Méthodes de dosage de l’HbA1c - sadiab-dz.com · Méthodes de dosage de l’HbA1c Surveillance du sujet diabétique IXème Congrès Maghrébin d'Endocrinologie et Diabétologie,

Méthodes de dosage de l’HbA1c Surveillance du sujet diabétique

IXème Congrès Maghrébin d'Endocrinologie et Diabétologie, 23-25 Novembre 2012- Alger

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Dr Edith Bigot-Corbel MCU-PH Biochimie- Nantes

http://www.google.fr/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/fr/thumb/6/62/Universit%C3%A9_de_Nantes_(logo).svg/532px-Universit%C3%A9_de_Nantes_(logo).svg.png&imgrefurl=http://encyclo.voila.fr/wiki/Fichier:Universit%C3%A9_de_Nantes_(logo).svg&usg=__rjjqLqSERCJwgdPkqsD6AHSTl1o=&h=286&w=532&sz=13&hl=fr&start=2&zoom=1&tbnid=60_Fh3FEg9vdVM:&tbnh=71&tbnw=132&ei=kWDJTbGVIIHZtAbB_8jfAw&prev=/images?q=LOGO+UNIVERSITE+DE+NANTES&hl=fr&gbv=2&tbm=isch&itbs=1

Complications du diabète et protéines

glyquées

• Gravité du diabète: complications dégénératives

• Objectif majeur de la prise en charge:

– Empêcher et/ou retarder l’apparition des complications dégénératives

(qualité de vie, coûts des traitements)

• Mode d’intervention: contrôle métabolique optimal (lien entre contrôle

glycémique et apparition des complications)

• Nécessité de marqueurs biologiques fiables:

– Marqueurs de glycation des protéines : HbA1c

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Leçons de l’UKPDS: moins de complications avec un meilleur contrôle glycémique

Reduction de 1% d’HbA1c

Réduction

du risque*

1%

Mortalité liée au diabète

IDM

Complications Microvasculaires

AOMI

UKPDS 35. BMJ 2000;321:405–12 *p<0.0001 IXème Congrès Maghrébin d'Endocrinologie et Diabétologie, 23-25 Novembre 2012- Alger

Définition de l’hémoglobine glyquée

• Ensemble des molécules d’Hb modifiées par fixation non

enzymatique d’oses (glc) sur des fonctions amines des chaînes ß

de globine

• Formation en 2 étapes:


Facteurs influençant la glycation

• La glycation est un phénomène naturel qui dépend:

– De la moyenne des concentrations en glucose

– De la vitesse de la réaction de glycation

– Du turn-over de la protéine

• Facteurs conditionnant les réactions de glycation in vivo:

– Physico-chimiques: température, pH

– Facteurs liés aux protéines: concentration ½ vie, accessibilité

– Facteurs liés aux oses: concentration, nature

• Effets de la glycation:

– Remaniements moléculaires

– Altérations structurales et fonctionnelles des protéines

– Mécanismes de maturation/vieillissement impliqués en pathologie

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Hétérogénéité de l’hémoglobine glyquée

HbA Tétramère 2ß2

Hb Glyquée

Caractérise toute fixation non enzymatique de glucose ou d’autres oses sur l’ Hb.

HbAo

Composant majeur de l’ HbA; comprend des formes non glyquées et des formes glyquées ailleurs que sur l’extrémité N-terminale des chaînes ß.

HbA1 Hb rapides;Hb A glyquée sur l’extrémité N-term. des chaînes ß quelque soit l’ose.

HbA1c HbA glyquée,par le glucose,sur l’extrémité N-term.,d’au moins une chaîne ß. Modification de la charge des molécules d’Hb

PréHbA1c Forme labile d’HbA1c.


HbA1a1

HbA1a2

HbA1b

HbA1c

Hb préA1c

Prélèvement et facteurs pré-analytiques

• Prélèvement:

- sur héparine,EDTA,ou fluorure

-Volume de sang nécessaire:5 µL à 2 mL

-Prétraitement de l’échantillon:

réalisation de l’hémolyse

élimination de la fraction labile

• Facteurs pouvant modifier la valeur d’ HbA1c:

-causes hématologiques

-insuffisance rénale

-dyslipoprotéinémies

-prise de médicaments

-

HbA1c en biologie clinique

• Années 1970-80: Utilisation clinique

• Années 1990-2000: Validation méthodologique

• Années 2000-2010: Standardisation

• En 2012

– Paramètre éprouvé

– Apparente simplicité

– Réelle complexité

• Deux problèmes

– Standardisation et performances des techniques

– Standardisation de l’expression des résultats

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Méthodes de dosage

• Dosage de l’Hb glyquée totale

• Dosages spécifiques de l’HbA1c

– Immunologiques

– Chromatographiques:

