MISE AU POINT / UPDATE DOSSIER

Intérêt des outils d’investigation des enzymes métaboliques en pratiqueclinique

Investigation tools for metabolic enzymes in clinical practice

C.F. Samer · V. Rollason · K. Ing Lorenzini · Y. Daali · J.A. Desmeules

Reçu le 7 juillet 2013 ; accepté le 15 août 2013© Springer-Verlag France 2013

Résumé La variabilité interindividuelle dans la réponsemédicamenteuse est un problème clinique majeur. La poly-médication et les polymorphismes génétiques modulant l’ac-tivité des enzymes du métabolisme médicamenteux tels queles cytochromes P450 (CYP) sont une source de variabilitédans la réponse médicamenteuse. De nouvelles techniquesdiagnostiques rendues plus sûres et plus simples à réaliseront été développées afin de diagnostiquer les variations dansl’activité métabolique des CYP (tests de phénotypage) ou derechercher des variantes alléliques spécifiques (génotypage).Alors que le génotypage des CYP offre la possibilité de pré-dire le phénotype en fonction des allèles identifiés pourautant que le lien entre génotype et phénotype soit établi,le phénotypage apporte des informations sur l’activité réelle(in vivo) des CYP et est le reflet d’une combinaison de fac-teurs génétiques, environnementaux et endogènes. Le géno-typage et le phénotypage pourraient ainsi être considérés demanière prospective afin d’identifier la molécule idéale ou ladose adéquate à administrer chez un patient donné, ou demanière rétrospective pour expliquer une réponse médica-menteuse anormale (toxicité ou inefficacité).

Mots clés CYP450 · Pharmacogénétique · Phénotypage ·Génotypage · Interactions médicamenteuses

Abstract Interindividual variability in drug response is amajor clinical issue. Polymedication and genetic polymor-phism modulating the activity of drug metabolism enzymes

such as cytochrome P450 (CYP) are a source of variability inthe drug response. New diagnostic techniques that are morereliable and simpler to perform have been developed in orderto diagnose the variations in metabolic activity of CYP (phe-notyping tests) or to assess specific allelic variants (genoty-ping). While CYP genotyping gives the option to predict thephenotype based on the identified alleles, provided that thelink between the genotype and the phenotype is established,phenotyping provides information on true (in vivo) CYPactivity and is a reflection of a combination of genetic, envi-ronmental and endogenic factors. Thus, genotyping and phe-notyping could be considered prospectively in order to iden-tify the ideal molecule or the correct dose to administer to agiven patient, or retrospectively to explain an abnormal drugresponse (toxicity or inefficacy).

Keywords CYP450 · Pharmacogenetics · Phenotyping ·Genotyping · Drug interactions

Introduction

La variabilité interindividuelle dans la réponse médicamen-teuse est un problème majeur en pratique clinique, en parti-culier lorsque les médicaments concernés ont une marge thé-rapeutique étroite. Une méta-analyse américaine a estimél’incidence d’effets indésirables sérieux à 6,7 %, et100 000 décès par année sont dus à des effets indésirablesmédicamenteux (EIMs) [28]. Les coûts associés sont consi-dérables (100 milliards de dollars), et jusqu’à 7 % des hos-pitalisations sont dues à des EIMs en Grande-Bretagne et13 % en Suède [16,34]. Inversement, seules 25 à 60 % desthérapies sont efficaces [55].

Différents facteurs sont incriminés, qu’ils soient intrinsè-ques (âge, genre, race/ethnicité, maladies concomitantes,dysfonction d’organe) ou extrinsèques/environnementaux(tabagisme, diète, comédications) [19].

C.F. Samer (*) · V. Rollason · K. Ing Lorenzini · Y. Daali ·J.A. DesmeulesService de pharmacologie et toxicologie cliniques,hôpitaux universitaires de Genève,rue Gabrielle-Perret-Gentil-4,CH-1211 Genève, Suissee-mail : Caroline.Samer@hcuge.ch

C.F. Samer · Y. Daali · J.A. DesmeulesCentre suisse de toxicologie humaine appliquée (SCAHT),université de Genève, Suisse

Douleur analg. (2013) 26:241-247DOI 10.1007/s11724-013-0354-8

La polymédication est une source bien établie de variabi-lité dans la réponse médicamenteuse chez les populationsâgées [19]. Les interactions médicamenteuses peuventmimer des défauts génétiques (comme avec les inhibiteursdes cytochromes P450 [CYP]) ou augmenter le métabolisme(inducteurs des CYP).

