I Bull. SOC. Chim. Belg., 58, pp. 301-309, 2 fig., 1949 I I

La chromatographie sur papier des acides a chlores

Une nouvelle voie simple et rapide permettant d’6tablir la formule de structure de dipeptides

Marcel RENARD (LiBge)

R f s ~ i ~ f . - On a BtudiP la chromatographie sur papicr des acidm

1” Le rapport chloracCtique et u-chlorpropionique. Cette etude fait ressortir quc :

inm parcouru par lc front dc l’acide mm parcouru par le front du solvant

augmente avcc la quanIit6 d’acide sc trouvant d a m la gouttc dCposCc1 au sommet du papier ;

2 O Dans le cas de melange dc ccs deux acides, l‘acide chloracetique exerce une action de deplacemcn t sur I’acide a-chlorpropionique.

L’utilisation de ces donnCes jointe 21 l’eniploi de la reaction d u melange HCI-HNO, concentrCs montrc, par son application h l’alanyl- glycine, que cet ensemble permet de dhelopprr une methode simple et rapide d ’identiiication des dipeptides.

Nous donnons, dam ce mfmoire, les premiers resultats d’une etude que nous avons entreprise pour mettre au point une mkthode simple et rapide de determination de l’enchai- nement des acides aminks dans un dipeptide, mCthode utili- sant la reaction de transformation du groupement NH, en groupement C1 que nous avons prec6demment 6tudi6e [ 11 .

Pour Btablir la structure d’un dipeptide, il ne suffit pas en effet de savoir que les deux acides amin6s qui le constituent sont par exemple l’alanine et la glycine, mais il faut encore pouvoir determiner quel est l’acide dont le groupement NH, est libre ; le dipeptide peut en effet avoir la formule A-G ou G-A, soit

0 //

CH,. CHNH,. C-NH-CH,.COOH (A-G)

302 ou

&I. RENARD

0 /

CH*NH,*C-NH-CH-COOH . I

CH, ((3-A)

Le developpement de mCthodes permettant de rCsoudre facilement cette question apparalt actuellement indispensable si l’on veut progresser dans le domaine de l’analyse des pro- thines, et reaemment, Sanger [2] d’une part, Consden, Gor- don et Martin [3] d’autre part, ont propose de telles methodes, le premier se basant sur la formation de derives dinitroph6- nyles, les seconds sur la reaction de Van Slyke.

La reaction du melange acide chlorhydrique-acide nitrique concentrks sur les acides amines qui comme on le sait trans- forme le NH, libre en C1 pouvait en principe permettre de resoudre Cgalement le probkme de faqon simple dans les cas oh elle est applicable. Si l’on envisage, en effet, la structure d’un dipeptide soit l’alanylglycine, cette reaction donnera, en presence d’une faible quantitC d’acide nitrique, la transforma- tion partielle du dipeptide en son d6rivC chlorC correspondant, soit

0 //

CH,.CHNH,.C-NH-CH,*COOH + HCI + HNO, 0

= CH,. CHC1. C-NH-CH, * COOH. //

L’hydrolyse de ce compose donnera CH, - CHCl * COOH -+ CHZNH, * COOH

et celle du dipeptide non transform6

CH, * CHNHZ - COOH + CHZNH, COOH . L’acide chlore est extrayable h l’Cther, tandis que les acides

amines ne le sont pas. Cette extraction donnera donc une solu- tion BthCrCe contenant l’acide chlore correspondant h l’acide amin6 qui dans le dipeptide a son NH, libre. Si l’on traite a nouveau le residu aqueux de l’extrait ether6 par un peu d’acide nitrique concentre, on aura maintenant la transformation des deux acides aminks en acides chlorCs et par extraction h 1’6ther on obtiendra une solution contenant les deux acides chlorhs

CHROMATOGRAPHIE DES ACIDES Cc-CHLORfiS 303 correspondant aux deux acides amin6s constitutifs du dipeptide.

Le problhme se r6sumait donc A pouvoir d6celer facile- ment la nature de l’acide ou des acides chlor6s obtenus en solution ethhree, et cela pour des quantiths aussi faibles que possible. La m6thode de chromatographie sur papier develop- pee par Consden, Gordon et Martin [4], nous a paru h ce sujet la mieux adaptbe et nous nvons donc commench 1’Ctude de l’application de cette technique & l’identification des acides chlorCs.

Nous avons Btudi6 les deux premiers termes de la shrie soit les acides chloracCtique et a-chlorpropionique.

