Fichier Thèse Delphine Bon pour BU en ligne OKthesesups.ups-tlse.fr/152/1/Bon_Delphine.pdf · Delphine BON le 11 décembre 2007 Evaluation de deux nouveaux outils pour l’étude

T H E S E

en vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE TOULOUSE

Délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier

Ecole doctorale Sciences de la Matière

Spécialité: Chimie Biologie Santé.

Présentée et soutenue par

Delphine BON

le 11 décembre 2007

Evaluation de deux nouveaux outils pour l’étude d’échantillons biologiques par

spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire:

-La RMN HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning): une technique d’analyse

d’échantillons bruts;

-La Métabonomique: une méthode d’analyse statistique des spectres pour la recherche

de signatures métaboliques.

Directeurs de thèse: Dr. Franck Desmoulin et Pr. Myriam Malet-Martino.

JURY

Président M. Robert Martino Professeur à l’UPS Toulouse

Rapporteurs Mme

Anne-Marie Delort DR CNRS Clermont-Ferrand

Mme

Roxanne Deslauriers DR CNRC Winnipeg (Canada)

Examinateurs Mme

Michelle Gué Professeur à l’UPS Toulouse

M. Martial Piotto Ingénieur chez Bruker Biospin Wissembourg

M. Franck Desmoulin CR INSERM Toulouse

Groupe de RMN Biomédicale, Laboratoire de Synthèse et Physicochimie de Molécules d'Intérêt Biologique

(LSPCMIB) - UNIVERSITE PAUL SABATIER - UMR CNRS UPS 5068 - Bât 2R1 - 118, route de Narbonne -

31062 Toulouse Cedex 9.

Tout d’abord, je tiens à remercier Pierre Tisnès ainsi que Michel Baltas, directeurs

successifs du laboratoire de Synthèse et PhysicoChimie de Molécules d’Intérêt Biologique, de

m’avoir accueilli.

Je remercie Anne-Marie Delort et Roxanne Deslauriers d’avoir accepté de juger mon

travail et d’en avoir été les rapporteurs. Merci à Michèle Gué et à Martial Piotto pour leur

participation au jury de cette thèse ainsi qu’à Robert Martino pour avoir accepter de présider

le jury.

Merci à Myriam Malet-Martino et Robert Martino qui m’ont permis de réaliser mon

travail de thèse dans leur groupe. Je les remercie pour leur bienveillance et leur aide au

quotidien.

Un grand merci à Franck Desmoulin qui m’a encadré au côté de Myriam pendant ces 3

années. Je le remercie pour sa gentillesse, sa disponibilité, sa patience, son aide en toute

circonstance et bien sûr pour son esprit « holistique ».

Merci à tous les autres membres du groupe de RMN Biomédicale pour leur présence et

leur bonne humeur. Joëlle, Brigitte, Véronique, ça a été un réel plaisir de travailler à votre

contact. Merci à Rémi et Olivier pour leurs conseils avisés d’ex-thésards. Un petit coucou

spécial à Saleh qui a partagé avec moi les joies et les soucis du labo pendant ces 3 ans. Un

grand merci aussi à Denis qui a su répondre présent aux moments critiques pendant la

dernière année, je lui souhaite bon courage et plein de bonheur pour la fin de sa thèse. Un

petit message de bienvenue à Stéphane et à Sacha qui ont rejoint l’équipe récemment.

Je remercie aussi les membres du service commun de RMN (Stéphane, Marc, Pierre et

Yannick) qui m’ont aidé à « dresser » les spectromètres, même si les choses ont parfois été

compliquées.

Un grand merci à tous mes amis, Freddy et Rodolphe en première ligne avec qui j’ai

parcouru un certain nombre d’années et sans qui je n’aurais pas fait ce parcours. Merci pour

tous ces moments. Sans oublier bien sûr Julie, Clément, Stéphanie, Damien, Adrien, Aline,

Yiqian, Ghis et Bruno, Olivier.

Enfin un grand merci à mes parents et à mon frérot pour leur soutien de tous les jours.

Merci à tout le reste de la famille et enfin, une petite pensée pour ceux qui sont partis.

Tables des matières.

1

TABLE DES MATIERES.

ABREVIATIONS. .................................................................................................................. 5

INTRODUCTION GENERALE. ......................................................................................... 7

PARTIE EXPERIMENTALE. ........................................................................................... 13

1. Produits chimiques. .......................................................................................................... 15

2. Matériel. ............................................................................................................................ 15

3. Préparation des échantillons. .......................................................................................... 15

3.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa .................................................................. 15

3.2 Larve Harpalus rufipes............................................................................................... 16

3.3 Tissus biologiques. ...................................................................................................... 16

3.4 Végétaux. ..................................................................................................................... 17

3.5 Préparation des cellules de glioblastomes. ............................................................... 17

3.6 Protocole d’extraction................................................................................................ 18

4. RMN .................................................................................................................................. 19

4.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa. ................................................................. 19

4.2 Larve de carabe Harpalus rufipes. ............................................................................ 20

4.3 Tissus biologiques bruts............................................................................................. 21

4.4 Extraits biologiques.................................................................................................... 23

5. Analyse statistique............................................................................................................ 25

CHAPITRE 1: La RMN HR-MAS: une technique d’analyse d’échantillons bruts. ..... 27

Introduction. ......................................................................................................................... 29

1. Historique de la RMN HR-MAS..................................................................................... 30

2. Principe de la technique................................................................................................... 31

2.1 Interactions et effets prédominants dans un milieu anisotrope. ............................ 31

2.1.1 L’anisotropie en RMN. .......................................................................................... 31

2.1.2 Représentation d’un système de spins nucléaires dans un champ magnétique. ... 31

2.1.3 Interactions dipolaires. ......................................................................................... 32

2.1.4 Susceptibilité magnétique...................................................................................... 33

2.1.5 Anisotropie de déplacements chimiques. .............................................................. 35

2.1.6 Couplages quadripolaires. .................................................................................... 36

2.1.7 Cas particulier des échantillons hétérogènes multiphasiques. ............................. 36

2.2 Types d’interaction dans le cas des échantillons biologiques. ................................ 37

2.3 L’équipement HR-MAS............................................................................................. 38


2

3. Les différentes applications de la RMN HR-MAS. ....................................................... 41

3.1 Applications de la RMN HR-MAS en chimie. ......................................................... 41

3.2 Applications de la RMN HR-MAS en biologie. ....................................................... 43

3.2.1 Etude des composés membranaires en suspension aqueuse. ................................ 43

3.2.2 Cellules.................................................................................................................. 44

3.2.3 Tissus. .................................................................................................................... 45

3.2.4 Agronomie. ............................................................................................................ 46

3.3 Conclusion................................................................................................................... 47

4. Evaluation de la RMN HR-MAS à travers l’étude de différents types d’échantillons

biologiques: avantages et limitations. ................................................................................. 48

4.1 Effet de la mise en rotation de l’échantillon à l’angle magique. ............................ 48

4.1.1 Cas du ver Aporrectodea caliginosa non dépuré.................................................. 48

4.1.2 Cas des tissus biologiques..................................................................................... 49

4.2 Matériel adapté à l’analyse de faibles volumes. ...................................................... 52

4.3 Effet de la vitesse de rotation. ................................................................................... 52

4.4 Effet de la température. ............................................................................................. 55

4.5 Stabilité des échantillons au cours du temps. .......................................................... 56

4.6 Problèmes liés aux échantillons biologiques. ........................................................... 59

4.7 Observation simultanée des métabolites hydrosolubles et des lipides................... 62

4.7.1 Les lipides.............................................................................................................. 62

4.7.2 Les métabolites hydrosolubles. ............................................................................. 63

4.7.3 Attribution des signaux.......................................................................................... 65

4.8 Quantification des métabolites. ................................................................................. 69

4.8.1 Choix des paramètres d’acquisition...................................................................... 70

4.8.2 Quantification de solutions standards par RMN HR-MAS. .................................. 71

4.8.3 Quantification des métabolites présents dans le tissu rénal par RMN HR-MAS.. 72

5. Analyse du ver Aporrectodea caliginosa par RMN HR-MAS. ..................................... 79

6. Analyse de la larve de carabe Harpalus rufipes par RMN HR-MAS. ......................... 88

CHAPITRE 2: La Métabonomique: une méthode d’analyse statistique des spectres pour

la recherche de signatures métaboliques.......................................................................... 103

Introduction ........................................................................................................................ 105

1. Les méthodes statistiques............................................................................................... 107

1.1 Méthodes statistiques uni/bivariées. ....................................................................... 107

1.1.1 Variance et écart type. ........................................................................................ 107


3

1.1.2 Le test de Student................................................................................................. 107

1.2 Méthodes statistiques multivariées ......................................................................... 108

1.2.1 Analyse en composantes principales (ACP)........................................................ 108

1.2.2 Classification....................................................................................................... 110

1.2.3 Analyse de la variance (ANOVA)........................................................................ 110

1.3 Conclusion sur les méthodes statistiques. .............................................................. 111

2. Logiciels et technique analytique utilisés. .................................................................... 111

2.1 Logiciels utilisés. ....................................................................................................... 111

2.1.1 Logiciel AMIX. .................................................................................................... 111

2.1.2 Logiciel développé sous R. .................................................................................. 111

2.2 Technique analytique: la RMN. .............................................................................. 112

2.3 Remarques concernant l’utilisation des données RMN pour le traitement

statistique par ACP. ....................................................................................................... 113

2.3.1 Taille de la matrice. ............................................................................................ 113

2.3.2 Incidence de la variabilité du pH. ....................................................................... 116

2.3.3 Prétraitement des spectres. ................................................................................. 116

2.3.4 Mise en évidence des échantillons atypiques. ..................................................... 116

2.4 Développement d’outil statistique pour la combinaison des données de différentes

origines. ........................................................................................................................... 119

2.4.1 Normalisation et criblage des variables. ............................................................ 120

2.4.2 Combinaison de variables de différentes origines. ............................................. 121

3. Application à la recherche de marqueurs métaboliques caractéristiques de la

résistance à la radiothérapie des glioblastomes. .............................................................. 124

3.1 Introduction. ............................................................................................................. 124

3.2 Analyse métabonomique par RMN de lignées cellulaires de glioblastomes

humains. .......................................................................................................................... 125

3.2.1 Récupération et extraction des cellules............................................................... 125

3.2.2 Attribution des signaux........................................................................................ 127

3.2.3 Analyse quantitative. ........................................................................................... 133

3.2.4 Zone des composés à choline. ............................................................................. 134

3.2.5 Effet de la confluence. ......................................................................................... 135

3.2.6 Recherche d’un marqueur métabolique discriminant le phénotype radiorésistance

vs phénotype radiosensible........................................................................................... 138

3.3 Conclusion................................................................................................................. 142


4

4. Analyse métabonomique des modifications précédant l’insuffisance cardiaque chez le

rat SHHF obèse................................................................................................................... 144

4.1 Introduction. ............................................................................................................. 144

4.2 Analyse des extraits hydrosolubles. ........................................................................ 145

4.3 Analyse des extraits organosolubles. ...................................................................... 149

4.4 Analyse combinée des données................................................................................ 151

4.5 Conclusion................................................................................................................. 153

CONCLUSION GENERALE. .......................................................................................... 155

BIBLIOGRAPHIE. ............................................................................................................ 159

RESUME............................................................................................................................. 177

Abréviations.

5

ABREVIATIONS.

15N Azote-15

13C Carbone-13

19F Fluor-19

31P Phosphore-31

1H Proton-1

Ace Acétate

ACP Analyse en Composantes Principales

ADP Adénosine diphosphate

Ala Alanine

AMP Adénosine monophosphate

ANOVA "ANalysis Of Variance" (Analyse de la variance)

Asp Aspartate

ATP Adénosine triphosphate

CCM Chromatographie sur Couche Mince

CDCl3 Chloroforme deutéré

Cho Choline

"Cho" Composés à choline (Cho, PC, GPC)

COSY COrrelation SpectroscopY

CP Composante Principale

CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gill

Cr Créatine

"Cr" Composés dérivés de la créatine (Cr, PCr et créatinine)

CV Coefficient de Variation

D2O eau deutérée

DMEM "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" (milieu de Eagle modifié par Dulbecco)

For Formiate

GABA γ-Aminobutyrate

Gln Glutamine

Glu Glutamate

Gly Glycine

GPC Glycérophosphorylcholine

GPE Glycérophosphoryléthanolamine

GSH Glutathion

His Histidine

HR-MAS "High-Resolution Magic Angle Spinning" (haute résolution avec rotation à

l’angle magique)

β-HB β-Hydroxybutyrate

IC Insuffisance Cardiaque

Ile Isoleucine

IR Infrarouge

Lac Lactate

Leu Leucine

LM Lipides Membranaires

Lys Lysine

MAO Monoamine oxydase

MPA Acide méthylphosphonique

MyoI Myo-Inositol

NAA N-acétylaspartate

Abréviations.

6

NAAG N-acétylaspartylglutamate

NAC N-acétylcystéine

α, β, et γ-

NTP

Phosphore α, β, et γ des nucléotides triphosphates

α, β-NDP Phosphore α et β des nucléotides diphosphates

PC Phosphorylcholine

PCr Phosphocréatine

PDE Phosphodiester

PE Phosphoryléthanolamine

Phe Phénylalanine

Pi Phosphate inorganique

PL Phospholombricine

PME Phosphomonoester

PSM Poste de Sécurité Microbiologique

PtCho Phosphatidylcholine

RF radiofréquence

RMN Résonance Magnétique Nucléaire

RR Radiorésistant

RS Radiosensible

ScylloI Scyllo-Inositol

SHHF rat "Spontaneous Hypertensive Heart Failure rat" (rat spontanément hypertendu et

développant une insuffisance cardiaque)

Succ Succinate

SVF Sérum de Veau Fœtal

T1 Temps de relaxation longitudinale

T2 Temps de relaxation transversale

Tau Taurine

TCB 1,3,5-trichlorobenzène

Thr Thréonine

TMPS-d6 acide 3-(triméthylsylil)-1-propane sulfonique-d6

TMS Tétraméthylsilane

Tyr Tyrosine

UV Ultraviolet

7

INTRODUCTION GENERALE.

8

Introduction générale.

9

De la chimie à la biologie, la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est devenue un

outil analytique indispensable pour l’analyse de mélanges tels que des extraits biologiques ou

ceux provenant de la chimie sur support solide.

Cette technique analytique permet l’observation de tous les composés grâce à

l’obtention d’un signal de précession libre pour un noyau donné, à la seule condition que ce

noyau possède un spin nucléaire non nul. Dès lors que la molécule ou le mélange étudié

contient ce noyau, il est possible d’obtenir un signal RMN. A titre de comparaison, il est

nécessaire que les molécules présentes dans l’échantillon soient susceptibles d’être séparées et

ionisées pour pouvoir être observées par spectrométrie de masse. La RMN permet d’obtenir

une représentation «totale» d’un mélange, sans préparation, au lieu d’une analyse moléculaire

ciblée correspondant à la détection spécifique de chaque constituant.

Cependant, il existe certains obstacles à l’utilisation de la RMN pour l’analyse des

mélanges: d’une part, sa faible limite de sensibilité et, d’autre part, un problème de

dynamique de concentrations. Malgré l’augmentation de la puissance des aimants et

l’utilisation de cryosondes qui ont permis un gain en sensibilité d’un facteur 3 ou 4, la RMN

reste une technique analytique peu sensible. En effet, sa limite de détection est de l’ordre de la

nanomole, nettement supérieure à celle de la spectrométrie de masse qui est de l’ordre de la

fentomole. Cependant, c’est la seule technique permettant l’observation globale et non

destructive des composés présents dans l’échantillon sans préparation ni a priori sur leurs

structures.

L’analyse des échantillons biologiques par RMN a longtemps été limitée, pour des

raisons de technique RMN et d’intérêt scientifique, à l’observation des noyaux phosphore-31

(31

P) et carbone-13 (13

C) principalement. La RMN 31

P est la seule méthode permettant la

mesure du potentiel de phosphorylation et du pH intracellulaire de manière non invasive sur

les cellules ou les organes1. La RMN

13C combinée à l’utilisation de substrats sélectivement

enrichis en 13

C a permis de mettre en évidence de nouvelles voies ou de nouveaux cycles

métaboliques2. Bien qu’étant ubiquitaire et plus sensible, le noyau d’hydrogène (proton,

1H)

n’a été que plus tardivement utilisé pour l’analyse des tissus biologiques. En effet, la RMN 1H

n’a pu se développer qu’en compensant sa faible distribution spectrale (qui est de 12 ppm) par

une meilleure résolution des signaux, c'est-à-dire grâce au développement d’aimants générant

des champs magnétiques supérieurs à 5 Tesla. De plus, il était impératif de pouvoir éliminer

le signal des hydrogènes de l’eau qui correspond à 111 mol.L-1

. Ceci devint possible avec

l’élaboration de séquences d’élimination sélective du signal de l’eau et l’augmentation de la

dynamique des convertisseurs analogiques digitaux des spectromètres.


10

Ces améliorations techniques et méthodologiques ont rendu aisée l’observation du 1H

pour analyser les métabolites présents dans les cellules ou les tissus. Cependant, certaines

caractéristiques comme la variation de pH entre différents compartiments des échantillons ou

l’existence d’inhomogénéités de susceptibilité magnétique concourent à un élargissement des

signaux et/ou à leur recouvrement. Par conséquent, l’obtention de spectres de haute résolution

permettant une quantification correcte des métabolites nécessite le plus souvent une extraction

préalable des composés présents dans les cellules ou les tissus. Ces extractions permettent

d’obtenir, d’une part, les métabolites hydrosolubles et, d’autre part, les métabolites

organosolubles. L’analyse est réalisée de manière séparée sur ces deux fractions limitant la

superposition des signaux et éliminant les effets des différences de susceptibilité magnétique.

De plus, concernant la fraction hydrosoluble de l’extrait, le pH peut être modifié de manière à

discriminer particulièrement certains composés dans le spectre. Cependant, il faut considérer

que l’extraction des composés se réalise avec un certain rendement et que ces composés

peuvent être altérés durant la procédure d’extraction. Dans l’absolu, l’extraction conduit à une

perte d’informations potentielles sur la compartimentation et la complexation des métabolites.

Depuis une dizaine d’années, la RMN HR-MAS (High-Resolution Magic Angle

Spinning: haute-résolution avec rotation de l’échantillon à l’angle magique) a été proposée

pour l’analyse des tissus biologiques. Elle permet une amélioration de la résolution des

spectres 1H obtenus à partir d’échantillons biologiques bruts. Cette technique permet la

détection, dans un échantillon de tissu intact, de l’ensemble des métabolites hydro- et organo-

solubles, ce qui évite l’extraction et permet d’envisager l’obtention d’informations analogues

à celles qui seraient obtenues dans le tissu in situ. L’amélioration de la résolution des spectres

ainsi qu’une excellente sensibilité sont les arguments qui ont amené de nombreuses équipes,

dont la nôtre, à faire l’acquisition d’une sonde HR-MAS.

Ainsi, il est possible d’obtenir le profil «spectral» d’un échantillon caractérisé par la

variation de l’intensité du signal en fonction des fréquences mesurées sur un spectre RMN.

Dans le cas des échantillons biologiques, les signaux proviennent des métabolites et ce profil

est donc synonyme de profil «métabolique». La caractérisation d’un échantillon par son profil

«métabolique» a entraîné des recherches sur les modifications des profils dans les tissus,

cellules, plasma ou urine afin de proposer des marqueurs spécifiques de perturbations induites

par une pathologie, un traitement chimique ou physique.

Les progrès de l’informatique et l’apparition de nouveaux outils statistiques en

combinaison avec des méthodes d’analyse délivrant un grand nombre de données ont permis

l’émergence de nouvelles disciplines comme la Génomique fonctionnelle (autrement appelée


11

Transcriptomique), la Lipidomique, la Protéomique et la Métabonomique. Ces disciplines

visent à différencier des groupes d’échantillons en fonction de données discriminantes et à

effectuer des études sur les réponses d'un système biologique exposé à des perturbations

environnementale, biochimique ou génétique.

La première partie de cette thèse est consacrée à l’évaluation de la RMN HR-MAS

appliquée à l’analyse de tissus biologiques. Les avantages de cette méthode seront exposés à

travers l’étude d’échantillons biologiques d’origine variée (prélèvements de tissus, cellules,

animaux). Cependant, ces avantages méritent d’être mis en perspective: (i) à la lumière de la

pratique expérimentale acquise à ce jour, (ii) en fonction de la nature et de l’origine de

l’échantillon analysé et (iii) selon l’objectif expérimental fixé. Les résultats obtenus par cette

méthode seront comparés à ceux obtenus à partir de l’analyse par RMN conventionnelle des

extraits de tissus.

La deuxième partie de cette thèse est consacrée à la recherche de marqueurs

métaboliques à l’aide d’outils statistiques d’analyse de données issues de spectres RMN.

Nous avons réalisé l’étude métabonomique comparée de cellules de glioblastomes de

phénotypes radiorésistant (RR) et radiosensible (RS). Cette étude a permis de mettre en

évidence des marqueurs caractéristiques de la radiorésistance. L’analyse en composantes

principales (ACP) et la combinaison de données normées, provenant de spectres obtenus à

partir du même individu, ont permis la caractérisation des modifications métaboliques

induites par une pathologie (obésité chez le rat) et la caractérisation du phénotype (variétés de

courge).

12

13

PARTIE EXPERIMENTALE.

14

Partie expérimentale.

15

1. Produits chimiques.

Les solvants utilisés sont de qualité analytique.

Les produits chimiques utilisés pour réaliser les ajouts de standards (pour les attributions des

signaux) proviennent de la société Sigma-Aldrich.

2. Matériel.

Mixeur: IKA WERKE Ultra-Turrax T8 avec une tige de 5 mm de diamètre.

Lyophilisateur: Labconco Lyph.Lock4.5.

Speed’Vac: Concentrator SAVANT.

Compteur de cellules: Z1™ Series COULTER COUNTER.

Centrifugeuse: Sigma-202MK.

pH mètre: CyberScan 500

Electrode de mesure: Mettler Toledo InLab 422

Logiciel d’acquisition, de traitement et d’analyses des données RMN: WINNMR,

XWINNMR, TopSpin, Mestrec, Amix, R.

3. Préparation des échantillons.

3.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa

Les vers de terre Aporrectodea caliginosas ont été prélevés dans un potager du sud-ouest de

la France (Embernou, 43°45’N, 1°38’ E). Les animaux ont été maintenus dans la terre argilo-

siliceuse du lieu d’origine, dans l’obscurité et à 14 ± 1°C jusqu’au moment de leur analyse

effectuée dans les 12 h suivant le prélèvement.

Avant l’analyse, les animaux sont placés entre deux papiers humidifiés avec de l’eau distillée

afin d’éliminer les éventuels restes de terre. Les vers entiers mesurent 7,6 ± 0,6 cm et pèsent

592 ± 91 mg (n=7).

Pour l’analyse des vers entiers avec une sonde RMN conventionnelle, trois animaux sont

immergés dans une solution aqueuse d’éthanol 5% (v/v) servant de sédatif durant 5 minutes

puis placés dans un tube de 10 mm de diamètre avec 3 mL d’une solution aqueuse à 5%

d’éthanol (v/v).


16

Pour l’analyse par RMN HR-MAS, les animaux sont séparés en trois parties:

• une partie antérieure de 185 ± 68 mg (n=5)

• une partie médiane de 225 ± 70 mg (n=5)

• une partie postérieure de 177 ± 48 mg (n=5).

Un fragment de ver est placé dans le rotor HR-MAS 4 mm qui est ensuite complété avec du

D2O.

3.2 Larve Harpalus rufipes.

Les larves du carabe Harpalus rufipes ont été prélevées dans un potager du sud-ouest de la

France (Embernou, 43°45’N, 1°38’ E). Les animaux ont été maintenus dans la terre argilo-

siliceuse du lieu d’origine, dans l’obscurité et à 14 ± 1°C jusqu’au moment de leur analyse

effectuée dans les 12 h suivant le prélèvement.

Deux récoltes ont été effectuées, une au printemps et une en hiver. Les animaux de printemps

mesurent 11,3 ± 1,0 cm et pèsent 31 ± 8 mg (n=5) et ceux d’hiver 13,4 ± 0,7 cm pour 36 ± 5

mg (n=5).

Les animaux vivants sont placés dans le rotor HR-MAS 4 mm qui est ensuite complété avec

du D2O.

3.3 Tissus biologiques.

Des rats mâles Wistar ont été utilisés pour les expériences de comparaison RMN

conventionnelle et RMN HR-MAS. Ils proviennent de l’animalerie de Rangueil (Toulouse,

France). Les prélèvements de tissu font 77 ± 20 mg (n=9) pour les expériences avec la sonde

conventionnelle et 33 ± 4 mg (n=9) pour les expériences avec la sonde HR-MAS.

La même race de rat a été utilisée pour les autres expériences RMN HR-MAS sur le tissu

rénal. Les prélèvements font 19 ± 6 mg (n=3) pour la quantification par RMN HR-MAS et

21 ± 7 mg pour la quantification directe, 13 ± 3 mg (n=12) pour les mesures de T1 et T2.

Des rats mâles de souche Sprague Dawley ont été utilisés pour l’étude de l’effet

néphroprotecteur de la pargyline. Ils proviennent de l’unité INSERM U388, Pharmacologie

Moléculaire et Physiopathologie Rénale IFR31, CHU Rangueil. Les échantillons font en

moyenne 13 ± 3 mg (n=12).


17

Des rats SHHF ont été utilisés pour l’étude de l’obésité sur l’insuffisance cardiaque. Ils

proviennent de l’unité INSERM UPS U586, Institut Louis-Bugnard, Université Paul-

Sabatier, CHU Rangueil. Les échantillons font en moyenne 91 ± 39 mg (n=20).

Pour l’analyse des tissus biologiques bruts, deux types d’expériences ont été effectués, celles

avec la sonde HR-MAS et celles avec une sonde conventionnelle large bande inverse (BBI,

Bruker).

Pour les expériences HR-MAS, le rotor 4 mm adapté à un volume de 50 µL a été choisi. Le

rotor ainsi que ses éléments sont placés sur un lit de carboglace. Un volume de 10 µL d’une

solution froide de TMPS-d6 (3-(triméthylsylil)-1-propane sulfonique-d6) à 10 mmol.L-1

est

placé au fond du rotor. Puis, l’échantillon congelé est inséré dans le rotor avant sa fermeture.

Le rotor est conservé dans la carboglace jusqu’à l’analyse. La pesée de l’échantillon est

effectuée en faisant la tare avec l’ensemble des éléments du rotor.

Pour les expériences avec la sonde conventionnelle, un tube équipé d’inserts de susceptibilité

magnétique adaptée aux milieux aqueux (Shigemi Inc., USA) a été utilisé pour l’observation

des tissus dans la sonde. Le tissu baigne au centre de 200 µL d’une solution 5 mmol.L-1

de

TMPS-d6 dans D2O (0,9% NaCl p/v).

Les expériences sur le tissu frais reprennent le même protocole mais sur lit de glace au lieu

de carboglace et l’échantillon est placé dans le tube ou le rotor durant les 5 minutes qui

suivent le prélèvement.

3.4 Végétaux.

Trois variétés de courges potagères ont été analysées: Potimarron et Bleu de Hongrie de

l’espèce Cucurbita maxima et Butternut de l’espèce Cucurbita moshata. Les échantillons ont

été obtenus par carottage au centre de la partie charnue du fruit. Le cylindre obtenu de 3 mm

de diamètre interne et 14 mm de longueur fait 80 ± 7 mg (n = 9). Il est inséré dans le rotor

HR-MAS 4 mm qui est ensuite rempli de D2O.

3.5 Préparation des cellules de glioblastomes.

Les cellules sont fournies par le Département de Radiothérapie-Centre de Lutte Contre le

Cancer Claudius Regaud. Nous avons travaillé avec quatre lignées cellulaires, deux lignées

radiorésistantes (U87 RR et SF763 RR) et deux lignées radiosensibles (U251 RS et SF767


18

RS). Le nombre de manipulations et la quantité de cellules obtenue sont présentés dans le

tableau suivant:

Cellules Nombre de points Nombre de cellules par

boîtes (millions)

U87 RR (confluence 60%) 5 3,8 ± 0,4

U87 RR (confluence 80%) 5 6,0 ± 1,5

U87 RR (confluence 100%) 5 4,8 ± 1,1

U251 RS (confluence 60%) 5 4,6 ± 1,6

U251 RS (confluence 80%) 5 7,8 ± 1,8

U251 RS (confluence 100%) 5 14,3 ± 4,4

SF763 RR (confluence 60%) 6 4,7 ± 0,8

SF767 RS (confluence 60%) 6 4,8 ± 1,2

Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de culture de 140 mm de diamètre de manière

à obtenir à quatre jours 60%, 80% ou 100% de confluence (paramètre défini visuellement par

l’expérimentateur). Elles sont ensuite maintenues dans le milieu de culture constitué de

DMEM contenant 10% de L-glutamine (p/v), 4,5 g.L-1

de D-glucose et 10% de SVF (sérum

de veau fœtal) (v/v). L’incubation se fait à 37°C pendant 4 jours au bout desquels le milieu

de culture est enlevé. Les cellules sont rincées avec 10 mL de sérum physiologique froid

(4°C) puis elles sont décollées de la boîte par trypsinisation (1 mL de trypsine par boîte

pendant 1 minute). Elle sont reprises 2 fois dans 10 mL de sérum physiologique froid et

centrifugée. Une série d’expériences a été réalisée en décollant les cellules par grattage et

non pas par trypsinisation. Les résultats ne sont pas présentés mais sont identiques à ceux

obtenus avec la méthode de trypsinisation (n=3). Les cellules sont comptées. Le culot est

ensuite repris dans un mélange chloroforme/méthanol/eau dans des proportions volumiques

finales de 8/3/2 pour subir une extraction.

3.6 Protocole d’extraction

Certains échantillons (cellules et tissus) ont été soumis à un protocole d’extraction rapide

permettant de séparer simultanément les métabolites hydrosolubles des lipides121

. Brièvement,

l’échantillon est mixé à froid (4°C) en présence d’un mélange chloroforme/méthanol/eau dans

des proportions volumiques de 8/3/2. Après centrifugation à 10°C et séparation des phases,


19

les solvants sont évaporés pendant 1 heure au Speed-Vac et lyophilisés; les résidus des

différentes fractions sont stockés à -80°C. Avant l’analyse RMN, la fraction aqueuse et la

fraction organique sont reprises dans un solvant deutéré, respectivement 550 µL de D2O ou

550 µL de tampon borate 12,5 mmol.L-1

pH 8,5 (5 ou 10 µL de TMPS-d6 10 mmol.L-1

) et 600

µL de CDCl3 (5µL de TCB 100 mmol.L-1

).

Remarques dans le cas des cellules:

Les cellules sont reprises dans 3 mL de CHCl3/CH3OH: 2/1 (v/v). Elles sont mélangées 2

minutes au vortex. Puis 1 mL d’eau milliQ est additionné. Après 5 minutes dans la glace, on

ajoute à nouveau 6 mL de CHCl3/CH3OH: 2/1 (v/v) puis 1 mL d’eau milliQ et 2 mL de

CHCl3. L’échantillon est mélangé au vortex et laissé au repos 20 minutes avant centrifugation

à froid.

