Métabolisme du Tryptophane et cancer

Audrey Le GouëllecLaboratoire TIMC/TheREx UMR5525

Stratégie thérapeutique innovante

Tryptophane Kynurénine

Indoléamine 2,3 dioxygénase

Aliments riches en Trp

Trp/ LNAAs

LAT‐1

Tryptophane

Serotonine Kynurenine

ProtéinesIDO

TDO

95%

Melatonine

NAD+

Acide anthraniliqueAcide quinolinique

Hydroxykynurenine

1956

1998

2006

Cancer, Immunotolérance et métabolisme du Tryptophane

3

Mise en évidence de métabolites du Trp dans l’urine de patients atteints de cancer de la vessie  Boyland et al. (PMID: 13373811)

Kynurenine, IDO et tolérance du fœtus chez la femme enceinte Munn et al. Science (PMID: 9712583)

Kynurenines, Immuno‐tolerance et progression du cancer Uyttenhove et al. Nature med. (PMID: 14502282) , Munn et al. (PMID: 1857253)

Lien mécanistique

Biomarqueurs cliniques et développement de nouvelles thérapies

Y. Suzuki et al. / Lung Cancer 67 (2010) 361–365Augmentation du ratio Kyn/Trp chez les patients atteints du cancer du poumon.

Et Hepatocarcinome (com. Personnelle P. Hainaut)

Mode d’action des métabolites de la voie

Austin et al. Drug Discov Today PMID: 25478733

Deproteinization

Samples are spiked with stable 13C‐labeled internal standard

Metabolites and internal standart (IS)

LC‐MS/MS Analysis

M M+n

IMIM+n

Absolute Quantification(M+n known)

Advantages:

Reduction of analysis errors (matrix effects) Improved linearity of calibration curves

Métabolomique ciblée quantitative de la voiedu Tryptophane

HPLCPhase inverse

ElectrosprayMass 

spectrometry

R² = 0,999

0

50

100

150

0 100 200

R² = 0,9987

0

20

40

60

0 20 40 60

R² = 0,9971

0

20

40

60

0 20 40 60

R² = 0,999

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6

R² = 0,9908

0

20

40

60

0 20 40 60

R² = 0,9997

0

20

40

60

0 20 40 60

R² = 0,9994

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

Trp KYN Sero

5-HTP 3-HK

AK

3-HA AA

R² = 0,9980

0

20

40

60

0 20 40 60

Courbe de calibration: Linéarité de la méthode

12C

/13C

C (μM)

Répétabilité

Molécule Niveau du CQI Ecart‐type CV (%)

3HK60 nM 4 6

24 nM 1 6

13 nM 1 5

Kyn4 µM 0,2 6

1,9 µM 0,1 4

0,8 µM 0,03 4

5HTP50 nM 7 15

23 nM 2 11

11 nM 1 10

5‐HT4,3 µM 0,3 7

2 µM 0,1 5

1 µM 0,08 8

Trp150 µM 6 4

80 µM 2 3

30 µM 1 3

AK57 nM 3 6

24 nM 1 5

11 nM 0,7 6

AA58 nM 4 7

26 nM 1,6 6

12 nM 1,2 11

Limite de linéarité

Molécule LOD LOQLimite de linéarité haute

Valeurs normales 

dans le sang (littérature)

3HK 0,88 nM 1,76 nM 90 nM 20‐30 nM

Kyn 67 nM 132 nM 4 µM 1‐2,5 µM

5HTP 5,11 nM 10,2 nM 110 nM 30‐50 nM

Séro 3,7 nM 4,5 nM 5 µM 500 nM‐1,7 µM

Trp 13 nM 32,5 nM 465 µM 40‐80 µM

AK 0,15 nM 0,45 nM 64 nM 30‐40 nM

3HA 11,6 nM 35 nM 74 nM 20‐30 nM

AA 0,05 nM 0,13 nM 65 nM 10‐20 nM

BacVacTM: Bacterial vaccine for active and specific immunotherapy

2 International patents UJF :EP 1 692 162 B1 et WO 2013/087667

MCCVaxTM : 1er candidat vaccin développé par APCure

POC CLARA 2014

BacVac et réponse mémoire

Memory marker at Day 90 on Ova CD8+ T cells in splenocytes

* p<0.05***p<0.001

Conclusions et Perspectives

Développement de l’immunothérapie active et spécifique: BacVac : Bactérie avec un métabolisme du Trp actif => Etude de l’impact de la

production de ces métabolites sur la polarisation de la réponse immune lorsde la vaccination BacVacTM.

Combinaison Immunothérapie active et spécifique et Inhibiteurs de l’IDO => Evaluation de l’efficacité du traitement. 

Recherche de nouveaux modèles tumoraux à tester

Métabolomique ciblée et quantitative de la voie de catabolisme du Trp:

Validation de la méthode en plasma☐Validation de la méthode autres matrices en cours (LBA, Urine, LCR, …)☐Evaluation de l’intérêt du suivi de ces métabolites dans différentes pathologies: maladies neurodégénératives, infections chroniques, SAOS

VOIE TRP

CANCER

MÉTABic

CIBLEE

IMMUNITE

MERCI

Pr Bertrand ToussaintEt tous les autres TheRexiens …

Pr Benoit Polack

12

Pr Patrice FaureDr V. DucrosLysiane BouletJulien MonteremalCandice Trocme

TheRex Day Juillet 2014

Dr L. Buffat

ANR GEFLUC

Lavoué et al. J Transl Med. 2013 Jun 13;11:147

Pseudomonas aeruginosa

Pathogène opportuniste extracellulaire (intra?)

