UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP -DAKAR

FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARIVlACIEi'"

ANNEE 1991

LES HEPATITES NON-A NON-B :DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE ET ETUDE EPIDEMIOLOGIGUE'

A DAKAR ET DANS SA REGION

soutenue le 26 janvier 1991

par

Madame Aminata 5ALL/ r ----, ---=, !. ONSEll AFRICAïN~ '- "" '-, -,

i POUR l'ENSEIGNEM MAtGACH~,: C. A. MES ENT SUPERIEUR!

1... - OUAGAD 1

Arr;v~e 2.J .ADU.r .1995 OUGOU!Enregistré ~OUSn. - ' f

MEMBRES DU JURY~~~" '," 'H. D'1' ~: '1, 3' . ,:

Président ~ M. René NDOYE, Professeur

Membres: M. Amadou Moustapha SOW, Professeur

M. Doudou BA. Professeur

M. Lamine DIAKHATE, Professeur

M. Abibou SAMB, Professeur

Directeur de Thèse: M. Jacques PILLOT, Professeur

Co-directeur: Docteur Bernard LEGUENNO

Invité: Docteur Jean-Pierre DIGOUTTE

Ce travail a été réalisé avec l'aide d'un contrat de recherche

DREP n° 90/071 en collaboration avec

- L'Institut Pasteur de Dakar (service virologie médicale)

- L'Institut Pasteur de Paris (service immunologie microbienne)

- L'hôpital Antoine Béclère Clamart (service immunologie)

JE DEDIE CE TRAVAIL

- A mon MARI

Ta patience et ta compréhension sont inestimables. Sans cesdeux qualités qui te glorifient, ce travail n'aurait jamaispu être réalisé avec autant de sérénité et de lucidité.

Ce travail est donc le tien.

- A mes PARENTS

Que de sacrifices consentis pour la réussite de vosenfants !Puisse ce travail vous donner satisfaction et vous procurerde la joie.

- A ma soeur Aïssatou SALL, et à mon frère Cheikh T. SALL

In memoriam.

- A mes enfants

- A toute ma famille

- A toute ma belle-famille

- A mes amies Tout particulièrement Mme DIENG Khady SECK etMme DIOP Awa GUEYE

A NOS MAITRES ET JUGES

Toutes VOS ,critiques et vos suggestions seront bienacceptées.

Votre ardeur et votre passion du travail font de vous desEtres appréciés.Vos réalisation scientifiques font de vous des Hommesrespectés.Vous êtes donc des juges dignes de ce nom.

Au Professeur Jacques PILLOT

- Directeur de l'Unité d'Immunologie MicrobienneInstitut Pasteur Paris

- Chef du Service de Bactériologie-Immunologiede l'Hôpital Antoine BECLERE

- Professeur de Microbiologie à la Faculté deMédecine de l'Université Paris VI

Vous nous avez accueilli dans vos Laboratoires et permis laréalisation de ce travail que vous avez dirigé avecbienveillance et enthousiasme.Votre support financier et technique ont été indispensablesà son accomplissement.Soyez-en remercié et soyez assuré de mon admiration.

Au Docteur Bernard LEGUENNO

- Chef du Service de virologie Médicale del'Institut Pasteur de Dakar

Vous nous avez accueilli dans votre service plusieurs annéesdurant.Vos conseils et suggestions tout au long de ce travail ontété d1un grand apport.En témoignage de mes remerciements.

JE REMERCIE

- Tout le personnel du laboratoire d'analyses biologiques del'Institut d'Hygiène Sociale tout particulièrement Mme DIOP SataDIAGNE pour sa participation à l'étude expérimentale.

Tout le personnel du laboratoire de Pharmacologie/Physiologie de l'UCAD plus particulièrement le Professeur BabacarFAYE, et Mme DIENG Cathy FAYE.

- Toute l'équipe de Physiologie Médicale de l'UCAD.

Le personnel du laboratoire d'immunologie de l' HôpitalAntoine BECLERE et tout particulièrement :

Mme LAZIZI Yamina auprès de qui j'ai trouvé un soutien moral etscientifique sans faille durant mes multiples séjours en France.

Mme Liliane KEROS

Mme Solange D' AZAMBUJA, Mme Marie José BRIANTAIS, Serge, Edi the"Marie Françoise.

- Le personnel du laboratoire d'Immunologie Microbienne del'Institut Pasteur de Paris, en particulier Hakima, Bernadette,Agathe.

L'équipe du Département Informatique de l'ENSUT toutparticulièrement Mr CORENTHIN et Mr BASSENE.

- Toute la famille BLOT pour leur sincère amitié

-p L A li

INTRODUCTION

SITUATION DU PROBLEME

PREMIERE PARTIE = DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE E :MISE AU POINT D'UN TEST DE DEPISTAGE DES SUJETS INFECTES PAR LEVHE

ETUDE EXPERIMENTALE SUR L'ANIMALDU VHE AU SINGE.

1 - Matériel et méthode2 - Résultats3 - Tests d'inoculations croisées

TRANSMISSION

PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES ET MARQUAGE

1 - PREPARATION DES IgG ANTI VHE A PARTIR DE SERUMS DESUJETS INFECTES PAR LE VHE.

1) Matériel

2) Méthode

II - SEPARATION DES ANTICORPS ANTI VHE DE SINGESPAR METHODES CHROMATOGRAPHIQUES

1) - Préparation des IgM anti VHE

2) - Préparation des IgG anti VHE

3) Controle de pureté des IgM et IgG préparées

4) - Concentration desÉ.·,:immunoglobulines préparéeset déterminat~~r~e-l~:t~neur en proteines.

III - MARQUAGE DES IgG FRACTIONNEES' { (~'1;, \\ "::.\

1) - pour immunoe\z}mol~e / '1:C', """ ,~'/.,,<:".~"

a) marquage à la,p$r.oxy~ase, ,t>~r:;lJpe.' . •

b) marquage a la oe-'t?a,""'galactosldase

2) - pour immunofluorescence.

3) - Controle du marquage.

METHODES ANALYTIQUES

RECHERCHE DES ANTICORPS ANTI VHE DANS LES SERUMS DE SINGES

- Etude de la réaction immunoglobuline fluorescentesur coupe de foie de singes infectés

RECHERCHE DE L'ANTIGENE VHE DANS LES SELLES DESUJETS INFECTES :

l - par microscopie. électronique

II - par culture cellulaire

III - par techniques immunoenzymatiques

DEUXIEME PARTIE : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C = ETUDECRITIQUE DES METHODES DE DETECTION DES ANTICORPS ANTI HCV.

A - METHODES DE DETECTION DES ANTICORPS ANTI HCV

1) Points communs

2) Points différentiels

B - ETUDE DE LA SPECIFICITE DES TESTS DE DETECTION

1) Méthode

2) Résultats.

TROISIEME PARTIE : ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DES HEPATITES NA NB ADAKAR ET DANS SA REGION

A - RECHERCHE DE L'HEPATITE E DANS UNE POPULATION DESUJETS ATTEINTS D'HEPATITE AlGUE

1) Méthode

2) Résultats

B - ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C

1) Détermination de la prévalence du portage desanticorps antiHCV dans la population générale

2) Détermination de la prévalence du portage desanticorps antiHCV chez les donneurs de sang.

3) Recherche des facteurs de risque de portage desanticorps antiHCV

4) Evaluation du risque de transmission del'hépatite C pour 100 unités de sangtransfusées par rapport à d'autres maladiestransmissibles par voie parentérale

QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION GENERALE

CINQUIEME PARTIE CONCLUSION

SIXIEME PARTIE : BIBLIOGRAPHIE.

AgHBs

AgVHE

BSA

B W

CMV

DEAE

DO

EBV

EDTA

ELISA

E l A

Fc

HIV

IgM

IgG

ITCF

K D

Kb

NANB

NANBNC

NaBH4

ONPG

OPD

PAGE

PBS

PEG

- LISTE DES ABREVIATIONS -

Antigène Australia

Antigène du virus de l'Hépatite E

Bovin serum Albumin

Bordet Wassermann

cytomegalovirus

Diethylaminoéthyl

Densité optique

virus d'Epstein Barr

Sel de l'acide éthylène diamine tétracétique

Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

Electro Immuno Assay

Partie constante de l'IgG

Human Immunodeficiency Virus

Immunoglobuline type M

Immunoglobuline type G

Isothiocyamate de fluorescéine

Kilodalton

Kilobase

non-A, non-B

non A, non B, non C

Borohydrure de Sodium

Ortho nitrophényl Bêta galactopyrannoside

Ortho phénylène diamine

Electrophorèse en gel de polyacrylamide

Phosphate buffer salin

Polyethylène glycol

PCR

SGOT

SGPT

SOD

VCA

VHA HAV

VHB

VHC

VHE

YF

Polymérisation Chain Reaction.

Sel de l'acide glutamo-oxaloacétique

Sel de l'acide glutamo-pyruvique

Superoxyde dismutase

Antigène Viral Capsidiaire

Virus de l'Hépatite A

Virus de l'Hépatite B

Virus de l'Hépatite C

Virus de l'Hépatite E

Yellow Fever (fièvre jaune)

- LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES-

Tableau 1 Le virus de l'Hépatite Ccaractéristiques

Principales

Tableau 2 situation taxonomique probable du virusde l'Hépatite C

Tableau 3 : Principales caractéristiques du VHE

Tableau 4 Diagnostic par soustraction des Hépatitesnon A, non B

Tableau 5 Résultat des selles de malades de Constantinepar méthode d'immunocapture des IgM

Tableau 6 Résultat des selles de malades de Constantinedans le système THjSpH avec des IgG marquées àla péroxydase

Tableau 7 Résultat des selles de malades de Constantinetestées dans les systèmes THjSpH avec des IgGmarquées à la Bêta galactosidase

Tableau 8 Résultat des selles de malades de Constantinedans le système TSjSpS avec des IgG marquées àla péroxydase

Tableau 9 Résultat des selles de malades de Constantinetestées dans le système TsjSpS avec des IgG marquéesà la Bêta galactosidase

Tableau 10

Tableau Il

Tableau 12

Tableau 13

Tableau 14

Tableau 15

Résultat des selles de Constantine testées dans lesystème TsjSpS avec comme liquide de saturation lelait écrémé à 4 %

Recherche de la protéine Fv dans les sellespositives de malades de Constantine

Résultat des selles de Constantine après passagesur immunoadsorbant

Réexamen des selles de malades de Constantineaprès passage sur immunoadsorbant d'IgM monoclonale

Résultat des selles de Bangkok après passage surimmunoadsorbant

Résultat du contrôle de spécif~cité de la réactionimmuno-enzymatique par recherche de l'antigène VHE

Tableau 16

Tableau 17

Tableau 18

Tableau 19

Tableau 20

Tableau 21

Tableau 22

Tableau 23

Tableau 24

Tableau 25

Tableau 26

Résultat du contrôle de la spécificité de laréaction immuno-enzymatique par réactionsd'inhibition

Résultat du contrôle de la spécificité de laréaction immunoenzymatique par réactionsd'inhibition avec des IgM et avec des IgG

Résultat du contrôle de la spécificité de laréaction immunoenzymatique par des réactions témoins

Résultat du contrôle de la spécificité des méthodesde détection du VHC

Résultat de la recherche des marqueurs viraux dansles sérums de sujets DAKAROIS atteints d'Hépatiteaiguë

Résultat de la recherche des anticorps anti HCVdans les serums de sujets atteints d'Hépatite aiguëà DAKAR

Résultat de la recherche de l'AgVHE dans lesselles de sujets atteints d'Hépatite aiguë à DAKAR

Résultat de la recherche de l'AgVHE dans les sellesde sujets atteints d'Hépatite aiguë à DAKAR aprèspassage sur immunoadsorbant

Résultat de la recherche des facteurs de risquede portage des anticorps antiHCV à DAKAR

Résultat de la recherche des anticorps antiHCVen relation avec des marqueurs indirects desHépatites

Propriétés physico-chimiques et biologiques desagents responsables des Hépatites NANB

- FIG URE S -

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Evolution des transaminases chez le singe témoinSI

Evolution des transaminases chez le singe témoinS2

Evolution des transaminases chez le singe témoinS3

Figure 4 Evolution des transaminases chez le singe témoinS4

Figure 5 Evolution des transaminases chez le singe PATAS S5inoculé avec l'extrait de selles chloroformé

Figure 6 Evolution des transaminases chez le singe PATAS S6inoculé avec l'extrait de selles non chloroformé

Figure 7 Evolution des transaminases chez le singecercopithèque S7 inoculé avec l'extrait de selleschloroformé

Figure 8 Evolution des transaminases chez le singecercopithèque S8 inoculé avec l'extrait de sellesnon chloroformé

Figure 9 Evolution des transaminases chez le singe S9 aprèsinoculation croisée

Figure 10 Evolution des transaminases chez le singe S10 aprèsinoculation croisée

Figure Il Résultat du fractionnement des anticorps antiVHE surS300

Figure 12 Evolution de la "proteine Fv" chez le singe (parrapport au SGPT)

Figure 13 Evolution de la protéine Fv chez le singe (parrapport au SGPT)

Figure 14 Evolution de l'AgVHE chez le singe S8 (par rapportau SGOT)

Figure 15 Evolution de l'AgVHE chez le singe S8 (par rapportau SGPT)

Figure 16 Histogramme de répartition de la prévalence desanticorps antiVHE en fonction de la tranche d'âge

Figure 17 Cinétique de l'évolution des anticorps antiVHC enfonction du temps (séroconversion précoce)

Figure 18 Cinétique de l'évolution des anticorps antiVHC enfonction du temps (séroconversion tardive).

INTRODUCTION

si de nombreuses infections virales sont susceptibles de

provoquer des hépatites, le vocable "hépatite virale" a surtout

été réservé aux hépatites A et B qui se différencient par des

critères cliniques, épidémiologiques et étiologiques.

En effet depuis la découverte de l'antigène Australia (AgHBs)

par BLUMBERG et collaborateurs en 1967 (13), et la visualisation

du virus de l'hépatite A au microscope électronique en 1973 (27),

les agents viraux de ces deux types d'hépatite sont actuellement

bien connus; et des tests très performants pour la caractérisation

des virions ou de leurs antigènes, ou la mise en évidence

d'anticorps spécifiques furent mis au point.

c'est dans ce contexte que l'on s'est rendu compte, que des

agents viraux, autres que le virus de l'hépatite A (VHA) ou le

virus de l'hépatite B (VHB) , étaient à l'origine d'hépatites

transmissibles donc infectieuses, qui jusque là, échappaient au

diagnostic biologique.

De telles hépatites furent groupées sous le nom d'''hépatite

non-A non-B".

Mais il convient de préciser que ce groupe bien que très

hétérogène exclut néanmoins :

- les hépatites bactériennes,

- les hépatites parasitaires,

- les hépatites médicamenteuses

les hépatites auto-immunes et même

les hépatites virales dues au cytomégalovirus, ou au virus

d'Epstein Barr, ou encore au virus Delta.

Très rapidement, des données épidémiologiques, virologiques

et cliniques ont permis d'individualiser deux formes d'hépatites

non-A non-B (39-48-70-77-89).

La première ressemble à l'hépatite A ; elle est transmise par

voie entérale, est dénuée de tout risque de chronicité ; elle est

surtout fréquente dans les pays sous développés où elle est

responsable de morbidité et mortalité accrues chez la femme

enceinte au troisième trimestre de la grossesse (3-23-26-49-57-64-

1

80) .

L'agent causal récemment découvert est dénommé VHE (17) et

l'on parle alors d'hépatite E.

La seconde forme ressemble à l'hépatite B elle est

essentiellement transmise par voie parentérale (5-14-32-40-41) et

évoluerait vers la chronicité dans 50 à 80 % des cas (50-66-68)

aboutissant à la cirrhose et au cancer primitif du foie (12-81).

Plusieurs agents en seraient probablement responsables i mais le

principal, identifié récemment, a été dénommé VHC par la majorité

des auteurs, et l'on parle alors d'hépatite C~

si l'identification du VHC et du VHE constitue à l' heure

actuelle un progrès décisif pour la santé publique, le diagnostic

biologique des infections correspondantes pose encore problème.

En effet, les tests de dépistage des sujets infectés par le

VHC ou le VHE, sont à l'état de recherche pour l'hépatite Ei alors

que pour l'hépatite C, nous disposons à l'heure actuelle de tests

immuno-enzymatiques, qui détectent les anticorps dirigés contre un

antigène exprimé lors de l'affection par le virus C (anti HCV) dans

le sérum ou le plasma. Mais ces tests posent des problèmes de

spécificité et les sérologies positives doivent être interprétées

avec prudence lorsque le sérum contient des immuncomplexes, dans

les cas de dysglobulinémie, et même dans certaines affections avec

dysfonctionnement hépatique.

Ce sont ces deux problèmes majeurs qui nous ont conduit :

1- à la mise au point d'un test de dépistage des sujets

infectés par le VHE.

2- à une étude critique des tests de détection des anticorps

antiHcV, avant d'entreprendre l'étude épidémiologique des hépatites

NA NB à Dakar et dans sa région.

2

SITUATION DU PROBlEME

Depuis de nombreuses années déjà, et grâce à la microscopie

électronique, les agents responsables des hépatites A et B sont

bien connus.

Le virus de l'hépatite A ou VHA est un virus de très petite

taille, non enveloppé et dont l'information génétique est portée

par un génome à ARN. Il détermine une virémie de courte durée, de

deux à trois semaines. Pendant cette période le virus est excrété

en abondance et uniquement dans les matières fécales, ce qui

détermine un mode de contamination féco-orale autour du suj et

atteint, du fait des conditions d'hygiène précaires. L'immunité

conférée par ce virus est très stable.

Le virus de l'hépatite B ou VHB est très différent. Sa partie

centrale comprend un déterminant antigénique appelé HBc et un

·génome à ADN qui porte l'information génétique. Ce virus est

enveloppé et son enveloppe porte le déterminant antigénique HBs.

Si l'on exclut les formes fulminantes, la virémie déterminée par

ce virus est toujours prolongée et deux cas de figure peuvent se

présenter: - soit le sujet guérit dans 90 % des cas après une

virémie de six à huit semaines ;

- soit le sujet devient porteur chronique dans 10 % des cas.

La transmission se fait principalement par voie sanguine ou

sexuelle. Le virus n'est pas éliminé dans les matières fécales mais

on le retrouve dans les sécrétions telles que la salive, les

larmes, la sueur ou encore les sécrétions génitales.