Remarque dans le cas du tissu ventriculaire cardiaque:

Les échantillons congelés sont broyés dans l’azote liquide au pilon dans un mortier en

porcelaine avant d’être mixés et de subir l’extraction. Le volume total d’extraction est de

6,5 mL.

Remarque dans le cas du tissu rénal.

Le volume total d’extraction est de 4,1 mL.

4. RMN

Hormis les expériences 2D réalisées sur les extraits cellulaires, tous les spectres ont été

réalisés avec un spectromètre Bruker ARX puis Avance 400 (Bruker Biospin, France) à un

champ magnétique de 9,4 Tesla.

4.1 Ver endogéique Aporrectodea caliginosa.

Spectres RMN 31

P:

Enregistrement des spectres à 161,98 MHz.

Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (90°)-acquisition avec découplage du proton.

Température d’acquisition: 14°C.

Fenêtre spectrale: 16,6 kHz.

Taille du FID: 32K.


20

Temps d’attente entre les impulsions (d1+AQ): 1,2 s.

Nombre d’accumulations: 1024.

Temps d’acquisition: 12 min.

Traitement du signal: augmentation de la résolution digitale à 64K et apodisation du signal

avant transformée de Fourier (25 Hz).

Pour les expériences avec la sonde conventionnelle, les déplacements chimiques sont calibrés

par rapport au signal du MPA (acide méthylphosphonique) qui sert de référence externe

placée dans un capillaire coaxial et dont le déplacement chimique est de 30,3 ppm.

Pour les expériences HR-MAS, les spectres ont été réalisés avec une vitesse de rotation de 1

kHz et les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal des PDE

(phosphodiesters) comme référence interne à 0,82 ppm.

4.2 Larve de carabe Harpalus rufipes.

Spectres RMN HR-MAS 1H.


Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (90°)-acquisition avec présaturation du signal

de l’eau.


Fenêtre spectrale: 9,6 kHz.

Taille du FID: 32K.






Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 4 kHz.

Les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal des omégas-3 comme

référence interne à 0,95 ppm.


21

4.3 Tissus biologiques bruts.

Spectres RMN 1H

• Comparaison sonde HR-MAS et sonde conventionnelle.


Utilisation d’une séquence simple d’impulsion (30°)-acquisition ou d’une séquence d’écho de

spin CPMG avec un temps d’écho de 120 ms couplées à une séquence de présaturation du

signal des protons de l’eau.


Fenêtre spectrale: 8 kHz.

Taille du FID: 32K.






Les expériences HR-MAS ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.

• Comparaison de certains paramètres.


Utilisation d’une séquence simple d’impulsion (90°)-acquisition avec présaturation du signal

des protons de l’eau.



Taille du FID: 32K.






Les expériences HR-MAS ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.


22

Différentes séries d’expériences ont été effectuées (voir annotations sur les figures):

• vitesses de rotation: de 1 à 6 kHz

• températures: de: 0, 5 ou 10°C.

• Temps d’attente entre les impulsions: 1 à 8 s.

• Calcul des T1.


Utilisation d’une séquence d’inversion-récupération.



Taille du FID: 32K.


Délai entre les impulsion � et �/2: 0,1 à 10 s.


Nombre d’incréments: 64

Temps d’acquisition: 10 h.

Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.

• Calcul des T2.


Utilisation d’une séquence séquence d’écho de spin CPMG avec des temps d’écho variant de

0,4 à 400 ms couplée à une séquence de présaturation du signal des protons de l’eau.



Taille du FID: 32K.






Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz


23

Spectres RMN HR-MAS 31

P.

• Comparaison tissu frais et tissu congelé.


Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (30°)-acquisition avec découplage du proton.



Taille du FID: 16K.






Les déplacements chimiques en 31

P sont calibrés par rapport au signal du Pi (phosphate

inorganique) comme référence interne à 2,2 ppm.

Les expériences ont été réalisées avec une vitesse de rotation de 2,5 kHz.

4.4 Extraits biologiques.

Spectres RMN 1H.


Utilisation d’une séquence simple d’impulsions (90°)-acquisition couplée à une séquence de

présaturation du signal des protons de l’eau.

Température d’acquisition: 298 K.

Fenêtre spectrale: 6 kHz pour les extraits aqueux et 4 kHz pour les extraits organiques.

Taille du FID: 32K.

Temps d’attente entre les impulsions (d1+AQ): 4,7 s pour les extraits aqueux et 5 s pour les

extraits organiques.


Temps d’acquisition: 20 min pour les extraits aqueux et 22 min pour les extraits organiques.


avant transformée de Fourier (0,3 Hz).


24

Les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal du TMPS à 0 ppm pour les

extraits aqueux et par rapport au CDCl3 à 7,26 ppm pour les extraits organiques.

Expériences 2D.

Les expériences 2D réalisées sur les extraits cellulaires ont été effectuées avec un

spectromètre Avance 500 équipé d’une cryosonde TCI.

• Séquence cosypr.

Enregistrement des spectres à 500 MHz.

Utilisation d’une séquence de corrélation homonucléaire 1H/

1H couplée à une séquence de

présaturation du signal des protons de l’eau.


Fenêtre spectrale: 4 kHz *4 kHz.

Taille du FID: 1024.



Nombre d’expériences: 512

Temps d’acquisition: 9 heures.

• Séquence HMBC.

Enregistrement des spectres à 500 MHz pour le proton et 125 MHz pour le carbone.

Utilisation d’une séquence de corrélation hétéronucléaire 1H/

13C à travers plusieurs liaisons.






Nombre d’expériences: 512.



25

• Séquence HSQC.

Enregistrement des spectres à 500 MHz.

Utilisation d’une séquence de corrélation hétéronucléaire 1H/

13C à travers une seule liaison.






Nombre d’expériences: 512.


Les déplacements chimiques sont calibrés par rapport au signal du TMPS-d6 à 0 ppm.

5. Analyse statistique.

Les données RMN sont introduites dans le logiciel de traitement AMIX (Bruker) et les

spectres sont échantillonnés par pas (voir tableau). La numérisation des intensités des

spectres fournit une table croisant les variables avec les individus. Les analyses statistiques

sont réalisées avec le logiciel AMIX ou le logiciel R.

Echantillons Zone étudiée Pas (ppm) Nombre d’individus.

Cellules 4,5/0,5 0,01 20 (10RS et 10RR)

Tissu rénal 4,5/0,5 0,01 12 (4*3) et 10

4,8/0,5 ppm en 1H 0,01

Courge 10/-20 ppm en

31P 0,1

9 (3*3)

Cellules 4,5-0,5 0,01 30 échantillons

(15 U87 RR et 15 U251 RS)

Cellules

4,5-0,5

(exclusion 1,91/1,93 et

1,30/1,35)

0,01 32 (10 U87, 6 SF763, 10

U251 et 6 SF767)

4/1,3 ppm pour les

extraits aqueux 0,04

Cœur 6/0,5 ppm pour les

extraits organiques

(exclusion 3,34/3,40 et

4,12/4,24 ppm

0,01

20 (4*5)

26

27

CHAPITRE 1: La RMN HR-MAS: une

technique d’analyse d’échantillons bruts.

28

Chapitre 1: la RMN HR-MAS.

29

Introduction.

Dérivant des sondes utilisées en RMN du solide, les sondes RMN HR-MAS ont été

développées, dans un premier temps, afin d’assurer le suivi des réactions de synthèse et de

permettre l’étude structurale des semi-solides (gels). Leur utilisation a par la suite été étendue

à l’analyse de tissus biologiques d’origine animale ou végétale. Cette technique de RMN

consiste à faire tourner rapidement l’échantillon sur lui-même à un angle de 54,7° par rapport

au champ magnétique principal Bo (appelé angle magique).

Dans la première partie, nous décrirons brièvement les bases théoriques de la RMN

avec rotation de l’échantillon à l’angle magique. Ensuite, nous présenterons les applications

de cette technique dans de nombreuses disciplines ainsi que ses développements

méthodologiques. Puis, au vu de l’intérêt croissant ces 10 dernières années de la RMN HR-

MAS pour l’exploration des tissus biologiques et de son utilisation en métabonomique, en

particulier sur les tissus pathologiques humains, nous avons tenté d’évaluer cette technique

sur un large éventail expérimental allant de l’étude in situ d’animaux introduits vivants (ver,

larve) à l’analyse de biopsies d’organes.


30

1. Historique de la RMN HR-MAS.

La première constatation expérimentale de l’effet de l’inclinaison du tube en rotation

fut réalisée en RMN du sodium-23 (23

Na) par Andrew et al. 3

qui montrèrent, en mesurant la

largeur du signal du chlorure de sodium pour des angles de rotation compris entre 50 et 100°,

un affinement maximum du signal pour un angle de 54,7°. Cette étude confirma,

expérimentalement, la valeur théorique de l’angle magique de 54,7°. L’affinement du signal

dans le cas présent correspond à l’élimination des effets des couplages quadripolaire et

dipolaire sur le signal.

Dans le même temps, des expériences réalisées par RMN du fluor-19 (19

F) sur du

fluorure de calcium ou du téflon, en faisant tourner les échantillons à des angles de 0°, 54,7°

et 90° par rapport au champ Bo, ont mis en évidence la présence de bandes latérales de

rotation sur les spectres. Ces bandes latérales, caractéristiques d’une anisotropie résiduelle

(inhomogénéités de champ), ne disparaissent que si l’on augmente suffisamment la vitesse de

rotation4.

Dosko�ilová et al.5 reprennent simplement la théorie du solide afin de mettre en

évidence les différences de susceptibilité pouvant exister au sein d’un échantillon. Ils

montrèrent, sur un modèle hétérogène simple, un solvant placé dans le rotor avec des billes de

verre, une élimination des effets des différences de susceptibilité magnétique. Garroway et al.6

confirment ce même effet sur un autre type de modèle hétérogène. Ils utilisèrent un rotor avec

deux compartiments dans lesquels sont placés une solution de TMS dans du méthanol et la

même solution en présence d’une solution paramagnétique.

Ces expériences réalisées il y a plus de 20 ans ont démontré l’effet «magique» de la

rotation de l’échantillon à l’angle de 54,7° sur les couplages dipolaires, quadripolaires et sur

les différences de susceptibilité magnétique.


31

2. Principe de la technique7-10

.

2.1 Interactions et effets prédominants dans un milieu anisotrope.

2.1.1 L’anisotropie en RMN.

Dans un liquide, l’environnement autour d’une molécule est en moyenne isotrope

c'est-à-dire que son environnement est le même dans toutes les directions de l’espace. Si on

considère deux orientations possibles pour une molécule par rapport au champ magnétique

Bo, le passage d’une position à l’autre peut se faire avec une fréquence plus ou moins grande.

Dans un liquide, cette fréquence est de l’ordre de 1012

Hz et donc nettement supérieure à celle

du phénomène de RMN. Dans ce cas, on admet qu’on a affaire à un milieu isotrope. Pour

simplifier, on parle de milieu isotrope si toute grandeur dont relèvent les spectres RMN est

moyennée dans toutes les directions de l’espace.

Pour pouvoir qualifier l’isotropie d’un milieu:

• les mouvements moléculaires doivent être très rapides par rapport aux variations des

interactions affectant les spins nucléaires;

• la molécule observée doit pouvoir adopter toutes les directions de l’espace.

Par opposition aux liquides, les solides (poudres ou cristaux) sont anisotropes puisque les

mouvements moléculaires sont ralentis, voire inexistants.

2.1.2 Représentation d’un système de spins nucléaires dans un champ magnétique.

On peut décrire un système de spins nucléaires introduit dans un champ magnétique

Bo par les perturbations qu’il subit dans ce champ. Il existe deux sortes d’interactions: celle

liée à la présence du champ magnétique (effet Zeeman) et celles qui lui sont propres.

Faisons brièvement un inventaire des hamiltoniens que l’on doit considérer pour un

système donné.

QCSADJz HHHHHH ˆˆˆˆˆˆ ++++=


32

Avec:

• H : hamiltonien total.

• zH : hamiltonien Zeeman.

• JH : hamiltonien du couplage scalaire.

• DH : hamiltonien dipolaire.

• CSAH : hamiltonien d’anisotropie de déplacement chimique.

• QH : hamiltonien quadripolaire.

En milieu isotrope, seuls les déplacements chimiques et les couplages indirects

(couplages scalaires J) ne sont pas moyennés et vont être représentés sur le spectre.

En milieu anisotrope, en plus des déplacements chimiques et des couplages indirects,

d’autres phénomènes et interactions peuvent apparaître:

• les interactions dipolaires (hamiltonien dipolaire)

• les différences de susceptibilité magnétique (hamiltonien Zeeman)

• l’anisotropie de déplacement chimique (hamiltonien d’anisotropie de déplacement

chimique)

• les interactions quadripolaires (hamiltonien quadripolaire).

Chacun de ces phénomènes étant à l’origine d’une augmentation spécifique de la

largeur du signal, l’élimination de l’effet d’un phénomène conduit à une amélioration de la

résolution.

2.1.3 Interactions dipolaires.

Les interactions dipolaires proviennent du couplage dans l’espace des moments

magnétiques de deux noyaux (dipôles magnétiques).

L’énergie d’interaction dipolaire (ED) entre deux noyaux i et j peut être définie par la relation:

)1cos3( 2

3−∝ θ

µ

ijD r

E


33

Avec:

• �: moment magnétique

• ijr : distance entre les deux noyaux i et j considérés

• θ : angle entre le vecteur ij et le champ Bo.

L’interaction dipolaire dépend donc:

• de l’angle entre le vecteur internucléaire et l’axe du champ magnétique appliqué

• de la position relative des deux spins i et j c'est-à-dire de la distance internucléaire

Par conséquent:

• En phase liquide, comme θ varie constamment et rapidement puisque l’orientation des

molécules varie au cours du temps, l’ensemble des couplages dipolaires est moyenné à

zéro.

• En phase solide, θ est fixe et les couplages dipolaires deviennent les interactions

principales. On obtient donc des spectres avec des signaux très larges.

Pour éliminer les couplages dipolaires, il faut que 0)1cos3( 2 =−θ soit °= 7,54θ .

Ainsi, si on place le système en rotation à un angle de 54,7°, on annule les effets des

interactions dipolaires.

2.1.4 Susceptibilité magnétique.

La susceptibilité magnétique caractérise la faculté d'un matériau à s'aimanter sous

l'action d'un champ magnétique. En présence d'un champ magnétique, les différents moments

magnétiques électroniques ou nucléaires vont se distribuer sur différents niveaux d'énergie.

Pour le 1H dont le spin a pour valeur ½, l'aimantation peut prendre deux positions dites

parallèle ou anti-parallèle. L'état parallèle étant de plus basse énergie, il est le plus peuplé.

Cette différence de population dans le milieu est à l’origine de l’aimantation nucléaire

macroscopique, notée Mo.

Cette aimantation Mo est proportionnelle à l'intensité du champ magnétique externe

Ho dans le cas d’un milieu isotrope. Le coefficient de proportionnalité, noté mχ , définit la

susceptibilité magnétique du milieu considéré.


34

oHoM m

��χ=

Lorsque le milieu est anisotrope, la susceptibilité magnétique n’est pas la même dans

toutes les directions de l’espace et constitue un des éléments responsables de l’élargissement

des raies. Dans ce cas, le champ d’induction magnétique oB�

devient:

oHoMoHoB m

��)1()( 00 χµµ +=+=

avec 0µ la perméabilité du vide.

oB�

varie donc en fonction du matériau étudié, c'est-à-dire en fonction des différentes

susceptibilités magnétiques. Si l’on considère un échantillon anisotrope comme un ensemble

de régions ayant différentes susceptibilités magnétiques, alors pour chaque région, le champ

magnétique efficace est représenté à la fois par le champ magnétique externe Ho et par une

contribution provenant des susceptibilités magnétiques macroscopiques donnée par la

relation:

HoH vχαπ

)3

4( −=∆

Avec:

• vχ : susceptibilité du volume v

• α : facteur qui dépend de la forme de l’échantillon

Les variations de susceptibilité magnétique peuvent être écrites suivant:

Avec:

• k: facteur géométrique

• θ : angle entre la direction de l’axe de rotation de l’échantillon et le champ

magnétique Bo.

Tout comme les interactions dipolaires, les variations de susceptibilité magnétique s∆

peuvent annuler si 0)1cos3( 2 =−θ soit °= 7,54θ .

)2

1cos3(

3

)13(4 2 −−−=

∆=∆

θπχ k

Ho

Hs v


35

2.1.5 Anisotropie de déplacements chimiques.

Chaque noyau possède un environnement chimique (donc électronique) qui lui est

propre. Il existe de faibles variations du champ magnétique ressenties par le noyau. Le champ

ressenti n’est donc non plus le champ Bo mais un champ efficace Beff:

)1( σ−=−= BoBlocalBoBeff

Avec:

• σ : constante d’écran dont la valeur varie en fonction de l’environnement local (autres

noyaux, effets électroniques, solvants…).

Si une molécule possède différentes orientations figées dans l’espace, un même noyau

de cette molécule ne va pas ressentir le même champ magnétique local. En effet, un même

spin va pouvoir ressentir différentes constantes d’écran en fonction de son orientation par

rapport à l’environnement. Ainsi, le signal obtenu sera non plus un signal fin, mais la somme

d’un ensemble de signaux fins caractéristiques de chaque orientation.

Pour une molécule de symétrie sphérique, le déplacement chimique est indépendant de

l’orientation moléculaire. Pour une molécule asymétrique, le déplacement chimique dépend

donc de l’orientation. Le champ magnétique ressenti par le noyau varie en fonction de

l’orientation de la molécule dans le champ magnétique. Le spectre RMN d’une distribution

aléatoire d’orientations fixées, telles que dans un solide, va ressembler à la figure 1.1. Le

signal le plus intense, dans les champs faibles, correspond à une orientation privilégiée de la

molécule par rapport à Bo. Dans un liquide, le champ est moyenné à cause des mouvements

rapides de la molécule et on obtient des signaux fins et symétriques.

Figure 1.1: Allure simplifiée d’un spectre RMN d’une molécule en milieu anisotrope en fonction de son orientation par rapport au champ magnétique principal Bo.


36

Le déplacement chimique est fonction de deux valeurs. Une constante d’écran isotrope

et une constante d’écran anisotrope. En phase liquide, la deuxième valeur est nulle. En phase

solide, cette valeur est fonction de )1cos3( 2 −θ . Elle peut donc s’annuler si °= 7,54θ .

2.1.6 Couplages quadripolaires.

Les couplages quadripolaires concernent les noyaux dont le spin est supérieur à ½.

Leurs effets sont d’autant plus importants que l’atome possède davantage d’électrons; ils

agissent sur la relaxation du noyau et élargissent fortement les raies. Ils concernent la

distribution du nuage électronique de l'atome. Lorsque celle-ci est non sphérique (distribution

asphérique de charges électroniques), il se crée un gradient de champ électrique dans la

molécule. Ainsi, les noyaux interagissent à la fois avec Bo et ce gradient. Le couplage

quadripolaire ne contribue pas au signal observable dans les conditions de notre étude. Malgré

tout, ce type de couplage peut être éliminé grâce à la rotation de l’échantillon à l’angle

magique.

2.1.7 Cas particulier des échantillons hétérogènes multiphasiques11,12.

Dans le cas de systèmes multiphasiques, les variations de susceptibilité au sein de

l’échantillon se manifestent de deux manières:

• une composante dipolaire dans la région la plus hétérogène qui entraîne

l’élargissement des signaux et qui peut être annulée grâce à la rotation à l’angle

magique,

• une partie isotrope propre à chaque phase et résultant en différents déplacements

chimiques et pour laquelle la rotation à l’angle magique ne peut rien.

Comme l’expliquent Chen et al.11

, on peut schématiser ce phénomène en imaginant

une sphère: le champ à l’extérieur de la sphère est un chevauchement d’un champ statique et

d’un champ dipolaire et le champ à l’intérieur de la sphère est un champ homogène de valeur

différente (associé à la susceptibilité magnétique de la sphère). La composante dipolaire

élargit le signal et les composantes isotropes entraînent une différence de déplacement

chimique. La rotation rapide à l’angle magique élimine la composante dipolaire, ce qui résulte

en un champ homogène à l’extérieur de la sphère. Cependant, la rotation ne permet pas


37

d’éliminer les contributions isotropes à l’intérieur et à l’extérieur de la sphère. On observera

donc deux signaux.

On sait que la composante dipolaire est fonction de )1cos3(2

−θ alors que les

différences de susceptibilité magnétique entre les deux phases peuvent être reliées à une

différence de déplacement chimique de la manière suivante:

χνθ

ν ∆−=∆ 0

2 )2

sin1(

Avec:

• ν∆ : différence de déplacements chimiques

• θ : angle entre la direction de l’axe de rotation de l’échantillon et le champ

magnétique Bo

• χ∆ : différence de susceptibilité magnétique entre les deux phases du système

• 0ν : fréquence

La rotation à l’angle magique ne permet donc pas d’annuler ce terme puisque pour

°= 7,54θ , χνν ∆=∆ 03

2.

2.2 Types d’interaction dans le cas des échantillons biologiques.

La grande diversité des échantillons biologiques rend le type et l’importance relative

des interactions ressenties par un système de spin très variables d’un échantillon à l’autre. Par

conséquent, l’élimination des effets de ces interactions sur l’amélioration du signal de RMN

est fonction des caractéristiques de l’échantillon. Le tableau 1.1 relève de façon très

simplifiée les types d’interaction susceptibles d’être rencontrés dans cette diversité biologique

qui va des liquides tels qu’urine, plasma, extrait à l’animal entier.


38

Tableau 1.1: Récapitulatif des types d’interaction anisotrope pouvant exister dans différentes sortes d’échantillons biologiques par rapport à un solide ou un gel (+ ou -: présence ou absence de l’interaction dans le milieu considéré ; * : en présence d’un noyau de spin supérieur à ½).

Chimie Biologie

Solides Gels Animaux Tissus

biologiques Cellules

Liquides

(extraits,

fluides)

DH ++++ +++ ++ - - -

CSAH ++++ +++ +++ ++ ++ -

QH * ++++ +++ ++ + + +

MAS HR-MAS

2.3 L’équipement HR-MAS.

Une sonde HR-MAS possède les mêmes caractéristiques générales qu’une sonde

dédiée à l’analyse exclusive des solides. La RMN HR-MAS ne nécessitant pas une largeur

spectrale aussi importante que la RMN du solide, les sondes HR-MAS s’adaptent sur les

spectromètres de RMN liquide dont la puissance d’émission RF est plus faible. De plus, alors

que la largeur des signaux obtenus en RMN du solide rend la présence d’un canon de shims et

d’un canal de lock superflue, ces modules sont nécessaires en RMN HR-MAS pour obtenir

une résolution semblable à celle des liquides.

La sonde HR-MAS utilisée pour ce travail est équipée d’un canal qui permet

l’acquisition de spectres 1H et

19F et d’un canal

31P. De plus, elle possède un canal deutérium

(2H), utilisé comme signal de référence pour compenser la dérive du champ magnétique

principal, et d’une bobine de gradient dont l’axe principal est parallèle à l’axe du stator. Un

système pneumatique couplé à la sonde assure les fonctions de basculement du stator,

d’entraînement et d’éjection du rotor. De plus, une unité de régulation de température permet

d’ajuster la température entre -20 et 70°C.

La sonde peut se décomposer en deux parties. Une partie centralisant toute la

connectique (Figure 1.2) et une partie correspondant à la tête de mesure qui comporte le

stator avec ses antennes d’émission-réception (Figure 1.3).


39

Figure 1.2: Partie connectique de la sonde HR-MAS. (a) canal 1H/19F, (b) canal 31P, (c) canal 2H, (d) gradient, (e) chauffage, (f) mesure de la température, (g) entrées pneumatiques pour le basculement du stator, la rotation et l’éjection du rotor, (h) réglage de l’impédance des antennes RF, (i) réglage micrométrique de l’angle de basculement du stator.

Figure 1.3: Tête de mesure de la sonde HR-MAS.

Les rotors (longueur: 18 mm; diamètre externe: 4 mm) sont essentiellement composés

d’un tube en zirconia (oxyde de zirconium) et de pièces en Kel-f®

(Polychlorotrifluoroéthylène, PCTFE) offrant différents volumes utiles. Les trois

configurations possibles ont été utilisées, c'est-à-dire une sphère de 12 µL, un ovoïde de

50 µL ou un cylindre de 92 µL. Les rotors de 12 et 50 µL sont composés de quatre éléments.

Après la mise en place de l’échantillon et du solvant deutéré dans le tube, un insert servant à

limiter la partie supérieure du volume utile est descendu dans le tube. Le volume utile est

ensuite isolé de la partie supérieure du tube en bouchant l’orifice de cet insert avec une vis de

1 mm. Enfin, le montage du rotor se termine en plaçant un capuchon faisant office de turbine

sur le tube (Figure 1.4).

a

f

cd

b

e

g

h

i

Stator avec rotor en

place.


40

Figure 1.4: Équipement servant à la mise en place de l’échantillon dans le tube (a) guide de mise en place de la turbine, (b) extracteur de turbine, (c) tube avec insert inférieur, (d) inserts supérieurs montés sur vis d’insertion, (e) bouchon à visser sur l’orifice de l’insert supérieur, (f) tournevis adapté, (g) turbine.

a b

cd

eg

f


41

3. Les différentes applications de la RMN HR-MAS.

Les expériences RMN HR-MAS permettent d’étudier des échantillons dont les

propriétés se situent entre celles des liquides et celles des solides. Ces échantillons peuvent

être des lipides, des polymères sous forme de gels, des membranes, des résines, des petites

molécules fixées sur des substrats à faible mobilité, des produits de l’agronomie (aliments),

des cellules ou encore des tissus biologiques. Nous présenterons certaines des applications de

la RMN HR-MAS rencontrées dans la littérature dans le domaine de la chimie et de la

biologie.

3.1 Applications de la RMN HR-MAS en chimie.

La RMN HR-MAS permet en synthèse organique, par exemple, de résoudre l’analyse

structurale de polymères de haut poids moléculaire ou de suivre des réactions d’élongation de

molécules greffées sur support solide. Ce suivi peut devenir complexe en particulier dans le

domaine de la chimie combinatoire. L’intérêt de la RMN HR-MAS dans ces disciplines est

souligné par les exemples qui suivent.

La synthèse organique sur support solide est un domaine de la chimie qui connaît un

fort développement. Elle permet en effet de faciliter les étapes et d’améliorer les rendements

de synthèse. La chimie sur support solide consiste à faire croître des molécules préalablement

greffées sur une matrice telle que des résines ou des billes. L’ensemble molécule-support peut

être décomposé en trois zones formant un système anisotrope:

• La première zone est la matrice solide qui constitue le corps principal du support. Ce

support est en général une résine, c’est-à-dire un polymère plus ou moins réticulé

(exemples des résines de Merrifield13

ou de Wang14

).

• La seconde zone est un bras espaceur chimiquement inerte à l’extrémité duquel se

trouve le groupe fonctionnel qui sert à ancrer la molécule à synthétiser.

• Enfin, la troisième zone est la molécule à synthétiser.

Un des freins au développement de la synthèse organique en phase solide fût le

manque de techniques permettant l’analyse directe de l’ensemble molécule-matrice. En effet,

la caractérisation des molécules synthétisées en phase solide consiste le plus souvent à

analyser la molécule séparée de son support. Dans ce cas, les méthodes d’analyse classiques


42

telles que la CCM, la RMN liquide haute résolution ou la spectrométrie de masse peuvent être

utilisées. Ces méthodes, bien que très efficaces, nécessitent cependant la destruction du

support et prennent beaucoup de temps. Mais, que ce soit en spectrométrie de masse ou en

spectroscopie IR, peu de matériel est nécessaire pour l’analyse.

L’analyse directe de l’ensemble molécule-matrice a pu être réalisée tout d’abord par

des méthodes qualitatives de contrôle basées sur des tests colorimétriques (ninhydrine)15

ou en

utilisant la spectroscopie IR16

ou Raman17

, puis par des méthodes quantitatives avec la

spectrométrie de RMN ou la microspectroscopie IR à transformée de Fourier (FT-IR)18-19

. En

ce qui concerne la RMN, la large dispersion spectrale des signaux du carbone a permis

d’utiliser la RMN liquide conventionnelle du 13

C pour observer l’ensemble molécule-

matrice20-21

. Cependant, la faible sensibilité de cette méthode et l’importante largeur de raie

des signaux, due à l’anisotropie du système molécule-support, en font une méthode peu

utilisée. L’observation par RMN d’autres noyaux plus sensibles tels que le 19

F ou le 31

P a

aussi été réalisée22-23

. Des largeurs de raies importantes combinées à la faible dispersion

spectrale des signaux du 1H n’ont pas permis d’utiliser la RMN conventionnelle pour l’étude

de tels systèmes.

La première expérience de RMN HR-MAS 1H et

13C sur des résines gonflées a été

réalisée par Stöver et Fréchet en 198924

. Ces auteurs ont montré que l’on pouvait obtenir des

spectres RMN haute résolution de l’éphédrine liée à une résine de polystyrène gonflée dans

du chloroforme deutéré. Fitch et al. 25

réalisent aussi l’acquisition de spectres RMN HR-MAS

de l’ensemble molécule-matrice gonflé dans du DMSO-d6 et comparent les spectres obtenus

dans un tube de 5 mm avec une sonde classique aux spectres réalisés avec une rotation de

2 kHz à l’angle magique. En 1996, Keifer et al.26

font une comparaison des spectres d’une

molécule greffée sur une résine de Wang obtenus avec différentes sondes: (i) haute-résolution

liquides (ii) solides (CP-MAS) et (iii) HR-MAS. Que ce soit en 1H ou

13C, la meilleure

résolution est obtenue avec les sondes HR-MAS.

Un des avantages de la RMN HR-MAS est la possibilité de déterminer précisément le

pourcentage d’impuretés formées au cours d’une réaction chimique sur différents supports

solides27

. Toutefois, malgré sa grande efficacité pour étudier des milieux hétérogènes, la

qualité des spectres obtenus est hautement liée au support et au solvant utilisé28

.

Généralement, le solvant sera celui utilisé pour la synthèse ou son équivalent deutéré.

La synthèse en phase solide est un outil intéressant pour la synthèse de molécules

complexes mais aussi pour l’obtention de banques de molécules de façon combinatoire29-30

.

Elle consiste au greffage de petites molécules organiques sur un support (généralement des


43

billes de résines) et à faire grandir la molécule à partir de ce support par ajout de plusieurs

réactifs dans une même étape afin de multiplier le nombre de produits finaux et ainsi générer

des banques de molécules. L’analyse de telles réactions pose les mêmes problèmes que ceux

décrits précédemment et la RMN HR-MAS semble être une technique adaptée au suivi

réactionnel de synthèse combinatoire. La chimie combinatoire est très développée notamment

pour la synthèse d’oligonucléotides, de peptides ou de polysaccharides par exemple31

.

