La spermatogenèse et les souris mutant-t

• -comment arriver à produire des millions de spermatozoïdes par jour

• -comment assurer que les gamètes sont égaux

• -les mutants où les gamètes ne sont pas égaux: une piste pour comprendre la spermatogenèse

Spermatogenèse

• 15% de couples n’arrivent pas à avoir un enfant: 50% des problèmes proviennent des mâles.

• La spermatogenèse dépend de 3 types de cellules• -cellules germinales• -cellules de Sertoli• -cellules de Leydig

• La spermatogenèse est sous contrôle de 2 hormones:• -FSH agit sur les cellules de Sertolidifférentiation cellules

germinales• -LH agit sur les cellules de Leydigtestosterone productionlibido,

développement sexuel

Régulation Hormonale

Spermatogenèse murine

Les tubules seminifères

La structure des spermatozoïdes

Les protéines Ropporin et Rhodolphin se trouvent dans le queue associés avecles microtubules et les G protéines ( Rho etc).

Les malformations des spermatozoïdes

Les chromosomes X et Y pendant la spermatogenèse

• Crossing-over obligatoire pour les paires d’autosomes pendant la méiose: un check-point

• Pareil pour les chromosomes X et Y: région pseudoautosomal sur les 2 chromosomes: souris X0 sont stériles

• La transcription des gènes sur le chromosome X arrête pendant la méiose, la transcription des autosomes continue

• Peu de gènes sur le chromosome Y; sur le chromosome X beaucoup de gènes qui s’expriment au début de la spermatogenèse.

• Fin de la spermatogenèse il faut que les protéines encodés par le chromosome X se trouvent dans toutes les cellules y compris la moitié qui manque le chromosome X

• AKAP4: le déplacement des spermatozoïdes dépend de cyclic AMP et l’activité de cette molécule dépend des kinases. Les kinases se trouvent dans la structure des spermatozoïdes. AKAP4 est un gène sur le X qui assure la bonne distribution des kinases dans les spermatozoïdes

• Les gènes sur le X sont de bons candidates pour les gènes à l’origine des problèmes de fertilité chez l’homme.

Spermatogenèse et l’apoptose

Les cellules de Sertoli sont essentiels pour le développement des cellules germinales.

-rapport nombre cellules Sertoli/nombre cellules germinales important

Souris transgenique pour Bcl-2 ( anti-apoptotic) stérile

Avec des souris non-transgenique: marquage avec anticorps Bax ( pro-apoptotic) montre un vague d’apoptose à 3 semaines. Le nombre de cellules germinales est réduit par 80%

Le rôle des cellules de Sertoli est capital pour la spermatogenèse.

Pas de système in vitro à cause de cette interaction très étroite

Les gènes avec les empreintes génomiques

• Certains gènes s’expriment à partir du chromosome paternel ou maternel et pas les deux.

• A la fécondation un embryon XY aura des chromosomes qui proviennent de la mère avec des empreintes femelle.

• Pendant la spermatogenèse il faut remplacer les empreintes femelle avec des empreintes mâles

• Les empreintes sont changés chez des spermatocytes: histoire de changer les patrons de méthylation.

Comment étudier la spermatogenèse?

• Pas de système in vitro où on peut faire différencier les cellules germinales en spermatozoïdes

• -purification des cellules sur les gradients de BSA

• -Souris mutants ( Tfm, Sxr, Steel)• Steel: Pas de cellules germinales• Sxr: Spermatagonie• Tfm: Spermatagonie, 1° spermatocytes

• -souris à des ages différents

Développement poste natal des cellules germinales

• Jours poste natal Cellules présentes• 0 jours Spermatogonie• 9 jours 1° Spermatocytes• 1st division méiotique • 18 jours 2° Spermatocytes• 2nd division méiotiquecellules haploides• 20 jours Spermatides rondes• 25 jours Spermatides allongés• 35 jours Spermatozoïdes

L’expression de l’information génétique pendant la spermatogenèse

• 1. Est-ce que les gènes continuent d’être exprimé après la méiose?

• 2. Quel est le rôle des ponts cytoplasmiques qui existent entre les cellules germinales?