Cette parfaite connaissance des VHA et VHB a permis à la

recherche dans le domaine des hépatites de faire un grand bond et

la terminologie "hépatites non-A, non-B" fut introduite pour

désigner des hépatites dont les agents étiologiques n'étaient pas

identifiés, mais qui apparaissent sérologiquement distinctes des

hépatites A et B (4-8-28-29-33-78).

Quels sont donc ces virus des hépatites non-A non-B ?

A l'heure actuelle, deux virus peuvent être sûrement

incriminés (2-14-48-62)

3

- l'un ubiquitaire, déterminerait une virémie prolongée. Il n'est

pas apparemment éliminé par les matières fécales et son mode de

contamination est très voisin de celui du virus B. Ce virus est

dit virus non-A non-B, liB like", mais c'est surtout la dénomination

de VHC (virus de l'hépatite C) qui est reconnue par la majorité des

auteurs depuis 1989.

Il s'agit d'un virus à ARN dont la classification taxonomique

est encore mal définie.

En effet, les comparaisons de séquences en nucléotides

indiquent des homologies avec le groupe des Flavivirus (en

particulier virus de la dengue et de la fièvre jaune), des

Pestivirus et même de virus de plantes (20-51-55-62).

Les principales caractéristiques du VHC et la position

taxonomique des virus voisins sont mentionnées dans les tableaux

suivants :

4

LE VIRUS DE L'HEPATITE C

Prévalence Infection aractéristique Modèle lassification ~tigènes utilisables pour

la recherche d'anticorps

20 à 40 % des 75 %des cas Evolution vers la Chimpanzé Flavivirus vraisemblable Protéine non structurale

cas d'hépatites chronicité dans ARN à simple brin, 10 KI: recombinante (20)

aiguës reconnues 50 à 60 %des cas Une seule phase de lec- en radioimmunologie ou ELISA

dans les pays ture Foie de chimpanzé ou de

développés Densité = 1,09-1,11 patients infectés en ii

Diamètre = 60 nm immunofluorescence indirecte 1

Pas de transcriptase in- (réaction de blocage,

verse Krawczynski (51)

~on encore visualisé au

Microscope électronique

Pas de culture cellulaire1

Tableau n" 1

SITUATION TAXONOMIQUE POSSIBLE DU VIRUS DE L'HEPATITE C

ARN génomique Dengue

non polyadénylé Encéphalite japonaise

Pas d'ARN subgé- Yest-Nile, encéphalite de

Principales caractéristiques Famille

ARN + Flaviridae

Simple brin

10-11 000 paires de bases

Genres

Flavivirus

Groupes

Fièvre jaune (virus amaril)

1 ARN génomique Virus Sinbis

polyadénylé

ARN +

Simple brin

11-12 000 paires de bases

Togaviridae

nomique

Togavi rus

Pestivirus

Saint-Louis

Encéphalite à tiques

Virus de la rubéole

Peste porcine

ARN génomique non Maladie des muqueuses

polyadénylé

Pas d'ARN subgé- Diarrhée bovine

nomique Border-disease des moutons

Tableau n° 2

Ce n'est que récemment que le VHC a été caractérisé dans son génomJ

de façon originale, par purification et clonage de ses acides nUcléiqueJ

dans le plasma d'un chimpanzé infecté avec le sérum d'un sujet porteuJ

d'une hépatite chronique NANB post-transfusionnelle (20). ;1

On distingue schématiquement deux régions : jles régions structurales qui codent pour les antigènes d'enveloppe e

5

......:

de capside.

- la région non structurale qui code en particulier pour des protéineE

impliquées dans la réplication virale. :1

Les figures 1 et 2 proposent un schéma de son organisatio~ généralE

et de son génome que l'on subdivise en gènes st.ructuraux (C, PrM, E) e,~\gènes non structuraux (NSl, NS2, NS3, NS4, NSS).

Les déterminants codés par les régions E et NSI semblent

particulièrement importants pour l' immunogénici té et l' antigénicité d~~particules virales.

$" 9! 1Protéine)\", .1b::~r. ~ d'enveloppe E·

{ J:' y., . .&J...F- Protéine~. . ..':'."~ de membrane M

~: ~~ .~ Prot{oineif .... .~~"B de nucléocapsic1e C

~'. ",:~

~J!J[~~Jt~Figure 1 : Représentati.on schém~~iquedu virus C par analogie aux f1avlvlrus.

Figure 2 : Représentation schématique de l'organisation génétique des flavivirus(réalisée par Vincent Deubel, Laboratoire des Arbovirus, Institut Pasteur Fondation)

AUG 10 723 nucléotides stop

3'

NS5(900)

·IAllr~NS4A NS48(150) (248)

C5-1C 100-3

NS3(618)

NON STRUCTURAL5' STRUCTURAL

IA_A_~_AII·IC prM E NS1 NS2A NS2B(113) (166) (495) (352) (218) (130)

II Â Ipr M

(75)La région 5' du génome virai code pour des protéines de structure intervenant dans la composition de la capside et de I"enveloppe virale.La région 3' code pour des protéines de régulation dont le rôle reste mal connu Les régions E et NS1 semblent très importantes pour l'anligénicilé desparticules.La région du génome viral soulignée en trait plein est celle qui a été initialement clonée par Chiron. Le test anti-HCV (Chiron-Ortho-Abbott) repose donc surl'expression de l'antigène correspondant.

6

L'autre virus incriminé dans ces hépatites NANB est proche du virus

A. La contamination se fait par les aliments souillés par les matières

fécales de sujets infectés par ce virus NANB (9). Ce virus est dit "NANB",

liA like" ou également "VRE".

Dans certains pays d'Afrique ou d'Asie, ce virus existe à l'état

endémique, mais il sévit également soit de manière sporadique soit sous

la forme d'épidémies, dans de nombreux pays sous développés. Déjà en 1955

en Inde, 29 mille cas d'hépatites à transmission orale avaient été

identifiés (60-83). En 1975, une épidémie semblable survenait en Inde dans

la ville de Ahmedabad (71). Des études sérologiques ont révélé qu'il ne

s'agissait ni d'hépatite A, ni d'hépatite B.

Plus récemment encore, en 1980, dans la ville de Kashmir, une épidémie

fut rapportée (79-86). Des études épidémiologiques et cliniques menées dans

d'autres pays sur les hépatites ont révélé des épidémies en Asie du Sud­

Est (58), au Népal dans la vallée du Katmandu (38-46), au Pakistan (21).

De telles épidémies sont également survenues en Afrique du Nord, en ALGERIE

(10-59), en Afrique de l'Ouest en COTE d'IVOIRE (69), en Afrique de

l'Est au Soudan (1) et en Somalie (57), et plus récemment encore au Mexique

(80), en Amérique du Nord et au Japon(88). La plus importante est apparue

en Chine où plus de 100 mille cas ont été recensés entre septembre 1986 et

avril 1988.

Dans toutes ces épidémies, le mode de transmission retenu est la

transmission hydrique(1-8-19-36-37-45) .

7

1~4. ,

DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DE L'HEPATITE E.

Balayan et al., 1983; Belabbes et al., 1985; Favorov et al., 1986;.

Pattanayak., 1986; Shakhgildyan et al., 1986; pillot et al., 1987;

et autre sources.

8

Pour caractériser le virus, de nombreuses recherches au microscope

électronique ont été réalisées, soit à partir de selles de patients ou de

singes infectés (15), soit dans des coupes de foie de singes infectés (7­

15), soit dans la bile où le virus semble présent en grande quantité et où

même un clonage du génome viral a pu être obtenu. Dans 4 % des cas, des

particules virales d'un diamètre de 27-38 nm ont été mises en évidence

(15); et on admet aujourd'hui qu'il s'agit d'un virus non enveloppé de 32

nm de diamètre en moyenne.

Son génome a été cloné et séquencé (16-67).

Il est constitué d'un ARN simple brin de 7600 nucléotides. Il fait

partie de la famille des Calicivirus (16).

Deux particularités caractérisent ce virus

- celle de donner des hépatites fulminantes chez la femme enceinte avec

10 à 40 % de mortalité

- une variabilité très significative de souches provenant de différentes

régions du globe (16).

Les principales caractéristiques de ce virus sont mentionnées dans

le tableau suivant :

Prévalence

IMe

Cas sporadiques

50 % des hépatites

aiguës chez l'enfant:

80 % chez les femmes

enceintes

Népal

Epidémies dans La

saison humide

Cas sporadiques entre

les épidémies

80 % des hépatites

Tableau n D 3

Caractéristique clinique Modèle animal

Infection asymptomatique Sensibilité de presque

dans 30 à 50 %des cas toutes les espèces de

Taux de mortalité 1-3 % singes (chimpanzé,

sauf chez la femme encein- Rhésus, cynomolgus,

te cercopithèque)

Pas d'évoLution vers La

chronicité

9

Classification

CaLicivirus

ARN à simple brun

8,5 Kb

Densité = 1,29

Diamètre =

30 - 33 nm

Visualisé dans les

seLLes, La bile

Pas de culture

1

1

l'

1

Si des progrès importants ont été réalisés ces dernières années pOUl

la caractérisation du VHC et du VHE, le diagnostic des infectio~~correspondantes, jusqu'à très récemment ne se faisait que par exclusidl

l '

des autres formes d'hépatites à partir de leur marqueurs viraux.1

Le tableau suivant récapitule les principaux marqueurs qui peuveBi

être recherchés, mais il convient de préciser que l'on se contenB(

généralement d'un seul marqueur considéré comme optimal, plus fiable, Ji

inscrit en caractère gras dans notre tableau. il

DIAGNOSTIC PAR SOUSTRACTION DES HEPATITES NON-A NON-B :1

Hépatites

A B Virus delta CMV EBV YF,

antigène viral -(selles)

1

Hybridation DNA -ou RNA (selles)

IgM anti-virusA -(sérum)

DNA polyrnérase -(sérum)

1

Hybridation DNA - 1

1

(sérum) ,

Antigène pré-S2 -,

(sérum) 1

anti-HBc,

IgM - 1

(sérum)

Antigène viral -(sérum)

1

...,~-;"{J('IvE;:-.

~\IgM anti-Delta ~ _ ft.. ,

,'- "'" ;

(sujets!~ ,

AgHBs+) <' ? :,

~~(~. "

IgM anti-CMV

~IgM anti-VCA \O~~ -\. ,..

trgM anti-YF -;, ::..•.•' e,v< -",..~<":. fl~.m.•{\

Les tests à la fois les plus simples et les plus significatifs pou~l'exclusion du virus considéré sont en caractère gras. Tableau n° 4

10

1

1 1

:1

Cette méthode très laborieuse de diagnostic des hépatites NANB, d~même que la gravité du problème de santé publique qu'elles représenten~1devaient très vite orienter vers la recherche de marqueurs plus SPécifiqu~!

1

en vue d'un diagnostic plus fiable.

11

, ,i t

PREMIERE PARTIE:

MISE AU POINT D'UN TEST DE

DEPISTAGE

DES, SUJETS INFECTES PARlEVHE

Dans la perspective d'un dépistage des sujets infectés par

le VHE, nous avons élaboré différents protocoles de recherche,

les uns visant à rechercher les déterminants antigéniques du

virus dans les selles et sa visualisation au microscope les

autres visant à mettre en évidence des anticorps antiVHE.

Pour la recherche du virus ou de ses déterminants

antigéniques, nous avons mis en jeu :

. l' immunomicroscopie électronique pour la recherche directe

du virus dans les selles,

. la culture cellulaire à partir des selles,

les tests immunoenzymatiques de capture d'antigène sur

les selles.

Pour la recherche des anticorps anti VHE, c'est la

microscopie à immunofluorescence qui a été mise en jeu.

Toutes ces techniques nécessitent soit une source d'antigène

VHE, soit une source d'anticorps anti VHE. c'est pourquoi, nous

avons eu recours :

- A) à la transmission du VHE au singe

B) à des méthodes préparatives à savoir

1. la préparation d' IgG anti VHE à partir de sérums de

sujets infectés par le VHE,

2. la séparation par méthodes chromatographiques des

anticorps anti VHE (IgM et IgG) à partir de sérums de singes

infectés.

3. le marquage des IgG fractionnées pour leur utilisation

comme outil analytique.

12

ETUDE EXPERIMENTALE SUR L'ANIMAL:

TRANSMISSION DU VHE AU

SINGE

..l'existencei Depuis que d'un virus NANB à transmission oro-

fécale fut reconnue, plusieurs publications se succèdèrent

confirmant la présence de ce virus dans de nombreux pays,

notamment dans les pays en voie de développement.

Des protocoles expérimentaux d'étude furent proposés et le

modèle retenu fut la transmission du virus à la race simienne.

Différentes espèces de singes ont été testées cynomolgus,

Rhésus, Saïmiri ... (6-15-69-73-74-76-77).

Dans le même sens, nous avons donc tenté de transmettre

l'hépatite NANB à deux espèces de singe retrouvées au Sénégal:

Erythrocebus Patas et Cercopithecus Eathiops.

1. Matériel et méthode

a) - matériel

Lors d'une épidémie d' hépatite virale à transmission hydrique

survenue en Constantine, des selles et des sérums de suj ets

atteints avaient été collectés pendant la phase aiguë de la

maladie. A partir des sérums, différents marqueurs viraux des

hépatites infectieuses ont été recherchés. L'absence d'IgM anti

HAV, d'IgM anti-HBc, d'IgM anti-Delta, d'IgM anti-CMV, d'IgM

anti-VCA a permis de retenir le diagnostic d'hépatite non-A non­

B. Le mode de transmission a permis de retenir le diagnostic

d'hépatite non-A non-B type E. A partir des selles, des

extractions du virus ont été réalisées suivant des méthodes

classiques d'extraction d'entérovirus.

1ère technique

- Faire une suspension de selles à 10 % en PBS (cf préparation

des tampons)

- centrifuger à 5 000 tours/minute pendant dix minutes

Agiter le surnageant avec 0,5 ml de chloroforme

centrifuger à 5 000 tours/minute pendant dix minutes

Recueillir la phase aqueuse

- Passer sur filtre 0,22 f et récupérer le filtrat qui constitue

l'inoculum.

13

2éme technique

- Faire une suspension de selles à la % en PB8

- Centrifuger à 5 000 tours/minute pendant trente minutes

- Filtrer sur filtre 0,22 p et récupérer le filtrat.

b) Méthode

- Phase d'observation ou de pré-inoculation

Pendant cette période, les singes après avoir été

déparasités (lvermec lM ou Mintézol suspension), sont suivis sur

le plan biologique. Un bilan hépatique a été réalisé et les

transaminases sériques ont été dosées chaque semaine pendant un

mois. Les selles ont été également recueillies pendant cette

période.

- Phase d'inoculation

Un lot de 8 singes ne possédant ni anticorps antiHAV, ni

anticorps anti-HBc, répartis en 3 groupes selon l'espèce a été

utilisé dans notre expérimentation.

- Le groupe 1 est constitué de 4 singes témoins dont 2 de type

Patas (81, 8_2) et 2 de type Cercopithèque (83,84). Ces singes

témoins ont été inoculés avec des selles humaines ne comportant

aucun agent infectieux reconnu.

- Le groupe 2 comprend 1 singe Patas (85) ayant reçu 0,5 ml

d'extrait chloroformé de selles d'un sujet atteint d'hépatite E

(El), 1 singe Patas (86) ayant reçu 0,5 ml d'extrait de selles

non chloroformé du même sujet (E2).

est la voie intraveineuse.

1 singe Cercopithèque

1 singe Cercopithèque

- Le groupe 3 comprend également

inoculé avec 0,5 ml dl extrai t El,

inoculé avec 0,5 ml d'extrait E2.

La voie d'administration utilisée

(87)

(88)

Les selles de ces différents singes furent collectées

quotidiennement, les sérums hebdomadairement, et conservés

à -80·C.

2. Résultats

14

Dans le groupe 1 : aucune variation sensible des transaminases

n'a été observée (cf courbes 81, 82, 83, 84).

Dans le groupe 2 :

85 pas d'élévation des transaminases (cf courbe 85),

86 élévation des transaminases au bout de 10 jours (cf

courbe 86).

Dans le groupe 3 :

87 pas d'élévation des transaminases (cf courbe 87),

88 on observe une augmentation considérable des transaminases

au bout de 4 semaines (cf courbe 88).

15

Evolution des transminases chez le singe PATA5 TEMOIN - 51

300 i 1

250

I~ SGor 1...- SGPT

200

150\0.--i

100

50

9989796959493929199-1-11

0' , l , , , , , 1 , 1 , , • , , l , , ft , , , , Il

-21

Jours

Evolution des transminases chez le singe PATA5 TEMOIN - 52

300 i ,

250

200

150

100

50

I~ SGOT 1-+- SGPT

['r-i

-11 -1 9 19 29 39 49 59 69 79 89 99

Jours

Evolution des transminases chez le singe CERCOPITHEQUE TEMOIN - 53

300 i i

250

1- SGOf1-+- SGPT

200

150 cori

100

99897969594939291 99- 1- 1 1

o l , l , l , l , l , l , l , l , 1 1 l , l , l , 1 1

- 2 1

50

Jours

Evolution des transminases chez le singe CERCOPITHEQUE TEMOIN - 54

300 1 1

250

I~ SGor1-+ SGPT

200

150 0'\ri

100

50

9989796959493929199-1-11

o l , , , l , , , l , l , l , l , l , l , l , l , Il

-21

Jours

Evolution des Transminases chez le singe PATA5 - 55

300 i i

250

200

I~ san 1-+- SGPT

150

oN

100

50

100908070605040302010o-10-20

o 1 ft 1 ft , J , ,1ft l , l , l , 1 t 1 ! ' , 1 1 1 , J

-30

Jours

Evolution des transminases chez le singe PATA5 - 56

300. i

-a- SGOT...... SGIT

250

200

150 r-iN

100

50

100908070605040302010o-10-20

o ' , l , l , , ,1 ft l , l , , ft , , , ft 1 1 l , 1 1 1

-30

Jours

/

Evolution des transminases chez le singe Cercopitheque - 57

300' ,

250

I~ SGOT1...... SGPT

200

150

NN

100

50

100908070605040302010o-10-20

o ' , l , , 1 l , , ft l , 1 1 l , , • l , l , 1 1 l , 1

-30

Jours

Evolution des transminases chez le singe CERCOPITHEQUE - S8

300. 1

1- SGar 1...... SGPT

MN

99

.,~,.