La génétique est une autre source de variabilité interindi-viduelle pouvant influencer la réponse médicamenteuse. Eneffet, 60 à 80 % des médicaments commercialisés étantmétabolisés par des enzymes polymorphiques, les EIMs etl’inefficacité thérapeutique pourraient être attribués en partieà des variations génétiques au niveau des enzymes du méta-bolisme et notamment des CYP.

Afin d’évaluer l’importance clinique de ces facteurs géné-tiques et environnementaux, un certain nombre de facteursdoivent être considérés. L’impact clinique d’un polymor-phisme donné va dépendre de l’importance de la voie méta-bolique, de la présence d’un métabolite actif, de sa puissancepar rapport à la molécule mère, de la fenêtre thérapeutique dela molécule et de la présence d’autres voies d’élimination.

De nouvelles techniques diagnostiques rendues plus sûreset plus simples à réaliser ont été développées afin de diagnos-tiquer les variations dans l’activité métabolique des CYP(tests de phénotypage) ou de rechercher des variantes alléli-ques spécifiques (génotypage). Le phénotypage et/ou le géno-typage devraient permettre de mieux identifier les patients àrisque d’inefficacité ou de toxicité et offrir des outils permet-tant d’individualiser les prescriptions médicamenteuses.

Généralités sur les polymorphismes des CYPayant un impact clinique sur les traitementsmédicamenteux

Les CYP sont un groupe d’isoenzymes localisées principa-lement au niveau du réticulum endoplasmique des celluleshépatiques. Ils catalysent des réactions d’oxydation et deréduction de composés lipophiles endogènes (stéroïdes, aci-des biliaires, acides gras, prostaglandines) et exogènes(médicaments) en composés plus polaires (hydrophiles) afinde permettre leur élimination urinaire. Le génome humaincomprend 57 gènes CYP classifiés selon leur homologie deséquence en 18 familles et 44 sous-familles [35]. La familledes CYP 1 à 3 est impliquée dans le métabolisme de phase 1,alors que les CYP 4 à 51 sont associés au métabolisme desendobiotiques.

Les principaux CYP polymorphiques ayant un impactclinique sur la réponse aux traitements médicamenteux sontles CYP2D6, CYP2C9 et CYP2C19.

Bien qu’il représente 1–5 % du contenu total hépatique,le CYP2D6 est responsable du métabolisme oxydatif deplus de 25 % des médicaments couramment prescrits, telsque les antidépresseurs, les antipsychotiques, les opioïdes,

les antiarythmiques, le tamoxifène, beaucoup d’entre euxayant une marge thérapeutique étroite [15,18,57]. LeCYP2D6 est codé par un gène hautement polymorphiqueavec plus de 70 allèles et 130 variantes génétiques décrites[64]. Des variations interethniques marquées dans la fré-quence des différents allèles sont rapportées [24,32,57] et sontdisponibles dans diverses bases de données en ligne (dbSNP[69], ALFRED [60], 1000 Genomes [61]). Les individus sontclassifiés en quatre groupes phénotypiques prédits par le nom-bre d’allèles fonctionnels. Les métaboliseurs lents (poormetabolizers [PMs]) sont porteurs de deux allèles inactifs(null) entraînant une activité enzymatique absente. Ils repré-sentent 5–10 % de la population caucasienne alors que cephénotype est rare chez les Asiatiques [2,32]. En Europe,95 à 99 % des PMs sont détectés en recherchant les princi-paux allèles null, à savoir les allèles CYP2D6*3, *4, *6 et ladélétion du gène CYP2D6*5 [9]. L’allèle nul CYP2D6*4(défaut de splicing) est présent chez 12–21 % des Caucasiens,mais chez seulement 1–2 % des Asiatiques et Africains.Les métaboliseurs intermédiaires (IMs) sont porteurs d’unecombinaison d’un allèle nul ou de deux allèles défectueux.Les allèles défectueux courants sont les CYP2D6*9, *10,*17 et *41 [2]. Les IMs représentent 10–15% des Caucasiens,mais sont plus fréquents chez les Asiatiques (jusqu’à 50%) enraison de la grande prévalence de l’allèle *10, et jusqu’à 30 %chez les Africains où l’allèle *17 est fréquent. Les porteursdes duplications géniques ou multiduplications sont assignésau phénotype de métaboliseurs ultrarapides (UMs) [1–10 %des Caucasiens] [23]. Les UMs sont plus prévalents dans lespays du Sud de l’Europe (Espagne : 7–10 %, Sicile : 10 % vsSuède : 1–2 %). Les duplications géniques sont décrites chez20 % des Saoudiens et 29 % des Éthiopiens. Les métaboli-seurs normaux (extensive metabolizers [EMs]) ont une acti-vité enzymatique normale et représentent 60–85 % de lapopulation caucasienne.