3.2 Applications de la RMN HR-MAS en biologie.

De 1972 à aujourd’hui, la RMN HR-MAS a été utilisée pour l’analyse d’échantillons

très variés allant des systèmes biologiques complexes aux produits de l’agronomie. Certains

de ces travaux ont contribué aux évolutions et améliorations ou à la mise en évidence de

certains biais de la méthode d’analyse par RMN HR-MAS.

3.2.1 Etude des composés membranaires en suspension aqueuse.

En 1972, Chapman et al. 32

montrent que la rotation de l’échantillon à l’angle magique

permet d’améliorer sensiblement la résolution de spectres 1H de lécithines en suspension

aqueuse, en particulier avec l’affinement du signal provenant des groupements

triméthylamine. Haberkorn et al. 33

obtiennent les premiers spectres haute résolution par RMN

13C et

31P sur des lipides membranaires dans les mêmes conditions. La résolution obtenue est

suffisante pour permettre une attribution complète des carbones des lipides. En 1997, Zhou et

al. 34

propose un protocole de préparation des échantillons pour l’étude de la dispersion des

lipides grâce à l’utilisation d’ampoules de verre sphériques à placer dans le rotor.

Ces premiers travaux ont ouvert la porte à des nombreuses études sur les systèmes

membranaires que ce soit sur les lipides35-39

, les lipopolysaccharides ou les peptides

constitutifs ou associés aux membranes biologiques40-45

. Dans tous les cas, les produits sont

étudiés en milieu aqueux afin de mimer l’environnement cellulaire. De plus, de nombreuses

séquences bidimensionnelles révélant les corrélations internucléaires et intermoléculaires ont

été appliquées pour les attributions des signaux et l’étude structurale.

Ces différents travaux ont permis de mettre en avant l’intérêt de la RMN HR-MAS

pour l’étude de ces biomolécules dans leur environnement d’origine et ont initié les travaux

HR-MAS réalisés sur les cellules et les tissus.


44

3.2.2 Cellules.

L’utilisation de la RMN HR-MAS a permis, en particulier, de réaliser l’étude

structurale des lipopolysaccharides présents à la surface des membranes directement sur des

culots de bactéries41,43,44,46-49

.

Elle a aussi été utilisée pour la caractérisation in situ des métabolites présents dans

différents types cellulaires. Par exemple, l’analyse de la composition en métabolites a servi au

contrôle de la production en réacteur et à la détermination de la valeur nutritionnelle de

l’algue Thallassiosira pseudonana46. Plusieurs types cellulaires composant la glie ont été

métaboliquement caractérisés sur des cellules isolées à partir de cerveaux de rats50

. Cette

technique a aussi été utilisée pour la caractérisation métabolique d’un adénocarcinome de

l’endomètre (cellules Ishikawa) et d’une étude métabonomique du tamoxifène montrant des

changements induits sur les concentrations en nucléotides, éthanolamine et myo-inositol51

.

Lors de l’utilisation de la RMN HR-MAS pour l’étude de cellules, deux signaux

attribués à la résonance de l’eau ont été mesurés. Cette observation a suggéré la présence d’un

signal attribué à l’eau extracellulaire à 4,71 ppm (T1=2,28s; T2=69ms) et d’un signal attribué

à l’eau intracellulaire à 4,78 ppm (T1=1,41s; T2=18ms)52

. Ce phénomène a été mis à profit

pour étudier la perméabilité transmembranaire d’agents de contraste utilisés en imagerie

médicale53

. Ainsi, la non-perméabilité membranaire des trois principaux complexes de

gadolinium classiquement utilisés (Gd-BOPTA, Gd-DTPA, et Gd-DOTA) a pu être confirmée

sur des cellules sanguines humaines. Mais, Chen et al.11

théorisent la présence de ces deux

signaux et contredisent l’hypothèse proposée par Humpfer et al.52

ainsi que l’interprétation

des résultats des expériences de Griffin et al.51

sur la diffusion de l’eau dans les cellules.

En réalité, dans ces expériences, on peut noter que l’échantillon soumis à une rotation

rapide se distribue suivant deux phases dès 1 kHz54

, un tore central pauvre en cellules entouré

d’un tore constitué majoritairement de cellules et d’une faible quantité d’eau. Ainsi, la

différence de susceptibilité magnétique entre ces deux phases est à l’origine des deux

déplacements chimiques de l’eau. Le basculement de l’échantillon à 54,7° n’est plus magique

car cet effet de différence de déplacement chimique isotrope ne peut pas s’annuler à l’angle

magique11-12

.

Ce phénomène a permis une évaluation indirecte de la viabilité cellulaire et du contenu

protéique cellulaire55

. En effet, au cours du temps, on note que les deux signaux de l’eau

observés lors de la mise en rotation du tube se confondent au bout de 48 heures d’analyse. La

raison en est la lyse cellulaire qui est induite par les contraintes mécaniques existant dans le


45

tube de 4 mm dues à la forte vitesse de rotation (4 kHz). De plus, l’existence d’une corrélation

linéaire entre la différence de déplacements chimiques des deux signaux de l’eau et la teneur

protéique cellulaire a été décrite54

. De la fragilité des cellules dépendra la viabilité. Par

exemple, 15 à 19% des adipocytes sont lysés après seulement deux heures de rotation à 3

kHz55

.

Bruno et al. 56

ont montré que l’étude des échanges à travers les membranes cellulaires

par RMN HR-MAS nécessite la création d’un mélange cellulaire homogène insensible à la

vitesse de rotation. Ainsi, la mesure des vitesses d’échange de l’eau à travers la membrane des

érythrocytes a pu être mesurée grâce à l’immobilisation de ces cellules dans un gel

d’albumine chimiquement réticulé.

3.2.3 Tissus.

La première expérience RMN HR-MAS sur des tissus biologiques a été réalisée par

Cheng et al. en 199657

. Ils réalisent des spectres RMN 1H de nodules lymphatiques. Ce type

d’échantillon ayant un contenu graisseux élevé, l’utilisation de séquence CPMG (Carr-

Purcell-Meiboom-Gill) (atténuation des signaux en fonction de leur T2) a permis l’obtention

de spectres monodimensionnels de bonne résolution en 20 minutes environ. Les différences

observées entre les spectres ont permis de caractériser la présence de cellules malignes dans

ce tissu. En 1997, ils décrivent pour la première fois une étude qui relie l’analyse qualitative

et quantitative des tissus par RMN HR-MAS avec l’imagerie médicale. Ainsi, dans le cas de

la maladie de Pick (maladie neurodégénérative), ils montrent qu’il existe un lien entre le taux

de N-acétylaspartate (NAA) et la dégénérescence. Ils mettent aussi en évidence une différence

des temps de relaxation transversale des métabolites entre les régions atteintes et saines avec

une augmentation de ces temps de relaxation dans les zones atteintes58

.

Ces études ont ouvert la voie à de nombreux travaux réalisés sur les tissus biologiques

par RMN HR-MAS. Il en existe aujourd’hui des centaines et il est donc difficile d’en faire

une liste exhaustive mais nous indiquerons quelques exemples.

Tout d’abord, des études sur le cerveau ont été réalisées, et pour beaucoup, elles

mettent en avant la comparaison éventuelle de cette technique avec la spectroscopie in vivo 59-

62 et/ou une différenciation entre différents types de tissus (sain vs malade ou malade 1 vs

malade 2 ou région 1 vs région 2)61-66

. Une autre étude montre une bonne corrélation entre la

quantification relative par RMN HR-MAS et celle réalisée à partir d’un extrait67

.


46

Mais la plus grande partie des travaux réalisés par RMN HR-MAS concerne le foie et

les reins. Il peut s’agir tout simplement d’études de faisabilité avec l’utilisation de diverses

séquences d’acquisition des spectres dans un but d’attribution des signaux68-73

, ou d’études

comparatives métabonomiques de différenciation de tissu normal vs tissu sain74-76

, ou bien

encore de l’effet biochimique de toxiques ou de drogues sur l’organe77-84

.Un dernier exemple

traite de la différenciation des échantillons de tissu rénal et des urines de différentes espèces

d’animaux et notamment le rat de laboratoire85

.

3.2.4 Agronomie.

La RMN HR-MAS a rapidement été appliquée à l’analyse et la caractérisation des

produits agro-alimentaires.

En 1989, Rutar86

réalise des expériences de RMN HR-MAS 1H et

13C sur des graines

de tournesol et de haricots. Il a ainsi accès à la composition lipidique des graines sans avoir

besoin de passer par une phase d’extraction. Une fréquence de rotation de 1 kHz est suffisante

pour éliminer les effets des couplages dipolaires et des différences de susceptibilité

magnétique présentes au sein d’un échantillon tel qu’une graine.

La détermination de la composition des produits par RMN HR-MAS permet de définir

une signature chimique qui pourra être corrélée à l’origine géographique, une étape de

production ou être utilisée pour un contrôle de qualité. Ainsi, une étude sur des farines

hydratées a été réalisée par RMN HR-MAS afin de caractériser l’origine géographique de blés

provenant de différentes régions du sud de l’Italie87

. Cette étude, bien que non statistiquement

validée (2 échantillons par groupe), était encourageante. C’est pourquoi en 2007, les mêmes

chercheurs caractérisent l’origine de pains italiens en combinant les résultats obtenus par

RMN HR-MAS avec ceux obtenus en spectrométrie de masse et les caractéristiques

morphologiques ou chromatiques88

.

De façon similaire, la caractérisation et la détermination géographique ou raciale de

viandes de bœuf89

et d’agneau90

ou la caractérisation de fromage (parmesan) et de son

origine91

ont été réalisées.

En 2000, une étude sur la composition de la pulpe et du jus de mangue a été conduite

afin de suivre les modifications biochimiques lors du mûrissement des fruits directement à

partir de la pulpe92

. La dégradation enzymatique de l’amylose a été suivie in situ sur des

farines de blé hydratées93

. L’observation sans extraction des carotènes, composés fortement

lipophiles, dans leur matrice biologique naturelle (carotte) a pu être effectuée94

.


47

L’utilisation de la RMN HR-MAS semble également être intéressante pour la

caractérisation des métabolites présents dans les algues95-98

.

Dans d’autres disciplines, la RMN HR-MAS a été utilisée pour différencier les

fractions libres et liées de pesticides sur des argiles anioniques. Concernant l’étude de la

biodisponibilité des polluants dans les sols, la RMN du solide, très efficace pour obtenir des

informations structurales, ne permet pas la quantification de cette biodisponibilité. La RMN

HR-MAS peut être utilisée pour résoudre ce genre de problème en travaillant sur des

échantillons hydratés99

. Enfin, des études sur la transformation des résidus de plantes dans

l’environnement100

ou sur la dispersion du glyphosate dans les sols grâce aux vers de terre101

montrent l’intérêt de cette technique dans le domaine écologique. La RMN HR-MAS a aussi

été utilisée en géologie pour l’analyse des liquides présents dans les roches sédimentaires.

Notamment, elle permet de déterminer la proportion d’hydrocarbures contenus dans la roche

mère tels que des grès schisteux102

.

Ces nombreuses études montrent l’étendue possible de l’utilisation de la RMN HR-

MAS que ce soit pour caractériser un produit (origine, structure, dégradation d’un produit

alimentaire, pollution) ou tout simplement pour évaluer la faisabilité de la technique sans

passer par une phase d’extraction. Elle peut donc s’avérer très utile dans le contrôle qualité et

devenir une technique de routine dans ce domaine.

3.3 Conclusion.

La diversité des travaux relevés dans la littérature, notamment dans l’utilisation de la

RMN HR-MAS pour les tissus biologiques, génère une multiplicité de protocoles d’études.

Nous avons donc choisi d’évaluer les paramètres optimaux d’analyse en étudiant divers types

d’échantillons biologiques (animaux, végétaux et tissus). Cette étude nous a permis de mettre

en valeur les atouts et les inconvénients de l’utilisation de la RMN HR-MAS.


48

4. Evaluation de la RMN HR-MAS à travers l’étude de différents types

d’échantillons biologiques: avantages et limitations.

4.1 Effet de la mise en rotation de l’échantillon à l’angle magique.

Dans un premier temps, il convient d’évaluer l’effet de la mise en rotation des

échantillons à l’angle magique. Nous présenterons les spectres d’échantillons bruts obtenus

avec une sonde conventionnelle en comparaison avec ceux obtenus avec une sonde RMN HR-

MAS.

4.1.1 Cas du ver Aporrectodea caliginosa non dépuré.

Nous avons réalisé l’acquisition de spectres 31

P en plaçant 3 vers dans un tube de

10 mm. De manière à rendre immobiles les animaux pendant l’acquisition des spectres, le

tube est rempli avec une solution aqueuse à 5% d’éthanol (v/v) qui permet de maintenir les

animaux anesthésiés. Les vers Aporrectodea caliginosa sont non dépurés, c'est-à-dire qu’ils

contiennent de la terre minérale. Les spectres obtenus avec la sonde conventionnelle 31

P de 10

mm sont présentés dans la figure 1.5a. Ensuite, une partie de l’animal est introduite dans le

rotor de 4 mm avant l’acquisition des spectres 31

P avec la sonde RMN HR-MAS (Figure

1.5b).

La comparaison du spectre RMN 31

P obtenu avec une sonde de 10 mm classique et le

spectre obtenu avec la sonde HR-MAS met en évidence l’amélioration de la résolution des

signaux du spectre obtenu par RMN HR-MAS. En effet, la largeur de raie à mi-hauteur des

signaux détectés est d’environ 160 Hz pour les spectres obtenus avec la sonde conventionnelle

alors que celle du signal de la phospholombricine (PL) mesurée sur le spectre HR-MAS est de

13 ± 4 Hz (n=9).


49

Figure 1.5: Spectres RMN 31P du ver Aporrectodea caliginosa obtenus (a) sur 1,2 g d’échantillon avec une sonde conventionnelle, (b) sur 198 mg avec une sonde HR-MAS.

Cette expérience est très comparable du point du vue phénoménologique à

l’expérience initiale de validation de la RMN HR-MAS réalisée par Dosko�ilová et al.5,

expérience ayant montré pour la première fois qu’il était possible d’obtenir avec une bonne

résolution le signal d’un solvant dans un système hétérogène (billes de verres de quelques

micromètres de diamètre). Dans notre cas, l’échantillon est constitué non seulement de

l’animal, mais aussi et pour une grande part, de terre. Ainsi, la rotation à l’angle magique a

pour conséquence d’éliminer les effets de différents phénomènes (variation de susceptibilité

magnétique, anisotropie de déplacement chimique et interactions dipolaires) qui contribuent à

l’augmentation de la dispersion spectrale du signal.

4.1.2 Cas des tissus biologiques.

Comme nous l’avons énoncé précédemment, l’intérêt principal de la technique HR-

MAS est d’obtenir des signaux de haute résolution pour les composés présentant une grande

mobilité en éliminant les différences de susceptibilité magnétique pouvant exister au sein d’un

échantillon. Les tissus biologiques (à l’exception du sang ou de la lymphe) peuvent, en

première approche, être considérés comme constitués de cellules maintenues dans un support

ppm -18-16-14-12-10-8-6-4-202468101214

PME

Pi

PDE

PL

�-NTP �-NTP

�-NTP�-NDP �-NDP

b Sonde HR-MAS

a Sonde conventionnelle


50

de nature cellulosique pour les végétaux ou protéique pour les animaux, l’ensemble baignant

dans le milieu extracellulaire.

Nous avons donc entrepris la comparaison des spectres de tissus biologiques obtenus

en utilisant une sonde RMN liquide conventionnelle de 5 mm et la sonde HR-MAS. Ces

expériences ont été réalisées sur des pièces de tissu rénal, cardiaque et musculaire

squelettique.

Pour d’optimiser les conditions d’acquisition des spectres avec la sonde

conventionnelle et, en particulier, afin de réaliser la meilleure homogénéité du champ

magnétique statique, nous avons utilisé des tubes munis d’un insert de susceptibilité

magnétique équivalente à celle de l’eau. Ainsi, le fragment, baignant dans une solution de

D2O (NaCl 0,9% p/v), reste au centre de l’antenne ce qui permet de réaliser l’homogénéité sur

le signal de l’eau de l’échantillon (Figure 1.6).

Figure 1.6: Tube RMN conventionnel de 5 mm contenant un échantillon de tissu rénal (80 mg), 200 µL de D2O (NaCl 0,9% p/v) et un insert Shigemi ayant la susceptibilité magnétique du D2O.

A titre d’exemple, la comparaison des spectres de tissu musculaire squelettique de rat

obtenus avec les deux types de sondes et dans les mêmes conditions d’acquisitions, à savoir

l’application d’une séquence simple d’impulsions (30°) couplée à une séquence de

présaturation du signal des protons de l’eau, est présentée sur la figure 1.7. On peut observer

que la résolution spectrale est très modérément améliorée avec la sonde HR-MAS. On le

remarque principalement au niveau de la créatine et de ses composés dérivés ("Cr") dont les

signaux sont situés autour de 3,05 ppm et entre 3,80 et 4,00 ppm.


51

Figure 1.7: Spectres RMN 1H de tissu musculaire squelettique de rat obtenus (a) avec une sonde HR-MAS (m = 40 mg) (b) avec une sonde conventionnelle (m = 66 mg).

La technique HR-MAS diminue en moyenne de 25% les largeurs des signaux 1H des

tissus du muscle squelettique, du cœur ou du rein de rat par rapport à celles obtenues avec une

sonde RMN liquide conventionnelle. Cette diminution correspond à un gain en résolution

d’environ 1 Hz (Tableau 1.2). Dans ces tissus, les variations de susceptibilité magnétique

sont donc en réalité modérées expliquant le fait que l’utilisation de la technique HR-MAS

n’amène, pour certains échantillons, qu’un bénéfice relativement faible sur la résolution.

Tableau 1.2: Largeurs à mi-hauteur (l1/2) en Hz du signal du lactate (Lac) et de la créatine et de ses dérivés ("Cr") mesurées sur des spectres 1H de tissu rénal, cardiaque ou musculaire squelettique obtenus avec une sonde conventionnelle et une sonde HR-MAS (n=3 dans chaque cas).

Tissu rénal Tissu cardiaque Tissu musculaire

l1/2 Lac l1/2 "Cr" l1/2 Lac l1/2 "Cr" l1/2 Lac l1/2 "Cr"

Sonde

conventionnelle 3,0 ± 0,6 4,6 ± 0,5 3,6 ± 1,3 4,7 ± 0,6 3,6 ± 0,7 4,9 ± 0,4

Sonde HR-MAS 1,6 ± 0,7 3,6 ± 0,6 2,6 ± 0,7 3,5 ± 0,6 3,5 ± 1,4 4,0 ± 0,5

Affinement avec

la sonde HR-

MAS

47% 22% 28% 26% 3% 18%

ppm1.001.502.002.503.003.504.004.50

ppm1.001.502.002.503.003.504.004.50

ppm1.001.502.002.503.003.504.004.50

ppm1.001.502.002.503.003.504.004.50

a Sonde HR-MAS

b Sonde conventionnelle

"Cr"

"Cr"

Lac


52

4.2 Matériel adapté à l’analyse de faibles volumes.

Par nature, la sonde HR-MAS est limitée à l’analyse de petits échantillons (3 à 50 mg)

avec des antennes RF adaptées aux faibles volumes de l’ordre de 50 µL pour la sonde HR-

MAS 4 mm52

. De plus, le basculement de l’échantillon permet d’utiliser des bobines de type

solénoïde qui ont un excellent facteur qualité103

.

Le gain en sensibilité apporté par la sonde HR-MAS est notamment illustré par

l’expérience réalisée sur le ver Aporrectodea caliginosa. En effet, les spectres RMN 31

P

réalisés avec les mêmes conditions d’acquisitions ont été obtenus avec 1,2 g de matière pour

la sonde conventionnelle alors que, pour les expériences HR-MAS, la quantité de matière

utilisée était de 198 ± 62 mg. Pour les expériences réalisées sur les tissus biologiques, nous

avons pu analyser par RMN HR-MAS 1H des échantillons dont la masse était de 7 mg.

Ce constat, bien que trivial, doit cependant être souligné. En effet, dans certains cas, la

sonde HR-MAS peut être avantageusement utilisée pour analyser des extraits liquides

provenant de très petits échantillons, en particulier lorsque l’utilisation d’une cryo-sonde n’est

pas possible.

4.3 Effet de la vitesse de rotation.

Une vitesse de rotation de quelques dizaines d’Hertz (c’est-à-dire quelques dizaines de

rotation par seconde) est théoriquement suffisante pour éliminer les variations de

susceptibilité magnétique existant au sein de l’échantillon104

. Dans la pratique, cette vitesse de

rotation est couramment comprise entre 1 et 5 kHz. Des impératifs de nature différente

influent sur le choix de la vitesse de rotation du rotor:

• impératif technique: le système de régulation pneumatique assurant l’entraînement et

la sustentation du rotor impose une vitesse minimum d’utilisation comprise entre 0,6

et 1 kHz suivant les équipements101,105

.

• impératif physique: les altérations du champ magnétique induites par les différents

éléments du rotor (avec la présence éventuelle d’air emprisonné) sont supérieures à

celles provenant de l’échantillon per se. En conséquence, la vitesse de rotation doit


53

être au moins égale à la dispersion spectrale du signal observé en condition statique

(liée essentiellement aux inhomogénéités du champ Bo provoquées par la sonde et le

rotor), soit de l’ordre de la centaine d’Hertz104

.

• impératif de lisibilité des spectres: des bandes latérales de rotation apparaissent et se

superposent au spectre à faible vitesse de rotation. Bien qu’elles puissent être

éliminées en utilisant des séquences d’impulsions RF particulières104

ou par la

combinaison de spectres obtenus à différentes vitesses de rotation105

, ces méthodes

impliquent soit une pondération du signal en fonction du temps de relaxation

transversale (T2), soit une augmentation du nombre de spectres par analyse.

Nous avons effectué une série d’expériences RMN HR-MAS 1H et

31P en faisant

varier la vitesse de rotation de l’échantillon afin de déterminer une vitesse optimale. Nous

présentons ici les spectres RMN HR-MAS de tissu rénal de rat pour des vitesses comprises

entre 1 et 6 kHz.

Dans le cas de l’observation des signaux 1H, on remarque que l’augmentation de la

vitesse de rotation de l’échantillon s’accompagne d’une légère augmentation de l’intensité des

signaux à composantes larges, principalement les lipides membranaires (Figure 1.8). En

raison de l’élimination des interactions dipolaires et de l’anisotropie de déplacement

chimique, la contribution des phospholipides membranaires dans la zone comprise entre 0,6 et

2,5 ppm augmente avec la vitesse de rotation et plusieurs signaux se superposent à ceux des

métabolites de faible poids moléculaire. La présence des bandes latérales de rotation dans la

zone d’intérêt du spectre est notable pour une vitesse de 1 kHz.

Nous observons évidemment le même phénomène d’augmentation de la contribution

des phospholipides membranaires sur les spectres RMN HR-MAS 31

P (Figure 1.9). Ceci se

traduit à partir de 3 kHz par la montée du signal correspondant aux phosphodiesters (PDE).


54

Figure 1.8: Spectres RMN HR-MAS 1H de tissu rénal de rat (m = 12 mg) obtenus à différentes fréquences de rotation: 1, 2,5 et 5 kHz. (Les zones encerclées correspondent aux bandes latérales de rotation.)

Figure 1.9: Spectres RMN HR-MAS 31P de tissu rénal de rat (m = 8 mg) obtenus à différentes fréquences de rotation.

2,5 kHz

1 kHz

5 kHz

ppm -5.00.05.010.015.0

Glu

Lac

"Cho"

ppm

-5,00,05,0

1 kHz

2 kHz

3 kHz

4 kHz

5 kHz

6 kHz

PDE

Pi

PME


55

Une vitesse de rotation de 2,5 kHz a été choisie pour la réalisation des expériences par

HR-MAS, cette valeur correspondant à la vitesse minimale pour laquelle les bandes latérales

sont situées en dehors de la zone d’intérêt du spectre.

4.4 Effet de la température.

La température est un élément important qui influence à la fois la qualité du spectre en

affectant la viscosité de l’échantillon et l’intégrité de l’échantillon en modifiant les activités

enzymatiques potentielles.

L’effet de la température sur les signaux des métabolites obtenus sur un échantillon

maintenu à une température constante et contrôlée a été évalué.

Figure 1.10: Spectres RMN HR-MAS 1H de tissu rénal de rat (m = 11 mg) obtenus à différentes températures d’acquisition: 0, 5, 10°C pendant 20 minutes.

En raison de la dissipation d’énergie produite par le frottement dans l’air du rotor, la

température réelle de l’échantillon est légèrement supérieure à la température affichée qui

correspond à la température du flux pneumatique. Cette élévation de température est de

ppm 2,0 1,5 1,0 0,00,5

0°C

5°C

10°C

Leu, Ile, Val,

CH3 LM Ala

LeuAce

Glu

Lac, (CH2)n LM

TMPS-d6


56

l’ordre de 1°C à 2,5 kHz106

. Les signaux des spectres obtenus à 0, 5 et 10°C restent identiques

avec cependant une légère amélioration de la résolution à 10°C notamment pour les signaux à

1,35 ppm (doublet du lactate (Lac) et signal large des (CH2)n des lipides membranaires (LM))

(Figure 1.10). Nous avons choisi de travailler à froid, à 5°C au dessus du point de

congélation, afin de limiter au maximum l’altération biologique des échantillons.

4.5 Stabilité des échantillons au cours du temps.

Les conditions de température et de vitesse de rotation ayant été définies, nous avons

évalué l’effet du temps d’analyse sur la préservation du contenu des échantillons107

.

L’acquisition répétée des spectres sur plusieurs heures a permis de déterminer l’évolution du

contenu métabolique de divers échantillons maintenus à 5°C et tournant à 2,5 kHz durant

l’expérience. Ainsi, la concentration de certains métabolites du tissu rénal a été suivie pendant

11h30 (Figure 1.11). Les signaux correspondants à la choline et ses dérivés ("Cho"; zone 3,18

à 3,26 ppm), au glutamate (Glu; zone 1,97 à 2,22 ppm) et à la créatine (Cr; zone 3,00 à 3,08

ppm) restent stables durant l’expérience. Par contre, on observe une faible augmentation du

signal attribué à l’ensemble leucine, isoleucine et valine (Leu+Ile+Val; zone 0,84 à 1,10 ppm)

ainsi qu’une faible diminution du signal attribué au lactate (Lac; zone 1,30 à1,97 ppm).

0

5

10

15

20

25

30

35

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 11,5

Temps (heures)

Co

ncen

trat

ion

rela

tiv

es

des

mét

abo

lite

s (%

)

Leu+Ile+ValLacGluCr"Cho"

Figure 1.11: Évolution des signaux caractéristiques d’acides aminés (Leu+Ile+Val et Glu), du lactate (Lac), de la créatine (Cr) et de la choline et de ses dérivés ("Cho") dans un échantillon de tissu rénal à 5°C et 2,5 kHz pendant 11h30. Les concentrations sont calculées en pourcentage de la somme des signaux intégrés.

La même expérience reconduite sur du tissu cardiaque confirme la stabilité des

composés détectés sur plusieurs heures (tableau 1.3). L’écart-type des concentrations calculé


57

à partir de 11 mesures, un spectre acquis toutes les heures durant 11 heures, est au maximum

de 1%.

Tableau 1.3: Pourcentages de certains métabolites dans des échantillons de tissu rénal et cardiaque sur une période de 11 h lors d’une expérience RMN HR-MAS 1H à 5°C et 2,5 kHz. Les valeurs sont données en pourcentage de la somme des signaux intégrés. Les résultats sont représentés avec l’écart type calculé à partir de 11 mesures, une mesure toutes les heures.

Tissu rénal Tissu cardiaque

Leu+Ile+Val 29,2 ± 1,0 5,5 ± 0,5

Lac 25,7 ± 0,7 22,8 ± 0,8

Glu 16,1 ± 0,2 17,3 ± 0,5

Cr 5,9 ± 0,1 13,5 ± 0,3

"Cho" 23,0 ± 0,5

Tau 40,9 ± 0,8

Cette stabilité est illustrée dans la figure 1.12 qui représente, sous forme

d’histogramme, les concentrations relatives des différents métabolites dans le rein et le cœur.

Figure 1.12: Pourcentages de certains métabolites dans des échantillons de tissu rénal et cardiaque sur une période de 11 h lors d’une expérience RMN HR-MAS 1H à 5°C et 2,5 kHz. Les valeurs sont données en pourcentage de la somme des signaux intégrés. Les résultats sont représentés avec l’écart type calculé à partir de 11 mesures, une mesure toutes les heures.

Le premier spectre d’un échantillon de tissu rénal et le spectre du même échantillon

obtenu 19 heures plus tard sont, à l’exception de la zone des composés à cholines (3,2 à

3,3 ppm), identiques (Figure 1.13). Il n’y a donc pas de dégradation importante des

métabolites avec le temps. L’acquisition du premier spectre est initiée dans les 5 minutes qui

suivent la préparation du rotor. Ce temps préparatoire est nécessaire à la remontée en

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Leu+Ile+Val Lac Glu Cr Cho Tau

Métabolites

Po

urcen

tag

e (

%)

Tissu rénal

Tissu cardiaque


58

température de l’échantillon (les échantillons étant placés et maintenus à -80°C avant leur

insertion dans la sonde HR-MAS) et à l’optimisation de l’homogénéité du champ

magnétique108

. La modification du profil des composés à cholines ("Cho") est probablement

liée à l’altération de l’intégrité cellulaire avec une hydrolyse de la phosphatidylcholine,

constituant principal des membranaires cellulaires. L’hydrolyse de la phosphorylcholine (PC)

intervient rapidement dans le tissu non congelé.

Figure 1.13: Spectres RMN HR-MAS 1H de tissu rénal de rat (m = 8 mg); t=0, obtenu immédiatement après stabilisation de la température à 278 K, t=19 h, obtenu 19 h plus tard.

Alors que les spectres de tissus évoluent peu, la dégradation physique de l’échantillon

est systématiquement observée à l’ouverture du rotor. En effet, en fin d’expérience, et en

particulier pour les échantillons préalablement congelés, il y a apparition d’une phase liquide

importante séparée d’un reste fibreux de tissu. La rotation de l’échantillon avec ses

conséquences mécaniques sur le tissu est à l’origine de la destruction de l’intégrité tissulaire.

L’analyse du même échantillon sans reste fibreux confirme que c’est bien le liquide d’origine

intracellulaire et interstitiel qui contribue majoritairement au spectre.

Les conséquences mécaniques de la vitesse de rotation du rotor sur l’échantillon ont

été évaluées de façon théorique103

et pratique54,105,109

. L’échantillon est soumis à un gradient

t=0

t=19h

ppm 4,0 3,5 2,5 2,0 1,5 1,03,0

"Cho"

Cho

PCGPC


59

de force centrifuge de plusieurs milliers de g provoquant des contraintes mécaniques élevées.

La pression générée par la force centrifuge peut atteindre plusieurs dizaines de bars dans

l’enceinte contenant l’échantillon12

.

L’étude histologique du tissu après analyse RMN HR-MAS montre que sa structure

est modérément altérée pour des vitesses inférieures à 700 Hz105

ou tout du moins reste

interprétable d’un point de vue anatomohistopathologique. Cependant, le maintien relatif de la

matrice du tissu n’exclut pas une altération des cellules comme cela a par ailleurs été

démontré54

. La plupart des études publiées sont réalisées à une vitesse de rotation comprise

entre 1 et 5 kHz.