• affinité

• échange d’ions: HPLC

– Electrophorétiques

– Enzymatique

En France: Les seules utilisables sont celles répondant au cahier des charges

relatif aux notices des réactifs dosant l’HbA1c, (AFSSAPS 30/09/05)

Objectif répétabilité : CV HbA1c < 3%

Objectif reproductibilité : CV HbA1c < 4%

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Dosage de l’Hb glyquée totale

• Technique autmatisée de Chromatographie d’affinité:

IMX

– Les résultats sont corrigés par rapport à une courbe

d’étalonnage mémorisée qui a été titrée en HbA1c par HPLC

– Résultats corrigés exprimés en % d’HbA1c

• Avantages:

– Pas d’interférence

• de la fraction labile

• De la température

• De l’Hb carbamylée

• De l’Hb acétylée

• Inconvénients:

-pas de détection des hémoglobines anormales

-résultats corrigés

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Dosages spécifiques de l’HbA1c

• Immunologiques:

• Ac mono ou polyclonaux spécifiques de la liaison glucose –extrémité N-terminale

de la valine

– Immunoturbidimétriques en phase homogène

– Immunoinhibition sur latex

– ELISA: microplaques, AC monoclonaux

– Inconvénients:

– Les limites de l’utilisation dépendent de l’épitope reconnu

– Pas d’identification des Hbs anormales

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Dosage immunologiques:

- méthode turbidimétrique en phase homogène:

automates labo Roche, Beckmann, Abbott…..

-Dosage par réaction d’inhibition d’agglutination: DCA

2000 Siemens

• Principe général:

-sang prélevé sur EDTA puis hémolysé

-détermination du taux d’ Hb totale par une méthode colorimétrique

-puis détermination du taux d’ HbA1c par 1 Ac monoclonal

% HbA1c=(HbA1c / Hb )x 100



• Méthodes électrophorétiques:

– En gel d’agarose: ne répond pas aux exigences

– IEF: ne répond pas aux exigences

– Capillaire: développé par Sebia

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• Techniques chromatographiques

– Manuelle: microcolonnes Biorad

– Automatisée HPLC

• Chromatographie par échange d’ions

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• Biorad / Tosoh

-sang hémolysé automatiquement puis injecté à

travers la colonne

-colonne constituée d’une résine non poreuse

d’échange de cations

-séparation des fractions par 3 tampons de

concentrations salines différentes

-détection des fractions par lecture

spectrophotométrique à 415 nm

Dosages spécifiques de l’HbA1c: HPLC

• Sang normal:6 fractions identifiées et

quantifiées (HbA1a, HbA1b, HbF, HbA1c

labile, HbA1c stable, HbAo)

• Rapport entre les différentes fractions

effectué par calcul de l’aire des pics


Dosages spécifiques de l’HbA1c: HPLC

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Avantage HPLC: détection des variants de l’Hb



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l’HbA1c


• Technique immunologique

– techniques d'immunodosage: microparticules bleues conjuguées aux anticorps anti-

A1C migrent sur la tigette réactive. pour mesurer l'A1C et analyse chimique pour

mesurer l'hémoglobine totale

– résultat quantitatif très rapide : 5 minutes

– cartouches à usage unique.

– 5 µL de sang total (une grosse goutte) prélevés au bout du doigt

– le prélèvement du sang, la dilution et le transfert de l'échantillon se font

désormais en une seule étape

– aucun étalonnage et aucun entretien ne sont nécessaires

– Précision de laboratoire à 99 %

19 IXème Congrès Maghrébin d'Endocrinologie et Diabétologie, 23-25 Novembre 2012- Alger

Interprétation des résultats d’HbA1c

• Les normes d’HbA1c (selon étude DCCT) ont été

définies pour :

– Une durée de vie normale des hématies: 120 jours

(absence d’hémolyse, de transfusion, …)

– Une synthèse normale d’hémoglobine

– Une population de patients homozygotes A/A

(HbA0 > 95%)

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Difficultés d’interprétation des résultats d’HbA1c

• Métabolisme anormal de l’Hb ou des GR

• Traitement stimulant l’hématopoïèse

• Hémorragies

• Transfusions

• Traitement antirétroviral

• Splénectomie

• Présence de variants d’Hb

• Conséquences physiopathologiques

– Diminution de la ddv des GR + hémolyse

– Cinétique de glycation différentes

• Conséquences analytiques (dépendent de la méthode)

