etudes physiologiques

développées

Biochimie facile Reproductibilité des

résultats

Qualités d’un modèle

Intérêt de croiser les résultats obtenus à partir de plusieurs modèles ?

Limites des modèles animaux


Une analogie jamais parfaite

Influence des facteurs non

expérimentaux sur la

réponse du modèle

Anatomie Suivre des procédures validées

Aspects techniques de l’élevage Physiologie

Techniques expérimentales

Reproductible

Ethique

Modèles mammifères traditionnels utilisés


L'expérimentation animale : une pratique controversée


Analogie avec l’homme? Problèmes éthiques

Méthodes alternatives à l’expérimentation animale ?

Les méthodes alternatives

- Modèles cellulaires ou tissus/organes isolés

- Méthodes physico-chimiques

- Modèles mathématiques et informatiques

Utilisation des animaux à des fins scientifiques reste à l’heure

actuelle incontournable

Méthodes alternatives à l’expérimentation animale ?

L'expérimentation animale d’aujourdhui, un nouveau leitmotiv :

le bien-être animal

« Principe des 3 R »

Remplacement de l’animal par des

méthodes alternatives

Réduction

du nombre d’animaux

utilisés dans les études

Raffinement des procédures d’expérience dans

le but d’éviter ou de diminuer la

souffrance animale

Mais aussi….Utilisation d’espèces animales pour lesquelles les connaissances

scientifiques établissent qu’elles sont moins sensibles aux contraintes établies

Modèles non mammifères

Arabidopsis thaliana

Danio rerio

Caenorhabditis elegans

Drosophila melanogaster

Dictyostelium discoideum

Acanthamoeba sp.



Ex. du Danio rerio

Plan





abscessus

Le Danio (Danio rerio ou Zebrafish)

Généralités • Poisson tropical d'eau douce • Téléostéen, famille des Cyprinidés • Originaire des régions nord-est de l’Inde

• Initialement : utilisé comme modèle en biologie du développement

• Aujourd’hui : - Ecotoxicologie / toxicologie

- Génétique

- Biologie cellulaire

- Neurobiologie

- Cancérologie

- Pharmacologie

- Et INFECTIOLOGIE

Le Danio (Danio rerio ou Zebrafish)

Organisme modèle pour l'étude de diverses maladies

infectieuses

(Neely et al. 2002;

Miller et Nelly, 2004;

Bates et al. 2005)

(lin et al. 2007)

(Vergunst et al. 2010)

(Menudier et al. 1996)

Pseudomonas aeruginosa

Pathogène le mieux étudié et caractérisé chez le danio

Mycobacterium marinum

Streptococcus sp.

Staphylococcus aureus

Burkholderia cenocepacia

Listeria sp.

(Brannon et al. 2009; Clatworthy et al. 2009)

Avantages du danio comme modèle d'infection

Élevage en laboratoire aisé et peu onéreux

• Petite taille • Conditions d’élevage peu stringentes • Excellentes capacité reproductives • Temps de génération court

Nombreux outils / bases de données disponibles

• Génome entièrement séquencé http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/ - 85% d’identité avec l’homme

• Annotation en cours http://www.genetics.wustl.edu/fish_lab/frank/cgi-bin/fish/ - Nombreux gènes orthologues avec les mammifères

• Nombreuses bases de données disponibles sur internet - ZFIN : http://www.shigen.nig.ac.jp:6070/

• Large gamme d’outils cellulaires, moléculaires et génétiques - Technologie antisens : Oligonucléotides morpholinos

- Puces à ADN


Système immunitaire (SI) homologue à celui des mammifères

- Leucocytes, macrophages, granulocytes

- Système complément actif avec 3 voies

différentes - Voie classique

- Voie des lectines

- Voie alternative

- Nombreux récepteurs

- TLR

- Cytokines proinflammatoires (TNFa IL1B

INF1, INF2, IL10, 11, 15, 22 et 26)

- Chimiokines

- Lymphocytes T CD4 et CD8

- Lymphocyte B

- Ig et TCR avec diverses

recombinaison et

réarrangement durant le

développement

SI inné SI adaptatif


Elaboration progressive du SI


SI innée puis SI adaptatif

Suivi spatiotemporel non invasif du processus infectieux in vivo

• Fécondation et développement ex utéro

• Transparence des embryons


1dpi

2dpi

3dpi

4dpi

5dpi

Suivi du même embryon sur 6dpi

6dpi

0dpi

Utilisation

bactéries fluo

Utilisation de lignées transgéniques



MPEG::DsRed

mpx::eGFP

Macrophages Sécrétion IL1b

Neutrophiles

IL1b::eGFP © G

. L

utfa

lla

Utilisation de lignées

transgéniques

+

bactéries fluo



La transparence un potentiel extraordinaire pour l’étude des interactions hôte-pathogène

mpx::eGFP

© M

. N

guyen C

hi

Limites du modèle

• Manque d’Ac monoclonaux • Site ZFIN : plus de 400 Ac répertoriés (en développement)

• Manque de lignées cellulaires • Alternative : la carpe commune

• Transparence : limitée à 3 semaines

• Lignée transparente : Casper

• Modèle medaka

• Température • Maintenance du danio entre 26 et 29°C / pathogènes mammifères adaptés à la T°C de leur hôte

Interactions dans ce modèle affectées?