Le CYP2C19 est responsable du métabolisme de médica-ments couramment prescrits tels que le clopidogrel, les inhi-biteurs de la pompe à protons (IPPs) et certains antidépres-seurs [24,58]. L’enzyme est hautement polymorphique, et àce jour au moins 35 variantes (*1B à *28) et une série desous-variantes ont été décrites, le CYP2C19*1 représentantl’allèle sauvage (wild type) [52]. En fonction de la capacité àmétaboliser la (S)-méphénytoïne ou d’autres substrats tests,les individus peuvent être catégorisés en EM, PM ou UMpour le CYP2C19 [14,49]. Les hétérozygotes EMs sont par-fois décrits comme IMs. La majorité des PMs du CYP2C19sont porteurs des variantes alléliques CYP2C19*2 et *3, quisont des allèles de perte de fonction (loss of function [LOF])[14], alors que la variante *17 est associée à un gain defonction (gain of function [GOF]) avec une activité augmen-tée [49]. Des variations interethniques dans la distributiondes différents allèles ont été mises en évidence. La fré-quence allélique du CYP2C19*2 est de 15 % en Afrique,

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de 29–35 % en Asie, de 12–15 % chez les Caucasiens et de61 % en Océanie. L’allèle CYP2C19*3 est retrouvé princi-palement en Asie (5–9 % chez les Asiatiques, moins de0,5 % chez les Caucasiens). La fréquence allélique duCYP2C19*17 est de 16 % en Afrique, de 3–6 % en Asie etde 16–21 % chez les Caucasiens [31,43].

Le CYP2C9 est impliqué dans le métabolisme des anta-gonistes de la vitamine K, des anti-inflammatoires non sté-roïdiens, des sulfonylurés, des antagonistes du récepteur del’angiotensine II et de la phénytoïne. Il est soumis à un poly-morphisme génétique, et, à ce jour, plus de 35 variantes allé-liques et un certain nombre de sous-variantes sont décrites[63]. Les deux variantes alléliques les plus fréquentes sontles CYP2C9*2 [38] et CYP2C9*3 [50]. Ces deux polymor-phismes sont associés à une réduction de l’activité duCYP2C9. Ils sont portés par 35 % des Caucasiens [26,29]mais sont relativement rares chez les populations asiatiqueset africaines [56].

Méthodes de mesure de l’activitédes cytochromes P450

Deux approches, le phénotypage et le génotypage, sontmaintenant disponibles afin d’aider à personnaliser les thé-rapies médicamenteuses à côté de la traditionnelle quantifi-cation des concentrations du médicament en circulation (the-rapeutic drug monitoring [TDM]).

Les tests de phénotypage et de génotypage sont amenés àêtre utilisés en pratique clinique pour respectivement identi-fier les variations dans l’activité enzymatique des CYP oules variantes alléliques portées par le patient.

Le génotypage permet de déterminer précisément lesséquences d’ADN individuelles en analysant les mutationsgénétiques fonctionnelles codant pour des enzymesspécifiques.

Il offre la possibilité de prédire le phénotype en fonctiondes allèles identifiés pour autant que le lien entre génotype etphénotype soit établi. Le génotypage n’est pas encore dispo-nible pour tous les CYPs, et son principal désavantage estson incapacité à mesurer l’influence des facteurs environne-mentaux tels que les interactions médicamenteuses sur l’ac-tivité enzymatique. Le phénotypage des CYP apporte desinformations sur l’activité réelle (in vivo) des CYP et pour-rait ainsi apporter des informations cliniques plus pertinentesen étant le reflet d’une combinaison de facteurs génétiques,environnementaux et endogènes [27].