4.6 Problèmes liés aux échantillons biologiques.

L’origine des tissus biologiques ainsi que leurs conditions de prélèvement, de stockage

et d’analyse peuvent être extrêmement variées. Ces éléments doivent être réellement

appréciés avant de débuter une étude afin d’évaluer leur impact sur la reproductibilité et la

validité expérimentales, sur la réutilisation potentielle de l’échantillon et enfin sur la sécurité

sanitaire.

Il convient tout d’abord de différencier les analyses réalisées sur le tissu frais des

analyses réalisées sur le tissu congelé. Dans la pratique, peu d’études ont une logistique de

collection des échantillons compatible avec une analyse immédiate du tissu110

. La majorité

des études est réalisée avec des échantillons qui ont été rapidement congelés dans l’azote

liquide, puis maintenus à -80°C jusqu’au moment de l’analyse73,109,111

. En l’absence d’agent

cryoprotecteur, le cycle de congélation-décongélation est connu pour détruire les tissus112

.

Cette destruction est essentiellement liée à l’éclatement des cellules constitutives du tissu. Elle

affecte donc l’organisation subcellulaire et la compartimentation métabolique.

Les différences observées sur les spectres RMN HR-MAS de biopsies du muscle

squelettique de rat révèlent l’effet délétère de la congélation sur le tissu. Conformément à des

observations antérieures, le contenu en ATP du muscle frais reste constant au moins 2 heures

à 4°C alors qu’il est indétectable dans le muscle ayant subi un cycle de congélation (azote

liquide)-décongélation (4°C) avant l’analyse (Figure 1.14)113,114

.


60

Figure 1.14: Spectres RMN HR-MAS 31P de muscle squelettique de rat: (a) frais (m = 48 mg), (b) ayant subi un cycle de congélation-décongélation (m = 36 mg).

L’analyse RMN HR-MAS 1H montre, en accord avec les travaux de Middleton

et al.115

sur une biopsie corticale de rein, que les signaux de l’échantillon soumis à un cycle de

congélation-décongélation sont mieux résolus (Figure 1.15). Nous pouvons remarquer

principalement une légère augmentation de la résolution au niveau des doublets du β-

hydroxubutyrate (β-HB), du lactate (Lac) et de l’alanine (Ala). La zone comprise entre 3,0 et

3,6 ppm est aussi mieux résolue dans le cas du tissu ayant subi un cycle de congélation-

décongélation.

ppm-25.0-20.0-15.0-10.0-5.00.05.0

PME

Pi

PDE

PCr

�-NTP�-NTP

�-NTP

a tissu frais

b tisssu décongelé

ppm-25.0-20.0-15.0-10.0-5.00.05.0


61

Figure 1.15: Spectres RMN HR-MAS 1H de muscle squelettique de rat: (a) frais (m = 48 mg), (b) ayant subi un cycle de congélation-décongélation (m = 36 mg).

En effet, la précipitation des protéines et la modification des temps de relaxation

consécutives au cycle de congélation-décongélation expliquent l’affinement des

signaux116,117

. En particulier, de nombreuses protéines solubles ne sont pas résistantes à la

congélation et peuvent se dénaturer de manière irréversible ou précipiter, provoquant ainsi la

libération dans le milieu de métabolites. La combinaison, sur certains tissus, des effets du

cycle de congélation-décongélation et de la centrifugation conduit à la formation d’un

exsudat et d’un amas fibreux dans le rotor. A titre anecdotique, signalons que les exsudats

obtenus sont utilisés par la répression des fraudes pour contrôler l’absence de congélation

des viandes118

.

De plus, les biopsies sont des échantillons biologiquement actifs, ce qui implique une

activité enzymatique et un risque biologique potentiel. Les modifications du contenu en

métabolites sont susceptibles d’intervenir dès le prélèvement, durant le stockage, la

préparation de l’échantillon et le temps d’analyse. Malgré la manipulation et l’analyse des

échantillons à basse température, la dégradation enzymatique des métabolites persiste111

. Le

risque biologique est particulièrement prégnant pour les échantillons d’origine humaine. En

effet, la manipulation des biopsies doit être réalisée en conformité avec les exigences de

sécurité sanitaire liées aux risques biologiques L2 ou L3, c’est-à-dire au minimum dans une

p p m1 . 0 01 . 5 02 . 0 02 . 5 03 . 0 03 . 5 04 . 0 0

p p m1 . 0 01 . 5 02 . 0 02 . 5 03 . 0 03 . 5 04 . 0 0

3,5 2,5 1,5ppm 1,02,03,04,0

a tissu frais

b tissu décongelé

β-HB Ala

"Cr" Lac


62

salle dédiée et sous un poste de sécurité microbiologique (PSM, norme: NF EN 12 469).

Actuellement, la mise en place de l’échantillon et le montage du rotor sont peu compatibles

avec le respect de ces normes. L’utilisation d’un insert étanche, à usage unique, dans lequel

l’échantillon est placé immédiatement après le prélèvement, pourrait être une alternative. Ce

type d’insert étanche existe mais, à l’heure actuelle, il n’est adapté qu’au rotor 7 mm et un tel

système pour les rotors 4 mm n’est pas encore commercialisé.

4.7 Observation simultanée des métabolites hydrosolubles et des lipides.

4.7.1 Les lipides.

Les lipides présents dans les échantillons peuvent être classés en deux catégories en

fonction de leur capacité à être observés par RMN: (i) les lipides à faible mobilité comme les

lipides constitutifs des membranes (phospholipides, cholestérol) qui sont organisés et soumis

à un couplage dipolaire et à une anisotropie de déplacement chimique, (ii) les lipides à grande

mobilité (isotrope) comme les lipides neutres (triglycérides) concentrés dans des gouttelettes

lipidiques. Avec la RMN HR-MAS, en raison de l’élimination des interactions dipolaires et de

l’anisotropie de déplacement chimique, la contribution des lipides membranaires augmente

avec la vitesse de rotation et plusieurs signaux se superposent à ceux des métabolites de faible

poids moléculaire.

Les triglycérides de réserve observés dans les tissus ont une résolution spectrale

suffisante pour être identifiés et quantifiés. Par exemple, il est possible de mesurer in situ sur

la larve d’un carabe placée directement dans le rotor, le niveau de poly-insaturation moyen et

le contenu relatif en lipides insaturés en oméga-3. Cette étude nous a permis de mettre en

évidence une adaptation de la larve aux conditions de température hivernale en observant une

augmentation de la concentration relative en lipides oméga-3 dont le triplet caractéristique est

situé à 0,96 ppm (Figure 1.16).


63

Figure 1.16: Spectres RMN HR-MAS 1H caractéristiques de larves de carabe (Harpalus rufipes): (a) larve prélevée en hiver, (b) larve prélevée au printemps. Spectres obtenus avec une séquence simple (impulsion-acquisition) et présaturation du signal des protons de l’eau. Signaux attribués selon la formule générale des triglycérides (formule en insert).

4.7.2 Les métabolites hydrosolubles.

L’objectif de la plupart des études étant l’évaluation des modifications des contenus en

métabolites de faible poids moléculaire, l’élimination de la contribution des lipides est

souvent recherchée. La séquence d’écho de spin CPMG qui atténue le signal en fonction du

temps de relaxation transversale T2 est couramment utilisée pour atténuer les signaux dont le

T2 est plus court. Cette séquence est particulièrement efficace pour éliminer la contribution

des lipides membranaires (LM) (Figure 1.17).

2 3 4 5 6 11 10 9 8 7 12 14 15 16 17 18 13 H2C

HC

O

OCOR2

H2C OCOR3

C CH2

O

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH CH2 CH CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH2 CH CH CH2 CH CH CH2 CH3

�

�

��3

Triglycérides

1,13,23,43,63,84,04,24,4

1,1 0,83,23,43,63,84,04,24,4

18

38,14

211

� �

9, 10, 12,

13, �

Cholines

Tréhalose (C2-C6)

3

Cholines

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,64,04,44,85,25,6

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,6

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,6

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,6

0,8

Cholines

4-7, 15-17

a Récolte hivernale

b Récolte vernale

�3


64

Figure 1.17: Spectres RMN HR-MAS 1H d’un échantillon de tissu rénal de rat (m = 12 mg). (a) Spectre obtenu avec une séquence simple (impulsion(90°)-acquisition) et présaturation du signal des protons de l’eau, (b) spectre obtenu avec une séquence d’écho de spin (CPMG) avec un temps d’écho de 120 ms et une présaturation du signal des protons de l’eau.

En revanche, lorsqu’il s’agit d’éliminer la contribution des triglycérides de réserve, la

pondération en T2 des signaux ne permet plus une atténuation satisfaisante. On le constate,

par exemple, pour un prélèvement sur lequel est resté attaché un fragment de tissu adipeux

(Figure 1.18). Un tel échantillon de tissu est rejeté d’une étude si celle-ci est uniquement

basée sur l’analyse par RMN HR-MAS alors que les métabolites endogènes sont parfaitement

analysables dans la fraction aqueuse de l’extrait de cet échantillon (Figure 1.18c).

��

TMPS-d6

CH3 LM

Leu, Ile, ValAla

Lac-CH2-CH2-CO- LM

Lys, Leu

=CH-CH2 LM

Ace

Glu

(CH2)n LM

�-HB

-CH2-CH2-CO- LM

Glu

a

b


65

Figure 1.18: Spectres RMN HR-MAS 1H d’un échantillon atypique de tissu rénal (m = 15 mg) de rat. Spectres obtenus (a) avec une séquence simple (impulsion(90°)-acquisition), (b) avec une séquence d’écho de spin CPMG et un temps d’écho de 120 ms. (c) Spectre de la fraction aqueuse de l’extrait de cet échantillon. A l’exception du signal des composés à choline ("Cho") et de la taurine (Tau), les autres signaux attribués aux spectres a et b concernent les triglycérides.

4.7.3 Attribution des signaux.

Les attributions des signaux des spectres (Tableau 1.4 et figure 1.19) ont été établies

à partir des données de corrélations 1H-

1H obtenues par RMN HR-MAS sur le tissu et en

utilisant les données de la littérature119

.

La méthode par ajout direct de standards pour l’attribution des résonances est délicate

à utiliser dans le cas de la RMN HR-MAS. L’ouverture répétée du rotor contenant le même

échantillon conduit à une perte non contrôlée d’une fraction du liquide présent. De plus,

l’hétérogénéité physique et physicochimique de l’échantillon dans le rotor ne permet pas de

garantir une attribution sur la base de la superposition de signaux. La sonde HR-MAS utilisée

dans ce travail ne disposant pas de canal 13

C, les confirmations de certaines attributions ont

a

b

c

CH3

(CH2)n

CO-CH2-CH2

=CH-CH2

CO-CH2

=CH-CH2-CH=

α CH2-O

du glycérol

γ CH2-O

du glycérol

"Cho", Tau

ppm1.001.502.002.503.003.504.00


66

été obtenues en exploitant les données de corrélations 1H-

13C HSQC ou HMBC avec une

sonde conventionnelle sur les fractions hydrosolubles des extraits tissulaires.

Figure 1.19: Spectres RMN HR-MAS 1H de tissu rénal de rat (m = 13 mg) obtenue avec une séquence d’écho de spin CPMG et un temps d’écho de 120 ms et présaturation du signal des protons de l’eau.

Tableau 1.4: Attributions des métabolites hydrosolubles de tissu rénal de rat réalisées par ajout de standards dans les extraits aqueux (pH 8,5).

Métabolites Formules chimiques Groupement

Déplacement

chimique

(ppm)

J (Hz)

Acétate

(Ace) CH3

O

O-

CH3 1,92 (s)

Alanine

(Ala) CH3

NH3

+

O-

O

CH3

CH

1,48 (d)

3,74 (q)

7,2

7,2

ppm0.01.02.03.04.0

Leu, Ile, Val.

Lac

Ala

Leu,

Lys

Ace

Glu

Glu

"Cr"

�-glucose

Lac

"Cho",

Tau

Tau

MyoI"Cr"

MPA

TMPS-d6

Asp

Gly

�-HB


67

Aspartate

(Asp) O-

O-

NH3

+O

O

CH

CH2

3,89 (dd)

2,75 (ABd)

4-9,2

4-8,8-17,2

Choline

(Cho) N

+

CH3

OH

CH3

CH3

+N(CH3)3

N-CH2

HO-CH2

3,21 (s)

3,51 (m)

4,05 (m)

Créatine

(Cr) N

NH2

O-

O

CH3

NH CH3

CH2

3,04 (s)

3,96 (s)

Créatinine

NH

N

NH

CH3

O

CH3

CH2

3,05 (s)

4,06 (s)

Glucose O

OH

OH

OH

OH

OH

1

�-1CH

�-1CH

5,23 (d)

4,64 (d)

4,7

7,8

Glutamate

(Glu)

O-

O

NH3

+O

-

O

1

2

3

4

53CH2

4CH2

2CH

2,07 (m)

2,36 (td)

3,77 (t)

2,6-7,6

7,7

Glycéro

phosphoryl

choline

(GPC)

N+

CH3

O

CH3

CH3

P

O

OO

-

OH

OH

1

2 +N(CH3)3

N-2CH2

O-1CH2

3,24 (s)

3,66 (m)

4,31 (m)

�-hydroxy

butyrate

(�-HB)

CH3

O-

OH

O CH3

CH

CH2

1,15 (d)

2,40 (qd)

4,15 (m)

5,9

6,0-14

Glycine

(Gly)

O

NH3

+

O-

CH2 3,56 (s)


68

Isoleucine

(Ile)

O

NH3

+

CH3

CH3

O1

23

4

5

6

5CH3

4CH2

3CH

6CH3

2CH

0,95 (t)

1,25-1,30

(2m)

2,04 à 1,94

(m)

1,02 (d)

3,68 (d)

7,8

6,8

4,0

Lactate

(Lac)

CH3

O-

O

OH

CH3

CH

1,33 (d)

4,11 (q)

7,0

7,0

Leucine

(Leu)

O

NH3

+

CH3

CH3

O-1

2

3

4

5

55CH3

3CH2 et

4CH

2CH

0,94-0,96

(2d)

1,6-1,8 (2m)

3,67 (t)

5,9-61,

7,0

Lysine

(Lys)

O

NH3

+

NH2

O-

NH2-CH2

(CH2)3

CH

3,00 (t)

1,44-1,74

(2m)

3,50 (t)

7,2

6,0

Myo-inositol

(MyoI)

5CH3

3CH2 et

4CH

2CH

5CH 3,28 (t) 9,4

Phosphoryl

choline

(PC)

N+

CH3

O

CH3

CH3

P

OH

OO

-

N(CH3)3

N-CH2

O-CH2

3,23 (s)

3,64 (m)

4,28 (m)

Phosphocréatine

(PCr)

N

NH

O-

O

CH3

NH

P

O-

O

OH

CH3

CH2

3,04 (s)

3,96 (s)

Succinate

(Succ)

O-

O-

O

O

(CH2)2 2,41 (s)


69

Taurine

(Tau)

O-

S

NH3

+

O

O

CH2-S

CH2-N

3,41 (t)

3,25 (t)

6,8

6,8

TMAO N+

CH3

CH3

CH3 O-

(CH3)3 3,28 (s)

Valine

(Val)

O

NH3

+

CH3

CH3 O-12

3

4

4

4CH3

4CH3

3CH

2CH

1,04 (d)

0,99 (d)

2,28 (m)

3,61 (d)

6,8

7,8

4,4

4.8 Quantification des métabolites.

La capacité à détecter in situ et en haute résolution les métabolites contenus dans un

fragment de tissu, sans extraction préalable, est à l’origine de l’engouement porté à

l’utilisation de la RMN HR-MAS. La RMN permet théoriquement d’accéder à des

informations sur l’environnement et la mobilité du composé détecté. Cependant, hormis de

rares travaux sur la partition de l’eau51

et du glyphosate101

, à notre connaissance, aucune

information tangible sur la compartimentation ou la détermination des fractions libres ou liées

de métabolites n’a été obtenue par RMN HR-MAS. La destruction partielle de l’organisation

du tissu en est certainement la raison majeure. Dans ces conditions, on s’attend à ce que la

quantification par RMN HR-MAS et par RMN conventionnelle réalisée respectivement sur un

échantillon de tissu et sur la fraction aqueuse de l’extrait de ce tissu soient similaires.

Les signaux des métabolites de faible poids moléculaire étant superposés aux signaux

provenant des lipides, la quantification des métabolites n’est pas directement accessible. La

séquence d’écho de spin CPMG est utilisée pour observer et résoudre correctement les

signaux des métabolites à grande mobilité (Figure 1.17). Le recours à une séquence atténuant

les signaux en fonction de leur T2 simplifie le spectre mais complique la détermination

quantitative des métabolites. En effet, la quantification suppose une connaissance du temps de

relaxation T2 des différents signaux des molécules étudiées.

Nous présentons ici les différentes étapes requises pour réaliser la quantification

absolue des métabolites présents dans le tissu rénal à partir de spectres RMN HR-MAS. Une


70

référence interne est ajoutée à l’échantillon de tissu pour déterminer la quantité absolue des

composés détectés. Nous avons utilisé le TMPS-d6 (acide 3-(triméthylsilyl)-1-propane

sulfonique-d6) ou le MPA (acide méthylphosphonique) en solution dans D2O pour la RMN

1H ou

31P. Les résultats de la quantification obtenus sur le tissu de rein seront comparés aux

résultats de la quantification obtenus par RMN conventionnelle sur l’extrait de ces

échantillons «post-HRMAS» (c'est-à-dire que les extraits sont réalisés immédiatement après

l’expérience RMN HR-MAS et sur le même échantillon). De plus, afin d’évaluer l’impact de

l’analyse HR-MAS sur les métabolites extraits, ces résultats seront également comparés à la

quantification obtenue par RMN conventionnelle sur des extraits aqueux réalisés sur le tissu

rénal dès sa sortie du congélateur.

4.8.1 Choix des paramètres d’acquisition.

De manière à simplifier la quantification, les paramètres d’acquisition des spectres ont

été choisis pour assurer le retour complet de l’aimantation à l’équilibre entre les acquisitions.

Ainsi, le temps d’attente entre deux impulsions de lecture est choisi afin de ne pas induire de

pondération en T1 (temps de relaxation longitudinale) des signaux du spectre. Les temps de

relaxation longitudinale des protons à l’origine des signaux du spectre ont été mesurés en

utilisant la séquence classique d’inversion-récupération. Le temps de relaxation T1 des

différentes résonances est compris entre 198 et 792 ms (Tableau 1.5).

Tableau 1.5: Temps de relaxation longitudinale (T1) in situ des principaux métabolites du rein donnés en ms ± SD (n=3). CV: coefficient de variation.

Métabolites T1 (ms) CV

TMPS-d6 789 ± 12 1,5%

Leu, Ile, Val 591 ± 27 3,4%

�-hydroxybutyrate 516 ± 92 11,7%

Lactate 420 ± 27 3,4%

Alanine 392 ± 32 4,1%

Acétate 792 ± 52 6,6%

Glu 375 ± 7 0,9%

Cr, PCr 749 ± 78 9,9%

Cho 661 ± 67 8,5%

PC, GPC 576 ± 12 1,5%

Tau 777 ± 28 3,5%

Glucose 298 ± 63 8,0%

Lipides 198 ± 29 3,7%


71

En accord avec les mesures du T1, les spectres acquis avec un temps d’attente

supérieur ou égal à 3,45 s sont strictement superposables (Figure 1.20).

Figure 1.20: Spectres RMN HR-MAS 1H de tissu rénal de rat (m = 9 mg) obtenus avec différents temps d’attente entre les impulsions.

Un délai d’attente de 3,45 secondes a donc été choisi pour l’acquisition des spectres

destinés à la quantification absolue des métabolites.

4.8.2 Quantification de solutions standards par RMN HR-MAS.

Afin de s’assurer de l’exactitude de la méthode et de l’absence d’éventuels artéfacts,

en particulier ceux induits par la présaturation du signal de l’eau, la quantification de solutions

standards a été réalisée avec une séquence simple d’impulsion-acquisition et dans des

conditions de relaxation complète.

Le volume utile de l’antenne étant de l’ordre de 50 µL, la quantification n’est

pertinente que pour les rotors de 50 µL et 12 µL. Cependant, nous avons constaté qu’un

déplacement de liquide survenait entre le compartiment de l’échantillon et la partie supérieure

du tube en raison de la surpression générée durant la rotation et d’un défaut d’étanchéité entre

la vis et l’insert. Ce défaut d’étanchéité rend aléatoire la quantification absolue avec les rotors

de 12 µL. Seuls les rotors de 50 µL ont été utilisés pour réaliser la quantification absolue des

composés. Cependant, ces rotors ne sont que partiellement remplis, avec un volume maximal

de 30 µL, afin que la totalité du liquide reste confiné dans le volume utile du rotor.

ppm 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0

3,45 s

7,45 s

10,45 s


72

L’exactitude de la quantification a été évaluée sur des solutions contenant du lactate,

du glucose, du phosphate inorganique pour 6 concentrations allant de 1,25 à 18 mmol.L-1

et

en présence de TMPS-d6 et de MPA. La quantification est réalisée à partir des signaux des 1H

du MPA (doublet à 1,20 ppm), du lactate (doublet à 1,35 ppm) et du glucose (doublet

dédoublé à 3,23 ppm) mesurés sur les spectres de RMN HR-MAS 1H. Les concentrations

mesurées et rapportées en pourcentage des concentrations réelles sont de 101 ± 3% pour le

MPA, 100 ± 4% pour le lactate et 102 ± 3% pour le glucose. La quantification réalisée à partir

des spectres RMN HR-MAS 31

P permet de mesurer 99 ± 3% du Pi présent dans le rotor.

La quantification par RMN HR-MAS des composés présents dans des échantillons

maintenus confinés dans le volume utile du rotor est donc parfaitement exacte et

reproductible.

4.8.3 Quantification des métabolites présents dans le tissu rénal par RMN HR-MAS.

4.8.3.1 Mesure des temps de relaxation transversale T2.

La quantification de la plupart des métabolites visibles sur le spectre RMN HR-MAS

1H implique, comme nous l’avons montré, d’atténuer voire d’éliminer les signaux provenant

des lipides à l’aide de la séquence CPMG. Il est donc nécessaire de mesurer, pour chaque

signal, l’atténuation induite pour un temps d’écho donné. La connaissance des temps de

relaxation T2 est requise pour déterminer la concentration des métabolites quel que soit le

temps d’écho utilisé pour la séquence d’écho de spin. Les temps de relaxation T2 des

résonances des 1H donnant les signaux utilisées pour la quantification des métabolites ont

donc été déterminés en mesurant la variation de l’intensité de chaque signal en fonction du

temps d’écho appliqué71,111

. L’évolution de l’intensité du signal à 2,076 ppm attribué aux

protons du glutamate (groupement 3CH2) en fonction du temps d’écho est présentée dans la

figure 1.21. L’intensité du signal évolue en fonction du temps d’écho en suivant la loi:

)exp()(2T

TeIoxyI −=

Avec:

• T2: temps de relaxation transversale

• Te: temps d’écho

• I(xy): intensité du signal mesuré après le temps d’écho Te

• Io: intensité maximale du signal


73

Figure 1.21: Évolution de l’intensité du signal à 2,076 ppm pour des spectres RMN HR-MAS 1H de tissu rénal obtenus à 5°C et 2,5 kHz en fonction du temps d’écho appliqué. (a) Echelle normale avec courbe de régression logarithmique, (b) échelle logarithmique avec courbe de régression linéaire.

L’évolution de l’intensité en représentation logarithmique permet aisément de

comparer et de déterminer les valeurs de T2 (Figure 1.21). Les valeurs de T2 des résonances

des 1H des métabolites caractéristiques sont reportées dans le tableau 1.6. Les valeurs

correspondent à la moyenne de mesures réalisées sur 9 échantillons.

Le temps d’écho de 120 ms a été choisi pour la réalisation des spectres RMN HR-

MAS. Ce temps correspond à un compromis entre l’atténuation des signaux provenant des

lipides et l’obtention du spectre avec un rapport signal sur bruit acceptable en 10 minutes pour

un échantillon de tissu de rein dont la masse moyenne est d’environ 10 mg.

y = -19144Ln(x) + 125440

R2 = 0,9579

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Temps d'écho (ms)

Inte

nsi

té I

y = -0,0065x + 11,137

R2 = 0,9652

8

8,5

9

9,5

10

10,5

11

11,5

12

12,5

13

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Temps d'écho (ms)

Ln

(I)

-1/T2


74

Tableau 1.6: Temps de relaxation transversale (T2) in situ des principaux métabolites du rein donnés en ms ± SD (n=9) et facteur d’atténuation pour un temps d’écho de 120 ms. CV: coefficient de variation.

Métabolites T2 (ms) CV Facteur d’atténuation

à 120 ms

TMPS-d6 170 ± 20 11,8% 0,51

Leu, Ile, Val 202 ± 22 10,7% 0,45

�-hydroxybutyrate 356 ± 92 25,9% 0,29

Lactate 168 ± 27 15,8% 0,51

Alanine 295 ± 32 8,1% 0,33

Acétate 385 ± 60 15,6% 0,27

Glu 167 ±16 10,7% 0,52

Cr, PCr 245 ± 58 23,5% 0,39

Cho 421 ± 75 17,7% 0,25

PC, GPC 378 ± 28 7,5% 0,28

Tau 629 ± 58 16,3% 0,17

Glucose 179 ± 33 18,7% 0,49

Lipides 84 ± 11 13,5% 0,77

Les temps de relaxations T2 sont compris entre 167 ms pour les 1H du glutamate et

629 ms pour les protons de la taurine. Les protons des groupements méthyles des lipides

(phospholipides) présentent, comme attendu, un T2 plus court.

4.8.3.2 Quantification absolue par RMN HR-MAS.

La quantification des métabolites présents dans le tissu de rein a été réalisée à partir

des spectres RMN HR-MAS acquis avec la séquence CPMG en prenant en compte le facteur

d’atténuation spécifique de chaque signal pour un temps d’écho de 120 ms (Tableau 1.7).


75

Tableau 1.7: Concentrations des principaux métabolites du tissu rénal déterminées à partir des signaux des spectres RMN HR-MAS. Les concentrations sont rapportées en nmol/mg de tissu ± SD (n=3). CV: coefficient de variation.

Métabolites Zone d’intégration (ppm)

(Groupement)

Concentration

(nmol/mg de tissu) CV

Leu, Ile, Val 0,92-1,09 (3*2CH3) 27,1 ± 1,5 5,5%

�-hydroxybutyrate 1,13-1,17 (CH3) 11,8 ± 1,4 11,9%

Lactate 1,30-1,36 (CH3) 15,8 ± 3,0 19,0%

Alanine 1,46-1,50 (CH3) 7,8 ± 1,2 15,4%

Acétate 1,91-1,93 (CH3) 1,3 ± 0,2 15,4%

Glu 2,33-2,39 (4CH2) 28,5 ± 3,5 12,3%

Cr, PCr 3,02-3,06 (CH3) 11,2 ± 1,3 11,6%

Cho 3,19-3,22 (+N(CH3)3) 4,0 ± 0,5 12,5%

PC, GPC 3,22-3,26 (+N(CH3)3) 4,4 ± 0,6 13,6%

Tau 3,40-3,46 (S-CH2) 21,5 ± 2,5 11,6%

Glucose 4,62-4,66 et 5,22-5,25 (1CH) 19,0 ± 4,3 22,6%

4.8.3.3 Comparaison de la quantification par RMN HR-MAS avec d’autres protocoles.

Immédiatement après l’acquisition du spectre servant à la quantification des

métabolites, le contenu du rotor et son liquide de rinçage sont récupérés et l’extraction est

réalisée. Une autre série d’extractions est réalisée sur des échantillons de tissus de rein

directement sortis du congélateur et n’ayant subi aucun traitement préalable. Les fractions

aqueuses des extraits sont analysées par RMN liquide conventionnelle. Les résultats de

quantification obtenus sur ces trois groupes d’échantillons sont présentés dans le tableau 1.8.

La comparaison des résultats obtenus avec les trois protocoles de quantification est

illustrée par la figure 1.22.


76

Tableau 1.8: Concentrations des principaux métabolites de tissu rénal mesurées selon 3 protocoles différents: extraits aqueux de tissu analysés par RMN conventionnelle (n=5); extraits aqueux du tissu «post-HR-MAS» analysés par RMN conventionnelle (n=3); tissu de rein analysé directement par HR-MAS (n=3). Les valeurs sont données en nmol/mg de tissu ± SD (CV).

Extraction directe du

tissu

Extraction du tissu

après HR-MAS

Analyse directe du

tissu

Leu+Ile+Val 18,8 ± 0,9 (4,8%) 28,5 ± 1, 0 (3,5%) 27,1 ± 1,5 (5,5%)

�-HB 6,9 ± 0,5 (7,2%) 8,0 ± 1,8 (22,5%) 11,8 ± 1,4 (11,9%)

Lac 22,9 ± 0,6 (2,6%) 11,1 ± 1,9 (17,1%) 15,8 ± 3,0 (18,9%)

Ala 7,9 ± 0,4 (5,1%) 12,9 ± 0,6 (4,7%) 7,8 ± 1,2 (15,4%)

Ace 3,3 ± 0,3 (9,1%) 4,3 ± 0,2 (4,7%) 1,3 ± 0,2 (15,4%)

Glu 23,5 ± 1,8 (7,7%) 25,9 ± 2,4 (9,2%) 28,5 ± 3,5 (12,3%)

Cr+PCr 12,7 ± 1,0 (7,9%) 10,1 ± 1,2 (11,9%) 11,2 ± 1,3 (11,6%)

Cho 5,2 ± 0,5 (9,6%) 4,1 ± 0,5 (12,2% 4,0 ± 0,5 (12,5%)

PC+GPC 1,8 ± 0,2 (11,1%) 3,0 ± 0,2 (6,7%) 4,4 ± 0,6 (13,6%)

Tau 19,0 ± 1,5 (7,9%) 20,2 ± 1,3 (6,4%) 21,5 ± 2,5 (11,6%)

Glucose 22,5 ± 2,4 (10,7%) 19,0 ± 2,7 (14,2%) 19,0 ± 4,3 (22,7%)

Figure 1.22: Concentrations des principaux métabolites de tissu rénal mesurées selon 3 protocoles différents: (en vert) extraits aqueux de tissu analysés par RMN conventionnelle (n=5); (en rouge) extraits aqueux du tissu «post-HR-MAS» analysés par RMN conventionnelle (n=3); (en bleu) tissu de rein analysé par HR-MAS (n=3). Les valeurs sont données en nmol/mg de tissu ± SD.