89796959493929199-1-11

o l , 1 l , , , , , , , 1 l , , , l , l , 1 1 1

-21

200

100

JOUIS

3. Tests d'inoculations croisées

Ne disposant d'aucun test biologique de dépistage des

marqu~urs du VHE, et pour vérifier que le virus inoculé était

différent du VHC et ne possédait aucune communauté antigénique

avec ce dernier, des tests d'inoculations croisées ont été

pratiqués.

a) Technique

Ce test porte sur deux singes type Cercopithèque: l'un S9

fut infecté expérimentalement par des selles de sujets atteints

d'hépatite NANB épidémique l'autre, SlO, par le sérum d'un

malade atteint d'une hépâtite NANB post-transfusionnelle.

S9 4 semaines après l'inoculation, une élévation importante

des transaminases fut observée suivie d'un retour à la

normale 4 semaines plus tard (cf courbe) .

S10 : Une élévation plus modérée des transaminases fut obtenue

au bout de 5 semaines avec retour à la normale 4 semaines plus

tard. C'est à ce moment là que les inoculations croisées furent

pratiquées, c'est-à-dire que le singe S9 était inoculé avec le

sérum d'un malade atteint d'hépatite C à la phase aiguë et le

singe S10 avec les selles de sujets atteints d'hépatite E pendant

la montée des transaminases.

b) Résultats

si l'on exclut les formes d'hépatite à rechute, on peut

conclure que le virus inoculé est différent du VHC et qu'il ne

possède aucune communauté antigénique avec celui-ci; puisque une

élévation des transaminases sériques, témoin d' une hépatite

clinique, fut observée 20 jours après ces réactions croisées (cf

courbes S9, 810).

24

Evolution des transminases chez le singe - 59

400 1 1

350l;r SGar 1-+- SGPr

300

250

l!)

N

100 110 120 130 140 150908070605040302010oo l , 1 ?" l , l , l , l , l , 1 l , 1 1 1 1 l , l , 1 l , l , , , l , l , 1

-30 -20 -10

50

100

150

200

Jours

Evolution des transminases chez le singe - 510

400 1 1

300

-Go SGOT-+- SGPT

200

100

\.0N

100 110 120 130 140 150908070605040302010oo 1 ft , , , , , , , , l , l , l , , ft , , , l , , l , l , , e , , , , , l ,

-30 -20 -10

Jours

PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES

ET MARQUAGE

A N T l - V H E

DES U JET S

LEV H E

l - PRE PAR A T ION DES l g G

A PAR TIR DES E R U M S

l N FEe TES PAR

1) Matériel

il s'agit de sérum de malades atteints d'hépatite virale à

transmission hydrique, survenue à Bangkok lors d'une épidémie.

Les sérums ont été prélevés chez ces sujets pendant la phase

convalescence de la maladie, c'est-à-dire après le retour à la

normale des transaminases.

2) Méthode

La préparation se fait à partir des sérums des malades

convalescents par relargage à l'aide de sels neutres.

a. Principe

Le sulfate d'ammonium à demi-saturation précipite les

fractions riches en IgG.

b. Technique

- Préparation de la solution saturée de sulfate d'ammonium

Dissoudre 1 g de sulfate d'ammonium par ml d'eau distillée à

50°C. Ajouter du sulfate jusqu'à saturation, ajuster le pH

à 7.

Saturation du sérum

Les IgG précipitent en grande partie à 40 % de saturation.

Il faut calculer la quantité de solution saturée à utiliser

par la formule

saturation 2 - saturation 1

1 - saturation 2

Saturation 1 degré de saturation de départ du sérum

Saturation 2 degré de saturation que l'on veut obtenir.

Exemple : à partir de sérum frais, combien de ml de sulfate

d'ammonium saturé faut-il ajouter pour obtenir une solution à

40 % ?

27

0,40 - ° 0,4 = 0,66 soit 66 %

1 - 0,4 0,6

Donc pour 100 ml de sérum, il faudra ajouter 66 ml de solution

saturée de sulfate d'ammonium.

- Mettre le mélange une nuit à +4°C.

- Centrifuger à faible vitesse (2 000 t/mn) pendant la minutes

et recueillir le culot de centrifugation qui contient les IgG.

Le culot est alors repris dans du tampon PBS sous un volume

de 1 ml.

Dessaler cette solution en dialysant dans du tampon PBS

pendant 48 heures.

- Vérifier au troisième jour que l'eau de dialyse ne contient

plus de traces de sulfate d'ammonium en effectuant la réaction

de Nessler.

- Réaction de Nessler

A 2 gouttes d'eau de dialyse, ajouter 0,7 ml de réactif de

Nessler, puis 3 ml de lessive de soude l' apparition d'une

coloration rouille indique la présence de sulfate d'ammonium.

Dialyser à nouveau jusqu'à disparition de cette coloration de

l'eau de dialyse. Les IgG ainsi préparées peuvent être conservées

à +4°C.

28

II SEP A RAT ION

A N TIC ° R P SAN T l

DE SINGES

DES

- V H E (IgM - IgG)

1. préparation des IgM antiVHE

Elle se fait à partir d'un pool de sérums du singe S8

recueillis pendant la montée des transaminases par un

fractionnement en gel filtration sur colonne.

a) - principe

C'est une méthode de filtration sur tamis moléculaire qui

sépare des protéines de même solubilité mais de poids

moléculaires différents.

b) - Technique

Préparation de la colonne

Elle nécessite un choix judicieux de la colonne, du tampon

et du gel.

Choix de la colonne : Il dépend de la quantité de produit

à injecter et de son volume.

5 à 10 ml de sérum : colonne Pharmacia K50-100 (soit 5 cm de

diamètre, 100 cm de longueur). Volume de la colonne = 1,8 1.

1 à 2 ml de sérum : colonne Pharmacia K25-100 ou SR25-100 ou

colonne Wright GA-22 x 90. Volume de la colonne = 530 ml.

0,5 ml : colonne Pharmacia K15 x 100 ou K16 x 100 ou colonne

Wright GA-16 x 90. Volume de la colonne = 200 ml.

0,25 à 0,5 ml de sérum: colonne Pharmacia K9-60 ou colonne

Wright GA-10 x 60. Volume de la colonne = 38 ml.

Débit de la colonne : il dépend de sa taille, de la nature

du gel et de la qualité de la séparation. Les valeurs moyennes

sont" les suivantes

- pour une K50-100 30 à

- pour une K25-100 7 à

- pour une K15-100 2,5 à

choix du gel en fonction

Poids moléculaire > 1 million

CLB) .

50 ml/heure

15 ml/heure

8 ml/heure.

du poids moléculaire à séparer

: Sepharoses (notamment Sepharose

29

Poids moléculaire compris entre 80 mille et 1 million Sephacryl

Sephacryl

magnétique, puis

(sinon risque de

le tampon est

moitié dans du

S300.

Poids moléculaire compris entre 20 mille et 150 mille

S200.

Poids moléculaire < 20 mille: Sephadex G75 ou G50.

Choix du tampon : Habituellement, on utilise du tampon

PBS-azide à 1/1000 0,15 M PH 7,2.

Remarque : Le tampon utilisé, de même que le gel doivent être

dégazés.

Comment dégazer le tampon ?- Dans une fiole à vide, mettre environ deux fois le volume de

la colonne de tampon.

- Mettre sous agitation magnétique faible.

Recouvrir avec un bouchon trop large, puis relier à une trompe

à eau puissante pendant un quart d'heure.

- Pour casser le vide, arrêter l'agitateur

retirer le tuyau avant d'arrêter la pompe

reflux) .

Comment dégazer le gel ?

La même technique que celle pour dégazer

utilisée, mais diluer préalablement le gel de

tampon dégazé.

- Mettre sous agitation lente afin de ne pas briser les billes

de gel.

Installation de la colonne

La colonne est installée verticalement (vérifier dans toutes

les directions avec un niveau à eau).

- installer un réservoir en haut de la colonne

en bas de la colonne, mettre un tuyau de longueur supérieure

à celle de la colonne

- remplir entièrement la colonne avec du tampon dégazé et purger

le tuyau de sortie

- verser le gel doucement dans la colonne au-dessus du tampon

dans lequel il tombe en formant des volutes

installer la pompe qui doit être reliée à l ' extrémité

inférieure de la colonne par un tuyau le plus court possible,

30

et dont le débit est supérieur au débit d'utilisation pour

permettre au gel de se tasser.

- laisser le gel se tasser. Le gel est correctement tassé

lorsque son niveau supérieur dans le haut de la colonne ne

varie plus

- enlever l'excès de gel

- enlever le réservoir

- installer l'adaptateur en l'enfonçant légèrement dans le gel

le visser solidement

Pour purger l'air du tuyau du bas, laisser couler l'eau de

la colonne. Pour purger la pompe, la faire marcher à vide avant

de la relier à la colonne. Le tuyau d'arrivée à la pompe plonge

dans le tampon par l'intermédiaire d'un microtube en verre qui

l'empêche de flotter. Le tuyau de sortie de la colonne est relié

directement au collecteur de fractions où la collection se fait

en gouttes (100 gouttes = environ 5 ml) ou en temps. Ce

collecteur est en relation avec un enregistreur qui inscrit la

forme globale de la courbe.

La lecture

Les fractions sont analysées par absorption dans l'UV à 280

nm. Les densités optiques obtenues au spectrophotomètre sont

reportées sur une coufbe en fonction du volume d'élution : la

courbe présente alors trois pics s'il s'agit d'un sérum:

1er pic correspondant aux IgM (PM = 1000 Kd)

2éme pic est celui des IgG (PM = 150 Kd)

3éme pic représente l'albumine (PM = 68 Kd).

Dans notre étude, pour la séparation des immunoglobulines,

nous avons choisi une colonne Pharmacia K2S-100, le gel Sephacryl

S300 et du tampon PBS azide à 1/1000 comme éluant.

31

c) - Résultats

Les résultats obtenus sont les suivants

4,0

3,5

3,0

8t::

0 2,500N,C\i0:::lcr' 2,0

'P§<'0~.....en 1,5t::00.

1,0

0,5

0,00 50 100 150 200 250 300 350

Volume d1élution en ml

1er pic IgM

2e pic = IgG

3e pic = albumine.

Les différentes fractions correspondant aux IgM ont été

collectées et dialysées dans du tampon PBS pendant trois jours

avant d'être soumises à un contrôle de pureté.

32

2. préparation des IgG antiVHE

On utilise un pool de sérums du singe S8 recueillis pendant

la phase de convalescence de la maladie, que l'on fractionne par

chromatographie pur résines échangeuses d'ions. Nous avons

utilisé comme support: DEAE Trisacryl M, IBF.

a) - principe

Il est basé sur la propriété des protéines à s'associer aux

groupes chargés fixés sur les résines. Plus la protéine est

chargée, c'est-à-dire éloignée de son point isoélectrique, plus

fortement elle se fixe. On obtient l' élution en augmentant

progressivement la force ionique.

b) - Technique

Après avoir séparé les fractions d' IgM et d' IgG par

chromatographie sur S300, dialyser les IgG dans du tampon Tris

HCl 0,025 M, Nacl 0,035 M, pH 8,8 pendant 48 heures,

- Déposer l'échantillon sur la colonne à raison de 5 ml de

sérum pour 15 ml de gel équilibré dans le même tampon (volume

gel/volume d'échantillon = 3).

Le débit est de l'ordre de 50 ml/heure. Sous ces conditions,

seules les IgG ne sont pas retenues par le support et sont éluées

dans un pic étroit. Le degré de pureté des IgG éluées est de

99,5% .

Remarque : La capacité maximale de la DEAE Trisacryl M est de

50 mg de protéines par ml de gel. Cette technique est applicable

à différentes espèces animales mais avec un degré de pureté

variable.

Espèce Pureté IgG

Rat ++

Souris

Lapin ++

Mouton ++

Chèvre +

Porc ++

Chien ++

Homme +

33

3. Contrôle de pureté des IqM et IqG préparées

Il se fait par immunodiffusion sur gel suivant la technique

classique d'outcherlony.

a) - principe

L'antigène en solution diffuse dans un gel contenant

l'anticorps. Les deux réactifs (antigène et anticorps) diffusent

l'un vers l'autre dans une couche de gel vierge et lorsqu'ils se

rencontrent, il y a formation d'un arc de précipitation.

b) - Technique

Préparation du gel

Le gel est composé d'agarose = 0,6 g

PEG 6000 3 g

tampon 100 ml

Tris 0,02 M 2,42 g

glycine 0,01 M 0,75 g

EDTA 0,01 M 2,9 g

eau QSP = 1 000 ml

agitateur chauffant et il est

Le gel est alors coulé sur une

Le tampon est ainsi préparé

Le mélange se fait sur

conservé en chambre humide.

surface de verre (plaque de verre ou boîte de Pétri) et après

solidification, des sources de diffusion sous forme de puits

circulaires sont creusées avec un emporte-pièce dans la gélose.

On dépose dans deux puits différents l'antigène et l'anticorps,

et la diffusion se fait pendant 48 h en chambre humide.

c) - Résultats

Par cette technique nous avons pu contrôler que les

immunoglobulines que nous avons préparées étaient pures.

34

4. Concentration des immunoglobulines préparées et

détermination de la teneur en protéines

Cette concentration se fait par ultrafiltration sous

différence de pression.

a) - Technique

Dans une fiole à vide, on place un boyau à dialyse

parfaitement étanche dans lequel on introduit la suspension

d'immunoglobulines à concentrer. La fiole est reliée à une trompe

à eau et bouchée hermétiquement. Il règne ainsi dans la fiole,

une pression inférieure à celle existant dans le boyau, de telle

sorte que l'eau puisse s'échapper du boyau alors que les

protéines sont retenues à l'intérieur du sac à dialyse qui

constitue en fait une membrane semi-perméable. La teneur finale

en protéines est évaluée au spectrophotomètre UV à 280 nm.

35

acétique carbonate

- sodium métapériodate

III - MAR QUA G EDE SIg G FRA C T ION NEE S

Nos IgG fractionnées ont été marquées soit pour usage

ultérieur en immunoenzymologie (peroxydase-bêta-galactosidase),

soit pour immunofluorescence (fluorescéine).

1) - pour immunoenzymoloqie

a) Marquage à la péroxydase

Réactifs

- eau parfaitement déionisée, bidistillée

- peroxydase

acétate de sodium anhydre Acide

disodique anhydre - carbonate monosodique

- sodium borohydrure.

Technique

- Premier jour A 8 mg de peroxydase dans 1 ml H20, ajouter 0,8

ml de NaI04 0,1 M (21 mg/ml) en agitant. Laisser 20 à 30 min

maximum à température ambiante. Dialyser cette solution une nuit

à +4°C contre un tampon acide acétique-acétate de sodium 10-3 M

pH4, 4 (1 1) (cf préparation des tampons).

Dialyser simultanément 5 mg d'IgG (volume compris entre 0,2 et

0,5 ml) contre du tampon carbonate 10-2 M pH 9,5 une nuit à +4°C

(2 XII) (cf préparation des tampons).

- Deuxième jour: Mélanger les solutions d'IgG et de péroxydase.

Volume final compris entre 2 et 2,5 ml. La solution se trouble

parfois : elle redevient limpide après alcalinisation.

Alcalinisation ajouter 40 à 60 pl de tampon carbonate 1 M.

Contrôler le pH. si pH < 9,0 ajouter du tampon carbonate 1 M par

aliquotes de 10 pl.

Laisser 3 heures à température ambiante à l'obscurité.

Ajouter 100 pl de NaBH4 à 4 mg/ml en eau distillée et laisser 2

heures à +4°C.

Dialyser contre du PBS (2 xlI) une nuit à +4°C.

- Troisième jour: Diluer à l'aide d'un tube gradué à 50 % en

glycérol. Bien homogénéiser.

Le conjugué est stable à -20°C pendant au moins un an.

36

b) Marquage à la bêta-galactosidase

Principe

La préparation du conjugué anticorpsjbêta-galactosidase se

fait par la glutaraldéhyde qui est fixée aux anticorps, selon la

technique de GUESDON-AVRAMEAS et TERNYNCK (34).

Cette méthode permet l'association de l'enzyme à la protéine

par l'intermédiaire des groupements aldéhydes de la

glutaraldéhyde qui réagissent avec les groupements aminés de

l'anticorps et de l'enzyme.

Technique

La bêta-galactosidase, à raison de la mg est additionnée

de 5 mg d'anticorps sous un volume total de 2 ml ; le mélange

est dialysé toute la nuit contre du tampon phosphate 0,1 M pH

6,8 (cf préparation des tampons). On ajoute le lendemain à ce

mélange, maintenu sous agitation, 100pl d'une solution de

glutaraldéhyde à 1 % dans du tampon phosphate 0,1 M pH 6,8. Après

3 heures de contact à la température du laboratoire, on ajoute

une solution de lysine (ou de tout autre réactif contenant des

groupements NH2 libres) en tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 pour

obtenir une concentration finale en lysine de 0,1 M. Celle-ci,

laissée en contact pendant 2 heures à la température du

laboratoire, permet le blocage de l'excès de glutaraldéhyde.

Conservation

Les conjugués à la péroxydase ou à la bêta-galactosidase,

sont enfin dialysés contre du PBS pendant 3 jours à +4°C, puis

centrifugés 20 minutes à 3.000 g, et un volume égal de glycérol

est ajouté comme conservateur. Le mélange peut alors être

conservé sans antiseptique à -20°C.

37

2. pour immunofluorescence

a) Marquage des IgG par la fluoresceine

Technique

On utilise l'isothiocyanate de fluorescéine Mérieux (ITCF).

La solution de protéines à conjuguer est ajustée à 20 mg/l

(mesure de la DO à 280 nm avec précision). Avant de mettre

l'ITCF, il faut ajuster le pH à 9 en ajoutant l/lOème du volume

de tampon carbonate O,S M aux protéines.

L'isothiocyanate de fluorescéine ne se dissout qu'à PH 9.

Ajouter l'ITCF à la solution de protéines à conjuguer en raison

de 1 mg pour 40 mg de protéines

- Laisser en agitation douce et continue une nuit à +4°C

- Séparer alors les protéines marquées sur Sephadex GSO.