– Détection du variant

– Interprétation et rendu des résultats ou non

• Présence d’autres Hb modifiées

– La fixation sur l’Hb de substances non glucidiques qui modifient ses pptés physico-chimiques et peut augmenter

les valeurs d’HbA1c

• Acétylation avec aspirine ou au cours de l’éthylisme chronique ou l’Hb acétylée peur représenter 2à 3%

• Carbamylation de l’Hb lors de l’IR: fixation d’isocyanate provenant de la décomposition de l’urée

• fructosamines

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• Étude des interférences

– http:// www.ngsp.org

• HbS, C, E, D

– Interférences variables selon les méthodes

• Immunodosages: spécificité de l’antigène

– Possibilités de rendre le résultat si:

• Validation analytique (corrélation à méthode

de référence ou de comparaison)

• Absence d’hémolyse

• Suivi individualisé (le patient est son propre

témoin si % constant HbA0)

– Non utilisable pour les homozygotes SS, CC

ou hétérozygotes SC

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http://www.ngsp.org/






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Impact de différents facteurs sur la glycémie moyenne estimée: ADAG = glycémie moyenne dérivée de l’HbA1c

Glycémie (g/L) = [(35.6x % HbA1c) – 77.3] x 0.01 •Glycémie à jeun et post-prandiale

•Période

•Âge

•Ethnie

•Variations interindividuelles

•…..

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HbA1c et Contrôle de qualité: CQI, CQE, CQN

Les méthodes demeurent inégales (précision et exactitude….)

Valeur basse

Valeur élevée

Affinité 10.4 10.6

CLBP 3 2.6

CLHP 2.9 2.8

Immunochimie 3.6 3.9 CV (%) interlaboratoire moyen des différentes méthodes disponibles

éléctrophorèse 0.1%

Mini-colonnes Échanges ions

<0.1%

Chromato affinité 3.6%

Chromatographie échange ions CLBP

2.9%

CLHP 52%

Immunologiques 40.6%

Méthodes utilisées en France Données CQN 2007

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Standardisation

• 2007: standardisation du dosage et de l’expression des résultats

• Etudes DCCT et UKPDS : recommandations objectifs thérapeutiques

basés sur HbA1c unités NGSP/DCCT

• La méthode NGSP/DCCT initialement prise comme référence ne peut

pas être considérée comme méthode de référence (pas spécifique

HbA1c et stabilité analytique à long terme insuffisante)

• 1995 mise en place d’un groupe de travail IFCC, aboutissant en 2002 à la

description d’une méthode de référence et production de matériau de

référence (15 labos dans le monde)

– Méthode IFCC non destinée à être utilisée en routine

– Sert à établir la traçabilité des méthodes commercialisées par les fabricants

– Fournit des valeurs plus basses que NGSP/DCCT (plus spécifique)

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Standardisation

• NGSP: National Glycohemoglobin Standardization Program

– Système de référence:

• CLHP (ech cations)

• étalon: HbA1c purifiée

– S’appuie sur les travaux menés depuis plusieurs années par le DCCT (Diabetes

Control and Complication Trial)

• IFCC: plus récent International Federation of Clinical Chemistry

– Système de référence:

• Définition plus restrictive de l’HbA1c : structure de référence: hexapeptide N-terminal glyqué des

chaînes b de globine

• CLHP phase inverse avec détection par spectrométrie de masse, électrotrospray ou électrophorèse

capillaire après digestion enzymatique de l’Hb

– Sur le plan scientifique apparaît plus satisfaisant mais les travaux du DCCT

semblent difficilement transposables aux résultats obtenus (valeurs plus basses)

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Standardisation

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Standardisation

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Valeur de la certification NGSP- IFCC

• la certification aux normes internationales est reconnue par

l’Afssaps comme étant un gage de qualité

Extrait de l’analyse des résultats du

dernier Contrôle National Qualité

publié en Novembre 2010


Recommandations SFBC

• Rendre les résultats d’Hb glyquée sous forme d’HbA1c exprimée en % de l’Hb

totale (NGSP/DCCT) et en mmol d’HbA1c/mol Hb (IFCC)

• Ne pas convertir les résultats en glycémie moyenne calculée : ADAG (un tableau

de correspondance peut être fourni avec les résultats)