0

10

20

30

40

Leu+Ile

+Val

Lac Ala

Ace G

lu

Cré

atin

esCho

PC+G

PCTau

Glu

cose

Métabolites

Co

ncen

tra

tio

ns

(nm

ol/

mg

de t

issu

rén

al)

Extraction directe du tissu

Extraction du tissu après RMN HR-MAS

Analyse directe du tissu par RMN HR-MAS


77

Les concentrations mesurées sur ces échantillons sont assez similaires. En particulier,

les résultats de la quantification des métabolites par RMN HR-MAS sur le tissu

(histogrammes bleus) et par RMN conventionnelle sur la fraction hydrosoluble de l’extrait de

ce même tissu (histogrammes rouges) sont proches pour la plupart des métabolites dosés. On

remarque cependant des différences pour les concentrations en PC+GPC, acétate et alanine

entre ces groupes. La superposition de l’un des signaux de la taurine avec le signal des

protons des groupements +N(CH3)3 de PC+GPC est probablement à l’origine de cette

surestimation lors de l’analyse directe du tissu par RMN HR-MAS. La différence observée

pour la concentration en acétate est intéressante car cette différence pourrait rendre compte

qu’une grande partie de l’acétate est sous forme complexée in situ en accord avec les données

de la littérature120

. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces différences soient liées à une

erreur de mesure des temps de relaxation T2 de certains signaux comme le suggère le résultat

incohérent obtenu pour la quantification de l’alanine. A l’exception des acides aminés (Leu,

Ile, Val et Ala) et du lactate, les quantifications des métabolites sont identiques pour les deux

groupes d’extraits. La RMN conventionnelle étant la méthode d’analyse de ces deux groupes

d’extraits, les différences sont certainement imputables à la modification de l’échantillon

survenant dans les premières minutes qui suivent sa décongélation et précèdent l’analyse par

RMN HR-MAS.

Bien que des différences de quantification soient observés entre ces groupes, cette

étude montre que la quantification à partir des spectres RMN HR-MAS est réalisable et que

les résultats sont proches des résultats obtenus sur les extraits. Il est certain que les procédures

actuelles de comparaison de profils de spectres basées sur la comparaison de fractions

normalisées de spectres sont des méthodes plus efficaces de différenciation de groupes.

Cependant, la quantification sera toujours nécessaire pour, au minimum, comparer des

données obtenues par différents protocoles.

4.8.3.4 Conclusion.

La quantification absolue par RMN HR-MAS des métabolites directement sur des

tissus biologiques est donc réalisable d’un point de vue pratique. Elle est assez reproductible

mais nécessite un temps d’investissement par échantillon beaucoup trop long.

De plus, comme nous l’avons vu précédemment, il arrive que le prélèvement de

l’échantillon n’ait pas été réalisé dans des conditions optimales et un fragment de tissu


78

adipeux peut rester autour de l’échantillon (Figure 1.18). Dans ce cas, malgré l’application

d’un temps d’écho de 120 ms, les signaux des triglycérides ne sont pas suffisamment atténués.

L’analyse par RMN HR-MAS d’un échantillon présentant de telles caractéristiques ne

donnera donc aucun résultat. La quantification des métabolites de faible poids moléculaire est

donc impossible ainsi qu’une éventuelle analyse statistique à partir de ces spectres. Par contre,

l’analyse de la fraction hydrosoluble du tissu est aisément réalisable et permet à la fois la

quantification et une analyse statistique a posteriori.

L’élimination de l’étape d’extraction de l’échantillon se révèle donc comme l’intérêt

principal de la méthode HR-MAS. Cependant, le recours à une méthode d’extraction présente

des avantages sur les plans logistique, sanitaire et analytique d’utilisation des échantillons.

Des protocoles d’extraction réalisables sous PSM, rapides, reproductibles et adaptés à

l’analyse par RMN ont été développés. En particulier, les méthodes de Bligh et Dyer121

et de

Tyagi et al.122

permettent d’obtenir simultanément une fraction aqueuse contenant les

métabolites hydrosolubles et une fraction organique contenant les lipides. Ces fractions sont

biologiquement inactives, donc sans risque biologique, ce qui facilite leur manipulation et leur

stockage. Cependant, dans le cas du tissu nerveux, il faut aussi prendre en compte les risques

provenant d’une éventuelle infection par le prion. Sur le plan de l’analyse RMN, l’utilisation

d’extraits a de nombreux avantages. Les spectres obtenus sur ces fractions ne présentent pas

d’altération de la ligne de base, les signaux sont systématiquement résolus sans avoir recours

à des séquences d’impulsions qui modifient la proportionnalité entre les signaux. La

quantification relative comme absolue est donc simple à réaliser grâce à l’utilisation d’une

référence interne ou grâce à la méthode ERETIC. De plus, les modifications de paramètres

physicochimiques comme le pH et la température ou l’ajout de standard peuvent être réalisés

afin de résoudre la superposition et l’attribution des signaux. L’analyse de la fraction

organique permet une détermination fine des lipides membranaires et des triglycérides

présents dans l’échantillon. Enfin, l’extrait peut être analysé par d’autres méthodes (LC-MS,

GC-MS,…) qui offrent des informations métaboliques complémentaires.


79

5. Analyse du ver Aporrectodea caliginosa par RMN HR-MAS.

Le ver de terre est un modèle animal qui est couramment utilisé pour l’étude et la

compréhension des phénomènes de diffusion et de toxicité des polluants dans les sols

(écotoxicité). Ainsi des protocoles utilisant le modèle du ver de terre sont aujourd’hui intégrés

par directive européenne à un processus normatif de détermination du niveau de toxicité des

pesticides. Ces protocoles se réalisent au long cours à des doses infra-létales et dans les

conditions proches des conditions culturales. Ces tests reposent essentiellement sur

l’évaluation de paramètres liés à la mesure des populations et du comportement des animaux.

Les paramètres proprement biochimiques sont difficilement accessibles car les analyses

traditionnelles biochimiques ou analytiques requièrent, pour être correctement réalisées, la

dépuration de l’animal, c’est à dire une vidange complète du contenu intestinal (obtenue le

plus souvent par un jeûne de 24h). La RMN permet l'analyse rapide d’un grand nombre de

composés. Cependant une analyse du ver n’est possible que si l’animal est préalablement

dépuré ou sur des préparations (fluide coelomique). La forte variation de susceptibilité

magnétique qui résulte de la présence de terre conduit à une très grande dispersion des

résonances et donc à des signaux larges et non résolus. L’originalité du travail que nous

présentons concerne l’observation des métabolites in situ et sur des animaux non dépurés en

utilisant la RMN HR-MAS comme outil d’analyse. Ainsi, en utilisant la RMN HR-MAS 31

P,

les principaux métabolites phosphorylés ont été caractérisés sur l’animal non dépuré.

L’attribution des résonances a été confirmée en appliquant les techniques bidimensionnelles

de corrélation 1H-

1H ou

1H-

31P à la méthode HR-MAS. La diminution du contenu en

phospholombricine (phosphagène spécifique des vers de terre) ainsi que l’acidose

intracellulaire consécutive à une hypoxie provoquée ont été mesurées. L’effet d’une

contamination aiguë au glyphosate (herbicide de plus en plus utilisé) a été suivi. Nos résultats

suggèrent que le glyphosate est adsorbé par le mucus du ver et que l’animal contribue donc à

la dispersion et la stabilisation du glyphosate dans le sol. De plus, l’analyse par HR-MAS du

1H des métabolites nous a permis de mettre en évidence une différenciation métabolique des

différentes parties de l’annélide. La quantité de lipides est plus importante dans la partie

antérieure où sont localisées les fonctions grandes consommatrices d’énergie (reproduction,

formation des cocons) et la concentration en succinate est plus importante dans la partie

postérieure en accord avec une fermentation anaérobie dans cette zone.

La publication qui relate ce travail est présentée à la suite in extenso.


80


81


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86


87


88

6. Analyse de la larve de carabe Harpalus rufipes par RMN HR-MAS.

Les carabes sont des coléoptères qui vivent sur le sol. Ils jouent un rôle régulateur tant

au niveau de la pousse des « mauvaises herbes » que du maintien des populations d’insecte

ravageurs dans les cultures. C’est en partie en raison de leur intérêt en agriculture et plus

encore en «agriculture raisonnée ou durable» qu’ils font l’objet d’un grand nombre de travaux.

Cependant ces travaux concernent presque exclusivement l’étude descriptive des populations:

cycle de vie, phylogénie, impact des traitements et peu d’études concernent le domaine de la

biochimie. En réponse à l’élargissement des moyens de traitement (pesticides systémiques,

enrobages des semences, semences génétiquement modifiées), les outils d’analyse doivent se

diversifier pour anticiper ou comprendre les répercussions des nouvelles pratiques culturales

sur l’écosystème du sol.

Harpalus rufipes est un carabe qui, à l’état larvaire, est essentiellement granivore et

qui devient polyphage (graine et insecte) à l’état d’imago. Harpalus rufipes fait parti des

carabes se reproduisant tardivement dans l’année si bien que certaines de ses larves subissent

le passage d’un hiver. Dans cette étude, nous avons utilisé la technique de RMN HR-MAS

pour analyser in situ le contenu des larves Harpalus rufipes. Cette technique a été utilisée car

elle présente une excellente sensibilité et est particulièrement adaptée à l’analyse

d’échantillons de type cylindrique ayant une longueur de 10 mm et un diamètre de 3 mm. Ces

dimensions correspondent aux dimensions des larves. La RMN HR-MAS 31

P a permis

l’analyse des composés phosphorés (métabolisme énergétique) en particulier de la

phosphoarginine (phosphagène répandu chez les insectes). L’effet d’une contamination aiguë

au glyphosate a été suivi. L’herbicide n’a aucun effet sur le métabolisme énergétique de la

larve. La cuticule enveloppant la larve est hydrophobe et préserve l’animal de l’entrée du

glyphosate. L’analyse par HR-MAS 1H montre que les larves sont essentiellement composées

de triglycérides. Les larves prélevées au printemps (vernales) et les larves prélevées en

décembre (hivernales) présentent un degré d’insaturation des chaînes acyles différent.

L’augmentation de l’insaturation des lipides est corrélée à une augmentation de la quantité

relative des chaînes acyles de type oméga 3 (n-3) chez les larves hivernales. Il s’agit

probablement d’une adaptation aux conditions hivernales afin d’assurer une fluidité suffisante

aux triglycérides de réserves et donc leur accessibilité enzymatique lorsque la température

diminue.

L’article qui relate ce travail, rédigé tel qu’il est présenté à la suite, est soumis pour

publication.


89

In situ analysis of metabolites of Harpalus rufipes larvae by 31

P and 1H HR-

MAS NMR spectroscopy. Seasonal variations in mean unsaturation of

storage lipids.

Franck Desmoulin, Delphine Bon, Véronique Gilard, Myriam Malet-Martino, Robert

Martino.

Groupe de RMN Biomédicale, Laboratoire SPCMIB, UMR CNRS 5068, Université Paul

Sabatier, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse, France.

Introduction.

Harpalus rufipes (H. rufipes) is an abundant carabid beetle species frequently found in

many agricultural crops, waste places, court yards (Luff 1980). H. rufipes is an autumn-

breeding ground beetle with overwintering larva. Larvae of H. rufipes are seed-feeders with a

preference for small seeds such as dandelion, ryegrass, and lamb’s-quarters seeds, while the

adults are omnivorous, feeding on other invertebrates (Hartke et al. 1998). Partly because

many carabid beetles constitute beneficial populations of arthropods against insect pest of

economic crops, they have giving rise to many studies about their population biology, life

cycle, phylogeny, ecological involvement, mortality following crop treatments (Kromp 1999).

However, a few concern investigations of the carabid beetle’s metabolism and to our

knowledge none on H. rufipes. In this study we applied the recent HR-MAS NMR method to

analyse metabolites which are present in the whole larva of H. rufipes. The HR-MAS NMR is

particularly adapted to the analysis of small tubular animals. We previously applied the

method to the study of the endogeic earthworm Aporrectodea caliginosa (Bon et al., 2006). In

addition to 1H HR-MAS NMR spectroscopy of the larva that allows the in situ detection of

water soluble metabolites and lipids, phosphorus-31 (31

P) HR-MAS NMR spectroscopy that

permits a direct observation of high-energy phosphate compounds was assessed. Moreover,

31P HR-MAS NMR was carried out to evaluate the effect of acute treatment of glyphosate.

Larva of H. rufipes survives extended periods in winter even if submitted to freezing-

temperature. Poikilotherm organisms, from bacteria through plants to animals, show capacity

for remodelling of the lipid composition of their biological membranes in response to

changing ambient temperature. In this study we have carried out the in situ analysis of the

storage lipids of vernal larvae and overwintering larvae.


90

Materials and methods.

Larvae collection and analysis

Larvae H. rufipes (De Geer 1774) were collected from the soil by handsorting in a

2 m2 area plot of a vegetable garden near Toulouse (Embernou, 43°45’N, 1°37’E), South

West of France. Two collection campaigns were organised; animals were collected in May

(vernal group, n=7) and in December (overwintering group, n=18). Larvae measured 11.3 ±

1.0 mm or 13.4 ± 0.7 mm and weighted 31.4 ± 7.6 or 36.4 ± 5.4 mg in the vernal and the

overwintering group, respectively. Animals were maintained with their native soil and in the

dark at 14°C ± 1°C. Experiments were performed within 2 days of their capture. Prior to the

NMR analysis, the larva was put into in the 4 mm HR-MAS zirconium tube (3 mm inner

diameter, 16 mm length, 95 µL volume) that was filled up with D2O and sealed with a cap.

First acquisition of HR-MAS NMR spectra started within 2 min after the larva preparation

and then 31

P and 1H NMR spectra were acquired consecutively.

Acute exposure to glyphosate.

A larva was placed into a vial containing a moistened filter paper and was then

uniformly sprayed with a glyphosate solution (0.4 mL of 7.2 mg.mL-1

(N-phosphomethyl)

glycine , which corresponds to a concentration usually applied in agriculture) and left for 10

min. Before the 31

P HR-MAS NMR experiment, the larva was submitted to a brief flow of

distilled water to remove external glyphosate. This experiment was carried out in triplicate.

Larva extracts.

Larvae (n=11) from the overwintering group were frozen and powdered together in

liquid nitrogen. Powder was subjected to the dual-phase extraction method (Tyagi et al.

1996). Briefly, a solution of chloroform/methanol/water was added to the powder (total

volume 4mL). Water-soluble fraction was collected and freeze-dried. Before HR-MAS NMR

analysis, it was redissolved in 200 µl of D2O supplemented with 3.5 mmol.L-1

sodium

trimethyl-silylpropanesulfonate (TMPS as internal 1H NMR references.

HR-MAS NMR spectroscopy.

All HR-MAS NMR spectra were recorded on a Bruker ARX 400 spectrometer at spin

rates ranging from 1 to 4 kHz using a 4 mm 1H/

31P double resonance probe equipped with a

2H lock, Z coil gradient and variable temperature capabilities. The temperature during

experiments was kept at 14°C.

31P HR-MAS NMR spectra were acquired at 162 MHz with proton decoupling. Spectra were

obtained in 12 min by accumulating 1024 FID resulting from 90° excitation pulses. Typical


91

acquisition parameters were a SW of 16 kHz and 32K data points. Typical processing

parameters were 64K zero-filling and a LB of 25 Hz applied prior to Fourier transform. δ are

reported relative to the signal of internal phosphoarginine (δ = -2.90 ppm relative to the

resonance of 85% H3PO4 as external standard). The chemical shift values of the

phosphoarginine resonance from the water-soluble extract have been measured for pH values

ranging from 6 to 9 in presence of standard phosphocreatine (δ= -2.45 ppm) giving a value of

-2.90 ± 0.01 (n=4). The dependence of the chemical shift of glyphosate and Pi on the pH was

previously determined (Bon et al. 2006). NDP concentration was determined as previously

described (Desmoulin et al. 1987).

1H HR-MAS NMR spectra were acquired at 400 MHz. Spectra were obtained in 4 min by

accumulating 64 FID resulting from 90° excitation pulses. Typical acquisition parameters

were a SW of 9.6 kHz and 32K data points. Typical processing parameters were 64K zero-

filling and a LB of 1 Hz applied prior to Fourier transform. Characteristic metabolites

(Phalaraksh et al. 1999) and lipid signals (Adosraku et al, 1994, Roncalli et al. 2007) have

been assigned by reference to literature data and on the basis of 2D homonuclear correlation

spectroscopy (COSY) experiments performed on the extracts. The signal of TMPS (δ = 0

ppm) for water-soluble metabolite and residual CHCl3 (δ = 7.36 ppm) for lipids served as

references for chemical shift. The number of protons giving rise to a signal was considered in

the calculations of relative concentrations. The number of terminal-CH3 per glycerol body

was calculated as the ratio of the signal area of total fatty chains (peak 2 in figures 3 and 5) to

the sum of the signals � and � of esterified glycerol (peaks � and � in figures 3 and 5).

Percentage of n-3 fatty acyl chains was calculated as the ratio of the signal area of the triplet

at 0.96 ppm of the terminal-CH3 (peak n-3 in figures 3 and 5) to the signal area of total fatty

chains (peak 2 in figures 3 and 5). Mean unsaturation was calculated as the ratio of the signal

area of vinyl groups from fatty chains (-CH=CH-; peak 9, 10, 12, 13 in figures 3 and 5) to the

signal area of total fatty chains. Number of trehalose sugar unit per glycerol body was

calculated as the ratio of the signal area of trehalose (C2 to C6, figures 3 and 5) to the sum of

signal � and � of esterified glycerol.

COSY data were obtained with a SW of 9.6 kHz in both dimensions. The F2 dimension was

acquired with 4K real data points and recorded in blocks of 32 scans per experiment. The F1

dimension contained data points from 512 experiments. Total acquisition time was 10 h. Prior

to processing, the F1 dimension was zero-filled to 1K data points. Fourier transform was done

after applying an exponential apodisation (1 Hz) in both dimensions.


92

Results and discussion.

31P HR-MAS spectra of larvae H. rufipes.

A characteristic 31

P HR-MAS NMR spectrum obtained immediately after the larva had

been put into the tube is presented in Fig. 1A. On the basis of the chemical shifts and previous

studies (Thompson et al. 1989, Van Den Thillart and Van Waarde 1996), the resonances were

attributed to phosphorus signals from phosphomonoesters (PME), inorganic phosphate (Pi),

free and membraneous phosphodiesters (PDE), the phosphoramidate group of

phosphoarginine (P-Arg) (δ = -2.90 ppm) and phosphate groups of di- and tri-nucleotides

(NDP, NTP). Since it is well established that the measurement of the Pi resonance position on

the frequency scale (chemical shift) allows the determination of the mean internal pH (pHi)

(Desmoulin et al. 1987), a pH value of 7.23 ± 0.14 (n = 4) was measured for the larvae. No

significant change was observed between spectra obtained from animals of the vernal and

overwintering groups.

(ppm)-18-16-14-12-10-8-6-4-202468101214

PME

Pi PDEγ-NTP

β-NDP

α-NTP

α-NDPβ-NTP

P-Arg

A

B

T-6-P

G-6-P

F-6-P

PC

Fig. 1 : 31P HR-MAS NMR spectra of phosphorylated metabolites obtained (A) in situ immediately after the insertion of larvae in the tube, and (B) on the aqueous fraction of an extract of H. rufipes larvae, pH=7.5. PME: phosphomonoesters, Pi: inorganic phosphate, PDE: phosphodiesters, P-Arg: phosphoarginine, α- and β-NDP: α and β phosphorus nuclei of nucleotide diphosphates, α-, β- and γ-NTP: α, β and γ phosphorus nuclei of nucleotide triphosphates, T-6-P: trehalose-6-phosphate, PC: phosphorylphosphate, F-6-P: fructose-6-phosphate, G-6-P: glucose-6-phosphate, GPE: glycerophosphorylethanolamine, GPC: glycerophosphorylcholine.

GPE

GPC


93

Spectrum of the water soluble fraction from larvae extract shows a better resolution and

some changes in the PDE region (Fig. 1B). The broad PDE signal of larva spectra comes

mainly from phospholipids and other water soluble compounds (Fig. 1A). Only water soluble

compounds give rise to signals in the spectrum of the extract (Fig 1B). On the basis of their

chemical shift values, these signal correspond to glycerophosphorylethanolamine (GPE) and

glycerophosphorylcholine (GPC). The resolution of PME and Pi signals has been improved in

the spectrum of the extract because extraction suppresses compartimentation of metabolites

and pH gradient phenomenons which occur in the intact tissues. Moreover, extraction

eliminates macromolecular binding and interaction of phosphate groups with paramagnetic

ions; the resolution of di- and tri-nucleotides (NDP, NTP) signals has thus been improved in

the spectrum of the extract (Desmoulin et al. 1987). This spectrum is similar to the spectrum

of a perchloric acid extract of larvae from Manduca sexta previously described by Thompson

et al. (1989). Four phosphorylated metabolites give rise to a signal in the PME spectral region.

They are sugar phosphates as glucose-6-phosphate (G-6-P), trehalose-6-phosphate (T-6-P),

fructose-6-phosphate (F-6-P) and phosphorylcholine (PC) (Fig. 1B). Concentrations measured

in the extract were 2.9, 0.7, 0.3, and 0.2 µmol.g-1

w. w. for T-6-P, PC, F-6-P and G-6-P,

respectively. In agreement with previous 31

P NMR analysis on hemolymph and fat body

(Thompson et al. 1989), T-6-P is the main phosphorylated metabolite in insect larvae. The

concentrations of Pi, phosphoarginine, NTP and NDP were 1.8, 2.7, 1.2 and 0.4 µmol.g-1

w.

w., respectively. 31

P NMR spectra obtained in vivo from the larvae or from a larvae extract

(Fig. 1B) were similar.

Because the larva was confined within the tube which was filled up with D2O, tissues

were subjected to hypoxic conditions that resulted in a rapid decline of the phosphoarginine

peak with a concomitant increase of the Pi signal. Indeed, the amount of phosphoarginine

dropped by 30% after 30 min and 80% after 1 h. The upfield shift of the Pi resonance

indicated a pHi value of 6.95. HR-MAS NMR experiments require a minimum spinning rate

of 1 kHz. Under these conditions, larvae have not survived to the experiments in contrast to

our previous HR-MAS NMR experiment carried out on an earthworm (Bon et al. 2006).

In situ detection of glyphosate.

In a previous work, we emphasise the interest of 31

P HR-MAS NMR to evaluate

bioavailability and ecotoxicity of glyphosate for soil fauna (Bon et al., 2006). The trapping of

glyphosate by the non-depurated earthworm following topical acute exposure was observed

from 31

P HR-MAS NMR analysis. On the contrary, exposition of the larva to glyphosate had


94

no effect on the 31

P spectrum (Fig. 2A). There is no signal corresponding to the phosphonate

group of glyphosate. When an aliquot of the glyphosate stock solution was added, the signal

from glyphosate at 10.11 ppm appeared (Fig. 2B). After a 30 min period, peak shape and

chemical shift of glyphosate remained unchanged, which indicates that the watertight cuticule

prevents the larva from the entrance of a polar compound as glyphosate. Consequently, the

energy status of the larva is not modified following acute exposure to glyphosate in agreement

with the low direct toxicity of the herbicide (Dalby et al. 1995).

(ppm)-18-16-14-12-10-8-6-4-202468101214

Glyphosate

B

A

PME

PiPDE

γ-NTP

β-NDP

α-NTP

α-NDPβ-NTP

P-Arg

Fig. 2 : Characteristic 31P NMR HR-MAS NMR spectra of a larva (A) which has been reated with glyphosat, (B) 20 min after the addition in the zirconium tube of a glyphosate solution (B).

1H HR-MAS NMR spectra of H. rufipes larvae.

A typical 1H HR-MAS NMR spectrum of a larva H. rufipes is presented in Fig. 3. The

main resonances are coming from lipid moieties and trehalose. The assignments of the

resonances have been confirmed by the two-dimensional 1H-

1H HR-MAS Correlation

Spectroscopy (COSY) experiment and are reported in Table 1.


95

Fig. 3.: Typical 1H HR-MAS NMR in situ spectrum of a larva (A). Peak assignments are reported in Table 1. Numbers refer to the characteristic moieties of a triglyceride (with linoleic or linolenic (n-3) acid as radical) drawn above. HR-MAS two-dimensional 1H-1H correlation spectroscopy (COSY) of in situ larva (B). Acyl : signals from fatty acyl chains, Pro: proline, Ala: alanine, Lac: lactate, Glu: glutamate, Gln: glutamine, Tre: trehalose, Cit: citrate.

(ppm) 5.6 4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8 0.0

(ppm)

5.6

4.8

4.0

3.2

2.4

1.6

0.8

Pro

Pro

Ala

Lac

Cit

Glu, Gln

Esterified glycerol

Tre

Acyl

Acyl

Acyl

n-3

2 3 4 5 6 11 10 9 8 7 12 14 15 16 17 18 13

H2C

HC

O

OCOR2

H2C OCOR3

C CH2

O

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH CH2 CH CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH3αααα

ββββ

γγγγ n-3

4-7

15-17

n-3

18

8,142

311

9,10,12,13

ββββ αααα γγγγ


96

Table 1: Assignment of main signals of the H. rufipes larva 1H HR-MAS NMR spectrum Chemical shifts are expressed in ppm relative to internal TMPS. Numbers and symbols refer to the characteristic moieties of the triglyceride as given in Fig. 3 and Fig. 5.

Chemical shift ppm Moieties

18 Fatty acids 0.90 CH3-(CH2)n

n-3 Fatty acids 0.96 (n−3) CH3

4-7, 15-17 Fatty acids 1.28 CH3-(CH2)n

3 Fatty acids 1.58 -CH2-CH2-CO-

8, 14 Fatty acids 2.04 -CH2-CH=CH-

2 Fatty acids 2.24 -CH2-CH2-CO-

11 Fatty acids 2.78 =CH-CH2-CH=

Cholines 3.20 -+N(CH3)3

Trehalose 3.44/3.65 C4H and C6H

�, � Glycerol body 4.07-4.27 -CH2-OCOR

9, 10, 12, 13 Fatty acids 5.30 -CH=CH-

Signals of metabolites which overlap with strong lipid signals were revealed in the

two-dimensional NMR experiment. Thus, 1H-

1H correlation signals arising from amino acids

(proline, alanine, glutamate and glutamine) and organic acids (lactate, citrate) were detected.

A better analysis of the metabolites could be done from the aqueous fraction of the extract

(Fig. 4).,Assignments of the resonances have been confirmed by the two-dimensional 1H-

1H

HR-MAS COSY experiment and are reported in Table 2.

Fig. 4 :1H HR-MAS NMR spectrum of the water soluble fraction of a larva extract Peak

assignments are reported in Table 2.

(ppm)

0.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.4

1

4

3

2

5ref 6

8

9 11

7

10

12 13

14

15

16

17

18 19

21

20

22

23

24,25

26


97

Table 2: Assignments of the signals of 1H HR-MAS NMR spectrum obtained on the water soluble fraction of a H. rufipes larva extract. Chemical shifts are expressed in ppm relative to internal TMPS.

Metabolites Chemical shift ppm Moieties

1 Isoleucine 0.93 δ CH3

2 Leucine 0.94/0.96 δ/δ' CH3

3 Valine 0.98 γ CH3

4 Isoleucine 1.00 γ' CH3

5 Valine 1.03 γ' CH3

6 Lactate 1.32 β CH3

7 Isoleucine 1.45 γ CH

8 Alanine 1.47 β CH3

9 Leucine 1.71/1.72 β CH2/β CH3; γ CH

10 Lysine 1.89 β CH2

11 Acetate 1.92 β CH3

12 Isoleucine 1.97 β CH

13 Proline 2.00/2.07 γ CH2/β CH2

14 Glutamine/Glutamate 2.14 β CH

15 Proline/Glutamate 2.34 γ CH2/γ CH2

16 Glutamine 2.5 γ CH2

17 Citrate 2.53,2.57/2.68,2.72 α/α’/γ/γ’ CH

18 Choline 3.24 N-CH3

19 Trehalose 3.44 C4

20 Glycine 3.56 α CH


22 Trehalose 3.75/3.85 C2/C3


24 Alanine 4.04 α CH

25 Choline 4.04 α CH2

26 Proline 4.12 α CH

Typical 1H HR-MAS NMR spectra of larva from vernal and overwintering group are

presented in Fig. 5. The characteristic signal of methyl of n-3 acyl chains was different

whether larva was collected in May or December. 1H NMR gives a single run information on

total lipids and mean unsaturation of a complex lipid mixture. Thus, characteristic signals of


98

some lipid moieties allow to determine the mean unsaturation of acyl chains, the number of

acyl chain per esterified glycerol and the percentage of n-3 fatty acyl chains (see material and

methods). These parameters have been computed and compared for larvae from overwintering

and vernal groups. The number of terminal-CH3 of total fatty acyl chain per esterified

glycerol body was very close to 3 (Table 3). This indicates that almost all fatty acyl chains

are esterified to glycerol bodies are fully esterified. Therefore, triglycerides represent the main

lipids measured in larvae. The major storage site for triglycerides in insects is usually the fat

body (Kerkurt 1985).

Fig. 5: Characteristic in situ 1H HR-MAS NMR spectra of an overwintering larva (A) and vernal larva (B). Peak assignments are reported in Table 1.

1H NMR data on fatty acid composition of these triglycerides shows that n-3 fatty acids

represent about 40% of the total fatty acids (Table 3).

2 3 4 5 6 11 10 9 8 7 12 14 15 16 17 18 13 H2C

HC

O

OCOR2

H2C OCOR3

C CH2

O

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH CH2 CH CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH2 CH CH CH2 CH CH CH2 CH3

�

�

�n-3

Triglycérides

1,13,23,43,63,84,04,24,4

1,1 0,83,23,43,63,84,04,24,4

18

38, 14

211

� �

9, 10, 12,

13, �

Cholines

Trehalose (C2-C6)

3

Cholines

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,64,04,44,85,25,6

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,6

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,6

(ppm)0,81,21,62,02,42,83,23,6

0,8

Cholines

4-7, 15-17

A Overwintering

B Vernal

n-3


99

Table 3: Lipid composition determined from in situ 1H HR-MAS NMR spectra of larvae. Data are presented as mean ± SD. Statistical significance was determined using Student’s t-test; p values are reported.

Moreover, there was a significant change in the percentage of n-3 fatty acids between

larvae groups with an increase in the overwintering group. In accordance with this

observation, the increase in the percentage of n-3 fatty acids led to a significant increase of the

mean unsaturation of total fatty acids. Ratio between quantities of sugar and lipids determined

as the ratio of trehalose unit per glycerol body was similar and about 0.3 for the overwintering

and vernal larvae groups (Table 3). Indeed, triglycerides (triacylglycerol) represent the largest

store of metabolic energy in insects (Wang et al. 2005). Many poikilothermic animals adapt to

changing environmental temperatures by modifying concentration of some metabolites or by

increasing the mean unsaturation in phospholipids to maintain cell membrane fluidity and

normal cellular functions. In this study, we investigated mainly triglycerides which are

storage lipids. We measured in H. rufipes larva an increase in mean unsaturation mainly due

to an increase of the percentage of n-3 unsaturated lipids in triglycerides. Consequently, there

is depression of the freezing point with a higher mobility of triglyceride in the fat body. Thus,

energy production from triglyceride can occur at a sustained rate for a lower temperature. This

is in agreement with similar levels of high energy phosphate metabolites in vernal and

overwintering groups (data not shown).

Conclusion.