La presence de I’acide sur le papier est dPcel6e h l’nide d’une solution dilu6e de mbthylorange.

Deux faits importnnts sont mis en lumibre par cette etude. Dana les conditions oil nous avons travail16 :

1. La valeur de

) mm parcouru par le front de I’acide mni parcouru par le front du solvant

depend pour ces acides de la quantit6 presente dans la goutte d6pos6e dans le haut de la bande de papier filtre. (Le mCme fait a 6th signal6 par Elsden [5] dans le ci1S des acides simples.)

2. Dans le cas de m6lange des deux acides, l’acide chlor- acetique exerce sur l’ncide z-chlorpropionique une action de d6placement qui conduit & obtenir pour ce dernier une valeur de R plus grande que si la m&me quantite d’acide a-chlorpro- pionique se trouvait seule dans la goutte.

Le problhme de la dhtermination de la structure d’un dipeptide ne demandant que des renseignements qualitatifs, ceux-ci sont facilement obtenus en tenant compte de l’inten- sit6 de la tache observee et de la valeur de R. On peut d’ail- leurs confirmer cette conclusion en d6posant d’abord sur le papier une goutte contenant line faible quantith de l’ncide suppos6, puis au m&me endroit une goutte de la solution exa- minee; on ne doit obtenir qu’une seule tache et une valeur de R plus grande. Si on dCpose d’abord sur le papier une faible quantit6 d’un acide autre que celui supposC puis la solu- tion, on obtiendra alors deux taches et les valeurs de R qui leur correspondent permettront d’ailleurs de nouveau In v6ri- fication du premier resultat. Nous montrerons par son appli- cation A I ’alanylglycine que cette m6thode permet effective- ment d’obtenir trhs simplement et trbs rnpidement les

304 M. RENARD

indications necessaires pour 6crire la formule du dipeptide en question.

Nos experiences mont,rent de plus que la variation de R en fonction de la quantite d’acide presente dans la goutte conduit, pour de faibles quantitb, & estimer avec une bonne approximation cette quantitk. Elle est susceptible de fournir pour des quantites de l’ordre de 10 30 y une methode de determination quantitative des acides chlores.

Nos experiences indiquent Bgalement que pour les acides chlores au del& de l’acide a-chlorpropionique, le methylorange ne constitue plus un indicateur suffisamment sensible ; il faut pour donner plus de gen6ralit6 & la methode rechercher d’autres indicateurs.

C’est dans les deux voies que nous venons d’indiquer que nous poursuivons nos recherches.

PARTIE EXPI~RIMENTALE

Le papier utilist? est le papier Whatman no 4, decoupt? en bande de 3 cm de large et 29 cm de long. On vaporise sur la bande une solution aqueuse dilu6e de methylorange. On place ensuite les bandes pendant 15 h 18 heures dans une enceinte saturee de vapeur d’eau. On depose alors h 1,5 cm des bords lat6raux et h G cm du bord superieur du papier, l’aide d’une pipette de Linderstroem-Lang, une goutte (4 mms) de solution. On dkveloppe le chromatogramme. Ce d6veloppement est effec- tu6 dans un exsiccateur ordinaire de 25 cm de diametre interieur. Le dispositif utilis6 est schCmatis6 dans la figure 1.

Comme on le voit, nous effectuons un chromatogramme ascendant (8 cm) puis descendant (8 cm) selon la technique de R. J. Block [6].

Avec l’exsiccateur utilise, on peut effectuer trois chromatogrammes h la fois.

1.e papier est plong6 dans le solvant sature d’eau sur une hauteur

BACVETTE DEVERRE

WUTTE DE SQLUTiON

SDLVANT SNRE D’EAU

FIG. 1.

CHROMATOGRAPHIE DES ACIDES a-CHLOR88. 305 de 3 cm. Dans ccs conditions, ct pour une avance du front du solvant Pgale A 16 cm, le dkveloppement du chroinatogramme demande 60 70 minutes.

L’exsiccateur est placB dans unc cage fcrmke ob la tempBrature s’est maintenue a 2Z0+Zo.

Lorsque les quantitCs d’acide utilibCes sont faibles, 5 y d’acide chlor- acbtique, 20 A 30 y d’acide a-chlorproFionique, la tache rouge qui dBcBle la presence de I’acide n’apparait pas toujours nettement quand on sort le papier de l’exsiccateur. Pour mettre celle-ci facilement en Bvidence, il suffit de laisser &her le papicr ( 3 minutes) et de le vaporiscr a nou- veau avec la solution aqueuse de inbthylorange. Marquer alors le front de la tache par un trait de crayon, car la coloration disparaft assez rapidemen t.