• Les méthodes doivent doser directement l’HbA1c ou pouvoir être reliées à une

méthode de référence (IFCC) dosant l’HbA1c pour corriger les valeurs brutes

• Les techniques utilisées par les labos doivent faire la preuve de leur traçabilité à

une méthode de référence recommandée par les sociétés scientifiques: IFCC

(NGSP)

• Les fabricants doivent fournir les documents de certification relatifs à la

standardisation

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Recommandations 2011 ADA et American Association for

Clinical Chemistry

• L’HbA1c doit être mesurée régulièrement chez les patients diabétiques afin d ’évaluer

l’équilibre glycémique

• Les laboratoires doivent utiliser une méthode certifiée NGSP et corrélée à la référence

DCCT. Les fournisseurs doivent également fournir la corrélation avec la méthode IFCC

• Les laboratoires mesurant l’HbA1c doivent participer à un programme de CQ utilisant du

sang frais

• Mise en garde sur les interférences potentielles (hémoglobinopathies et modification de

la ddv des GR)

• CV intralaboratoire < 2% et CV interlaboratoire < 3.5% sur 2 niveaux différents de

contrôles

• Tout résultat d’HbA1c en dessous de la limite inférieure (4%) ou supérieur à 15% doit

être vérifié sur un nouveau prélèvement

• Tout résultat d’HbA1c discordant avec la clinique doit être complété par des explorations

complémentaires

• Les POCT pour la mesure de l’HbA1c ne sont pas assez précis pour pouvoir être utilisé

dans le diagnostic de diabète

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Intérêt de l’HbA1c dans le diagnostic du diabète

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Historique des méthodes diagnostiques:

ADA Expert Committee 1997, WHO Consultation 1999 :

• Glycémie à jeun : > 125 mg/ml (7.0 mmol/L)

• Glycémie HGPO à 2h. > 200 mg/dL (11.1 mmol/L) pour une charge à 75 g de glucose

• IFG (impaired Fasting Glucose) : 110 – 125 mg/dL Glucose HGPO 2h. : IGT (impaired Glucose Tolerance) : 140 – 200 mg/dL

HbA1c pas recommandé en tant que critère diagnostique Raison : absence de standardisation !


2012 – Qu’est-ce qui a changé ?

• Standardisation de l’HbA1c

• Facteurs interférents pour le dosage de l’HbA1c connus

et minimisés

• Nouvelles données disponibles sur la relation entre

glycémie et complications cliniques


Diabetes Care 2009 ; 32 : 1327-1334

Attributs techniques : glycémie vs. HbA1c

Préanalytique: HbA1c Glucose stabilité in vivo + - stabilité in vitro + - Variabilité analytique: + + Variabilité biologique: intra-individuelle faible plus élevée inter-individuelle faible plus élevée Clinique: pas de timing avec timing sans préparation > 8 h. jeûne pas affecté par stress affecté par tout


Pour en savoir plus…

1. Sacks D et al. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnostic and management of diabetes mellitus. Clin.

Chem. 2011, 57:6 e1-e47

2. Sacks D et al. Gaps in the glycation Gap hypothesis. Clin. Chem. 2011, 57: 2, 150-152

3. Little R. et al. Status of hemoglobin A1c measurement and goals for improvement: from chaos to order for improving diabetes

care. Clin. Chem. 2011, 57, 2: 205-214

4. Corbé-Guillard E et al. Labile Hemoglobin A1c : unexpected indicator of preanalytical contraindications. Clin.Chem 2011, 57, 2: 340-

346

5. Weykamp C. et al. The analytical goals for hémoglobin A1c measurement in IFCC units and National Glygohemoglobin

Standardization Program Units are different. Clin. Chem 2011, 57, 8: 1204-1205

6. Lenters-Westra E et al. Six of eight HbA1c POC instruments de not meet the general accepted analytical performance criteria.

Clin. Chem 2010, 56, 1: 44-52

7. Hanas R et al. 2010 consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin A1c measurement. Diabetes research

and clinical practice 2010, 90: 228-230

8. Nathan D et al. Translating the A1c assay into estimated average glucose values. Diabetes Care 2008, 31: 1473-1478

9. Gillery et al. Propositions pour l’expression standardisée des résultats d’HbA1c. Ann. Biol. Clin. 2009, 67: 669-671

10. Rodriguez-Segade S et al. Progression of nephropathy in type 2 diabetes: the glyccation gap is a significant predictor after

adjustment for glycohemoglobin (HbA1c). Clin. Chem. 2011, 57-2: 264-271

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