• Différences anatomiques évidentes

• Pas de méthode globale pour une suppression de gène ciblé

• Oligonucléotides morpholinos

• Mutation d’insertion

• SI • Identification de cellules dendritiques non établie

Le danio comme modèle d'infection

Qu‘est ce que le modèle danio nous apprend de plus que les autres

Pourquoi le danio comme modèle d’infection

Vertébrés Invertébrés

Un « hybride invertébré / murin»

Qu‘est ce que le modèle danio nous apprend de plus que les autres

Pourquoi le danio comme modèle d’infection

Vertébrés Invertébrés

• Données fondamentales

• Ethique

• Suppression sélective de gène

• Suppression sélective de gène

• Proche de l’homme évolutivement

• Données fondamentales

• Proche de l’homme évolutivement

• SI : branche innée et adaptative

• Etude non invasive

• Maintenance

• Ethique

• Etude non invasive et moins laborieuse

Stratégie d’infection

Déchorionage mécanique



Voie d’infection naturelle : Tractus gastro intestinal, branchies, lésions…

• Co incubation : inoculation dans un milieu contenant des bactéries

• Injection intrapéritonéale ou intramusculaire sur embryons anesthésiés

(microinjection entre 28hpf et 30 hpf voir jusqu’à 48hpf)

Infection expérimentale


Heart

Hindbrain ventricle

Otic vesicle

Spinal chord

Notochord Subcutenous

Caudal vein (CHT)

Yolk

Injection dans différents

compartiments

200μm




Ex. du Danio rerio

Plan





abscessus

La tuberculose

Contexte actuel • M. Tuberculosis agent étiologique de la tuberculose

• 1/3 de la planète actuellement infecté

• Plus de 2 millions morts/an

• Traitements inadaptés : apparition de souches multirésistantes et ultrarésistantes

(Données WHO, 2011)

La tuberculose

Le granulome

tuberculoïde

Importance de la compréhension des mécanismes de formation des granulomes pour

expliquer la physiopathologie de la tuberculose et développer des traitements efficaces

(Russell, 2007)

Forme latente (90%)

Asymptomatique

Forme réactivée (10%)

Symptomatique

La tuberculose

Modèle murin non adapté

pour décripter la formation

du granulome


Un couple pathogène-hôte comme modèle de la tuberculose

Danio rerio

Observation et analyse in vivo de la formation de granulomes

La tuberculose

Pourquoi utiliser M. marinum ?

• Induit la tuberculose du poisson

• Proximité phylogénique avec M. tuberculosis

• Génome séquencé

• Restrictions en biosécurité plus faibles

• Température optimale de croissance de 25-30°C

M. bovis

M. tuberculosis

M. africanum

M. canetti

M. microti

M. smegmatis

M. marinum M. ulcerans

M. leprae

M. paratuberculosis M. avium

M. tuberculosis

complex

Mycobactéries à croissance lente

M. abscessus

Mycobactéries à croissance rapide

Un bon modèle pour comprendre le granulome tuberculeux dans le modèle danio

M. marinum

Couple M. marinum / danio

Que peut nous apprendre le couple M. marinum / danio ?

Danio rerio


Couple M. marinum / danio

Apport du couple M. marinum / danio

Des résultats inattendus

• SI inné + adaptatif longtemps considérés comme nécessaire à la formation du granulome

Formation du granulome est en premier lieu le fait du SI inné

© L

. A

libaud

Pré-granulome

M. ma::eGPF MPEG::DsRed Overlay

Injection dans la veine caudale

© G

. Lutfalla

Infections

Lignée transgénique

avec

MmaM MPEG::DsRed


Identification et caractérisation de nouveaux facteurs

de virulence mycobactériens

• Banque de mutants transpositonnels M. marinum (JD Cirillo, Texas, USA)

Dictyostelium discoideum

Screening de la banque dans Dictyostelium disciodeum

• Amibe sociale, vivant sur des tapis de feuilles mortes

• Utilisée initialement en biologie cellulaire

• Culture et maintenance facilitées

• Hôte modèle pour différentes bactéries pathogènes

…et aussi pour M. marinum (Solomon et al, 2003)

Pourquoi utiliser Dictyostelium discoideum ?