Infections aigues ou chroniques

« Intelligente » : >6000 gènes, régulations, furtivité

SST3 (injectisome) dédié à l’injection d’exotoxines ExoS, ExoT and ExoU dans les cellules de l’hôte

Le Gouellec et al. 2012 

14

SST3‐ SST3 +100% bactéries tuées   100%  PMNS tuésDacheux et al., J.Bact., 1999

Une histoire de 15 ans

Preuve de conceptHow does it work?

15

Cellulesanormales

Structure du SST3 de P.aeruginosa :une seringue moléculaire

Translocon

Aiguille

Base

PcrV

PscF

Effector or Toxins

16

De P. aeruginosa a BacVac®(bacterial vaccine) 

17

De P. aeruginosa a BacVac®(bacterial vaccine) 

18

Exos 1-54 Antigène d’intérêt

Preuve de concept avec un Xeno‐antigène modèle OVA 

In vitro

DC activation Ag processing !and presentation

CD11c

IAb

Control BacVac - OVA

BacteriaSecretion Signal

OVA Ag

---

+++

+-+

++-

A B C

D‐14 D‐7

C57BL/6j7 weeks old

Epaulard et al. 2006Molecular Therapy

xOST S54‐OVAOSTΔBD S54‐OVA unable to translocate protein through T3SS OST S54‐GFP 

OST S0‐OVA unable to secrete and translocate protein through T3SSPBS 

Controls

!9

In vivo

Induction of Ag specific T cells Prophylactic Protection!against Tumor Challenge

SIINFEKL Tetramer

CD

8

A B C

Epaulard, Mol Ther 2006

19

Résultats‐ Chapitre3:Evaluationdelʼimmunitéanti‐vecteurpréexistante

SoutenancedeThèse_YanWANG_18/04/2012

‐3M ‐2M ‐ 14D/‐7D Day0Tumor challenge

Une immunité préexistente ne chage pas l’efficacité de BacVac

20

Groupe1:PBS‐PBS‐PBSGroupe2:OST‐OST‐OSTGroupe3:OST‐OST‐OST‐OVAGroupe4:OST‐OVA

Résultats‐ Chapitre3:Evaluationdelʼimmunitéanti‐vecteurpréexistante

21Une immunité préexistente ne chage pas l’efficacité de BacVac

Padre‐GP100Padre‐TRP2L

Résultats ‐ Chapitre 1 : Amélioration de lʼefficacité du vecteur bactérien

Vaccination avec antigènes naturels TRP2 & GP100 : Tumor associated antigens expressed by melanoma and glioblastoma cells

Mice model of glioblastoma (GL261 cells)

Wang et al., J. of Immunotherapy, 2012

6X 

C57BL/6j TumorGL261

Therapeutic setting

22

Stratégies d’attenuation

1. Virulence genes deletion2. Photochemical treatment23

De la preuve de concept à

l’utilisation cliniqueThe decision to test live bacteria is a balancing actbetween benefits to patients and risks to patients and the environment « Theodore Friedman »

Strategies d’attenuation de la virulence de P. aeruginosa

CLIN1Adapted to chemicallydefined medium

and lasI

24

Killed But Metabollically Active (MMA)

Traitement photochimique pour l’obtention du KBMA

Principe du traitement photochimique: Une souche inactivée dans le système Nucleotide excision repair (NER) est exposée 

exposed a un psoralen et soumise à une irradiation UVA

KBMA bacteria combine the advantages of live attenuated (efficacy) and Killed(safety) vaccine (Brockstedt et al. Nat med. 2005)

Amotosalen

25

Optimisation du traitement photochimique

Concentration d’amotosalen, durée et énergie de l’exposition aux UVA 

0µM 2µM 5µM 10µM 15µM 20µMEGTA

1/1.25x108 replicating bacteria

26

Les bactéries KBMA induisent une réponse CD8 spécifique dans la souris

activatednon-activated

27

KBMA induisent la lyse de cellules (OVA)

B16-OVA

28

KBMA se dissémine comme la souche non traitée mais ne se réplique pas

Nuclear imaging SPECT/CT with Tc99m labeled‐Bacteria

29

KBMA induit une réponse inflammatoire systémique modérée

Systemic response in mouseCytokine assay xMAP Technology (Luminex)

30

Etudes précliniques

J‐14 J‐7 J0

Prime Boost Challenge Tumoral

J0 J+1 J+24

Challenge Tumoral Vaccination

31

KBMA‐M1 est sûre et induit une réponse CD8 spécifique dans les PNH

32

KBMA induit une réponse long terme

33

Memory marker at Day 90 on Ova CD8+ T cells in splenocytes

* p<0.05***p<0.001

APPLICATIONS Infections virales, maladies émergentesGrippe , M1 (CD8) et M2e (humorale) 

Cancers viro induits : Merkel Cell Carcinoma

Infections à pathogènes intracellulaires Bactériens ou parasitaires

Vaccins anti P.aeruginosa Conférer des attributs favorisant la réponse vaccinale En inhibant des facteurs de furtivité (QS, Kyn, FliC, CIF,..) En surexprimant des antigènes de surface (OprF,..)

34

Valorisation  2 Brevets mondiaux: B.Polack, B.Toussaint, L. Quénée. Tool for the transfer and production of proteins using the pseudomonas type III secretion system. International patent UJF (EP 1 692 162 B1). 2004

A Le Gouellec, B Polack, B Toussaint Attenuated and adapted strain of P. aeruginosa for delivering antigens International patent UJF/CHU (Brevet WO 2013/087667)

APCure SAS fondée en 2012 par Dr. Laurent Buffat développe des stratégies d’immunothérapie active spécifique sur la platform BacVac : cancers viro‐induits (Preuve de Concept CLARA 2014)

35