Génotypage des CYPs

Les méthodes classiques de biologie moléculaire permettentl’analyse individuelle des allèles par la technique de réactionde polymérase en chaîne (polymerase chain reaction [PCR])

pour amplifier l’ADN, suivie d’une méthode de détectionpost-PCR telle que le polymorphisme de longueur des frag-ments de restriction (restriction fragment length polymor-phism [RFLP]) après hydrolyse par des enzymes de restric-tion ou grâce à des sondes fluorescentes spécifiques à chaqueallèle [10]. Ces méthodes permettent seulement d’analyserde petits sous-groupes de variantes alléliques, ce qui peutréduire la puissance de prédiction du phénotype pour cer-tains groupes de métaboliseurs. De plus, on considère quel’allèle sauvage (wild type *1) est présent par défaut, il n’estdonc pas spécifiquement recherché.

Les techniques basées sur la réaction en chaîne par poly-mérase en temps réel (real-time PCR) sont maintenant dis-ponibles pour les variantes génétiques cliniquement impor-tantes des CYP décrits plus haut, à savoir les CYP2C9, 2C19et 2D6. En fonction du nombre de polymorphismes nucléo-tidiques (SNPs) à analyser, des approches de multiplexageont également été développées. Les technologies par pucesgénétiques (microarray) offrent l’avantage de déterminersimultanément différents allèles, en plus d’être rapides etfaciles à réaliser [22].

AmpliChip CYP450 GeneChip®

L’AmpliChip CYP450 GeneChip®, développée par RocheMolecular Systems et Affymetrix, utilise une méthoded’hybridation par puces à oligonucléotides qui permet dedéterminer les génotypes des CYP2D6 et CYP2C19. Elle aété le premier outil disponible cliniquement basé sur la tech-nologie par puces génétiques et approuvé par la FDAen 2004. 15 000 sondes d’oligonucléotides sont inclusesdans la puce génétique qui permet de tester simultanémentles 20 allèles du CYP2D6 (*1, *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *9,*10, *11, *15, *17, *19, *20, *29, *35, *36, *40 et *41)ainsi que sept duplications du CYP2D6 (*1xN, *2xN,*4xN, *10xN, *17xN, *35xN et *41 xN) et trois allèles pourle CYP2C19 (*1, *2 et *3) [11].

Les cinq étapes permettant de déterminer le génotype sontles suivantes :

• amplification par PCR de l’ADN purifié ;

• étiquetage du produit amplifié ;

• hybridation du produit étiqueté à la puce génétique et fixa-tion du produit lié ;

• scanning de la puce génétique ;

• interprétation du phénotype par un logiciel à l’aide d’unalgorithme [12].

Ce test ne détermine pas le nombre exact de copies sup-plémentaires d’allèles du CYP2D6. La performance del’AmpliChip® pour prédire le phénotype du CYP2D6 a étéévaluée (n = 165), et une cohérence globale de 80 % a étéobtenue. La prédiction du phénotype a été optimale chez lesPMs (sensibilité et spécificité 100 %) et satisfaisante chez les

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EMs (sensibilité 95 % et spécificité 47 %) et les IMs (sensi-bilité 42 % et spécificité 97 %), mais des différences ont étéobservées pour la prédiction des UMs (sensibilité 6 % etspécificité 99 %) [37].

Kit de détection Luminex Tag-It Mutation

Le kit de détection produit par Luminex utilise une plateformede génotypage par puces à microsphères (microsphere-baseduniversal array) [11]. Le kit Luminex xTAG CYP2D6 a étéapprouvé par la FDA pour détecter les allèles suivants :CYP2D6 *1, *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *9, *10, *11, *15,*17, *29, *35, *41, et xN. Cependant, ce test ne spécifie pas sil’allèle est dupliqué, et il n’est pas associé à un logiciel avecalgorithme de prédiction du phénotype. Sept allèles peuventêtre détectés pour le CYP2C19 (*2, *3 et les rares *4, *5, *6,*7 et *8) et cinq allèles pour le CYP2C9 (*2, *3, *4, *5 et *6).