Recherche de paires de solvants convenables

Celle-ci a 6t6 faite B l’nide d’un melange d’acides chlor- achtique, a-chlorpropionique, a-chlorisoval6rique et a-chloriso- caproi‘que.

Les piiires alcool butylique-eau, alcool hexylique-eau, ne permettent pas une separation convenable ; il en est de m&me de la paire chloroforme-eau, m&me en y adjoignant des pro- portions variables d’alcool butylique.

La paire t6trachlorure d’adtylbne-eau &pare assez bien les deux premiers acides, mais pas les suivants ; il en est de m&me pour la paire &her isopropylique-eau.

Les paires dichlorBthylbne-eau et tetrachlorure de carbone- eau donnent des rdsultats plus satisfaisants et permettent une s6paration nette des quatre constituants. Dam la suite de nos expdriences, nous avons utilis6 la paire dichlor6thylkne-eau qui donne la meilleure s6paration pour les deux premiers acides.

Pour les acides chlores, In tache tend ?I s’dtendre vers l’ar- riere et ceci d’autant plus que la (pantit6 d’acide utilisde est grande ; le front de l’avance de la tilche reste cependant tou- jours trbs net, c’est ce front que nous avons mesur6.

Dans les premiers essais, nous avons laisst? le solvant par- courir 20 cm ; nous avons cependant constat6 qu’une bonne s6paration Btait d6ji r6alisCe aprks un cheminement du sol- vant Bgal B 16 cm. Nous avons donc dans les essais suivants limit6 le dhveloppement i 16 cm.

306 M. RENARD

VALEURS DE R

Quantitd dam In goutte Acide chloracdtique Acide a-chlorpropionique T R Intensite R Intensit4

- f - 5 0909

10 0,145 mf

30 Q,22 F 0,36 40 0,245 F 0,41 80 09% F 0,56

20 0,195 F 0729

f = faible ; mf = moyennement forte ; F = forte.

f f

mf F

Mhlange d’addes chloracCtique et u-chlorpropionique

La figure 2 resume les resultats obtenus (courbes C,

510 20 W 40 8 o x

FIG. 2. Courhe A : Acide chlorac6tique wul. Courbe B : hcide a-chlorpropionique seul. Courbe C : h i d e a-chlorpropionique en

presence de 10 ‘I d’acide chlorac8tiquc. Courbe D : Acide achlorpropionlque en

pdsence de 20 7 d’acide chlorac8tique. Courhe E : Adde a-chlorpropionique en

presence de 40 7 d’acide chlorac4tiqr:r

Ces courbes montrent nettement l’action de deplacement

CHROMATOGRAPHIE DES ACIDES a-CHLORES 307 produite par I’acide chloracetique dont les diffdrentes quan- tit& donnent, elles, les mbmes valeurs de R que celles de la courbe A. Cet effet n’a plus guhe d’influence pour 80 y d’acide a-chlorpropionique, les valeurs de R trouv6es pour cette quantite d’acide en presence de 10, 20 et 40 y d’acide chloracCtiyue oscillent en effet entre 55 et 57.

La limite de sensibilite est atteinte pour 20 y d’acide a-chlorpropioniyue quand il se trouve seul, mais en presence d’acide chloracktique, l’effet de d6placement exerce par ce dernier permet de retrouver facilement 10 y d’acide a-chlor- propionique. Cet effet de d6placement au point de vue analy- tique est favorable, il permet en effet de deceler de faibles quan- tit& d’acide a-chlorpropionique m&me en presence de fortes quantitCs d’acide chloracktique. En effet, les deux valeurs de R Ctant trhs voisines pour 80 y d’acide chloracetique et 20 y d’acide a-chlorpropionique, on pourrait craindre de n’avoir pas une s6pnmtion suffisante pour pouvoir distinguer les deux taches ; or l’expdrience donne deux taches bien marquCes avec R=0,283 et 0,368 ; bien plus, en deposant sur le papier 80 y d’acide chlorac6tique et 10 y d’acide a-chlorpropionique, les deux taches sont de m&me trbs nettement sBpar6es avec R = 0,274 et 0,332.