Séparation des protéines marquées sur Sephadex GSO

- Laver le gel avec du PBS 2 à 3 fois puisque le gel est en

tampon phosphate. Pour celà centrifuger à 3.000 tours/minute

pendant S minutes et éliminer le surnageant

- Verser alors le gel dans une colonne de manière à ce que la

hauteur de la colonne soit dix fois supérieure à son diamètre.

Il faut S ml de gel pour 1 ml de solution à chromatographier ;

-Laver la colonne en continu pendant 40 minutes environ avec

l'eau physiologique tamponnée:

- Déposer délicatement la solution conjuguée sur le papier filtre

en haut du gel et laisser couler.

Résultats

Les protéines marquées sont éluées les premières et les

fractions correspondantes sont colorées, suivies des protéines

non marquées dont les fractions correspondantes sont incolores.

L'ITCF libre est éliminée dans les dernières fractions colorées.

On fait un pool des premières fractions colorées qui ont

été recueillies et on évalue la teneur en protéines à 280 nm

puis à 496 nm.

La concentration finale en protéines exprimée en ng/ml est

donnée par la formule

38

DO 280 nm - 0,46 (DO 496 nm)

p =-~---------------------------

J~ :Rj 0,46

1,4

est

1,4

= concentration en protéines

= facteur de correction dû à l'ITCF

= absorption dans l'UV de 1 mg de protéines.

Après quoi, on calcule le poids de l'ITCF en gamma/ml. Il

donné par la formule :

DO (496)

F = -------0,21

1 gamma d'ITCF a une absorption de 0,21 à 496 nm

Calculer le rapport F/P. Ce rapport doit être compris entre

3 et 6. Les immunoglobulines marquées à la fluorescéine ainsi

préparées sont épuisées sur de la poudre de foie de boeuf.

Technique d'épuisement

- On utilise 100 mg de poudre de foie de boeuf pour 20 mg de

protéines marquées ;

- A cette poudre réhydratée au préalable, ajouter la solution

de protéines marquées ;

- Laisser le mélange une heure à la température du laboratoire,

puis une nuit à +4°C.

Cette méthode permet de capter tous les anticorps anti-foie,

il ne reste que les anticorps anti-virus donc toute fluorescence

observée au microscope sera spécifique du virus.

De plus les immunoglobulines non marquées sont faiblement

chargées tandis que celles qui sont marquées sont plus chargées

négativement. Dans ce cas, les anticorps anti-tissus ou anti­

cellules qui portent des charges positives vont se lier par des

liaisons électrostatiques avec les protéines marquées à la

fluorescéine. Il s'agit de liaisons non spécifiques.

L'épuisement par la poudre débarrasse de ces forces

électronégatives donc les seules liaisons présentes seront

ensuite des liaisons immunologiques entre le virus et les

anticorps marqués.

Remarque : A la place de la poudre de foie, on peut utiliser un

sérum polymérisé avec du glutaraldéhyde qui donne un gel. La

technique d'épuisement reste inchangée.

39

3. Contrôle du marquage

a) - Matériel

- Plaques à microtitration

SI : substrat spécifique pour béta-galactosidase (ONPG 8 mg dans

2 ml d'H20+ PM2 8 ml + mercaptoéthanol 56 pl).

S2 : substrat spécifique pour péroxydase (OPD 2 mg/ml + tampon

citrate +1 ul/ml d'H202).

- Tampon de saturation (BSA 0,5/1000 + Tween 20 à 1/1000 + PBS)

- Tampon de lavage (PBS + Tween 20 à 1/1000)

- R3 : IgG de lapin anti-Fc(gamma) humain dont la méthode de

préparation est décrite en annexe).

b) - Technique

Sur une plaque Nunc, incuber à 37°C l'anti-Fc (gamma) à une

concentration de 5 gamma/ml de PBS, puis une nuit à +4°C ;

- A l'aide du tampon de saturation (200 Pl/puits), saturer la

plaque 2 à 3 heures à 37°C;

- Laver avec la solution de lavage

Ajouter l'IgG marquée diluée dans le tampon de saturation à

40 gamma/ml et incuber 1 heure à 37°C;

- Laver plusieurs fois.

si l'IgG est marquée à la bêta-galactosidase, ajouter 100

pl de substrat 1, puis 50 pl de carbonate de Na et lire à 405

nm. si l'IgG est marquée à la péroxydase, ajouter 100 pl de

substrat 2, puis 50 pl d'acide sulfurique 4N et lire à 496 nm.

40

METHODES ANALYTIQUES

RECHERCHE DES ANTICORPS

ANTIVHE DANS LE SERUM

ETUDE DE LA REACTION IMMUNOGLOBULINE FLUORESCENTE

SUR COUPE DE FOIE DE SINGE INFECTE

1. Principe

Des coupes de foie de singe infecté expérimentalement sont

mis en contact avec les IgG marquées à la fluorescéine des

malades à tester.

si le virus est présent dans les coupes de foie, il se forme

une réaction antigène/anticorps que l'on visualise au microscope

à irnrnunofluorescence.

2. Technique

La technique utilisée est l'irnrnunofluorescence directe

- A partir des biopsies de foie de singe infecté par le VHE et

montées sur cryobed, on réalise à l'aide d'un cryostat des coupes

de 5 u que l'on dépose sur lames

- Sécher à l'air libre et fixer à l'éther pendant 5 minutes.

Ajouter 50 à 100 fI d'IgG de malades à tester, marquées à la

fluorescéine ;

Incuber 30 minutes à 37°C en chambre humide ~

- Laver 3 ou 4 fois en PBS puis en eau distillée

- Monter en glycérine tamponnée avec une lamelle

- Observer à l'aide d'un microscope à irnrnunofluorescence.

3. Résultats

Nous avons utilisé comme source d'antigène VHE le foie du

singe Patas infecté expérimentalement prélevé chaque semaine par

biopsie à l'aiguille, après inoculation.

41

Les résultats ont été constamment négatifs.

sérum de singe

Avant inoculation

J7

(7 jours après inoculation)

J14

J21

J30

J37

J44

42

IFD

RECHERCHE DE L'ANTIGENE VHE DANS

LES SELLES DE SUJETS INFECTES

l - RECHERCHE DE LIANTIGENE VHE PAR IMMUNOMICROSCOPIE

ELECTRONIQUE

1. Technique

- Des suspensions à 10 % en PBS ont été réalisées avec les selles

du singe S8 recueillies quotidiennement

- centrifuger à 5.000 tours/mn pendant 30 minutes

- Passer sur filtre 0,22 p- A partir d'l ml de filtrat, faire une ultracentrifugation à

30.000 tours/mn pendant 4 heures soit 100.000 g (BECKMANN R50)

- Reprendre le culot dans un volume minimum de surnageant (50

ul environ)

- Faire une coloration négative en mettant en contact une goutte

du culot viral avec une goutte de réactif phospho-tungstique (cf

préparation en annexe)

- Déposer une goutte du mélange sur une grille et laisser sécher

- Observer au microscope électronique.

Par cette technique, nous n'avons pas pu détecter le VHE

dans les selles que nous avons testées, ce qui nous a conduit à

améliorer cette technique de la manière suivante :

- A deux gouttes de la suspension du culot viral, ajouter une

quantité équivalente d'IgM de malades atteints d'hépatite E

- Mettre à l'étuve à 37°C pendant une heure

- Aj outer alors l' anti-p commercial (monoclonal anti-IgM humaine)

dilué au l/lOOème

- Faire une ultracentrifugation à 95.000 tours/mn (400.000 g)

pendant 5 minutes sur BECKMANN TL 100.

- Remettre le culot en suspension dans un volume minimum de

surnageant

- Observer alors au microscope électronique.

2. Résultats

Ils sont restés tout aussi décevants : la recherche du VHE

dans les mêmes selles que précédemment, s'est avérée négative.

43

fait par

de l'effet

II - RECHERCHE DU VHE PAR CULTURE CELLULAIRE

1. Culture des lignées cellulaires utilisées

Les lignées cellulaires utilisées sont :

- La lignée PLC PRF5 (Alexander) = lignée d'hépatocytes dérivée

d'un hépatocarcinome d'un sujet porteur d'antigène HBs.

- La lignée HepG2 = lignée dérivée d'un hépatoblastome humain.

Ces cellules se cultivent dans des boîtes de culture

stériles (Falcon) en plastique de 25 cm2, dans une étuve à 37°C

en atmosphère à 5 % de C02.

Le milieu de culture est

Le milieu Dulbecco MEM (GIBCO-BRL) additionné de 10 %

de sérum de veau foetal.

2. Inoculation des cultures cellulaires

- Les extraits de selles supposés contenir le VHE sont passés

sur filtre 0,22 p puis dilués dans le milieu de culture sans

sérum de veau foetal.

- Déposer 0,5 ml de cet extrait sur la culture.

- Incuber 1 heure à 37°C.

- Ajouter alors 4,5 ml de milieu complet (l'inoculum est alors

au 1/10ème).

Le premier renouvellement du milieu se fait 24 heures après,

puis toutes les 48 heures.

3. Lecture

La recherche de l'antigène VHE se

immunofluorescence indirecte, et la recherche

cytopathogène par microscope électronique.

Recherche de l'antigène VHE par immunofluorescence indirecte.

Mettre sur les cellules inoculées 50 à 100 pl de sérum

contenant des immunoglobulines antiVHE, et dilué en PBS (dilution

minimale au 1/20ème)

- Laisser incuber à 37 OC en chambre humide une à deux heures.

44

- Laver en tampon PBS trois fois.

Ajouter 50 à 100pl d'antiglobulines humaines marquées à la

fluorescéine (antilgG, M humaines Pasteur ou Mérieux) diluées

en PBS.

- Faire une contre coloration au Bleu Evans (5mn).

- Laver en eau distillée et monter en glycérine tamponnée avec

une lamelle.

Recherche de l'effet cytopathogène

Elle se fait directement au microscope électronique au

grossissement 40.000.

4. Résultats

En microscopie électronique aucun effet cytopathogène n'a

été observé de même la culture sIest avérée négative. Mais il

faut souligner à ce propos que jusqu'à ce jour aucune technique

de culture du VHE n'a pu être mise au point malgré des recherches

laborieuses menées par plusieurs équipes.

45

III - MISE AU POINT D'UNE METHODE OPTIMALE DE DETECTION

DE L'ANTIGENE VHE DANS LES SELLES PAR TECHNIQUES

IMMUNOENZYMATIQUES.

1. PRINCIPE GENERAL

Selle IConjugué :

à tester IIgG humaine

Imarquée à la

Ibéta-galactosidase

d'IgM

antiVHE

Support

recouvert

1

1

1

1

1

1

,..........:---=::...:...:..:..--,-:....::..---=:..=.:......---------=---------,1

~~U.!i. ~.- .~ 1

-------11

1

1

Chromogenèse 1

1

1

1

46

extraits de selles à tester et des

sains ne comportant aucun agent

2. TECHNIQUES

1) Technique par immunocapture des IgM

a) Matériel et réactifs :

- Plaques de microtitration,

- Tampon PBS

- Solution d'anti-p commercial,

- Sérum total de malades en phase aiguë d'hépatite E,

- R1 = solution de lavage (PBS, Tween 20 : 1 %0),

- R2 = IgG humaine de sujets présumés convalescents d'hépatite

E,marquée à la péroxydase,

R3 = milieu réactionnel de l'enzyme comprimé d'OPD tampon

citrate + H202,

- R4 = solution d'arrêt (H2S044N).

b) Méthode

Premier jour

- Sensibiliser les plaques avec 100 pl/puits de solution d'anti­

u à 5 gamma/ml de PBS. Placer les plaques 1 heure à 37°C puis une

nuit à +4°C.

- Laver alors 3 fois les plaques avec la solution R1. Ajouter

100 pl de sérums de sujets infectés dilués au 1/100e et incuber

1 heure à 37°C.

Deuxième jour

saturer les plaques avec une solution de bovalbumine à 1/1000

pendant 2 heures à 37°C;

- Préparer parallèlement les

selles témoins de sujets

infectieux (au moins 5)

- Pour celà,

centrifuger à

surnageant sur

- Laver 3 fois

faire une suspension de selles à 10 % en PBS,

5.000 tours/mn pendant 30 minutes. Passer le

filtre 0,22 p et recueillir le filtrat;

les plaques

47

infectés par VHE

la phase aiguë de

- Ajouter les extraits de selles à tester et les selles témoins

en raison de 100 pl/puits

- Mettre les plaques 1 heure à 37°C puis une nuit à +4°C.

Troisième jour

- Laver les plaques 3 fois ;

Mettre 100 pl de R2 à une concentration optimale qui est de 2

gamma/ml et incuber 1 heure à 37°C

- Laver plusieurs fois les plaques (au moins 3 fois) et ajouter

100 pl de réactif R3 à préparer extemporanèment

- Laisser agir 5 minutes à l'obscurité;

Arrêter la réaction avec 50 pl de R4/puits. Lire à 496 nm sur

lecteur plaque ELISA.

L' intensité de la coloration lue en densité optique, est

proportionnelle à la quantité de conjugué lié, et donc

éventuellement à la concentration d'antigène VHE présent dans

les échantillons de selles.

Les résultats sont exprimés en PIN, c'est-à-dire

DO de l'échantillon

moyenne des DO des témoins négatifs

Le résultat est considéré comme positif lorsque PIN > 2,1 soit

une DO supérieure à 2 a des DO témoins.

c) - Résultats

Nous avons testé des selles de sujets

lors d'une épidémie de Constantine, pendant

la maladie dans deux systèmes :

- Un système témoin constitué de sérum de sujet sain n'ayant

jamais été en contact avec le VHE et les IgG marquées à la

péroxydase du même sujet.

- Un système spécifique comprenant un pool de sérums de sujets

infectés par le VHE pendant la phase aiguë de la maladie, et les

IgG marquées à la péroxydase de ces mêmes sujets pendant la phase

de convalescence.

48

Les résultats sont les suivants

Selles testées

Tl

T2

T3

T4

T5

Cyt 22

Cyt 23

Cyt 34

Cyt 3

Cyt 9

Cyt 11

Cyt 12

Cyt 17 017

Cyt 28 002

Système témoin

PIN

1,2

1,3

0,80

1,13

0,90

2,20*

1,90

2,7*

4,2*

2,1*

3,2*

0,8

1,21

1,61

système spécifique 1

PIN 1

1

1,3

1,7

0,60

1,02

1,1

3,18*

1,66

5,3*

7,6*

2,5*

3,8*

0,90

1,18

2,01

T selles témoins ne contenant aucun agent infectieux

Cyt = selles de malades de Constantine testées

Tableau n° 5

Comme le montre le tableau précédent, ces résultats ne sont

pas concluants puisqu'on observe 100 % de réactions non

spécifiques.

Pour obtenir des réactions plus spécifiques, nous avons mis

en jeu la technique par séparation des IgM qui elle, utilise des

IgM et des IgG purifiées.

49

2. Technique par fixation directe des IgM sur support

a) Matériel et réactifs

Quatre systèmes ont été réalisés

- Un système témoin humain TH qui consiste à sensibiliser les

plaques à microtitration avec de l'IgM fractionnée de sujet sain

et révéler avec l'IgG marquée du même sujet.

- Un système témoin singe TS qui consiste à sensibiliser les

plaques avec l'IgM du singe S8 avant inoculation et révéler avec

l'IgG marquée du même singe avant inoculation.

- Un système spécifique humain SpH qui consiste à sensibiliser

les plaques avec l'IgM de sujet atteint d'hépatite E pendant la

phase aiguë et révéler avec l'IgG marquée du même sujet pendant

la phase de convalescence.

- Un système spécifique singe Sp qui consiste à sensibiliser les

plaques avec l'IgM du singe S8 pendant la montée des

transaminases et révéler avec l'IgG marquée du même singe après

retour à la normale des transaminases.

Les IgG utilisées ont été marquées avec la bêta­

galactosidase et la péroxydase, et les substrats révélateurs de

ces enzymes sont respectivement

- le mélange: ONPG 4 mg/ml; PM2 ; bêta-mercapto~thanol 0,1 M

7 pl/ml PM2 ;

- l'OPD + tampon citrate + H202.

50

b) Méthode

Les plaques sensibilisées sont placées 1 heure à 37°C, puis

une nuit à +4°C.

- Laver les plaques avec le liquide de lavage PBS + Tween 20

à 1/1000.

