La PCR en temps réelLa PCR en temps réel

Exemple d'utilisation au laboratoire Exemple d'utilisation au laboratoire de Bactériologie de l'hôpital Pellegrinde Bactériologie de l'hôpital Pellegrin

Sabine PereyreSabine Pereyre

PCR conventionnelle

TaqTaq

Dénaturation (95°C)

Hybridation des amorces

Elongation (72°C)

30 - 35 cycles

ADN, amorces, dNTP, Taq pol

PCR conventionnelle

1- Extraction (manuelle ou automatisée)

2- Amplification

3- Révélation : Electrophorèse sur gel d'agarose (1-2%)

Taq Taq

+

-

Cinétique de la PCR

Cinétique de la PCR

Phase exponentiellePhase plateau

- Haute précision pendant la phase exponentielle- Variabilité importante à la phase plateau

PCR en temps réelPCR "classique"en point final

PCR conventionnelle versus en temps réel

PCR en temps réel

Basée sur la détection d'un "reporter" fluorescent Signal proportionnel à la quantité d'amplicons Signal détecté "en temps réel"

1- Extraction (manuelle ou automatisée)

2- Amplification et détection synchroniséeSystème fermé, pas de manipulation post-amplification

● Rapidité

● Faible risque de contamination

PCR conventionnelle versus en temps réel

PCR conventionnelleGel d'agarose

PCR en temps réelCourbe de fluorescence

PCR en temps réel - Quantification

Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité de produit amplifié Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification

Ct ( Cycle threshold) = nombre de cycle d'amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement significatif par rapport au bruit de fond (valeur seuil).

Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré

Seuil fixé au

dessus du bruit de fond

Dér

ivée

de

la f

luo

resc

ence

Nbre de cycles

Ct

Quantification – courbes de calibration

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40

Nombre de cycles

Flu

ores

cen

ce é

mis

e (U

A)

101106 105104

103 102

Nom

bre

de

cop

ies

(log

)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38

Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998

Ct 1

Echantillon Inconnu : Ct =25

Génération de la fluorescence

1- Agent se liant à l'ADN double brin :

● STBR Green I

2- Utilisation de sondes

● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman

● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance

Energy Transfert)

● Molecular Beacons (balises moléculaires)

Principe du SYBR Green I

= Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente lorsqu'il est lié à l'ADN double brin

hעF

Après amplification

F

ADN double brin

hע

Avant amplification

SYBR Green

Le SYBR Green en solution émet peu de fluorescence

Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN double brin naissant, entraînant une augmentation de la fluorescence

Principe du SYBR Green I

L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation(l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)

SYBR Green Avantage - Inconvénients

Avantage- Economique- Facile d'utilisation- Pas d'expertise particulière pour le design de sondes fluorescentes- Non affecté par des mutations de l'ADN cible (qui affectent l'hybridation des sondes spécifiques)

Inconvénients- La spécificité repose entièrement sur les amorces- Faux positifs, surestimation de la quantification (le SYBRgreen se fixe à n'importe quelle molécule d'ADN double brin y compris des produits non spécifiques ex : dimères d'amorces, mauvais appariements)

Analyse de la courbe de fusion indispensable

Analyse de la courbe de fusion

- Chaque produit d'amplification est caractérisé par son Tm (température de fusion = melting temperature)= température pour laquelle 50% de l'ADN double brin est dissocié

- Le Tm d'un produit d'amplification est mesuré en suivant l'évolution de la fluorescence lorsque la température augmente

- Deux produits de PCR diffèrent par leur Tm il est possible de détecter des produits non-spécifiques, des dimères d'amorce

Analyse de la courbe de fusion

Température °C

Déri

vée d

e la

flu

ore

scen

ce

Tm =87°C

SYBR Green

Nombre de cycles Température °CFlu

ore

scen

ce

Flu

ore

scen

ce

Courbe de fusionCourbe d'amplification

Ct : quantification Tm : spécificité du produit d'amplification

Génération de la fluorescence

1- Agent se liant à l'ADN double brin

● SYBR Green I

2- Utilisation de sondes

● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman

● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance

Energy Transfert)

● Molecular Beacons (balises moléculaires)

Sondes Taqman - Principe

Hybridation d'une sonde spécifique

Composition de la sonde ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5'Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein

● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

pas d'émission de fluorescence

Cette méthode repose sur deux principes :- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)- l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

Spécificité des amorces pour la PCR Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

5’

5’

3’

3’

FP

RP

Reporter Quencher

FAM, VIC TAMRA

Sondes Taqman - Principe

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R Q

Lumière

- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),

pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

Sondes Taqman - Principe

- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde libération du reporter

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R

Q

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R

Q

- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

La fluorescence est proportionnelle aux taux d'hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d'amplification

Sondes Taqman

Avantage : - Spécificité accrue

Spécificité des primers pour la PCRSpécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

- Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents

Inconvénient :- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

● Utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires d'une séquence cible

- Une sonde marquée en 3' par un marqueur fluorescent, qui émet une fluorescence verte - Une sonde marquée en 5' par un fluorochrome accepteur, qui émet une fluorescence rouge

● Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible proximité des fluorochromes Transfert d'énergie fluorescence rouge

En solution, bruit de fond de fluorescence verte

Pendant l'hybridation, fluorescence verte

FRET

Dénaturation Hybridation

Elongation

L'acquisition du signal se fait pendant l'hybridation. L'accroissement de fluorescence rouge est proportionnel à la quantité d'ADN synthétisé

Molecular beacons

= sonde d'hybridation en épingle à cheveux appelée balise moléculaire- Une boucle : séquence complémentaire d'une séquence cible de l'ADN- Deux bras de séquences complémentaires- Un fluorochrome émetteur (ex : FAM, ROX, TET)- Un fluorochrome suppresseur, non fluorescent. Il dissipe l'énergie de l'émetteur en chaleur (FRET)

Fluorochrome émetteur Fluorochrome suppresseur = quencher

Molecular beacons

1- Dénaturation

2- Hybridation

3- Elongation

La sonde s'hybride préférentiellement à sa séquence cible complémentaire sur la matriceEmission de fluorescence

balises libres : pas de fluorescence

Libération de la balise : pas de fluorescence

Molecular beacons

Avantages - Très spécifique : détections des SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

Si la séquence cible ne correspond pas parfaitement à la balise moléculaire, pas d'hybridation donc pas d'émission de fluorescence (formation en épingle à cheveux thermodynamiquement plus stable)

Inconvénient - Difficulté du design des sondes d'hybridation

Les appareils de PCR en temps réel

LightCycler (Roche Diagnostics)

Utilisation de fins capillaires en verre permettant une optimisation des échanges thermiques

Rotor de 32 places

GeneAmp 5700 et Prism 7000 (Applied Biosystems)

GeneAmp 5700 ABI Prism 7000

Réactions en plaque de 96 puits

COBAS Taqman (Roche Diagnostics)

(48 tests)

COBAS Taqman 48

Icycler (BioRad)

Réactions en plaque de 96 puits

MX4000 (Stratagene) et Rotor Gene (Corbett Resesarch)

MX4000 Rotor Gene

SmartCycler (Cepheid)

Tubes réactionnels conçus pour optimiser les échanges thermiques et la sensibilité optique Chaque tube peut fonctionner avec un programme indépendant

Principaux appareils de PCR en temps réel

Avantages PCR en temps réel /PCR conventionnelle

PCR conventionnelle PCR temps réel

Préparation de l'échantillon (lyse de l'organisme, purification des AN)

Manuel

Automatisé

Manuel

Automatisé

Amplification et détection Plusieurs étapes

Système ouvert

Intégré

Simultané

Système fermé

Système de détection Gels

Radio-isotopes

Enzymes

Fluorochromes

Temps d'analyse 4h à 48h 20 min à 2h

Taux de contamination Moyen à fort Faible

Taux de quantification 2-3 log 5-6 log

Reproductibilité Bonne intra-labo

Mauvaise inter-labo

Grande (théoriquement)

Traçabilité Détection, enregistrement et analyses intégrés

Coût Gel : 4-5 euros SYBR Green : 4-5 euros

Sondes : 10 euros

1- Diagnostic bactériologiquePCR qualitative ou quantitative

2- Etude de la résistance aux AB

3- Typage bactérien (génotypage)

Apport de la PCR en temps réel en Bactériologie

1- Diagnostic bactériologique

Exemple 1: Mycoplasma pneumoniae (TP jeudi)

- Bactérie responsable d'infections respiratoires chez l'enfant et l'adulte jeune

Culture difficile, peu sensible, en 3 semaines Antibiotiques classiquement utilisés (β-lactamines) inactifs A Pellegrin

Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic)PCR en temps réel Taqman sur ABI Prism 7700, gène de l'adhésine P1

Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100ème, 1/1000ème

pur10-1 10-2 10-3

En rouge : patient positif pour M. pneumoniae

Patient

Diagnostic bactériologique

Exemple 2 : Chlamydia trachomatis (TP vendredi)

- Bactérie responsable d'infections génitales souvent inapparentes chez l'homme et la femme. Complications: stérilité féminine

Bactérie intracellulaire culture cellulaire difficile

A Pellegrin- Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic)- PCR en temps réel Taqman sur COBAS Taqman

Diagnostic bactériologique

Exemple 3 : Neisseria meningitidis (méningocoque)

- Bactérie responsable de méningites graves. Diagnostic et traitement antibiotique sont une urgence vitale. Nécessité d'une prophylaxie pour l'entourage (AB ou vaccin)

la culture bactérienne nécessite 24 heures

A Pellegrin

- Culture classique- PCR en temps réel SYBR Green (gène ctrA, Pr de mb externe)

