Techniques d'hybridation in situ et d'immunohistochimie

Hybridation in situL'hybridation in situ permet de dtecter l'expression dun ARNm grce lhybridation dune sonde spcifique complmentaire dans un tissu donn.sonde complmentaire

ARNmLes sondes chaudes = sondes radioactives rvles par mulsions photographiques (prcipitation des grains d'argent): marquage autoradiographique Utilisation de nuclotides radiomarqus: phosphore 32, tritium, soufre 35, ...

Les sondes froides sont marques par un haptne (digoxignine, biotine) et rvles par un AC coupl une enzyme (peroxydase...): dtection immunoenzymatique (immunocytochimie) Utilisation de nuclotides modifis: dig-dUTP, bio-dUTP, ...

Avantage: - trs spcifique

Inconvnients: - peu sensible (difficults d'accessibilit de la sonde vers sa cible) - la squence recherche doit tre en grande quantit

-Dtection du marquage microautoradiographiqueAfin de dtecter la prsence de la sonde radioactive au niveau cellulaire les lames sont recouvertes d'une fine couche d'mulsion photographique: - les lames sont immerges lobscurit brivement dans l'mulsion et mises scher. - Les lames mulsionnes sont stockes 4C l'abri de la lumire et de l'humidit pendant une priode de 6 9 semaines.

-Aprs 6 semaines d'exposition on procde des essais de rvlation du marquage. Lorsque le marquage atteint une intensit satisfaisante on procde la rvlation de l'ensemble des lames: les lames sont plonges dans un bain de rvlateur puis plonges dans un bain de fixateur photographique. Aprs un rinage de 30 minutes l'eau distille on peut procder la contrecoloration (crsyl violet, thionine, ) ou d'autres marquages selon les exprimentations. (Pour les dtections immunocytochimiques on ne fait pas de contre-coloration.)

- Observation du marquage microautoradiographiqueLa prsence de la sonde radioactive hybride sur les ARNm recherchs se traduit, aprs rvlation de l'mulsion photographique, par la prsence de grains d'argent sur les cellules.

Hybridation in situ: autoradiographieBrightfield Darkfield

L'immunohistochimieL'immunohistochimie permet de dtecter lexpression dune protine dans un tissu donn. Exemple: mise en vidence de lexpression de GFAP, NeuN, PSA-NCAM...

peroxydases Complexe Avidine-biotinebiotine

DAB (diaminobenzidine) + Ni + H2O2 Oxydation Produit color

AC IIbiotinyl avidine

AC I

Antigne

Protocole exprimental:- Animaux sont perfuss : dabord avec un tampon hparin pour liminer un max de sang puis avec para-formaldhyde (PAF) 4% = fixe les tissus l'instant t. - Coupes du cerveau au vibratome (50 m) dans du tampon phosphate (PBS). - Les coupes sont ensuite permabilises avec du triton (dtergent). - On supprime les peroxydases endognes avec du mthanol +H2O2. - On bloque les sites aspcifiques avec du srum ou BSA. Si AC secondaire chvre = srum de chvre. - Incubation avec AC primaire (1 nuit). - AC secondaire avec un systme damplification du signal avidine-Biotine (ABC= avidin-biotincomplex).

- On rvle lactivit enzymatique de la peroxydase de Raiffort avec comme chromogne la diaminobenzidine (DAB) qui par oxydtion devient color et leau oxygne comme substrat. - Les coupes sont dshydrates dans des bains dthanol (gradient) pour liminer l'eau des coupes puis montes sur les lames dans une solution glatine qui permet la coupe de coller la lame.

Immunohistochimie NeuN: rvlation avec la DAB

Immunohistochimie fluorescente: observation au microscope fluorescence

AC-p67phox

AC-GFAP

DAPI

Merge

Double marquage- double hybridation in situ: 1- sonde froide: immunoprcipitation 2- sonde chaude: autoradiographie - immunohisto + hybridation in situ: 1- AC anti-prot 2- sonde chaude

NeuN: protine (marron) Activin A: ARNm (points bleus)

- double immunohistochimie: - double immunoprcipitation (bleu et marron) - double immnunofluorescence (mission de 2 longueurs d'onde )

TD n3Objectif : Observer la localisation de diffrents marqueurs rvls par hybridation in situ ou immunohistochimie et rpondre aux difrentes questions

I.Hybridation in situ :Marquage sonde chaude :Rvlation du marquage ARNm du transporteur la dopamine. A partir de lobservation du marquage sur les coupes disponibles proposer la (les) structure (s) exprimant ce marqueur. A votre avis il y a-t-il co-localisation possible entre lARNm et la protine? Rvlation du marquage ARNm dun facteur de transcription NFkB. A partir de lobservation du marquage sur les coupes disponibles proposer la (les) structures exprimant ce marqueur. Quelles sont les difficults rencontres par raport ce marquage ? Proposer une explication. Rvlation du marquage ARNm dun facteur de transcription egr-1 A partir de lobservation du marquage sur les coupes disponibles proposer la (les) structures exprimant ce marqueur.

Marquage sonde froide :Rvlation du marquage ARNm codant pour le gne de la glutamate dcarboxylase (GAD). Dans quelle voie de synthse intervient cette enzyme O est situ le marquage ?

II. Immunohistochimie :

Rvlation du marquage de la protine GFAP (GLIAL FIBRILLARY ACIDIC PROTEIN). Prciser la localisation cellulaire du marquage (nuclaire, cytoplasmique, membranaire). Prciser la localisation de la protine (structures, hippocampe, striatum.) : Quel type cellulaire est rvl par ce marqueur ? Rvlation du marquage de la protine NeuN (facteur de transcription). Prciser la localisation cellulaire du marquage (nuclaire, cytoplasmique, membranaire). Prciser la localisation de la protine (structures, hippocampe, striatum.) : Quel type cellulaire est rvl par ce marqueur ? Rvlation du marquage de la protine PSA-NCAM (Polysialic acid neuronal cell adhesion molecule) Prciser la localisation cellulaire du marquage (nuclaire, cytoplasmique, membranaire). Prciser la localisation de la protine (structures, hippocampe, striatum.) : Quel type cellulaire est rvl par ce marqueur ? Rvlation du marquage du rcepteur aux glucocorticodes (facteur de transcription). Prciser la localisation cellulaire du marquage (nuclaire, cytoplasmique, membranaire). Prciser la localisation de la protine (structures, hippocampe, striatum.) : Quel type cellulaire est rvl par ce marqueur ?