Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs

Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires :

étude et recherche d’effecteurs

Thèse préparée au laboratoire du cytosqueletteThèse préparée au laboratoire du cytosquelette

INSERM U366 - CEA GrenobleINSERM U366 - CEA Grenoble

Sous la direction deSous la direction de

Didier Job et Odile ValironDidier Job et Odile Valiron

Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaireIntroduction : le cytosquelette microtubulaire

ObjectifsObjectifs

Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubulesdes microtubules

Caractérisation d’oligomères stimulant la Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubulesnucléation des microtubules

Recherche de nouveaux effecteurs de Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubulesl’assemblage des microtubules

Conclusions et perspectivesConclusions et perspectives


ObjectifsObjectifs





Le cytosquelette microtubulaire

InterphaseInterphase MitoseMitose

Structure des microtubules

Assemblage des microtubules

L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors

d’équilibre

Eléments requis :Eléments requis :Concentration critique, température minimaleSource d’énergie: GTPSolution adéquate (tampon, magnésium)

Nucléation des microtubules

DIMERESDIMERES

OligomèresOligomères

FeuilletsFeuillets

MICROTUBULESMICROTUBULES

Elongation des microtubules

Addition de dimèresAddition de dimères Elongation de feuilletsElongation de feuillets

Instabilité dynamiqueInstabilité dynamique

Etat stationnaire

Consommation d’énergie à l’état stationnaireConsommation d’énergie à l’état stationnaire

Flux de sous-unités

200010

50

4000

30

0

Lo

ng

ueu

r (µ

m)

Temps (s)

TreadmillingTreadmilling

+-

Dynamique des microtubulesin vivo

Interphase Mitose

Une architecture dynamiqueUne architecture dynamique

Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire

Renouvellement permanent des microtubules

Instabilité dynamique « tempérée »

Treadmilling

Contrôle de la stabilité des microtubules

Protéines stabilisant les microtubulesProtéines stabilisant les microtubulesMAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4

Lis1, DoublecortineXMAP230, XMAP215, TOGpSTOP

Intégrateurs du cytosqueletteIntégrateurs du cytosquelettePlakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments)MACF (microtubules, actine)

Protéines déstabilisantesProtéines déstabilisantesStathmine, SCG10XKCM1, Kar3pRev

Modulation du turnover des microtubules

Protéines liant l’extrémité Protéines liant l’extrémité plusplus des microtubules des microtubules

Bim1, EB1, EB2Bim1, EB1, EB2

Tip1pTip1p


ObjectifsObjectifs





Objectifs

Réévaluation des facteurs contrôlant la Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubulesdynamique des microtubules

Obtention et caractérisation d’oligomères Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des de tubuline stimulant la nucléation des microtubulesmicrotubules

Recherche de nouveaux effecteurs de la Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubulesdynamique des microtubules

Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire

Objectifs


Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules

Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules

Conclusions et perspectives

Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

Mise au point de dosages Mise au point de dosages

Mesure simultanée deMesure simultanée de

- concentration en tubuline-GTP

- « masse » de tubuline assemblée

- distribution de longueurs des

microtubules et longueur moyenne

[Tubuline-GTP](t)[Tubuline-GTP](t)

m(t)m(t)

l(t)l(t)

[MT](t)[MT](t)

Tubuline complexée au GTP sans excès de GTPTubuline complexée au GTP sans excès de GTPPas de système régénérateur du GTPPas de système régénérateur du GTP

la tubuline n’assemble qu’une seule fois

Réactions d’assemblages

•Vitesse et amplitude augmentent•Symétrie des courbes

•Désassemblage en dessous de la concentration critique

Nucléation des microtubules

Vitesse de formation de nouveaux microtubules :Vitesse de formation de nouveaux microtubules :• Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP• Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP• Exposant de nucléation : environ 6,2

Elongation des microtubules

Vitesse d’élongation indépendante de :Vitesse d’élongation indépendante de :- concentration instantanée de tubuline-GTP- concentration initiale en tubuline-GTP

Limitée par les propriétés intrinsèques des Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?microtubules ?