- Saturer alors les plaques avec 200 ul de liquide de saturation

(BSA 0,5/1000, Tween 20 0,5/1000, PBS 100 ml)

- Placer les plaques à l'étuve à 37°C pendant 2 heures

Laver les plaques 3 fois et déposer les extraits de selles à

tester à raison de 100 pl/puits, laisser une heure à 37°C puis

une nuit à +4°C ;

- Laver les plaques 3 fois ;

Ajouter l'IgG marquée diluée dans le liquide de saturation à

la concentration de 1 gamma/ml

- Laver les plaques au moins 3 fois

- Ajouter les substrats spécifiques (100 pl/puib)

- Bloquer les réactions soit avec du carbonate 1,43 M si l'IgG

est marquée à la bêta-galactosidase soit avec l'acide sulfurique

4N si l'IgG est marquée avec la péroxydase.

c) - Résultats

51

SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE DANS LE SYSTEME TH/SpH AVEC DES IgGMARQUEES A LA PEROXYDASE

Selles testées système témoin TH système spécifique SpHPIN PIN

Tl 1,30 1,00T2 1 1,01T3 0,91 1,01T4 1,08 1,21T5 0,75 0,35T6 1,10 0,50T7 1,10 0,90T8 1,20 0,60T9 1,00 0,90Cyt 1 2,62* 3,18*Cyt 2 1,12 1,04Cyt 4 1,84 0,83Cyt 7 1,30 0,36Cyt 8 1,43 0,66Cyt 9 0,65 0,20Cyt 10 2,20* 0,84Cyt Il 0,80 3,72*Cyt 12 1,30 0,20Cyt 13 0,34 0,56Cyt 14 2,30* 1,81Cyt 15 1,53 0,45Cyt 16 1,65 2,54*Cyt 17 1,34 1,45Cyt 18 2,35* 2,18*Cyt 19 1,84 1,45Cyt 20 1,46 3,72*Cyt 21 1,28 0,72Cyt 22 0,80 0,63Cyt 23 1,57 0,74Cyt 24 7,26* 2,45*Cyt 25 3,11* 5,27*Cyt 27 1,23 0,81Cyt 28 2,11* 0,92Cyt 34 1,67 5,81*Cyt 35 1,60 0,47Cyt 36 4,07* 7,08*Cyt 37 5,01* 10,7*

Tableau n° 6

T = selles de sujets sainsCyt = selles de malades de Constantine

52

SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE TESTEES DANS LES SYSTEMESTH/SpH AVEC DES IgG MARQUEES A LA BETA-GALACTOSIDASE

Selles testées Système témoin TH Système spécifique SpHPIN PIN

Tl 1,30 1,00T2 1 1,01T3 0,91 1,01T4 1,08 1,21T5 0,75 0,35T6 1,10 0,50T7 1,10 0,90T8 1,20 0,60T9 1,00 0,90Cyt 1 2,62 * 3,18*Cyt 2 1,12 1,04Cyt 4 1,84 0,83Cyt 7 1,30 0,36Cyt 8 1,43 0,66Cyt 9 0,65 0,20Cyt 10 2,20* 0,84Cyt Il 0,80 3,72*cyt 12 1,30 0,20Cyt 13 0,34 0,56Cyt 14 2,30* 1,81Cyt 15 l,53 0,45Cyt 16 1,65 2,54*Cyt 17 1,34 1,45Cyt 18 2,35* 2,18*Cyt 19 1,84 1,45Cyt 20 1,46 3,72*Cyt 21 1,28 0,72Cyt 22 0,80 0,63Cyt 23 l,57 0,74Cyt 24 7,26* 2,45*Cyt 25 3,11* 5,27*Cyt 27 1,23 0,81Cyt 28 2,11* 0,92Cyt 34 1,67 5,81*Cyt 35 1,60 0,47Cyt 36 4,07* 7,08*Cyt 37 5,01* 10,7*

Tableau n° 7

T = sellés de sujets sainsCyt selles de malades de Constantine

53

SELLES DE CONSTANTINE DANS LE SYSTEME TS/SpS AVEC DES IgG

MARQUEES A LA PEROXYDASE

1 Selles testées Système témoin TS Système spécifique spsi

1 PIN PIN 1

1 1

1 Tl 1,80 1,02 1

1 T2 1,20 1,20 1

1 T3 l,50 0,53 )

1 T4 1,02 0,95 1

1 T5 1,60 1,30 1

1 Cyt 1 2,60 4,10* 1

1 Cyt 10 1,10 0,90 1

1 Cyt 14 1,60 1,45 1

1 Cyt 15 1,35 1,90 1

1 Cyt 18 2,32* 2,91* 1

1 Cyt 20 2,60* 3,10* 1

1 Cyt 24 2,08 5,2* 1

1 Cyt 25 2,19* 5,60* 1

1 Cyt 26 3,10* 4,9* 1

1 Cyt 28 1,60 1,20 1

1 Cyt 35 5,5* 11,9* 1

1 Cyt 36 2,97* 6,03* 1

1 Cyt 37 4,60* 10,70* 1

1 Cyt 38 3,60* 4,01* 1

Tableau n° 8

T selles témoins de sujets sains

Cyt = selles de malades de Constantine

54

SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE TESTEES DANS LE SYSTEME TSISpS

AVEC DES IgG MARQUEES A LA BETA-GALACTOSIDASE

Iselles testées 1 système témoin TS système spécifique SpS

1 1 PIN PIN

1 1

1 Tl 1 1,20 0,80

1 T2 1 0,80 0,60

1 T3 1 0,90 1,00

1 T4 1 1,00 1,18

1 T5 1 0,72 0,80

1 Cyt 1 1 1,90 4,20*

Cyt 10 1 1,12 0,80

Cyt 14 1 1,30 1,75

Cyt 15 1 1,10 1,20

Cyt 18 -1 1,23 2,70*

Cyt 20 1 1,35 2,80*

Cyt 24 1 1,80 5,6*

Cyt 25 1 2,07* 6,10*

Cyt 26 1 2,39* 4,7*

Cyt 281 1,20 0,90

Cyt 35 1 3,14* 12,6*

Cyt 36 1 2 7,05*

Cyt 37 1 3,11* 11,2*

Cyt 38 1 2,88* 3,9

Tableau n° 9

T = selles de sujets sains

Cyt = selles de malades de Constantine

55

Ces résultats montrent :

que le marquage à la péroxydase donne des réactions non

spécifiques dans 95 % des cas contre 64 % pour le marquage à la

bêta-galactosidase pour lequel nous avons opté.

- de même 60 % des réactions positives sont non spécifiques dans

le système humain contre 40 % dans le système singe. Nous avons

donc abandonné le système humain au profit du système singe que

nous avons cherché à améliorer.

Pour celà le lait écrémé à 4 % connu comme agent de blocage

non spécifique en Westernblot et qui en Elisa permet

l'utilisation de certains systèmes où les réactions non

spécifiques sont fréquentes (au risque de diminuer la

sensibilité) a été mis en jeu comme agent de saturation et de

dilution à la.place de la BSA.

Comme en atteste le tableau suivant aucune amélioration

sensible n'a été obtenue, seul le bruit de fond est diminué sans

que la positivité des réactions ne soit affectée.

56

SELLES DE CONSTANTINE TESTEES DANS LE SYSTEME TSISpS AVEC

COMME LIQUIDE DE SATURATION LE LAIT ECREME A 4 %

Selles testées système Témoin TS système spécifique spsi

PIN PIN 1

1

Tl 0,80 0,60

T2 0,45 0,40

T3 0,60 0,80

T4 0,80 1,50

T5 0,70 0,60

Cyt 1 1,05 5*

Cyt 10 0,90 0,50

Cyt 14 0,80 0,73

Cyt 15 0,63 0,58

Cyt 18 0,79 3,11

Cyt 20 0,90 4,5

Cyt 24 1,10 5,3

Cyt 25 1,81 6,90

Cyt 26 2,15* 4,93*

Cyt 28 0,80 0,79

Cyt 35 2,60* 11,5*

Cyt 36 1,03 6,8*

Cyt 37 2,6* 10,7*

Cyt 38 2,10* 4*

Tableau n° 10

T selles témoins de sujets sains

Cyt = selles de malaqes de Constantine

57

c'est dans ce contexte qu'une étude menée par l'équipe du

Pr J. PILLOT (61) devait nous orienter vers la recherche d'une

protéine non spécifique appelée "Protéine Fv". En effet, cette

étude met en évidence l'existence de cette protéine dans les

selles d'hépatite non-A non-B. Cette protéine est capable de se

combiner de manière non immune avec la maj orité des

immunoglobulines humaines quelque soit leur isotype ou leur

allotype. Ce facteur est également présent chez 35 % des

hépatites B ainsi que chez 6,7 % des témoins (fréquence attendue

des porteurs sains).

La protéine est spécifique du fragment Fab et plus

précisément du fragment Fv et du domaine VH.

La molécule est une sialoglycoprotéine acide (pHi = 4)

hydrophobe, trypsine et chymotrypsine résistante. Al' état natif,

son poids moléculaire apparent est de 175 Kda en SDS-PAGE

préparative, il est de 85 Kda, ce qui suggère une structure

dimérique. L'origine hépatique a été démontrée par sa détection

dans la bile et le foie de patients ayant subi une

transplantation hépatique pour hépatite non-A non-B fulminante.

Les meilleures conditions permettant de caractériser cette

protéine Fv mettent en jeu une IgM monoclonale préparée à partir

du sérum d'un sujet atteint de la maladie de Waldenstrom et une

IgG d'enfant de 6 mois à 1 an marquée à la péroxydase.

Par cette technique, nous avons recherché la protéine Fv

dans les selles du singe infecté expérimentalement par le VHE;

et dans les différentes selles de Constantine positives.

C'est ainsi que nous avons pu détecter chez le singe ce

facteur qui apparaît avant la montée des transaminases comme le

montrent les f igures suivantes; et qui serait un marqueur précoce

des hépatites.

58

Evolution de la protéine Fv chez le singe 58

300 1 1 10

-e- SGar-+- Prot Fv

2

8

200

1 X ?---i \ 16

§ t IV \ ~>~ en~ l!)01-<Cf'.J ~

4

1 1/ \ ~ 1100

908070605040302010

• '. 1 .' ., ' 1 1 1 1 1 1 1 1 l , l , I,l 0100

Jours

Evolution de la protéine Fv Chez le singe S8

300 1 1 la

-e- SGPT~ Prot Fv

2508

250

200

1 /~ 16

t 1S0r 1 1 \\ t;;. 0~ \0....

0 0Cf) '"'~

4

1 1 1 \\ A 1100

908070605040302010

• ',' l' " ' l , l , , , l , , , l , , 1 1 a100

Jours

f~t7-,--'- -

Ql,lant à la recherche de cette protéine dans les selles de

Constantine, les résultats obtenus sont les suivants

RECHERCHE DE LA PROTEINE Fv DANS LES SELLES POSITIVES DE

MALADES DE CONSTANTINE

1

Selles testées 1 système témoin système spécifique Protéine

Ts sps Fv

PIN PIN PIN

Tl 1,20 0,80 1,01

T2 0,80 0,60 1,20

T3 0,90 1,00 0,90

T4 1,00 1,18 0,70

T5 0,72 0,80 0,95

Cyt 1,90 4,20* 1,6

Cyt 18 1,23 2,70* 1,08

Cyt 20 1,35 2,80* 1,3

Cyt 24 1,80 5,6* 2,8*

Cyt 25 2,07* 6,10* 2,60*

Cyt 26 2,39* 4,7* 2,85*

Cyt 35 3,14* 12,6* 4,11*

Cyt 36 2 7,05* 3,8*

Cyt 37 3,11* 11,2* 4,7*

Cyt 38 2,88* 3,9* 3,01*

Tableau n° 11

T = selles témoins de sujets sains

Cyt = selles de malades de Constantine

61

D'après ces résultats, ces réactions non spécifiques

semblent liées à l'existence de cette protéine Fv qui est

présente dans 70 % des selles positives. Nous avons alors émis

l'hypothèse que le passage des selles sur immunoadsorbant d'IgM

monoclonale devrait donc éliminer ces réactions non spécifiques.

Préparation de L'immunoadsorbant

L'immunoadsorption sur Sépharose activé a été effectuée selon

la méthode de March et Cuatrecasas modifiée par l'introduction

de Bromure de cyanogène (BrCn) en solution dans l'acétronitrile.

Pour 50 mg de protéines à fixer, on utilise 10 ml de Sépharose

4B (Pharmacia) .A un volume de Sépharose 4B tassé par décantation,

on ajoute un volume d'eau distillée et 2 volumes de carbonate de

sodium 2M. Dans cette suspension, on introduit 1/20e de volume

de BrCn dissout dans l'acétonitrile, à raison de 2 g de BrCn pour

1 ml d'acétonitrile. Cette opération est effectuée rapidement,

sous hotte aspirante et avec agitation pendant 2 minutes.

Ensuite, le Sépharose est rapidement lavé sur un verre fritté n°

3 raccordé à une fiole à vide, avec un grand excès d'eau

distillée froide (4°C). On lave ensuite en tampon carbonate 0,1

M pH9 à +4°C. Après ce dernier lavage, le Sépharose est dispersé

toujours à +4°C, dans le tampon carbonate (10 ml pour 10 ml de

Sépharose). Les protéines dialysées en tampon carbonate 0,1 M pH

9 sont ajoutées, goutte à goutte en agitant, puis laissées sous

agitation douce à +4°C pendant 18 heures. Le Sépharose est

ensuite refiltré sur verre fritté, le filtrat est recueilli en

vue de calculer le rendement de fixation de la protéine au

Sépharose activé, par absorption à 280 nm. On traite ensuite

l'immunoadsorbant par l'éthanolaminé 1 M pH 9 pendant 2 h à la

température du laboratoire, en agitation douce afin de saturer

les sites actifs lib~es. Puis, l'immunoadsorbant est traité par

l'agent d'élution qui sera utilisé ultérieurement pour extraire

la substance fixée chlorure de magnésium 5 M ou un tampon

glycine pH 2,8 ou encore un mélange d'acide acétique dioxane pH

2,9 (acide acétique 0,2 M + 10 % de dioxane). Après lavage en eau

physiologique, l'immunoadsorbant est prêt à l'emploi.

62

Technique

Les selles à tester sont adsorbées par addition de 2 volumes

d'extraits de selles à un volume d'immunoadsorbant. Le mélange

est maintenu sous agitation douce une nuit à +4°C. Centrifuger

alors 10 min à 2.000 tlmn et recueillir les surnageants qui sont

à nouveau testés par la technique décrite précédemment.

selles testées système témoin Ts système spécifique spsl

PIN PIN 1

1

Tl 0,88 0,80 1

T2 1,04 0,92 1

T3 1,16 1 1

T4 1,12 1,44 1

Cyt 26 0,8 0,8 1

Cyt 35 1,16 14,56* 1

Cyt 37 1,24 3* 1

Cyt 38 0,84 1,32 1

Tableau n° 12

T selles témoins de sujets sains

Cyt selles de malades de Constantine

63

Comme le montre le tableau précédent, pour les quatre selles

étudiées, deux conservent leur activité en système spécifique

tandis que les deux autres la perdent. Ce qui est en faveur pour

ces dernières d'une interférence de la protéine Fv.

Ces résultats semblent donc confirmer notre hypothèse et

nous ont conduit à la recherche de l'antigène VHE et de la

protéine Fv dans les selles du singe infecté, dans différentes

selles de sujets atteints d'hépatite épidémique à Constantine

et à Bangkok après passage systématique sur immunoadsorbant,

avant d'entreprendre cette même étude sur les selles de sujets

atteints d'hépatite aiguë à Dakar et dans sa région.

Résultats :

1) chez le singe infecté l'antigène VHE est détectable dès

la troisième semaine après l'inoculation c'est-à-dire pendant la

période d' incubation, avant la montée des transaminases (cf

courbes suivantes).

64

Evolution de l'AgVHE dans les selles du singe S8

300 i 1 30

250

-0-

-+-SGPTAgVHE

toU')

200

150

100

50

20

10

~:r:;>00~

lîI\.0

908070605040302010......' l , l , Iii , 1 1 l , l , 1 1 1 1 1 0

100

Jours

t~_·

....•.•••""'y

Evolution de l'AgVHE dans les selles du singe 58

300 1 1 30

-0-

......SGOTAgVHE

boCf)

200

100

20

10

~

::c:>0.0~

\0\0

908070605040302010

.".. , l , , l , 11ft , 1 ) 1 l , l , , 1 1 a100

Jours

<rWmr'-"~fl(.('

2) Résultats des selles de malades de Constantine

REEXAMEN DES SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE APRES PASSAGE

SUR IMMUNOADSORBANT D'IgM MONOCLONALE

1 1

selles testéeslsystème Témoin Tslsystème spécifique Protéine 1

PIN Sps PIN Fv

Tl 1,20 0,90 0,80

T2 0,90 0,80 0,60

T3 0,90 1 0,60

T4 1,20 1,10 0,30

T5 0,70 0,78 0,50

Cyt 1 2,05 4,30* 0,90

Cyt 10 1,12 1,00 0,80

Cyt 14 1,40 1,36 0,96

Cyt 15 1,01 1,20 0,50

Cyt 20 1,20 3,10* 0,68

Cyt 24 1,20 6,9* 0,45

Cyt 25 l,50 6,20* 0,50

Cyt 26 0,95 1,28 0,61

Cyt 28 1,12 1,00 0,72

Cyt 35 1,1 14* 0,81

Cyt 36 0,95 6,9* 0,85

Cyt 37 1,1 3,5* 0,65

Cyt 26 0,95 1,28 0,50

Tableau n° 13

T = selles témoins de sujets sains

Cyt selles de malades de Constantine

67

3) Résultats des selles de malades de Bangkok

SELLES DE MALADES DE BANGKOK APRES PASSAGE

SUR IMMUNOADSORBANT D'IgM MONOCLONALE

1 1 1

Selles testéeslsystème Témoin Tslsystème spécifique Protéine 1

Tl

T2

T3

T4

T5

SR002

SR008

SR012

SR021

SR022

SR028

SR031

SR036

SR046

SR050

SR051

SR053

SR059

SR064

SR066

RTA050

RTA056

HH153

SR019

Tableau n° 14

Tl, T2 . . .SR - RTA - HH

PIN PIN Fv

1,12 l,OS 1,03

0,80 1,02 0,03

1,5 0,68 0,70

0,35 0,20 1,35

1,83 l,6O l,51

0,7 0,9 0,90

1,8 1,5 0,89

0,65 0,5 0,79

1,25 1,5 0,93

0,8 0,52 0,43

0,70 0,50 0,50

0,68 0,50 0,53

1,89 1,6 1,12

2,01 1,7 l,50

0,60 0,4 0,42

l,50 0,6 0,69

0,62 2,9* 0,80

0,50 0,7 0,90

0,91 3,1* 0,60

0,82 2,5 l,OS

0,60 3,6* l,2O

0,60 0,60 0,56

0,50 0,49 0,46

0,6 2,7* 0,78

selles témoins de sujets sains

selles de malades de Bangkok

68

Dès lors, nous avons alors entrepris un contrôle de la

spécificité du système de détection que nous avons mis au point.

Pour ce faire :

- 18 selles de malades atteints d'hépatite aiguë à Dakar ont été

testées dans notre système de même que 18 selles de sujets

témoins ne souffrant d'aucune atteinte hépatique évidente.

- des réactions d'inhibition et des réactions témoins utilisant

différents anticorps d'une part, et les selles positives d'autre

part, ont été réalisées.

69

CONTROLE DE LA SPECIFICITE DE LA REACTION

1.) Par recherche de l'antigène VHE chez les différents

sujets atteints d'hépatite aiguë à Dakar.

Selles test'ées Nombre 1 Protéine F Nombre de positifl

en AgVHE 1

1

Selles de sujets 4 2 1 1

atteints d'hépa-

tite A

Selles de sujets 9 4 0

atteints d'hépa-

tite B

Selles de sujets 3 1 0

atteints d'hépa-

tite C

Selles de sujets 1 0 0

atteints d'hépa-

tite à CMV

selles de sujetsl 1 0 0

atteints d'hépa-I

tite à EBV

Selles de sujetsl 18 5 0

témoins dakaroisl

ne souffrant d'

aucune atteinte

hépatique évi-

dente.

Tableau n° 15

70

2.) Réactions d'inhibition

a) principe

Les selles adsorbées après passage sur immunoadsorbant d'une

IgM monoclonale sont incubées avec des sérums contenant des

anticorps antiVHE.