• 3. Comment c’est possible d’avoir la différenciation des spermatozoïdes en même temps que l’empaquetage de l’ADN

Criblage différentiel pour identifier les gènes qui s’expriment après la meiose

• Banque ADNc de testicule de la souris adulte• ARN des testicules des souris de 2 semainessonde ADNc • ARN des testicules des souris de 3 semainessonde ADNc

• Criblage de la banque avec les deux sondes

• Identification des clones qui s’allument avec la sonde de 3 semaines mais pas avec la sonde de 2 semaines

• Vérification des résultats par Northern blot

Expression des gènes: la suite

• Un nombre important de gène s’exprime pendant et vers le fin de la méiose• La majorité de ces gènes sont encore exprimés dans les spermatids

• Hypothèse: un ‘re-programming’ du génome pendant la méioseexpression des gènes essentiels pour la différentiation des spermatozoïdes.

• Expression de beaucoup de gènes qui probablement n’ont pas de rôle important dans la vie des cellules germinales

• Expression des nouveaux isoformes: e.g. Pgk-2, sur le chromosome X

• Comment assurer que tous les spermatozoïdes sont ‘égaux’ si les gènes sont toujours exprimés après la meiose:

Le rôle des ponts cytoplasmiques

• Est-ce que les molécules peuvent traverser les ponts cytoplasmique?• Souris transgénique pour un gène qui code pour l’hormone de croissance sous

contrôle du promoteur qui s’exprime fin de la méiose. Une copie intégré dans le génome.

• +/tr méiosespermatides + et spermatides tr

• Marquage avec un anti-corp ante-GH: GH présente dans toutes les cellules. • Soit la protéine peut traverser les ponts cytoplasmiques• Soit l’ARNm peut traverser les ponts cytoplasmiques• Soit les deux: in situ pour faire la différence?

• En plus: la protéine AKAP4, protéine structurelle présente dans les spermatazoïdes, encodé sur le chromosome X est exprimé uniquement dans les cellules post-méiotique.

• XY spermatides X et spermatides Y: il faut AKAP4 dans les deux.• L’ARNm en association avec TB-RBP ( testis-brain RNA binding protein) traverse les

ponts cytoplasmiques

Testis-Brain RNA Binding protein

• ARNm en combinaison avec TB-RBP important pour empêcher la traduction et pour le transport dans les cellules germinales

• Même problème chez certaines cellules neuronales

• E.g. Les motoneurones: les ARN m sont produits dans le corps cellulaire, les protéines sont produites fin des axons, souvent très longs. TB-RBP doit assurer que ces ARNm ne sont pas traduits dans le corps cellulaire mais dans les projections cellulaires.

Un lien entre la transcription et le transport des ARNm

• Les transcrits des gènes qui montrent un décalage entre transcription-translation fixent la protéine TB-RBP

• La transcription de ces mêmes gènes dépend d’un facteur de transcription appelé ACT

• ACT se trouve dans le cytoplasme et est transporté dans le noyau pour activer la transcription

• KIF17b: kinesin, testis-spécifique ( isoform de la kinesin neuronale KIF17, essentiel pour le transport des récepteurs des neurotransmetteurs)

• KIF17b est essentiel pour le transport de ACT dans le noyau• KIF17b se trouve dans un complèxe avec les ARNm/TB-RBP

associé avec les microtubles • Donc KIF17b active l’expression des gènes et assure le transport

des transcrits • e.g. AKAP4 via les ponts cytoplasmiques.

La protamine

• La protamine remplace les histones pendant l’empaquetage de l’ADN

• Les transcrits du gène sont présents 20 jours après la naissance

• La protéine est détectée 8 jours plus tard• Les séquences essentielles pour ce décalage

sont dans le 3’UTR• Faire la transgenèse avec des transgènes

chimères pour identifier les séquences• Expression précoce stérilité

Décalage transcription/traduction

• Chromatographie d’affinité pour trouver des protéines qui se fixent sur les 3’UTR

• Protamine Binding Protein isolé.• Souris KO pour cette protéine: Regarde l’expression de transgène

GH-3’UTRPr ( GH-Hormone de Croissance, pas exprimé normalement dans les cellules germinales).

