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Mitochondrie et reproduction
Julie Steffann INSTITUT IMAGINE
Hopital Necker-Enfants Malades Paris
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13 polypeptides
70 polypeptides
ADN mt
ADN nucléaire
ADP
LA CHAINE RESPIRATOIRE
22 tRNA et 2 rRNA
CI
CII
CIII CIV CV
ATP
H+ H+ H+
H+
O2 H2O NADH NAD+
Cellules somatiques
homoplasmie homoplasmie hétéroplasmie
La ségrégation mitotique
ADNmt 1 ADNmt 2
mitochondrie ovocyte fécondé
Embryon préimplantatoire
Blastomères
Ovocytogenèse
ADNmt 1 ADNmt 2
mitochondrie ovocyte fécondé
blastocyste Blastomères
Théorie du « bottleneck »
ovocytes matures
cellules primordiales germinales
≈ 10 ADNmt/cell
≈200 000 ADNmt
≈ 1000 ADNmt/cell.
≈ 200 000 ADNmt (11 000 - 903 000)
Wai, Biol Reprod 2010
Nb de copies ADNmt/cell
20 000 40 000
160 000
Cree, Nat Genet 2008
Nb de copies ADNmt x 103
Nb de copies d’ADNmt au cours du développement embryonnaire chez la souris
5
centrifugation
Removal of the mitochondria
Cattle embryos N°1 N°2 Chiaratti et al., 2010
In vitro culture (9 days)
In vitro culture (9 days)
mtDNA copy number
D 0
J 9
Induced mtDNA-depletion is spontaneously reversible during early embryogenesis
Nb de copies d’ADNmt au cours du développement embryonnaire chez l’homme
Steuerwald, 2000
Reynier, 2001
Barrit, 2002
May-Panloup, 2005
90 000 à 1 550 000 copies d’ADNmt
Lin, 2004
300 000 à 1 100 000 copies d’ADNmt
7
QUESTION
Ovocytes et embryons porteurs de mutations de l’ADNmt: modèles spontanés de déficit énergétique
Mutation de l’ADNmt Arrêt de développement embryonnaire
?
Mutation de l’ADNmt Impact sur le métabolisme mitochondrial ?
Transfert à J5 de 1 à 3 embryons
« sains »
Biopsie embryonnaire J3
Stimulation, ponction ovarienne et ICSI
Diagnostic PCR 12 à 24 heures
Le diagnostic préimplantatoire
mutant wild-type
Gigarel et al., MGM, 2005
MT-TL1 m.3243A>G MELAS
MT-TK m.8344A>G MERRF
MT-ATP6 m.9185T>G m.8993T>G NARP or LEIGH
mtDNA
MT-ND3 m.10197G>A LEIGH
Neurogenic muscle weakness Ataxia Rétinitis Pigmentosa
Myopathy Encephalopathy Lactic Acidosis Stroke-like episodes
Myoclonic Epilepsie Ragged-Red Fibers disease
1 ♀ hétéroplasmique 3 embryons
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 100
Nb d ’embryons/ovocytes
% de mutation Steffann, 2005
7 ovocytes
Blok,1997
Données humaines ovocyte/embryon mutation m.8993T>G
0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100
% de mutation
Nombre d’embryons
2 ♀ hétéroplasmiques 38 embryons
X 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
10
20
30
40
50
60
84 oocytes Brown, 2001
Données humaines ovocyte/embryon mutation MELAS
1 ♀ hétéroplasmique 14 embryons
Monnot et al., 2011; Steffann et al., 2015
0
1
2
3
4
5
6
7
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
5 ovocytes Nb d ’embryons/ovocytes
% de mutation
Données humaines ovocyte/embryon mutation MERRF
Conclusions
La présence d’une mutation de l’ADNmt ne semble pas impacter le développement embryonnaire précoce
Mutation de l’ADNmt Arrêt de développement embryonnaire
NON
Impact sur le métabolisme mitochondrial
?
FIV avec ICSI MATERIEL et METHODES
Embryons totaux (J3-J5) n=41 Ovocytes n=36 12 MELAS 5 MERRF
19 TEMOINS
12 MELAS 12 MERRF 17 TEMOINS Lyse
10’ à 65°
+ 15 µl H2O
+ mix PCRfluo
Mesure du nombre de copies d’ADNmt par
qPCR
+ mix qPCR
wt mutant
Mesure du taux d’hétéroplasmie
0
200,000
400,000
600,000
800,000
1,000,000
embryos oocytes
mtDNA copies in human control oocytes and embryos
No mtDNA réplication and no mtDNA degradation during early embryogenesis
Or Degradation = Synthesis
mtDNA copy number
200,000
400,000
600,000
800,000
1,000,000
1,200,000
m.3243A>G control m.8344A>G 0
p = 0.0003
EMBRYOS : mtDNA copy number
mtDNA copy number in embryos carriers of - m.3243A>G MELAS - m.8344A>G MERRF
2 hypothesis: 1 / mutation-dependent activation of mtDNA replication? 2/ only MELAS embryos with high-mtDNA copy number survive?
mtDNA copy number
p = 0.53
Monnot et al., 2011, JMG
mtDNA copy number in m.3243A>G MELAS cells increases gradually with early human development Monnot et al., 2011, JMG
A correlation between mtDNA copy numbers and mutant loads was observed in m.3243A>G MELAS embryos (R2=0.42, p<0.0013)
Mutant load (%)
Monnot et al., 2011, JMG
Pas de sélection négative contre les embryons porteurs d’un taux élevé de mutation au cours du développement embryonnaire précoce.
CONCLUSIONS
Les taux d’hétéroplasmie ovocytaires et embryonnaires sont superposables.
Il existe une sélection négative contre les cellules germinales ayant un taux élevé de mutation MELAS (>80%).
La maturation ovocytaire est probablement affectée par des taux élevé de mutation MELAS. Il n’y pas de sélection négative contre d’autres mutations (NARP et MERRF). Effet moins délétère sur la respiration cellulaire?
Défaut fertilisation Défaut de l’ADNmt
Défaut de l’ADNmt Défaut maturation
Mutations de l’ADNmt / infertilité Vers le développement de nouveaux « traitements »?
Le transfert nucléaire
Wang et al., Cell., 2014
Fuseau meiotique Tachibana et al, Nature 2009
ZYGOTE
Entre ovocyte M2
Transfert noyau de GP
Pronucléi Craven L et al., 2010 Nature
-20 000 gènes nucléaires -37 gènes mitochondriaux
ü Interdit en France? Projet à soumettre à l’ABM ü Risque à long terme? Transcriptomique sur embryons « corrigés »
Mitochondries et amélioration des capacités ovocytaires?
Transfert d’ooplasme à partir de cellules immatures ovocytaires pour augmenter les
chances de succès de la fécondation in vitro « ovascience »
AUGMENT
7 mai 2015 : naissance du premier bébé avec le traitement AUGMENT d’ovascience
Dr Casper, Toronto, Mount Sinai Hospital
Une collaboration Necker/Béclère Laboratoire de Génétique
Moléculaire Institut IMAGINE • J. Steffann • S. Monnot • N. Gigarel • A. Munnich • A. Rotig • J-P. Bonnefont
Hôpital Necker-Enfants Malades
Biologie de la reproduction et
Gynécologie Obstétrique • N. Frydman • L. Hesters • A. Benachi
Hôpital Antoine-Béclère
Agence de biomédecine