Les antigènes VHE sont alors supposés se complexer et ne

devraient plus réagir ultérieurement, lorsqu'ils sont mis en

réaction dans le système de détection précédemment défini.

b) Technique

On réalise différentes dilutions (1/10, 1/20, 1/40, 1/80,

1/100) à partir d'un mélange d'IgM et d'IgG provenant du singe

S8 infecté par le VHE, à 2,5 mg/ml pour chaque immunoglobuline.

A 100 pl de cette solution d'anticorps spécifiques, on

ajoute 100 fI de selles antérieurement reconnues comme contenant

l'antigène associé à l'infection par le VHE.

Laisser en contact 2 heures à 37°C puis une nuit à +4°C.

Passer à nouveau les selles dans le système spécifique.

c) résultats

71

Résultats

1 lavant inhibition 1après inhibition

Iselles testées Ac anti-VHEI PIN PIN

1

1 Pl 1/10 6,9 0,90

1 1/20 0,89

1 1/40 0,93

1 1/80 1,37

1 1/100 l,50

1

1 P2 1/10 6,20 1,18

1 1/20 1,12

1 1/40 1,10

1 1/80 1,25

1 1/100 1,35

1 P3 1/10 6,9 0,60

1 1/20 0,90

1 1/40 0,80

1 1/80 1,01

1/100 1,63

P4 1/10 3,10 1,10

1/20 1,25

1/40 1,80

1/80 2,10*

1/100 2,30*

P5 1/10 3,50 0,60

1/20 0,80

1/40 0,80

1/80 0,83

1/100 0,90

Tableau n° 16

Pl - P2 .•• = selles positives dans le système de détection

spécifique.

72

Pour savoir si l'inhibition était obtenue avec les IgM ou

avec les IgG, l'une des selles positives (Pl) a été incubée et

avec les IgM, et avec les IgG du singe infecté à 2,5 mg/ml

diluées au 1/10, 1/20, 1/40, 1/100, 1/200e.

Les résultats obtenus sont les suivants

Iselle positive Selle positive Selle positive 1

1dans le système de incubée avec les incubée avec les 11détection PIN IgM antiVHE (2,5 IgG antiVHE (2,5 1

mg/ml) diluées mg/ml) diluées 1dilutions PIN dilutions PIN 1

1

Pl 6,9 1/10 0,375 1/10 1,75 11/20 0,375 1/20 0,3751

1/40 0,31 1/40 0,9381

1/80 0,25 1/80 0,19 11/100 1,00 1/100 0,81 1

1/200 1,00 1/200 0,81 1

Tableau n° 17

Ces résultats montrent bien que la réaction d'inhibition

est obtenue avec les deux types d'anticorps et que le test de

dépistage semble spécifique.

Pour confirmer cette spécificité des réactions témoins ont

été réalisées.

73

3.) Réactions témoins

Pour réaliser ces réactions témoins l'une des selles

positives est incubée avec des sérums de malades dilués au 1110e,

au 1/50e, et au 11100e et contenant soit des IgM antiHAV, soit

des IgM antiHbc, soit des IgM antiCMV, soit des IgM antiVCA et

avec le sérum du malade contenant des IgM antiHAV, et dont les

selles s'étaient avérées positives dans notre système et que nous

avons appelé sérum douteux.

Résultats

serum conte- Sérum conte- Sérum contenant Sérum contenant Sérum douteux

nant des IgM nant des IgM des IgM anti VCA des 1gM ant i CMV

anti HAV ant i Hbc

dilutions PIN di luti ons PIN di lutions PIN DILUTIONS PIN di lutions PIN

selle posi-

tive P/N=6,9

1/10 5,31 1/10 5,00 1/10 5,62 1/10 5,75 1/10 D,50

1/50 5,31 1/50 5,37 1/50 5,56 1/50 5,56 1/50 0,93

1/100 6,062 1/100 5,37 1/100 5,18 1/100 7,87 1/100 1,50

Ces réactions témoins prouvent donc que ce test est bien

spécifique et la réaction d'inhibition obtenue à partir du

sérum "douteux" nous permet de conclure que ce sérum contient

et des anticorps antiHAV et des anticorps antiVHE.

74

DEUXIEME PARTIE:

DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE

DE l'HEPATITE C :

ETUDE CRITIQUE DES TESTS

DE DETECTION

DES ANTICORPS ANTIHCVg

Depuis que la recherche systématique de l'antigène HBs chez

les donneurs de sang a été rendue obligatoire dans de nombreux

pays, l'incidence des hépatites post-transfusionnelles a diminué

de manière très sensible mais beaucoup moins qu'on ne pouvait

l'espérer.

En effet, il a été montré que l'hépatite C représente à

l'heure actuelle 50 à 90 % des hépatites post-transfusionnelles

(81) et constitue pour certains pays un véritable fléau en santé

publique.

Des tests de détection des anticorps anti VHC dans le sérum

ou dans le plasma ont été mis au point permettant certes de

réduire cette redoutable complication des transfusions sanguines.

Ces anticorps reconnaissent une protéine de la région non

structurale du VHC probablement impliquée dans la réplication

virale. L'avantage de ce point est qu'il existerait une relation

entre le taux de l'anticorps anti-HCV et la réplication virale

et donc l'infectiosité du sérum.

Des études expérimentales sur le chimpanzé menées par Weiner

et al. (85) ont permis de le démontrer.

Mais ces tests posent des problèmes de spécificité comme

le prouvent les études suivantes.

75

AI METHODES DE DETECTION DES ANTICORPS ANTIHCV

A l'heure actuelle, pour la recherche des anticorps antiHCV

nous disposons de techniques immunoenzymatiques :

- tests de screening en Elisa (Ortho Elisa et Abbott ElA).

- tests de confirmation par immunoblot (Chiron Riba, Abbott

Inhibition) (53).

Tous ces tests présentent des points communs et quelques

points différentiels.

1) - POINTS COMMUNS

a) - principe

Tous ces tests ont le même principe à savoir

un support réactionnel revêtu d'un antigène recombinant

spécifique de HCV est mis en contact avec le sérum ou le plasma

à tester.

si l'anticorps antiHCV est présent dans le prélèvement, des

complexes antigène-anticorps vont se former à la surface du

support réactionnel après incubation.

Dans le cas contraire, aucun complexe ne se fixera, et les

protéines plasmatiques ou sériques libres seront évacuées lors

du lavage.

Une immunoglobuline anti humaine marquée à la peroxydase

est alors ajoutée et peut se fixer aux anticorps spécifiques

déjà couplés aux antigènes ,viraux.

si ces complexes immuns sont absents, le conjugué libre est

évacué au cours du lavage.

Enfin, un système de détection enzymatique spécifique est

ajouté entraînant l'apparition d'une coloration révélatrice de

la présence d'anticorps antiHCV.

La réaction est stoppée soit grâce à un réactif bloquant

(H2S04) , soit par lavage et l' intensité de la coloration est

proportionnelle à la quantité de conjugué lié et par delà à la

concentration d'anticorps anti-HCV présents dans le prélèvement.

b) - l'antigène

76

Il s'agit d'un antigène recombinant spécifique de HCV et

préparé de la manière suivante :

Concentré d'Antigènes HCV

ARN HCV extrait

ADNC synthétisé

Insertion au phage

9Transfection de

E. Coli

( 5QZ><SZ>e;z;>J

~gt

11

Transfection

levure

Protéine 5-1-1

Isolement d'un clone réagissant

avec le sérum d'un chimpanzé

contenant le HCV...~ 1 1 bJ-{

0===lTFr~Protéine C-100-3

~ /utilisées comme source d'Ag

recombinant spécifique de HCV.

77

2) - POINTS DIFFERENTIELS

a) - le support

Il est constitué

- soit de micropuits revêtus de l'antigène pour le kit Ortho,

- soit de billes revêtues du même antigène pour le kit Abbott

ou encore

- de membrane de nitrocellulose pour les tests de confirmation.

b) - les immunoglobulines marquées

Pour les tests screening, l'immunoglobuline marquée est une

immunoglobuline monoclonale de souris antihumaine dans le système

ortho, alors qu'il s'agit d'une immunoglobuline polyclonale de

lapin antihumaine dans le test Abbott.

Quant aux tests de confirmation, les immunoglobulines

marquées utilisées sont des immunoglobulines de chèvre anti IgG

humaine.

78

BI - ETUDE DE LA SPECIFICITE DE CES TESTS

1) Méthode

Pour étudier la spécificité de ces tests une étude

rétrospective a été réalisée sur différents sérums présentant

une réaction positive :

en IgM anti HAV = 10

en latex waaler rose = 10

en facteur antinucléaire, antiDNA = 20

et sur des sérums de sujets atteints d'hépatites auto­

immunes = 13

- ou de cirrhoses alcooliques = 142

Chacun de ces sérums a été étudié dans les 4 tests

précédemment cités.

2) Résultats

Les résultats obtenus ont été consignés dans le tableau

suivant :

79

1Sérums Nombre Ortho 1 Chiron Abbott Abbott

1 testé Elisal Riba ElA inhibition

1 1

lanti HAV IgM+ la 3 1 1 3 2

1 1

lanti Hbc IgM+ 9 a / a a a

1 1

1 latex Waaler la 4 1 2 2 1

IRose + 1

1

1 Facteur anti- 20 la 1 4 5 1

1 nucléaire 1

lantiDNA + 1

1

1 Hépatites 13 7 1 4 7 6

1auto-immunes 1

1

/cirrhoses 142 42 1 22 38 11

1 alcooliques 1

1

Tableau n° 18

Que faut-il conclure de cette étude ?

1) - les sérums trouvés positifs en Elisa ne sont pas tous

confirmés par les tests proposés et les discordances observées

(surtout pour les sérums faiblement positifs) ne permettent pas

de rendre un résultat sûr.

2) l' hétérogénéité de ces résultats montre que

llutilisation des tests de confirmation est nécessaire et sans

doute pas suffisante pour établir le diagnostic d'une infection

par le virus c, notamment dans les situations pathologiques, où

aucun facteur de risque n1est rapporté.

80

TROISIEME PARTIE:

ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE

DES HEPATITES

NON-A NON-B A DAKAR ET

DANS SA- REGION

~S~..1l

A - RECHERCHE DE L'HEPATITE E DANS UNE POPULATION

DE SUJETS ATTEINTS D'HEPATITE AlGUE A DAKAR

1) Méthode

Cette étude porte sur 30 cas de sujets adultes atteints

d'hépatite aiguë parfaitement définie sur le plan clinique. Sur

le plan biologique, le dosage des transaminases sériques (SGOT­

SGPT) , de la bilirubine (directe, indirecte et totale), des

phosphatases alcalines et des gammaGT ont permis de confirmer le

diagnostic d'hépatite.

Le retour à la normale des transaminases 3 mois après, et

un contrôle clinique, ont permis de confirmer le diagnostic

d'hépatite aiguë.

A partir des sérums de ces malades, différents marqueurs

viraux ont été recherchés, à savoir :

- les IgM anti-HAV,

- l'antigène HBs et les IgM anti-HBc,

- les IgM anti-CMV,

- les IgM anti-vCA,

- les marqueurs de la fièvre jaune.

2) Résultats

Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau suivant:

82

RECHERCHE DES MARQUEURS VIRAUX DANS LES SERUMS DE SUJETS

ATTEINTS D'HEPATITE AlGUE

Marqueurs d'hépatite

IgM anti-HAV

Antigène HBs

dont IgMHbc+

dont IgMHbc­

IgM anti-VCA

IgM anti-CMV

IgM anti-virus amaril 1

Tableau n° 19

Nombre de cas positifs

4

9

5

4

1

1

o

D'après ces résultats, nous pouvons déduire que 50 % de ces

hépatites aiguës de l'adulte sont NANB.

Nous avons alors entrepris la recherche des anticorps anti

HCV dans les sérums correspondants. Pour ce faire, les sérums

d'hépatite NANB ont été testés dans les kits Abbott et dans les

kits Ortho.

Les résultats suivants ont été obtenus

Noobre Noobre X Noobre X

SérUllS NANB Positifs Ortho Positivité Ortho Positifs Abbott Positivité Abbott

15 3 20 3 20

Tableau n° 20

83

Ces résultats ont été confirmés par des tests de

confirmations disponibles également, et commercialisés par les

mêmes laboratoires que précédemment cités. Ces tests montrent

que les anticorps anti-HCV sont effectivement présents dans 20%

des cas.

A partir des selles de ces sujets et des selles témoins,

nous avons recherché l'antigène VHE, et les résultats obtenus

sont consignés dans le tableau suivant :

Nombre de positifsen AgVHE

Nombre1

\selles testées

1

1,--------------+----------------

Selles de sujetsatteints d'hépatite A

4 1

Selles de sujetsatteints d'hépatite B

9 o

Selles de sujetsatteints d'hépatite C

3 o

Selles de sujetsatteints d'hépatiteà CMV

1 o

Selles de sujetsatteints d'hépatiteà EBV

1 o

Selles de sujetsatteints d'hépatiteà sérologie négative

12 5

Selles de sujets témoinsDakarois ne souffrantd'aucune atteinte hép­tique évidente

30 1

Tableau n° 21

84

Nous constatons que parmi les 12 sujets atteints d'hépatite

non A non B non C, 5 présentent une réaction positive en AgVHE.

En guise de contrôle ces 12 selles ont été testées à nouveau

dans notre système spécifique singe après passage sur

immunoadsorbant, et les résultats suivants ont été obtenus

RECHERCHE DE L'ANTIGENE VHE CHEZ DES SUJETS ATTEINTS

D'HEPATITE AlGUE NANB A DAKAR

Selles testées système Ts Système Sps

PIN PIN

Tl 0,80 0,60

T2 1,12 0,90

T3 0,83 0,72

T4 0,79 0,81

T5 1,25 0,98

81 1,12 0,93

82 1,89 1,13

83 0,78 0,66

84 0,74 0,80

85 0,92 0,90

86 1,42 1,23

87 1,66 1,67

88 1,06 4,5*

89 1,61 7,9*

810 1,31 12,6*

811 0,91 11,9*

812 1,09 6,3*

8 = selles de sujets atteints d'hépatite aiguë NANB à DAKAR

T selles de sujets témoins.

Tableau n° 22

85

Cinq de ces selles sont effectivement positives en AgVHE

soit un pourcentage de 41,66 % des hépatites non A non B

non C.

D'après cette étude, si aucun cas d'épidémie d'hépatite n'a

été signalé à ce jour au Sénégal, nous pouvons cependant affirmer

qu'il existe des cas sporadiques d ' hépatite non A non B qui

représentent 50 % des hépatites aiguës dans notre étude dont 17

% sont confirmés en VHE et 10% en VHC.

86

B - ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C

Cette étude a pour but :

- de déterminer la prévalence du portage des anticorps anti HCV

dans la population générale et chez les donneurs de sang ;

- de rechercher les facteurs de risque de portage des anticorps

antiHCV ;

- de rechercher une corrélation entre la présence des anticorps

anti HCV et des marqueurs indirects tels que les transaminases

sériques (SGOT - SGPT) dont la recherche systématique est rendue

obligatoire dans certains pays, mais non encore pratiquée au

Sénégal.

- d'évaluer le risque de transmission de l'hépatite C pour 100

unités de sang transfusées par rapport à d' autres affections

transmissibles par voie parentérale telles que la syphilis, le

SIDA ou encore l'hépatite B.

1 - Détermination de la prévalence du portage des

anticorps anti HCV dans la population générale.

Cette étude porte sur 950 suj ets apparemment sains, répartis

en deux groupes, representatifs de la population sénégalaise.

Le premier groupe comprend 500 sujets de 15 à 55 ans et le

deuxieme groupe 450 sujets de 55 à 90 ans.

Ces suj ets sont groupés par tranche d'âge et les sérums

sont étudiés unitairement à l'aide du test Elisa screening Ortho.

Chaque échantillon positif ou douteux est réétudié et

confirmé en immunoblot (Riba anti HCV Ortho) puis reclassé parmi

les sérums anti HCV positifs ou négatifs.

Les résultats montrent :

a) une prévalence globale de portage de 0,73 % avec une

certaine variabilité suivant la tranche d'âge considérée (cf.

histogramme de répartition des âges).

87

Lill ELISA positifEJ RIBA positif

% 20

10

Prévalence du portage des anticorps anti-HCV dans la populationgénérale suivant les classes d'âge

coco

ifll'f,~""'····, .~:.:.~

15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-55 56-59 60-64 65-69 70-74 > 74

Age

b) - qu'il n'y a pas de différence significative suivant le sexe.

Test de Fisher (p = 0,45).

HCV Femmes Hommes Total

négatifs 490 4S3. 950

positifs 5 2 7

Prévalence 1,02 ~ O,4S ~ 0,73%10 0

1

Tableau n° 23

2 - Détermination de la prévalence du portage des

anticorps antiHCV chez les donneurs de sang.

L'étude porte sur 383 donneurs, bénévoles, non sélectionnés

prélevés au Centre National de Transfusion Sanguine de DAKAR.

A partir de leur sérum la recherche des anticorps antiHCV

a été effectuée.

Les résultats montrent une prévalence du portage des

anticorps antiHcV de 0,5 % après confirmation.

Les donneurs sont alors divisés en 2 groupes distincts :

les porteurs de l'AgHbs et les non porteurs afin de trouver une

corrélation entre le portage de l' AgHBs et la présence des

anticorps anti HCV.

Résultats

Nombre de cas

HCV +

AgHBs +

56

1

89

AgHBs-

325

1

Soit une prévalence du portage des anticorps anti HCV de

1,78% chez les donneurs AgHBs+ versus 0,3 % chez les donneurs

AgHBs-. P = 0,27 non significatif.

3 - Recherche des facteurs de risque de portage des

anticorps antiHCV.

Compte tenu des données épidémiologiques et cliniques en

ce qui concerne l' hépati te C, 3 facteurs de risque ont été

recherchés :

- l'hospitalisation,

- la transfusion,

- antécédent d'hépatite.

Les résultats obtenus sont les suivants

Facteurs de 1 Nombre total HCV HCV

risque 1 positifs négatifsl

1

Hospitalisation 1 83 1 82

1

Transfusion 1 5 0 5

1

Antécédent 1 17 2 15

d'hépatite 1

1

Sans antécédent 1 769 4 765

Tableau n° 24

90

D'après ces résultats il n' y aurait pas de différence

statistiquement significative entre

le groupe témoin et le groupe de suj ets ayant déj à été

hospitalisés (p = 0,21),

- le groupe témoin et les sujets ayant déjà été transfusés.