• Pas d’expression précoce et pas de traduction plus tard.• Modèle: contrôle en deux étapes: une protéine se fixe sur le 3’UTR

pour empêcher la traduction. Le rôle de PBP est de déplacer cette protéine pour permettre la traduction

Les mi-RNA et la régulation post-transcriptionnel

miR-469 et la régulation de la traduction des ARNm de la Protamine et les Transition Proteins

• Les souris KO pour GRTH (Gonadotropin-regulated testicular RNA helicase) sont stériles: absence de la production de plusieurs protéines essentielles pour la spermatogenèse

• Les souris KO pour GRTH ont une expression plus élevée du miR-469

• Les séquences reconnues par miR-469 sont présentes dans la partie codante des ARNm de Protamine et Transition Proteins

• Modèle: miR-469 s’exprime et se fixe sur les ARNm pour empêcher leur traduction. GRTH empêche l’expression de miR-469 et les ARNm peuvent être traduits.

• L’action des mi-RNA dépend du site où ils lient l’ARN: partie codanteempêche la traduction. Non-codantedegradation

Inactivation du chromosome X pendant la spermatogenèse

• L’inactivation du chromosome X se fait chez les femelles

• La réactivation du chromosome X se fait pendant la gamétogenèse chez les femelles

• Le chromosome X est aussi inactiver pendant la gamétogenèse chez le mâle

-Pendant la méiose les chromosomes homologues forment des synapses . Les synapses se forment aussi entre le chromosome X et le

chromosome Y dans la partie PAR ( pseudo-autosomal region).

-Absence des synapses mène à l’arrêt de la méiose : système pour assurer que tous les chromosomes soient présents.

Le fait que l’appariement entre le X et le Y est partiel est probablement la raison pour lequel il faut inactiver Les hommes et les

souris XYY ou avec des translocations du chromosome X sont souvent stérile car ils n’arrivent pas à inactivé ces séquences

-Le gène Xist s’exprime pendant la spermatogenèse mais les souris où Xist est inactivé peuvent toujours inactivé le X.

-Dès que la méiose est terminé ( spermatides rondes) l’organisation de la chromatine du chromosome X change-plus ouvert-mais juste 13% des

gènes qui codent des ARNm sont exprimes après la méiose.

-A la différence de l’inactivation du X dans les cellules XX il n’y a pas des gènes qui codent des ARNm qui s’échappent. 360 gènes testé.

Par contre 67 sur 77 miRNA sont exprimés après l’inactivation du X.

Une corrélation entre les miRNA gènes qui échappent et la présence sur le X des îlots de H3K4me3, associé avec la chromatine active.

On explique les gènes qui échappent dans les cellules XX par la présence d’un homologue sur le Y. Le même argument ne tient pas pour MSCI car les 2 chromosomes sont inactivés.

Les miRNA pourrait jouer un rôle dans l’inactivation. A) les miRNA sont essentiels pour la mise en place de la heterochromatinisation du X et B) les miRNA sont impliqués dans la régulation de l’expression des ARNm qui codent pour les protéines essentiels pour MSCI.

L’observation récente que Dicer est essentiel pour l’inactivation du X dans les cellules femelles montre un lien en commun.

Male sex chromosome inactivation ( MSCI)

a

Y-Box proteins

• Y-box proteins: famille de protéines qui se fixent sur l’ARN et l’ADN

• MSY2: 0,7% de la protéine totale dans les cellules germinales, majorité dans le cytoplasme

• In vitro l’interaction entre MSY2 est les ARNm est non-spécifique

Par contre immunoprécipitation des ARNm sous forme de polyribosomes montre que la majorité des ARNm qui fixe MSY2 ne sont pas dans les polyribosomes ( donc subissent un contrôle niveau de la traduction).

Y-box proteins-suite

• Les gènes qui codent pour les ARNm qui fixent le MSY2 contiennent un MSY2 site dans leur promoteur

. Transgèniques: Promoteur SP10, avec ou sans site MSY2, avec GFP. MSY2 site dans le promoteurARNm n’est pas présent dans les polyribosomes.

• La présence d’un site MSY2 dans le promoteur marque le transcrit pour stockage.

• KO du gène MSY2-transcription, épissage normal mais des transcrits normalement absents des polyribosomes sont présents.