iPLEX® ADME

Trois tests ont été développés par Sequenom : iPLEXADME PGx, CYP2C9/VKORC1 et CYP2C19. L’iPLEXADME PGx analyse de manière simultanée 192 SNPs dans36 gènes tels que les CYP1A, 2A6, 2B6, 2C19, 2C8/9, 2D6,2E1, 3A4/5, les enzymes du métabolisme médicamenteux dephase II et les transporteurs médicamenteux. L’analyse estassurée par le système MassARRAY. Des tests ciblés (targe-ted assay panels) peuvent également être créés avec le pro-gramme Assay Explorer [67]. L’iPLEX ADME CYP2C9/VKORC1 teste un ensemble de 36 SNPs pour le CYP2C9et de neuf SNPs pour le VKORC1. L’iPLEX ADMECYP2C19 analyse 31 SNPs pour le CYP2C19.

L’essai INFINITI® CYP2C19

Ce test commercialisé par AutoGenomics utilise une puce àcapture d’hybridation avec détection automatique de pro-duits PCR multiples. L’amplification par PCR est réaliséeoffline alors que le reste du processus est automatisé parl’analyseur AutoGenomics INFINITI. Le test est disponiblesous deux formats : un ou quatre échantillon(s) par pucegénétique. Il identifie seulement les allèles CYP2C19 *2,*3, *17 et les génotypes correspondants. Le rapport du testliste les allèles et fournit le génotype détecté (type sauvage,muté, hétérozygote). Le taux de réussite du génotypage (callrate) rapporté par le fabricant est supérieur à 90 % [62].

Test de sensibilité à la warfarine eSensor®

Ce test d’hybridation de l’ADN et de détection électrochi-mique est commercialisé par GenMark et permet la détectionet le génotypage du CYP450 2C9 (*2 et *3) et du VKORC1

(-1639G>A), avec un résultat fourni en approximativement3 heures et demie [65].

Système Spartan RX CYP2C19

Ce kit identifie les porteurs de l’allèle CYP2C19*2 en utili-sant un prélèvement par écouvillon au niveau de la joue.L’échantillon est inséré dans une cartouche qui s’insèreensuite dans un instrument Spartan RX avec impression durésultat en une heure [68].

Phénotypage des CYPs

Le phénotypage d’un CYP consiste à administrer un substrattest (probe drug) métabolisé par un CYP spécifique. L’éva-luation des paramètres pharmacocinétiques du substrat test etde ses métabolites ou la mesure du ratio entre la substancemère et son métabolite (metabolic ratio) permet de définir unprofil métabolique individuel et ainsi de distinguer les indi-vidus [47].

Le phénotypage isolé implique l’administration d’unsubstrat test spécifique à un CYP, alors que le phénotypagesimultané est réalisé par administration concomitante de plu-sieurs substrats tests spécifiques (probe cocktail) et permetde détecter de manière simultanée l’activité enzymatique demultiples enzymes dans un test unique, ce qui permet d’évi-ter l’influence liée à la variabilité en fonction du temps desrésultats de phénotypage [3,5,21,25,48,59].

Divers médicaments ont été décrits comme substrats testsde phénotypage pour le CYP2D6. La débrisoquine et la spar-téine ont été fréquemment utilisées, mais des problèmes liés àleur disponibilité et leur sécurité d’emploi ont limité leur uti-lisation [51]. Récemment, le dextrométorphane a été consi-déré comme substrat test de choix pour mesurer l’activité duCYP2D6 en déterminant le ratio métabolique dans l’urineaprès huit heures [4,7,40,42]. L’oméprazole est le substrat testde choix pour le phénotypage du CYP2C19 [1,6,53]. Danstous les cocktails, la caféine est considérée comme le meilleursubstrat test pour le phénotypage du CYP1A2 [36,41,45].Divers substrats tests ont été proposés pour mesurer l’activitédu CYP3A, comme l’érythromycine, la dapsone et le corti-sol endogène. Le midazolam est également un substrat teststandard pour le CYP3A en raison de sa sélectivité et del’absence de transport par la P-glycoprotéine. Cependant,l’administration orale de midazolam ne permet pas de diffé-rencier les CYP3A4 et CYP3A5 [30,54]. Des administra-tions orale et intraveineuse du midazolam permettent demesurer sélectivement l’activité des CYP3A4/5 hépatiqueset intestinaux. Différents substrats tests ont été proposés pourmesurer l’activité enzymatique du CYP2C9, à savoir la war-farine, le tolbutamide, le losartan et l’ibuprofène [33]. Pour le

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CYP2B6, l’Agence européenne du médicament (EMA)recommande l’utilisation du bupropion [17].