To the best of our knowledge it is the first time that HR-MAS NMR method has been

applied to the study of metabolic changes in whole-larvae. 1H HR-MAS NMR method

Overwintering collection

(n=4)

Vernal collection

(n=4) p value

Number of terminal-

CH3 per glycerol body. 3.2 ± 0.4 3.3 ± 0.2 0.21

Percentage of n-3 fatty

acyl chains. 45 ± 2% 38 ± 2% 0.0003

Mean unsaturation of

fatty acyl chains. 4.3 ± 0.6 3.5 ± 0.5 0.032

Number of trehalose

unit per glycerol body. 0.34 ± 0.07 0.33 ± 0.06 0.207


100

allowed the in situ metabolomic analysis of whole-larva metabolites. Carabids are soil-

dwelling arthropods susceptible to insecticides and other environmental pollutants. HR-MAS

NMR is a fast method to assess toxicity effects of treatments on energetic and intermediary

metabolism in order to optimize doses so that beneficial populations of arthropods are not

harmed. Direct metabolic profiling is becoming the new way to evaluate the impact of

agricultural treatments, tillage managements or seasoning on the arthropods status.

Acknowledgements.

We thank Dr. Pavel Saska for fruitful discussion, Dr. Guénola Pérès for help to identify

larvae, and Laura Desmoulin for help to collect larvae.

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102

Conclusion.

Dans la première partie de cette thèse, nous avons tenté de montrer quels étaient les

avantages et les contraintes d’utilisation de la RMN HR-MAS appliquée à l’étude des tissus

biologiques. Certes, la RMN HR-MAS est un outil très puissant dans de nombreux domaines

et elle nous a permis de travailler sur des échantillons très variés. Cependant, nous estimons,

après les différentes études et observations que nous avons réalisées, qu’il est nécessaire de se

poser un certain nombre de questions avant de se lancer dans une étude sur les tissus

biologiques par RMN HR-MAS, ce genre d’études étant généralement des études

métabonomiques. S’il s’agit d’un travail ayant pour but d’émettre un diagnostic ou une

classification, alors la RMN HR-MAS peut-être l’outil approprié si les conditions de

prélèvement, de stockage et d’analyse des échantillons sont véritablement définies et peuvent

se poursuivre sur le long cours. S’il s’agit par contre d’une étude de recherche de marqueur

métabolique dont l’objectif est la compréhension d’un mécanisme biologique, ce qui nécessite

donc une quantification, alors il convient peut-être mieux de mener en parallèle une analyse

par RMN liquide conventionnelle sur les extraits organiques et aqueux et une analyse par

RMN HR-MAS afin de pouvoir réunir un maximum d’informations et, éventuellement, de

pouvoir y ajouter des données de spectrométrie de masse. Il convient donc de réfléchir à la

finalité de l’utilisation des données RMN avant de décider d’utiliser en premier lieu la RMN

HR-MAS sur les tissus biologiques.

103

CHAPITRE 2: La Métabonomique: une méthode

d’analyse statistique des spectres pour la recherche

de signatures métaboliques.

104

Chapitre 2: la Métabonomique.

105

Introduction

Le développement des outils analytiques et informatiques ainsi que la génération d’un

grand flux de données obtenues par RMN ou spectrométrie de masse à partir de matériels

biologiques variés (cellules, tissus, fluides biologiques) ont permis l’émergence d’une

nouvelle discipline, la Métabonomique123

. Tout comme la Génomique, la Transcriptomique

ou la Protéomique, qui utilisent le suffixe "omique", la Métabol/nomique fait partie de ces

nouvelles disciplines qui explorent de façon complète un domaine. Si la Génomique

s'applique à l'étude de l’ensemble des gènes, la Transcriptomique s’intéresse à l’ARN, la

Protéomique aux protéines et la Métabon/lomique concerne l’exploration des métabolites. Les

métabolites se situent au dernier échelon de l’organisme puisqu’ils sont la résultante de l'effet

des gènes, de la régulation des protéines et de l'environnement auquel est soumis l’individu.

Ce sont des molécules de faible poids moléculaire (inférieur à 1000) qui résultent du

catabolisme et de l’anabolisme de l’organisme (sucres, acides aminés, acides gras, …).

Nombreux d’entre d’eux sont connus et ont déjà été dosés mais certains sont encore inconnus

ou inexploités.

Les termes Métabolomique et Métabonomique sont souvent considérés comme

équivalents. Ils désignent tous deux l'analyse qualitative et quantitative de l'ensemble ou d'un

ensemble de métabolites présents dans un système biologique complet (comme une cellule ou

un tissu). Mais si la Métabolomique consiste à décrire et quantifier systématiquement la

totalité des métabolites présents dans ce système à un moment donné, c’est-à-dire la

détermination du Métabolome, la Métabonomique concerne la description des variations de

métabolites induites par une perturbation à ce système (maladies, médicaments ou produits

toxiques)124-127

.

Nous utilisons comme outil d’analyse privilégié la spectroscopie de RMN qui permet

d’obtenir un grand nombre de données spectroscopiques à partir de banques d’échantillons

Ces données sont analysées grâce à des outils statistiques, généralement multivariés, tels que

l’Analyse en Composantes Principales (ACP) qui permet une représentation simplifiée de

l’ensemble des données, afin de mettre en évidence des paramètres de discrimination entre les

échantillons.

Nous avons réalisé des analyses métabonomiques dans le cadre de différentes études.

La première concerne la recherche de métabolites discriminants de cellules de glioblastomes

de phénotype radiorésistant et radiosensible. Cette étude a permis de mettre en évidence des


106

marqueurs caractéristiques de la radiorésistance. L’un des challenges des disciplines

«omiques» est de pouvoir analyser simultanément les données générées par différentes

techniques et donc de les combiner afin de pouvoir, par exemple, lier la modification de

l’expression d’un gène avec celle d’un métabolite. L’ACP normée a été utilisée pour l’analyse

statistique de données obtenues à partir de divers types d’échantillons ou de différentes

méthodes d’analyse. Ainsi, les modifications métaboliques induites par l’obésité chez le rat

ont été caractérisées en combinant les données RMN 1H des fractions hydrosolubles et

organosolubles. De même, la caractérisation des phénotypes de différentes variétés de courge

a été confortée en combinant les données obtenues à partir des spectres RMN 1H et

31P.


107

1. Les méthodes statistiques.

L’objectif des statistiques est de recueillir, traiter et interpréter les données. Il existe de

nombreuses méthodes d’analyse statistique qui dépendent du type (variables quantitatives ou

qualitatives) et du nombre de données à analyser. Nous présenterons ici les méthodes

statistiques que nous avons utilisées pour traiter les données obtenues par RMN.

1.1 Méthodes statistiques uni/bivariées.

En analyse chimique, on utilise généralement les méthodes statistiques univariées.

Elles sont adaptées à l’analyse d’un faible nombre de variables. Dans le cas de la

spectroscopie RMN, leur utilisation va entraîner de nombreuses pertes d’information

principalement à cause de la superposition des signaux qui ne seront donc pas exploitables.

1.1.1 Variance et écart type.

L'écart type d’une population représente la dispersion des valeurs par rapport à la

moyenne et donc l’homogénéité d’une variable dans une population. C’est la racine carrée de

la variance. L’écart type se calcule selon la formule:

)1(

)( 22

−

�−�=

nn

XiXn iσ

Avec:

• σ : écart-type

• n: nombre d’individus

• Xi: valeur de la variable

1.1.2 Le test de Student.

Le but d'un test statistique tel que le test de Student est de tester une hypothèse

concernant deux ensembles de données. Le test de Student est un test paramétrique qui

consiste à tester l'égalité des moyennes de 2 populations en comparant la différence centrée

réduite de leurs moyennes empiriques.


108

Pour utiliser ce test, il est nécessaire de connaître l’origine des échantillons et les

variables doivent avoir été identifiées; il s’agit d’une méthode supervisée et qui se fait donc

avec un a priori.

Nous considérons significativement différentes les moyennes de deux populations si le

test de Student donne une valeur inférieure à 5%.

1.2 Méthodes statistiques multivariées

Les analyses statistiques multivariées sont un ensemble de méthodes destinées à

synthétiser l'information issue d’un grand nombre de variables afin d’en simplifier la

représentation et l’interprétation. Elles permettent, dans le cas de la RMN, de révéler

l’importance d’une variable discriminante qui aurait été ignorée lors d’une analyse univariée.

Mais, les méthodes statistiques multivariées appliquées aux données provenant de la RMN

peuvent entraîner certains biais. S’il s’agit simplement d’utiliser ces méthodes dans un but de

classification, de gradation, il n’y a aucun problème à effectuer le traitement des données «en

aveugle»; mais, s’il s’agit de rechercher l’effet d’un phénomène sur le métabolisme, on peut

effectivement obtenir des résultats sans que le lien entre l’effet observé sur le spectre et le

métabolisme n’existe réellement. Il faut donc prendre avec précaution les résultats obtenus

avec les méthodes statistiques multivariées.

1.2.1 Analyse en composantes principales (ACP).

L’ACP est une méthode d'analyse descriptive des données, non supervisée, qui

consiste à rechercher les corrélations existant entre N variables aléatoires parmi une

population de K individus en recherchant les directions (ou composantes) de l'espace qui

contiennent la plus grande quantité d’informations, la plus grande quantité de variance. Ces

directions sont les composantes principales (CP). L’ACP est donc une méthode statistique

descriptive multivariée qui permet de représenter un grand nombre de données de façon

synthétique. Elle permet de réduire les N variables en quelques composantes les plus

représentatives. Cette méthode permet à la fois de représenter de manière synthétique les

individus et les variables selon les composantes principales. Elle est utilisée pour repérer des

groupes d’individus dont l’ensemble des variables est homogène et de visualiser des

différences de variables entre les individus. Elle a aussi pour objectif de mettre en avant des

individus au comportement atypique par rapport au reste de la population.


109

Pour faire une ACP, on part d’une matrice M de données à K lignes (individus ou

échantillons) et N colonnes (variables).

��

�

�

��

�

�

=

KN

N

N

XX

XX

XX

M

,2,1

2,2,1

1,1,1

......

............

......

......

Chaque variable ),...,( ,1, KNNN XXX = a une moyenne NX et un écart-type NXσ .

En fonction de l’origine et de la diversité des données à traiter, l’ACP peut être

normée ou non normée. La normalisation consiste à transformer des données lorsque celles-ci

sont d’origine différente afin de les ramener à des espaces comparables. Il est donc nécessaire

de normaliser les données lorsqu’elles sont de mesure, de moyenne ou de variabilité

différente. La normalisation consiste à transformer la matrice de variables brutes M en une

matrice de variables centrées réduites M pour laquelle les variables sont représentées par:

),...,( ,1, KNNN YYY = avec )( 1,

1,1,

1,

N

NNN

XV

XXY

−=

Avec:

• X : valeur de la variable

• X : moyenne

• )(XV : variance

La matrice est ensuite diagonalisée afin de trouver les valeurs propres, permettant de

déterminer le nombre d’axes que l’on va conserver. A l’aide des valeurs propres, les vecteurs

propres vont être calculés par un procédé d'algèbre linéaire consistant à rechercher une base

de vecteurs propres de l'espace vectoriel. On conserve généralement les composantes

principales qui contiennent 90% de la variance. Souvent, 3 composantes principales suffisent

à décrire 90% de l’information du système. Enfin, on calcule les coordonnées des variables

dans l’espace conservé puis celles des individus. On obtient ainsi deux représentations

graphiques: une représentation pour laquelle un point représente la projection d’une variable

dans un plan défini par les composantes principales («loading plot») et une représentation


110

pour laquelle un point représente la projection d’un individu dans un plan défini par les

composantes principales («score plot»).

1.2.2 Classification.

La classification regroupe un ensemble de techniques utilisées pour classifier des

objets. L'analyse de classification est un outil de découverte, une méthode d'analyse

multivariée permettant de former des groupes homogènes d'individus ou d'objets selon un

critère. Il existe de nombreuses techniques de classification et elles visent toutes à répartir n

individus caractérisés par p variables X1, X2, …, Xp en un certain nombre m de sous-groupes

aussi homogènes que possible.

Il existe deux grandes familles de techniques de classification:

• la classification non hiérarchique: décomposition de l’ensemble de tous les individus

en m classes d’équivalences, m étant fixé.

• la classification hiérarchique: on fixe un niveau de précision et selon ce niveau, des

individus seront ou non dans le même groupe.

Avec cette dernière méthode, on met davantage l’accent sur les individus que sur les

variables, à la différence des méthodes factorielles. Il existe un grand nombre de variantes de

ces méthodes. Afin d’obtenir une «bonne» classification, on peut être amené à appliquer

plusieurs de ces méthodes sur un même jeu de données.

1.2.3 Analyse de la variance (ANOVA).

L’analyse de la variance est une technique statistique permettant de comparer les

moyennes lorsque l’on a plus de deux populations et/ou un grand nombre de variables.

L'analyse de la variance n'est pas une méthode qui permet d'étudier les différences de

variances entre populations, mais une méthode pour étudier les différences de moyennes entre

populations. C’est l’équivalent du test de Student et c’est donc une méthode supervisée. Il

s'agit de comparer des moyennes de différents groupes et de dire si, parmi l'ensemble des

moyennes, au moins l’une d'entre elles diffère des autres, mais on ne sait ni laquelle ni le

nombre d'entre elles. Tout comme le test de Student, nous considérons que si la valeur trouvée

est inférieure à 5%, seuil que nous nous sommes fixé, les moyennes des deux populations sont


111

significativement différentes. Nous avons parfois utilisé cette technique afin de réduire la

taille de la matrice en éliminant les variables pour lesquelles les moyennes entre les

populations ne sont pas significativement différentes.

1.3 Conclusion sur les méthodes statistiques.

Nous avons utilisé ces méthodes statistiques avec des objectifs différents mais

complémentaires. Systématiquement, les données RMN que nous avons obtenues ont été

traitées de 2 manières. La première méthode est l’analyse quantitative classique des données

avec intégration des signaux exploitables du spectre (signaux attribués à un ou plusieurs

métabolites). Nous avons calculé les moyennes et écart-types des concentrations des

métabolites pour chaque groupe puis réalisé des tests de Student. Ensuite, les données ont été

soumises aux méthodes statistiques multivariées et comparées aux résultats issus de l’analyse

uni/bivariée.

2. Logiciels et technique analytique utilisés.

2.1 Logiciels utilisés.

2.1.1 Logiciel AMIX.

Le logiciel AMIX (Analysis of MIXtures - Analyse de mélanges) est un outil de

traitement des spectres RMN (monodimensionnels et bidimensionnels), d’UV-visible ou de

spectrométrie de masse. Il a été conçu et développé par la société Bruker Biospin. C’est un

logiciel dédié au traitement des données spectroscopiques qui permet d’exploiter des milliers

de spectres pour effectuer un traitement statistique. Ce logiciel de conception privée ne nous a

pas permis d’introduire des données provenant d’autres origines telles que des données

biochimiques ou cliniques ou des données issues de la Génomique ou de la Protéomique.

2.1.2 Logiciel développé sous R.

Le langage R, d’accés libre sur internet (http://www.r-project.org/index.html), a été

élaboré pour la conception d’outils statistiques. Il est composé de multiples fonctions

permettant la conception de programmes de calcul ou encore de créations graphiques.


112

L’importation et l’exportation sous différents formats sont également possibles. Nous avons

utilisé ce langage pour élaborer un programme permettant la combinaison des données de

différentes origines, la réalisation de classifications et enfin la représentation de

dendrogrammes.

2.2 Technique analytique: la RMN.

Les analyses métabonomiques présentées dans ce manuscrit ont été réalisées à la fois

avec le logiciel AMIX et des logiciels développés sous R. Le traitement des spectres RMN a

systématiquement été réalisé avec AMIX. Ce logiciel permet de transformer le spectre en une

matrice de K lignes (individus ou échantillons) et N colonnes (variables ou déplacements

chimiques).

Une base de spectres est introduite dans le logiciel. Chaque spectre est ensuite découpé

à intervalles réguliers ou non, définis par l’utilisateur. Pour chaque intervalle, l’aire sous la

courbe du spectre est un «bucket». Littéralement, un «bucket» est une tranche de spectre.

Pour chaque «bucket», la valeur de l’intégrale du spectre est insérée dans un tableau qui sera

ensuite traité avec R ou AMIX. La figure 2.1 montre comment un spectre est transformé en

un histogramme représentant l’aire du spectre pour chaque intervalle échantillonné.

a

Figure 2.1: (a) Spectre RMN 1H de cellules tumorales, (b) représentation du spectre échantillonné par pas de 0,01 ppm.

a Echantillonnage du spectre par pas de 0,01 ppm.

b Spectre RMN 1H de cellules tumorales.

a

b


113

Les données obtenues sont des valeurs algébriques qui correspondent aux intensités

des différents signaux formant le spectre de RMN. Elles sont issues de l’échantillonnage du

spectre qui est réalisé avec le logiciel AMIX. L’intensité totale du spectre est donc la somme

de l’ensemble des fractions échantillonnées. Chaque fraction échantillonnée du spectre

correspond au signal des protons d’un métabolite ou d’un groupe de métabolites parfaitement

identifié ou identifiable et est normalisée par rapport à la somme de l’ensemble des fractions

échantillonnées. La figure 2.2 représente une partie d’une matrice de données obtenue après

le découpage des spectres par le logiciel AMIX. Les individus sont représentés sur les lignes

et les variables sur les colonnes.

Figure 2.2: Tableau récapitulant les valeurs des variables pour chaque échantillon (lignes) pour un intervalle de déplacement chimique donné (colonnes). La valeur donnée pour l’intervalle correspond au centre de celui-ci.

2.3 Remarques concernant l’utilisation des données RMN pour le traitement statistique

par ACP.

2.3.1 Taille de la matrice.

Le découpage des spectres RMN en «buckets» génère pour la plupart des études un

nombre de variables bien supérieures au nombre d’individus étudiés. Par exemple, il est

fréquent d’obtenir des fichiers contenant plusieurs centaines de variables pour seulement

vingt individus alors que pour réaliser une APC, il est préférable d’avoir une matrice carrée.

Afin d’obtenir une représentation la plus proche de la réalité, il est donc nécessaire de

diminuer autant que possible le nombre de variables avant de réaliser l’ACP.

Pour diminuer la taille de la matrice, nous pouvons augmenter la largeur des «buckets»

c'est-à-dire le pas d’échantillonnage des spectres. Mais cette action peut entraîner une perte

d’information. En effet, en augmentant le pas, on diminue la précision d’analyse des variables

responsables de la représentation des individus.

Individus

VariablesVariables


114

La figure 2.3 permet d’illustrer ce phénomène. Nous avons réalisé différentes ACP à

partir de la même banque de spectres 1H. L’ensemble des spectres a été traité de 3 façons

différentes: la région des spectres de 4,5 à 0,5 ppm a été échantillonnée avec un pas de

0,01 ppm, avec un pas de 0,02 ppm et avec un pas de 0,04 ppm. On obtient donc

respectivement 400, 200 et 100 «buckets» pour 20 individus. Dans les trois cas, on note une

bonne séparation des 2 groupes d’individus selon l’axe CP1. Le fait d’augmenter la taille du

pas d’échantillonnage jusqu’à 0,04 ppm ne modifie pas la représentation des individus selon

les axes CP1 et CP2. Par contre, au niveau de la représentation des variables, nous n’obtenons

pas tout à fait les mêmes résultats ou tout du moins pas la même précision. Pour un

échantillonnage de 0,01 ppm, la discrimination des individus se fait selon 2 variables

principales: les «bucket» 3,23 et 3,22 c'est-à-dire les zones du spectre allant respectivement de

3,225 à 3,235 ppm et de 3,215 à 3,225 ppm. Si on augmente la taille du pas d’échantillonnage

à 0,02 ppm, il est vrai qu’on divise par deux le nombre de variables mais on perd aussi une

information. En effet, pour un tel échantillonnage, la discrimination des individus se fait grâce

au «bucket» 3,23 c'est-à-dire la zone du spectre allant de 3,22 à 3,24 ppm. Pour un

échantillonnage de 0,04 ppm, la précision de la zone du spectre qui permet la discrimination

est encore moins grande puisque c’est le «bucket» 3,24 qui permet la différenciation des deux

groupes, soit une zone qui s’étend de 3,22 à 3,26 ppm.


115

Figure 2.3: Représentations des individus (scores, à gauche) et des variables (loadings, à droite) résultant d’ACP réalisées à partir de la même banque de spectres mais dont les données spectrales ont été échantillonnés avec 3 pas différents (a) 0,01 ppm, (b) 0,02 ppm et (c) 0,04 ppm.

Afin de maintenir le potentiel informationnel maximal, nous avons systématiquement

réalisé les ACP à partir d’une matrice provenant de spectres échantillonnés par pas de 0,01

ppm et par pas de 0,04 ppm. Nous avons vérifié que la discrimination des individus était la

même dans les deux cas. Ceci nous a permis d’être le plus précis possible quant à la

détermination des variables les plus impliquées dans la représentation des individus.

Une autre possibilité pour diminuer le nombre de variables sans perdre la précision

spectrale consisterait tout simplement à réaliser plusieurs analyses statistiques sur des zones

de spectres plus petites. Dans ce cas, nous perdrions tout l’intérêt d’utiliser l’ACP comme

méthode de simplification des données.

CP1

-0.50

0.00

0.50

CP2scores CP1, CP2

-0.50 0.00 0.50

a Pas d’échantillonage: 0,01ppm

CP1

-0.50

0.00

0.50

CP2scores CP1, CP2

-0.50 0.00 0.50

CP1

-0.50

0.00

0.50

PC2scores CP1, CP2

-0.50 0.00 0.50

4.44.44.474.464.4

4.444.434.44.44.40

4.3

4.38

4.384.3

4.34.344.344.32

4.324.3

4.304.284.284.264.26

4.244.234.224.214.204.194.184.174.164.1

4.14

4.13

4.1

4.11

4.11

4.09

4.04.074.07

4.054.04.034.034.01

4.013.993.983.973.96

3.9

3.93.93

3.923.9

3.903.893.88

3.883.873.86

3.843.8

3.823.81

3.80

3.79

3.78

3.7

3.7

3.75

3.74

3.73

3.72

3.71

3.70

3.63.68

3.673.6

3.653.64

3.63 3.63

3.62

3.613.59

3.5

3.573.56

3.5

3.54

3.53

3.52

3.51

3.503.493.483.473.463.453.43.43.423.43.403.393.383.38

3.373.363.3

3.333.3

3.303.2

3.283.273.263.2

3.24

3.23

3.22

3.21

3.20

3.193.183.13.163.153.143.13.133.123.113.13.083.03.03.0

3.04

3.033.023.013.00

2.99

2.98

2.97

2.962.92.9

2.93

2.92

2.912.90

2.82.882.882.872.862.852.842.822.812.802.792.782.772.762.752.742.732.72.712.7

2.692.682.672.62.652.642.632.632.622.612.602.59

2.572.56

2.552.54

2.53

2.5

2.512.502.492.482.472.462.45

2.42.432.42

2.412.4

2.3

2.3

2.38

2.37

2.36

2.35

2.34

2.32.3

2.32.22.22.272.262.252.242.232.222.212.202.192.18

2.172.16

2.12.14

2.13

2.12.12

2.12.10

2.09

2.08

2.07

2.05

2.04

2.032.022.01

2.001.91.91.971.91.91.941.93

1.91

1.901.891.881.81.861.851.81.831.821.811.801.791.781.771.71.751.751.71.71.711.701.691.681.671.661.651.641.631.631.621.601.591.581.571.561.551.541.531.521.511.501.50

1.481.41.4

1.451.441.41.421.411.401.391.381.31.371.31.31.2

1.281.271.261.25

1.21.241.221.211.201.191.181.171.161.151.14

1.131.11.12

1.111.0

1.081.01.0

1.0

1.01.0

1.021.011.00.990.9

0.9

0.90.90.94

0.930.90.90.900.80.80.80.80.80.840.830.820.810.800.790.780.770.760.750.740.730.720.710.700.690.680.670.660.650.640.630.630.610.600.590.580.570.560.550.540.530.520.510.50

CP2

PC

loadings CP1, CP2

-0.50

-0.40

-0.30

-0.20

-0.10

0.00

-0.50 -0.25 0.00 0.25

CP1loadings CP1, CP2

CP2

CP1

4.49

4.474.45

4.434.41

4.39

4.37

4.34.3

4.3

4.294.274.25

4.24.214.194.17

4.1

4.134.11

4.094.04.054.03

4.013.93.9

3.953.933.91

3.893.83.83.8

3.8

3.793.77

3.7

3.73

3.713.63.67

3.653.63

3.63.5

3.57

3.53.53

3.513.493.43.453.433.413.39

3.373.35

3.333.3

3.23.27

3.25

3.23

3.21

3.193.13.13.133.113.093.07

3.0

3.033.02.92.97

2.952.93

2.912.82.872.852.832.82.792.772.752.732.712.692.62.65

2.632.612.52.57

2.552.53

2.5

2.492.47

2.452.43

2.412.39

2.3

2.35

2.33

2.312.292.272.252.232.212.19

2.17

2.15

2.13

2.11

2.09

2.07

2.05

2.03

2.01

1.991.971.951.931.911.891.871.851.831.811.791.771.751.731.711.69

1.671.651.61.611.591.571.51.531.51

1.491.471.451.431.411.391.37

1.351.311.291.271.251.231.211.191.171.15

1.131.111.09

1.07

1.051.031.010.99

0.970.95

0.930.910.890.870.850.830.810.790.770.750.730.710.690.670.650.630.610.590.570.550.530.51

PC

-

-

0.0

-0.25 0.00 0.25

loadings CP1, CP2

CP2

CP1

4.48

4.44.40

4.3

4.324.28

4.24

4.204.16

4.12

4.084.04

4.00

3.96

3.92

3.83.8

3.80

3.7

3.7

3.68

3.64

3.60

3.563.5

3.43.443.40

3.3

3.3

3.28

3.24

3.20

3.163.13.0

3.0

3.0 2.96

2.922.88

2.842.82.72.722.682.64

2.60

2.5

2.52

2.48

2.442.4

2.36

2.32

2.282.242.20

2.1

2.12

2.08

2.04

2.0

1.9

1.92

1.81.841.801.76

1.721.68

1.641.601.561.5

1.481.44

1.401.36

1.32

1.28

1.241.20

1.16

1.12

1.08

1.041.00

0.96

0.920.88

0.840.80.760.720.680.640.600.560.52

PC

-0.50

-0.25

0.00

- 0.00 0.2

b Pas d’échantillonage: 0,02ppm

c Pas d’échantillonage: 0,04ppm

3,23

3,22

3,24

3,23


116

La seule et véritable manière de résoudre correctement ce problème de taille de la

matrice est d’augmenter considérablement le nombre d’individus. Cependant, ceci implique

une collecte d’échantillons suffisante, ce qui n’est pas toujours possible ou réalisable suivant

les études.

2.3.2 Incidence de la variabilité du pH.

Pour les spectres RMN 1H, nous avons échantillonné les spectres par «buckets» de

0,01 ppm afin d’être le plus précis possible lors de l’analyse de la représentation des variables

et ainsi pouvoir dire exactement quels signaux sont responsables de la représentation des

individus. Néanmoins, certains métabolites sont très sensibles au pH et leur déplacement

chimique varie en fonction du pH. La vérification des résultats obtenues par un

échantillonnage par pas de 0,04 ppm en comparaison avec les données obtenus par un

échantillonnage par pas de 0,01 ppm peut donc être aussi utilisée afin d’éviter d’obtenir une

discrimination en fonction du pH. Ainsi, les résultats obtenus sont bel et bien liés au

phénomène observé et non pas à un problème de pH. De plus, ces légères variations de pH

peuvent aboutir à l’obtention de résultats assez approximatifs. Certains travaux ont montré

qu’il était possible de réaligner les pics de façon automatique128-131

. L’utilisation de solutions

tampons pour les fractions aqueuses des extraits permet généralement d’éviter ce problème.

2.3.3 Prétraitement des spectres.

Il est impératif de réaliser un prétraitement des spectres avant la procédure

d’échantillonnage. Ainsi, la correction de la phase des signaux et de la ligne de base doit être

parfaitement réalisée. De même, la calibration des déplacements chimiques nécessite

l’utilisation d’une référence.

2.3.4 Mise en évidence des échantillons atypiques.

L’ACP permet de mettre en évidence très rapidement les individus atypiques par

rapport à l’ensemble des individus. Cette atypie peut être la conséquence d’un problème de

pH, d’un problème de prétraitement des spectres ou peut être liée à une hétérogénéité

biologique des prélèvements.


117

Pour illustrer la capacité de criblage des individus atypiques par l’ACP, nous

présentons ci-dessous les résultats d’une étude réalisée sur des prélèvements de tissu de rein.

Cette étude consiste à étudier par RMN HR-MAS 1H l’effet néphroprotecteur de l’inhibition

de la monoamine oxydase (MAO) par la pargyline sur le stress oxydatif qui survient à la

reperfusion du rein pré-ischémié.

L’ischémie partielle ou totale d’un organe correspond à la diminution ou à l’arrêt de la

circulation artérielle. Elle se traduit par une diminution consécutive de l’apport en oxygène et

des dommages réversibles ou non sur l’organe ou le tissu concerné. Les origines de l’ischémie

sont diverses: accident vasculaire (athérosclérose, pontage coronarien, transplantation

d’organe, insuffisance cardiaque aiguë). De nombreuses études ont montré que pendant la

période d’ischémie, mais surtout au moment de la reperfusion (ré-oxygénation de l’organe), il

existait une production considérable de radicaux libres132

. Cependant, les sources

intracellulaires des espèces réactives de l’oxygène produites durant un épisode d’ischémie-

reperfusion sont mal connues. Des travaux récents ont mis en évidence le rôle crucial des

MAO dans la formation de peroxyde d’hydrogène lors de la reperfusion. Cette production

d’espèces réactives de l’oxygène a été corrélée avec une apoptose et une nécrose induite133,134

.

Les effets de la protection par des inhibiteurs spécifiques de la MAO telle que la pargyline sur

des reins ayant subi une ischémie-reperfusion sont étudiés directement sur les biopsies par

RMN.

La figure 2.4 représente la distribution des individus résultant de l’ACP des spectres

RMN HR-MAS 1H de biopsies de tissu rénal de rats. L’acquisition des spectres a été réalisée

par l’application d’une séquence impulsion(90°)-acquisition avec présaturation du signal des

protons de l’eau.

Cette ACP est réalisée sur trois types d’échantillons de tissu rénal de rat, avec quatre

échantillons par groupe. Le premier groupe de rat a subi un épisode d’ischémie-reperfusion

(groupe NF, •), le second groupe a été traité à la pargyline et a subi un épisode d’ischémie-

reperfusion (groupe PNF, ×) et le troisième groupe est le groupe témoin de l’effet unique de la

pargyline (groupe P, �).


118

Figure 2.4: Représentation des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN HR-MAS 1H réalisés sur trois types d’échantillons de tissu rénal de rat (groupe NF: •; groupe PNF: ×,.groupe P: �)

L’ACP nous a permis de révéler la présence de deux échantillons atypiques sur le

groupe de 12. Les spectres des échantillons NF1 et PNF3 présentent des différences avec

respectivement une quantité de phospholipides membranaires et de triglycérides

anormalement élevée. Pour l’échantillon PNF3, la contribution des triglycérides est telle

qu’elle recouvre les signaux des autres métabolites. Le groupe des individus homogènes se

caractérise par une faible dispersion quand les deux individus atypiques sont intégrés à l’ACP.