Spermatogenèse murine

Le complèxe-t de la souris

• 1% du génome de la souris, sur le chromosome 17• Présence des gènes qui touchent à:

• -le crossing over• -le développement des embryons• -la fertilité des souris mâles ( mais pas les femelles)

• Les informations qui proviennent de ces expériences ont:• -donné des nouvelles idées sur la base de la fertilité mâle• -montré comment les mutations défavorables pour un individu

peuvent être favorable pour une population

L’organisation du complèxe-t

Clonage de Tcp-1 et Tcp-11

• Cell 14, 44-56 1986

• Molecular cloning and sequence analysis of a haploid expressed gene encoding t complex polypeptide 1

• Keith R. Willison, Keith Dudley and Jean Potter Chester Beatty Laboratories Institute of Cancer Research Fulham Road, London SW3 6JB, UK

Mech Dev. 1994 Jul;47(1):73-80. – The mouse t-complex gene, Tcp-11, is under translational control.– Hosseini R, Ruddy S, Bains S, Hynes G, Marsh P, Pizzey J, Dudley K.– Developmental Biology Research Centre, Randall Institute, King's College, London,

UK.

– Bioessays. 1999 Apr;21(4):304-12. Links

• New insights into the t-complex and control of sperm function.• Fraser LR, Dudley K.• Anatomy and Human Biology Group and Developmental Biology

Research Centre, London, United Kingdom. lynn.fraser@kcl.ac.uk

La mutation tufted tf

TRD Chromosome 17

TRD

Haplotypes partiels

• La recombinaison entre les t-chromosomes et les chromosomes sauvages est réduite dans la région du complèxe-t

• Les crossing-overs qui ont lieu donnent des haplotypes partiels avec une partie de la région du complèxe-t dans le forme t

• On peut utiliser les haplotypes partiels pour identifier les régions qui contiennent les distorters et les responders

• Les haplotypes partiels sont connus par les gènes létales

Distorters et Responder des t-mutants

TRD

Late mating experiments

L’accouplement se fait vers minuit juste après la libération des ovocytes: la fécondation se fait quand l’ovocyte est encore haut dans le système reproductif

On mettant le mâle avec la femelle plus tard ( vers 04H00) la fécondation se fera quand l’ovocyte est déjà descendu une partie des trompes utérine.

TRD peut être réduit ou éliminé

Deux possibilités:-en réduisant la distance nagé par les spermatozoïdes les spermatozoïdes t ne

sont plus supérieur-en réduisant la distance on réduit le temps que les spermatozoïdes passent

dans les trompes utérines

Spermatazoide t v spermatazoide +Course à la nage

• Accouplement entre une souris mâle t/+ et une femelle +/+

• 4 heures après l’accouplement isole les trompes uterines et les couper en tranches

• Isoler les spermatazoides, isoler l’ADN• Southern blot avec une sonde qui donne une

polymorphism

• En bas des trompes: + = t• Milieu des trompes: t>+• Haut des trompes: t>>+• Fort probable que les t nagent plus vite que les +

Mixed inséminations

• TRD:• Mâle t/+ x femelle +/+ 95% t/+ 5% +/+

• Fécondation avec des spermatozoïdes provenant de 2 mâles différents

• Mâles t/+ et +/+ x femelle +/+ 50% t/+ 50% +/+

• Les spermatozoïdes t sont supérieurs par rapport aux partenaires méiotique mais ne sont pas supérieurs par rapport aux spermatozoïdes provenant des souris sauvage.

• Conclusion: les cellules germinales portant le chromosome t peuvent endommager les cellules germinales sauvages

Identification des gènes et des protéines impliqués dans le TRD

• 1. Analyse des protéines dans les cellules germinales des souris sauvages et t. Par gel en 2 dimensions 10 protéines polymorphiques.

• 2. Séparation des cellules germinales pour voir dans quelles cellules les protéines s’expriment.

• 3. Criblage des banques de spermatids etc.

4. Localisation des gènes avec des haplotypes partiels: candidats pour les distorters et responder• 5. Micro-dissection des chromosomes avec des

translocations• 6. Analyse des banques de données

Identification du gène responder

• Un gène qui est candidat pour le responder doit:

• -se trouve dans la bonne région génomique

• -s’exprime dans les cellules germinales

• -être polymorphique ( niveau séquence ou expression) entre les souris t et les souris +

• -agir comme un responder chez des souris transgèniques

Identification du Responder :1.

• Le reponder se trouve où dans le complexe-t?

• Utiliser les haplotypes partiels

• Un haplotype qui manque le responder n’est pas transmis à une pourcentage élévée

• Chercher les gènes candidats ( ilots CpG etc).