Le désavantage majeur du phénotypage qui a par le passélimité son utilisation est la survenue d’effets indésirables etd’interactions pharmacocinétiques/pharmacodynamiquesentre les substrats tests quand des doses thérapeutiques sontutilisées. La probabilité de telles interactions et d’effets indé-sirables est maintenant minimisée par l’utilisation de dosesréduites de ces substrats tests (microdoses). Les microcock-tails utilisant des microdoses de chaque substrat test ont ainsiété développés.

Un autre désavantage des méthodes de phénotypage est larécolte d’échantillon qui peut être fastidieuse. Ainsi, pour laplupart des cocktails validés, il y a nécessité de prélever plusd’un échantillon sanguin et de collecter l’urine sur huit heu-res au moins. Des méthodes de prélèvements alternativessont maintenant développées et optimisées afin d’améliorerle confort du patient et de réduire la quantité de liquide bio-logique prélevé. Récemment, la procédure de prélèvementpar papier buvard (dried blood spot [DBS]) a été validéepour évaluer l’activité du CYP2C9 en utilisant le flurbipro-fène comme substrat test [8]. Cette procédure offre l’avan-tage d’être moins invasive, d’offrir un meilleur rapportcoût/efficacité et de permettre un transport et un stockagefacilités par rapport aux méthodes classiques de prélèvementde sang veineux [13]. En raison de son caractère moins inva-sif et du faible volume de sang requis, la procédure par DBSest parfaitement adaptée à l’évaluation de la pharmacociné-tique d’un médicament dans une étude clinique ou à celle del’activité enzymatique [46].

Conclusion

Le phénotypage et le génotypage des CYP sont deux nou-veaux outils dans l’arsenal diagnostique du clinicien quidevraient permettre d’aider à personnaliser les thérapiesmédicamenteuses. Le phénotypage des CYP offre l’avantaged’être le reflet d’une combinaison de facteurs génétiques,environnementaux et endogènes. Le génotypage est moinsinvasif et plus facile à réaliser. En identifiant les variationsdans l’activité enzymatique ou les variantes alléliques desCYP, ces tests permettent déjà de diagnostiquer de manièrerétrospective une cause pharmacocinétique à une réponsethérapeutique anormale (inefficacité ou toxicité) chez unpatient donné. Ces nouvelles techniques diagnostiques, plussûres et plus simples, devraient permettre un diagnostic plusrapide des variations métaboliques et à moindre coût.

De meilleures issues thérapeutiques en fonction dubagage génétique du patient ont été mises en évidence dansles domaines oncologique, cardiovasculaire, de la psychia-trie et de la douleur en termes de choix du traitement et/oud’adaptation de dose, de sorte que les thérapies individuali-

sées sur la base de facteurs génétiques deviennent une réalitéproche [20,39]. De plus, les agences de régulation améri-caine et européenne (FDA et EMA) ont reconnu l’impor-tance clinique de la pharmacogénétique et développé desrecommandations pour l’industrie concernant la soumissionde données pharmacogénomiques avec les nouveaux médi-caments. Elles recommandent maintenant de mettre à jourles informations professionnelles des médicaments quanddes données convaincantes sont disponibles [44].

Une connaissance détaillée de la pharmacologie est tou-tefois un prérequis pour leur utilisation en pratique clinique,et les médecins peuvent avoir des difficultés à interpréterla valeur clinique des données pharmacogénétiques. Desrecommandations d’adaptation de dose fondées sur les géno-types validées par des experts du domaine sont ainsi progres-sivement publiées. Elles sont mises à jour de manière pério-dique sur la ressource en ligne PharmGKB [66].

L’utilisation du phénotypage et du génotypage des CYPdevrait ainsi se généraliser en pratique clinique afin de maxi-miser l’efficacité des thérapies tout en réduisant les risquesde toxicité.

Conflit d’intérêt : les auteurs déclarent ne pas avoir deconflit d’intérêt.

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