Par contre le risque est net chez des sujets ayant des

antécédents d'hépatite (p = 0,000016).

Nous avons également cherché à établir une relation entre

la présence des anticorps antiHCV et des marqueurs indirects des

hépatites. Pour ce faire les sujets sont divisés en 2 groupes

- ceux ayant des transaminases normales (SGOT-SGPT < 25 UI/I)

- ceux ayant des transaminases élevées (SGOT-SGPT > 25 UI/I).

(technique Biomérieux)

Les résultats montrent

6

96

102

sujets ayant des

transaminases sé-I

riques élevées

1

847

848

sujets ayant des

transaminases sériques

normales

1

1

1

1---------------------------.-,

IHCV

Ipositifs

1

IHCV

1 négatifs

1

1Total

Tableau na 25

faut souligner que les deux donneurs

ont des transaminases élevées.

les 2 groupes est statistiquement

et on peut dire qu'il existe une

des anticorps antiHCV et le taux

La différence entre

significative (p = 8.10-6

corrélation entre le portage

de transaminases sériques.

Dans le même sens, il

antiHCV+ dans notre étude,

91

4 - Evaluation du risque de transmission de l'hépatite C

pour 100 unités de sang transfusées par rapport a

d'autres maladies transmissibles par voie parentérale.

Chez les donneurs de sang, si le dépistage n'était pas fait,

,le risque de transmission de :

- l'hépatite B serait de 14,62 % (73 donneurs/500 sont AgHbs+)

- celui de transmettre le SIDA serait de 1,04 % (6 donneurs/500

sont HIV+)

celui de transmettre la syphilis serait de 0,78 % (4

donneurs/500 sont BW +)

- et enfin celui de transmettre l'hépatite C est de 0,50 % (2

donneurs/500 sont antiVHC +) .

92

DISCUSSION GENERALE

l - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE E

A - ETUDE EXPERIMENTALE SUR L'ANIMAL

Cette étude que nous avons menée, permet de conclure

1. Les espèces de singe retrouvées au Sénégal sont

sensibles au VHE et pourront ainsi être utilisés comme source

d'antigène pour nos travaux ultérieurs.

2. La sensibilité des singes au VHE est variable d'une

espèce à l'autre.

3. Le temps d'incubation de la maladie varie de 10 à 30

jours. Ce délai a largement été confirmé par de nombreux auteurs

(23-26-65) et lion retient aujourd'hui que la période

d'incubation varie en moyenne de 20 à 32 jours.

4. L'élévation des transaminases constitue un bon

marqueur biochimique de l'hépatite E.

5. Le virus de l' hépatite E est probablement sensible

au chloroforme voir même inactivé (30).

Cette sensibilité du virus à différents agents chimiques a

également été rapportée par d'autres auteurs (31-71) et

récapitulée dans le tableau suivant

PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ET BIOLOGIQUE DES AGENTSRESPONSABLES DES HEPATITES NANB

Filtration 220 nm

chaleur (60 0, 10h)

Formol (1/1000)

Chloroforme 10%

Ethanol

Tableau n° 26

93

passe

sensible

sensible

sensible

sensible ou non

Quant aux méthodes que nous avons utilisées pour le

dépistage des sujets infectés par le VHE, une étude critique

nous permettra de mieux opter pour une technique.

B - ETUDE CRITIQUE DES TECHNIQUES UTILISEES

POUR LE DEPISTAGE DES SUJETS INFECTES PAR LE VHE

1 - L1immunofluorescence pour la recherche des

anticorps antiVHE

Par la méthode de recherche que nous avons utilisée, nous

n'avons pu détecter aucun anticorps antiVHE dans les sérums

testés parce que très probablement le foie que nous avons utilisé

comme source d'antigène ne contenait pas le VHE.

En effet, une étude américaine ultérieure menée au Center

of Diseases Control par BRADLEY et collaborateurs (16), et

utilisant la même technique, s'est soldée par des résultats

positifs. Ils ont pu retrouvé le VHE dans les hépatocytes de

foie de singe infecté expérimentalement le premier jour de la

montée des transaminases, et ont mis au point un système de

détection des anticorps antiVHE à partir de ce foie (17).

Nous avons donc déduit que la réplication du VHE dans le

foie était très brève et que les biopsies que nous avons

utilisées avaient été réalisées trop tardivement.

Par ailleurs, il nous plaît de souligner que nos différents

sérums ont été contrôlés par la même équipe et que le sérum de

notre singe S8 a été retrouvé positif en anticorps antiVHE après

inoculation et négati f avant inoculation. ·Mais il faut le

reconnaître il s'agit là d'une méthode qu'on ne peut utiliser en

routine et qui reste réservée à la recherche; parce que :

- les réactifs ne sont pas renouvelables,

- il y a difficulté de standardisation.

Les appl ications possibles seraient l 'util isation dl un sérum

confirmé positif en anticorps, marqué, qui servirait à rechercher

l'antigène VHE dans les coupes de foie; ou bien l'utilisation

d'un système foie positif/sérum marqué positif utilisable pour

94

la sérologie en série dans un test de blocage (les sérums étudiés

seront alors utilisés non marqués) .

2 - Recherche du virion dans les selles

a) - par microscopie électronique

Bien qu'ayant multiplié nos recherches et essayé de

nombreuses techniques de microscopie électronique, les résultats

sont restés négatifs, cependant qu'il était montré dans certaines

études la présence de particules de 27 à 32 nm dans les selles

de suj ets atteints d 1 hépatite E (15). Mais il convient de

préciser que ces particules n'étaient retrouvées que dans 4 % des

cas.

De ces expériences nous avons déduit :

- que la quantité de VHE éliminée dans les selles était faible

nécessitant donc un enrichissement. Cette déduction était

d'autant plus logique que des méthodes de purification virale

par gradient de sucrose ou de chlorure de Césium que nous avons

entreprises ne nous ont jamais permis d'isoler le virus à partir

des selles. Toutes ces difficultés, de même que le faible

pourcentage de positivité constaté limitent donc l'utilisation

de cette méthode.

b) - par culture cellulaire

Tous nos essais de culture cellulaire sur lignée

hépatocytaire HepG2 et PLcPRF5 ne nous ont pas permis d'observer

un effet cytopathogène caractéristique du VHE.

Le VHE ne provoque-t-il pas d'effet cytopathogène ? In

vitro, il est difficile de répondre à cette question puisque

jusqu'à ce jour aucune équipe de chercheurs n'a pu cultiver ce

virus.

si cet échec constaté face aux techniques usuelles de

culture virale pourrait s'expliquer par une fragilité du virus,

ou encore par des conditions de conservation difficiles à

respecter il semble plutôt lié à la nature du produit

95

pathologique en l'occurrence les selles qui peuvent contenir de

nombreuses substances cytotoxiques.

Il faudrait dans ce cas peut-être avoir recours à des

techniques de purification virale à partir des selles, ou de la

bile, où le virus semble également présent avant d'entreprendre

la culture cellulaire.

In vivo, les biopsies hépatiques que nous avons effectuées

chez le singe infecté expérimentalement n'ont révélé aucune

lésion caractéristique au niveau des hépatocytes.

Par contre chez l'homme des études bien documentées portant

sur des biopsies de foie réalisées chez des sujets décédés

d'hépatite E fulminante ont permis de décrire des lésions

caractéristiques (22-35-64-65). Mais les différents résultats

présentés ne sont pas tous concordants et des investigations plus

poussées seraient certes nécessaires.

3 - Recherche de l'antigène VHE par techniques

immuno-enzymatiques.

Les différentes techniques mises au point permettent de

tirer les conclusions suivantes :

La recherche de l'antigène VHE dans les selles à partir

d'un système humain donne de moins bons résultats que le système

singe. Nous avons émis l'hypothèse que dans les selles on peut

retrouver des substances telles que les lipopolysaccharides

bactériens, et certains germes saprophytes de la flore

intestinale, qui peuvent se lier aux sites anticorps des IgM

fixées sur le support réactionnel, et aux fragments Fab des IgG

marquées donnant des réactions non spécifiques (95 % dans notre

étude). C'est la raison pour laquelle nous avons abandonné le

système humain au profit du système singe que nous avons

optimisé.

En fait, à côté des substances d'origine bactérienne de la

flore intestinale saprophyte il existe d'autres substances non

spécifiques pouvant se lier soit aux IgG, soit aux IgM de manière

non immune et pouvant interférer avec le système spécifique.

En effet, d'après nos résultats, la protéine Fv que nous

96

avons décrite précédemment semble être la principale cause de

ces réactions non spécifiques puisque le passage des selles sur

immunoadsorbant d' IgM monoclonale qui élimine la protéine Fv fait

disparaître ces réactions dans 100 % des cas.

Mais il faut cependant remarquer que lorsque le seuil de

positivité est faible (PIN < 3) l'utilisation de

l'immunoadsorbant peut perturber les réactions dans la mesure

où une partie de l'antigène spécifique peut se fixer sur

l'immunoadsorbant donnant ainsi de faux résultats négatifs. Dans

de tels cas, le contrôle devra Si effectuer par des réactions

d'inhibition sur des selles non adsorbées.

Mais il faut cependant dire que si la protéine Fv est source

de réactions non spécifiques, sa recherche semble fort

intéressante dans la mesure où elle est le témoin précoce d'une

inflammation hépatique. Chez le singe, elle apparait 20 jours

après 11 inoculation alors que les transaminases ne s'élèvent

qu'au bout de 25 jours.

Chez l'homme, à défaut d'étude menée avant la montée des

transaminases, ont peut dire que son apparition dans les selles

est contemporaine de l'élévation des transaminases sériques.

Le passage en revue de toutes les techniques que nous avons

util isées pour le dépistage des suj ets infectés par le VHE,

révèle que les meilleurs résultats ont été obtenus avec les

techniques immunoenzymatiques; qui pour être valables, rappelons

le doivent utiliser :

- des anticorps antiVHE d'origine non humaine

- des IgG marquées à la béta-galactosidase qui révèlent moins

la protéine F que les IgG marquées à la péroxydase. Des études

menées par l'équipe du Professeur Jacques PILLOT (61) l'ont

effectivement prouvé.

et enfin des selles passées sur immunoadsorbant d'IgM

monoclonale pour éliminer les réactions non spécifiques.

97

· '..~"!§,

;.

C- ACQUISITIONS ET PERSPECTIVES

Grâce à ces techniques immuno-enzymatiques, nous avons pu

mettre au point une méthode spécifique reproductible de

détection de l'antigène VHE dans les selles des malades infectés.

Malgré une variabilité des souches de VHE provenant de

différentes régions du globe, signalée par certains auteurs,

nous pouvons dire qu'il existe au moins une communauté

antigénique entre ces différentes souches.

En effet par cette technique, nous avons pu retrouver

l'antigène VHE dans les selles de malades atteints d'hépatite E

de différentes provenances

- de la Thaïlande (dans 26 % des selles de malades de Bangkok)

- de l'Afrique du Nord (dans 38 % des selles de malades de

Constantine) .

- de l'Afrique de l'Ouest, au Sénégal où nous avons retrouvé des

cas sporadiques d'hépatite E à Dakar (33 % des hépatites NANB

dans notre étude).

Mais il faut cependant remarquer que cet antigène apparaît

précocement dans les selles, dès la période d'incubation chez

l'animal, pendant la montée des transaminases chez l'homme et

que par cette technique le diagnostic de l'hépatite E ne peut se

faire que pendant la phase aiguë de la maladie.

Mais si l'on sait aujourd'hui qu'aucun cas d'hépatite E

chronique n'a été signalé chez l'homme ou chez l'animal, on peut

dire que la majeure partie des hépatites E pourront être

diagnostiquées par cette méthode. Il s'agit là d'une contribution

importante dans le domaine de recherche des hépatites, surtout

si l'on sait qu'à l' heure actuelle nous ne disposons d'aucun test

utilisable en routine pour le diagnostic de l'hépatite E.

Cependant une question subsiste : Quand disparaît l'antigène

VHE chez l'homme?

98

Si nous pouvons donner une réponse à cette question en ce

qui concerne le singe où l'antigène n'est plus détectable au

delà du 42ème jour après inoculation, chez l'homme un suivi dans

le temps de l'évolution de cet antigène s'avère nécessaire.

Des études prochaines nous permettront certainement de

répondre à cette question.

Mais l'apparition précoce de l'antigène détecté qui apparaît

avant la montée des transaminases chez l'animal, sa présence de

courte durée dans les selles, de même que les problèmes inhérents

au traitement et à la conservation des selles, rendent bien

compte de l'intérêt de développer un test sérologique de

détection des anticorps antiVHE, à partir d'antigène produit chez

le singe.

C'est pourquoi nous incluons dans nos perspectives

immédiates de recherche l'inoculation de plusieurs singes genre

cercopithèque, afin d'obtenir à partir de leur foie, ou de leur

selle, ou de leur bile, une quantité suffisante en antigène VHE.

Ainsi, nous pourrons réaliser:

- soit des monoclonaux à partir du VHE pour la recherche des

anticorps antiVHE dans le sérum ou le plasma;

- soit mettre au point une technique de dépistage par

"Dot-Blot" par fixation directe de l'antigène VHE sur membrane.

Ainsi nous pourrons étudier l'évolution des anticorps

antiVHE chez le singe et par transposition chez l' homme; et

disposer de tests d'utilisation plus malléables en routine.

Mais dores et déjà nous pouvons dire que nous sommes armés

si une épidémie d'hépatite E arrivait à se déclarer au Sénégal.

99

Par ailleurs, dans le cadre de la prévention de l'hépatite,

nous incluons dans nos perspectives de recherche, la préparation

d'immunoglobulines à partir de sujets ayant été infectés par le

VHE, et ayant acquis une immunité. L'injection de telles

immunoglobulines pourrait assurer une immunisation passive chez

des sujets à risque, et plus particulièrement chez la femme

enceinte, chez qui une telle prophylaxie peut être

particulièrement intéressante en attendant de disposer d'un

vaccin éventuel.

100

II - DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C :

L'étude critique que nous avons menée en ce qui concerne

les méthodes de dépistage des sujets infectés par le VHC, nous

permet d'affirmer que le diagnostic biologique de l'hépatite C

par la recherche des anticorps antiHCV, pose encore de nombreux

problèmes.

En effet, on sait que certains cas d'hépatite C, ne sont

pas reconnus comme tels, et restent sérologiquement muets. Il

faut d'ailleurs souligner à ce propos, que le sérum du chimpanzé

qUl a servl à l'identification du virus ne contenait pas

d'anticorps antiVHC; prouvant ainsi que les cas les plus

infectieux, peuvent en être dépourvus.

- La recherche de ces anticorps au cours des hépatites C aiguës

est peu contributive. En effet une étude récente montre que si

les anticorps antiHCV sont parfois contemporains du pic des

transaminases comme en atteste la figure suivante, il

sont le plus souvent retardés par rapport à celui-ci (82).

1/12r8J1/1QI8J

X FOIS LANORM~lE

l~.ooT .\i

"Wr \5.00~ e\

1 _

o.oo~1----I../_\_-._.........=.---=--_--+-__.~~~11618J , l8I8J

Cinétique des anti- VHC et évolution des SGPT d 1

aIlS le temps.

101

l1,

En fait, ils ne sont guère détectables que dans 40% des cas

seulement au cours du premier mois. En effet, pour environ la

moitié des cas, la séroconversion est tardive (63-82), entre 2

et 12 mois, alors que pour la moitié de ces malades les

transaminases sont déjà revenues à la normale.

1D~1

u.oo1

,0.ooJ \

~'ooL0 00 .~.-. •• 1

11 10m2 1/12182

•3111/83

•1 •

V4/8.:l

j

Cin~tique des anti· VHC et ~volution des SGPT dans le temps.

- Ces tests de détection des anticorps antiHCV posent également

des problèmes d'interprétation infection ancienne avec

élimination du virus ou infection actuelle?

- De plus comme nous l'avons montré ces tests semblent être à

l'origine des réactions non spécifiques réactions positives

dans les hépatites auto-immunes, dans les affections où le

facteur rhumatoïde est présent, dans les hépatites A aiguës, et

même dans les cirrhoses alcooliques. Certains de ces résultats

ont été confirmés par d'autres études.

102

Plusieurs hypothèses sont avancées pour expliquer ces

probables faux positifs.

- La présence au cours des hépatites auto-immunes d'un (auto)

anticorps oligoclonal de spécificité indéterminée, réagissant

également avec l'antigène C 100-3 du kit. (54).

- La présence d'un anticorps anti-idiotype se fixant à la phase

solide du kit et liant également les IgG. (54).

- Ou bien la présence d'anticorps circulants dirigés contre la

superoxyde-dismutase (SaD). En effet on sait que l'antigène cible

des tests HCV ELISA est un polypeptide de fusion C 100-3/S00; et

le contrôle des sérums de 19 sujets antiHCV positifs, dont 10

sont atteints d'hépatite NANB chronique post-transfusionnelle,

et 9 d'hépatite chronique active auto-immune, par une recherche

d'anticorps anti-sOO, montre que les antigènes SaD sont toujours

absents dans le premier groupe et touj ours présents dans l'autre.

(43) .

- Ou la présence d'anticorps de faible affinité, plus sensibles

au lavage à l'urée 8 moles/l, seraient également responsables de

certains faux positifs des tests HCV ELISA, observés au cours

d'hépatopathies variées (87).

- Ou encore la présence d'anticorps non spécifiques dirigés

contre des Togavirus ou de Flavivirus autres que le virus de

l'hépatite C,circulant en milieu tropical ,qui réagiraient

également avec la proteine C 100-3 du kit (étude en cours par

notre équipe) .

De plus des discordances très nettes apparaissent suivant

les techniques utilisées A titre d'exemple 4 % de

séropositivité en anticorps antiHCV ont été observés chez les

donneurs de sang sénégalais en "screening Elisa" versus 0,4 %

en "Immunoblot".

Cette situation semble préoccupante surtout si l'on sait

que la maj eure partie des études épidémiologiques dont nous

disposons à l' heure actuelle ont été effectuées avant

l'utilisation de ces tests de confirmation (24-25-44-52). Ces

études ne doivent être interprétées qu'après contrôle par ces

tests.