Régime principal composé

de bactéries

Apport du modèle dictyostelium

Klebsiella aerogenes

4-8 days

at 25°C

Dictyostelium M.marinum

Phagocytosis

plaque

Bacterial

layer

Bactérie

pathogène

Bactérie non

pathogène

(Alibaud L. et al, 2011)


MmaM_L1D

MmaM

MmaM_RD1

Msm

Avant le screening ...

Mise au point des conditions permettant la discrimination

des souches virulentes/avirulentes

Un moyen facile d’identifier

des mutants



MmaM

MmaM_RD1

MmaM_47

MmaM _87

Identification d’un mutant

attenué : MmaM_47

Screening de la banque transpositionnelle de M. marinum dans Dictyostelium

PCR1 (~370pb)PCR2 (~850pb)PCR3

PCR3 (735bp)

MMAR_1778 (tesA)

MmaM_47

MmaM

hyg probe

Tn5370

Identification d’une insertion dans MmaM_47


Insertion dans tesA, présent dans le cluster de DIM

ppsA ppsB ppsC ppsD ppsE mas pks1

ppsA ppsB ppsC ppsD ppsE mas pks1

M. tuberculosis

M. marinum



Biosynthèse des DIMs et des PGLs chez M. tuberculosis

PGL

O O O

R

O O

sugar

2-5 2-5

15-17 15-17

16-22

PapA5

R: =O

--OCH3 Phthiocerol A Phthiodiolone A

PpsE FadD26, PpsA-D

Fattyacid O H

O 18-20

O H O H R

O H O H

S

O O

KS

AT

ACP

C

TesA 18-20

18-20

DIM

O O R O O

18-20

2-5 2-5

15-17 15-17

PapA5

FadD28, Mas

Fattyacid

Mycocerosic acid

O H

O

H O O

15-17

14-16

2-5

O H O H R

Phenolphthiocerol A Phenolphthiodiolone A

16-22

R: =O

--OCH3

Chorismate

FadD22, Pks15/1, FadD29, PpsA-D

pyruvate

p-HBA

H O C O O H

O

- O O C C H 2

H O C O O H

H O

S

O O O H O H H O

16-22

TesA

PpsE

KS

AT

ACP

C



DIM phthiocerol dimycocerosate

PGL glycolipides phénoliques



PGL I

PGL II

Profil des DIMs et PGLs dans le mutant tesA::Tn

Mutant tesA::Tn incapable de synthétiser les

PDIMs et les PGLs

DIM A

1

2

DIM B

1

2

Purified spots

MmaM MmaM_87 tesA::Tn tesA::Tn + pMV261_tesA

1

2

1

2

1

2

1

2

La complémentation avec tesA

restore la virulence



Validation du phénotype du mutant

tesA::Tn dans un organisme plus

complexe et plus spécifique ?


Infection du mutant tesA::Tn dans différents compartiments

Heart

Hindbrain ventricle Otic vesicle

Spinal chord


Caudal vein

Yolk


pre-granuloma aggregates no granuloma formation very few infected macrophages


Infection du mutant tesA::Tn dans différents compartiments



Macrophage infecté

MmaM RD1 tesA::Tn

Mutant tesA::Tn incapable de se multiplier dans les macrophages

Infection du mutant tesA::Tn

dans différents compartiments

Cerveau Vésicule otique

Le mutant tesA::Tn présente une réduction de virulence lorsqu’il est injecté dans tous

les compartiments excepté…



Heart

Hindbrain ventricle

Otic vesicle

Spinal chord


Caudal vein (CHT)

Yolk

Notochorde : seul compartiment permettant

La prolifération de tesA::Tn

Heart

Hindbrain ventricle Otic vesicle

Spinal chord


Caudal vein (CHT)

Yolk



tesA::Tn_GFP blood flow tesA::Tn_mC Notochord

1hpi

2dpi

5dpi

7dpi

infection et mort rapide de

l’embryon

Co-Infection avec tesA::Tn

infection controlée

par les macrophages


Injection dans la notochorde

© G

. Lutfalla

Infections

Lignée transgénique MPEG

/

MmaM MPEG::DsRed

© L

. A

libaud

M. ma::eGPF MPEG::DsRed Overlay

La notochorde est inaccessible aux macrophages

Notochorde

• Identification d’un mutant de virulence dans dictyostelium

• Le mutant tesA incapable de synthétiser les DIMs et GPLs

• Le mutant tesA attenué dans le poisson

Apport du trio M. marinum / dictyo/ danio

Identification et caractérisation de nouveaux facteurs

de virulence mycobactériens

Rôle clé des ces glycolipides de paroi pour la virulence

de M. marinum

gène tesA : Bon candidat en temps que cible thérapeutique

• Découverte d’un nouveau compartiment qui permet la prolifération du mutant tesA

la notochorde (absence de macrophages)

