Upload
thibault-pinel
View
112
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
INSERM – Université Pierre et Marie CuriePitié-Salpêtrière
« Génétique et mécanismes des maladies de l’excitabilité musculaire et de la sclérose en plaques»
Dr Sophie NICOLE
GENETIQUE ET
HEMIPLEGIE ALTERNANTE
Génétique et hémiplégie alternante?Génétique et hémiplégie alternante?
• Très probablement car :
signes cliniques stéréotypés
pas de lien avec un facteur particulier (grossesse,
environnement,…) cas familiaux (jumeaux monozygotes)
hémiplégie alternante liée à une mutation ATP1A2, SLC1A3
et CACNA1A
• Un corps humain est composé d’organes
Corps, organes, cellules et chromosomes
Corps, organes, cellules et chromosomes
23 paires de chromosome
• Une cellule contient 23 paires de
chromosomes
• Chaque organe est composé de cellules (1 péta (1015 ) cellules dans le corps
humain)
Chromosomes, gènes et bases : ADN Chromosomes, gènes et bases : ADN
• L’ensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de
bases
• Les chromosomes contiennent des gènes
• L’ensemble des chromosomes humains contiendrait 30.000 gènes
• Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide
DéoxyriboNucléique)
Chromosomes, gènes et bases : ADN Chromosomes, gènes et bases : ADN
• L’ensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de
bases
• Les chromosomes contiennent des gènes
• L’ensemble des chromosomes humains contiendrait 30.000 gènes
• Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide
DéoxyriboNucléique)
BASE GENE CHROMOSOME
lettre phrase livre
Gènes et protéines Gènes et protéines
Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirschromosome
Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirsgène
la maitresse nous donne beaucoup trop de devoirsexons
LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAUCOUP TROP DE DEVOIRSprotéine
Fonction cellulaire
• La protéine exerce une fonction cellulaire
• Un gène code pour une protéine
Gènes, protéines et cellulesGènes, protéines et cellules
Protéines et maladiesProtéines et maladies
• Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à l’origine d’une
maladie
LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAU DE DEVOIRSprotéine
Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirschromosome muté
Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirsgène
la maitresse nous donne beau de devoirsexons
• L’anomalie dans la protéine résulte d’une mutation
dans le gèneLamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirschromosome
Protéines et maladiesProtéines et maladies
• Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à l’origine d’une
maladie • L’anomalie dans la protéine résulte d’une mutation
dans le gène
trouver l’anomalie parmi 3,2 milliards de lettres
Comment identifier l’anomalie génétique?
Comment identifier l’anomalie génétique?
• Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage)
- l’association française contre les myopathies : 20.000 euros
- l’AFHA : 30.000 euros
débutée en juin 2008. Au 30 octobre :
- 22 familles
- 72 personnes
données cliniques essentielles
- médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE
Comment identifier l’anomalie génétique?
Comment identifier l’anomalie génétique?
• Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage)
- l’association française contre les myopathies : 20.000 euros
- l’AFHA : 30.000 euros
débutée en juin 2008. Au 30 octobre :
- 22 familles
- 72 personnes
conseil scientifique en cours d’établissement
- banque (1)
- AFHA (1)
- neuropédiatre et chercheur (2-3)
Ouverte à tout projet de génétique sur l’HA
données cliniques essentielles
- médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE
- base de données européenne ENRAH
Comment identifier l’anomalie génétique?
Comment identifier l’anomalie génétique?
• Mode de transmission : dominant de novo possible
• Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche
dominant de novo
dominant
• Etudes moléculaires de l’ADN des patients comparés à des individus
« témoins »
Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN
I. Approche gènes candidats: Idée sur la fonction cellulaire altérée
Migraine hémiplégique familiale
- gènes ATP1A2, CACNA1A
- faite par les équipes américaines, hollandaises et italiennes
Pas de mutation dans les cas d’ hémiplégie alternante
« typique »
Nombre gènes candidats trop important pour poursuivre
cette approche
Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN
II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans la totalité du
génome- anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype »)
- 1 patient aux USA: rien de trouvé
- 1 patient allemand, qui devrait être étudié (Pays-Bas)
- oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région
Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN
II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome
entier
- recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays)
Plateforme Illumina « P3S »
- anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype »)
- oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région
Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN
II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome
entier
sonde
ADN à tester
- recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays)
- anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype »)
- oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région
Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN
II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome
entier
ADN contrôle (parents)
ADN enfant
- recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays)
- anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype »)
- oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région
II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome
entier
avantages :
- manipulation rapide
- pas d’a priori biologique
désavantages :
- chère car nouvelle technologie
-support informatique
faites aux Etats-Unis (K. Svoboda)?
Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN
Projet de rechercheProjet de recherche
Recherche d’anomalies submicroscopiques par SNP-CGH
arrays (Illumina)- Janvier - septembre 2009 Analyse de 100 patients européens (idéal)
- 400 euros par patient : 40.000 euros
- analyses informatiques
- réalisée par Chirine El Baba (étudiante M2 : BAC + 5 ans)
- Septembre 2009 - juin 2010 Validation des remaniements candidats
- SNP-CGH arrays chez les parents si plus de 20
remaniements / patient
16.000 euros
(estimation 20 patients)
- quantitative real-time PCR 20.000
euros (estimation 50 remaniements)
- rémunération d’un doctorant (3 ans)
coût patronale de 2.400 euros/mois
soit 28.000 euros /
an
- Total coût 20.000 à
64.000 euros
Futur…Futur…
- Remaniements pathologiques candidats :
- études des gènes de la région
- recherche de mutation chez les patients sans remaniements
- Pas de remaniements pathologiques candidats :
- recherche de modifications épigénétiques
envisagée en Belgique?
- séquençage génome complet de plus en plus envisageable…
Prof Bertrand Fontaine
Chirine El Baba
Immunomarquage PLN sur fibroblastes humains Culture de fibroblastes- ensemencement 1.5.104 à 2.104 cellules par puit (100 µl maximum/puit)2 boites et 2 puits/boite par individu (3 puits pour le témoin)- après ½ journée, rajouter 1 ml de milieu/boite (milieu + 10% SVF)- laisser pousser de 4 (2.104 ) à 6 (1.5.104) jours (jusqu’à ce que cellules soient confluentes) Immunomarquage- rinçage PBS 1X- fixation PFA4% froid, 10 min à 4°C- rinçage 3X PBS1X- rapide rinçage PBS-tween 0.1%- incubation anticorps primaire. 1H00, T° ambiante
1 série avec triton : PBS-BSA3% + triton-X100 0.1%1 série sans triton : PBS-BSA3% - anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab.) + anti-fibronectine (1/500 ; F3648, Sigma-Aldrich)- anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab) + anti-DV (1/100; R. Timpl, lapin).
- 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante- incubation anticorps secondaire. 1H00, T° ambiante (PBS-BSA3%)
- anti-souris FITC (1/100 ; whole IgG, Jackson immunoresearch) + anti-lapin-TR (1/100, Jackson Lab)- 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante- 5 min Hoechst 1/100 dans PBS1X- rinçage 1X PBS1X- rapide rinçage H2O et montage fluoromount-G (Southern Biotechnology).
! pas de montage en vectashield car cellules se décollent.
Coût estiméCoût estimé
Euros HT Echantillon 20 familles (60 ech.)
Illumina (P3S) 304 20.000
lames CNV610-Quad 300
échantillon 2
run 1,5
Affymetrix (Strasbourg) 595 35.700
sonde 345
lames SNP 6.0 250
Agilent (Strasbourg) 823 49.380
sonde 345
lames 1 X 244K 478 (X 2?)