En revanche, lorsque l’ACP est réalisée sans les deux individus atypiques, on remarque une

plus forte dispersion indépendante du groupe d’origine des échantillons (Figure 2.5). Ce

résultat montre que ces échantillons de reins ne présentent pas de corrélation entre le

traitement subi et le profil métabolique. Autrement dit, cette étude métabonomique n’a pas

permis de mettre en évidence la modification de certains métabolites liée à la protection du

néphron par la pargyline. Ces résultats ont été confirmés par une analyse quantitative

classique des métabolites présents dans les différents groupes.

PNF3

NF1

CP1

CP2


119

Figure 2.5: Représentation des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN HR-MAS 1H réalisés sur trois types d’échantillons de tissu rénal de rat (groupe NF: •; groupe PNF: ×,.groupe P: �). Ont été exclus de l’analyse les individus atypiques présents dans la figure 2.4.

2.4 Développement d’outil statistique pour la combinaison des données de différentes

origines.

La recherche de variables discriminantes permettant d’attribuer un individu à un même

groupe expérimental ou clinique est la problématique actuelle des méthodes d’investigation

globale des sciences biologiques. Une nouvelle stratégie de découverte de corrélation entre

ces différentes sciences que sont la Génomique, la Protéomique et la Métabolomique

implique de comparer ces données non pas par domaine mais certainement de manière

holistique. Une telle démarche nécessite la transformation de la matrice des variables brutes

en une matrice de variables centrées réduites (voir § 1.2.1). Il en est de même lorsque l’on

souhaite combiner les informations provenant de spectres RMN de nature différente obtenus à

partir d’un même individu. Ce peut être, par exemple, le traitement statistique combiné de

spectres de RMN 1H obtenus à partir de la fraction aqueuse et de la fraction organique de

l’extrait, ou bien encore la combinaison de spectres RMN 1H et

31P du même individu. Nous

CP1

CP2


120

présentons ici les résultats et les écueils rencontrés au cours du développement de cette

approche innovante de combinaison de données issues de plusieurs analyses réalisées par

RMN pour un même individu.

2.4.1 Normalisation et criblage des variables.

Afin de contraindre les variables qui proviennent de mesures d’origine différente à

faire partie du même espace, ces variables doivent être centrées et réduites et non pas

seulement normalisées par rapport à la somme des «buckets» comme c’est souvent le cas

lorsque nous travaillons avec des données d’une seule origine135-137

. Cette normalisation a

pour effet de donner le même potentiel informationnel à chaque variable, en l’occurrence à

chaque «bucket». Cependant, un des effets pervers de la normalisation des données

spectroscopiques est de ramener les variables provenant de signaux fortement influencés par

le bruit au même niveau que les variables pertinentes du signal138

. Ainsi, des valeurs proches

de 0 dans la matrice non normée prennent autant de poids que toutes les autres variables lors

de la réalisation d’une ACP normée. Ceci aboutit en définitive à une perte du pouvoir

discriminant des variables par bruitage de l’information pertinente. Il faut donc éliminer,

avant la normalisation, les variables qui sont soit fortement influencées par le bruit soit non

porteuses d’une information pertinente. Deux méthodes ont été utilisées: l’écrêtage ou

l’analyse supervisée de la variance des variables.

L’écrêtage des variables, c'est-à-dire l’élimination des «buckets» dont l’intensité est

inférieure à un seuil défini, permet de supprimer les variables fortement influencées par le

bruit. En utilisant l’écrêtage, nous avons obtenu des résultats en ACP normée proches voire

identiques à ceux obtenus avec l’ACP non normée. Bien que donnant les résultats attendus,

cette méthode présente l’inconvénient majeur d’obliger l’utilisateur à effectuer des opérations

supplémentaires afin de déterminer le seuil d’écrêtage. De plus, l’écrêtage étant réalisé avec

un seuil défini par l’utilisateur, cette méthode est arbitraire.

La deuxième méthode de filtrage des données que nous avons utilisé consiste à réaliser

une analyse supervisée de la variance (ANOVA). Le recours à l’ANOVA nécessite une

supervisation des individus, c'est-à-dire l’affectation préalable des individus à un groupe

expérimental. Cette affectation ne pose pas de problème dès lors que les groupes sont définis

expérimentalement, ce qui est le plus souvent le cas. La classification des individus en groupe


121

peut aussi réalisée de manière strictement analytique par la méthode de k-means139

dès lors

que l’on fixe le nombre de groupes expérimentaux. Dans tous les cas, la méthode de

classification par la méthode des k-means a été utilisée pour la supervisation des groupes

avant l’ANOVA.

Ainsi, nous pouvons choisir de déterminer l’appartenance d’un échantillon à un groupe

d’individus de manière manuelle (supervisée) ou automatique (par la méthode k-means).

2.4.2 Combinaison de variables de différentes origines.

La combinaison de variables de différentes origines a deux objectifs; le premier est

d’aboutir à la plus grande discrimination possible entre les groupes, le second est la possibilité

de repérer d’éventuelles corrélations existant entre ces variables différentes140-141

.

Nous avons réalisé une étude métabolomique sur trois variétés de courges (Potimarron

et Bleu de Hongrie de l’espèce Cucurbita maxima et Butternut de l’espèce Cucurbita

moshata). L’échantillonnage des spectres RMN HR-MAS 1H et

31P fournit donc des variables

de nature, d’intensité différente.

Pour chaque variété, nous avons réalisé 3 mesures par RMN HR-MAS 1H et

31P. Les

ACP de chaque origine, c'est-à-dire l’ACP réalisée sur les variables obtenues à partir des

spectres RMN HR-MAS 1H et l’ACP réalisée sur les variables obtenues à partir des spectres

RMN HR-MAS 31

P, sont présentées dans la figure 2.6.


122

Figure 2.6: Représentation des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN HR-MAS (a) 1H et (b) 31P de trois variétés de courges. Les spectres caractéristiques de ces variétés sont présentés à droite.

La distribution des individus suivant les deux premières composantes principales des

deux ACP permet une bonne discrimination des 3 groupes de courges à la fois pour les

données 1H et pour les données

31P.

Après un filtrage de l’ensemble des données spectroscopiques par ANOVA, l’ACP

normée est réalisée sur les variables combinées. Comme la figure 2.7 permet de le constater,

la discrimination des individus est plus grande lorsque l’ACP est réalisée sur la combinaison

des variables. L’analyse fine de la distribution des variables suivant les composantes

principales permet de mettre en évidence des corrélations d’ordre métabolique entre ces

variables. En particulier, le niveau en glucides (composants majoritairement observés sur les

spectres 1H) est corrélé au niveau en sucre phosphate (PME) dans la zone allant de 4 à 6 ppm

(sur les spectres 31

P).

12

3

4

6

5

7

8

9

ppm 1,02,03,04,0

Potimarron

Bleu de Hongrie

Butternut

7

8

9

1

2

3

4

6

5

Bleu de Hongrie

5,0 0,0 -5,0 -10,0ppm

Potimarron

Butternut

a

b PME

CP2

CP2

CP1

CP1


123

Figure 2.7: Représentation des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN HR-MAS 1H et 31P regroupés de trois variétés de courges.

Bleu de Hongrie

Potimarron

Butternut

CP1

CP2


124

3. Application à la recherche de marqueurs métaboliques caractéristiques de la

résistance à la radiothérapie des glioblastomes.

3.1 Introduction.

Les glioblastomes sont des tumeurs solides et primitives du cerveau. Plus précisément,

ils font partie des tumeurs gliales (gliomes) car ils résultent de la dérive tumorale d’une

cellule gliale, l’astrocyte. Le glioblastome est l’astrocytome (tumeur dérivant de l’astrocyte)

ayant le plus haut grade de malignité. Il est de grade IV suivant la classification de

l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS)142

. La survie moyenne d’un patient atteint d’un

glioblastome n'est que de quelques mois143

. C’est la tumeur cérébrale la plus fréquence chez

l’adulte.

La radiothérapie est largement utilisée pour traiter les tumeurs solides cérébrales

puisque plus de 50% des patients reçoivent ce type de traitement au cours de leur maladie. Ce

traitement peut être associé à la chirurgie ou à la chimiothérapie mais demeure souvent la base

du traitement dans le cas des tumeurs cérébrales144,145

. Cependant, la récidive locale après

radiothérapie reste un problème clinique majeur et est une cause d’échec thérapeutique pour

les tumeurs cérébrales. En dépit des améliorations techniques et méthodologiques constantes

de la technique d’irradiation, comme la radiothérapie conformationnelle permettant entre

autre de majorer la dose d’irradiation au sein de la tumeur et d’éliminer spécifiquement les

cellules tumorales, certaines tumeurs récidivent en raison d’une faible sensibilité à

l’irradiation. En effet, pour un même type de tumeur, en l’occurrence les glioblastomes, on

observe des disparités de réponse au traitement146,147

.

Des travaux récents, réalisés sur différentes souches cellulaires isolées à partir de

glioblastomes, ont effectivement mis en évidence une variation dans la réponse aux radiations

ionisantes et ont montré un lien entre la radiorésistance des cellules et des mécanismes

d’adhésion cellulaire148,149

. De plus, notre équipe a montré qu’il existe une corrélation entre le

rapport PC/GPC et la gradation des tumeurs cérébrales150,151

.

Nous avons réalisé des analyses métabonomiques par RMN 1H in vitro sur quatre

lignées cellulaires de glioblastomes humains, deux lignées radiosensibles (RS) qui sont SF767

et U251 et deux lignées radiorésistantes (RR) qui sont U87 et SF763. Nous avons identifié et

quantifié les métabolites observés dans les différents types de lignées afin de (i) mettre en

évidence le ou les métabolites qui pourraient être des marqueurs pronostiques de réponse à la

radiothérapie et (ii) contribuer à une meilleure compréhension des phénomènes mis en jeu


125

dans la radiorésistance des cellules cancéreuses, et (iii) pouvoir éventuellement développer de

nouveaux agents radiosensibilisants utilisables en pratique clinique.

Les résultas présentés concernent l’analyse par RMN 1H de ces différentes lignées

cellulaires de glioblastomes. Deux traitements parallèles des données ont été effectués. Le

premier est une analyse quantitative classique des principaux métabolites observés par

RMN 1H. Le second est une analyse du profil métabolique par une ACP sur les données

spectrales.

3.2 Analyse métabonomique par RMN de lignées cellulaires de glioblastomes humains.

Nous avons réalisé une première étude sur une lignée radiosensible (U87) et une

lignée radiorésistante (U251) dont le pourcentage de survie est respectivement de 40% et 80%

après une irradiation de 2 Gray148

. La mise en place et la validation des protocoles utilisés

constituent les objectifs principaux de cette étude préliminaire. Les extraits cellulaires ont été

analysés par RMN 1H. L’effet du niveau de la confluence des cellules dans la boîte de culture

sur la concentration de certains composés a été évalué. Enfin, la recherche de marqueurs

métaboliques discriminant le phénotype radiorésistant du phénotype radiosensible a été

réalisée en comparant les profils métaboliques de ces quatre lignées de glioblastomes.

3.2.1 Récupération et extraction des cellules.

Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture jusqu’au moment de leur

prélèvement. Le milieu de culture DMEM contient un grand nombre de composés qui sont

aussi présents dans les cellules. Etant donné que l’analyse métabonomique repose sur la

comparaison des extraits cellulaires, il est important de s’assurer que les composés présents

dans l’extrait sont exclusivement d’origine cellulaire. Ainsi, après prélèvement du milieu de

culture, les boîtes de cultures sont rincées avec 10 mL de sérum physiologique (NaCl) à 37°C.

Puis, les cellules sont soumises à l’action de la trypsine pour permettre leur décollement. Les

cellules sont reprises dans 10 mL de sérum physiologique froid (4°C) puis centrifugées. Le

culot de cellules est à nouveau repris dans 10 mL de sérum physiologique froid puis

centrifugé. Enfin, l’extraction avec séparation des métabolites hydrosolubles et liposolubles

est réalisée sur le culot.

La figure 2.8 représente trois spectres RMN 1H:


126

• le spectre du milieu de culture récolté avant la récupération des cellules (avant

trypsinisation) (a),

• le spectre de la fraction hydrosoluble du milieu de culture pur (c'est-à-dire après

l’extraction au chloroforme/méthanol/eau) (b),

• le spectre de la fraction hydrosoluble d’un extrait cellulaire (U251) (c).

Figure 2.8: Spectres RMN 1H (a) du milieu de culture récolté avant la récupération des cellules, (b) de la fraction hydrosoluble du milieu de culture pur, (c) de la fraction hydrosoluble des cellules (U251).

Les zones encadrées des spectres mettent en évidence les signaux qui sont soit

spécifiques du milieu de culture, soit spécifiques des cellules. Par exemple, entre 2,3 et

2,6 ppm, l’un des signaux du glutathion (GSH) et l’un des signaux du glutamate (Glu) sont

observables uniquement dans l’extrait cellulaire. Par contre, nous retrouvons le signal de la

glutamine (Gln) sur les 3 spectres. Entre 3,0 et 3,3 ppm, les signaux des dérivés de la créatine

("Cr") et de la choline ("Cho") sont spécifiques aux extraits cellulaires et n’apparaissent pas

dans le milieu de culture. A l’inverse, les signaux du glucose, composé majoritairement

présent dans le milieu de culture, n’apparaissent pas sur le spectre de l’extrait. Les spectres

a

b

c

p p m1 . 0 01 . 5 02 . 0 02 . 5 03 . 0 03 . 5 04 . 0 04 . 5 0

GSH

Gln

"Cr"

"Cho"

Glucose

Glu

Gln

Gln


127

des fractions hydrosolubles des extraits cellulaires sont donc exclusivement représentatifs des

métabolites cellulaires car exempts de signaux attribuables au milieu de culture.

3.2.2 Attribution des signaux.

Les attributions ont été effectuées à partir des analyses bidimensionnelles de

corrélations des signaux (COSY, HMQC, HMBC), par ajout de standards et sur la base de

données provenant de la littérature119,152

. Un spectre RMN 1H caractéristique de la fraction

hydrosoluble des cellules de glioblastomes (U251 RS) est représenté sur la figure 2.9 et les

attributions sont présentées dans le tableau 2.1.

ppm1.001.50

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0ppm

Leu, Ile, Val

Thr

Lac

Ala Leu, Lys Lys

Ace

a

b


128

ppm4.004.50

ppm3.003.103.203.303.40

ppm2.102.202.302.402.502.602.702.80

Glu, Gln, GSH

Glu

Gln

GSH Succ

Asp

GSH

Cr PCr

Cho

PC

GPC

Lac

Glu, Gln, GSH

Gly

c

d

e


129

Figure 2.9: (a) Spectre RMN 1H complet de la fraction hydrosoluble d’un extrait cellulaire de glioblastomes à pH 8,5 (lignée U251) et agrandissement des zones (b) 0,5 à 2,0 ppm, (c) 2,0 à 2,9 ppm, (d) 2,9 à 3,5 ppm, (e) 3,5 à 4,7 ppm, (f) 5,5 à 7,5 ppm et (g) 7,5 à 9,5 ppm.

Tableau 2.1: Attributions des métabolites hydrosolubles de cellules de glioblastomes réalisées par ajouts de standards dans les extraits aqueux (pH 8,5).


Déplacement

chimique

(ppm)

J( Hz)

Acétate

(Ace) CH3

O

O-

CH3 1,92 (s)

Alanine

(Ala) CH3

NH3

+

O-

O

CH3

CH

1,48 (d)

3,75 (q)

7,5

7,5

Aspartate

(Asp) O-

O-

NH3

+O

O

CH

CH2

3,91 (dd)

2,76 (ABd)

3,2-8,2

3,0-7,6-17,6

ppm8.008.509.00

ppm6.006.507.00

ATP, ADP, AMP

Tyr Tyr His

Phe

For

ATP, ADP, AMP

f

g

His


130

-ADP N

NN

N

NH2

OO

OHOH

P

O

OH

P

O

O

OH

O-

1

1CH

CH=

CH=

6,16 (d)

8,27 (s)

8,53 (s)

7,8

AMP N

NN

N

NH2

OO

OHOH

P

O

OH

O-

1

1CH

CH=

CH=

6,16 (d)

8,27 (s)

8,53 (s)

7,8

ATP N

NN

N

NH2

OO

OHOH

P

O

OH

P

O

O

OH

O-

OH

O

O

P

1

1CH

CH=

CH=

6,16 (d)

8,18 (s)

8,53 (s)

7,8

Choline

(Cho) N

+

CH3

OH

CH3

CH3

+N(CH3)3

N-CH2

HO-CH2

3,21 (s)

3,51 (m)

4,05 (m)

Créatine

(Cr) N

NH2

O-

O

CH3

NH CH3

CH2

3,04 (s)

3,93 (s)

Formiate

(For)

O-

O

CH 8,46 (s)

Glutamate

(Glu)

O-

O

NH3

+O

-

O

1

2

3

4

53CH2

4CH2

2CH

2,10 (m)

2,32 (td)

3,77 (t)

7,8-1,8

7,7

Glutamine

(Gln)

O

NH3

+O

-

O

NH2

1

2

3

4

5 3CH2

4CH2

2CH

2,14 (m)

2,44 (td)

3,77 (t)

nd

9,5-2,4

9,4

Glutathion

(GSH)

O-

NH

NH

O-

O

NH3

+

O

SH

O

O

Partie Glycine

Partie Cystéine

Partie glutamate1

2 3

4 5

Partie glycine

CH2

Partie cystéine

CH

CH2

Partie

glutamate

3,78 (s)

4,46 (dd)

2,88-2,96

(dd)

5,2-6,4

5,0-6,0


131

2CH

3CH2

4CH2

3,78 (t)

2,14 (m)

2,55 (m)

6,0

Glycéro

phosphoryl

choline

(GPC)

N+

CH3

O

CH3

CH3

P

O

OO

-

OH

OH

1

2 +N(CH3)3

N-2CH2

O-1CH2

3,24 (s)

3,66 (m)

4,31 (m)

Glycine

(Gly)

O

NH3

+

O-

CH2 3,55 (s)

Histidine

(His)

O

NH3

+

NH

N

O-

CH

CH2

CH=

CH=

3,98 (dd)

3,202 (ABd)

7,04 (s)

7,73 (s)

4,8-8,0

4,8-8,0

Isoleucine

(Ile)

O

NH3

+

CH3

CH3

O-1

23

4

5

6

5CH3

4CH2

3CH

6CH3

2CH

0,95 (t)

1,30-1,48

(2m)

1,98 (m)

1,02 (d)

3,67 (d)

7,6

7,2

4,0

Lactate

(Lac)

CH3

O-

O

OH

CH3

CH

1,33 (d)

4,11 (q)

7,0

7,0

Leucine

(Leu)

O

NH3

+

CH3

CH3

O-1

2

3

4

5

55CH3

3CH2 et

4CH

2CH

0,97 (d)

0,96 (d)

1,67 (m)

3,73 (t)

7,0

6,7

7,0

Lysine

(Lys)

O

NH3

+

NH2

O-

NH2-CH2

(CH2)3

CH

3,00 (t)

1,44 (m) –

1,74 (m)

3,50 (t)

7,2

6,0

Phénylalanine

(Phe)

O

NH3

+

O-

CH= 7,37 (m)


132

Phosphoryl

choline

(PC)

N+

CH3

O

CH3

CH3

P

OH

OO

-

+N(CH3)3

N-CH2

O-CH2

3,23 (s)

3,64 (m)

4,28 (m)

Phospho

créatine

(PCr)

N

NH

O-

O

CH3

NH

P

O-

O

OH

CH3

CH2

3,05 (s)

3,95 (s)

Scyllo-Inositol

(ScylloI)

OH

OH

OH

OH

OH

OH CH 3,36 (s)

Succinate

(Succ)

O-

O-

O

O

(CH2)2 2,41 (s)

Taurine

(Tau)

O-

S

NH3

+

O

O

S-CH2

N-CH2

3 ,28 (t)

3,42 (t)

4,2

4,2

Thréonine

(Thr)

O

NH3

+

OH

CH3

O-

CH3

CH

CH

1,31 (d)

4,25 (m)

3,59 (d)

6,9

7,0

Tyrosine

(Tyr)

O

NH3

+

OH

O CH=

CH=

6,89 (d)

7,19 (d)

8,5

8,5


133

Valine

(Val)

O

NH3

+

CH3

CH3 O-12

3

4

4

4CH3

4CH3

3CH

2CH

1,04 (d)

0,99 (d)

2,28 (m)

3,61 (d)

5,2

5,2

4,8

Les métabolites que nous observons sont principalement des acides aminés, les dérivés

de la choline et de la créatine ainsi que des acides organiques tels que le lactate ou l’acétate.

Seuls les métabolites dont les attributions sont avérées ont été recensés. Nous n’excluons pas

cependant la présence en très faible quantité d’acides aminés N-acétylés (NAA, NAC,

NAAG), de GABA, de PE et de GPE.

3.2.3 Analyse quantitative.

Une référence interne (TMPS-d6) est ajoutée à l’extrait pour la quantification absolue

des métabolites. La quantité de chaque métabolite mesurée dans l’extrait est ensuite ramenée

au nombre de cellules pour obtenir une concentration en nanomoles par million de cellules

(Figure 2.10 et tableau 2.2).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Leu+Ile

+Val

Lac Ala

LeuAce G

luSucc G

lnGSH C

rPC

rCho PC

GPC

Métabolites

Con

cen

trati

on

s (n

mol/

mil

lion

de

cell

ule

s) U87 RR

U251 RS

Figure 2.10: Concentrations absolues des métabolites pour les deux lignées cellulaires de glioblastomes (U87 RR et U251 RS). Les concentrations sont données en nmol/million de cellules ± SD (n=5 pour chaque lignée) (* p<0,05).

* *

* *

*


134

Tableau 2.2: Concentrations absolues des métabolites pour les deux lignées cellulaires de glioblastomes (U87 RR et U251 RS) (*p<0,05). Les concentrations sont données en nmol/millions de cellules ± SD (n=5) (CV..

U87 RR U251 RS

Leu+Ile+Val 4,67 ± 0,63 (13%) 5,98 ± 1,37 (23%)

Lac 6,56 ± 0,44 (7%) 6,32 ± 1,32 (21%)

Ala 1,88 ± 0,16 (8%) 2,18 ± 0,41 (19%)

Leu 6,00 ± 1,15 (19%) 7,42 ± 1,94 (26%)

Ace 11,3 ± 2,65 (23%) 3,91 ± 0,96 (25%)

Glu 7,26 ± 1,10 (15%) 16,7 ± 2,29 (14%)

Succ 0,54 ± 0,18 (33%) 0,74 ± 0,1 (13%)

Gln 4,53 ± 0,53 (11%) 4,62 ± 1,08 (23%)

GSH 7,08 ± 1,18 (17%) 16,11 ± 2,29 (14%)

Cr 0,31 ± 0,03 (9%) 0,51 ± 0,08 (15%)

PCr 0,62 ± 0,07 (12%) 0,70 ± 0,08 (12%)

Cho 0,24 ± 0,08 (34%) 0,43 ± 0,19 (41%)

PC 0,93 ± 0,08 (8%) 1,44 ± 0,28 (20%)

GPC 1,60 ± 0,14 (9%) 0,34 ± 0,04 (13%)

Il existe des différences significatives entre les deux types de cellules. Les

concentrations en glutamate (Glu), glutathion (GSH) et créatine (Cr) sont significativement

plus élevées dans les cellules U251 RS que dans les cellules U87 RR. De plus, la

concentration en glycérophosphorylcholine (GPC) est 4,7 fois plus importante dans la lignée

U87 RR. Les concentrations en choline (Cho), phosphorylcholine (PC), et phosphocréatine

(PCr) ne sont pas significativement différentes entre les deux lignées.

3.2.4 Zone des composés à choline.

De nombreux travaux rapportent des modifications du spectre RMN 1H au niveau de

la zone des composés à choline en relation avec le degré de malignité, que ce soit sur des

cellules en culture, sur des biopsies ou sur le tissu in vivo153. Ainsi, une étude antérieure

réalisée dans le laboratoire sur des biopsies de tumeurs cérébrales a montré qu’il existait une

corrélation entre le rapport PC/GPC et le grade de la tumeur150

. Cette observation a été

confirmée par ailleurs sur d’autres types de cancers comme le cancer du sein ou de la


135

prostate153-155

. Le rapport PC/GPC est quatre fois plus élevé dans les extraits de biopsies de

gliomes de haut grade de malignité comme les glioblastomes que dans les gliomes de bas

grade. Cette augmentation du rapport PC/GPC est en grande partie due à l’augmentation de la

concentration de la PC dans les gliomes de haut grade150

. On pourrait donc s’attendre à ce que

les rapports PC/GPC mesurés dans des lignées cellulaires qui sont isolées à partir de différents

glioblastomes humains soient supérieurs ou proches de 1,9 qui est la valeur mesurée dans les

biopsies. Or, si cela se vérifie pour la lignée U251 RS dont le rapport PC/GPC est de

4,46 ± 1,00 (n=5), cela n’est pas le cas pour la lignée U87 RR qui a un rapport PC/GPC de

0,58 ± 0,02 (n=5) (Figure 2.11).

Figure 2.11: Agrandissement de la zone 3,2 à 3,27 ppm des spectres RMN 1H représentatifs de la fraction hydrosoluble de cellules (a) U87 RR et (b) U251 RS. Cho: choline, PC: phosphorylcholine et GPC: glycérophosphorylcholine.

La quantification absolue permet cependant de remarquer que les concentrations en

PC restent proches dans ces lignées et que la diminution du rapport PC/GPC est la

conséquence d’une augmentation importante de la concentration en GPC dans la lignée

U87 RR. Cette contradiction n’est qu’apparente puisque cela n’exclut pas que la

concentration de la PC soit un marqueur de malignité. Concernant les autres métabolites, on

remarque principalement une différence significative au niveau du rapport

glutamate/glutamine. Il est de 1,60 ± 0,12 pour les cellules U87 RR et de 4,11 ± 0,74 pour les

cellules U251 RS.

3.2.5 Effet de la confluence.

Bien que l’utilisation de lignées cellulaires provenant d’un même type tumoral

constitue un modèle in vitro plus simple pour l’étude de la radiorésistance, il s’avère que le

U87 RRppm

33.2403.2503.260

GP

C

PC

Ch

o

a

GP

C PC

Ch

o

ppm33.2403.2503.260

U251 RS

b

U87 RRppm

33.2403.2503.260

GP

C

PC

Ch

o

a

U87 RRppm

33.2403.2503.260

GP

C

PC

Ch

o

a

GP

C PC

Ch

o

ppm33.2403.2503.260

U251 RS

b

GP

C PC

Ch

o

ppm33.2403.2503.260

U251 RS

b


136

comportement en culture et la morphologie des lignées sont sensiblement différents.

Notamment, leur cinétique de croissance en culture peuvent être différentes et aboutir à un

pourcentage de remplissage des boîtes de culture (% de confluence) différent entre les lignées

pour le même temps de mise en culture. Les investigations biologiques sur les lignées

cellulaires sont réalisées en phase d’étalement avant que la confluence ne soit atteinte,

généralement entre 40 et 80% de la confluence156,157

. Nous avons observé des différences

sensibles dans les vitesses d’étalement entre lignées cellulaires de glioblastomes. Ainsi,

après 5 jours et avec un ensemencement identique, nous observons un niveau de confluence

de 80% pour U251 RS et 60% pour U87 RR. Compte tenu de l’importance du cycle de la

phosphatidylcholine (voie de Kennedy)154

dans la croissance cellulaire158

, qui implique de

nombreux composés à cholines comme PC, GPC et Cho, nous avons étudié l’effet du niveau

de confluence sur ces composés à choline présents dans la fraction aqueuse des extraits

cellulaires (Tableau 2.3).

Tableau 2.3: Concentration de choline (Cho), phosphorylcholine (PC) et glycérophosphorylcholine (GPC) pour deux lignées cellulaires de glioblastomes (U87 RR et U251 RS) à 60%, 80 et 100% de confluence. Les concentrations sont données en nmol/million de cellules ± SD (n=5 par groupe). Le rapport PC/GPC est aussi indiqué.

U251 RS U87 RR

60% 80% 100% 60% 80% 100%

Cho 0,43 ± 0,19 0,14 ± 0,02 0,18 ± 0,07 0,24 ± 0,08 0,44 ± 0,10 0,48 ± 0,09

PC 1,44 ± 0,28 0,95 ± 0,10 0,62 ± 0,17 0,93 ± 0,08 0,56 ± 0,06 0,55 ± 0,20

GPC 0,34 ± 0,04 0,40 ± 0,03 0,44 ± 0,15 1,60 ± 0,14 1,30 ± 0,19 1,83 ± 0,29

PC/GPC 4,46 ± 1,00 2,37 ± 0,22 1,75 ± 0,36 0,58 ± 0,02 0,44 ± 0,03 0,33 ±0,15

Nous observons une diminution de la concentration de PC en relation avec le niveau

de confluence des cellules. La concentration en GPC n’est pas affectée par le niveau de

confluence des cellules. Elle reste approximativement 4 fois plus élevée dans les cellules

U87 RR que dans les cellules U251 RS quel que soit le niveau de confluence. Nous n’avons

pas observé d’effet de la confluence cellulaire sur les concentrations des autres métabolites

présents dans ces lignées cellulaires.

La collection de spectres réalisés sur les extraits cellulaires pour les différents niveaux

de confluence est analysée de manière statistique en ACP. La représentation graphique de la


137

distribution des individus de cette ACP (Figure 2.12) illustre le caractère discriminant du

profil métabolique des deux lignées cellulaires et montre l’absence d’effet du niveau de

confluence. La représentation des variables confirme que GPC est la variable la plus

discriminante des deux types cellulaires. Pour la suite de l’étude, les analyses ont été réalisées

sur la fraction aqueuse de l’extrait des cellules, pour toutes les lignées, lorsque le niveau de

confluence atteint 60%.

Figure 2.12: Représentation des individus et des variables suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H de la fraction hydrosoluble des extraits cellulaires de glioblastomes. Cellules U87 RR : •, cellules U251 RS: �. Points encerclés: cellules ayant atteint la confluence.

Les signaux du lactate (entre 1,30 et 1,35 ppm) et de l’acétate (entre 1,91 et 1,93 ppm)

participent aussi à la dispersion des points selon l’axe CP2. L’exclusion des signaux de ces

métabolites avant l’ACP diminue légèrement la dispersion des individus. Autrement dit, les

variations de ces composés semblent aléatoires car elles n’influent pas sur la discrimination

des deux groupes (Figure 2.13).

Ace

Lac

Lac

GPC

PC

Ace

Lac

Lac

GPC

PC

CP2 CP2

CP1 CP1


138

Figure 2.13: Représentation des individus et des variables suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H de la fraction hydrosoluble des extraits cellulaires de glioblastomes (60 et 80% de confluence). Ont été exclues les zones du spectre correspondant aux CH3 de l’acétate (1,91 à 1,93 ppm) et du lactate (1,30 à 1,35 ppm).•: cellules U87 RR et �: cellules U251 RS.