Apport du trio M. marinum / dictyo/ danio

Modèle d’étude pour la tuberculose osseuse

● 1-2% des cas de tuberculose

● Destruction des disques intervertébraux et progressive affaissement vertébral



Ex. du Danio rerio

Plan





abscessus

Mycobacterium abscessus

Généralités

• Mycobactérie à croissance rapide (MCR) • Pathogène émergeant • Large spectre d’infections

Infections à M. abscessus associées au

développement de lésions granulomateuses

pseudo-tuberculeuses

(So

ng e

t a

l. 2

01

0)

Problème majeur

Atteintes pulmonaires chez les patients

mucoviscidosiques


(Medjahed et al. 2009)

GPLs

Glycopeptidolipides (GPLs)


Modèle ex vivo Modèle in vivo

(Ca

the

rin

ot

et

al, 2

007;

Byrd

et

Lyons,

1999)

• Colonies rugueuses

• Persistence et mutiplication

• Hypervirulent

• Réponse pro-inflammatoire intense / TNF-α

• Colonies muqueuses

• Incapable de se multiplier

et de persister

• Atténué

Morphotype S Morphotype R

Glycopeptidolipides (GPLs)


Contexte actuel

• Aucun vaccin disponible • Résistance naturelle + apparition de souches multirésistantes • Mécanismes moléculaires / déterminants de virulence requis pour le développement de la maladie inconnus

Nécessité de développer de nouveaux modèles d’étude pertinents

Souris

Peu de modèles d’étude

disponibles

ex vivo

Macrophages

Lignées cellulaires

in vivo


Que peut nous apprendre le modèle d’infection danio ?

Injection dans la veine caudale

Étude de la virulence de M. abs dans les embryons de danio

Suivi en temps réel de l’infection

Tropisme préférentiel pour le cerveau (40% des embryons)

Formation de foyers infectieux localisés au niveau du

SNC exclusivement avec la souche R

(60% des embryons)

Variant R plus virulent que S

Analyse de la survie Évaluation de la charge bactérienne au cours de l'infection

Charge bactérienne plus importante

chez les embryons infectés par le

variant R

A partir de 3dpi

0 à 3dpi

Multiplication des 2 variants

Log

CFU

/ e

mb

ryo

2μm

1μm

3 dpi

5μm

1μm

1μm 10μm

5μm 2μm

Cerveau Moelle épinière

7 dpi 3 dpi

• Bactéries internalisées

• Pas de pré-granulome

• Siège de divisions bactériennes intenses

Exploration ultrastructurale des foyers infectieux

Étude de la virulence de M. abs dans les embryons de danio

Controle

1 dpi 6 dpi 6 dpi

Variant R

dans

La lignée transgénique mpx:GFP

Moelle épinière Cerveau

Recrutement des neutrophiles

SI inné de l'hôte dans le contrôle de l'infection

SI inné de l'hôte dans le contrôle de l'infection

Profil de cytokines au cours de l'infection

1,E-05 1,E-04 1,E-03 1,E-02

Témoins_24hpi

Variant_S_24hpi

Variant_R_24hpi

Témoins_48hpi

Variant_S_48hpi

Variant_R_48hpi

Témoins_5dpi

Variant_S_5dpi

Variant_R_sans foyer_5dpi

Variant_R_avec_foyers_5dpi

IL1b

1,E-06 1,E-05 1,E-04 1,E-03

TNFα

1,00E-06 1,00E-05 1,00E-04

IFNγ2

Production précoce

de IL1b et de TNFa

suite à l’infection par

les 2 variants puis de IFNG2

La production de ces cytokines pro-inflammatoires est significativement plus importante lors des infections à R

Variant R

dans

La lignée transgénique IL1b:GFP

MabsR::mCherry IL1b::eGFP Overlay

© G

. Lutfalla

L’embryon de danio comme nouveau modèle d’infection pour

l’étude de M. abscessus

Le danio : un bon potentiel pour étudier la virulence

de M. abs

► Étude de la virulence des morphotypes R et S dans l’embryo de danio

• Les 2 morphotypes sont capables de se multiplier dans le poisson

• La souche R établi une infection létale plus rapide que la souche S

• Développement de foyer infectieux au niveau du SNC→ Cerveau

► Contribution du SI inné de l’hôte dans le contrôle de l'infection

• Recrutement actif des neutrophiles aux foyers infectieux

• Production précoce de IL1b et de TNFa suite à l’infection par les 2

souches puis de IFNG2.

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