103

Tous ces problèmes mettent l'accent sur la nécessité de

disposer de tests plus performants , plus spécifiques donc plus

fiables surtout si l'on sait que le VHC est caractérisé par un

vaste réservoir de porteurs chroniques asymptomatiques dont

certains évoluent de manière insidieuse vers la cirrhose et le

cancer primitif du foie.

104

III - ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DES HEPATITES NANB

L'étude épidémiologique que nous avons entreprise permet

de tirer ies conclusions suivantes :

- l'hépatite E existe bien au Sénégal. Dans notre échantillon,

elle représente 42 % des hépatites NANBNC et 17 % des hépatites

aiguës chez l'adulte.

Ce pourcentage semble nettement inférieur à celui observé

dans certains pays en voie de développement où l'on rapporte que

l'hépatite E représente entre 50 et 90% des hépatites virales

aiguës (65). Une enquête à plus large échelle, serait peut-être

nécessaire pour confirmer le pourcentage que nous avons obtenu.

Cependant ce pourcentage relativement faible, ne doit

nullement détourner notre attention du risque d'épidémie qui

existe; épidémies, rappelons le, sont survenues dans de nombreux

pays d'Afrique et d'Asie.

- Toujours dans notre étude, cette hépatite ne concerne que les

jeunes adultes de 21 à 40 ans. Ces résultats semblent donc

confirmer les conclusions de l'étude menée par RAMALINGASWANI

V. et collaborateurs (59) qui disaient je cite : "l' hépatite

NANB à transmission entérale touche avec une égale fréquence

l'homme et la femme et s'observe principalement chez le jeune

adulte entre 15 et 40 ans".

Quant à l'étude épidémiologique de l'hépatite C, elle nous

permet de constater :

- le faible pourcentage du portage des anticorps antiHCV dans

la population générale (0, 73 %) et chez les donneurs de sang

(0,5%); pourcentages certes sous estimés, si l'on sait qu'une

étude récente a montré la possibilité de détecter par PCR l'ARN

HCV dans le sérum et le foie de sujets apparemment séronégatifs,

incluant des sujets avec hépatite chronique, mais également des

donneurs de sang. Elle nous permet également de constater que la

prévalence des anticorps anti-HCV augmente avec l'âge jusqu'à la

quatrième décennie, puis décroit ensuite, reflétant probablement

la disparition des anticorps détectables avec le temps. Il faut

remarquer que de telles conclusions sont également rapportées

105

par une étude américaine récente. (72).

Cependant, on constate également dans notre étude une

prévalence relativement élevée de 4,12% (4 antiHCV+/97 étudiés)

dans la tranche d'âge G5~G9 ans. Des études ultérieures pourront

certainement nous éclairer sur cette forte prévalence.

de formuler les recommandations suivantes les tests

actuellement commercialisés pour la détection des anticorps

antiHCV par screening Elisa ne doivent pas être utilisés de

manière systématique dans nos centres de transfusion sanguine.

En effet ils donnent 90% de réactions positives non spécifiques.

Et si l'on sait que près de 20% des donneurs de sang sont

éliminés puisque porteurs de l'AgHBs, plus de 2% éliminés puisque

porteurs du HIV ou du Tréponéma pallidum; ces fausses réactions

positives, ne feraient que limiter à tort, le nombre de donneurs

déjà nettement insuffisant; sans vouloir parler du coût élevé de

ces recherches, qui serait de 12.500 F CFA pour un seul

dépistage.

A défaut, l'utilisation de mélanges de solvants et de

détergents destinés à l'inactivation virale serait peut être à

envisager au moins pour la préparation des fractions

plasmatiques. Ces procédés sont aujourd'hui couramment employés

et ont fait la preuve de leur efficacité dans certains pays

d'Europe. (42).

- De proposer un schéma simple, qui pourrait être retenu devant

tout don de sang en attendant de disposer de tests plus fiables

pour le diagnostic de l'hépatite C, et plus accessibles sur le

plan économique.

lOG

DONNEURS DE SANG

- - - - -

lA9"HBS~ BW+ HIV+ :1- - - --RECUSER LE DON

.. 1

DOSAGE DES TRANSAMINASES

SERIQUES

TRANSAMINASES

NORMALES1 -- -. - - - - - - - - -- 1,TRANSAMINASES 1

IFAIBLEMENT ELEVEES 11 1

,25 < SGOT/SGPT < 65 UII,

~TRANSAMfuASES-- ~l,'ELEVEES> 2 FOIS J

!LA NORMALE '

RETENIR LE

DON

RECUSER LE DON

INEXPLIQUEES

lRECUSER LE DON

RECUSER LE DONRETENIR LE DON

EXPLIQUEES

(alcool, obésité ... )

,__ L_ _1 RECHERCHE DES l1 1

: ANTICORPS11 ANTI-HCV 1

L---l-----~

ANTI-HCV- ANTI-HCV+

1107

En effet ce schéma s'inspire des résultats d'une étude

hollandaise (56) qui montre une prévalence du portage des

anticorps antiHCVde 0,6% chez des donneurs de sang à

transaminasémie normale; de 10% à transaminasémie faiblement

élevée (une à deux fois la normale), mais de manière répétée;

de 24% chez les donneurs dont le taux de transaminases sériques

est supérieur à deux fois la normale.

Il s'inspire également de notre étude dakaroise où nous

avons constaté que 80% des sujets porteurs des anticorps anti­

HCV, et 100% des donneurs de sang anti-HCV+, ont un taux de

transaminases sériques élevé avec une moyenne de 70 UI/l pour

les SGOT et les SGPT.

Donc en attendant de disposer de tests plus fiables pour

le diagnostic de l'hépatite C, le dosage systématique des

transaminases sériques chez les donneurs de sang constituerait

une prévention au moins partiellement efficace de l' hépatite

NANB post-transfusionnelle.

108

CONCLUSION

Au terme de notre étude, nous pouvons dire que les tests

commercialisés actuellement pour le dépistage des sujets infectés

par le VHC permettent de détecter des anticorps dirigés contre

un antigène exprimé lors d'une hépatite NANB appelée hépatite

« C ».Ces tests permettent certes de détecter 50 à 80 % des

hépatites transmises par voie parentérale autres que l'hépatite

B permettant ainsi de réduire considérablement les hépatites

post-transfusionnelles.

cependant ces tests posent encore de sérieux problèmes :

- les anticorps antiHCV ne sont détectables en moyenne que dans

30 à 40 % des hépatites aiguës, ils n'apparaissent qu'après 3 à

4 mois d'évolution. Il paraît donc essentiel de pouvoir disposer

d'un marqueur plus précoce de l'infection, tant en ce qui

concerne les exigences de la sécurité transfusionnelle, que

celles du diagnostic clinique des infections aiguës.

De plus comme nous l'avons montré, ces tests semblent être

à l'origine de nombreuses réactions non spécifiques; 50 à 60 %

dans certaines situations pathologiques, 90 % en milieu tropical

plus précisément à DAKAR où notre étude a été menée.

Ces réactions non spécifiques semblent liées au fait que

l'antigène utilisé pour la détection des anticorps antiVHC est

une protéine fonctionnelle et non pas structurale du VHC.

Dès lors, il parait imperleux de se diriger vers le

recherche d'autres marqueurs plus spécifiques, pour un diagnostic

biologique fiable de l'hépatite C.

L'espoir est permis, si l'on sait aujourd'hui,qu'une équipe

de chercheurs japonais a pu isoler une protéine de structure du

VHC de 22 KD, reconnue par les anticorps présents dans le sérum

d'un patient atteint d'hépatite NANB chronique.

Cette protéine a déjà été partiellement purifiée en vue de

la préparation d'un test ELISA pour la détection d'un anticorps

anti 22KD dans les sérums de patients atteints d'hépatite NANB.

Les essais préliminaires utilisant ce test encore à l'état

de recherche montrent que non seulement la majorité des hépatites

C chroniques sont diagnostiquées, mais également les hépatites

C aiguës.

109

diagnostic

en pleine

De tels tests sembleraient donc plus performants pour le

diagnostic biologique de l'hépatite C.

Sinon, un appel à l'amplification genlque comme l'a déjà

suggéré HOUGHTON serait peut-être nécessaire.

En effet, la PCR permet la détection de l'ARN HCV, et ce

de façon précoce, puisque dans les expériences de transmission

à des chimpanzés, l'ARN a pu être détecté dans les premiers jours

suivant l'inoculation. La PCR devrait donc pouvoir permettre une

estimation sensible et très directe de la virémie. La PCR peut

cependant poser plusieurs problèmes

- risque de contamination inhérent à ces techniques.

- nécessité d'utiliser des séquences adaptées à l'isolat du fait

de la variabilité génétique éventuelle. (47).

- nécessité d'une bonne conservation des sérums car l'ARN HCV

est manifestement facilement dégradé.

Seules des comparaisons permettront de dire si l'estimation

de la virémie peut être réalisée au mieux par des tests

sérologiques, ou par des techniques de biologie moléculaire comme

la PCR.

C'est dire donc que les méthodes actuelles de

de l' hépatite C loin d'être satisfaisantes, sont

évolution et ouvrent ainsi une voie de recherche.

Quant au diagnostic biologique de l'hépatite E, comme nous

l'avons exposé précédemment, nous avons pu mettre au point une

méthode spécifique de détection de l'antigène VHE, qui a permis

de nous rendre compte de l'existence du VHE au Sénégal.

Même si le nombre de cas étudié semble limité, les résultats

sont statistiquement interprétables et nous pouvons dire que

l'hépatite E représente 42 % des hépatites NANBNC et 17 % des

hépatites aiguës de l'adulte dans notre échantillon.

110

Cependant en combinant les tests actuels de détection des

anticorps antiHCV et notre méthode de détection de l'antigène

VHE, on se rend compte que 47 % des hépatites NANB aiguës à DAKAR

restent encore non identifiées.

Nous savons déj à qu'il existe des formes d' hépatite C

séronégatives, et des études en immunomarquage et amplification

moléculaire dans le foie ont déjà permis de le démontrer dans au

moins 15 % des cas (18). Cette situation est finalement

comparable à celle toujours d'actualité des hépatites B

séronégatives au cours desquelles le VHB est uniquement

détectable par PCR, ces cas étant toujours classés

sérologiquement dans le groupe des hépatites NANB résiduelles

(18). Cette situation démontre bien la nécessité de disposer de

tests spécifiques, fiables, très performants pour pouvoir parler

d'hépatite C ou d'hépatite E et pose par là même le problème de

la terminologie d' hépatite NANB qui devient impropre, et la

suggestion de certains auteurs (18-81) de parler "d'hépatites

séronégatives" devient justifiée.

Ce terme refléterait ainsi le besoin de rechercher de

nouveaux marqueurs, tant pour le VHB que pour le VHC ou le VHE

ou tout autre virus. Et ce n'est que grâce à de tels progrès

qu'il sera possible de préciser l'existence de virus

supplémentaires, et de pouvoir répondre à la question que l'on

se pose actuellement, à savoir

"Existe-t-il plus de cinq virus des hépatites 7".

III

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AIlTIlTEXE

l - PREPARATION DES IgG DE LAPIN ANTI Fc (t) HUMAIN

Elle se fait en deux étapes :- Préparation du fragment Fc (gamma) humain par la méthode dePORTER qui est appliquée à des IgG humaines purifiées sur OEAEcellulose.

A 1 g d' IgG dissoute dans 100 ml de tampon phosphatemonopotassique disodique 0,1 M pH 7,2, on ajoute 44,6 mg d'acideéthylène diamine tétracétique (EOTA), puis 96,6 mg de L-cystéineet 10 mg de papaïne cristallisée (Merck). Après incubation de 3heures· à 37 oC, on dialyse contre du tampon phosphatemonopotassique disodique 0,1 M pH 7,2. On filtre sur SéphadexG100 dans ce même tampon pour éliminer les IgG non digérées quisortent dans le premier pic exclu et les produits de dégradationqui sortent dans un troisième pic. Le deuxième pic qui contientles fragments d'IgG est concentré et dialysé en tampon phosphatemonopotassique disodique 0,005 M pH 7 , 2. A ce stade, des cristauxde Fc (gamma) apparaissent dans le sac de dialyse. on lesrecueille par centrifugation et les purifie par sixcristallisations successives réalisées par dialyse en eaudistillée froide, avec redissolution en tampon acétate 0,1 M pH5,4. Le contenu du deuxième pic dialysé est ensuitefractionné sur OEAE 52 équilibrée en tampon phosphate 0,005 MpH 7,2. Les fragments Fab ne sont pas retenus dans cesconditions. Les fragments Fc (gamma) sont élués en tamponphosphate 0,3 M pH 7,2. A ce stade, les fractions ne sont pasgénéralement rigoureusement pures, ce qui rend nécessaire unedernière purification. Pour ce faire, les fragments Fc (gamma)sont passés sur un immunoadsorbant d' IgG de mouton anti-Fab,pour éliminer les impuretés résiduelles.

La caractérisation immunologique des produits est réaliséepar immunodiffusion double en gel vis-à-vis d'anti-sérum humaintotal, d'anti-IgG, d'anti-Fab et d'anti-Fc (gamma). La puretébiochimique est établie et le contrôle des masses moléculairesest réalisé par électrophorèse en gel de polyacrylamide sos.

- Immunisation du lapin

Elle se fait par injection intramusculaire, toutes les 3semaines, de 100 mg de protéines dans 0,2 ml d'eau physiogiqueen présence d'un volurne d'adj uvant complet de Freund. L' évolutiondu taux des anticorps et leur spécificité est suivie parimmunodiffusion en gel et hémagglutination passive, et lessaignées sont réalisées au moment jugé opportun, en général après3 ou 4 injections de l'antigène.

//

II - PREPARATION DES REACTIFS ET TAMPONS UTILISES

A - T A M P 0 N S

1 - Tampon Tris (hydroxymethyl) aminométhane :

A : 0,2 M solution de Tris hydroxyméthyl aminométhane(24.2 g dans 1000 ml)

B : 0.2 M HeL50 ml de A + x ml de B, compléter à 200 ml.

x

5.08.1

12.216.521.926.832.538.441.444.2

2 - Tampon bicarbonate-carbonate

pH

9.08.88.68.48.28.07.87.67.47.2

A 0.2 M solution de carbonate anhydre de sodium(21.2 g dans 1000 ml).

B 0.2 M solution bicarbonate de sodium (16.8 g dans1000 ml).x ml de A + y ml de B, compléter à 200 ml.

x

4.07.59.5

13.016.019.522.025.027.530.033.035.538.540.542.545.0

y

46.042.540.537.034.030.528.025.022.520.017.014.511. 59.57.55.0

pH

9.29.39.49.59.69.79.89.9

10.010.110.210.310.410.510.610.7

G.E. Delory et E. J. King, J. Biochem., 1945, 39, 245

11

1

1

/

3 - Tampon phosphate:

A 0.2 M solution phosphate monobasique de sodium(27.8 g dans 1000 ml).

B 0.2 M solution de phosphate dibasique de sodium(53.65 g de Na2HP047 H20 ou 71.7 g de NaHP0412 H20 dans 1000 ml).

x ml de A + y ml de B, compléter à 200 ml.

x

93.592.090.087.785.081.577.573.568.562.556.551.0

y

6.58.0

10.012.315.018.522.526.531. 537.543.549.0

pH

5.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.8

x

45.039.033.028.023.019.016.013.010.58.57.05.3

y

55.061.067.072.077.081. 084.087.090.591.593.094.7

pH

6.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.0

S.P.L. Sorensen, Biochem. Z., 1909, 21, 1311909, 22, 352

4 - Tampon acétate:

A 0.2 M solution diacide (11.55 ml dans 100 ml)B 0.2 M solution dlacétate de sodium (16.4 de C2H302Na

ou 27.2 g de C2H302Na 3H20 dans 1000 ml).x ml de A + y ml de B, compléter à 100 ml.

x y pHacide acétique acétate de Na

46.3 3.7 3.644.0 6.0 3.841.0 9.0 4.036.8 13.2 4.230.5 19.5 4.425.5 24.5 4.620.0 30.0 4.814.8 35.2 5.010.5 39.5 5.28.8 41.2 5.44.8 45.2 5.6

G.S. walpole, J. Chem. Soc. , 1914, 105, 2501

3 - Tampon phosphate ..A 0.2 M solution phosphate monobasique de sodium

(27.8 g dans 1000 ml).B 0.2 M solution de phosphate dibasique de sodium

(53.65 g de Na2HP047 H20 ou 71. 7 g de NaHP0412 H20 dans 1000 ml).

x ml de A + y ml de B, compléter à 200 ml.

x y pH x y pH

93.5 6.5 5.7 45.0 55.0 6.992.0 8.0 5.8 39.0 61. 0 7.090.0 10.0 5.9 33.0 67.0 7.187.7 12.3 6.0 28.0 72.0 7.285.0 15.0 6.1 23.0 77.0 7.381. 5 18.5 6.2 19.0 81. 0 7.477.5 22.5 6.3 16.0 84.0 7.573.5 26.5 6.4 13.0 87.0 7.668.5 31. 5 6.5 10.5 90.5 7.762.5 37.5 6.6 8.5 91. 5 7.856.5 43.5 6.7 7.0 93.0 7.951.0 49.0 6.8 5.3 94.7 8.0

S.P.L. Sorensen, Biochem. Z. , 1909, 21, 1311909, 22, 352

4 - Tampon acétate ..A 0.2 M solution d'acide (11.55 ml dans 100 ml)B 0.2 M solution d'acétate de sodium (16.4 de C2H302Na

ou 27.2 g de C2H302Na 3H20 dans 1000 ml).x ml de A + y ml de B, compléter à 100 ml.

x y pHacide acétique acétate de Na

46.3 3.7 3.644.0 6.0 3.841.0 9.0 4.036.8 13.2 4.230.5 19.5 4.425.5 24.5 4.620.0 30.0 4.814.8 35.2 5.010.5 39.5 5.28.8 41. 2 5.44.8 45.2 5.6

G.S. Walpole, J. Chem. Soc. , 1914, 105, 2501

,. '- .

B - REACTIFS

1 - PM2

Tampon phosphate 0,1 M PH 7,4Titriplex : 2 mMMgS04 1 mMMnS04 : 0,2 mM

2 - Réactif phospho-tunqstique

Acide ortho-phosphoriqueTungstate de sodium

0,01 N0,5 mM