Recherche de la structure d’un dipeptide

Nous sommes partis d’alimylglycine. On phse 100 mg d’alanylglycine que l’on introduit dans un tube a reaction. On ajoute 2 cms de HCl concentre et 0,032 cms de HNO, concen- tr6. On surmonte le tube d’un refrigerant ascendant et on chauffe 20 minutes au bain-marie. On plonge ensuite le tube dans l’eau bouillante pendant 2 heures. On laisse refroidir, on extrait avec 2 cms d’6ther. On pr6lhve la solution BtherBe I’aide d’une pipette r6unie A un appareil permettant de Crt5er une dEpression convenable. On ajoute 2 cms d’hther et on extrait A nouveau. On reunit les extraits 6thBres (E. E. I) . On chauffe prudemment la solution restant apres extraction pour Climiner l’ether, on ajoute 1 cm’ de HC1 concentre et 0,032 cms de HNO, concentre. On chauffe 15 minutes au bain-marie, on laisse refroidir. On extrait par 4 cms d’Cther que l’on enleve et a nouveau par 2 cm’ d’6ther. On reunit les extraits BthCrds (E. E. 11).

308 M. RENARD

Chromatographie des extraits 6th6r6s

a) E.E. I

endroit deux gouttes (22) de 1’E. E. I. On dCpose sur le papier une goutte ( 3 ) ou au meme

2 R=0,337 1 o,335 2 R=0,332 zz R=0,456.

Ces deux valeurs indiquent qu’il s’agit d’acide a-chlor- propionique, elles correspondent respectivement B 263 et 51 y d’acide a-chlorpropionique.

b ) E. E. I1

MCme mode operatoire.

5 R=0,112 1 0,175 et 0,284. 22 R=0,175 et 0,2X m R=0,175 et 0,287

Ces valeurs indiquent qu’il s’agit d’acides chlorac6tir;ue et a-chlorpropionique ; elles correspondent respectivemelit B 7 et 16 y d’acide chlorac6tique et 13 y d’acide x-chlorpropio- nique.

Le fait qu’il en est bien ainsi peut Ctre facilement dCmon- tr6 par les experiences de contrble suivantes :

a) E.E. I 1. On depose sur le papier au mCme endroit 10 y d!acide

chlorachtique et une goutte de 1’E. E. I

R=0,162 et 0,375,

soit 13 y (10) d’acide chloracetique et 28 y (26) d’acide a-chlorpropionique.

2. MCme mode op6ratoire pour 20 y d’acide a-chlorpro- pionique et une goutte de 1’E. E. I

R = 0,417 , soit 42 y (46) d’acide a-chlorpropionique.

L’E. E. I renferme donc hien de l’acide a-chlorpropio- nique et peut-&re une trhs faible quantitd (1 B 2 y) d’acide chlorac6tique.

CHROMATOGRAPHIE DES ACIDES a-CHLORES 309

b ) E. E. I1

chloracbtique et deux gouttes de 1’E. E. I1

R=0,213 et 0,306,

soit 26 y (26) d’acide chloradtique et 14 y (13) d’acide a-chlorpropionique.

2. MBme mode op6ratoire pour 10 y d’acide z-chlorpro- pionique et deux gouttes de 1’E. E. I1

1. On depose sur le papier au m&me endroit 10 y d’acide

R=0,16? et 0,351,

soit 14 y (16) d’acide chlorachtique et 23 y (23) d’acide a-chlorpropionique.

L’E. E. I1 renferme donc bien les acides chloracetique et ct- chlorp ropioni que.

Les deux acides amin6s constitutifs du dipeptide sont donc la glycine et I’alanine, de plus c’est l’alanine qui a son NH, lihre (E. E. I ) , le dipeptide est donc l’alanylglycine.

La formule de ce dipeptide a pu ainsi Btre Btablie six heures aprhs la pesEe de la prise d’essai.

* * *

Nous adressons au Fonds national de la Recherche scien- tifique nos sinceres remerciements pour l’aide qu’il nous a fournie au cours de cette recherche.

Bibliographie

11 M. RENARD, MCm. S O C . roy. Sciences de Lidge, 4e ser., t. VII (1946). 21 F. SANGER, Bioch. J . , 39, 507 (1945). 31 R. CONSDEN, A. H. GORDON, A. J. P. MARTIN, Bioch. J., 4i, 694 (1947). 41 R. CONSDEN, A. H. GORDON, A. J . P. MARTIN, Bioch. J . , 38, 226 (1944). 61 S . R. ELSDFN, Bioch. J., 40, 252 (1946). 61 R. J. BLocK, Communication personnelle.

UNIVERSITB DE LI~GE, Laboratoire d e Chirnie organique.