3.2.6 Recherche d’un marqueur métabolique discriminant le phénotype radiorésistance vs

phénotype radiosensible.

Au vu de ces résultats, nous avons décidé d’augmenter le nombre de lignées cellulaires

de glioblastomes humains pour notre étude. Ainsi, nous avons étudié les cellules SF763 RR et

SF767 RS (respectivement 90% et 55% de survie de ces cellules après une irradiation de 2

Gray)148

.

3.2.6.1 Analyse statistique multivariée.

Pour ces deux lignées supplémentaires, avant d’effectuer l’analyse quantitative, nous

avons utilisé l’ACP dans un but de simplification des données, pour voir rapidement s’il

existait une discrimination des lignées RR et RS (Figure 2.14).

U87 RR

U251 RS

GPC

PCU87 RR

U251 RS

GPC

PC

CP2 CP2

CP1 CP1


139

Figure 2.14: Représentations des individus et des variables suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H de la fraction hydrosoluble des extraits cellulaires de glioblastomes. En noir: U87 RR; en bleu: SF763 RR; en rouge: U251 RS et en vert: SF767 RS.

L’ACP de l’ensemble des lignées cellulaires montre qu’il y a trois clusters. Le premier

cluster (en noir) rassemble les échantillons provenant des cellules U87 RR et le second cluster

(en bleu) les échantillons provenant des cellules SF763 RR. Le troisième cluster rassemble la

totalité des échantillons provenant des cellules RS à savoir U251 RS et SF767 RS. La

séparation des groupes selon les composantes principales CP1 et CP2 s’effectue

majoritairement grâce aux signaux situés à 3,22 et 3,23 ppm correspondant à la PC et à la

GPC et, dans une moindre mesure, au signal situé à 3,78 ppm correspondant à la fois à l’un

des signaux du glutamate, de la glutamine et du glutathion. Il est donc possible de séparer les

souches RR des souches RS bien que les deux lignées RR forment deux clusters bien

distincts.

3.3.6.2 Analyse quantitative.

L’ACP nous a permis de mettre l’accent sur la zone du spectre correspondant aux

composés à choline (3,20 à 3,24 ppm). L’analyse classique du spectre RMN par intégration

des signaux permet d’analyser plus en détail cette zone pour les 4 lignées de glioblastomes

étudiés. Ainsi, nous avons comparé spécifiquement la proportion de PC et de GPC présente

dans chaque lignée (Figure 2.15 et Tableau 2.4).

U87 RR SF763 RR

SF767 RSU251 RS

3,23

3,22

3,78

U87 RR SF763 RR

SF767 RSU251 RS

U87 RR SF763 RR

SF767 RSU251 RS

3,23

3,22

3,78

3,23

3,22

3,78

CP1 CP1

CP2 CP2


140

Figure 2.15: Aires relatives de la phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine (GPC) de quatre lignées cellulaires de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n = 5 pour chaque lignée).

Tableau 2.4: Aires relatives de la phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine (GPC) de quatre lignées cellulaires de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n = 5 pour chaque lignée).

U87 RR SF763 RR U251 RS SF767 RS

PC 3,9 ± 0,4 13,6 ± 1,8 4,5 ± 0,2 3,1 ± 0,4

GPC 6,9 ± 1,0 1,0 ± 0,2 1,1 ± 0,1 0,2 ± 0,0

PC/GPC 0,58 ± 0,02 13,83 ± 2,48 4,46 ± 1,00 19,33 ± 7,07

La proportion de PC est nettement plus élevée dans les cellules SF763 RR que dans

l’ensemble des autres cellules. Par contre, la proportion de GPC est très importante dans les

cellules U87 RR et est quasi inexistante dans les cellules SF767 RS.

La GPC qui, lors de l’étude préliminaire, nous semblait être un marqueur de la

radiorésistance des glioblastomes n’en est finalement pas un. Quand au rapport PC/GPC, il est

de 0,58 ± 0,02 dans les cellules U87 RR et il est nettement supérieur à 2 dans les trois autres

lignées (13,83 ± 2,48 pour les SF763 RR, 4,46 ± 1,00 pour les U251 RS et 19,33 ± 7,07 pour

les SF767 RS).

0

0,05

0,1

0,15

0,2

PC GPC

Métabolites.

Air

es

re

lati

ve

s (%

)

U87 RR

SF763 RR

U251 RS

SF767 RS


141

Si nous observons les résultats non plus du point de vue des lignées cellulaires mais du

point de vue des phénotypes RR et RS, phénotype que nous essayons de déterminer, alors

nous pouvons voir que ni PC ni GPC ne permettent de caractériser les deux groupes (Figure

2.16 et Tableau 2.5).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Glu Cho PC GPC PC GPC Cho PC GPC

Métabolites.

Air

es r

ela

tiv

es (

%)

RR

RS

*

**

Figure 2.16: Concentrations relatives du glutamate (Glu), de la choline (Cho), de la phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine (GPC) des lignées radiosensibles et radiorésistantes de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n=10 pour chaque groupe) (*: p<0,05).

Cependant, la proportion de composés à cholines dans les extraits peut être utilisé

comme paramètre de discrimination. En effet, pour les lignées RR (U87 et SF763), le

pourcentage de composés à cholines est de 14, 1 ± 3,7% alors qu’il est seulement de

5,5 ± 1,8% pour les lignées RS (U251 et SF767). On peut aussi noter une variation

significative de la proportion de glutamate qui est plus élevée dans les cellules RS.


142

Tableau 2.5: Concentrations relatives du glutamate (Glu), de la choline (Cho), de la phosphorylcholine (PC) et de la glycérophosphorylcholine (GPC) des lignées radiosensibles et radiorésistantes de glioblastomes. Les concentrations relatives sont calculées en pourcentage par rapport à la somme de l’ensemble des signaux intégrés ± SD (n=10 pour chaque groupe).

RR RS

Glu 6,3 ± 0,9 11,0 ± 2,0

Cho 1,2 ± 0,6 0,9 ± 0,7

PC 9,2 ± 5,7 3,8 ± 1,00

GPC 3,7 ± 3,3 0,6 ± 0,6

PC+GPC 12,9 ± 3,8 4,5 ± 1,4

Cho+PC+GPC 14,1 ± 3,7 5,5 ± 1,8

3.3 Conclusion.

Le profil métabolique caractéristique de chaque lignée a été déterminé. Il traduit la

modification de la concentration relative de certains métabolites comme le glutamate et, de

façon prédominante, des composés à choline (PC et GPC).

L’ACP permet de discriminer les deux phénotypes. Ainsi, les lignées radiorésistantes

(U87 et SF763) se différencient des lignées radiosensibles (U251 et SF767). Il semblerait

qu’il existe un lien entre la résistance de ces lignées cellulaires à l’irradiation et le taux de

dérivés de la choline présents dans les extraits cellulaires de glioblastomes.

Ce travail mené sur quatre lignées cellulaires de glioblastomes a été renouvelé avec

un protocole légèrement différent: utilisation d’une solution tampon borate à pH 10 au lieu de

8,5, diminution des volumes d’extraction, variation de la méthode d’intégration et

changement d’expérimentateur. Les résultats ont été confirmés.

A ce niveau de l’étude, de nombreuses voies sont maintenant à explorer. Tout

d’abord, il serait intéressant d’augmenter sensiblement le nombre de lignées cellulaires de

glioblastomes afin de confirmer la véracité du biomarqueur comme marqueur métabolique de

la radiorésistance. Aussi, il convient maintenant de rechercher, à un niveau biochimique en

amont (gène, ARN et activité enzymatique), d’où proviennent ces différences afin de mettre

éventuellement en évidence des mécanismes impliqués dans la radiorésistance de certaines

de ces tumeurs. Pour cela, des travaux sur les enzymes du cycle de formation de la

phosphatidylcholine ainsi que des études transcriptomique et lipidomique sont en cours de


143

réalisation. Une autre perspective consiste à vérifier les résultats obtenus avec les lignées

cellulaires sur des biopsies de tumeurs cérébrales par RMN HR-MAS ou RMN

conventionnelle des extraits tissulaires. Le suivi des patients qui vont subir un traitement

radiothérapeutique devra nous permettre de vérifier cliniquement si le marqueur que nous

avons défini peut être utilisé comme outil d’aide au diagnostic. Si cela est avéré, il pourra

être utilisé pour aider les médecins dans le choix du traitement à effectuer. Ainsi, si la tumeur

est radiorésistante, cela pourra permettre au patient d’éviter un traitement radiothérapeutique

lourd dont l’efficacité sera faible.


144

4. Analyse métabonomique des modifications précédant l’insuffisance cardiaque

chez le rat SHHF obèse.

4.1 Introduction.

L’obésité est définie par l’augmentation de la masse graisseuse et se caractérise par un

indice de masse corporelle supérieur à 30 kg.m-2 159

. Elle touche 10 à 30% de la population

des pays industrialisés et tend à doubler tous les 10 ans160

. Cette pathologie constitue

aujourd’hui un facteur de risque majeur de l’insuffisance cardiaque (IC). Elle augmente le

taux de mortalité ainsi que le taux de morbidité pour le diabète de type II161

. En dépit de

récentes avancées thérapeutiques, le pronostic de l’IC reste mauvais (35% de mortalité à

5 ans). Si les modifications hémodynamiques et hormonales induites par l’obésité sont

aujourd’hui reconnues, les mécanismes moléculaires sous-jacents conduisant au

développement de l’IC restent peu connus.

Un des effets à long terme de l’obésité se caractérise notamment par une hypertrophie

ventriculaire gauche162

. Dans une étude réalisée sur des biopsies de cœur humain, il a été

montré que les patients obèses et hypertendus avaient un profil d’expression génique

clairement différent de celui des patients hypertendus163

. L’étude que nous présentons sur un

modèle animal s’intègre au projet de caractérisation des modifications du transcriptome et du

métabolome induites par l’obésité chez l’homme et qui influent sur le développement de l’IC.

Deux groupes d’animaux, rats spontanément hypertendus et développant une IC (rat

SHHF) obèses (mutation du gène du récepteur à la leptine = homozygote ObR-/-) et maigres

(hétérozygotes ObR-/+) ont été utilisés pour cette étude. Les rats ObR-/- (obèses dès 4 mois)

développent une IC après 14 mois alors que les rats ObR-/+ développent une IC après

16 mois. Les cœurs provenant des rats obèses ou maigres ne présentent aucune différence

morphologique et sont de poids identiques pour un âge donné. Le tissu du ventricule gauche

provenant des cœurs d’animaux sacrifiés à 4 et 10 mois a été utilisé pour une analyse

métabonomique (évolution du contenu en métabolites hydrosolubles et lipides) par

RMN 1H

164.


145

4.2 Analyse des extraits hydrosolubles.

Les fractions hydrosolubles obtenues à partir de l’extrait de tissu ventriculaire

cardiaque contiennent principalement de la taurine (Tau) et de la créatine (Cr). Nous pouvons

aussi voir qu’elles contiennent du lactate (Lac), de l’acétate (Ace), du succinate (Succ) ainsi

que de l’alanine (Ala), de la glutamine (Gln) et du glutamate (Glu) (Figure 2.17 et tableau

2.6).

Figure 2.17: Spectre RMN 1H d’un extrait hydrosoluble de tissu cardiaque de rat SHHF obèse âgé de 10 mois (m = 136 mg).

ppm1.001.502.002.503.003.504.00

Ala Ace

Glu,

Gln

Gln Glu

Succ

Cr

Lac

Cr

Lac

Tau


146

Tableau 2.6: Attributions des métabolites hydrosolubles du tissu cardiaque (pH 8,5).


Déplacement

chimique

(ppm)

J (Hz)

Acétate

(Ace) CH3

O

O-

CH3 1,92 (s)

Alanine

(Ala) CH3

NH3

+

O-

O

CH3

CH

1,48 (d)

3,74 (q)

8,1

8,1

Créatine

(Cr) N

NH2

O-

O

CH3

NH CH3

CH2

3,04 (s)

3,93 (s)

Glutamate

(Glu)

O-

O

NH3

+O

-

O

1

2

3

4

53CH2

4CH2

2CH

2,07 (m)

2,36 (td)

3,77 (t)

1,5-7,2

7,0

Glutamine

(Gln)

O

NH3

+O

-

O

NH2

1

2

3

4

53CH2

4CH2

2CH

2,14 (m)

2,45 (td)

3,77 (t)

3,2-7,9

7,7

Lactate

(Lac) CH3

O-

O

OH

CH3

CH

1,33 (d)

4,11 (q)

6,9

6,9

Succinate

(Succ)

O-

O-

O

O

(CH2)2 2,41 (s)

Taurine

(Tau)

O-

S

NH3

+

O

O

CH2-S

CH2-N

3,41 (t)

3,25 (t)

6,6

6,6

Les résultats de l’analyse quantitative sont reportés dans le tableau 2.7.


147

Tableau 2.7: Concentrations des métabolites de l’extrait aqueux de tissu cardiaque. Les concentrations sont données en nmol/mg de tissu ± SD. (a p<0,05 entre rats maigres à 4 mois et 10 mois ou entre rats obèses à 4 mois et 10 mois; b p<0,05 entre rats obèses et maigres au même âge).

Rat SHHF 4 mois Rat SHHF 10 mois

Maigres

(n=5)

Obèses

(n=5)

Maigres

(n=5)

Obèses

(n=5)

Taurine (Tau) 33,7 ± 3,6a 34,7 ± 6,0 28,5 ± 3,3 33,0 ± 3,5

b

Créatine (Cr) 16,5 ± 1,2a

15,2 ± 2,7a

12,2 ± 1,4 11,0 ± 1,3

Glutamate (Glu) 5,7 ± 0,6a

5,8 ± 0,9a

4,4 ± 0,8 4,5 ± 0,8

Glutamine (Gln) 7,8 ± 0,7a

6,6 ± 1,3b

6,7 ± 0,8 5,5 ± 0,9b

Acétate (Ace) 1,7 ± 0,4 1,6 ± 0,6 1,7 ± 0,7 1,1 ± 0,4

Alanine (Ala) 2,2 ± 0,1a

2,1 ± 0,1b

1,8 ± 0,3 2,1 ± 0,4

Lactate (Lac) 14,5 ± 5,1 21,5 ± 9,1a

11,0 ± 1,7 10,3 ± 1,4

Tout d’abord, nous observons une diminution de la concentration de l’ensemble des

métabolites avec l’âge, exceptée la taurine chez les animaux obèses et l’acétate chez les

animaux maigres. Ces faibles niveaux de métabolites chez les animaux obèses peuvent être

expliqués par une augmentation de la matrice extracellulaire (avec accumulation de collagène

de type I et III) dans le myocarde avec l’âge165

.

L’analyse quantitative des métabolites montre que le rapport Gln/Glu est

significativement plus bas chez les rats obèses que chez les rats maigres. En effet, chez les

animaux de 4 mois, ce rapport passe de 1,4 ± 0,1 à 1,1 ± 0,1. Chez les animaux de 10 mois, ce

même rapport passe de 1,5 ± 0,2 à 1,2 ± 0,1. La diminution de ce rapport peut être la

conséquence d’une augmentation du taux de conversion intracellulaire de la glutamine en

glutamate dans le tissu cardiaque chez les animaux obèses166,167

.

L’ACP réalisée à partir des spectres obtenus sur les extraits hydrosolubles permet

d’isoler le groupe des animaux obèses sacrifiés à 10 mois. Le groupe des animaux maigres à

10 mois est homogène mais ne peut pas être discriminé de l’ensemble des animaux jeunes

(4 mois), ces derniers ayant une distribution des individus assez hétérogènes selon les axes

PC1 et PC2 (Figure 2.18).


148

Figure 2.18: Représentations des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H de la fraction hydrosoluble des extraits de tissu cardiaque. En noir: maigres 10 mois; en bleu: obèses 10 mois; en rouge: maigres 4 mois et en vert: obèses 4 mois.

La discrimination des individus selon l’axe CP1 est principalement corrélée à des

variations du contenu en taurine et la discrimination selon l’axe CP2 est principalement

corrélée à des variations du contenu en créatine. Le résultat de l’ACP nous a conduit à

rechercher un paramètre discrimant qui correspondent à une combinaison algébrique de la

taurine et de la créatine. Ainsi, le rapport Tau/Cr est un bon paramètre discriminant. En effet,

ce rapport est de 2,0 ± 0,2 chez les animaux maigres à 4 mois, il passe à 2,3 ± 0,4 et 2,3 ± 0,3

chez les animaux maigres à 10 mois et obèses à 4 mois respectivement. Il est de 3,0 ± 0,4

chez les animaux obèses à 10 mois qui sont bien significativement différents des trois autres

groupes de rats.

L’augmentation du rapport Tau/Cr, tout comme la diminution du rapport Gln/Glu chez

les animaux obèses à 10 mois, impliquerait une consommation d’énergie plus importante par

les cellules cardiaques. En effet, l’hypertrophie ventriculaire entraîne le remplacement des

cellules saines par des cellules nécrotiques (fibrose)168

. Les cellules cardiaques fonctionnelles

sont moins nombreuses et doivent compenser la perte d’activité due à cette fibrose. Elles ont

donc besoin de plus d’énergie pour faire fonctionner le muscle cardiaque.

Obèses 10 mois

Maigres 10 mois

Maigres 4 mois

Obèses 4 mois

CP2

CP1


149

4.3 Analyse des extraits organosolubles.

Un spectre caractéristique de la fraction organosoluble de tissu cardiaque est présenté

dans la figure 2.19. Les attributions sont reportées dans le tableau 2.8.

Figure 2.19: Spectre RMN 1H d’un extrait organosoluble de tissu cardiaque de rat SHHF obèse âgé de 10 mois (m=136mg). (S: méthanol et eau)

Tableau 2.8: Attributions des lipides du tissu cardiaque.

Formules chimiques Groupement

Déplacement

chimique

(ppm)

Cholestérol

OH

CH3

CH3 CH3

CH3

CH318

19 27

2621

CH3 18

CH3 19

0,70 (s)

1,02 (s)

Triglycérides

O

O

OCH3

O

COR2

COR3

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

18 w3

CH2CH3

α

β

γ

CH3 18

CH3 18 �3

CH2 15-17,4-7

CH2 3

CH2 8,14

CH2 2

CH2 11

CH2 �,�CH �

CH 9,10,12,13

0,90

0,99 (t; 7,7 Hz)

1,27

1,61

2,06

2,34

2,84

3,86-4,46

5,24

5,38

ppm1.02 .03 .04 .05 .0

14

13

12

S

11

S

10

9 8 7 6

5

1

4

3

2

ppm 0.8500.9000.9501.0001.050


150

Choline de la PtCho

N+

CH3

O

CH3

CH3P

OR

O-

O

+N(CH3)3

N-CH2

O-CH2

3,23 (s)

3,60

4,26

Les extraits organosolubles analysés par RMN amènent de nombreuses informations.

Nous avons ainsi pu calculer les quantités de chaîne grasse (chaînes acyles) ainsi que le

pourcentage de chaînes acyles oméga-3, les quantités de cholestérol et de

phosphatidylcholine. De plus, nous pouvons avoir accès au nombre d’insaturation et de

polyinsaturation par chaîne grasse. Les résultats de l’analyse quantitative sont reportés dans le

tableau 2.9.

Tableau 2.9: Concentration des lipides de la fraction organosoluble, pourcentage de chaînes acyles oméga-3 par rapport à la totalité des chaînes grasses et moyenne des insaturations et polyinsaturations (a p<0,05 entre animaux maigres à 4 mois et 10 mois ou entre animaux obèses à 4 mois et 10 mois; b p<0,05 entre animaux obèses et maigres au même âge).

Rat SHHF 4 mois Rat SHHF 10 mois

Maigres (n=5) Obèses (n=5) Maigres (n=5) Obèses (n=5)

Chaîne acyle

(nmol/mg tissu) 103,5 ± 11,3 117,0 ± 6,9

a 90,7 ± 6,1 84,5 ± 4,7

Cholesterol

(nmol/mg tissu) 5,1 ± 0,3 5,3 ± 1,0 4,6 ± 0,6 5,1 ± 0,8

Phosphatidylcholine

(nmol/mg tissu) 14,5 ± 1,0 15,7 ± 2,1

a 13,6 ± 0,9 12,7 ± 0,8

Chaîne acyle saturée

en ω-3 (%) 8,8 ± 0,6 10,4 ± 0,8

b 8,1 ± 1,2 9,5 ± 0,6

b

Insaturations par

chaîne 1,7 ± 0,1 1,8 ± 0,1 1,8 ± 0,1 1,9 ± 0,0

b

Poly-insaturations

par chaîne 1,2 ± 0,1 1,2 ± 0,1

a 1,2 ± 0,1 1,3 ± 0,0

b

Nous remarquons une légère baisse de l’ensemble des lipides avec l’âge. Par ailleurs,

nous observons une augmentation significative de la contribution des lipides de type oméga-3

chez les animaux obèses quel que soit l’âge, ce qui semble assez surprenant. Mais une telle

augmentation a déjà été observée dans les phénomènes de régénération musculaire169

.


151

Figure 2.20: Représentation des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H de la fraction organosoluble des extraits de tissu cardiaque. En noir: maigres 10 mois; en bleu: obèses 10 mois; en rouge: maigres 4 mois et en vert: obèses 4 mois.

L’ACP réalisée à partir des fractions organosolubles nous permet de remarquer que les

animaux maigres de 4 mois sont isolés des trois autres groupes. Les animaux maigres 10 mois

et obèses 4 mois sont totalement confondus et les animaux obèses 10 mois sont assez

recentrés (Figure 2.20). Malheureusement, étant donné le faible nombre de métabolites

caractérisés dans la fraction organosoluble, cette analyse globale ne nous permet pas d’avoir

de plus amples informations.

4.4 Analyse combinée des données.

Nous avons ensuite réalisé la combinaison des données RMN 1H provenant des deux

fractions extraites. Comme nous l’avons vu précédemment (§ 2.4.2), cette combinaison passe

nécessairement par la transformation de chaque matrice de données en une matrice centrée

réduite. La normalisation des données est précédée d’une ANOVA permettant à la fois

d’éliminer les signaux correspondant au bruit spectral et aux variables non significativement

différentes entre les quatre populations. Afin de ne pas influencer le résultat de l’ACP, la

classification des quatre groupes d’échantillons est réalisée avec la méthode du k-means. La

représentation des individus selon les composantes principales 1 et 2 est montré sur la

figure 2.21.

Maigres 10mois

Obèses 10mois

Obèses 4 mois

Maigres 4 mois

Maigres 10mois

Obèses 10mois

Obèses 4 mois

Maigres 4 mois

CP2

CP1


152

Figure 2.21: Représentation des individus suivant les composantes principales CP1 et CP2 après l’ACP issue de l’analyse des spectres RMN 1H des fractions hydro- et organo-soluble des extraits de tissu cardiaque. En noir: maigres 10 mois; en bleu: obèses 10 mois ; en rouge: maigres 4 mois et en vert: obèses 4 mois.

L’ACP réalisée sur l’ensemble des données spectrales recueillies à partir du tissu

cardiaque nous permet de retrouver la tendance observée à la fois sur les extraits aqueux

(à propos du rapport Tau/Cr) et sur les extraits organiques (dans l’ACP). Cette tendance est

matérialisée par la flèche sur la figure 2.21. Les rats maigres 4 mois et les rats obèses 10 mois

ont un comportement totalement différent. Par contre, les animaux maigres 10 mois et les

obèses 4 mois ont un comportement similaire. Alors que les rats SHHF maigres entament les

processus métaboliques aboutissant à l’insuffisance cardiaque à 10 mois, les rats SHHF

obèses, quant à eux, semblent développer précocement ces mêmes processus, dès l’âge de 4

mois. Cette hypothèse est en accord avec le développement chronologique avéré de l’IC170

.

On peut remarquer la présence d’un point du groupe des animaux maigres 4 mois

assez écarté des quatre autres. Si l’on réalise l’ACP sans ce point, la tendance observée est

conservée voire amplifiée. Nous avons donc décidé de garder malgré tout cette information.

Maigres 4 mois

Maigres 10mois

Obèses 4 mois Obèses 10 mois

CP2

CP1


153

4.5 Conclusion.

Cette étude métabonomique confirme la précocité de l’insuffisance cardiaque chez le

rat obèse. Cette hypothèse pourrait être confirmé en poursuivant l’étude métabolique sur des

rats SHHF obèses et maigres à 14 mois. Les modifications métaboliques observées sont en

accord avec un remodelage cardiaque qui s’accompagne d’une expansion de la matrice

extracellulaire (fibrose)168

et d’une régénération musculaire169

. L’analyse transcriptomique

des mêmes individus ayant été parallèlement effectuée, nous avons le projet de combiner

l’ensemble des données pour les soumettre à une analyse statistique multivariée.

154

155

CONCLUSION GENERALE.

156

Conclusion générale.

157

Nous avons utilisé et évalué deux outils: la RMN HR-MAS, méthode d’analyse RMN

adaptée à une grande diversité d’échantillons, et la Métabonomique, méthode de traitement

statistique des données spectroscopiques pour la recherche de signatures métaboliques. Ces

deux outils se sont avérés très puissants mais possèdent, comme tout procédé, certains biais.

Pour la RMN HR-MAS appliquée à l’étude des tissus biologiques, des problèmes

principalement pratiques se posent: problèmes de prélèvement, obligation de congeler les

échantillons ou encore risque biologique. La sensibilité des sondes HR-MAS, permettant de

travailler avec de très faibles quantités de matière, leur donne tout de même un véritable

attrait. Les microsondes actuellement proposées sont peut être l’alternative à envisager pour

l’étude des tissus biologiques.

Concernant la Métabonomique appliquée aux données RMN, le principal souci que

nous avons rencontré se situe au niveau du nombre d’échantillons, celui-ci étant généralement

trop faible par rapport au nombre de variables étudiées. Mais l’utilisation des méthodes

statistiques multivariées appliquées au grand nombre de données que nous possédons permet

un gain de temps très important, par rapport à une analyse quantitative classique, en

permettant de cibler certains des métabolites qui pourront ensuite être quantifiés.

L’utilisation de ces deux outils nous a permis de travailler sur une large gamme

d’échantillons, que ce soit des animaux, des végétaux, des tissus biologiques ou encore des

cellules et sur de nombreux sujets d’études biomédicales allant de l’étude de la

néphroprotection par la pargyline, en passant par la recherche de marqueurs métaboliques de

la radiorésistance des glioblastomes ou encore les effets de l’obésité chez le rat hypertendu.

158

159

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l’Université Paul Sabatier, Toulouse, sous la direction de Myriam Malet-Martino.

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176

Résumé.

177

RESUME.

L’amélioration des outils analytiques est aujourd’hui indispensable pour la recherche

de nouveaux marqueurs métaboliques, que ce soit pour l’aide au diagnostic de pathologies ou

pour le suivi d’effets thérapeutiques. Lorsqu’on désire analyser des tissus par RMN liquide en

haute résolution, il est nécessaire de réaliser une extraction tissulaire préalable. A l’opposé, la

RMN HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning : RMN haute résolution par rotation

de l’échantillon à l’angle magique) permet l’analyse directe des tissus biologiques, qu’ils

soient d’origine animale ou végétale. La première partie de notre travail présente les

différentes études que nous avons réalisées illustrant l’intérêt et les limites de cette nouvelle

méthode. L’évaluation critique réalisée à partir d’un large éventail expérimental (animaux

vivants (ver endogéique et larve de carabe), tissus rénal, cardiaque et musculaire frais et

congelés) révèle ses inconvénients sur les plans logistique, sanitaire et analytique. La RMN

HR-MAS permet l’observation simultanée des métabolites hydrosolubles et organosolubles

mais leur quantification est souvent difficile. De plus, la rotation rapide du rotor (1-5 kHz)

entraîne une altération des échantillons. L’avantage principal de la méthode réside dans sa

capacité à analyser des échantillons de faible volume (12-92 µL) avec une excellente

sensibilité. Notre étude nous a conduit à privilégier l’analyse RMN sur l’extrait plutôt que sur

le tissu intact. La seconde partie concerne la métabonomique par RMN. L’étude

métabonomique comparée de cellules de glioblastomes humains de phénotype radiorésistant

ou radiosensible a permis de mettre en évidence des marqueurs caractéristiques de la

radiorésistance. L’analyse en composantes principales (ACP) normée a été utilisée comme

analyse statistique des données obtenues à partir de divers types d’échantillons ou de

différentes méthodes d’analyse. Ainsi, les modifications métaboliques induites par l’obésité

chez le rat ont été caractérisées en combinant les données RMN 1H des fractions

hydrosolubles et organosolubles. De même, la caractérisation des phénotypes de différentes

variétés de courge a été confortée en combinant les données obtenues à partir des spectres

RMN 1H et

31P.

MOTS CLES: RMN 1H et

31P, HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning),

métabonomique, glioblastomes, obésité.

Evaluation of two new tools for the analysis of biological samples by Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy:

-HR-MAS (High-Resolution Magic Angle Spinning) NMR: a technical analysis of crude

samples;

-Metabonomic: a new statistical method of spectra analysis for research of metabolic

signatures.

The improvement of analytical tools is essential to find new metabolic biomarkers, to

help for pathology diagnosis or to follow therapeutic effects. An extraction procedure is

needed to analyse tissues by liquid high-resolution NMR. With HR-MAS (High-Resolution

Magic Angle Spinning) NMR, a direct analysis of tissues is possible (animal or vegetal

tissues). The first part of this work shows the different studies we carried out to evaluate the

interests and the limitations of this new method. A critical evaluation, achieved on a large

scale of biological samples (live animals (earthworm, ground bettle larvae), fresh and frozen

kidney, cardiac and musculary tissues) highlights several drawbacks on logistical, sanitary

and analytical points of view. HR-MAS NMR allows the simultaneous observation of

hydrosoluble and organosoluble metabolites but their quantification is often difficult. Then

rapid rotation of the rotor (1-5 kHz) involves sample alteration. The main advantage of this

method resids in its ability to analyse small samples (12-92 µL) with high sensitivity. Our

study led us to favor liquid NMR analysis on extract tissues rather than NMR analysis on

intact tisssues. The second part concerns metabonomic by NMR. A compararive

metabonomic study of human glioblastoma cell lines, radioresistant or radiosensitive, reveals

a characteristic biomarker of radioresistance. Normalized principal component analysis (PCA)

has been used for a statistical analysis of data obtained on different kinds of samples or with

different analytical methods. Metabolic modifications induced by obesity on rat have been

characterized by the combination of 1H NMR spectra of hydrosoluble and organosoluble

fractions. Characterization of phenotypes from different varieties of squash has been

conforted by combination of data obtained with 1H and

31P NMR spectra.

KEYWORDS: 1H and

31P NMR, HR-MAS (High Resolution-Magic Angel Spinning),

metabonomic, glioblastoma, obesity.

Documents

Fichier Thèse Delphine Bon pour BU en ligne OKthesesups.ups-tlse.fr/152/1/Bon_Delphine.pdf · Delphine BON le 11 décembre 2007 Evaluation de deux nouveaux outils pour l’étude