Amplification du gène ctrA de N. meningitidis

Témoin + patient

Témoin + patient

eau

Diagnostic bactériologique à Pellegrin

Germes GènesPrincipaux

échantillonsExtraction Amplification1 Intérêt

M. pneumoniaeAdhésine P1

(P de mb)Respiratoires MagNA Pure TaqMan Culture difficile

C. pneumoniaePMP4

(P de mb)Respiratoires

MagNA Pure TaqMan Culture exceptionnelle

C. psittacciIncA (P mb d'inclusion)

respiratoires MagNA Pure TaqmanCulture facile mais secteur protégé P3

C. trachomatisPlasmide cryptique

Génitaux

UrineMagNA Pure

-COBAS Amplicor

-Taqman (COBAS Taqman)

Culture difficile (cellulaire)

M. genitalium Adhésine MgPaGénitaux

Urine

MagNA Pure SYBR Green puis

TaqmanCulture impossible

M. tuberculosis (BK) ARNr 16SRespiratoires

LCR, diversKit COBAS

COBAS Amplicor (PCR ELISA pt final)

Culture très lente

N. meningitidisctrA (P de mb

externe)LCR Manuelle2

SYBR Green Diagnostic d'urgence

B. pertussis

B. parapertussis

IS 481

IS 1001Respiratoires MagNA Pure SYBR Green Culture difficile

S.aureus (+/- mecA)Fragment sa442

mecASouche isolée Manuelle2 SYBR Green

Si identification difficile

PCR universelle 16S (pt fragment bactérien)

ARNr 16SPrélèvements

diversManuelle2 ou MagNAPure

SYBR GreenContrôle

d'extraction

PCR universelle 16S (grand fragment)

ARNr 16S Souche isoléeManuelle2 ou MagNAPure

SYBR GreenIdentification bactérienne

1Amplification par PCR en temps réel sauf COBAS Amplicor 2Extraction manuelle avec un tampon de lyse (Triton, Tween, Tris-EDTA) Ebullition 10 min centrifugation surnageant

2- Etude de la résistance aux antibiotiques

Exemple : Etude de la résistance à la clarithromycine chez H.pylori

H.pylori : bactérie responsable de l'ulcère gastro-duodénalClarithromycine: AB utilisé en association en 1ère intention

Résistance par mutation ponctuelle d'une base de l'ARNr23S, cible de cet AB (20% des souches)

A PellegrinPCR en temps réel, FRETsur Lightcycler

FRET: Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible proximité des fluorochromes Transfert d'énergie fluorescence rouge

- S'il y a une mutation sur l'ADN cible, la sonde (rouge) est moins bien hybridée- Si on augmente la température, elle se détachera plus facilement

Mutation

Réalisation de courbes de fusion

2- Etude de la résistance aux antibiotiques

Mismatch(mutation)

Hybridationparfaite

Température

basse moyenne élevée

Fluorescence Pas de fluorescenceFluorescence si hybridation parfaite

mais pas si mutation

Sauvage

AAAACAAAG

AGA

Mutations

Si mutation, le Tm est plus faible

Technique réalisable directement à partir des biopsies gastriques

3- Typage bactérien

- Typage bactérien : identifier les différents "types" ou les différentes souches d'une espèce bactérienne

- Intérêts nombreuxEx : identifier une épidémie liée à une même soucheEx : identifier un type plus virulent, résistant aux AB , etc…

Exemple : typage des souches de méningocoque à Pellegrin

- Il existe plusieurs sérogroupes : A, B, C, Y, W135 Des vaccins existent contre les sérogroupes A, C, Y, W135 mais pas contre le sérogroupe B

- Objectif du typage : si diagnostic de N. meningitidis, peut-on vacciner les sujets contacts? Si oui, avec quel vaccin?

Détermination du sérogroupe de N.meningitidis

- Amplification du gène siaD (biosynthèse de la capsule des sérogroupe B, C, Y et W135) ou ou mynB (biosynthèse des polyosides de capsule du sérogroupe A).

- Amorces spécifiques, différentes selon les sérogroupes

- PCR temps réel SYBR Green sur ABI prism 7000 durée 2-3 heures

Recherche du sérogroupe B

Témoin +

patient

Recherche du sérogroupe C

Témoin +patient

Confirmation : analyse de la courbe de fusion

Témoin +

patient

Recherche du sérogroupe W135

Témoin +

patient

Conclusion

Avantages de la PCR en temps réel● Automatisation ● Rapidité● Spécificité● Sensibilité● Faible risque de contamination

Place dans un laboratoire de Bactériologie● Diagnostic de bactéries non ou difficilement cultivable● Diagnostic d'urgence● Etude de la résistance aux AB de bactéries difficilement cultivables● Typage moléculaire