Identification du Responder: 2

• Sur les chromosomes t on trouve un gène de fusion.

• Fusion d’une kinase qui agi sur les protéines ribosomales avec un kinase appelé Smok ( sperm mobility kinase). Ce gène de fusion s’appele TCR.

• Smok est présent sur les chromosomes + et t: peut phosphoryler les microtubles

Identification du Responder: 3

• TCR s’exprime où?

• Utilisant l’hybridation in situ: expression dans les spermatides allongés, après la meioise. Smok s’exprime de la même manière.

• Activité enzymatique de TCR est 10 fois MOINS que l’activité de Smok ( test in vitro de la phosphorylation des microtubules).

Test pour l’activité Responder

• Utilise une souris transgènique pour TCR: le TCR se trouve sur le Y

• Croisement avec une femelle qui porte les distorters mais pas le responder.

• La présence du TCR sur le Y devrait favoriser la transmission de ce chromosome.

• 80% des souris nées sont des mâles.• Importance economique

Smok Kinase et TRD

G proteinsTagap1=GTPase activating proteininhibition of RhoA

Fgd2=Guanine exchange factoractivation of Rho?

Identification d’un gène candidat pour le distorter 1

Identification de la région où se trouve le distorter avec des partial haplotypes 

Fragments génomiques utilisés pour cribler les banques cDNA

Tagap : T-cell activation Rho GTPase activating protein : GAP protein

GAP proteins : augmente l’activité GTPase des protéines G ce qui réduit leur activité

Tagap a probablement comme cible Rho A

4 copies du gène chez les mutants t : une seule chez les wild-type.

Exprimé à partir de 7 jours dans le testis et dans la majorité des autres tissus.

Expression plus fort chez les mutants-t

Sur-exprime Tagap pour voir si on augmente la distortion. Utilise les souris t6 : elles manquent le distorter 1. Le

transgène Tagap augmente la distortion.

KO pour Tagap et ensuite croisement avec les t6 : moins de distortion par rapport à une croisement avec une

souris sauvage.

Le gène SD chez la drosophile code pour une protéine G

Identification of Tcd-1• Modèle : Rho A est un inhibiteur

de Smok kinase.• Rho A est inhibé par Tagap

(GAP protéine) donc Tagap augmente l’activité de Smok kinase

• Fort expression du gène Tagap dans les cellules qui portent le chromosome t MAIS les protéines sont partagées grâce aux ponts cytoplasmique donc Smok est activée dans toutes les cellules

• Tcr, présente uniquement dans les cellules t réduit l’activité de Smok. Tcr ne peut pas traverser les ponts cytoplasmique

Distorter 2

• Gènes candidats grâce aux haplotypes partiels

• Exprimé à partir de 7 jours dans les cellules germinales: expression moins forte plus tard

• Glycine dans la version t remplacé par serine dans la version sauvage ( serine souvent phosphorylé).

Distorter 2

• Le gène s’appelle Fgd2: guanine exchange factor (GEF)• Activateur des protéines Rho

• Northern blot: 2 transcrits: le plus long plus abondant chez les souris t: le plus court plus abondant chez les sauvage

• Quantification des transcrits: même nombre de transcrits donc plus de protéine complète et moins de protéine courte ( dominant-negative)_chez les souris t.

Distorter 2

• KO du gène • Fgd2/- mâle X th49/th49 femelle Fgd2/th49 -/th49

• Fgd2/th49 x +/+ 47% th49/+

• -/th49x+/+ 35% th49/+

• KO Fgd2 réduction de transmission

Hermann Bauer et al. Genes Dev. 2007; 21: 143-147

Le rôle des distorters

Socio-biologie du complexe-t

• 1. 2 grandes inversions très peu de recombinaison• 2. Peu de recombinaison beaucoup de mutations• 3. Mutations dans des gènes de fertilité mâle mâle

stérile. • 4. Très mauvaise pour la population des souris: 1 mâle

s’occupe de 40 femelles• 5. Sélection pour des mutations qui tuent des mâles

pendant l’embryogenèse réduction du nombre de souris qui porte le chromosome t

• 6. Sélection pour des mutations impliqués dans le TRD augmente le nombre de souris t.

Les inversions dans le complèxe-t