Désassemblage des microtubules

Désassemblage par catastrophesDésassemblage par catastrophesIndépendant de la longueurIndépendant de la longueur

Des facteurs de catastrophesDes facteurs de catastrophes des oligomères ?

Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

• Nucléation : un intermédiaire stable entre les Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubulesdimères de tubuline et les microtubules

Des oligomères de tubuline ?

• Elongation limitée par les propriétés intrinsèques Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubulesdes microtubules

Fermeture de feuillets

• Désassemblage limité par la fréquence de Désassemblage limité par la fréquence de catastrophecatastrophe

Des oligomères facteurs de catastrophes ?


Objectifs

Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules




Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation

des microtubules

Production d’assemblages de tubuline stabilisés par Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalentpontage covalent

Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéréAssemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGSCollecte des fragments de microtubules stabilisésFiltration éliminant les particules de plus de 100 nm

Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline

•Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique•Absence de fragments de microtubules dans les solutions

- filtration 100 nm- observation en immunofluorescence

Caractérisation des solutions d’oligomères

• Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm)• Des oligomères linéaires

Microscopie électroniqueMicroscopie électronique

Diffusion de lumièreDiffusion de lumière

Structure des oligomères

• Liaison de GTP par le dimère de tubulineLiaison de GTP par le dimère de tubuline échangeable sur la sous-unité

• Structures possibles des oligomèresStructures possibles des oligomères

Association longitudinale

Association latérale

Feuillet

Propriétés de liaison du GTP par les oligomères

Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactifEchange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif

Des oligomères formés par association latérale de dimères

Affinité plus faibleAffinité plus faibleEchange plus lentEchange plus lent

contraintes liées au pontage ?

Mécanisme de nucléation des microtubules par les

oligomères

Tubuline assembléeTubuline assemblée Longueur moyenne des microtubulesLongueur moyenne des microtubules

Concentration en microtubulesConcentration en microtubules

Exposant de nucléation

Exposant de nucléation

Environ 4 oligomères sont nécessaires pour Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubuleformer un nouveau microtubule

Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation

• Des oligomères linéaires formés par association latérale de Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimèresdimères

42 nm environ 10 dimères Taille + diffusion dynamique de la lumière 65% de tubuline sous forme oligomérique

• Exposant de nucléation : environ 4Exposant de nucléation : environ 44 oligomères se combinent pour former un microtubule formation d’un feuillet ?

• Les microtubules ne désassemblent pas spontanémentLes microtubules ne désassemblent pas spontanément Absence de facteurs de catastrophes ?


Objectifs





Stratégie de recherche de partenaires de la tubuline

Partenaires de la tubuline

Un nombre limité de partenairesUn nombre limité de partenaires

Des partenaires variables selon la nature des extraitsDes partenaires variables selon la nature des extraits

Protéines identifiées

MAPs et moteursMAPs et moteurs MAP2, KIF21A Protéines de la famille EBProtéines de la famille EB EB1, EB2 HSPsHSPs HSP70, HSP90 Enzymes du métabolismeEnzymes du métabolisme Citrate lyase

Efficacité de la méthode

Identification de protéines liées au cytosquelette Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulairemicrotubulaire

Identification toujours en cours Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé)Grande diversité d’extraits cellulaires possibles

Purification de partenaires interférant avec Purification de partenaires interférant avec l ’assemblagel ’assemblage

Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage

Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonnePossibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes


Objectifs





Conclusions Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubulesFacteurs contrôlant l’assemblage des microtubules

Nucléation en deux étapes (oligomères ?)Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubulesDésassemblage limité par la fréquence de catastrophes

Facteurs de catastrophes = oligomères?

Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubulesstimulant la nucléation des microtubules

Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéréOligomères formés par association latérale d’environ 10 dimèresEnviron 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule

Identification de partenaires de la tubulineIdentification de partenaires de la tubulineDes partenaires identifiés « qui font sens »Identifications en cours

Perspectives

Des outils pour étudier les effecteurs du Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelettecytosquelette

Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères Recherche de facteurs de catastrophes Réalisation d’un « protéome » des partenaires de la tubuline

Transposition aux études cellulairesTransposition aux études cellulaires Effet des oligomères de nucléation dans les cellules

Documents

Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs